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技術 試料中の発生源寄与の決定のためのアッセイシステム

出願人 アリオサダイアグノスティックスインコーポレイテッド
発明者 スパークス、アンドリューストラブル、クレイグワン、エリックオリファント、アーノルド
出願日 2011年8月8日 (8年6ヶ月経過) 出願番号 2013-523386
公開日 2013年8月19日 (6年6ヶ月経過) 公開番号 2013-532494
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 連結形式 連続連結 補正指標 増分費用 変動位置 頻度範囲 並行配列 粘着プレート
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図面 (17)

課題・解決手段

本発明は、個体からの混合試料中の1つ以上の遺伝子座コピー数変動の検出および1つ以上の遺伝子座の多型検出のためのアッセイシステムおよび方法を提供する。

概要

背景

以下の考察においては、特定の物品および方法を背景および導入目的で説明する。本明細書に含まれるものは、先行技術の「自認」と解釈すべきではない。出願人は、必要に応じて、本明細書に記載の物品および方法が適用可能な法令条項の下で先行技術を構成しないことを証明する権利を明示的に保持する。診断法における近年の進歩は、疾患のリスク、存在および予後を決定するための低侵襲機構焦点を当ててきた。遺伝子異常を決定するための診断方法は、特定の疾患および障害を同定するだけでなく、疾患発生源および治療選択肢に関する価値ある情報を得るための標準的な技術になっている。

血液および血漿などの生体試料中無細胞核酸の同定により、臨床決定を行うのに採血などの低侵襲技術を用いることが可能になる。例えば、癌患者末梢血には悪性固形腫瘍由来する無細胞DNAが見出されており、移植を受けた個体は移植された器官に由来する無細胞DNAがその血流中に存在し、妊娠女性の血液および血漿中には無細胞胎児DNAおよびRNAが見出されている。さらに、ウイルス量の検出などの感染性生物に由来する核酸の検出または特定の株のウイルスもしくは細菌病原体の遺伝的同定は、重要な診断および予後の指標となる。したがって、患者自身の正常細胞とは別の発生源に由来する無細胞核酸によって、例えば、治療選択肢、診断、予後などに関する重要な医学的情報を得ることができる。

そのような試験感度は、異なる発生源に由来する核酸の量の同定、特に、第2の発生源に由来するより高レベルの核酸のバックグラウンドのある発生源に由来する低レベルの核酸の同定に依存することが多い。生体試料中に存在する無細胞核酸に対する少量の核酸種の寄与の検出は、得られるデータの正確な統計的解釈を実現することができる。

概要

本発明は、個体からの混合試料中の1つ以上の遺伝子座コピー数変動の検出および1つ以上の遺伝子座の多型検出のためのアッセイシステムおよび方法を提供する。

目的

本発明は、混合試料中の多いおよび/または少ない発生源に由来する核酸の寄与ならびに混合試料中の単一の発生源に由来する1つ以上の(1または複数の)ゲノム領域でのCNVの存在または非存在を決定する能力を有する単一アッセイシステムを提供する

効果

実績

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請求項1

混合試料中における発生源寄与の算出および1つ以上のゲノム領域中のコピー数変動(CNV)の存在または非存在の検出のための単一のアッセイシステムであって、第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドがゲノム領域中の、または該ゲノム領域に関連した1つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程;第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが2つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程;ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸相補的な連続的連結産物を作製する工程;第1および第2のユニバーサルプライマー領域を用いて前記連続的連結産物を増幅して、増幅産物を作製する工程;および前記増幅産物の配列を検出する工程を含む、アッセイシステム。。

請求項2

前記固定配列オリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー領域を含む、請求項1に記載のアッセイシステム。

請求項3

前記ユニバーサルプライマー領域が、増幅産物の配列決定において用いられる、請求項2に記載のアッセイシステム。

請求項4

ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドが、連続的連結産物の増幅の前に除去される、請求項1に記載のアッセイシステム。

請求項5

固定配列オリゴヌクレオチドの一方または両方がプレサークルプローブを含む、請求項1に記載のアッセイシステム。

請求項6

前記増幅産物が、検出の前に単離される、請求項1に記載のアッセイシステム。

請求項7

前記増幅産物が、検出の前に個々の分子として単離される、請求項5に記載のアッセイシステム。

請求項8

検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物の全部または一部の同一のコピーが作製される、請求項7に記載のアッセイシステム。

請求項9

検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一のコピーが作製される、請求項7に記載のアッセイシステム。

請求項10

コピー数に関して調査される少なくとも1つの遺伝子座が、多型に関して調査される全ての遺伝子座と異なる、請求項1に記載のアッセイシステム。

請求項11

コピー数に関して調査されるいくつかの遺伝子座が、多型に関して調査される遺伝子座と異なる、請求項10に記載のアッセイシステム。

請求項12

前記混合試料が、母体および胎児のcfDNAを含む母体試料である、請求項1に記載のアッセイシステム。

請求項13

単一アッセイを用いた、混合試料中における発生源寄与の算出および染色体異常の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムであって、第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第1の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程;第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第2の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程;第3のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが2つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程;ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程;前記連続的連結産物を増幅して、増幅産物を作製する工程;および前記増幅産物を検出する工程を含む、アッセイシステム。

請求項14

前記固定配列オリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー領域を含む、請求項13に記載のアッセイシステム。

請求項15

前記ユニバーサルプライマー領域が、増幅産物の配列決定において用いられる、請求項14に記載のアッセイシステム。

請求項16

ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドが、前記連続的連結産物の増幅の前に除去される、請求項15に記載のアッセイシステム。

請求項17

前記固定オリゴヌクレオチドのセットが同時に導入される、請求項13に記載のアッセイシステム。

請求項18

前記増幅産物が、検出の前に単離される、請求項13に記載のアッセイシステム。

請求項19

前記増幅産物が、検出の前に個々の分子として単離される、請求項18に記載のアッセイシステム。

請求項20

検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物の全部または一部の同一のコピーが作製される、請求項19に記載のアッセイシステム。

請求項21

検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一のコピーが作製される、請求項19に記載のアッセイシステム。

請求項22

コピー数に関して調査される少なくとも1つの遺伝子座が、多型に関して調査される全ての遺伝子座と異なる、請求項13に記載のアッセイシステム。

請求項23

コピー数に関して調査されるいくつかの遺伝子座が、多型に関して調査される遺伝子座と異なる、請求項22に記載のアッセイシステム。

請求項24

前記混合試料が、母体および胎児cfDNAを含む母体試料である、請求項13に記載のアッセイシステム。

請求項25

胎児異数性の存在または非存在を検出するために前記アッセイシステムが用いられる、請求項24に記載のアッセイシステム。

請求項26

単一アッセイを用いた、母体試料中の発生源寄与の算出および染色体異常の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムであって、第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第1の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記母体試料に導入する工程;第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第2の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記母体試料に導入する工程;第3のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが2つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記母体試料に導入する工程;ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程;前記連続的連結産物を増幅して、増幅産物を作製する工程;および前記増幅産物を検出する工程を含む、アッセイシステム。

請求項27

前記固定配列オリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー領域を含む、請求項26に記載のアッセイシステム。

請求項28

前記ユニバーサルプライマー領域が、前記増幅産物の配列決定において用いられる、請求項27に記載のアッセイシステム。

請求項29

ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドが、前記連続的連結産物の増幅の前に除去される、請求項27に記載のアッセイシステム。

請求項30

前記固定オリゴヌクレオチドのセットが同時に導入される、請求項26に記載のアッセイシステム。

請求項31

前記増幅産物が、検出の前に単離される、請求項26に記載のアッセイシステム。

請求項32

前記増幅産物が、検出の前に個々の分子として単離される、請求項31に記載のアッセイシステム。

請求項33

検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物の全部または一部の同一のコピーが作製される、請求項32に記載のアッセイシステム。

請求項34

検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一のコピーが作製される、請求項32に記載のアッセイシステム。

請求項35

コピー数に関して調査される少なくとも1つの遺伝子座が、多型に関して調査される全ての遺伝子座と異なる、請求項26に記載のアッセイシステム。

請求項36

コピー数に関して調査されるいくつかの遺伝子座が、多型に関して調査される遺伝子座と異なる、請求項26に記載のアッセイシステム。

請求項37

前記母体試料が、母体および胎児cfDNAを含む、請求項26に記載のアッセイシステム。

請求項38

混合試料内の1つ以上のゲノム領域中の発生源寄与の算出およびCNVの存在または非存在の検出のためのアッセイシステムであって、第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドがゲノム領域中の、または該ゲノム領域に関連した1つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程;第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程;それぞれのセットの前記固定配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域の間の遺伝子座の領域に相補的な1つ以上の架橋オリゴヌクレオチドを、該架橋オリゴヌクレオチドが前記遺伝子座中の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で導入する工程;ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程;前記連続的連結産物を増幅して、増幅産物を作製する工程;および前記増幅産物を検出する工程を含む、アッセイシステム。

請求項39

前記固定配列オリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー領域を含む、請求項38に記載のアッセイシステム。

請求項40

第1および第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドが、架橋オリゴヌクレオチドの導入の前に導入される、請求項39に記載のアッセイシステム。

請求項41

ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドが、架橋オリゴヌクレオチドの導入の前に除去される、請求項38に記載のアッセイシステム。

請求項42

前記架橋オリゴヌクレオチドが連結混合物と同時に導入される、請求項38に記載のアッセイシステム。

請求項43

前記固定配列オリゴヌクレオチドと前記核酸領域とのハイブリダイゼーション産物が、前記架橋オリゴヌクレオチドの導入の前に単離される、請求項38に記載のアッセイシステム。

請求項44

前記増幅産物が、検出の前に単離される、請求項38に記載のアッセイシステム。

請求項45

前記増幅産物が、検出の前に個々の分子として単離される、請求項44に記載のアッセイシステム。

請求項46

検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の前記増幅産物の全部または一部の同一のコピーが作製される、請求項45に記載のアッセイシステム。

請求項47

検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一のコピーが作製される、請求項45に記載のアッセイシステム。

請求項48

前記第1または第2のオリゴヌクレオチドが試料指標を含む、請求項38に記載のアッセイシステム。

請求項49

前記混合試料が、母体および胎児cfDNAを含む母体試料である、請求項38に記載のアッセイシステム。

請求項50

個体由来混合試料中のDNAの少ない発生源における1つ以上の染色体異常および1つ以上の多型を決定する能力を有する単一のアッセイシステム。

請求項51

単一のアッセイを用いた、混合試料中の発生源寄与の算出および染色体異常の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムであって、第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第1の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座に対応する2つ以上の核酸上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程;第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第2の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程;第3のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが2つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記混合試料に導入する工程;それぞれのセットの前記固定配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域の間の遺伝子座の領域に相補的な1つ以上の架橋オリゴヌクレオチドを、該固定配列オリゴヌクレオチドが前記遺伝子座中の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で導入する工程;ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程;前記連続的連結産物を増幅して、増幅産物を作製する工程;および前記増幅産物を検出する工程を含む、アッセイシステム。

請求項52

前記固定配列オリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー領域を含む、請求項51に記載のアッセイシステム。

請求項53

前記ユニバーサルプライマー領域が、前記増幅産物の配列決定において用いられる、請求項52に記載のアッセイシステム。

請求項54

ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドが、前記連続的連結産物の増幅の前に除去される、請求項51に記載のアッセイシステム。

請求項55

固定配列オリゴヌクレオチドの一方または両方のセットがプレサークルプローブを含む、請求項51に記載のアッセイシステム。

請求項56

前記増幅産物が、検出の前に単離される、請求項51に記載のアッセイシステム。

請求項57

前記増幅産物が、検出の前に個々の分子として単離される、請求項55に記載のアッセイシステム。

請求項58

検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の増幅産物の全部または一部の同一のコピーが作製される、請求項57に記載のアッセイシステム。

請求項59

検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一のコピーが作製される、請求項57に記載のアッセイシステム。

請求項60

コピー数に関して調査される少なくとも1つの遺伝子座が、多型に関して調査される全ての遺伝子座と異なる、請求項51に記載のアッセイシステム。

請求項61

コピー数に関して調査されるいくつかの遺伝子座が、多型に関して調査される遺伝子座と異なる、請求項60に記載のアッセイシステム。

請求項62

前記混合試料が、母体および胎児cfDNAを含む母体試料である、請求項51に記載のアッセイシステム。

請求項63

単一のアッセイを用いた、母体試料中の発生源寄与の算出および染色体異常の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムであって、第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第1の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座に対応する2つ以上の核酸上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記母体試料に導入する工程;第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが第2の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記母体試料に導入する工程;第3のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、該固定オリゴヌクレオチドが2つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で前記母体試料に導入する工程;それぞれのセットの前記固定配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域の間の遺伝子座の領域に相補的な1つ以上の架橋オリゴヌクレオチドを、該固定配列オリゴヌクレオチドが前記遺伝子座中の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で導入する工程;ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程;前記連続的連結産物を増幅して、増幅産物を作製する工程;および前記増幅産物を検出する工程を含む、アッセイシステム。

請求項64

前記固定配列オリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー領域を含む、請求項63に記載のアッセイシステム。

請求項65

前記ユニバーサルプライマー領域が、前記増幅産物の配列決定において用いられる、請求項64に記載のアッセイシステム。

請求項66

ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドが、前記連続的連結産物の増幅の前に除去される、請求項63に記載のアッセイシステム。

請求項67

固定配列オリゴヌクレオチドの一方または両方のセットがプレサークルプローブを含む、請求項63に記載のアッセイシステム。

請求項68

前記増幅産物が、検出の前に単離される、請求項63に記載のアッセイシステム。

請求項69

前記増幅産物が、検出の前に個々の分子として単離される、請求項68に記載のアッセイシステム。

請求項70

検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の増幅産物の全部または一部の同一のコピーが作製される、請求項69に記載のアッセイシステム。

請求項71

検出の前に、個々の単離された前記増幅産物がさらに増幅されて、個々の増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一のコピーが作製される、請求項69に記載のアッセイシステム。

請求項72

コピー数に関して調査される少なくとも1つの遺伝子座が、多型に関して調査される全ての遺伝子座と異なる、請求項63に記載のアッセイシステム。

請求項73

コピー数に関して調査されるいくつかの遺伝子座が、多型に関して調査される遺伝子座と異なる、請求項72に記載のアッセイシステム。

請求項74

前記母体試料が、母体および胎児cfDNAを含む、請求項63に記載のアッセイシステム。

請求項75

胎児染色体異常の存在または非存在を検出するために前記アッセイシステムが用いられる、請求項63に記載のアッセイシステム。

技術分野

0001

本発明は、単一のアッセイにおいて混合試料中コピー数変動を同定するためのアッセイシステムに関する。

背景技術

0002

以下の考察においては、特定の物品および方法を背景および導入目的で説明する。本明細書に含まれるものは、先行技術の「自認」と解釈すべきではない。出願人は、必要に応じて、本明細書に記載の物品および方法が適用可能な法令条項の下で先行技術を構成しないことを証明する権利を明示的に保持する。診断法における近年の進歩は、疾患のリスク、存在および予後を決定するための低侵襲機構焦点を当ててきた。遺伝子異常を決定するための診断方法は、特定の疾患および障害を同定するだけでなく、疾患発生源および治療選択肢に関する価値ある情報を得るための標準的な技術になっている。

