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課題・解決手段

ドを使用する。これらは、少なくとも1つの炭素原子および少なくとも2つの有機ペルオキシド基を含む。前記不活化剤は、理想的にはヒドロペルオキシドである。本発明は、ウイルスワクチンの調製中に特に有用である。具体的な一実施形態において、上記の不活化剤は、(i)少なくとも1つの炭素原子またはバックボーンと(ii)少なくとも2つのペルオキシド基、すなわち、2つの酸素原子間単結合−O−O−を含有する少なくとも2つの基とを含む。

概要

背景

ウイルスおよび細菌を不活性にするためのそれらの処理は、廃水または下水衛生化を含む様々な領域において、およびワクチンなどの非経口薬の分野においても重要である。例えば、多くのワクチンは微生物に基づいており、これらの微生物は、生感染性物質が最終ワクチンに存在しないことを確実にするように不活化される。ポリオウイルスの不活化が失敗した1950年代の「カッター(Cutter)事件」から公知であるように、不活化の失敗は、深刻な安全性リスクをもたらし得る。

不活化処理は、代表的に化学的手段に基づく。化学的処理としては、洗剤ホルムアルデヒド(通常はホルマリンとして)、β−プロピオラクトン(BPL)、グルタルアルデヒドエチレンイミンフェノールなどの使用が挙げられる。これらの不活化剤は、長年にわたって使用されている。例えば参考文献1(非特許文献1)を参照のこと。

これらの不活化剤の一部は、核酸の分解にも有用である。この分解は、ウイルスまたは細菌自体の不活化において役割を果たすことができるが、成長中に使用されてきた任意の細胞基質から残存核酸を無くすことにも有用であり得る。例えば、ウイルスを細胞培養で成長させて、ワクチンを調製するための材料を得ることができ、および製造中に、細胞培養基質からの一切の残存核酸を分解する工程を含むことは通例であり、それによって潜在的に発癌性の材料を除去する。参考文献2(特許文献1)には、ウイルスの不活化と宿主細胞DNAの分解の両方のためのBPLの使用が記載されている。

特定の微生物に応じてその最良の不活化剤は様々である。例えば、ウイルスの形態(サイズ、カプシド化(capsidation)、エンベロープなど)の相違は、不活化感度の相違につながる。例えば、参考文献3(非特許文献2)の付録2を参照のこと。一部の処理(例えば、非常に苛酷な加熱、消毒剤、強いUV線または放射線)は、普遍的に微生物を不活化することができるが、これらは免疫原性破壊し、そのため有効なワクチンの調製には不適切である。その代りとして、ワクチン免疫原性を保ちながら問題の微生物に対して有効であるような不活化処理が選択される。それ故、残念なことに、この処理は活性形態汚染因子を残すことがあり、ことによると、頑感染性因子によるワクチン汚染につながる。従って、ターゲット微生物と潜在的汚染物質の両方を不活化する広域スペクトルの不活化剤が必要とされている。そのような不活化剤は、ウイルス不活化推奨されるウシ血清またはトリプシンなどの製品[4(非特許文献3)]の処理にも有用であるだろう。

一部の不活化剤に伴うもう1つの難点は、それらの安定性である。ホルムアルデヒドは、特に高温で有効な不活化剤であるが、それは非常に安定であり、そのため不活化後残留物が残存する。これらの残留物は、残留活性微生物についての下流の試験干渉することがある。従って、これらの試験では高希釈物が使用されるが、これはそれらの感度を低減する。さらに、それらの残留物は、最終ワクチンにおける免疫応答に干渉することがあり、例えば、参考文献5(非特許文献4)は、ホルマリン不活化ワクチン過敏症を引き起こす危険がより高いだろうことを示唆している。

最後に、ホルムアルデヒドでの不活化は、いくつかの状況では可逆的であり得る[6、7]。

概要

ドを使用する。これらは、少なくとも1つの炭素原子および少なくとも2つの有機ペルオキシド基を含む。前記不活化剤は、理想的にはヒドロペルオキシドである。本発明は、ウイルスワクチンの調製中に特に有用である。具体的な一実施形態において、上記の不活化剤は、(i)少なくとも1つの炭素原子またはバックボーンと(ii)少なくとも2つのペルオキシド基、すなわち、2つの酸素原子間単結合−O−O−を含有する少なくとも2つの基とを含む。

目的

本発明は、(i)活性因子、例えばウイルス免疫原、および(ii)多官能性有機ペルオキシド還元剤との反応生成物を含む薬学的組成物も提供する

効果

実績

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請求項1

微生物含有試料を処理するためのまたは微生物を含有する危険のある試料を処理するためのプロセスであって、該試料を多官能性有機ペルオキシドと接触させる工程を包含する、プロセス。

請求項2

核酸を含有する試料を処理するためのプロセスであって、該試料を多官能性有機ペルオキシドと接触させて該核酸を分解する工程を包含する、プロセス。

請求項3

薬学的組成物を調製するための方法であって、該方法は、(i)微生物含有試料と多官能性有機ペルオキシドとを接触させて、該試料中の微生物を不活化する工程;(ii)工程(i)の生成物から薬学的組成物を調製する工程を包含する、方法。

請求項4

多官能性有機ペルオキシドの水溶液であって、該多官能性有機ペルオキシドが(a)1重量%未満または(b)5重量%〜70重量%の間のいずれかの濃度で存在するものである水溶液。

請求項5

(i)不活化された微生物と(ii)1重量%未満の多官能性有機ペルオキシドとを含む水性組成物

請求項6

微生物と多官能性有機ペルオキシドとの反応生成物を含む水性組成物。

請求項7

前記試料が、容器の表面または作業場の表面である、請求項1に記載のプロセス。

請求項8

前記微生物含有試料が、溶解状態の核酸も含む、請求項1に記載のプロセスまたは請求項3に記載の方法。

請求項9

前記試料が、細胞培養物から得られ、および前記核酸が、該細胞培養物からの細胞DNAである、請求項2もしくは請求項8に記載のプロセスまたは請求項8に記載の方法。

請求項10

前記試料がウイルスを含有する、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物

請求項11

前記試料が、無エンベロープDNAウイルスを含有する、請求項10に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項12

前記多官能性有機ペルオキシドが、−O−O−H基を含む、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項13

前記多官能性有機ペルオキシドが、ジェミナルペルオキシドである、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項14

前記多官能性有機ペルオキシドが、2つ、3つまたは4つのペルオキシド基を有する、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項15

前記多官能性有機ペルオキシドが、ジェミナルビスヒドロペルオキシドである、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項16

前記多官能性有機ペルオキシドが、ホモ二官能性である、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項17

前記多官能性有機ペルオキシドが、水溶性である、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項18

前記多官能性有機ペルオキシドが、ハロゲンを含まない、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項19

前記多官能性有機ペルオキシドが、炭素水素および酸素のみから成る、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項20

前記多官能性有機ペルオキシドが、300未満の分子量を有する、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項21

前記多官能性有機ペルオキシドが、式I:を有し、式中、R1aは、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C1−6アルキニル、C1−6−アルコキシ、C2−6−アルケニルオキシ、C(O)H、C(O)C1−6アルキル、C(O)OC1−6アルキル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノ、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノカルボニル、S(O)0−2C1−6アルキル、ヘテロシクロアルキルアリールまたはヘテロアリールであり;R2aは、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C1−6アルキニル、C1−6−アルコキシ、C2−6−アルケニルオキシ、C(O)H、C(O)C1−6アルキル、C(O)OC1−6アルキル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノ、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノカルボニル、S(O)0−2C1−6アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール、−(CR4R5)nCR6(OOH)2であるか、あるいはR2aは、LによってR2bに連結されており;R3は、HまたはC(OOH)R1bR2bであり、R1bは、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C1−6アルキニル、C1−6−アルコキシ、C2−6−アルケニルオキシ、C(O)H、C(O)C1−6アルキル、C(O)OC1−6アルキル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノ、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノカルボニル、S(O)0−2C1−6アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり;R2bは、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C1−6アルキニル、C1−6−アルコキシ、C2−6−アルケニルオキシ、C(O)H、C(O)C1−6アルキル、C(O)OC1−6アルキル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノ、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノカルボニル、S(O)0−2C1−6アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであるか、あるいはR2bは、LによってR2aに連結されており;R4は、各出現時、HまたはC1−3アルキル、ヒドロキシルシアノ、ニトロ、C2−4−アルケニル、C1−3−アルコキシ、C2−4−アルケニルオキシ、C1−3−アルキルカルボニルカルボキシ、C1−6−アルコキシカルボニル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−3アルキル化アミノカルボニル、C1−3−チオアルキル、C1−3−アルキルスルフィニル、C1−3−アルキルスルホニル、C1−3−アルキルアミノスルホニルおよびジ−C1−3−アルキルアミノスルホニルから選択され;R5は、各出現時、HまたはC1−3アルキル、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、C2−4−アルケニル、C1−3−アルコキシ、C2−4−アルケニルオキシ、C1−3−アルキルカルボニル、カルボキシ、C1−6−アルコキシカルボニル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−3アルキル化アミノカルボニル、C1−3−チオアルキル、C1−3−アルキルスルフィニル、C1−3−アルキルスルホニル、C1−3−アルキルアミノスルホニルおよびジ−C1−3−アルキルアミノスルホニルから選択され;Lは、C1−8アルキレンであり;R6は、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C1−6アルキニル、C1−6−アルコキシ、C2−6−アルケニルオキシ、C(O)H、C(O)C1−6アルキル、C(O)OC1−6アルキル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノ、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノカルボニル、S(O)0−2C1−6アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり;nは、1〜8である、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項22

前記多官能性有機ペルオキシドが、式II:を有する、請求項21に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項23

R1aが、HまたはCH3であり;およびR2aが、CH3、Etまたはn−Prである、請求項22に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項24

前記多官能性有機ペルオキシドが、式III:を有する、請求項21に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項25

R1aが、HまたはCH3であり;R2aが、CH3、Et、もしくはn−Prであるか、またはR2aが、LによってR2bに連結されており;R1bが、HまたはCH3であり;R2bが、CH3、Et、n−Prであるか、またはR2bが、LによってR2aに連結されており;およびLが、−(CH2)3−である、請求項24に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項26

前記多官能性有機ペルオキシドが、式IV:を有する、請求項21に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項27

R1aが、Hであり;R1bが、Hであり;およびnが、3である、請求項26に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項28

R1aおよびR2aが、同一である;および/またはR1aおよびR2bが、同一である;および/またはR2aおよびR2bが、同一である、請求項17〜23のいずれか一項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項29

●R1aが、HもしくはC1−4アルキルである;および/または●R2aが、HもしくはC1−4アルキルもしくは−(CH2)nCH(OOH)2であるか、またはLによってR2bに連結されている;および/または●R1bが、HもしくはC1−4アルキルである;および/または●R2bが、C1−4アルキルであるか、もしくはLによってR2aに連結されている。従ってR2bが、CH3、Etもしくはn−Prであり得る;および/または●各R4が、HもしくはCH3である;および/または●各R5が、HもしくはCH3である;および/または●Lが、C2−5アルキレンである;および/または●R6が、HもしくはC1−4アルキルである;および/または●nが、2〜6である、請求項21〜28のいずれか一項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項30

R1aが、HまたはCH3であり;R2aがCH3、Et、n−Prもしくは−(CH2)nCH(OOH)2であるか、またはR2aが、LによってR2bに連結されており;R3が、HまたはC(OOH)R1bR2bであり;R1bが、HまたはCH3であり;R2bが、CH3、Etもしくはn−Prであるか、またはR2bが、LによってR2aに連結されており;Lが、−(CH2)3−であり;およびnが、3である、請求項21〜29のいずれか一項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項31

前記多官能性有機ペルオキシドが、図1に示す式を有する、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項32