0003

血液および血漿などの生体試料中無細胞核酸の同定により、臨床決定を行うのに採血などの低侵襲技術を用いることが可能になる。例えば、癌患者末梢血には悪性固形腫瘍由来する無細胞DNAが見出されており、移植を受けた個体は移植された器官に由来する無細胞DNAがその血流中に存在し、妊娠女性の血液および血漿中には無細胞胎児DNAおよびRNAが見出されている。さらに、ウイルス量の検出などの感染性生物に由来する核酸の検出または特定の株のウイルスもしくは細菌病原体の遺伝的同定は、重要な診断および予後の指標となる。したがって、患者自身の正常細胞とは別の発生源に由来する無細胞核酸によって、例えば、治療選択肢、診断、予後などに関する重要な医学的情報を得ることができる。

0004

そのような試験感度は、異なる発生源に由来する核酸の量の同定、特に、第2の発生源に由来するより高レベルの核酸のバックグラウンドのある発生源に由来する低レベルの核酸の同定に依存することが多い。生体試料中に存在する無細胞核酸に対する少量の核酸種の寄与の検出は、得られるデータの正確な統計的解釈を実現することができる。

発明が解決しようとする課題

0005

したがって、試料中の核酸の寄与に関する情報を用いて生体試料中の1つ以上の(1または複数の)ゲノム領域中のコピー数変動(CNV)を算出するための方法が必要である。本発明は、この必要性に取り組む。

課題を解決するための手段

0006

この概要は、以下の詳細な説明においてさらに説明される単純化された形態の概念の選択を導入するために示される。この概要は、特許請求される主題の鍵となるか、もしくは本質的な特徴を同定することを意図されるものではなく、特許請求される主題の範囲を制限するために用いられることを意図されるものでもない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、利用性、および利点は、添付の図面に例示され、添付の特許請求の範囲に定義される態様を含む以下の詳細な説明から明らかである。

0007

本発明の方法は、個体に由来する試料内の多い発生源(より多い方の発生源)および/または少ない発生源(より少ない方の発生源)の寄与を決定し、混合試料中の遺伝子座の発生源の寄与と比較したゲノム領域の値の差異を決定するための単一の発生源内の1つ以上のゲノム領域に関するコピー数情報を決定する能力を有する単一アッセイシステムを含む。本発明は、混合試料内の単一の発生源からの発生源寄与およびコピー数変動(CNV
)を決定するための非多型および多型検出の両方を用いる単一アッセイシステムを用いる。試料内の多いおよび/または少ない発生源の寄与の決定により、混合試料中のCNVの決定のためのゲノム領域の十分な同定を可能にする両発生源に由来する十分な遺伝物質の存在に関する情報を得ることができる。

0008

1態様においては、前記アッセイシステムは、個体に由来する混合試料中の選択遺伝子座(選択された遺伝子座)の増幅および検出を用いて、発生源寄与を算出し、1つ以上のゲノム領域のコピー数を同定する。1つの具体的な態様においては、本発明は、混合試料中の多いおよび/または少ない発生源に由来する核酸の寄与ならびに混合試料中の単一の発生源に由来する1つ以上の(1または複数の)ゲノム領域でのCNVの存在または非存在を決定する能力を有する単一アッセイシステムを提供する。前記アッセイシステムは、混合試料内の2つ以上の発生源中に存在するゲノム領域のコピー数を特異的に検出することができる。寄与の決定のためには、ある発生源に由来する選択遺伝子座を、混合試料中の少なくとも1つの他の発生源の選択遺伝子座と区別する。しかし、コピー数変動を混合試料内の2つ以上のゲノム領域のレベルの比較によって検出することができるため、ゲノム領域のコピー数変動の決定のために、選択遺伝子座は発生源寄与に関して区別されても良いが、区別される必要はない。好ましくは、前記アッセイシステムにおいて分析される無細胞核酸は、無細胞DNA(cfDNA)である。

0009

かくして、第1の実施において、本発明は、1)2つ以上の情報遺伝子座から誘導された頻度データを用いて混合試料中の多い発生源および/または少ない発生源の寄与を決定するため;2)多いおよび少ない発生源における1つ以上のゲノム領域の頻度を決定するため;ならびに3)多いおよび/または少ない発生源における1つ以上のゲノム領域に関してCNVの存在または非存在を同定するための単一アッセイシステムを提供する。好ましくは、CNVの同定は、混合試料中の多いおよび/または少ない発生源に由来する2つ以上のゲノム領域のコピー数の比較に基づく。

0010

好ましくは、本発明のシステムを用いて分析される核酸は、無細胞核酸である。より好ましくは、前記アッセイシステムにおいて分析される核酸は、無細胞DNA(cfDNA)を含む。

0011

別の具体的な態様においては、本発明は、アッセイが、第1のセットの固定配列(固定された配列)オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、ゲノム領域中の、またはそれと関連する1つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程;第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、2つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程;ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、選択遺伝子座に相補的な連続的連結産物を作製する工程;連続的連結産物を増幅させて、増幅産物を作製する工程;および増幅産物を検出する工程を含む、混合試料内の発生源寄与の算出および1つ以上のゲノム領域におけるCNVの存在または非存在の検出のためのアッセイシステムを提供する。増幅産物の検出は、混合試料中の発生源寄与および1つ以上のゲノム領域のコピー数を算出するために用いられる。

0012

固定オリゴヌクレオチドのセットは、ゲノム領域または情報遺伝子座の連続的領域にハイブリダイズする2つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの好ましい態様においては、遺伝子座のセットはCNVについて調査され、より大きいゲノム領域(例えば、染色体の全部または一部)の増幅を示す。好ましくは、前記アッセイシステムは、混合試料内の多い発生源と少ない発生源との間でこれらの遺伝子座のコピー数を区別することができる。選択遺伝子座のレベルを、目的のゲノム領域について決定し、1つ以上の他の目的のゲノム領域および/または1つ以上の参照ゲノム領域の遺伝子座の量と比較して、混合
試料中の遺伝子座頻度に基づく潜在的なCNVを検出することができる。

0013

試料中の染色体異常の検出は、多いおよび/もしくは少ない発生源に由来する単一の染色体上に位置するかまたは該染色体と関連した複数の選択遺伝子座に関するCNVの検出に基づくものであってよい。かくして、別の具体的な態様においては、本発明は、1)2つ以上の情報遺伝子座から誘導された頻度データを用いて、混合試料中の多い発生源および/または少ない発生源の寄与を決定し;2)多いおよび少ない発生源における1つ以上のゲノム領域の頻度を決定し;3)混合試料中の多いおよび/または少ない発生源における染色体異常の存在または非存在を同定するための単一アッセイシステムを提供する。

0014

かくして、本発明は、アッセイが、第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定配列オリゴヌクレオチドが、第1の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程;第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、第2の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程;第3のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、2つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程;ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程;連続的連結産物を増幅させて、増幅産物を作製する工程;および増幅産物を検出する工程を含む、単一アッセイを用いる混合試料中の発生源寄与の算出および染色体異常の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムを提供する。増幅産物の検出を、混合試料中の発生源寄与の算出ならびに染色体異常の同定のために用いることができる。

0015

より具体的な態様においては、本発明のアッセイシステムは、母体試料中の胎児寄与率および染色体異常を同定するために用いられる。本発明は、第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、第1の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で母体試料に導入する工程;第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、第2の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で母体試料に導入する工程;第3のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、2以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で母体試料に導入する工程;ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程;連続的連結産物を増幅させて、増幅産物を作製する工程;および増幅産物を検出する工程を含む、アッセイシステムを提供する。増幅産物の検出を、母体試料における胎児寄与の算出ならびに胎児核酸中の染色体異常の同定のために用いることができる。

0016

本発明の特定の態様においては、固定オリゴヌクレオチドがアッセイの連結工程の間に直接的に連結されるように、それらは連続的領域のすぐ近くでハイブリダイズされる。しかしながら、他の態様においては、連続的領域におけるハイブリダイゼーション後に固定オリゴヌクレオチドの末端の間に1つ以上のヌクレオチドギャップが存在してもよい。例えば、ポリメラーゼを用いるプライマー伸長と連結との組合せにより、固定オリゴヌクレオチドを連結する。

0017

それぞれのセットの固定配列核酸は、選択遺伝子座中の少なくとも2つの別々の領域にハイブリダイズするように設計される。好ましい態様においては、2つ以上の別々のオリゴをセットで用いてこれらの領域にハイブリダイズさせ、選択遺伝子座に相補的な隣接核酸を提供する。しかしながら、いくつかの態様においては、セットは、本明細書でより詳細に説明されるように、選択遺伝子座に相補的な2つ以上の異なる非隣接領域を有する単
プローブ(例えば、パドロックプローブ)からなってもよい。固定配列オリゴのセットを、アッセイにおいて連続的に、またはアッセイにおいて同時に提供することができる。

0018

特定の好ましい態様においては、架橋オリゴを用いて、オリゴセット特異性を増加させる、および/または固定配列オリゴヌクレオチド間のギャップを埋める。従って、本発明の別の具体的な態様は、アッセイが、第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、ゲノム領域中またはそれと関連する1つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程;第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程;それぞれのセットの固定配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域の間およびすぐ近くの遺伝子座の領域に相補的である、1つ以上の架橋オリゴヌクレオチドを、架橋オリゴヌクレオチドが、前記遺伝子座中の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で導入する工程;ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続的連結産物を作製する工程;連続的連結産物を増幅させて、増幅産物を作製する工程;ならびに増幅産物を検出する工程を含む、混合試料内の発生源寄与の算出および1つ以上のゲノム領域中のCNVの存在または非存在の検出のためのアッセイシステムを提供する。増幅産物の検出を用いて、混合試料中の発生源寄与および1つ以上のゲノム領域のコピー数を算出する。

0019

本発明の別の具体的な態様は、混合試料中の発生源寄与を算出し、染色体異常を同定するための架橋オリゴヌクレオチドを用いるアッセイシステムを提供する。このアッセイは、第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、第1の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程;第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、第2の染色体に対応する2つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程;第3のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、2つ以上の情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で混合試料に導入する工程;それぞれのセットの固定配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域の間およびすぐ近くの遺伝子座の領域に相補的である、1つ以上の架橋オリゴヌクレオチドを、架橋オリゴヌクレオチドが、前記遺伝子座中の相補的領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で導入する工程;それぞれのセットの固定配列オリゴヌクレオチドに相補的な領域の間およびすぐ近くの遺伝子座の領域に相補的である、1つ以上の架橋オリゴヌクレオチドを、架橋オリゴヌクレオチドが、前記遺伝子座中の相補的領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で導入する工程;ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、核酸に相補的な連続連結産物を作製する工程;連続連結産物を増幅させて、増幅産物を作製する工程;ならびに増幅産物を検出する工程を含む。増幅産物の検出を、混合試料中の発生源寄与(母体試料中の胎児寄与など)の算出、ならびに染色体異常の同定のために用いることができる。

0020

本発明の特定の態様においては、固定オリゴヌクレオチドが全部、アッセイの連結工程の間に直接連結されるように、それらは架橋オリゴのすぐ近くでハイブリダイズされる。しかしながら、他の態様においては、架橋オリゴのハイブリダイゼーション後に固定オリゴヌクレオチドと架橋オリゴとの一方または両方の末端の間に1つ以上のヌクレオチドのギャップが存在してもよい。例えば、ポリメラーゼを用いるプライマー伸長と連結との組合せにより、固定オリゴヌクレオチドと、架橋オリゴとを連結する。

0021

本発明の多重化されたアッセイが、5以上、好ましくは10以上、好ましくは16以上、好ましくは20以上、好ましくは30以上、好ましくは32以上、好ましくは40以上
、好ましくは48以上、好ましくは50以上、好ましくは60以上、好ましくは70以上、好ましくは80以上、好ましくは90以上、およびより好ましくは96以上の選択遺伝子座を同時に分析することができることが重要な特徴である。これらの選択遺伝子座は、単一の試料に由来する異なる遺伝子座であってもよく、またはそれらは2つ以上の混合試料に由来する遺伝子座であってもよい。後者の場合、選択遺伝子座の分析に用いられる2つの固定配列オリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、該遺伝子座を特定の試料と関連付けることができる試料識別子(例えば、「試料指標」)を含む。あるいは、試料指標は、試料指標を含むプライマーを用いることにより連結産物の増幅中に添加することができる。

0022

好ましい態様においては、これらの遺伝子座の調査は、単一の増幅反応において複数の遺伝子座の増幅を可能にするユニバーサル増幅技術を用いる。本発明のアッセイシステムにおける寄与算出ならびにCNVおよび/または染色体異常の検出のための選択核酸を、混合試料からの初期選択的増幅後にユニバーサル増幅方法を用いて増幅させることができる。ユニバーサル増幅の使用は、単一の、または限られた数の増幅プライマーを用いて、単一または複数の試料に由来する複数の核酸領域を増幅させることを可能にし、単一の反応において複数の選択領域を増幅させるのに特に有用である。好ましい態様においては、増幅産物の配列決定においてユニバーサルプライマー領域を用いる。別の好ましい態様においては、ゲノム領域の検出のために用いられる固定配列オリゴヌクレオチドおよび多型の検出のために用いられる固定配列オリゴヌクレオチドにおいて、同じユニバーサルプライマー領域を用いる。

0023

かくして、本発明の具体的な態様においては、ユニバーサル増幅における使用のためのプライマーに相補的な配列を、選択的増幅の間またはその後に選択遺伝子座に導入する。好ましくは、そのような配列を、そのような選択核酸の末端に導入するが、それらをユニバーサル増幅手順からの増幅産物の同定を可能にする任意の位置に導入してもよい。

0024

特定の好ましい態様においては、用いられるプライマーの一方または両方は、試料指標または他の識別子を含む。具体的な態様においては、試料指標は1つ以上のユニバーサルプライマーに含まれる。試料指標を増幅産物中に組込み、次いで、異なる試料に由来する増幅産物を組み合わせることができる。試料指標はCNVおよび多型を元の試料に適切に割り当てることができるように、CNVまたは染色体異常の検出ならびに多型の検出と同時に検出される。

0025

特定の態様においては、アッセイシステムは2つ以上の調査される遺伝子座中の領域に相補的である1以上の共通の架橋オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子座調査を多重化する、すなわち、2つ以上の固定オリゴヌクレオチドセットについて単一の架橋オリゴを用いることができる。これにより、多重化されたアッセイシステムにおいて用いられる架橋オリゴヌクレオチドの数を、アッセイにおいて調査される遺伝子座の数より小さくできる。特定の具体的な態様においては、アッセイシステムは、本発明のアッセイシステムを用いて調査される2つ以上の遺伝子座と適合するようにそれぞれ設計された架橋オリゴヌクレオチドのプールを用いる。

0026

選択遺伝子座の頻度を、目的のゲノム領域について決定し、1つ以上の他の目的のゲノム領域および/または1つ以上の参照ゲノム領域の遺伝子座の頻度と比較して、混合試料中の遺伝子座頻度に基づいて潜在的なCNVを検出することができる。

0027

いくつかの例においては、用いて検出される染色体異常は、目的の染色体上での遺伝子増幅または遺伝子座伸長と関連する。他の例においては、染色体異常は、ゲノム中の染色体の余分な部分の存在をもたらす転座と関連する。さらに他の例においては、遺伝子異常
欠失である。

0028

特定の好ましい態様においては、染色体異常は、目的の染色体の異数性と関連する。例えば、胎児における最も一般的な染色体異常は、トリソミー21、18、13、Xおよび/もしくはYまたはモノソミーXである。具体的な好ましい態様においては、本発明のアッセイシステムは、母体試料の胎児DNAにおけるそのような一般的な染色体異数性を検出するために用いられる。

0029

本発明のアッセイシステムにおいては、必要に応じて、増幅産物を単離した後、検出する。単離される場合、好ましくはそれらを個々の分子として単離して、その後の検出を補助する。単離後、増幅産物をさらに増幅させて、個々の増幅産物の全部または一部の同一コピーを作製した後、検出することができる。あるいは、単離された増幅産物をさらに増幅させて、個々の増幅産物の全部または一部に相補的な分子の同一コピーを作製した後、検出することができる。

0030

CNVの検出の様々な方法を、本発明のアッセイシステムにおける多型の検出と共に用いることができる。1つの一般的な態様においては、アッセイシステムは、混合試料中の目的の第1のゲノム領域から1つ以上の選択核酸を増幅する工程;混合試料中の目的の第2の遺伝子座から1つ以上の選択核酸を増幅する工程、選択遺伝子座の相対頻度を決定する工程、選択遺伝子座の相対頻度を比較する工程、ならびに第1および第2の遺伝子座に由来する選択核酸の比較された相対頻度に基づいてCNVの存在または非存在を同定する工程を含む、混合試料中の1つ以上の遺伝子座におけるCNVの決定のための方法を用いる。好ましくは、アッセイ方法は、異なるゲノム領域に由来する2つ以上の選択遺伝子座を増幅するが、該遺伝子座は、同一の一般的なゲノム領域中に位置してもよく、これは、単一の遺伝子座由来のCNVよりもむしろ染色体異常から生じるCNVの確認のためである。

0031

より好ましくは、ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドを除去した後、架橋オリゴヌクレオチドを導入する。いくつかの態様においては、架橋オリゴヌクレオチドを連結混合物と同時に導入する。他の態様においては、固定配列オリゴヌクレオチドと遺伝子座とのハイブリダイゼーション産物を単離した後、架橋オリゴヌクレオチドを導入する。

0032

特定の具体的な態様においては、アッセイシステムは、本発明のアッセイシステムを用いて調査される2つ以上の遺伝子座と適合するようにそれぞれ設計された架橋オリゴヌクレオチドのプールを用いる。これらの態様においては、多重化アッセイにおいて用いられる架橋オリゴヌクレオチドは、好ましくは±5℃の範囲、より好ましくは±2℃の範囲のTmを有するように設計される。

0033

特定の態様においては、架橋オリゴヌクレオチドは、長さ2〜45ヌクレオチドである。具体的な態様においては、架橋オリゴヌクレオチドは、長さ3〜9ヌクレオチドである。さらに別の具体的な態様においては、オリゴヌクレオチドは長さ10〜30ヌクレオチドである。

0034

CNVについて調査される遺伝子座は、いくつかの例においては、より大きいゲノム領域、例えば、染色体の全部または一部の増幅を示すものであってよい。好ましくは、アッセイシステムは混合試料内の多い発生源と少ない発生源との間でこれらの遺伝子座のコピー数を区別することができる。

0035

別の態様においては、本発明は、混合試料中のCNVおよび感染性因子の両方の同定を
可能にする技術を用いる。これは特に、臨床結果が感染性因子の存在によって悪化し得る患者モニターするのに役立ち得る。例えば、移植を受けた患者は、免疫抑制剤服用する可能性が高く、したがって一般により感染しやすい。同様に、妊娠女性はその免疫系において変化を有し、かくして、母親および/または胎児に対して有害な効果を有し得る病原体による感染により罹りやすい。また、特定の型の癌は感染性因子と関連し(例えば、肝臓癌B型肝炎およびC型肝炎感染と関連し、子宮頚癌ヒトパピローマウイルス感染と関連する)、感染性因子の同定は臨床結果を予測するか、または患者のための医学的処置の好ましい経過を決定するのに有益であってよい。

0036

かくして、特定の態様においては、本発明は、アッセイが、第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが、ゲノム領域中の、またはそれと関連する1つ以上の遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で、混合試料に導入する工程;第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの情報遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で、混合試料に導入する工程;第3のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、固定配列オリゴヌクレオチドが、感染性因子を示す遺伝子座上の相補領域に特異的にハイブリダイズすることができる条件下で、混合試料に導入する工程;ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを連結して、遺伝子座に相補的な連続的連結産物を作製する工程;連続的連結産物を増幅させて、増幅産物を作製する工程;ならびに増幅産物を検出する工程を含む、単一のアッセイを用いて、混合試料中の発生源寄与の算出、ゲノム領域のCNVの存在または非存在、ならびに感染性因子の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムを提供する。増幅産物の検出は、混合試料中のゲノム領域のコピー数および感染性因子の存在または非存在と相関する。

0037

別の一般的な態様においては、アッセイシステムは、混合試料中の第1の目的の染色体から1つ以上の選択遺伝子座を増幅する工程;混合試料中の第2の目的の染色体から1つ以上の選択遺伝子座を増幅する工程;第1および第2の目的の染色体に由来する選択領域の相対頻度を決定する工程、第1および第2の目的の染色体に由来する選択領域の相対頻度を比較する工程;ならびに選択領域の比較された相対頻度に基づいて異常の存在または非存在を同定する工程を含む、ゲノム領域中のCNVと関連する染色体異常の存在または非存在を決定するための方法を用いる。好ましくは、それぞれの染色体から2つ以上の核酸領域を選択し、より好ましくは、それぞれの染色体から5つ以上の遺伝子座を選択する。

0038

さらに別の一般的な態様においては、アッセイシステムは、混合試料中の第1の目的の染色体に対応するcfDNA中の2つ以上の選択遺伝子座を増幅する工程;混合試料中の第2の目的の染色体に対応するcfDNA中の2つ以上の選択遺伝子座を増幅する工程、第1および第2の目的の染色体に由来する選択領域の相対頻度を決定する工程、第1および第2の目的の染色体に由来する選択領域の相対頻度を比較する工程、ならびに選択領域の比較された相対頻度に基づいて異数性の存在または非存在を同定する工程を含む、個体から得た混合試料中の異数性の存在または非存在の決定のための方法を用いる。具体的な態様においては、第1および第2の染色体の遺伝子座を単一の反応中で、好ましくは単一の容器内に含まれる単一の反応中で増幅する。

0039

好ましくは、アッセイシステムは、血液、血漿、血清などの被験体から容易に取得することができる試料中の遺伝子座の存在または非存在を検出する。1つの一般的な態様においては、アッセイシステムは、混合試料中のcfDNA中の選択領域の検出を用いる。1つのより具体的な態様においては、アッセイシステムは、ゲノム領域中のCNVの存在または非存在および1つ以上の遺伝子座における多型の存在または非存在を同定するために個体から得た混合試料のcfDNA中の選択領域の検出を用いる。ゲノム領域内のコピー
数を、選択遺伝子座の量の検出ならびに別のゲノム領域に由来する選択遺伝子座の量および/または参照ゲノム領域に由来する選択遺伝子座の量との比較に基づいて決定することができる。特定の態様においては、核酸の頻度の比率を、遺伝的に「正常な」被験体、すなわち、アッセイシステムにおいて調査される特定の遺伝子座と関連するCNVを有さない被験体の統計的に有意な集団について決定される参照平均比率と比較する。

0040

本発明の好ましい態様においては、選択核酸に対応する増幅産物を、選択遺伝子座の分析のために個々の分子として単離する。これらの個々の増幅産物を、互いに単離する、および好ましくは物理的に単離する(例えば、基質上で、または個々の容器中で)。単離後に個々の分子をさらに増幅して、複数の同一コピーの増幅産物、その一部、または増幅産物もしくはその一部に相補的な核酸を作製することができる。

0041

好ましい態様においては、個々の増幅産物は配列決定を通じて分析される。他の態様においては、個々の増幅産物はハイブリダイゼーション技術を用いて分析される。
選択遺伝子座のコピー数を、非多型検出方法、すなわち、選択核酸領域を同定するための特定の多型の存在または非存在に依存しない検出方法を用いて検出することができることが本発明の特徴である。好ましい態様においては、アッセイ検出システムは、混合試料中に存在する選択遺伝子座の相対数を「計測する」ための非多型検出方法を用いる。これらの数を用いて、統計的に、混合試料が混合試料内の多いおよび/または少ない発生源中のゲノム領域中にCNVを有する可能性があるかどうかを決定することができる。同様に、これらの数を用いて、統計的に、多い発生源および/または少ない発生源に由来する核酸が1つ以上の多型を有するかどうかを決定することができる。そのような情報を用いて、特定の病状または遺伝的障害を同定する、疾患または障害の診断または再発を確認する、疾患または障害の予後を決定する、潜在的な治療選択肢を決定するのを補助することなどができる。

0042

いくつかの態様においては、前記アッセイシステムにより用いられる異数性の決定のための方法は、試料中の2つ以上の染色体に由来する複数の選択遺伝子座のコピー数変動を測定する。特定の染色体に対応する異なる選択遺伝子座のレベルを個別に定量および比較して、混合試料中の1つ以上の細胞源中の染色体異数性の存在または非存在を決定することができる。個別に定量された領域は、正規化計算を受けてもよく、またはそのデータを外れ値除外にかけた後、比較して、混合試料中の異数性の存在または非存在を決定してもよい。

0043

他の態様においては、選択遺伝子座の相対頻度を用いて、第1および第2の目的の染色体の染色体頻度を決定し、異数性の存在または非存在は第1および第2の目的の染色体の比較された染色体頻度に基づく。

0044

さらに他の態様においては、選択遺伝子座の相対頻度を用いて、目的の染色体および参照染色体の染色体頻度を決定し、異数性の存在または非存在は目的の染色体および参照染色体の比較された染色体頻度に基づく。

0045

本発明のアッセイシステムは好ましくは高度に多重化されたシステムとして配置されるため、個々の試料および/または複数の試料内の単一または複数の染色体に由来する複数の遺伝子座を同時に分析することができる。そのような多重化されたシステムにおいては、試料を別々に分析するか、またはより多数の試料の分析のためにそれらを2つ以上の群に最初にプールすることができる。プールされたデータが得られる場合、好ましくはそのようなデータを異なる試料について同定した後、異数性の分析を行う。しかしながら、いくつかの態様においては、プールされたデータを潜在的なCNVについて分析し、最初の結果が、異数性の可能性がプールされた群内で検出されたことを示す場合、その群に由来
する個々の試料を続いて分析することができる。

0046

特定の態様においては、アッセイシステムは、特定の試料に関する情報を提供する1つ以上の指標を用いる。例えば、指標は、核酸が増幅された試料を示唆する選択的または普遍的増幅において用いることができる。

0047

1つの特定の態様においては、選択遺伝子座を単離した後、検出する。分析のために混合試料中に存在する特定の核酸を選択的に単離する任意の手段、例えば、ハイブリダイゼーション、増幅または混合試料からの核酸の他の形態の配列に基づく単離を用いて、選択遺伝子座を混合試料から単離することができる。単離後、選択核酸を、混合試料中のそれぞれの選択核酸の配列および/または相対量の決定のために、好適な検出形式に、例えば、マイクロアレイ上、またはフローセル中に個々に分配する。検出された核酸の相対量は、混合試料中に存在する選択核酸に対応する染色体のコピー数を指示する。

0048

好適な形式での選択核酸の単離および分配後、選択配列を、例えば、選択配列の配列決定を通じて同定する。
1つの具体的な態様においては、本発明は、母体および胎児のcfDNAを含む混合試料を提供する工程、混合試料中の第1および第2の目的の染色体に由来する2つ以上の選択遺伝子座を増幅する工程、混合試料中の第1および第2の目的の染色体に由来する2つ以上の選択遺伝子座を増幅する工程、目的の染色体に由来する選択領域の相対頻度を決定する工程、第1および第2の目的の染色体に由来する選択遺伝子座の相対頻度を比較する工程、ならびに選択遺伝子座の比較された相対頻度に基づいて胎児異数性の存在または非存在を同定する工程を含む、胎児異数性の存在または非存在の検出のためのアッセイシステムを提供する。

0049

いくつかの具体的な態様においては、ゲノム領域に由来する遺伝子座の相対頻度を個々に算出し、個々の遺伝子座の相対頻度を比較して、染色体異常の存在または非存在を決定する。他の具体的な態様においては、選択遺伝子座の相対頻度を用いて、第1および第2の目的の染色体ならびに参照染色体の染色体頻度を決定し、染色体または染色体のゲノム領域に関するコピー数変動は、第1および第2の目的の染色体の比較された染色体頻度に基づく。

0050

分析に用いられる混合試料は、本発明のアッセイシステムを用いて分析しようとする目的の核酸を含有する任意の試料から取得または誘導することができる。例えば、混合試料は、限定されるものではないが、母体血漿母体血清、または母体血液を含む、母体および胎児の両方の無細胞核酸を含む任意の母体体液に由来するものであってよい。移植患者に由来する混合試料は、ドナー細胞および患者の細胞の両方に由来する無細胞核酸を含有する任意の液体または組織であってよい。悪性腫瘍を有する患者からの混合試料は、患者の正常な、健康な組織に由来する無細胞核酸ならびに癌細胞に由来する無細胞核酸を含む。

0051

アッセイシステムは、混合試料中のcfDNAを検出するために用いられることが好ましいが、特定の態様においては、本発明のアッセイシステムを用いて分析される目的のDNAは、多い細胞種および少ない細胞種に由来するDNAを含有する混合試料に由来するよりもむしろ、異なる細胞種に直接由来するDNAを含む。そのような試料は、標的DNAに依存する様々な発生源から取得することができる。例えば、分析のための胎児細胞を、羊水胎盤(例えば、絨毛膜)などの試料から誘導することができる。ドナー器官の試料は、生検により個体中で取得することができる。感染性生物は個体から直接単離し、単離後に分析することができる。DNAは癌細胞または組織から抽出し、分析に用いることができる。

0052

混合試料から単離され、前記アッセイシステムにおいて検出される実質的な大部分の核酸が、混合試料中の特定の遺伝子座の存在、量および/または多型性に関連する情報を提供することが本発明の別の特徴である。これにより、本発明のアッセイシステムにおいて分析される大部分の核酸が情報を有することが確保される。

0053

いくつかの態様においては、複数の選択遺伝子座のセットをそれぞれのゲノム領域について調査し、混合試料中に存在する選択領域のセットの量を個々に合計して、混合試料中のゲノム領域の相対頻度を決定する。これは、混合試料中に存在する組み合わせた母体および胎児のDNAに関する遺伝子座の頻度の決定を含む。好ましくは、決定は別々の発生源に由来するDNA間の区別を必要としないが、特定の態様においては、この情報は、全体として試料中の相対頻度の情報に加えて取得することができる。

0054

好ましい態様においては、情報遺伝子座に対応する選択核酸を検出、合計して、混合試料中のゲノム領域の相対頻度を決定する。混合試料中の第2の遺伝子座に由来する遺伝子座と比較した場合に第1のゲノム領域に由来する遺伝子座について予想されるものよりも高い頻度は、混合試料中の第1のゲノム領域のCNVを指示する。

0055

ゲノム領域の比較は、染色体の一部または全部の比較であってよい。例えば、CNVについて検出されたゲノム領域は、両方が異数性である可能性が最小である場合、胎児における全染色体(例えば、第18および21染色体)であってよい。これはまた、一方が異数性であると推定され(例えば、第21染色体)、他方が参照染色体(例えば、第2染色体などの常染色体)として作用する染色体の比較であってもよい。さらに他の態様においては、比較は、異数性であると推定される2つ以上の染色体および1つ以上の参照染色体を用いることができる。

0056

1態様においては、本発明のアッセイシステムは、目的の染色体上の選択遺伝子座を表す複数の核酸を分析し、試料に由来するそれぞれの選択遺伝子座の相対頻度を分析して、試料中のそれぞれの特定の目的の染色体に関する相対染色体頻度を決定する。次いで、2つ以上の染色体またはその一部の染色体頻度を比較して、染色体異常が存在するかどうかを統計的に決定する。