前記多官能性有機ペルオキシドが、2,2’−ジヒドロペルオキシ−2,2’−ジブチルペルオキシド;2,2−ジヒドロペルオキシブタン;1,1−ジヒドロペルオキシメタン;1,1−ジヒドロペルオキシプロパン;1,1−ジヒドロペルオキシブタン;1,1’−ジヒドロペルオキシ−1,1’−ジプロピルペルオキシド;1,1’−ジヒドロペルオキシ−1,1’−ジブチルペルオキシド;1,1’−ジヒドロペルオキシ−1,1’−ジエチルペルオキシド;1,1,5,5−テトラヒドロペルオキシペンタン;3,7−ビス−ヒドロペルオキシ−1,2−ジオキセパン;および1,1−ジヒドロペルオキシエタンから成る群より選択される、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項33

前記多官能性有機ペルオキシドが、0.01%〜0.25%の間の濃度で使用される、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項34

前記多官能性有機ペルオキシドが、0℃〜50℃の間の温度で使用される、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項35

前記多官能性有機ペルオキシドが、0.25時間〜72時間にわたり、不活化のために使用される、前記いずれかの請求項に記載のプロセス、方法、溶液または組成物。

請求項36

残存するまたは過剰なペルオキシドが、前記試料の処理後に除去される、前記いずれかの請求項に記載のプロセス。

請求項37

除去が、還元剤を用いるものである、請求項36に記載のプロセス。

請求項38

前記還元剤が、アスコルビン酸または還元糖である、請求項37に記載のプロセス。

技術分野

0001

この出願は、米国仮出願第61/395,117号(2010年5月6日出願)(この完全な内容は、全ての目的のために参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。

0002

技術分野
本発明は、微生物不活化におよび/または核酸の分解に(および特に、DNAの分解に)有用である化合物の分野にある。

背景技術

0003

ウイルスおよび細菌を不活性にするためのそれらの処理は、廃水または下水衛生化を含む様々な領域において、およびワクチンなどの非経口薬の分野においても重要である。例えば、多くのワクチンは微生物に基づいており、これらの微生物は、生感染性物質が最終ワクチンに存在しないことを確実にするように不活化される。ポリオウイルスの不活化が失敗した1950年代の「カッター(Cutter)事件」から公知であるように、不活化の失敗は、深刻な安全性リスクをもたらし得る。

0004

不活化処理は、代表的に化学的手段に基づく。化学的処理としては、洗剤ホルムアルデヒド(通常はホルマリンとして)、β−プロピオラクトン(BPL)、グルタルアルデヒドエチレンイミンフェノールなどの使用が挙げられる。これらの不活化剤は、長年にわたって使用されている。例えば参考文献1(非特許文献1)を参照のこと。

0005

これらの不活化剤の一部は、核酸の分解にも有用である。この分解は、ウイルスまたは細菌自体の不活化において役割を果たすことができるが、成長中に使用されてきた任意の細胞基質から残存核酸を無くすことにも有用であり得る。例えば、ウイルスを細胞培養で成長させて、ワクチンを調製するための材料を得ることができ、および製造中に、細胞培養基質からの一切の残存核酸を分解する工程を含むことは通例であり、それによって潜在的に発癌性の材料を除去する。参考文献2(特許文献1)には、ウイルスの不活化と宿主細胞DNAの分解の両方のためのBPLの使用が記載されている。

0006

特定の微生物に応じてその最良の不活化剤は様々である。例えば、ウイルスの形態(サイズ、カプシド化(capsidation)、エンベロープなど)の相違は、不活化感度の相違につながる。例えば、参考文献3(非特許文献2)の付録2を参照のこと。一部の処理(例えば、非常に苛酷な加熱、消毒剤、強いUV線または放射線)は、普遍的に微生物を不活化することができるが、これらは免疫原性破壊し、そのため有効なワクチンの調製には不適切である。その代りとして、ワクチン免疫原性を保ちながら問題の微生物に対して有効であるような不活化処理が選択される。それ故、残念なことに、この処理は活性形態汚染因子を残すことがあり、ことによると、頑感染性因子によるワクチン汚染につながる。従って、ターゲット微生物と潜在的汚染物質の両方を不活化する広域スペクトルの不活化剤が必要とされている。そのような不活化剤は、ウイルス不活化推奨されるウシ血清またはトリプシンなどの製品[4(非特許文献3)]の処理にも有用であるだろう。

0007

一部の不活化剤に伴うもう1つの難点は、それらの安定性である。ホルムアルデヒドは、特に高温で有効な不活化剤であるが、それは非常に安定であり、そのため不活化後残留物が残存する。これらの残留物は、残留活性微生物についての下流の試験干渉することがある。従って、これらの試験では高希釈物が使用されるが、これはそれらの感度を低減する。さらに、それらの残留物は、最終ワクチンにおける免疫応答に干渉することがあり、例えば、参考文献5(非特許文献4)は、ホルマリン不活化ワクチン過敏症を引き起こす危険がより高いだろうことを示唆している。

0008

最後に、ホルムアルデヒドでの不活化は、いくつかの状況では可逆的であり得る[6、7]。

0009

国際公開第2007/052163号

先行技術

0010

Mayrら編、Handbuch der Schutzimpfungen in der Tiermedizin Verlad Paul Barey(1984年)
European guidelines on Viral Safety Evaluations of Biotechnology Products; ICH Q5A (CPMP/ICH/295/95)
Note for Guidance on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal products, CPMP/BWP/1793/02
Moghaddamら、Nature Medicine(2006)12:905〜7

発明が解決しようとする課題

0011

従って、新規の改善された微生物不活化剤が必要とされている。これらは、頑丈なものを含めて様々な微生物に対して、所望の免疫原性を除去することなく、有用であらねばならない。それらはまた、干渉するまたは有害な残留物を殆どまたは全く残してはならず、その不活化は、可逆的であってはならない。理想的には、それらは、核酸の分解にも適したものであらねばならず、水性媒体の存在下であってもそれらの活性を示さねばならない。

課題を解決するための手段

0012

本発明は、微生物不活化剤として、および/または核酸を分解するために、多官能性有機ペルオキシドを使用する。これらの不活化剤は、(i)少なくとも1つの炭素原子またはバックボーンと(ii)少なくとも2つのペルオキシド基、すなわち、2つの酸素原子間単結合−O−O−を含有する少なくとも2つの基とを含む。前記不活化剤は、理想的にはヒドロペルオキシドであり、すなわち、基−O−O−Hを含有する。そのような化合物は、当該技術分野において既知であるが、今般、それらが、免疫原性に負の影響を及ぼすことなく不活化を達成することができる微生物(レオウイルスなどの安定していることで知られているウイルスを含む)の強力な不活化剤であることを示す。さらに、それらは、高水溶性であり得、毒性分解生成物を生成せず(例えば、酢酸プロピオン酸または酪酸などの単純なカルボン酸しか生成せず)、ならびに広範なpHおよび温度にわたって活性である。さらに、それらは、水性条件で驚くべき安定性を示すことができ、および細胞DNAの分解に有効である。

0013

従って、本発明は、微生物含有試料(例えば、液体試料)を処理するためのプロセスを提供し、このプロセスは、前記試料と多官能性有機ペルオキシドを接触させる工程を包含する。このプロセスは、結果として、試料中の微生物の不活化を生じさせることができる。

0014

本発明は、核酸(例えば、DNA、例えば細胞DNA)を含有する試料(例えば、液体試料)を処理するためのプロセスも提供し、このプロセスは、前記試料と多官能性有機ペルオキシドを接触させる工程を包含する。このプロセスは、結果として、試料中の核酸の分解を生じさせることができる。

0015

本発明は、薬学的組成物を調製するための方法も提供し、この方法は、(i)微生物含有試料と多官能性有機ペルオキシドを接触させて、試料中の微生物を不活化する工程;(ii)工程(i)の生成物から薬学的組成物を調製する工程を包含する。この薬学的組成物は、有用にはワクチン(例えば、ウイルスワクチン)である
本発明は、(i)活性因子、例えばウイルス免疫原、および(ii)多官能性有機ペルオキシドと還元剤との反応生成物を含む薬学的組成物も提供する。前記還元剤および反応生成物は、非毒性であらねばならず、例えば、両方とも糖であり得る。

0016

本発明は、多官能性有機ペルオキシドの水溶液も提供し、ここで、前記多官能性有機ペルオキシドが(a)1重量%未満または(b)5重量%〜70重量%の間のいずれかの濃度で存在する。この溶液は、特に選択肢(a)の場合、微生物も含有することがある。選択肢(a)の場合、その濃度は、通常、0.001%〜0.5%、例えば0.01%〜0.25%の間、0.01%〜0.1%の間、または約0.05%である。選択肢(b)の場合、その濃度は、6%〜60%、7%〜50%、8%〜40%、9%〜35%または10%〜30%の範囲であり得る。

0017

本発明は、(i)不活化された微生物および(ii)1重量%未満(例えば、0.001%〜0.5%の範囲内、例えば、0.01%〜0.25%の間、0.01%〜0.1%の間、または約0.05%)の多官能性有機ペルオキシドを含む液体組成物も提供する。

0018

本発明は、微生物と多官能性有機ペルオキシドとの反応生成物を含む液体組成物も提供する。

0019

本発明は、多官能性有機ペルオキシドを含む殺菌性組成物も提供する。そのような溶液は、微生物が無いことを除いて上で論じた水溶液を含む。

0020

本発明は、薬物の製造に使用するための、例えばワクチンの製造の際に使用するための、任意の上述の組成物も提供する。同様に、本発明は、薬物を製造するためのプロセスを提供し、このプロセスは、任意の上述の組成物を使用する。

0021

本発明は、微生物不活化剤としての多官能性有機ペルオキシドの使用も提供する。本発明は、微生物不活化剤として使用するための多官能性有機ペルオキシドも提供する。本発明は、微生物不活化剤としての本発明の水溶液の使用も提供する。本発明は、微生物不活化剤として使用するための本発明の水溶液も提供する。

0022

試料
本発明は、微生物含有試料の処理に有用である。これらの試料は、好ましくは液体試料であるが、固体、例えば容器または作業場の表面、であってもよい。そのような試料としては、微生物培養液血液製剤血清血漿、または血液由来製剤(例えば、抗血液凝固薬);動物由来原料および製品;微生物によって汚染され得る他の原料;ワクチンおよび診断薬生産(例えば、ELISA)の際の組換えタンパク質、材料および中間体微生物剤を利用するプロセスからの廃棄物;廃水、下水;食品(例えばミルク);などが挙げられるが、これらに限定されない。

0023

本発明は、試料の消毒または滅菌において、および特に、表面上で生きている微生物を破壊するための該表面の消毒のために、さらなる用途を有する。例えば、本発明は、使用前に作業面を消毒するために、使用前に外科用器具もしくはインプラントを滅菌するために、または消毒もしくは滅菌が望ましい任意の他の目的のために、使用することができる。

0024

本発明は、ウイルスと細菌の両方を含む様々なタイプの微生物の不活化に有用である。エンベロープウイルスおよび無エンベロープウイルスに関してそれを使用することができる。RNAゲノム(一本もしくは二本鎖)またはDNAゲノム(一本もしくは二本鎖)を有するウイルスに関してそれを使用することができ、一本鎖ゲノムは+センスであってもよいし、−センスであってもよい。分節ゲノムまたは非分節ゲノムを有するウイルスに関してそれを使用することができる。カプシド単数もしくは複数)を有するウイルス、またはカプシドを有さないウイルスに関してそれを使用することができる。グラム陰性菌またはグラム陽性菌に関してそれを使用することができる。