0057

別の態様においては、本発明のアッセイシステムは目的の染色体上の選択遺伝子座の複数コピーのセットを分析し、試料に由来するそれぞれの選択遺伝子座の相対頻度を分析し、独立に定量して、試料中のそれぞれの選択遺伝子座に関する頻度を決定する。試料中の遺伝子座の合計を比較して、混合試料中の1つの発生源のゲノム領域中の1つ以上の遺伝子座についてCNVが存在するかどうかを統計的に決定する。

0058

別の態様においては、それぞれの染色体上の遺伝子座のサブセットを分析して、染色体異常が存在するかどうかを決定する。遺伝子座頻度を特定の染色体について合計し、遺伝子座の合計を用いて異数性を決定することができる。本発明のこの態様は、それぞれのゲノム領域中の個々の遺伝子座の頻度を合計した後、ある染色体のゲノム領域上の遺伝子座の合計を別の染色体のゲノム領域に対して比較して、染色体異常が存在するかどうかを決定する。遺伝子座のサブセットを無作為であるが、染色体異常が存在するかどうかを決定する際に統計的に有意な結果をもたらすのに十分な数の遺伝子座を用いて選択することができる。異なる遺伝子座のサブセットの複数の分析を混合試料内で実施して、より高い統計力を得ることができる。別の態様においては、試料間であまり変動しないことが知られるか、または染色体頻度の決定に用いられるデータを制限することにより、例えば、試料内の非常に高いか、もしくは非常に低い頻度を有する遺伝子座に由来するデータを無視することにより、特定の遺伝子座を選択することができる。

0059

特定の態様においては、1つ以上の特定の遺伝子座の測定された量を正規化して、試料中の遺伝子座の量の差異を説明する。アッセイシステム(例えば、温度、試薬ロット相違)、試料の基本的な生物学(例えば、核酸含量)、操作者の相違、または任意の他の変数などの発生源に由来する既知の変動を正規化することにより、これを行うことができる。

0060

特定の具体的な態様においては、混合試料中の少ない発生源に由来する核酸の相対割合の決定が、その試料中の少ない発生源内のコピー数変動を示し得る遺伝子座の相対的な統計的存在に関する重要な情報を提供するため、アッセイシステムを実施するのに有益であり得る。少ない発生源に由来する混合試料に寄与した遺伝子座の決定は、目的のゲノム領域に関する頻度の統計的に有意な差異を算出するのに用いられる情報を提供することができる。かくして、そのような遺伝子座は、アッセイにおいて2つの形態の情報を提供することができる−対立遺伝子情報は混合試料中の少ない細胞の寄与率を決定するのに用いることができ、対立遺伝子情報の合計は混合試料中のその遺伝子座の相対的な全体の頻度を決定するのに用いることができる。対立遺伝子情報はその遺伝子座の相対的な全体の頻度を決定するのに必要とされない。

0061

別の具体的な態様においては、本発明のアッセイシステムを用いて、細胞集団中の潜在的なモザイク現象、ならびに多いおよび/または少ない発生源におけるモザイク現象の同定を確認するためにさらなる確認試験を行うべきであるかどうかを決定することができる。特定の例においては、混合試料中の少ない発生源に由来する核酸のパーセントの決定は、モザイク現象の見積もられたレベルの定量を補助することができる。続いて、特定の細胞または組織におけるモザイクの完全または部分的な異数性を識別することができる他の試験法を用いて、モザイク現象を確認することができる。

0062

さらに別の具体的な態様においては、本発明のアッセイシステムを用いて、少ない種が夾雑種である、試料中の夾雑を決定することができる。
別の態様においては、所与の選択核酸のオリゴヌクレオチドを、環状または単分子プローブがそれに結合することができるように、非配列特異的末端で接続することができる。この態様においては、環状プローブの3’末端および5’末端は、選択遺伝子座に結合し、少なくとも1つのユニバーサル増幅領域が環状プローブの選択されていない特異的配列中に存在する。

0063

増幅産物を、初期混合試料から多型領域富化を要することなく直接分析することができることがアッセイの重要な特徴である。かくして、本発明は、選択遺伝子座の配列決定の前に介入多型富化工程を行うことなく母体試料に由来するCNVおよび多型の両方の検出を可能にする。

0064

選択増幅および検出の標的化手法を用いてCNVおよび発生源寄与の両方を決定することが、アッセイの別の重要な特徴である。これにより、アッセイにおいて集められた情報の大部分がCNVおよび/または発生源寄与の決定にとって有用になり、参照配列整列させなければならない配列リードを生成させる必要性を取り除くことができる。

0065

これらのおよび他の態様、特徴および利点を本明細書に記載のようにより詳細に提供する。

図面の簡単な説明

0066

本発明のアッセイシステムにおいて用いられる全工程の単純化された流れ図。
本発明の連結に基づくアッセイシステムの第1の全体図。
本発明の連結に基づくアッセイシステムの第2の全体図。
本発明の連結に基づくアッセイシステムの第3の全体図。
本発明の1アッセイシステムを用いて得られた遺伝子型決定性能を例示する図。
本発明のアッセイを用いた胎児パーセントの決定の結果を例示するグラフ
母体試料の2つのコホートに関する異数性および多型の検出に用いられる要素を示す図。
妊娠被験体の第2のコホートのサブセットに関する患者の概要および試料情報およびデータを示す図。
妊娠被験体の第2のコホートのサブセットに関する患者の概要および試料情報およびデータを示す図。
妊娠被験体の第2のコホートのサブセットに関する患者の概要および試料情報およびデータを示す図。
妊娠被験体の第2のコホートのサブセットに関する患者の概要および試料情報およびデータを示す図。
妊娠被験体の第2のコホートのサブセットに関する患者の概要および試料情報およびデータを示す図。
第1のコホートに関して本発明の1態様を用いて達成された第21染色体の異数性検出を例示する図。
第1のコホートに関して本発明の1態様を用いて達成された第18染色体の異数性検出を例示する図。
第2のコホートに関して本発明の1態様を用いて達成された第21染色体の異数性検出を例示する図。
第2のコホートに関して本発明の1態様を用いて達成された第18染色体の異数性検出を例示する図。

実施例

0067

(定義)
本明細書で用いられる用語は、当業者によって理解されるような平易で通常の意味を有することが意図される。以下の定義は、読者が本発明を理解するのを助けることを意図されるものであって、具体的に指摘しない限りそのような用語の意味を変化させるか、またはさもなければ制限することを意図されるものではない。

0068

用語「増幅された核酸」は、混合試料中のその出発量と比較して、インビトロ(in vitro)で実施された任意の核酸増幅法または複製方法によって量が少なくとも2倍増加した任意の核酸分子である。

0069

本明細書で用いられる用語「増幅産物」とは、鋳型として連続的連結産物を用いる増幅反応から生じる産物、または鋳型として連続的連結産物に相補的な分子を用いる増幅反応から生じる産物を指す。

0070

用語「染色体異常」とは、単一の遺伝子座よりも大きい染色体の全部または一部に影響する任意の遺伝的変化を指す。遺伝子変異体は、限定されるものではないが、増幅または欠失、転座、逆位、および突然変異などの任意のCNVを含んでもよい。染色体異常の例としては、限定されるものではないが、ダウン症候群(トリソミー21)、エドワード症候群(トリソミー18)、パトー症候群(トリソミー13)、クラインフェルター症候群(XXY)、トリプルX症候群、XYY症候群、トリソミー8、トリソミー16、ターナー症候群ロバートソン転座ディジョージ症候群およびヴォルフ・ヒルシュホルン症候群が挙げられる。

0071

用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成規則により関連する核酸分子(すなわち、ヌクレオチドの配列)を参照して用いられる。相補的ヌクレオチドは、一般に、AとT(もしくはAとU)、またはCとGである。2つの一本鎖RNAまたはDNA分子は、最適に整列され、好適なヌクレオチド挿入または欠失を有する、一方の鎖のヌクレオチドが、少なくとも約90%〜約95%の相補性、およびより好ましくは約98%〜約100%の相補性、およびさらにより好ましくは100%の相補性で対形成する場合、実質的に相補的であると言われる。あるいは、RNAまたはDNA鎖がその相補体に選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合、実質的な相補性が存在する。選択的ハイブリダイゼーション条件としては、限定されるものではないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約1M未満、より通常は約500mM未満および好ましくは約200mM未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、一般に、融点(Tm)よりも少なくとも約2℃〜約6℃低い。

0072

本明細書で互換的に用いられる用語「コピー数変動」または「CNV」は、DNA中の1つ以上の遺伝子座の異常な数のコピーを有する細胞をもたらすゲノムのDNAの変化である。臨床的に関連するCNVは、単一の遺伝子に限られるか、または遺伝子の連続するセットを含んでもよい。CNVはまた、完全な染色体の1つ以上のさらなるコピーを含むものまで、特定の染色体上で欠失、逆位または複製したゲノムの比較的大きい領域に一致してもよい。本明細書で用いられる用語「CNV」は、任意の配列関連情報を指すものではなく、むしろ試料中に存在する遺伝子領域の量または「計数」を指すものである。

0073

用語「補正指標」とは、増幅、配列決定または配列決定中の1つ以上の塩基の欠失、置換もしくは挿入ならびにオリゴ合成、増幅、およびアッセイの他の態様などの配列決定の外部で起こり得るヌクレオチド変化の検出を含む他の実験誤差の同定および補正を可能にするさらなるヌクレオチドを含んでもよい指標を指す。これらの補正指標は、別々の配列である独立指標であってよく、またはそれらを他の領域内に埋込んで、用いられる実験技術正確度を確認するのを助けることができる、例えば、補正指標はユニバーサル増幅に用いられる配列のサブセットまたは試料遺伝子座のヌクレオチドのサブセットであってもよい。

0074

本明細書で用いられる用語「診断ツール」とは、例えば、診断試験または患者試料に対するアッセイを実行するためのシステムにおいて組み合わせて用いられる本発明の任意の組成物またはアッセイを指す。

0075

用語「疾患形質」とは、病理学的状態、例えば、疾患、障害、症候群または素因と関連する単一遺伝子または多遺伝子形質を指す。
本明細書で用いられる用語「ゲノム領域」とは、ゲノム中に連続的様式で通常認められる1つ以上の遺伝子座の任意の領域を指す。ゲノム領域は、最大で染色体全体を含むものまでサイズが変化してもよい。

0076

用語「ハイブリダイゼーション」は一般に、核酸の相補鎖の対形成が起こる反応を意味する。DNAは通常二本鎖であり、鎖が分離された場合、それらは好適な条件下で再度ハイブリダイズする。ハイブリッドはDNA−DNA、DNA−RNAまたはRNA−RNAの間で形成することができる。それらは、短い鎖と、短い鎖に相補的な領域を含む長い鎖との間で形成することができる。不完全なハイブリッドも形成することができるが、それらがより不完全であるほど、それらはより不安定である(形成する可能性が低くなる)。

0077

本明細書で用いられる用語「情報遺伝子座」とは、特定の染色体またはある染色体の全部もしくは一部のCNVを決定する目的で調査されたその染色体の一部の上のある細胞源にとってホモ接合性であり、第2の細胞源にとってヘテロ接合性である遺伝子座を指す。本発明のアッセイシステムにおける使用のための情報遺伝子座としては、参照染色体の調査のために用いられる遺伝子座ならびに細胞源中で異数性であると推定される染色体の調査のために用いられる遺伝子座が挙げられる。情報遺伝子座はまた、単一の個体内の異なる個体に由来する細胞源中の遺伝子座のコピー数を識別することもできる(例えば、移植レシピエントにおける移植ドナー細胞の検出または母体混合試料内の胎児DNAの検出)。

0078

本明細書で用いられる用語「遺伝子座」とは、ゲノム中の既知の位置の遺伝子座を指す。
用語「多い発生源」とは、ある個体由来の試料中の核酸(当該個体において支配的なゲノム材料を表す)の発生源を指す。

0079

本明細書で用いられる用語「母体試料」とは、胎児および母体の両方の無細胞ゲノム材料(例えば、DNA)を含む妊娠した哺乳動物から採った任意の試料を指す。好ましくは、本発明における使用のための母体試料は、比較的非侵襲的な手段、例えば、静脈切開術または被験体から末梢試料を抽出するための他の標準的な技術により得られる。

0080

用語「融解温度」または「Tm」は、一般的に二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖解離するようになる温度と定義される。核酸のTmを算出するための式は当業界で周知である。標準的な参考文献により示されるように、Tm値の単純な見積もりを、核酸が0.5M以下の陽イオン濃度を有する水溶液中にあり、(G+C)含量が30%〜70%であり、nが塩基数であり、mが塩基対不一致の割合である場合、式:Tm=81.5+16.6(log10[Na+])0.41(%[G+C])−675/n−1.0mにより算出することができる(例えば、サムルックジェイら(Sambrook J et
al.),Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)を参照されたい)。他の参考文献は、Tmの算出のために構造ならびに配列の特徴を考慮に入れる、より洗練された計算を含む。

0081

「マイクロアレイ」または「アレイ」とは、アレイのそれぞれの部位が、実質的に同一の、または同一のコピーのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドからなり、空間的に規定され、アレイの他のメンバーの部位と重複しない、すなわち、部位が空間的に別個のものであるような核酸を含有する部位のアレイを担持する、表面、好ましくは全く平面的ではなく、または実質的に平面的な表面を有する固相支持体を指す。アレイまたはマイクロアレイはまた、ビーズまたはウェルなどの表面を有する非平面的な調査可能な構造からなってもよい。アレイのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを固相支持体に共有結合させるか、または非共有結合させることができる。従来のマイクロアレイ技術は、例えば、シーナ(Schena),Ed.,Microarrays:A Practical Approach,IRL Press,Oxford(2000)に概説されている。「アレイ分析」、「アレイによる分析」または「マイクロアレイによる分析」とは、例えば、マイクロアレイを用いる1つ以上の生物分子配列分析などの分析を指す。

0082

用語「少ない発生源」とは、限られた量で存在し、そのゲノム構成および/または発現における差異に起因して多い発生源から識別可能である、個体内の核酸の発生源を指す。少ない発生源の例としては、限定されるものではないが、妊娠女性における胎児細胞、悪性腫瘍を有する患者における癌細胞、移植患者におけるドナー器官に由来する細胞、感染
した宿主における感染性生物に由来する核酸などが挙げられる。

0083

本明細書で用いられる用語「混合試料」とは、一方が多い発生源であり、他方が単一の個体内の少ない発生源である、2つ以上の目的の細胞種(細胞タイプ)に由来する無細胞ゲノム材料(例えば、DNA)を含む任意の試料を指す。混合試料の例としては、母体試料(例えば、母体および胎児の両方のDNAを含む母体の血液、血清または血漿)、ならびに末梢由来体細胞試料(例えば、異なる細胞種、例えば、造血細胞間葉細胞、および他の器官系に由来する循環細胞を含む血液、血清または血漿)が挙げられる。混合試料は、個体における多い発生源および少ない発生源の両方に由来するゲノム材料を含む試料を含み、例えば、正常な体細胞および非定型体細胞、または2つの異なる個体に由来するゲノムを含む細胞であってよく、2つの異なる個体に由来するとは、例えば、母体および胎児の両方のゲノム材料を含む試料、またはドナーおよびレシピエントの両方に由来する細胞を含む移植患者に由来する試料を含む。

0084

本明細書で用いられる用語「単一遺伝子形質」とは、単一の遺伝子中の突然変異または多型と関連する、正常な、または病理学的な任意の形質を指す。そのような形質としては、単一の遺伝子における機能障害により引き起こされる疾患、障害、または素因と関連する形質が挙げられる。形質はまた、非病理学的特徴(例えば、特定の細胞種上の細胞表面分子の存在または非存在)も含む。