0025

従って、前記試料は、以下のものの1つ以上を含有し得る:
オルトミクソウイルスインフルエンザA型B型またはC型ウイルスなどの、オルトミクロウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。インフルエンザA型またはB型ウイルスは、汎流行間期(interpandemic)(周年性/流行期性)株である場合もあり、または汎流行アウトブレイクを引き起こす可能性のある株(すなわち、現在循環している株中の赤血球凝集素に比べて新しい赤血球凝集素を有するインフルエンザ株、または鳥類被験体において病原性であり、且つ、ヒト集団において水平伝播する可能性を有するインフルエンザ株、またはヒトに対して病原性であるインフルエンザ株)からのものである場合もある。特定の流行期におよび株の性質に依存して、インフルエンザA型ウイルスは、次の赤血球凝集素サブタイプの1つ以上に由来し得る:H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15またはH16。
パラミクソウイルス科ウイルスニューモウイルス(RSV)、パラミクソウイルス(PIV)およびモルビリウイルス麻疹)などの、パラミクソウイルス科ウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
● ニューモウイルス:ニューモウイルスまたはメタニューモウイルス、例えば呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、マウス肺炎ウイルスおよびシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、を不活化するために本発明を使用することができる。好ましくは、前記ニューモウイルスは、RSVまたはヒトメタニューモウイルスHMPV)である。
● パラミクソウイルス:1、2、3または4型パラインフルエンザウイルス(PIV)、流行性耳下腺炎センダイウイルスシミアンウイルス5、ウシパラインフルエンザウイルスおよびニューカッスル病ウイルスなどの、パラミクソウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。好ましくは、前記パラミクソウイルスは、PIVまたは流行性耳下腺炎である。
● モルビリウイルス:麻疹などのモルビリウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
ピコルナウイルスエンテロウイルスライノウイルスヘパナウイルス(Heparnavirus)、カルジオウイルスおよびアフトウイルスなどの、ピコルナウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
● エンテロウイルス:1、2または3型ポリオウイルス、1〜22および24型コクサッキーAウイルス、1〜6型コクサッキーBウイルス、1〜9、11〜27および29〜34型エコーウイルスECHOウイルス)ならびにエンテロウイルス68〜71などの、エンテロウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。好ましくは、前記エンテロウイルスは、ポリオウイルス、例えば、MahoneyもしくはBrunendersなどの1型株、MEF−Iなどの2型株、またはSaukettなどの3型株である。
● ヘパルナウイルス:A型肝炎ウイルスなどのヘパルナウイルス(へパトウイルスとも呼ばれる)を不活化するために本発明を使用することができる。
トガウイルスルビウイルス、アルファウイルスまたはアルテリウイルスなどの、トガウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。風疹ウイルスなどのルビウイルスが好ましい。不活化に有用なアルファウイルスとしては、サケ膵臓病ウイルス(salmon pancreas disease virus)および睡眠病ウイルス(sleepingdisease virus)などの、水生アルファウイルスが挙げられる。
フラビウイルスダニ媒介脳炎(TBE)、デング熱(1、2、3または4型)、黄熱病日本脳炎西ナイル脳炎セントルイス脳炎ロシア春夏脳炎、ポワッサン脳炎などの、フラビウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
C型肝炎ウイルス:C型肝炎ウイルス(HCV)を不活化するために本発明を使用することができる。
ペスチウイルスウシウイルス性下痢(BVDV)、ブタコレラCSFV)またはボーダー病(Border disease)(BDV)などの、ペスチウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
ヘパドナウイルスB型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
ラブドウイルス:リッサウイルス(例えば、狂犬病ウイルス)およびベシクロウイルス(VSV)などの、ラブドウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
カリシウイルス科ノーウォークウイルス、ならびにノーウォーク様ウイルス、例えばハワイウイルス(Hawaii Virus)および雪山ウイルス(Snow Mountain Virus)、ならびにベシウイルス(Vesivirus)、例えばブタ小水疱発疹ウイルス、などの、カリシウイルス科を不活化するために本発明を使用することができる。
コロナウイルスSARS、ヒト呼吸器系コロナウイルス、トリ伝染性気管支炎(Avian infectious bronchitis)(IBV)、マウス肝炎ウイルスMHV)およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)などの、コロナウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
レトロウイルスオンコウイルスレンチウイルスまたはスプーマウイルスなどの、レトロウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。オンコウイルスは、HTLV−1、HTLV−2またはHTLV−3であり得る。レンチウイルスは、SIV、HIV−1またはHIV−2であり得る。
●レオウイルス:オルトレオウイルス、ロタウイルスオルビウイルスまたはコルティウイルスなどの、レオウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
パルボウイルス:パルボウイルスB19またはボカウイルス(Bocavirus)などの、パルボウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
● 他の肝炎ウイルスデルタ肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルスまたはG型肝炎ウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
ヒトヘルペスウイルス単純ヘルペスウイルス(HSV)、水痘−帯状疱疹ウイルス(VZV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6(HHV6)、ヒトヘルペスウイルス7(HHV7)およびヒトヘルペスウイルス8(HHV8)などの、ヒトヘルペスウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
パポバウイルスパピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなどの、パポバウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。パピローマウイルスとしては、HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63および65が挙げられる。
アデノウイルス科ヒトアデノウイルスA、B、C、D、E、FまたはGのいずれかを含む、アデノウイルスを不活化するために本発明を使用することができる。
ボルデテラ属百日咳菌などのボルデテラ属の細菌を不活化するために本発明を使用することができる。
クロストリジウム属(Clostridiaceae):破傷風菌およびボツリヌス菌などの、クロストリジウム属を不活化するために本発明を使用することができる。
コリネバクテリウム科:ジフテリア菌などのコリネバクテリウム属を不活化するために本発明を使用することができる。
パスツレラ科インフルエンザ菌などのパスツレラ属の種を不活化するために本発明を使用することができる。
ミコバクテリウム科(Mycobactericeaea):ヒト結核菌(M.tuberculossi)、ウシ結核菌および弱毒化カルメット‐ゲラン杆菌などの、ミコバクテリアを不活化するために本発明を使用することができる。
ナイセリア科:髄膜炎菌および淋菌などの、ナイセリア属の種を不活化するために本発明を使用することができる。
サルモネラ属(Salmonellaceae):チフス菌、S.paratyphi、S.typhimurium、S.enteritidisなどの、サルモネラ属の種を不活化するために本発明を使用することができる。
連鎖球菌属(Steptococcaceae):肺炎連鎖球菌肺炎球菌)、S.agalactiaeおよび化膿連鎖球菌などの、連鎖球菌を不活化するために本発明を使用することができる。
マイコプラスマ科:汚染された細胞培養物または細胞培養由来材料において見つけることができる任意のM.種を含めて、M.pneumonia、M.hyorhinis、M.bovis、M.agalactiae、M.gallisepticumなどの、マイコプラスマを不活化するために本発明を使用することができる。

0026

微生物に加えて、試料は、溶解状態の核酸、例えば残留細胞DNA、も含むことがある。これらの状態は、例えば溶菌ウイルスを細胞培養中に成長させ、細胞を含まない産物を調製したとき、起こり得る。そのような試料の場合、前記多官能性有機ペルオキシドは、微生物を不活化することもでき、溶解状態の核酸を分解することもできるので、ワクチン製造中に、特にウイルスワクチンの製造中に、二重の恩恵をもたらすことができる。従って、本発明による処理のための試料は、微生物および細胞DNA(例えば、MDCKなどの細胞株からのゲノムDNA)を含み得る。

0027

試料が、(微生物も含んで、または含まずに)核酸を含む場合、該核酸は、典型的には、DNA(例えば細胞DNA)を含む。微生物内の(例えば、細菌内の、またはビリオン内の)核酸ではなく、前記核酸は、溶解状態で遊離しているであろう(例えば、細胞内の細胞DNAではなく溶解状態である細胞DNA(すなわち、元々は細胞のものであるが、もはや細胞内に存在しないDNA))。

0028

前記微生物は、意図的に(例えば、ワクチンを調製するためのウイルス成長後に)存在することもあり、(例えば、下水中の、または汚染された細胞培養培地成分、細胞もしくは培養物からの組換えタンパク質発現後の)汚染物として存在することもある。また、幾つかの実施形態において、試料は、微生物を計画的に含有することがあるが、汚染微生物(単数または複数)も含有することがある。

0029

本発明は、ウイルスの不活化に特に有用であるので、微生物含有試料を処理するためのプロセスは、好ましくは、ウイルス含有試料中のウイルスを不活化するためのプロセスである。

0030

幾つかの実施形態では、必ずしも微生物を含有するとは限らないが微生物を含有する疑いのあるかまたはその危険のある試料を処理するために、本発明を使用することができる。これらの実施形態において、前記処理は必須ではないが、危険回避のために微生物不活化を確実にするために(例えば、消毒に)用いられる。一般に、前記試料は、微生物の成長または存続を支持することができるだろう。

0031

微生物を含むことに加えて、試料は、他の材料、例えば細胞基質またはそれらの残留物、細胞核酸(例えば、DNA)、卵タンパク質など、を含有することがある。微生物を不活化することに加えて、有機ペルオキシドは、これらの他の材料と反応することができる。しかし、理想的には、前記試料は、不活化剤との反応について感染性材料と競合する有意な量の非感染性材料を含まない。そのような反応は、不活化剤を浪費する。これらの無駄な反応を被ることがある材料としては、例えば、還元剤(下記参照)が挙げられる。従って、例えば、高レベル残留グルコースを保持する培養を回避し得る。

0032

本発明による試料の処理後、残存するまたは過剰なペルオキシドを除去および/または破壊することができる。これは、様々な方法で、例えば還元剤の添加によって、達成することができる。適する還元剤としては、チオ硫酸ナトリウムアスコルビン酸、糖(例えば、グルコースまたはスクロース;好ましくは還元糖)、多糖類ポリフェノールなどが挙げられるが、これらに限定されない。還元剤(単数または複数)は、代表的に、ペルオキシドに対して(還元基あたりで計算して)モル過剰で、例えば、2:1と4:1の間の化学的不活化剤に対してモル過剰の還元基で添加される。ペルオキシドの初期濃度遮断するために十分な量で還元剤を添加することができる。しかし、既知の終濃度範囲を用いる十分に標準化されたプロセスについては、使用者は、より低い濃度、例えば不活化後に残存するであろう量のペルオキシドを遮断するために十分な濃度、を添加することを好むだろう。

0033

化学的不活化剤に依存して、および使用される還元剤に依存して、不活化された不活化剤が反応溶液中に残存してもよく(例えば、それが無害な場合、例えば、単純な糖の場合)、またはそれを希釈してもよく、またはそれを除去してもよい。除去工程は、関心のある試薬下流プロセシングの一部として(例えば、不活化された材料からのタンパク質またはウイルス成分の精製中に)行うことができる。従って、除去は、限外濾過ダイアフィルトレーション透析クロマトグラフ精製などを伴うことがある。

0034

多官能性有機ペルオキシド
本発明は、多官能性有機ペルオキシドを使用する。そのような化合物は、少なくとも1つの炭素原子またはバックボーンを含む、すなわち、それらはH2O2とは異なる有機物である。それらは、少なくとも2つの基も含む、すなわち、それらは、過酢酸とは異なる複数の官能性ペルオキシド基を含有する。

0035

前記ペルオキシド化合物は、理想的にはヒドロペルオキシドであり、すなわち、基−O−O−Hを含有する。それは複数のヒドロペルオキシド基を含有することもある。他の多官能性有機ペルオキシドは、ペルオキシケタール、例えばCR1R2(OOR3)(OOR4)またはテトラオキサンであり得るが、炭素原子に結合している少なくとも1つの−O−O−H基を含む化合物が好ましい。

0036

少なくとも1つのペルオキシド基が、有機ペルオキシドを生じさせるように炭素原子に結合しており、および幾つかの実施形態では、各ペルオキシド基中の酸素原子の少なくとも1つが、炭素原子に結合している。

0037

前記ペルオキシド化合物は、理想的には、2つのペルオキシド(またはヒドロペルオキシド)基が同じ炭素原子に結合しているジェミナルペルオキシド(またはヒドロペルオキシド)である。

0038

前記化合物は、理想的には、2つ、3つまたは4つのペルオキシド基を有するが、より多数のペルオキシド基を有する化合物を除外しない。

0039

前記化合物は、ホモ二官能性である場合があり、すなわち、それは、2つの同一のペルオキシド(またはヒドロペルオキシド)官能基を含む;従って、不活化剤は、ジェミナルビスヒドロペルオキシドであることがある。あるいは、不活化剤は、ヘテロ二官能性であることがあり、すなわち、それは、2つの異なるペルオキシド官能基を含み、例えば、それは、ヒドロペルオキシド(−OOH)および別のペルオキシド(−OOR(式中、R≠H))を含むことがある。

0040

好ましい化合物は、水溶性である。これは、ワクチン製造中のそれらの使用を容易にする。

0041

好ましい化合物は、ハロゲンを含まない。なぜなら、そのような化合物は、代表的により有害ではないようであるからである。従って、不活化剤は、炭素水素酸素および窒素原子のみから成り得る。特に好ましい化合物は、炭素、水素および酸素原子のみから成る。

0042

好ましい化合物は、500未満、例えば、<300、<250、<200、<150、<100の分子量を有する。

0043

好ましい化合物は、−C(=O)−OOH基を含まず、そのため(例えば過酢酸とは異なり)不活化中に非常に酸性のpHを生じさせない。そのような条件sは、pH感受性免疫原を破壊する場合があり、不活化プロセスに使用されるデバイスおよび機械類腐食につながる場合もある。

0044

好ましい化合物は非爆発性であり、例えば、トリアセトントリペルオキシドは好ましくない。

0045

不活化中、前記化合物は、理想的には、元の生成物より動物(ヒトを含む)に対して毒性である反応または分解生成物を形成しない。

0046

好ましい化合物は、(i)感染性力価の≧5、好ましくは≧7 log10低減でヒトインフルエンザA型ウイルス、および/または(ii)感染性力価の≧3、好ましくは≧5、および特に好ましい≧7 log10低減で3型レオウイルスを不活化することができる。

0047

好ましい化合物は、微生物を、その免疫原性を低減することなく、不活化することができる。特に好ましい化合物は、インフルエンザA型ウイルスを、その赤血球凝集素の免疫原性を低減することなく、不活化することができる。

0048

有用な化合物は、式I:

0049

を有し、ここで式中、
R1aは、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C1−6アルキニル、C1−6−アルコキシ、C2−6−アルケニルオキシ、C(O)H、C(O)C1−6アルキル、C(O)OC1−6アルキル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノ、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノカルボニル、S(O)0−2C1−6アルキル、ヘテロシクロアルキルアリールまたはヘテロアリールであり;
R2aは、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C1−6アルキニル、C1−6−アルコキシ、C2−6−アルケニルオキシ、C(O)H、C(O)C1−6アルキル、C(O)OC1−6アルキル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノ、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノカルボニル、S(O)0−2C1−6アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール、−(CR4R5)nCR6(OOH)2であるか、あるいはR2aは、LによってR2bに連結されており;
R3は、HまたはC(OOH)R1bR2bであり、
R1bは、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C1−6アルキニル、C1−6−アルコキシ、C2−6−アルケニルオキシ、C(O)H、C(O)C1−6アルキル、C(O)OC1−6アルキル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノ、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノカルボニル、S(O)0−2C1−6アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり;
R2bは、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C1−6アルキニル、C1−6−アルコキシ、C2−6−アルケニルオキシ、C(O)H、C(O)C1−6アルキル、C(O)OC1−6アルキル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノ、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノカルボニル、S(O)0−2C1−6アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであるか、あるいはR2bは、LによってR2aに連結されており;
R4は、各出現時、HまたはC1−3アルキル、ヒドロキシルシアノ、ニトロ、C2−4−アルケニル、C1−3−アルコキシ、C2−4−アルケニルオキシ、C1−3−アルキルカルボニルカルボキシ、C1−6−アルコキシカルボニル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−3アルキル化アミノカルボニル、C1−3−チオアルキル、C1−3−アルキルスルフィニル、C1−3−アルキルスルホニル、C1−3−アルキルアミノスルホニルおよびジ−C1−3−アルキルアミノスルホニルから選択され;
R5は、各出現時、HまたはC1−3アルキル、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、C2−4アルケニル、C1−3−アルコキシ、C2−4−アルケニルオキシ、C1−3−アルキルカルボニル、カルボキシ、C1−6−アルコキシカルボニル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−3アルキル化アミノカルボニル、C1−3−チオアルキル、C1−3−アルキルスルフィニル、C1−3−アルキルスルホニル、C1−3−アルキルアミノスルホニルおよびジ−C1−3−アルキルアミノスルホニルから選択され;
Lは、C1−8アルキレンであり;
R6は、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C1−6アルキニル、C1−6−アルコキシ、C2−6−アルケニルオキシ、C(O)H、C(O)C1−6アルキル、C(O)OC1−6アルキル、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノ、場合によりN−モノもしくはN−ジC1−6アルキル化アミノカルボニル、S(O)0−2C1−6アルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールであり;そして
nは、1〜8である。

0050

R1a、R2a、R3、R1b、R2b、R4、R5およびR6のこれらの選択肢に加えて、これらの基のそれぞれは、列挙した選択肢の誘導体である場合もある。

0051

アルキル、アルコキシラジカルのアルキル部分、アルケニル、アルケニルラジカルのアルケニル部分、アルキニルまたはアルキレンは、分岐していてもよく、もしくは非分岐であってもよく、および/または置換されていてもよく、もしくは非置換であってもよい。置換されている場合、各置換基を、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、C1−6−アルキル、C6−10−アリール、ベンジル、C2−6−アルケニル、C1−6−アルコキシ、C2−6−アルケニルオキシ、C1−6−アルキルカルボニル、カルボキシ、C1−6−アルコキシカルボニル、場合によりN−モノまたはN−ジC1−6アルキル化アミノ、場合によりN−モノまたはN−ジC1−6アルキル化アミノカルボニル、場合によりN−モノまたはN−ジC1−6アルキル化アミノスルフィニル、C1−6−チオアルキル、C1−6−アルキルスルフィニル、C1−6−アルキルスルホニル、アミノスルホニル、C1−6−アルキルアミノスルホニルおよびジ−C1−6−アルキルアミノスルホニルから選択することができる。

0052

R3が−Hでなく、R1aがR2aとは異なる場合、これらの化合物は、異なるエナンチオマー形態で存在する場合がある。本発明は、特定のエナンチオマーまたはラセミ混合物を使用することができる。

0053

幾つかの実施形態において、R1aおよびR2aは、同一である。他の実施形態において、R1aおよびR2aは、異なる。

0054

幾つかの実施形態において、R1aおよびR1bは、同一である。他の実施形態において、R1aおよびR1bは、異なる。

0055

幾つかの実施形態において、R2aおよびR2bは、同一である。他の実施形態において、R2aおよびR2bは、異なる。

0056

R1aは、好ましくはHまたはC1−6アルキルまたはC1−4アルキルである。従って、R1aは、HまたはCH3であり得る。

0057

R2aは、好ましくはHもしくはC1−6アルキルもしくはC1−4アルキルもしくは−(CH2)nCH(OOH)2であり、またはLによってR2bに連結されている。従って、R2bは、CH3、Et、n−Prまたは−(CH2)2−4CH(OOH)2であり得る。

0058

R1bは、好ましくはHまたはC1−6アルキルまたはC1−4アルキルである。従って、R1bは、HまたはCH3であり得る。

0059

R2bは、好ましくはC1−4アルキルであり、またはLによってR2aに連結されている。従って、R2bは、CH3、Etまたはn−Prであり得る。

0060

各R4(これらは同じであることもあり、または異なることもある)は、好ましくはHまたは−CH3またはヒドロキシルである。

0061

各R5(これらは同じであることもあり、または異なることもある)は、好ましくはHまたは−CH3またはヒドロキシルである。

0062

Lは、好ましくはC2−5アルキレン、例えば−(CH2)3−、である。

0063

R6は、好ましくはHまたはC1−6アルキルまたはC1−4アルキルである。

0064

nは、好ましくは2〜6であり、または2〜4であり、または3である。

0065

1つの実施形態において、R1aは、HまたはCH3であり;R2aは、CH3、Et、n−Prもしくは−(CH2)nCH(OOH)2であるか、またはR2aは、LによってR2bに連結されており;R3は、HまたはC(OOH)R1bR2bであり;R1bは、HまたはCH3であり;R2bは、CH3、Etもしくはn−Prであるか、またはR2bは、LによってR2aに連結されており;Lは、−(CH2)3−であり;およびnは、3である。

0066

前記化合物は、式II:

0067

を有することがあり、この式中、好ましい実施形態では、R1aは、HまたはCH3であり;およびR2aは、CH3、Etまたはn−Prである。

0068

前記化合物は、式III:

0069

を有することがあり、この式中、好ましい実施形態では、R1aはHまたはCH3であり;R2aは、CH3、Etもしくはn−Prであるか、またはR2aは、LによってR2bに連結されており;R1bは、HまたはCH3であり;R2bは、CH3、Et、n−Prであるか、またはR2bは、LによってR2aに連結されており;およびLは、−(CH2)3−である。

0070

前記化合物は、式IV:

0071

を有することがあり、この式中、好ましい実施形態では、R1aは、Hであり;R1bは、Hであり;およびnは、3である。

0072

適する化合物としては、2,2’−ジヒドロペルオキシ−2,2’−ジブチルペルオキシド;2,2−ジヒドロペルオキシブタン;1,1−ジヒドロペルオキシエタン;1,1−ジヒドロペルオキシプロパン;1,1−ジヒドロ−ペルオキシブタン;1,1’−ジヒドロペルオキシ−1,1’−ジプロピルペルオキシド;1,1’−ジヒドロペルオキシ−1,1’−ジブチルペルオキシド;1,1’−ジヒドロペルオキシ−1,1’−ジエチルペルオキシド;1,1,5,5−テトラヒドロペルオキシペンタン;3,7−ビス−ヒドロペルオキシ−1,2−ジオキセパン;および1,1−ジヒドロペルオキシメタンが挙げられるが、これらに限定されない。1,1−ジヒドロペルオキシエタンが好ましい。これらの化合物のうちの少なくとも幾つかは、当該技術分野において既知であり(例えば、参考文献8〜10を参照のこと)および/または商業的供給業者から、例えばFerak AG(ドイツ、ベルリン)からまたはArkema Inc.(米国、フィラデルフィア)から、入手できる。参考文献8〜10からのまたはこれらの供給業者から入手できる化合物、および特にそれらの水溶性化合物を、本発明で使用することができる。

0073

本発明は、単一の不活化剤化合物を使用することができ、または例えば式Iの1つより多くの異なる化合物を含む、化合物の混合物を使用することができる。混合物が2つの異なる有機ペルオキシドを含む場合、これらは、様々なモル比で、例えば10:1と1:10の間、5:1と1:5の間、2:1と1:2の間、または実質的に等モル比で存在し得る。混合物中の化合物は、例えば056−1と058−1の分子間で、環構造を形成するような水素結合を示すことがある。幾つかの化合物は、ダイマーとして存在することがあり、ならびにモノマーオリゴマーの混合物として存在することもある。

0074

従って、本発明は、式IIの化合物と式IIIの化合物とを含む混合物を使用することができる。そのような混合物において、R1aおよびR1bは、式IIと式IIIの両方において同じであってもよく;および/またはR2aおよびR2bは、式IIと式IIIの両方において同じであってもよい。