0085

用語「非母体」対立遺伝子は、胎児対立遺伝子(de novoでのSNPもしくは突然変異を有する対立遺伝子)および/または親対立遺伝子中に認められるが、母体対立遺伝子中には認められない多型および/または突然変異を有する対立遺伝子を意味する。

0086

選択遺伝子座の検出に関して用いられる場合、「非多型」とは、1つ以上の多型を含んでもよいが、検出が領域内の特定の多型の検出に依らない、そのような遺伝子座の検出を意味する。かくして、選択遺伝子座は多型を含んでもよいが、本発明のアッセイシステムを用いる領域の検出は、その領域中の特定の多型の存在または非存在よりもむしろ領域の発生に基づく。

0087

本明細書で用いられる「ヌクレオチド」とは、塩基−糖−リン酸の組合せを指す。ヌクレオチドは、核酸配列(DNAおよびRNA)のモノマー単位である。用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオシド三リン酸ATPUTP、CTG、GTPおよびdATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTPなどのデオキシリボヌクレオシド三リン酸、またはその誘導体を含む。そのような誘導体としては、例えば、[αS]dATP、7−デアザ−dGTPおよび7−デアザ−dATP、ならびにヌクレオチド誘導体を含有する核酸分子に対してヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体が挙げられる。本明細書で用いられる用語「ヌクレオチド」はまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddNTP)およびその誘導体をも指す。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例としては、限定されるものではないが、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP、およびddTTPが挙げられる。

0088

本発明によれば、「ヌクレオチド」は標識されていないか、または周知の技術により検出可能に標識されていてもよい。蛍光標識およびオリゴヌクレオチドへのその付着は、ハウグランド(Haugland),Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,9th Ed.,Molecular Probes,Inc.,Eugene OR(2002);ケラー(Keller)およびマナク(Manak),DNA Probes,2nd Ed.,Stockton Press,New York(1993);エクステイン(Eckstein),Ed.,Oligonucleotides and Analogue
s:A Practical Approach,IRL Press,Oxford(1991);ウェットムール(Wetmur),Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology,26:227−259(1991)などの多くの概説に記載されている。本発明に適用可能な他の方法は、以下の参考文献:ファングら(Fung et al.),米国特許第4,757,141号;ホブス ジュニアら(Hobbs,Jr.,et al.),米国特許第5,151,507号;クルイクシャンク(Cruickshank),米国特許第5,091,519号;メンチェンら(Menchen et al.),米国特許第5,188,934号;ベゴットら(Begot et al.),米国特許第5,366,860号;リーら(Lee et al.),米国特許第5,847,162号;カナら(Khanna et al.),米国特許第4,318,846号;リーら(Lee et al.),米国特許第5,800,996号;リーら(Lee et al.),米国特許第5,066,580号;マチエスら(Mathies et al.),米国特許第5,688,648号などに開示されている。以下の特許および特許公開:米国特許第6,322,901号;第6,576,291号;第6,423,551号;第6,251,303号;第6,319,426号;第6,426,513号;第6,444,143号;第5,990,479号;第6,207,392号;米国特許出願公開第2002/0045045号および第2003/0017264号に開示されたような、量子ドットを用いて標識を実行することもできる。検出可能な標識としては、例えば、放射性アイソトープ、蛍光標識、化学発光標識生物発光標識および酵素標識が挙げられる。ヌクレオチドの蛍光標識は、限定されるものではないが、フルオレセイン、5−カルボキシフルオレセインFAM)、2’7’−ジメトキシ−4’5−ジクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(JOE)、ローダミン、6−カルボキシローダミン(R6G)、N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA)、6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX)、4−(4’ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、カスケードブルー、オレゴングリーンテキサスレッドシアニンおよび5−(2’−アミノエチルアミノナフタレン−1−スルホン酸(EDANS)を含んでもよい。蛍光標識されたヌクレオチドの具体例としては、パーキンエルマー社(Perkin Elmer)[米国カリフォルニアフォスターティ(FosterCity)所在]から入手可能な[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP、および[dROX]ddTTP;アマシャム社(Amersham)[米国イリノイアーリントハイツ(Arlington Heights)所在]から入手可能なFluoroLink Deoxy Nucleotides、FluoroLink Cy3−dCTP、FluoroLink Cy5−dCTP、FluoroLink FluorX−dCTP、FluoroLink Cy3−dUTP、およびFluoroLink Cy5−dUTP;ベーリンガーマンハイム社(Boehringer Mannheim)[米国インディアナ州インディアナポリス(Indianapolis)所在]から入手可能なフルオレセイン−15−dATP、フルオレセイン−12−dUTP、テトラメチル−ローダミン−6−dUTP、IR770−9−dATP、フルオレセイン−12−ddUTP、フルオレセイン−12−UTP、およびフルオレセイン−15−2’−dATP;ならびにモレキュラープローブ社(Molecular Probes)[米国オレゴン州ユージーン(Eugene)所在]から入手可能なChromosomee Labeled Nucleotides、BODIPY−FL−14−UTP、BODIPY−FL−4−UTP、BODIPY−TMR−14−UTP、BODIPY−TMR−14−dUTP、BODIPY−TR−14−UTP、BODIPY−TR−14−dUTP、カスケードブルー−7−UTP、カスケードブルー−7−dUTP、フルオレセイン−12−UTP、フルオレセイン−12−d
UTP、オレゴングリーン488−5−dUTP、ローダミングリーン−5−UTP、ローダミングリーン−5−dUTP、テトラメチルローダミン−6−UTP、テトラメチルローダミン−6−dUTP、テキサスレッド−5−UTP、テキサスレッド−5−dUTP、およびテキサスレッド−12−dUTPが挙げられる。

0089

本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」とは、ワトソンクリック型の塩基対形成、塩基スタッキング、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型の塩基対形成などの規則的なパターンモノマー相互作用により一本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる、デオキシリボヌクレオチドリボヌクレオチド、そのアノマー形態、ペプチド核酸モノマー(PNA)、ロックドヌクレオチド酸モノマー(LNA)など、またはその組合せを含む天然または改変核酸モノマーの線状オリゴマーを指す。通常、モノマーはホスホジエステル結合またはその類似体により連結されて、数個のモノマー単位、例えば、8〜12個から数十個のモノマー単位、例えば、100〜200個以上の大きさの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。好適な核酸分子を、ボーケージ(Beaucage)およびカルターズ(Carruthers)(Tetrahedron Lett.,22:1859−1862(1981))により記載されたホスホルアミダイト法により、またはマテウッチら(Matteucci et al.)(J.Am.Chem.Soc.,103:3185(1981))によるトリエステル法により(両方とも本明細書に援用する)、または市販の自動化オリゴヌクレオチド合成装置を用いるなどの他の化学的方法により調製することができる。

0090

本明細書で用いられる用語「多遺伝子形質」とは、2つ以上の遺伝子における突然変異または多型と関連する正常な、または病理学的な任意の形質を指す。そのような形質としては、2つ以上の遺伝子における機能障害により引き起こされる疾患、障害、症候群、または素因と関連する形質が挙げられる。形質はまた、2つ以上の遺伝子の相互作用と関連する非病理学的特徴をも含む。

0091

本明細書で用いられる用語「ポリメラーゼ」とは、鋳型として別の鎖を用いて、個々のヌクレオチドを長い鎖に一緒に連結する酵素を指す。2つの一般的な種類のポリメラーゼ−DNAを合成するDNAポリメラーゼ、およびRNAを合成するRNAポリメラーゼが存在する。これらの2つのクラスの中に、どの種類の核酸が鋳型として機能することができ、どの種類の核酸が形成されるかに応じて、いくつかのサブタイプのポリメラーゼが存在する。

0092

本明細書で用いられる「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」とは、過剰の非特異的DNAの存在下でも、in vitroで選択DNAの特定の小片を複製するための技術を指す。プライマーを選択DNAに添加すると、プライマーはヌクレオチドおよび典型的には、Taqポリメラーゼなどを用いて選択DNAのコピーを開始する。温度を循環させることにより、選択DNAは変性およびコピーを繰り返す。他の無作為のDNAと混合した場合でも、1コピーの選択DNAを増幅して、数十億の複製物を得ることができる。ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、非常に少量のDNAを検出および測定し、DNAの特製小片を作製することができる。いくつかの例においては、線状増幅法をPCRの代替として用いることができる。

0093

本明細書で用いられる用語「多型」とは、限定されるものではないが、単一ヌクレオチド多型(SNP)、メチル化差異、ショートタンデムリピート(STR)、単一遺伝子多型、点突然変異トリヌクレオチドリピートインデルを含む任意の遺伝子変化または遺伝子座の配列変異体を指す。

0094

一般に、「プライマー」は、ポリメラーゼ連鎖反応の合成工程または特定の配列決定反
応において用いられるプライマー伸長技術などにおいて主DNAの伸長、連結および/または合成を準備するのに用いられるオリゴヌクレオチドである。プライマーはまた、特定の遺伝子座の検出のための捕捉オリゴヌクレオチドに遺伝子座の相補性を提供するための手段としてハイブリダイゼーション技術において用いることもできる。

0095

本明細書で用いられる用語「研究ツール」とは、薬理学的および/または生物学的治療剤の開発を含む、科学的探求、事実上は学問的または商業的探求に用いられる本発明の任意の組成物またはアッセイを指す。本発明の研究ツールは、治療剤または規制認可にかけられることを意図するものではなく、むしろ、本発明の研究ツールは研究を容易にし、規制当局への提出支援するための情報をもたらす意図をもって実施される任意の活動を含むそのような開発活動を補助することを意図されるものである。

0096

用語「試料指標」とは、一般に、一連の独自のヌクレオチド(すなわち、それぞれの試料指標は複数の試料の分析のための多重化されたアッセイシステム中の試料にとって独自である)を指す。かくして、試料指標を用いて、それぞれの試料をその試料指標に基づいて同定することができるように、単一の反応容器中の異なる試料の多重化のための遺伝子座同定を補助することができる。好ましい態様においては、試料のセット中のそれぞれの試料について独自の試料指標が存在し、試料は配列決定の間にプールされる。例えば、12の試料が単一の配列決定反応中にプールされる場合、それぞれの試料が独自に標識されるように少なくとも12の独自の試料指標が存在する。

0097

本明細書で用いられる用語「選択遺伝子座」とは、例えば、コピー数、1つ以上の多型の存在または非存在、感染性生物の存在または非存在などについて調査された遺伝子座に対応する遺伝子座を指す。そのような選択遺伝子座を、ハイブリダイゼーションおよび/または他の配列に基づく技術に基づいて直接単離し、検出のために試料から増幅させるか、またはそれらを配列の検出の前に鋳型として試料を用いて増幅させることができる。本発明のアッセイシステムにおける使用のための核酸領域を、個体間のDNAレベルの変動に基づいて、特定の染色体に対する特異性に基づいて、選択遺伝子座のCG含量および/もしくは必要とされる増幅条件に基づいて、または本開示を読む際に当業者に明らかである他の特徴に基づいて選択することができる。

0098

本明細書で用いられる用語「配列決定(sequencing)」、「配列決定(sequence determination)」などは、一般に、核酸中のヌクレオチド塩基順序を決定するのに用いることができる任意かつ全ての生化学的方法を指す。

0099

本明細書で用いられる用語「発生源寄与」とは、個体内の核酸の2つ以上の発生源の相対的寄与を指す。単一からの寄与は、一般に、試料からの核酸のパーセントとして決定されるが、任意の相対的測定値を用いてもよい。

0100

用語「特異的に結合する」、「特異的結合」などは、指定されたアッセイ条件下で統計的に有意な正のシグナルの生成をもたらす結合パートナー(例えば、核酸プローブまたはプライマー、抗体など)を指す場合に本明細書で用いられる。典型的には、続いて、相互作用は、望ましくない相互作用(バックグラウンド)の結果として生成された任意のシグナルの標準偏差の少なくとも2倍である検出可能なシグナルをもたらす。

0101

遺伝子との関係において本明細書で用いられる用語「状態」とは、特定の遺伝子からの翻訳および/またはタンパク質発現に影響するコード領域および非コード領域を含む、その遺伝子の対立遺伝子の配列の状態を指す。軟骨形成不全症(例えば、線維芽細胞増殖因子受容体をコードする遺伝子)もしくはハンチントン病(例えば、ハンチンチン遺伝子)、または男性胎児の場合のX連鎖疾患などの常染色体優性疾患と関連する遺伝子の状態を
罹患、すなわち、ある対立遺伝子が疾患もしくは障害の原因である突然変異を有する、または非罹患、すなわち、両方の対立遺伝子がそのような突然変異を欠く、と分類することができる。常染色体劣性疾患と関連する遺伝子またはX連鎖劣性障害と関連する母体遺伝子の状態を、罹患、すなわち、両方の対立遺伝子が疾患もしくは障害の原因となる突然変異を有する;キャリア、すなわち、ある対立遺伝子が疾患もしくは障害の原因となる突然変異を有する;または非罹患、すなわち、両方の対立遺伝子がそのような突然変異を欠く、と分類することができる。遺伝子の状態は、多遺伝子病を発症する危険性と関連する特定の対立遺伝子、例えば、特定の疾患もしくは障害に対して保護的である多型または特定の疾患もしくは障害の危険性の増強と関連する多型の存在または非存在を示唆することもできる。

0102

(発明の詳細な説明)
本明細書に記載のアッセイシステムおよび方法は、別途指摘しない限り、当業者の技術の範囲内にある、分子生物学組換え技術を含む)、細胞生物学、生化学、マイクロアレイおよび配列決定技術の従来の技術および説明を用いてもよい。そのような従来の技術としては、ポリマーアレイ合成、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび連結、オリゴヌクレオチドの配列決定、ならびに標識を用いるハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。好適な技術の具体的な例示は、本明細書に記載の実施例を参照することにより有することができる。しかしながら、等価な従来の手順も、勿論、用いることができる。そのような従来の技術および説明は、グリーンら(Green et al.),Eds.,Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I−IV)(1999);ワイナーら(Weiner et al.),Eds.,Genetic Variation:A Laboratory
Manual(2007);ディフェンバッハ(Dieffenbach),ドベクスラー(Dveksler),Eds.,PCRPrimer:A Laboratory Manual(2003);ボウテル(Bowtell)およびサムブルック(Sambrook),DNA Microarrays:A Molecular Cloning Manual(2003);マウント(Mount),Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis(2004);サムブルック(Sambrook)およびラッセル(Russell),Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2006);ならびにサムブルック(Sambrook)およびラッセル(Russel),Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2002)(全てCold Spring Harbor Laboratory Pressから);ストライヤーエル(Stryer,L.),Biochemistry(4th Ed.)ダブルユーエイフリーマン(W.H.Freeman),New York(1995);ゲイト(Gait),“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”IRL Press,London(1984);ネルソン(Nelson)およびコックス(Cox),Lehninger,Principles of Biochemistry,3rd Ed.,W.H.Freeman Pub.,New
York(2000);ならびにバーグら(Berg et al.),Biochemistry,5th Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York(2002)(全てあらゆる目的でその全体を本明細書に援用する)などの標準的な実験室マニュアル見出すことができる。本発明の組成物、研究ツールおよび方法を説明する前に、本発明が記載される特定の方法、組成物、標的および使用に限定されず、そのようなものとして、勿論、変化してもよいことが理解されるべきである。また、本明細書で用いられる用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

0103

本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる単数形「a」、「an」および「the」は、本文が別途明確に述べない限り、複数の指示対象を含むことに留意すべきである。かくして、例えば、「遺伝子座(a locus)」に対する参照は、1つの領域、1より多い領域、またはそのような領域の混合物を指し、「アッセイ(an assay)」に対する参照は当業者には公知の等価な工程および方法に対する参照などを含む。