0075

不活化剤は、関心のある試料中の微生物を不活化するために十分な濃度で、理想的には所望の微生物(またはその成分)の免疫原性を低減することなく、使用される。それらは、一般に、1重量%未満、および通常は0.001%〜0.5%の範囲内、例えば0.01%〜0.25%の間、0.01%〜0.1%の間、の最終濃度をもたらすように液体試料と混合されるであろう。例えば、添加される多官能性有機ペルオキシド(単数または複数)の全量は、全液体試料の(重量で)約0.75%、0.5%、0.25%、0.2%、0.1%、0.075%、0.05%、0.025%、0.01%または0.005%であり得る。典型的な量は、約0.05%である。

0076

不活化剤は、広範なPH範囲にわたって、例えば、pH5と10の間、pH6と9の間、またはpH7±0.5で使用することができる。不活化を緩衝液の存在下で行ってもよい(緩衝液が不活化剤と一緒に組成物中に存在してもよい)が、これは、通常、必要ではない。

0077

不活化剤は、任意の特定の状況で望まれる結果のために組み合わせた温度/時間スキームで使用され、実質的に同じ結果を達成しながらこれら2つの因子を変動させることができる。不活化は高温でより速く、そのため不活化期間を短縮することができる。状況に依存して、不活化温度は、例えば、長い不活化時間(例えば数時間もしくは数日)で0℃ほどもの低さに保たれることがあり、または短時間(例えば、ほんの数分間)、60℃ほどもの高さに保たれることがある。しかし、より高温では、多くの機能性タンパク質または抗原が損なわれるまたは破壊されることとなり、そのため好ましい処理は、通常、より低い温度(例えば、<30℃)を長時間用いることとなる。任意の特定の状況でのこれらのパラメータの影響を容易に試験することができる。

0078

不活化剤は、化合物が関心のある試料中の所望の微生物を所望の処理期間にわたって不活化できるようにする温度で使用されるだろう。従って、任意の適する温度で、例えば、0℃〜60℃の間、10℃〜50℃の間、15℃〜40℃の間、15℃〜25℃の間、19℃〜23℃の間などで不活化を行うことができる。不活化は、典型的には実質的に一定の温度、例えば±2℃、±1℃、で行われるだろう。しかし、幾つかの実施形態において、不活化は、異なる温度の相、例えば、低温での第一相(例えば、2℃〜8℃の間、例えば約4℃)およびより高温での、典型的には第一相より少なくとも10℃高い、第二相(例えば、25℃〜50℃の間、例えば約37℃)、またはより高温の第一相(例えば、25℃〜50℃の間、例えば約37℃)、その後、より低温の第二相(例えば、2℃〜8℃の間、例えば約4℃)を用いる。

0079

二相プロセスは、多官能性ペルオキシドを不活化と核酸分解の両方に使用する場合、特に有用である。典型的なスキームでは、より低温の相はウイルス不活化に好適であり得、これに対してより高温の相は、核酸分解に好適であり得る。

0080

不活化剤は、関心のある試料中の微生物を所望の温度で、理想的には所望の微生物の免疫原性を低減することなく、不活化するために十分な時間、使用される。不活化処理は、典型的には15分と72時間の間、例えば、6時間〜48時間、12時間〜36時間、18時間〜26時間、または約16時間もしくは約24時間、続く。

0081

不活化される微生物の性質および工業上の設定に依存して、当業者は、(i)不活化時間、(ii)不活化剤の濃度、および(iii)不活化温度の適切な組み合わせを選択することができる。実施において、ワクチン抗原のための不活化処理は、典型的に72時間まで続くが、実施上の理由のため24時間までまたはより短いプロセス時間が好ましい。しかし、数週間までのはるかに長い不活化時間が、例えば細菌抗原無毒化のために、用いられてもいる。頑強な抗原のために、または廃棄物中の微生物の不活化のために、より高い不活化剤濃度およびほんの数分または数時間の短い不活化時間が選択されることもある。

0082

処理の単一ラウンドによって達成されるより高いレベルの分解を達成するまたは確保するために反復を用いて、不活化のまたは核酸分解のプロセスを1回以上行ってもよい(すなわち、多官能性有機ペルオキシドを試料に添加し、試料に作用させ、その後、さらなる多官能性有機ペルオキシドを添加する、など)。例えば、前記プロセスを2回行ってもよい。各ラウンドの時間、温度および濃度を含む条件は、同じであってもよいし、または異なってもよい。異なるラウンドが異なる目的(focus)(例えば、1つのラウンドは不活化に好適であり、別のラウンドは核酸分解に好適であるなど)を有することができるように、条件を変えることができる。任意の2つのラウンドは、好ましくは、同じ多官能性有機ペルオキシドを使用するが、代替法としてそれらは異なる多官能性有機ペルオキシドを使用することができる。あるプロセスは、多官能性有機ペルオキシドを使用する2つのラウンドの間に、残留多官能性有機ペルオキシドを除去するおよび/または分解する工程を含む場合があるが、幾つかの実施形態では、この除去を伴わずに第二のラウンドが進行する場合がある。

0083

組み合わせ処理
本発明の不活化剤をアルキル化剤、すなわち化合物にアルキルラジカルを導入する物質、と組み合わせて使用することができる。適するアルキル化剤としては、β−プロピオラクトン(BPL)などのモノアルキル化剤が挙げられる。BPLは、多くのワクチンの調製の際にウイルスの不活化のために使用されるモノアルキル化剤である[2]。BPLは、核酸を含む様々な生体分子と反応し、アルキル化およびデプリネイションによって構造上の修飾を生じさせる。

0084

従って、本発明のプロセスが、多官能性有機ペルオキシドを使用する工程を伴う場合、そのプロセスは、アルキル化剤を使用する工程も伴うことができる。多官能性有機ペルオキシドとアルキル化剤を同時に使用するのではなく、これら2つの工程を好ましくは別々に行う。すなわち、多官能性有機ペルオキシドを使用して、後ほどアルキル化剤を使用するか、アルキル化剤を既に使用した後に多官能性有機ペルオキシドを使用する。

0085

従って、例えば、本発明は、微生物含有試料を処理するためのプロセスを提供し、このプロセスは、前記試料を、いずれかの順序で、(i)多官能性有機ペルオキシドおよび(ii)BPLなどのアルキル化剤と接触させる工程を包含する。

0086

同様に、本発明は、薬学的組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、(i)微生物含有試料を、いずれかの順序で、多官能性有機ペルオキシドおよびアルキル化剤と接触させる工程;(ii)工程(i)の生成物から薬学的組成物を調製する工程を包含する。両方の処理を伴う工程(i)が、微生物の非常に良好な不活化を達成する。

0087

本発明は、(i)微生物と多官能性有機ペルオキシドの反応生成物、(ii)微生物とアルキル化剤の反応生成物、および/または(iii)微生物と多官能性有機ペルオキシドとアルキル化剤との反応生成物のうちの2つ以上を含む液体組成物も提供する。前記組成物は、β−ヒドロキシプロピオン酸を含むことがある。

0088

本発明は、試料を処理するためのプロセスを提供し、このプロセスは、微生物含有試料とBPLなどのアルキル化剤との反応生成物である前記試料を多官能性有機ペルオキシドと接触させる工程を包含する。逆に、本発明は、試料を処理するためのプロセスも提供し、このプロセスは、微生物含有試料と多官能性有機ペルオキシドの反応生成物である前記試料をBPLなどのアルキル化剤と接触させる工程を包含する。本発明は、これら2つのプロセスのいずれかの結果として得られる処理された試料を使用する工程を含む、薬学的組成物の調製方法も提供する。

0089

上で述べたように、アルキル化剤と組み合わせて使用する場合、処理の少なくとも1つのラウンドは、アルキル化剤によるものであり、処理の少なくとも1つのラウンドは、多官能性有機ペルオキシドによるものである。前記試料を不活化の第一のラウンドにおいてアルキル化剤で、そして不活化の第二のラウンドにおいて多官能性有機ペルオキシドで処理してもよいし、または代替的に、不活化の第一のラウンドにおいて多官能性有機ペルオキシドで、そして不活化の第二のラウンドにおいてアルキル化剤で処理してもよい。不活化のさらなるラウンドをアルキル化剤または多官能性有機ペルオキシドのいずれかで(または任意の他の不活化剤で)行ってもよい。

0090

処理の各ラウンドの時間、温度および濃度を含む条件は、同じであってもよいし、または異なってもよい。BPLによる処理のための有用な条件を下で説明する:
BPLを典型的には1体積%未満(例えば、1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.2%、0.1%、0.075%、0.05%、0.025%、0.01%、または0.005%未満)の最終濃度まで添加する。好ましくは、BPLを0.1%と0.01%の間で使用する。

0091

アルキル化剤を好ましくは緩衝化水性試料に添加し、その溶液のpHを好ましくは5と10の間に維持する。さらに好ましくは、前記溶液のpHを6と9の間に維持する。さらにいっそう好ましくは、前記溶液のpHを7と8の間に維持する。

0092

アルキル化剤による逐次的処理の間に、アルキル化剤除去工程があってもよいが、第一の処理からの残存アルキル化剤を一切除去せずに第二の処理のためにアルキル化剤を添加してもよい。同様に、多官能性有機ペルオキシドを使用した場合には、それをアルキル化剤による処理の前に除去してもよい。

0093

アルキル化剤での、特にBPLでの処理は、異なる温度での相を伴うことがある。例えば、低温での(例えば、2℃〜8℃の間、例えば約4℃での)第一の相、およびより高温での、典型的には第一の相より少なくとも10℃高い(例えば、25℃〜50℃の間、例えば37℃での)第二の相があってもよい。この二相プロセスは、アルキル化剤を不活化とDNA分解の両方に使用する場合、特に有用である。典型的なスキームでは、ウイルス不活化をより低温の相の間で行い、DNA分解をより高温の相の間に行う。下でより詳細に説明するように、上昇された温度が熱感受性アルキル化剤の除去も助長し得る。

0094

アルキル化剤および任意の残留副生成物を、好ましくは、医薬の最終調合前に除去する。従って、最終組成物は、併せて0.1%未満の遊離プロピオン酸とBPL(例えば、0.1%、0.05%、0.025%、0.01%、0.005%、0.001%、または0.01%未満)を含有し得る。好ましくは、最終薬学的組成物は、0.01%未満のBPLを含有し得る。

0095

BPLは、加熱して非毒性β−ヒドロキシプロピオン酸への加水分解を生じさせることによって、便利に除去することができる。加水分解に必要な時間の長さは、BPLの全量および温度に依存する。温度が高いほど、迅速な加水分解が生ずるが、活性なタンパク質性成分を損なわせるほど高く温度を上昇させるべきではない。2時間〜2.5時間、約37℃への加熱がBPLの除去に適している。DNA断片化は、2℃〜8℃でのウイルス不活化工程中ではなく、37℃でのBPL加水分解工程中に主として発生する。

0096

薬学的組成物および製品
本発明は、薬学的組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、微生物含有試料(通常は液体試料)を多官能性有機ペルオキシドと接触させてその中の微生物を不活化する第一の工程、続いてその不活化された材料から薬学的組成物を調製する工程を包含する。不活化された材料を医薬の調製に直接使用することができ、またはそれをさらなる処理、例えば希釈、精製、他の活性成分との組み合わせ、不活性医薬成分との組み合わせなど、に供することができる。

0097

例えば、本発明は、ワクチンを調製するための方法を提供し、この方法は、ウイルス含有試料(例えば、液体試料、例えば培養液)を多官能性有機ペルオキシドと接触させてウイルスを不活化する第一の工程、続いてその不活化されたウイルスから薬学的組成物を調製する工程を包含する。不活化されてウイルスをワクチンの調製に直接使用することができ、またはそれをさらなる処理、例えば希釈、ウイルス成分のさらなる精製、他のワクチン抗原(ウイルス性および/もしくは細菌性)との組み合わせ、緩衝液(単数もしくは複数)との組み合わせ、アジュバントとの組み合わせなど、に供することがある。

0098

このプロセスは、微生物含有試料を調製する最初の工程、例えばウイルスまたは細菌培養工程、を含むことができる。

0099

ウイルスを成長させた後、精製ビリオンに対して、例えば、清澄化細胞培養物中に存在するビリオンに対して、またはそのような清澄化細胞培養物から精製されたビリオンに対して、不活化剤を使用することができる。1つの方法は、清澄化による細胞材料の除去、およびその後、その清澄化された細胞培養物からの、例えばクロマトグラフィーによる、ビリオンの精製を伴うだろう。不活化剤を、この様式で生成されたビリオンに対して使用することができ、またはさらなる必要に応じた限外濾過/ダイアフィルトレーション工程後に使用してもよい。上で述べたように、多官能性有機ペルオキシドは、ウイルスを不活化することに加えて、ウイルスを成長させた細胞基質からの一切の残留DNAを分解することができる。

0100

不活化剤をエンドトキシン除去工程前に使用することができ、またはエンドトキシン除去工程を行った後に使用することができる。

0101

ワクチン組成物は、例えば不活化インフルエンザウイルスからのスプリットまたは表面抗原ワクチンの調製の場合のように、不活化ウイルスからの免疫原性タンパク質(単数または複数)の精製によって調製することができる。

0102

不活化のためのウイルスは、任意の適する基質を用いて、例えば、細胞株培養物中、初代細胞培養物中、の中、などで、増殖させることができる。細胞培養は、多くの場合、哺乳動物細胞、例えば、ハムスター、ウシ、霊長類(ヒトおよびサルを含む)およびイヌの細胞を使用するだろう。様々な細胞タイプ、例えば腎臓細胞、線維芽細胞網膜細胞肺細胞など、を使用することができる。適するハムスター細胞の例は、BHK21またはHKCCという名を有する細胞株である。適するサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞、例えばVero細胞株におけるような腎臓細胞である[11−13]。適するイヌ細胞は、例えば、CLDKおよびMDCK細胞株におけるような腎臓細胞である。従って、適する細胞株としては、MDCK;CHO;293T;BHK;Vero;MRC−5;PER.C6;WI−38;などが挙げられるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスを成長させるために好ましい哺乳動物細胞としては、メイディンダービー・イヌ腎臓に由来するMDCK細胞[14−17];アフリカミドリザル(Cercopithecus aethiops)腎臓に由来するVero細胞[18−20];またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するPER.C6細胞[21]が挙げられる。これらの細胞株は、例えばAmerican Type Cell Culture(ATCCコレクション[22]から、Coriell Cell Repositories[23]から、またはEuropian Collection of Cell Cultures(ECACC)から、幅広く入手できる。例えば、ATCCは、カタログ番号CCL−81、CCL−81.2、CRL−1586およびCRL−1587で様々な異なるVero細胞を供給しており、ならびにカタログ番号CCL−34でMDCK細胞を供給している。PER.C6は、ECACCから寄託番号96022940で入手できる。哺乳動物細胞を使用することと同様に、アヒル(例えば、アヒル網膜)または雌鶏に由来する細胞株、例えばニワトリ胚線維芽細胞(CEF)など、を含む鳥類細胞または細胞株(例えば、参考文献24−26を参照のこと)上でウイルスを成長させることができる。例としては、ニワトリ胚性幹細胞に由来するEBx細胞株、EB45、EB14およびEB14−074[28]を含む、鳥類胚性幹細胞[24、27]が挙げられる。

0103

1つの有用な細胞株は、メイディン・ダービー・イヌ腎臓に由来するMDCK[29−31]である。元のMDCK細胞株は、ATCCからCCL−34として入手できる。MDCK細胞の派生物も使用することができる。例えば、参考文献14は、懸濁培養での成長に適合させたMDCK細胞株(DSMACC2219として寄託された「MDCK 33016」)を開示している。同様に、参考文献32は、無血清培養で懸濁状態で成長するMDCK由来細胞株(FERM BP−7449として寄託された「B−702」)を開示している。参考文献33は、「MDCK−S」(ATCCPTA−6500)、「MDCK−SF101」(ATCC PTA−6501)、「MDCK−SF102」(ATCC PTA−6502)および「MDCK−SF103」(PTA−6503)を含む、非腫瘍形成性MDCK細胞を開示している。参考文献34は、「MDCK.5F1」細胞(ATCC CRL−12042)を含む、感染に対する高い易罹患性を有するMDCK細胞株を開示している。これらのMDCK細胞株のいずれを使用してもよい。

0104

ウイルスを懸濁培養(例えば、参考文献14、35および36を参照のこと)で成長させることができ、または付着培養で成長させることができる。懸濁培養のための1つの適するMDCK細胞株は、(DSMACC2219として寄託された)MDCK33016である。代替法として、マイクロキャリア培養を使用することができる。

0105

ウイルスを無血清培養培地および/または無タンパク質培地で成長させることができる。培地は、ヒトまたは動物起源の血清からの添加物を含有しない場合、本発明の文脈の中で無血清培地と呼ばれる。無タンパク質は、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除して細胞の増殖(multiplication)が生じる培養であるが、ウイルス成長に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどの外因性タンパク質を場合により含むことがある培養を意味すると解される。

0106

材料であって、それら自体は薬学的組成物ではないが、薬学的組成物の調製中に使用されるものである材料を調製するためにも、本発明を使用することができる。例えば、本発明は、多官能性有機ペルオキシドを使用して既存のまたは可能性のある汚染ウイルスを不活化することによる、発酵培養プロセスからの組換えタンパク質分子などの、安全な医薬製品を製造するための方法を提供する。そのようなプロセスに存在し得るまたは導入される得るウイルスは、例えば、多くの不朽細胞株(permanent cell line)に、特に、齧歯動物細胞、例えばCHO(チャニースハムスター卵巣)細胞、またはマウス骨髄腫細胞、に存在するレトロウイルスである。他の汚染物は、動物由来原料、例えばブタトリプシン、ウシ起源培地補充物または動物起源のタンパク質水解物に由来する動物ウイルスであり得る。不活化剤を製造プロセスのほぼいずれの工程にでも導入することができる:原料、緩衝液、培地および他の出発物質の前処理にそれを使用してもよいし、バルク原料(例えば、発酵槽回収物)の回収中もしくは後に、または後の濃縮および精製工程中もしくは後にそれを適用してもよい。しかし、実施上の理由から、プロセスを通して活性微生物が持ち越されるのを避けるためにプロセスの早期に不活化を行うことが好まれる。

0107

薬学的組成物は、通常はそれらの抗原に加えて成分を含み、例えば、典型的には1つ以上の薬学的キャリア(単数もしくは複数)および/または賦形剤(単数もしくは複数)を含む。そのような成分の詳細な論述は、参考文献37において入手できる。ワクチン組成物は、例えば参考文献38および39に開示されているようなアジュバント(例えば、1つ以上のアルミニウム塩を含む、またはサブミクロン水中油型エマルジョンを含むアジュバント)も含むことがある。

0108

薬学的組成物は、特に投与の時点で、好ましくは水性形態であるが、非水性液体形態でまたは乾燥形態で、例えばゼラチンカプセルまたは凍結乾燥物(lyophilisate)などとして、提供することもできる。

0109

薬学的組成物は、1つ以上の保存薬、例えばチオメルサールまたは2−フェノキシエタノール、を含むことがある。水銀を含まない組成物が好ましく、保存薬を含まないワクチンを調製することができる。

0110

薬学的組成物は、例えば、張度を制御するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含むことがある。塩化ナトリウム(NaCl)が典型的であり、これは1mg/mLと20mg/mLの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウムリン酸二水素カリウム無水リン酸二ナトリウム(disodium phosphate dehydrate)、塩化マグネシウム塩化カルシウムなどが挙げられる。

0111

薬学的組成物は、200mOsm/kgと400mOsm/kgの間、例えば、240mOsm/kg〜360mOsm/kgの間、または290mOsm/kg〜310mOsm/kgの間の重量オスモル濃度を有し得る。

0112

薬学的組成物は、1つ以上の緩衝液を含むことがある。典型的な緩衝液としては、リン酸緩衝液;Tris緩衝液;ホウ酸塩緩衝液;コハク酸塩緩衝液;ヒスチジン緩衝液(特に、水酸化アルミニウムアジュバントとともに);またはクエン酸塩緩衝液が挙げられる。緩衝液は、典型的には5mM〜20mMの範囲で含まれるであろう。

0113

薬学的組成物は、典型的に、5.0と9.5の間、例えば、6.0と8.0の間のpHを有する。

0114

薬学的組成物は、好ましくは無菌である。

0115

薬学的組成物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、1用量あたり<1EU(エンドトキシン単位、標準尺度)、および好ましくは1用量あたり<0.1EUを含有する。

0116

薬学的組成物は、好ましくはグルテンを含まない。

0117

薬学的組成物は、洗剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(「Tween」として公知)、オクトキシノール(例えば、オクトキシノール−9(Triton X−100)もしくはt−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(「CTAB」)、またはデオキシコール酸ナトリウム、を含むことができる。洗剤は、痕跡量でのみ存在し得る。

0118

組成物は、単回投与用の材料を含むことがあるか、または多回免疫化用の材料を含むことがある(すなわち、「多回用量(multidose)」キット)。保存薬を含めることは、多回用量の構成(arrangement)において有用である。多回用量組成物に保存薬を含めることの代替法として(またはそれに加えて)、材料の取り出し用無菌アダプタを有する容器に組成物を収容することができる。

0119

薬学的組成物および特にワクチンは、典型的には約0.5mLの投薬体積で投与されるが、小児には半分の用量(すなわち、約0.25mL)が投与されるだろう。

0120

薬学的組成物を様々な方法で投与することができる。最も好ましい経路は、筋肉内注射よる(例えば、腕または下肢への)経路であるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射内、経口、皮内、経皮(transcutaneous)、経皮(transdermal)などが挙げられる。

0121

薬学的組成物は、動物(および特にヒト)患者への投与に適しており、従って、人的用途と獣医学的用途の両方を含む。患者における免疫応答を上昇させる方法においてそれらを使用することができ、この方法は、患者に前記組成物を投与する工程を含む。

0122

これらの方法によって上昇される免疫応答としては、一般に、抗体応答、好ましくは防御的抗体応答が挙げられる。ウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該技術分野において周知である。インフルエンザウイルスについては、例えば、ヒトでの研究により、HAに対する抗体力価は防御と相関することが証明されている。

0123

上で述べたように、ワクチン組成物は、該組成物を受ける患者において惹起される免疫応答(体液性および/または細胞性)を強化するように機能することができる1つ以上のアジュバント(単数または複数)を含むことができる。有用なアジュバントは、1つ以上のアルミニウム塩を含み得る。もう1つの有用なアジュバントは、水中油型エマルジョンを含み得る。他の有用なアジュバントは、当該技術分野において公知である。

0124

水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントを単独でかまたは組み合わせて使用することができる。これらの名前は従来的であるが、いずれも存在する実際の化合物の正確な記述ではないので、単に便宜上用いられている(例えば、参考文献40の第9章を参照のこと)。本発明は、アジュバントとして一般に使用される任意の「水酸化物」または「リン酸塩」を使用することができる。患者に投与するための組成物中のAl+++濃度は、好ましくは5mg/mL未満、例えば、≦4mg/mL、≦3mg/mL、≦2mg/mL、≦1mg/mLなどである。好ましい範囲は、0.3mg/mLと1mg/mLの間である。最大0.85mg/用量が好ましい。

0125

様々な有用な水中油型エマルジョンアジュバントが公知であり、それらは典型的には少なくとも1つの油と少なくとも1つの界面活性剤を含み、油(単数または複数)および界面活性剤(単数または複数)は、生体分解性代謝性)および生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般に、直径が1μm未満であり、これらの小さいサイズは、マイクロフルイダイザーを用いて達成され、安定したエマルジョンを提供する。<220nmである平均直径を有する液滴は、濾過滅菌に供することができるので好ましい。有用なアジュバントとしては、スクアレンおよび/またはポリソルベート80を挙げることができる。使用することができる適するアジュバントとしては、MF59およびAS03として公知のものが挙げられる。