0104

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間のそれぞれの途中の値およびその記述される範囲中の任意の他の記述されるか、または途中の値が本発明に包含される。記述された値が上限および下限を含む場合、これらの含まれる限界のいずれかを除く範囲も本発明に含まれる。

0105

明確に記述しない限り、本明細書で用いられる用語は当業者によって理解されるような平易かつ通常の意味を有することが意図される。以下の定義は、読者が本発明を理解するのを助けることを意図するものであるが、具体的に指摘しない限りそのような用語の意味を変化させるか、またはさもなければ限定することを意図するものではない。本明細書に記載の全ての刊行物は、その刊行物に記載され、本願で説明される発明と関連して用いることができる製剤および方法を説明および開示する目的で本明細書に援用される。

0106

以下の説明において、いくつかの具体的な詳細を、本発明のより完全な理解を提供するために記載する。しかしながら、本発明は1つまたは複数のこれらの具体的な詳細がなくても実施することができることが当業者には明らかである。他の例においては、本発明を不明確にするのを避けるために、周知の特徴および当業者には周知の手順は記載されていない。

0107

(一般的な本発明)
本発明は、単一の個体からの混合試料中の疾患状態と関連するコピー数変動、多型および核酸(例えば、病原体に由来する核酸、または癌、糖尿病アルツハイマー病などと関連する核酸)を検出する能力を有する単一のアッセイシステムを提供する。前記アッセイは、試料中の選択遺伝子座のコピー数に関する情報ならびに試料中の多い発生源および1つ以上の少ない発生源に由来する核酸の寄与の割合に関する情報を用いる、混合試料中の1つ以上の少ない発生源における遺伝子変動の同定を可能にする。これらの方法は、単一の個体中に存在する多いおよび少ない発生源に由来するゲノム材料(例えば、DNA)を含有する任意の混合試料にとって有用である。

0108

本発明のアッセイ方法における選択遺伝子座の使用は、混合試料内の1つ以上の発生源におけるコピー数変動の決定のための遺伝子座の直接検出を提供する。本発明の注目すべき利点は、コピー数変動および/または多型に対応する選択遺伝子座を、限定されるものではないが、ハイブリダイゼーション技術、デジタルPCRおよび高効率配列決定技術を含む様々な検出および定量技術を用いてさらに分析できることである。任意の染色体に関する任意の数の選択遺伝子座に対してプローブを設計することができる。選択遺伝子座の同定および定量の前の増幅は義務ではないが、検出の前に混合試料の限定的な増幅を用いて、出発材料内の核酸の全体数を拡張することができる。

0109

図1は、本発明のアッセイシステムにおいて用いられる全工程の単純化された流れ図である。図1は方法100を示し、第1の工程110において、混合された核酸試料が分析のために提供される。そのような技術は当業者には公知であるため、混合試料を実質的に任意の試料から調製することができる(例えば、ティエツ(Tietz),Textbood of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics,4th Ed.,Chapter 2,バーティス シー(Burtis,C.)アッシュウッドイー(Ashwood E.)およびブランスディ
ー(Bruns,D.)eds.(2006);Chemical Weapons Convention Chemicals Analysis:Sample Collection,Preparation and Analytical Method,メシラクソエム(Mesilaakso,M.),ed.,(2005);パウリスジン ジェイ(Pawliszyn,J.),Sampling and Sample
Preparation for Field and Laboratory,(2002);ベンカテシュ イエンガー ジーら(Venkatesh Iyengar,G.,et al.),Element Analysis of Biological Samples:Principles and Practices (1998);ドリエラックエス(Drielak,S.),Hot Zone Forensics:Chemical,Biological,and Radiological Evidence Collection(2004);ウェルズディー(Wells,D.),High Throughput Bioanalytical Sample Preparation(Progress in Pharmaceutical
and Biomedical Analysis)(2002)(それぞれ本明細書に援用する)を参照されたい)。選択された混合試料の種類に応じて、さらなるプロセッシングおよび/または精製工程を実施して、所望の純度またはサイズの核酸断片を取得することができる。超音波処理噴霧化ゲル精製、PCR精製系、ヌクレアーゼ切断、またはこれらの方法の組合せを含むプロセッシング方法を用いることができるが、これらに限定されるものではない。好ましい態様においては、無細胞DNA(cfDNA)を含む試料を用いる。

0110

工程120で、第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、混合核酸試料に、第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドが混合核酸試料にハイブリダイズすることができる条件下で導入する。第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドは、混合試料中の1つ以上の選択遺伝子座に相補的である核酸配列からなり、本明細書で詳細に説明されるように、コピー数変動および/または染色体異常を決定するのに有用である。コピー数変動および/または染色体異常を決定することができる核酸配列は、増幅または欠失、異数性、転座、または逆位などの染色体異常の同定を可能にする配列を含む。

0111

工程130では、第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを、混合核酸試料および第1のセットの固定配列オリゴヌクレオチドに、第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドが混合核酸試料にハイブリダイズすることができる条件下で導入する。第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドは、多型を検出することができる、混合試料中の1つ以上の選択遺伝子座に相補的である核酸配列を含む。必要に応じて、洗浄工程を、工程120と130との間、および工程130と140との間に行ってもよい。

0112

工程140では、混合試料中の選択遺伝子座の隣接領域にハイブリダイズした第1および第2のセットの固定配列オリゴヌクレオチドを連結し、工程150では、連結されたオリゴヌクレオチドを増幅させる。次いで、連結および増幅されたオリゴヌクレオチドを検出および分析し、工程160でのコピー数変動または染色体異常の決定および多型の同定を可能にする。

0113

固定配列核酸のセットは、選択遺伝子座中の少なくとも2つの別々の領域にハイブリダイズするように設計される。好ましい態様においては、2つ以上の別々のオリゴを用いてこれらの領域にハイブリダイズさせて、選択遺伝子座に相補的な隣接核酸を提供する。しかしながら、いくつかの態様においては、いわゆる「パドロックプローブ」または「分子反転プローブMIP)」などのプレサーキュラ(precircular)プローブを含む選択遺伝子座に相補的である2つ以上の異なる非隣接領域を含む単一のプローブを用いることができる。

0114

本発明は、大規模並行配列決定、ショットガン配列決定、およびCNVを検出ために他者により用いられた無作為デジタルPCRの使用などのより無作為な技術と比較して改善されたシステムを提供する。これらの上記手法は、試料中の全ての、または統計的に有意な集団のDNA断片の配列決定、次いで、これらの断片のマッピングまたはさもなければその好適な染色体への前記断片の結合に依る。次いで、同定された断片を互いに、またはいくつかの他の参照(例えば、正常な染色体構成)に対して比較して、特定の染色体上のCNVを決定する。目的の主要な染色体のみが、混合試料中のそのようなDNA断片の検出から生成される少数のデータを構成するため、これらの方法は、本発明と比較して本質的に不十分である。

0115

本発明のアッセイは、選択遺伝子座の標的化された検出を提供し、これは、選択遺伝子座の両含量に関する情報(すなわち、多型領域の存在)および試料中の選択遺伝子座の頻度に関する情報(その領域中の任意の推定される多型を検出するか、または検出しない)を提供する選択。この鍵となる特徴は、本発明の多重化されたアッセイの実施からの単一のデータセットとして、選択遺伝子座のコピー数および選択遺伝子座における多型の存在または非存在の両方を検出する能力を提供することである。

0116

試料中のDNAの非常に広いサンプリングに依存する技術は、分析される非常に広範囲のDNAを提供しているが、実際には、1X以下のベースで試料内に含まれるDNAをサンプリングしている(すなわち、サブサンプリング)。対照的に、本発明のアッセイにおいて用いられる選択遺伝子座の増幅は、目的の特定の遺伝子座の範囲の深さを提供し、最初の混合試料中に存在する選択遺伝子座(1つ以上の、少ない発生源に由来するものを含む)の、好ましくは2X以上の平均配列範囲、より好ましくは100X以上の配列範囲、さらにより好ましくは1000X以上の配列範囲を有するそのような選択遺伝子座の「スーパーサンプリング」を提供する。

0117

本発明の注目すべき利点は、アッセイから生じる増幅産物を、限定されるものではないが、ハイブリダイゼーション技術、デジタルPCRおよび高効率配列決定技術を含む様々な検出および定量技術を用いて分析することができることである。

0118

本発明の方法は、データのより効率的および経済的な使用を提供し、試料増幅後に分析される実質的に大部分の配列は混合試料中の選択遺伝子座の配列同一性および頻度に関する断定的な情報をもたらす。かくして、染色体領域の大規模並行配列決定または無作為デジタル「計数」およびそのような計数からの関連データのその後の同定に依る技術と違って、本発明のアッセイシステムは、当業界の他者により教示された無作為手法よりも非常に効率的なデータ収集の使用を提供する。

0119

(アッセイ方法)
本発明のアッセイシステムは、上記の一般的なスキームを用いるが、多くの異なる配置および変更を用いてもよく、そのいくつかは以下に記載され、その多くは2010年8月6日に出願された米国特許出願第61/371605号(その全体を本明細書に援用する)に例示されている。

0120

図2は、本発明の連結に基づくアッセイシステムの第1の全体図を示す。固定配列オリゴヌクレオチド201、203は、それぞれ、ユニバーサルプライマー領域209および211ならびにそれぞれ選択遺伝子座205および207に相補的な領域を含む。しかしながら、さらに、図2に記載のアッセイシステムは、第1の固定配列オリゴヌクレオチド201上の試料指標領域221を用いる。特定の態様においては、選択遺伝子座の配列の全部または一部を、記載された技術を用いて、例えば、配列決定またはハイブリダイゼー
ション技術により直接検出する。図2の例では、試料指標を第1の固定配列オリゴヌクレオチド201と結合させる。指標の検出は、高度に多重化されたアッセイシステムにおいて特定の試料に由来する配列を同定することができる。

0121

工程202では、固定配列オリゴヌクレオチド201、203を工程202において混合試料200に導入し、選択遺伝子座215に特異的に結合させる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドを残りの遺伝子試料から分離するのが好ましい(例えば、洗浄による(図示なし))。次いで、架橋オリゴを導入し、工程204において、第1(201)および第2(203)の固定配列オリゴヌクレオチドの間の遺伝子座の領域215にハイブリダイズさせる。結合したオリゴヌクレオチドを工程206において連結して、目的の遺伝子座に広がるそれに相補的な連続的核酸を作製する。本発明の特定の態様においては、架橋オリゴヌクレオチドは長さ2〜45ヌクレオチドである。具体的な態様においては、架橋オリゴヌクレオチドは長さ3〜9ヌクレオチドである。さらに別の具体的な態様においては、オリゴヌクレオチドは長さ10〜30ヌクレオチドである。

0122

連結後、連結産物をgDNA鋳型から溶出させる。ユニバーサルプライマー217、219を工程208において導入して、連結された第1および第2の固定配列オリゴヌクレオチドを増幅させて、目的の遺伝子座の配列を含む増幅産物223を作製する(210)。これらの産物223を単離、検出、同定および定量して、混合試料中の選択遺伝子座の存在および量に関する情報を提供する。好ましくは、増幅産物を、配列決定により検出および定量する。具体的な態様においては、試料指標と増幅産物との両方の配列を決定して、例えば、試料ならびに遺伝子座の同定を提供することが望ましい。本発明で想定される本明細書に示された試料指標などの指標を、第1の固定配列オリゴヌクレオチド、第2の固定配列オリゴヌクレオチドまたはその両方と結合させることができる。あるいは、またはさらに、指標を、連結された第1および第2の固定配列オリゴヌクレオチドを増幅させるのに用いられるプライマーであって、指標を増幅産物中に組込むのにも役立つプライマーと結合させてもよい。

0123

好ましい態様において、および図2に示されたように、核酸を単離することができる混合試料を代表する指標を用いて、多重化アッセイシステムにおいて選択遺伝子座の発生源を同定する。そのような態様においては、核酸を、試料指標を用いて独自に同定する。次いで、独自に同定されたオリゴヌクレオチドを単一の反応容器中で、他の混合試料に由来する核酸と組み合わせた後、配列決定することができる。そのような場合、配列決定データを独自の試料指標により分離して、それぞれの混合試料に関するそれぞれの標的遺伝子座の頻度を決定し、個々の試料中に染色体異常が存在するかどうかを決定する。

0124

試料指標を用いる本発明の態様においては、情報を同定することを含む試料指標が、ユニバーサルプライマー領域209および211と、試料中の選択遺伝子座に相補的な領域205および207との間に配置されるように、固定配列オリゴヌクレオチドを設計するのが好ましい。あるいは、指標およびユニバーサル増幅配列を、別々の試料について連結産物を増幅させるのに用いられるプライマー中にこれらの指標を含有させることにより、連結された第1および第2の固定配列オリゴ(および存在する場合、架橋オリゴ)に付加することができる。いずれの場合でも、好ましくは、前記指標は、それらが増幅時に保存されるように、遺伝子座特異的配列の上流であるが、ユニバーサルプライマーの下流でコードされる。

0125

図3は、1つ以上の架橋オリゴヌクレオチドが用いられ、どのように多型が検出および同定されるかを例示するアッセイシステムの方法を例示する。図3では、2つのセットの固定配列オリゴヌクレオチドが用いられる。これら2つのセットの固定配列オリゴヌクレ
オチドは、実質的に同じユニバーサルプライマー309、311および配列特異的領域305、307を含むが、異なる試料指標321、323を含み、その異なる指標は、特定の試料中に存在する単一ヌクレオチド多型の異なる塩基配列に対応するセットの固定配列オリゴヌクレオチド上にある。同じ混合試料300に由来するが、異なる対立遺伝子特異的オリゴセットを含む個別のチューブ中の材料を用いて連結反応を実行する。選択遺伝子座313、333におけるこのSNPの2つの可能なヌクレオチドに対応する架橋オリゴヌクレオチドを用いて、それぞれの連結反応において選択遺伝子座を検出する。連結された第1、第2の、および架橋オリゴヌクレオチドの実際の配列の配列決定は必ずしも必要ないが、連結産物全体の配列の多型を同定し、および/または確認を提供するために依然として決定することができるように、特定の多型対立遺伝子を示唆する2つの対立遺伝子指標321、323を増幅産物中に組込む。

0126

それぞれの固定配列オリゴヌクレオチドは、選択遺伝子座に相補的な領域305、307、および混合試料からの選択遺伝子座の最初の選択および/または単離後に、異なる選択遺伝子座を増幅させるのに用いられるユニバーサルプライマー領域309、311を含む。ユニバーサルプライマー領域は、前記指標および目的の核酸に相補的な領域にフランキングする固定配列オリゴヌクレオチド301、303および323の末端に位置し、かくして、任意のユニバーサル増幅法の産物中に核酸特異的配列および試料指標を保存する。固定配列オリゴヌクレオチド301、303、323を工程302で遺伝子試料300のアリコートに導入し、選択遺伝子座315または325に特異的に結合させる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドを残りの遺伝子試料から、例えば、洗浄(示さず)により分離するのが好ましい。

0127

A/T SNP 313またはG/C SNP 333に対応する架橋オリゴを導入し、工程304において、固定配列オリゴヌクレオチドの第1(305)および第2(307)の核酸相補領域の間の選択遺伝子座315または325の領域に結合させる。あるいは、架橋オリゴ313、333を、固定配列オリゴヌクレオチドと同時に試料に導入することができる。結合したオリゴヌクレオチドを工程306において、単一の反応混合物中で連結して、選択遺伝子座に広がるそれに相補的な連続的核酸を作製する。