0126

免疫原性薬学的組成物を単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールによって投与することができる。複数の用量を一次免疫化スケジュールでおよび/または追加免疫化スケジュールで用いることができる。多回用量スケジュールでは、様々な用量を同じ経路または異なる経路、例えば、非経口での初回刺激(prime)および粘膜での追加刺激(boost)、粘膜での初回刺激および非経口での追加刺激などによって与えることができる。1用量より多く(典型的には2用量)の投与が免疫原的にナイーブな患者では特に有用である。複数の用量を典型的には少なくとも1週間(例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間など)隔てて投与する。

0127

宿主細胞DNA
上で述べたように、多官能性有機ペルオキシドを本発明に従って使用して核酸を分解することができる。これは、例えば細胞培養物中でのウイルスの成長後に依然として存在する、宿主細胞DNAなどのDNAの分解に特に有用である。

0128

核酸を分解するための多官能性有機ペルオキシドでの処理は、理想的には、核酸が108塩基対あたり10より多くの脱塩基ヌクレオチド残基を含むまで、例えば、それが107塩基対あたり10より多くの脱塩基ヌクレオチド残基、106塩基対あたり10より多くの脱塩基ヌクレオチド残基、または105塩基対あたり10より多くの脱塩基ヌクレオチド残基を含むまで、継続する。脱塩基残基の(および特に、デプリネイション後の)存在は、核酸バックボーンの切断および従って断片化をもたらし得る。

0129

核酸を分解するための多官能性有機ペルオキシドでの処理は、理想的には、残存DNA鎖平均長が1000塩基対未満(例えば、900、800、700、600、500、400、300、200、150、100、75または50塩基対未満)になるまで継続する。好ましくは、残存DNAの長さは、500塩基対未満であり、さらに好ましくは200塩基対未満である。いずれの残存DNAのサイズも、キャピラリーゲル電気泳動または核酸増幅技術を含む、標準的な技術によって測定することができる。これらの残存する短い断片は、それらが機能性タンパク質をコードする可能性が低いもしくはコードすることができない、ヒトレシピエント染色体転位される可能性が低いもしくは転位され得ない、または別様にレシピエントDNA複製機構によって認識される可能性が低いもしくは認識され得ないほど小さい。一般に、機能性タンパク質に翻訳され得るヌクレオチド配列は、プロモーター領域、開始コドン停止コドン、および機能性タンパク質についての内部コーディング配列を必要とする。DNA損傷が、例えば多官能性有機ペルオキシドでの処理によって発生する場合、これらの領域の多くが改変または破壊されるので、転写および/または翻訳はもはや生じ得ない。

0130

薬学的組成物は、好ましくは、1用量あたり10ng未満(好ましくは1ng未満、およびさらに好ましくは100pg未満)の残留DNAを含有するが、痕跡量の宿主細胞DNAがなお存在することもある。一般に、本発明の組成物から排除されることが最も望ましい宿主細胞DNAは、200塩基対より長いDNAである。

0131

残留宿主細胞DNAの測定は、今では生物学的薬剤の慣例的規制要件であり、当業者の通常の能力の範囲内である。DNAを測定するために用いられるアッセイは、典型的には検証されたアッセイであるだろう[41、42]。検証されたアッセイの性能特性数学的な用語および定量可能な用語で説明することができ、その誤差の可能性のある源は同定されているだろう。前記アッセイは、一般に、正確度、精度、特異性などの特性について試験されているだろう。一旦、アッセイを(例えば、宿主細胞DNAの公知標準量に対して)較正し、試験したら、定量的DNA測定を慣例的に行うことができる。DNA定量についての3つの原則技術を用いることができる:ハイブリダイゼーション法、例えばサザンブロットまたはスロットブロット[43];イムノアッセイ法、例えばThreshold(商標)システム[44]:および定量的PCR[45]。これらの方法は、すべて当業者によく知られているが、各方法の特性そのものは、問題の宿主細胞、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび/またはプローブの選択などによって左右され得る。Molecular DevicesからのThreshold(商標)システムは、ピコグラムレベルの全DNAについての定量的アッセイであり、生物製剤中の汚染DNAのレベルのモニタリングに使用されている[44]。典型的なアッセイは、ビオチン化ssDNA結合タンパク質ウレアーゼ結合体化抗ssDNA抗体とDNAとの反応複合体の非配列特異的形成を伴う。すべてのアッセイ成分が、その製造業者から入手できる完全Total DNA Assay Kitに含まれている。様々な商業的製造業者、例えば、AppTec(商標)Laboratory Services、BioReliance(商標)、Althea Technologiesなどが、残留宿主細胞DNAを検出するための定量的PCRアッセイを提供している。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞DNA汚染を測定するための化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと全DNA Threshold(商標)システムの比較は、参考文献46において見つけることができる。

0132

特にMDCK細胞などのイヌの細胞に関して、ゲノムの分析は、長さが<500bpの13のコーディング配列、<200bpの3つの配列および<100bpの1つの配列を示す。従って、<200bpへのDNAの断片化は、実質的にすべてのコーディング配列を除去し、いずれの断片もその長さ付近の3つの遺伝子(すなわち:81bpのセクレチン;108bpのPYY;および135bpのオステオカルシン)のうちの1つに実際に対応する可能性は非常に低い。

0133

短い分解DNAは、長いDNAより容易に組成物から除去することができるので、本発明は、薬学的組成物中の残留DNAの量の低減に有用である。遊離DNAを分解するように微生物含有組成物を処理した後、DNA分解生成物を場合により除去することができる。従って、ウイルス含有試料については、DNA分解生成物をウイルスから分離することができる。小さい可溶性分解DNA断片を、例えばアニオン交換クロマトグラフィー、サイズベースの方法、などによって、ウイルスから容易に分離することができる。

0134

インフルエンザワクチン
本発明は、ワクチン製造中のインフルエンザウイルスの不活化に有用である。インフルエンザウイルス用のワクチンは、ビリオン全体に基づくことがあり、「スプリット」ビリオンに基づくことがあり、または精製表面抗原(赤血球凝集素を含み、通常はノイラミニダーゼも含む)に基づくことがある。本発明をこれらのいずれのタイプのワクチンの製造中にも使用することができる。

0135

インフルエンザビリオンウイルス含有流体、例えば尿膜腔液または細胞培養上清、から様々な方法によって回収することができる。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するために洗剤を含む線形スクロース勾配溶液を使用するゾーン遠心分離を伴うことがある。その後、抗原を必要に応じた希釈後にダイアフィルトレーションによって精製してもよい。

0136

スプリットビリオンは、「Tween−エーテル分割プロセスを含む、サブビリオ調製物を生成させるための洗剤(例えば、エチルエーテル、ポリソルベート80、デオキシコール酸塩、トリ−N−ブチルホスフェート、Triton X−100、Triton N101、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Tergitol NP9など)での精製ビリオンの処理によって得られる。例えばインフルエンザウイルスを分割する方法は、当該技術分野において周知である(例えば、参考文献47〜52などを参照のこと)。ウイルスの分割は、典型的には、感染性であろうと非感染性であろうとウイルス全体を破壊濃度の分割剤(splitting agent)で破壊するかまたは断片化することによって行われる。この破壊は、ウイルスの完全性を改変する、ウイルスタンパク質の完全なまたは部分的な可溶化を生じさせる結果となる。好ましい分割剤は、非イオン性およびイオン性(例えば、カチオン性)界面活性剤、例えばアルキルグリコシドアルキルチオグリコシドアシル糖、スルホベタインベタインポリオキシエチレンアルキルエーテル、N,N−ジアルキルグルカミド、Hecameg、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、NP9、第四級アンモニウム化合物サルコシル、CTAB(セチルトリメチルアンモニウムブロミド)、トリ−N−ブチルホスフェート、Cetavlon、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩リポフェクチンリポフェクタミン、およびDOT−MA、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール(例えば、Triton界面活性剤、例えばTriton X−100またはTriton N101)、ポリオキシエチレンソルビタンエステル(Tween界面活性剤)、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレン(polyoxyethlene)エステルなどである。1つの有用な分割手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの逐次的作用を用い、最初のビリオン精製中に(例えば、スクロース密度勾配溶液中で)分割を行うことができる。従って、分割プロセスは、ビリオン含有材料の(非ビリオン材料を除去するための)清澄化、回収したビリオンの(例えば、CaHPO4吸着などの吸着法を使用する)濃縮、非ビリオン材料からのビリオン全体の分離、密度勾配遠心分離工程において分割剤を使用する(例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの分割剤を含有するスクロース勾配を使用する)ビリオンの分割、およびその後、所望していない材料を除去するための濾過(例えば、限外濾過)を伴う場合がある。スプリットビリオンをリン酸ナトリウム緩衝化等張性塩化ナトリウム溶液に有用に再懸濁させることができる。スプリット・インフルエンザ・ワクチンの例は、BEGRIVAC(商標)、FLUARIX(商標)、FLUZONE(商標)およびFLUSHIELD(商標)製品である。

0137

精製インフルエンザウイルス表面抗原ワクチンは、表面抗原赤血球凝集素および、典型的には、ノイラミニダーゼも含む。精製形態のこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは、当該技術分野において周知である。FLUVIRIN(商標)、AGRIPRAL(商標)およびINFLUVAC(商標)製品は、インフルエンザ・サブユニット・ワクチンである。

0138

HAは、現行の不活化インフルエンザワクチンにおける主免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にSRIDによって測定されるHAレベルに照らして標準化される。既存のワクチンは、典型的には1株あたり約15μgのHAを含有するが、例えば小児には、または汎流行状況では、またはアジュバントを使用するときには、より低い用量を使用することができる。1/2(すなわち、1株あたり7.5μg HA)、1/4および1/8などの分割量が使用されるのと同様に、より高い用量(例えば、3×用量または9×用量[53,54])も使用される。従って、ワクチンは、1インフルエンザ株あたり0.1μgと150μgの間、好ましくは、0.1μgと50μgの間、例えば、0.1μg〜20μg、0.1μg〜15μg、0.1μg〜10μg、0.1μg〜7.5μg、0.5μg〜5μgなどのHAを含むことがある。具体的な用量としては、例えば、1株あたり約45、約30、約15、約10、約7.5、約5、約3.8、約3.75、約1.9、約1.5などが挙げられる。

0139

本発明で使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスにおいて見いだされるような天然HAを有することもあり、または修飾HAを有することもある。例えば、ウイルスを種において高病原性にさせる決定因子(例えば、HA1/HA2切断部位周辺の高塩基性領域)を除去するようにHAを修飾することは公知である。逆遺伝学の使用は、そのような修飾を助長する。

0140

ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス株は、流行期ごとに変わる。汎流行間期では、ワクチンは、代表的に2つのインフルエンザA型株(H1N1およびH3N2)と1つのインフルエンザB型株とを含み、三価ワクチンが典型的である。本発明は、汎流行ウイルス株(すなわち、ワクチンレシピエントおよび一般ヒト集団が免疫学的にナイーブである株、特にインフルエンザA型ウイルス)、例えばH2、H5、H7またはH9サブタイプ株、も使用することができ、汎流行株のためのインフルエンザワクチンは、一価であることもあり、または汎流行株が補足された通常の三価ワクチンに基づくこともある。しかし、流行期に、およびワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、HAサブタイプ、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15またはH16のうちの1つ以上から防護することができる。本発明は、インフルエンザA型ウイルスのNAサブタイプN1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8またはN9のうちの1つ以上から防護することができる。