0128

連結後、好ましくは、別々の反応をユニバーサル増幅および検出工程のために組み合わせることができる。ユニバーサルプライマー317、319を工程308で組合せ反応に導入して、連結された鋳型領域を増幅させ、工程310で、連結された第1および第2の固定配列オリゴならびに架橋オリゴの産物327、329を作製する。これらの連結産物327,329は、選択遺伝子座中の両方のSNPを表す。これらの連結産物327、329を、試料指標および/または選択遺伝子座中にSNPを含有する産物の領域を介して、連結産物の配列決定により検出および定量する。

0129

本発明のアッセイシステムの方法の代替的な配置においては、架橋オリゴは、固定配列オリゴの一方または両方に相補的な領域に直接隣接しない領域にハイブリダイズしてもよく、1つ以上のオリゴの伸長を必要とする中間工程が連結の前に必要である。例えば、図4に例示されるように、それぞれのセットのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、固定配列の2つのオリゴヌクレオチド401、403および1つ以上の架橋オリゴヌクレオチド413を含む。それぞれの固定配列オリゴヌクレオチドは、選択遺伝子座405、407に相補的な領域、およびプライマー配列を含み、プライマー配列は、好ましくは、ユニバーサルプライマー配列409、411、すなわち、ユニバーサルプライマーに相補的なオリゴ領域である。プライマー配列409、411は、固定オリゴヌクレオチド401、403の末端またはその近くに位置し、かくして、任意のユニバーサル増幅法の産物中に核酸特異的配列を保存する。固定配列オリゴヌクレオチド401、403を工程402で混合試料400に導入し、目的の遺伝子座415の相補部分に特異的に結合させる。ハイブ
リダイゼーション後、ハイブリダイズしなかった固定配列オリゴヌクレオチドを、残りの遺伝子試料から分離するのが好ましい(図示なし)。

0130

次いで、架橋オリゴヌクレオチドを工程404で導入し、第1(401)および第2(403)の固定配列オリゴヌクレオチドの間の選択遺伝子座415の領域に結合させる。あるいは、架橋オリゴを、固定配列オリゴヌクレオチドと同時に導入することができる。この例示的態様においては、架橋オリゴは第1の固定配列オリゴ領域405に直接隣接する領域にハイブリダイズするが、第2の固定配列オリゴヌクレオチド407の相補領域から1つ以上のヌクレオチド離れている。固定配列および架橋オリゴのハイブリダイゼーション後、架橋オリゴ413を、工程406で、例えば、ポリメラーゼおよびdNTPを用いて伸長させて、架橋オリゴ413と第2の固定配列オリゴ403との間のギャップを埋める。伸長後、結合したオリゴヌクレオチドを工程408で連結して、目的の遺伝子座415に広がるそれに相補的な連続的核酸を作製する。連結後、ユニバーサルプライマー417、419を工程410で導入して、連結された第1、第2の、および架橋オリゴを増幅させて、工程412で、目的の選択遺伝子座の配列を含む増幅産物423を作製する。必要に応じて、増幅産物423を単離、検出および定量して、混合試料中の選択遺伝子座の存在および量に関する情報を提供する。

0131

(コピー数変動の検出)
本発明は、1つ以上の遺伝子座のコピー数変動および1つ以上の多型の存在または非存在を同定するための方法を提供する。これを、単一の遺伝子配列に対応する目的の遺伝子座の特定の染色体に対応する遺伝子座の同定のための増幅方法を用いて実施することができる。

0132

前記アッセイシステムは、混合試料中の選択遺伝子座を同定し、好ましくは単離するために設計された核酸プローブを用いる。特定のプローブは、コピー数(すなわち、遺伝子座頻度)について調査される選択遺伝子座中の目的の配列を同定し、他のプローブは、混合試料中の多い発生源または少ない発生源に対応する核酸中の目的の多型(すなわち、遺伝子座含量)に対応する配列を同定する。

0133

具体的な態様においては、本発明のアッセイシステムは、分析される実質的に全ての選択遺伝子座を単離、増幅または分析するための1つ以上の選択的増幅工程(例えば、選択遺伝子座に特異的にハイブリダイズする1つ以上のプライマーを用いる)を用いる。そのような増幅技術は一般に、ゲノムの全部または実質的な部分の無作為の増幅を含むため、これは、例えば、大規模並行配列決定を用いる他者により用いられる無作為増幅手法とは正反対である。さらに、初期試料は必要に応じて、混合試料中の核酸のコピー数を増加させる一般的な増幅などの方法を用いて富化することができる。好ましくは、目的の遺伝子座を同定するのに用いられるハイブリダイゼーション、連結、および増幅工程を、混合試料上で直接実施する。

0134

一般的な態様においては、本発明の使用者は、異なる染色体上の複数の選択遺伝子座を分析する。試料について複数の遺伝子座を分析する場合、好ましい実施形態は、1つの反応容器中でそれぞれの試料について全ての選択遺伝子座を増幅させることである。複数の選択遺伝子座の頻度を用いて、染色体異常が存在するかどうかを決定し、必要に応じて、選択遺伝子座中の多型を同定する。

0135

好ましい態様においては、2つ以上の試料に由来する複数の選択遺伝子座を、単一の反応溶液中で増幅させ、例えば、配列決定により、単一のデータセット中で情報を同時に分析する。次いで、得られるデータを分析して、異なる試料に関する結果を分離し、個々の試料におけるCNVの存在または非存在および発生源寄与を決定するために用いる。

0136

1態様においては、複数の染色体上の複数の選択遺伝子座を用いて本発明のアッセイシステムにおいて染色体異常を同定し、複数の染色体上の選択遺伝子座の頻度を比較して、染色体上の複数の遺伝子座の頻度比に基づいて異数性の可能性の増加を同定する。頻度の正規化または標準化を、1つ以上の選択遺伝子座について実施することができる。

0137

別の態様においては、前記アッセイシステムは、2つ以上の染色体上の選択遺伝子座の頻度を合計した後、別の染色体に対して、ある染色体上の選択遺伝子座の合計を比較して、染色体異数性が存在するかどうかを決定する。別の態様においては、前記アッセイシステムは、2つ以上の染色体上の選択遺伝子座頻度のサブセットを分析して、2つの染色体のうちの1つについて染色体異数性が存在するかどうかを決定する。この比較は、同じか、または異なる染色体内で行うことができる。

0138

特定の態様においては、選択遺伝子座の頻度を決定するのに用いられるデータは、実験誤差に起因すると考えられるか、または特定の試料内の特発的な遺伝的偏りに基づいてレベルが上昇もしくは抑制された外れ値データを排除することができる。1例においては、合計するのに用いられるデータは、1つ以上の試料中の特に上昇した頻度を有するDNA領域を排除することができる。別の例においては、合計するために用いられるデータは、1つ以上の試料中で特に少ない量で見出される選択遺伝子座を排除することができる。

0139

別の態様においては、選択遺伝子座のサブセットを選択して、染色体異常が存在するかどうかを決定する場合に統計的に有意な結果を得ることができる。選択遺伝子座の異なるサブセットの複数の分析を、混合試料内で実施して、より高い統計力を得ることができる。例えば、第21染色体について100の選択遺伝子座および第18染色体について100の選択遺伝子座が存在する場合、それぞれの染色体について100より少ない領域を評価する一連の分析を実施することができる。この例では、選択遺伝子座は選択的に排除されない。

0140

特定の染色体上で検出可能な異なる核酸の量は、混合試料中の異なる細胞源における遺伝子座の一般的表示、混合試料中の異なる遺伝子座を表す異なる核酸の分解速度、試料調製方法を含むいくつかの因子に応じて変化してもよい。かくして、別の態様においては、染色体上の特定の遺伝子座の量を合計して、試料中の異なる染色体の遺伝子座の量を決定する。遺伝子座の頻度を特定の染色体について合計し、遺伝子座の合計を用いて、異数性を決定する。本発明のこの態様は、それぞれの染色体上の個々の遺伝子座の頻度を合計した後、ある染色体上の遺伝子座の合計を1つ以上の他の染色体に対して比較して、染色体異常が存在するかどうかを決定する。

0141

好ましくは、本発明のアッセイシステムを用いて分析される核酸を選択的に増幅し、必要に応じて、目的の遺伝子座(例えば、混合試料中の目的の遺伝子座に)に特異的なプライマーを用いて混合試料から単離する。選択的増幅のためのプライマーを、様々な理由のために選択することができるが、好ましくは、1)目的の染色体に由来する領域を効率的に増幅する;2)異なる混合試料中の母体および/または胎児発生源からの推定可能な範囲の発現を有する;ならびに3)特定の染色体にとって特徴的である、すなわち、他の染色体上の相同領域を増幅しないように設計する。以下は、本発明のアッセイシステムにおいて用いることができる例示的技術である。

0142

本発明のアッセイシステムは、目的の特定の遺伝子座の同定および定量により、異数性および特定の染色体異常の両方を検出する。そのような染色体異常としては、限定されるものではないが、欠失突然変異、挿入突然変異コピー数多型、コピー数変異体、第22染色体q11欠失症候群、第11染色体上の11q欠失症候群、第8染色体上の8p欠失
症候群などが挙げられる。一般に、同じか、または別々の染色体上に存在する少なくとも2つの選択遺伝子座を分析し、選択遺伝子座の少なくとも1つは胎児対立遺伝子異常と関連する。次いで、2つの選択遺伝子座の配列および2つの選択遺伝子座のコピー数を比較して、染色体異常が存在するかどうかを決定し、そうである場合、異常の性質を決定する。

0143

本明細書に含まれる説明の多くは、1つ以上の推定異数性染色体上の選択遺伝子座の量および1つ以上の正常な染色体上の選択遺伝子座の量を計数することにより異数性を検出することを記載するが、同じ技術を用いて、コピー数変動が染色体の一部にのみ起こるそのようなコピー数変動を検出することができる。コピー数変動の検出においては、推定コピー数変動位置内の複数の選択遺伝子座を、推定コピー数変動位置の外部の複数の選択遺伝子座と比較する。例えば、22q11欠失内の2つ以上の遺伝子座および22q11欠失の外側の2つ以上の遺伝子座を選択することにより、母体試料中で胎児における第22染色体q11欠失症候群を検出することができる。22q11欠失の外側の遺伝子座は、第22染色体の別の領域上にあるか、または完全に異なる染色体上にあってもよい。それぞれの遺伝子座の量を、本出願に記載の方法により決定する。

0144

いくつかの態様においては、選択遺伝子座を増幅させるためにユニバーサル増幅を用いることができる。いくつかの態様においては、それぞれの試料に関する選択遺伝子座を単一の容器中の単一の反応においてアッセイする。他の態様においては、複数の試料に由来する遺伝子座を、単一の容器中の単一の反応においてアッセイすることができる。

0145

本発明の特定の態様は、そのような欠失の境界を含む欠失を検出することができる。いくつかの態様においては、少なくとも24の選択遺伝子座を推定される欠失の領域内で用いることができ、少なくとも24の選択遺伝子座を推定される欠失の領域の外側で用いることができる。別の態様においては、少なくとも48の選択遺伝子座を推定される欠失の領域内で用いることができ、少なくとも48の選択遺伝子座を推定される欠失の領域の外側で用いることができる。別の態様においては、少なくとも48の選択遺伝子座を推定される欠失の領域内で用いることができ、少なくとも96の選択遺伝子座を推定される欠失の領域の外側で用いることができる。別の態様においては、少なくとも48の選択遺伝子座を推定される欠失の領域内で用いることができ、少なくとも192の選択遺伝子座を推定される欠失の領域の外側で用いることができる。好ましい態様においては、少なくとも384の選択遺伝子座を推定される欠失の領域内で用いることができ、少なくとも384の選択遺伝子座を推定される欠失の領域の外側で用いることができる。推定される領域内の選択遺伝子座と、推定される欠失の領域の外側の選択遺伝子座とを合計する。次いで、これらの合計を互いに比較して、欠失の存在または非存在を決定する。必要に応じて、合計の比率を計算し、その比率を正常な集団から作製された平均比率と比較することができる。1つ以上の選択遺伝子座の比率が期待される比率の統計的に外側にある場合、欠失が検出される。欠失を正に同定するための閾値は、正常な集団において算出される変動の2倍以上、好ましくは4倍以上であってよい。複数の選択遺伝子座が推定される欠失の領域の内部および外部に求められた場合、欠失の境界を同定することができる。

0146

(疾患または素因に関連する多型)
本発明のアッセイシステムを用いて、常染色体優性または劣性疾患または突然変異に関連する多型などの多型を検出することもできる。本発明のアッセイシステムの多重化された性質を考慮すると、検出は染色体異常の検出と同じアッセイで行う。かくして、単一のアッセイシステムは、異なるクラスの遺伝子突然変異に関する診断情報を提供することができる。従って、本発明の好ましいアッセイシステムは高度に多重化され、混合試料内の数百から数千もの選択遺伝子座を調査することができるため、特定の態様においては、混合試料内のマーカー遺伝子座、例えば、遺伝的危険性と関連する遺伝子座または感染性
物の存在または非存在を同定する遺伝子座について試料を調査するのが望ましい。かくして、前記アッセイシステムは、混合試料中のコピー数決定のための選択遺伝子座の検出と共にそのようなマーカー遺伝子座の検出を提供する。

0147

かくして、本発明のアッセイシステムを用いて、混合試料中の多型を検出することができ、そのような多型は、常染色体劣性障害に関連する遺伝子、常染色体優性障害に関連する突然変異;疾患および/または疾患の進行(例えば、転移)を生じる危険性ならびに予後指示因子に関連する多型に関連する。

0148

他の具体的な態様においては、本発明のアッセイシステムを用いて、母体試料中で胎児突然変異または多型を検出することができ、そのような突然変異または多型は、冠動脈性心疾患、糖尿病、高血圧鬱血性心不全、およびてんかんなどの多遺伝子障害と関連する。例としては、癌感受性遺伝子における突然変異(例えば、BRCAIもしくはIIまたはp53における突然変異)などの素因に関連する遺伝子における突然変異;アルツハイマー病の危険性に関連するapoE3遺伝子多型などの、後に疾患を開始する高い危険性に関連する多型が挙げられる。

0149

染色体異常および単一遺伝子突然変異または単一遺伝子もしくは多遺伝子疾患、障害、もしくは素因に関連する多型の検出に加えて、本発明のアッセイシステムは、混合試料中の感染性因子を同定することができる。

0150

(選択的増幅)
いくつかの選択的増幅方法を用いて、本発明のアッセイシステムにおいて分析される増幅された核酸を提供することができ、そのような方法を用いて、混合試料中の選択遺伝子座の初期含量に関する情報の保存を可能にする様式で混合試料中の選択遺伝子座のコピー数を増加させるのが好ましい。増幅および分析の全ての組合せが本明細書で詳細に説明されるわけではないが、本明細書と一致する領域の核酸を単離および/または分析するために様々な増幅方法および/または分析ツールを用いることは当業者の技術の範囲内にあり、そのような変更は本開示を読めば当業者には明らかである。

0151

そのような増幅方法としては、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(米国特許第4,683,195号;および第4,683,202号;PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification,ed.エイチ エーエルリッヒ(H.A.Erlich),Freeman Press,NY,N.Y.,1992)、リガーゼ連鎖反応(LCR)(ウー(Wu)およびウォレス(Wallace),Genomics 4:560,1989;ラングレンら(Landegren et al.),Science 241:1077,1988)、鎖置換増幅(SDA)(米国特許第5,270,184号;および第5,422,252号)、転写媒介性増幅(TMA)(米国特許第5,399,491号)、連結線形増幅(LLA)(米国特許第6,027,923号)など、自己持続型配列複製(グアテリら(Guatelli et al.),Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87,1874(1990)およびWO 90/06995)、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅(米国特許第6,410,276号)、コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応(CP−PCR)(米国特許第4,437,975号)、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応(AP−PCR)(米国特許第5,413,909号、第5,861,245号)ならびに核酸に基づく配列増幅(NASBA)(米国特許第5,409,818号、第5,554,517号および第6,063,603号(それぞれ本明細書に援用する)を参照されたい)が挙げられる。用いることができる他の増幅方法としては、PCT特許出願第PCT/US87/00880号に記載のQbeta Replicase、ウォーカーら(Walker et
al.),Nucleic AcidsRes.20(7):1691−6(1992)に記載のSDAなどの等温増幅法、および米国特許第5,648,245号に記載のローリングサークル増幅が挙げられる。用いることができる他の増幅方法は、米国特許第5,242,794号、第5,494,810号、第4,988,617号および米国特許出願第09/854,317号および米国特許出願公開第20030143599号(それぞれ本明細書に援用する)に記載されている。いくつかの態様においては、DNAを多重遺伝子座特異的PCRにより増幅する。好ましい態様においては、DNAをアダプター連結および単一プライマーPCRを用いて増幅する。他の利用可能な増幅方法は、平衡化PCR(マクリジオルゴスら(Makrigiorgos et al.),Nature Biotechnol,20:936−9(2002))ならびに核酸配列に基づく増幅(NASBA)および自己持続型配列複製(グアテリら(Guatelli et al.),PNAS USA 87:1874(1990))などの等温増幅方法などである。そのような方法に基づいて、当業者であれば、目的の遺伝子座の5’および3’側の任意の好適な領域中でプライマーを設計することができる。そのようなプライマーを用いて、DNAが目的の選択遺伝子座を含む限り、任意の長さのDNAを増幅することができる。

0152

目的のゲノム領域に由来する増幅された選択遺伝子座の長さは、増幅および/または選択された他の遺伝子座から、増幅された遺伝子座を識別するための十分な配列情報を提供するのに十分な長さである。一般に、選択遺伝子座に対応する増幅された核酸は、少なくとも約16ヌクレオチドの長さであり、より典型的には、選択遺伝子座に対応する増幅された核酸は、少なくとも約20ヌクレオチドの長さである。本発明の好ましい態様においては、選択遺伝子座に対応する増幅された核酸は、少なくとも約30ヌクレオチドの長さである。本発明のより好ましい態様においては、選択遺伝子座に対応する増幅された核酸は、少なくとも約32、40、45、50または60ヌクレオチドの長さである。本発明の他の態様においては、選択遺伝子座に対応する増幅された核酸は、約100、150または最大で200の長さであってよい。

0153

特定の態様においては、選択的増幅は、混合試料に由来するDNAの出発量が非常に限られる場合、例えば、試料中の無細胞DNAが限られた量で利用可能である場合に特に有用であり得る、初期線形増幅工程を含む。この機構は、元のDNA含量を代表するDNA分子の量を増加させ、DNAまたはDNAの画分(例えば、母体試料中の胎児DNA寄与)の正確な定量が必要とされるサンプリング誤差を低下させるのに役立つ。

0154

かくして、1態様においては、限られたサイクル数の配列特異的線形増幅を、cfDNAを含む出発混合試料に対して実施する。サイクル数は一般に、典型的なPCR増幅に用いられるものよりも少なく、例えば、5〜30サイクル以下である。プライマーまたはプローブを設計して、選択遺伝子座を含む特異的ゲノム断片または領域を増幅させることができる。プライマーもしくはプローブを5’末端の末端標識を用いて(例えば、ビオチンを用いて)、または他に、増幅産物をさらなる単離もしくは分析のために精製するか、もしくは固体基質(例えば、ビーズもしくはアレイ)に結合させることができるようなプライマーもしくはプローブに沿って改変することができる。好ましい態様においては、単一の反応が、異なる領域に由来する複数のDNA断片をもたらすように、プライマーを多重化する。次いで、線形増幅に由来する増幅産物を、標準的なPCR方法またはさらなる線形増幅を用いて増幅させることができる。

0155

例えば、cfDNAを妊娠女性の血液、血漿または血清から単離し、目的の染色体に対応する設定数の選択遺伝子座に対するプライマーと共にインキュベートすることができる。好ましくは、初期線形増幅に用いられるプライマーの数は、12以上、より好ましくは24以上、より好ましくは36以上、さらにより好ましくは48以上、およびさらにより
好ましくは96以上である。それぞれのプライマーは、単一の選択遺伝子座に対応し、必要に応じて、同定および/または単離のためにタグ付けされる。限られたサイクル数、好ましくは10以下のサイクル数を線形増幅と共に実施する。続いて、増幅産物を単離する、例えば、プライマーをビオチン分子に連結する場合、増幅産物を固体基質上のアビジンまたはストレプトアビジンへの結合により単離することができる。次いで、増幅産物を、他のプライマーを用いるさらなる増幅などのさらなる生化学的方法ならびに/または配列決定およびハイブリダイゼーションなどの検出技術にかける。

0156

線形増幅の効率は、特定の系において、正規化を用いて線形増幅に由来する産物が混合試料中の核酸の頻度および配列を代表することを確保することができるように、部位間およびサイクル間で変化してもよい。本発明のアッセイシステムを実施する者であれば、試料の複数のアリコートに由来する情報を用いて、異なる選択遺伝子座における変動を含む選択遺伝子座を代表する異なる増幅産物の量における変動および/または限定的初期線形増幅後の選択遺伝子座間の変動を決定することができる。そのような情報を用いて、試料DNA含量中の選択遺伝子座の初期レベルを決定し、選択遺伝子座の頻度の正規化を可能にすることができる。

0157

(ユニバーサル増幅)
本発明の好ましい態様においては、選択的に増幅された遺伝子座を、本発明のアッセイシステムを用いる様々な選択遺伝子座の全部または実質的に全部のユニバーサル増幅によりさらに増幅させるのが好ましい。選択的に増幅された遺伝子座を単一のユニバーサル増幅反応においてさらに増幅させることができるように、ユニバーサルプライマー領域を固定配列オリゴヌクレオチドに付加する。これらのユニバーサルプライマー配列を、選択的増幅方法の間に核酸領域に付加することができる、すなわち、選択的増幅のためのプライマーはユニバーサルプライマー配列を含む。あるいは、ユニバーサル増幅配列を含むアダプターを、初期増幅後および混合試料に由来する選択的に増幅された選択遺伝子座の単離後にアダプターとして選択的に増幅された選択遺伝子座の末端に付加することができる。

0158

1つの例示的な態様においては、選択遺伝子座を、目的の選択遺伝子座に相補的なプライマーを用いて混合試料から最初に増幅させた後、ユニバーサル増幅工程を行って、分析のための遺伝子座の数を増加させる。混合試料に由来する初期増幅産物へのプライマー領域の導入により、分析、例えば、配列決定の前、またはその間に選択核酸の全部または一部のその後の制御されたユニバーサル増幅が可能になる。

0159

ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)中に見られるように、DNA増幅中には偏りおよび変動性が導入され得る。増幅反応が多重化される場合、異なる選択遺伝子座は異なる速度または効率で増幅する可能性がある。これは、より良好な効率(すなわち、より好ましいハイブリダイゼーション反応速度)を有する多重反応中のいくつかのプライマーに部分的に起因し得、これは、プライマーおよび鋳型DNAの配列含量、バッファー条件、および他の条件など、他のプライマーよりもいくつかのプライマーを好む実験条件に起因する。多重化されたアッセイシステムにおけるユニバーサルDNA増幅は一般に、増幅される遺伝子座の間に導入される偏りおよび変動性がより少ない。

0160

従って、1態様においては、遺伝子座特異的配列を用いる小さいサイクル数(例えば、1〜10、好ましくは3〜5)の選択的増幅を実施した後、ユニバーサルプライマーを用いるユニバーサル増幅を行う。ユニバーサルプライマーを用いるサイクル数は変化するが、好ましくは、少なくとも10サイクル、より好ましくは少なくとも5サイクル、さらにより好ましくは20サイクル以上である。より少ない数の増幅サイクル後にユニバーサル増幅に移動することにより、特定の遺伝子座が他のものより大きい速度で増幅する偏りは低下する。

0161

必要に応じて、アッセイシステムは、選択的増幅反応において選択的に増幅されない任意の核酸を除去するために選択増幅方法とユニバーサル増幅方法との間に工程を含む。
選択的増幅に由来する全産物または産物のアリコートを、ユニバーサル増幅反応に用いることができる。同じか、または異なる条件(例えば、ポリメラーゼ、バッファーなど)を増幅工程において用いて、例えば、偏りおよび変動性が実験条件に起因して不注意に導入されないことを確保することができる。さらに、プライマー濃度における変動を用いて、他の選択遺伝子座と比較して、いくつかの選択遺伝子座について、配列特異的増幅サイクルの数を示差的に制限することができる。

0162

特定の態様においては、アッセイシステムにおいて用いられるプライマーまたはアダプターのユニバーサルプライマー領域は、1つの容器中の1つの反応において同時に多数の核酸を分析するための一般的なプライミング機構を用いる従来の多重化アッセイ方法と適合するように設計される。そのような「ユニバーサル」プライミング方法は、混合試料中に存在する選択遺伝子座の量の効率的な高容量の分析を可能にし、異数性の決定のためのそのような混合試料内の選択遺伝子座の存在の包括的定量を可能にする。

0163

そのようなアッセイ方法の例としては、限定されるものではないが、オリファントら(Oliphant et al.),米国特許第7,582,420号に記載のものなどの、様々な試料を同時に増幅および/または遺伝子型決定するのに用いられる多重化方法が挙げられる。

0164

いくつかの態様は、それぞれの方法の初期段階に由来するオリゴヌクレオチドが、方法の後の段階に由来するオリゴヌクレオチドにより用いることができる配列を含む核酸配列の多重検出のための共役反応を用いる。限定されるものではないが、以下に記載の方法(それぞれその全体が本明細書に援用される)を含む試料中の核酸を増幅および/または検出するための例示的方法を、単独で、または組み合わせて用いることができる。

0165

特定の態様においては、本発明のアッセイシステムは、以下の組合せの選択的およびユニバーサル増幅技術の1つを用いる:(1)ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)と一緒のリガーゼ検出反応(「LDR」);(2)LDRと一緒の二次PCRと一緒の一次PCR;および(3)二次PCRと一緒の一次PCR。本発明のこれらの態様の各々は、特定の核酸特徴を検出する際に特定の適用性を有する。しかしながら、それぞれは、それぞれの方法の初期段階に由来するオリゴヌクレオチドが、方法の後の段階に由来するオリゴヌクレオチドにより用いることができる配列を含む核酸配列の差異の多重検出のための共役反応の使用を必要とする。

0166

バラニーら(Barany et al.),米国特許第6,852,487号、第6,797,470号、第6,576,453号、第6,534,293号、第6,506,594号、第6,312,892号、第6,268,148号、第6,054,564号、第6,027,889号、第5,830,711号、第5,494,810号は、様々な核酸試料中の特異的ヌクレオチド配列の検出のためのリガーゼ連鎖反応(LCR)アッセイの使用を記載している。

0167

バラニーら(Barany et al.),米国特許第7,807,431号、第7,455,965号、第7,429,453号、第7,364,858号、第7,358,048号、第7,332,285号、第7,320,865号、第7,312,039号、第7,244,831号、第7,198,894号、第7,166,434号、第7,097,980号、第7,083,917号、第7,014,994号、第6,949,370号、第6,852,487号、第6,797,470号、第6,576,453
号、第6,534,293号、第6,506,594号、第6,312,892号および第6,268,148号は、核酸検出のためのLDR共役PCRを記載している。

0168

バラニーら(Barany et al.),米国特許第7,556,924号および第6,858,412号は、核酸検出のための共役したLDRおよびポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)を用いるプレサークルプローブ(「パドロックプローブ」または「多逆位プローブ」とも呼ばれる)の使用を記載している。

0169

バラニーら(Barany et al.),米国特許第7,807,431号、第7,709,201号および第7,198,814号は、核酸配列の検出のためのエンドヌクレアーゼ切断および連結反応の組合せの使用を記載している。

0170

ウィリスら(Willis et al.),米国特許第7,700,323号および第6,858,412号は、多重化された核酸増幅、検出および遺伝子型決定におけるプレサークルプローブの使用を記載している。

0171

ロナギら(Ronaghi et al.),米国特許第7,622,281号は、ユニークなプライマーおよびバーコードを含むアダプターを用いて核酸を標識および増幅するための増幅技術を記載している。

0172

好ましい態様においては、増幅産物を、以前に記載のように多重化する。好ましい態様においては、多重増幅産物を、増幅産物の分析によって定量する。好ましい態様においては、増幅方法に由来する個々の分子の代表的試料を、さらなる分析のために残りの試料から単離する。個々の分子の代表的試料を得るために、遺伝子座あたりの平均分子数は多重化反応により作られるサンプリングノイズを超えなければならない。1態様においては、遺伝子座あたりの平均数は100より多い。別の態様においては、遺伝子座あたりの平均数は500より多い。別の態様においては、遺伝子座あたりの平均数は1000より多い。

0173

増幅産物に由来する個々の分子を、異なる増幅産物を分析において互いに識別することができる様式で他の分子から物理的に単離するのが好ましい。好ましい態様においては、この単離は、固体基質上で行う。それぞれの単離された分子を、分析の前に特定の同定可能な、もしくは物理的なアドレスと結合させることができるか、またはアドレスは分析の結果に基づいて特定の増幅産物について既知となってもよい。基質は平面的な表面であるか、またはビーズなどの三次元的な表面であってもよい。

0174

一度単離されたら、個々の増幅産物をさらに増幅して、同じ既知の、または同定可能な位置でその分子の複数の同一のコピーを作製することができる。増幅は、その位置が同定可能な、または物理的なアドレスになる前または後に行ってもよい。次いで、増幅産物および/またはそのコピー(増幅産物と同一であるか、または該増幅産物に相補的であってよい)を、増幅産物またはそのコピーの配列に基づいて分析して、特定の遺伝子座および/またはそれが代表する対立遺伝子を同定する。

0175

好ましい態様においては、増幅産物または増幅産物の一部の全長を、配列決定を用いて分析することができる。決定するのに必要な塩基数は、特定の遺伝子座および/または対立遺伝子に属するものとして増幅産物を独自に同定するのに十分なものでなければならない。1つの好ましい態様においては、増幅産物の配列決定により遺伝子座を分析する。

0176

配列決定のいくつかの方法は、本発明のアッセイシステムと適合する。配列決定のための例示的方法としては、限定されるものではないが、ドルマナク(Drmanac),米
国特許第6,864,052号;第6,309,824号;および第6,401,267号;ならびにドルマナクら(Drmanac et al.),米国特許出願公開第2005/0191656号(本明細書に援用する)に開示されたものなどのハイブリダイゼーションに基づく方法、合成方法による配列決定、例えば、ナイレンら(Nyren et al.),米国特許第7,648,824号、第7,459,311号および第6,210,891号;バラスブラマニアン(Balasubramanian),米国特許第7,232,656号および第6,833,246号;クエイク(Quake),米国特許第6,911,345号;リら(Li et al.),Proc.Natl.Acad.Sci.,100:414−419(2003);ロナギら(Ronaghi et al.),米国特許第7,648,824号、第7,459,311号、第6,828,100号および第6,210,891号に記載のピロリン酸配列決定;ならびに連結に基づく配列決定法、例えば、ドルマナクら(Drmanac et al.),米国特許出願第20100105052号およびチャーチら(Church et al.),米国特許出願第20070207482号および第20090018024号などが挙げられる。

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