0141

本発明の組成物は、インフルエンザA型ウイルスおよび/またはインフルエンザB型ウイルスを含めて、1つ以上(例えば、1、2、3、4以上)のインフルエンザウイルス株からの抗原(単数または複数)を含むことができる。ワクチンが1つより多くのインフルエンザ株を含む場合、代表的に、異なる株を別々に成長させ、それらを、ウイルスを回収して抗原を調製した後、混合する。従って、本発明のプロセスは、1つより多くのインフルエンザ株からの抗原を混合する工程を含むことがある。2つのインフルエンザA型ウイルス株および1つのインフルエンザB型ウイルス株からの抗原を含む、三価ワクチンが典型的である。2つのインフルエンザA型ウイルス株および2つのインフルエンザB型ウイルス株、または3つのインフルエンザA型ウイルス株および1つのインフルエンザB型ウイルス株からの抗原を含む、四価ワクチンも有用である[55]。

0142

一旦、インフルエンザウイルスを特定の株について精製したら、それを他の株からのウイルスと組み合わせて、例えば、上で説明したような三価ワクチンを作製することができる。ウイルスを混合し、多価混合物からのDNAを分解するのではなく、各株を別々に処理し、そして一価バルクを混合して最終多価混合物を得ることが好ましい。

0143

一般
用語「含むこと(comprising)」は、「含むこと(including)」および「からなる」を包含する。例えば、Xを「含む」組成物は、Xから排他的に成ることがあり、または追加の何かを含むことがある(例えば、X+Y)。

0144

語「実質的に」は、「完全に」を除外しない。例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まないもある。必要とされる場合、語「実質的に」は本発明の定義から省略されることがある。

0145

数値xに関連して、用語「約」は、必要に応じたものであり、例えばx±10%を意味する。

0146

明確に言及されない限り、2つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、いずれの特定の混合順序も求めない。従って、任意の順序で混合することができる。3成分がある場合には、2成分を互いに併せることができ、その後、その併せたものを第三の成分と併せてもよい、等々。

0147

動物(および特にウシ)材料を細胞の培養で使用する場合、伝染性海綿状脳症(TSE)が無いおよび特にウシ海綿状脳症BSE)の無い源からそれらを得るべきである。全般的に、動物由来材料がまったく無い細胞を培養することが好ましい。

0148

化合物を組成物の一部として身体に投与する場合には、代替的にその化合物を適するプロドラッグで置換してもよい。

0149

細胞基質を(例えば、再集合または逆遺伝学のために)使用する場合、好ましくは、それは、例えば欧州薬局方総則(Ph Eur general chapter)5.2.3におけるような、ヒトワクチン生産における使用が認可されているものである。

図面の簡単な説明

0150

図1は、本発明の様々な不活化剤の構造を示す。
図2〜4は、時(図2および3では時間;図4では日)の経過につれてのDMEM中の薬剤069−1の含有率(%)を示す。矢印は、不活化剤(アスコルビン酸またはグルコース)の添加を示す。
図2〜4は、時(図2および3では時間;図4では日)の経過につれてのDMEM中の薬剤069−1の含有率(%)を示す。矢印は、不活化剤(アスコルビン酸またはグルコース)の添加を示す。
図2〜4は、時(図2および3では時間;図4では日)の経過につれてのDMEM中の薬剤069−1の含有率(%)を示す。矢印は、不活化剤(アスコルビン酸またはグルコース)の添加を示す。

実施例

0151

公知の不活化剤
公知不活化剤(β−プロピオラクトン、エチレンイミン、N−アセチルエチレンイミン、ホルマリン)を4つのウイルス:(i)エンベロープが無く、dsRNAゲノムを有する、3型レオウイルス;(ii)エンベロープを有し、dsDNAゲノムを有する、HSV−1ヘルペスウイルス;(iii)エンベロープが無く、dsDNAゲノムを有する、アデノウイルス5;および(iv)エンベロープを有し、ssRNAゲノムを有する、鳥類C型レトロウイルスについて試験した。レオウイルスは、二重カプシド層を有する小さな無エンベロープウイルスであり、そのようなウイルスは、不活化(それらに勝るのは結核菌および細菌胞子だけである[56])に対して非常に耐性である。

0152

結果を処理後のウイルス力価のlog10低減率(log10 reduction factor)として表1に表示する:

0153

これらのデータは、ヒトワクチンに使用した2つの主要な不活化剤(BPLおよびホルムアルデヒド)はすべての必要性を満たすことができないことを示す。安定したウイルスの低レベルの感染性でさえ、材料が下流での使用に(例えば、診断試薬として、またはワクチンもしくは他の医薬製品として)安全でない場合があることを意味する。

0154

新規な不活化剤
その安定性のため、レオウイルスモデル樹立して、新規不活化剤の活性を評価した。哺乳動物オルトレオウイルス、3型(Dearing株、ATCCVR−824)をL929マウス結合組織細胞(ATCC Cl−1)において成長させた。感染培養物の細胞を含まない培養上清からウイルスストックを作製し、アリコートに分け、その後、−60℃未満で保管した。不活化研究のためにウイルスを解凍し、その後、0.05%不活化剤を添加し(体積で1:2000)、その混合物を、ある一定の期間、低温(2℃〜8℃)、室温(19℃〜23℃と測定された)または37℃でインキュベートした。BPLとの比較を可能にするために、(i)不活化反応を一時的に37℃に上昇させ、(ii)チオ硫酸ナトリウムを不活化終了時に添加した(1mLの不活化溶液につき20μLの1.4Mストック溶液)。その後、標準的な力価測定(titration)により試料を残留感染性ウイルスについて試験した。ウイルス調製物の10倍系列希釈物をマイクロタイタープレートのL929培養物に接種した。成長ウイルスは、5〜6日後、顕微鏡により見ることができる細胞変性効果を生じさせる。力価をスピアマンカーバー法(Spearman−Kaerber method)によって計算した[57]。それを1mLあたりのlog10 TCID50として表現する。残留力価が検出限界(1mLあたり1.5 log10 TCID50)より下である場合、それらを、対照試料力価と≦1.5と間の差として表現する。そのような低減を「≧」記号によって示す。

0155

第二の試験ではインフルエンザウイルスを使用した。それはレオウイルスより安定性が低い。本質的にはレオウイルスについて説明したようにウイルス力価測定を行ったが、L929ではなくMDCK細胞を用いた。加えて、そのエンベロープ赤血球凝集素糖タンパク質(重要なワクチン免疫原)の安定性を評価した。赤血球凝集試験によってそれを機能的にアッセイすることができる。定量的HAアッセイのために、ウイルス調製物をPBS系列希釈(log2希釈)し、PBS中の0.5%ニワトリ赤血球と共にインキュベートした。周囲温度でのインキュベーション後、HA反応を評価した。明確な赤血球凝集を依然として生じさせる最高ウイルス希釈度逆数として活性を表現し、不活化前および後の力価として結果を示す。

0156

図1および/または表18からの番号付けで、様々な不活化剤を試験した。すべてが0.05%の濃度であった。混合物を使用したときはこれが総不活化剤濃度である。
レオウイルスでの結果は次のとおりであった(表2):

0157

前の結果でわかるように、BPL数値は、レオウイルス不活化が困難であることを裏付ける。複数のペルオキシドを有するすべての不活化剤は、BPLより(および前の実験でのホルムアルデヒドより)良好な不活化をもたらした。単一のペルオキシドを有する化合物(072)は、不良に機能した。より短い鎖長を有する(C4より低い)化合物は、最良の結果をもたらした。温度が高いほど良好な結果をもたらしたが、37℃での長いインキュベーションは、良好な熱安定性を有することができない抗原には理想的でない。より高温でより短時間が最適だろう。

0158

インフルエンザウイルスでの結果は次のとおりであった(表3):

0159

このように、検出限界より下へのインフルエンザウイルスの不活化が慣例的に達成された。さらにまた、より短い鎖長を有する化合物は最良の結果をもたらし、長い鎖長を有する分子、例えば071−1、078および080、ほど低い不活化能力を有した。さらに、すべての場合、および不活化温度にかかわらず、赤血球凝集力価は不活化による影響を受けなかった。これは、表面糖タンパク質抗原性が無損傷のままであることを示す。

0160

安定した無エンベロープウイルス・細菌での結果は、成功裏の細菌の不活化も期待できることを意味する。1968年、Spauldingは、化学的不活化および消毒に対する耐性のレベルを定義した[56]。この格付けによると、細菌(一部のマイコバクテリアおよび胞子を除く)は、の(非脂質性)ウイルスより化学的不活化に対する耐性が低い。この格付けは、何十年も前に確立されたが、未だに有効かつ適用可能である[58]。従って、安定した無エンベロープウイルスに対する効力は、細菌もこれらの化合物によって不活化できることを意味する。

0161

不活化剤069−1の不活化能力をさらなるウイルスに対して試験した。これらの研究では、濃度、時間および温度を変化させて、不活化に適する条件をさらに評価した。力価測定法の検出限界(≦101.5 TCID50/mL)より下への完全な不活化が観察された場合、より低い検出限界を有する残留ウイルスについての試験を部分的に行った。ウイルスに関して陰性の場合、そのような「残留ウイルス試験」の結果は、1mLの不活化試料あたりのそれぞれの検出限界を示すことによって得られる。これらの検出限界は、試験培養物に接種される試料体積に依存する。10mLの試料体積について、10−1.5 TCID50/mLという検出限界を得、1mLの試料体積について、それぞれの検出限界は、10−0.5 TCID50/mLであり、0.1mLの試料体積については、100.5 TCID50/mLであった。

0162

試験培養物中の残留細胞毒性(試験培養物中の細胞剥離または細胞死初期徴候によって示される)が、信頼できる力価読み取りを損なわせた場合、それらの力価測定希釈度(titration dilution)を評価しなかった。したがって、陰性力価測定の場合、適用可能な検出限界は、より高く、例えば、≦102.5 TCID50/mLであった。不活化剤およびアスコルビン酸の残留物を有する接種材料が、試験培養物上に残っている場合、最低力価測定希釈度で細胞毒性反応がある程度観察された。より大きな試料体積での残留ウイルス試験では、より大きな培養物を使用したので細胞毒性効果は観察されず、37℃で1時間のウイルスを吸着させた後に接種材料を除去し、中性緩衝液または培地で培養物を洗い流して(flush)残留化学物質を除去した。

0163

その後、log10低減値を、出発力価(同じ条件に曝露したが、不活化剤なしで緩衝液を添加した「保留試料(hold sample)」を用いて測定した)と不活化後の残留力価との差として計算した。「≧」符号を有する不活化率は、適用した方法の検出限界より下への完全な不活化を示す。その記号のない不活化率は、残留ウイルスの存在を示す。

0164

次の表は、ウイルス力価測定のためにおよびより大きい試料体積を用いる必要に応じた残留ウイルス試験のために使用したウイルスおよび利用した細胞培養物を示す。この表は、細胞およびウイルスの起源についての情報も提供し、細胞培養物接種とウイルス力価決定との間のインキュベーション期間(日)にも言及する。3%〜5%ウシ胎仔血清を補足したDMEM(ダルベッコ変性イーグル培地)で細胞培養物を成長させた。5%CO2および90%湿度を含有する雰囲気下、37℃で、試験培養物をインキュベートした。

0165

不活化剤069−1を0.025、0.05または0.1%(体積/体積)最終濃度の濃度で添加し、示した期間にわたってインキュベートした。所定の時点で不活化を停止させるために、0.2%の最終濃度を得るようにL+アスコルビン酸を添加した。この停止剤は、100mLの蒸留滅菌水中の20g L+アスコルビン酸を含有する20%ストック溶液として調製した。その後、その溶液を0.2μmフィルターに通すことによって濾過滅菌した。

0166

表4〜13は、様々な濃度の薬剤069−1による、および種々の条件下での、種々のウイルスモデルの不活化を示す。これらのウイルスの大部分は、無エンベロープであり、ならびに化学的不活化剤によって、およびウイルス抗原性を保存するために適用される条件下で、容易に不活化されない安定したウイルスの代表である。二本鎖ウイルス(ヘルペスウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、およびポリオーマウイルス)を選択した。なぜなら、それらは、化学的不活化および他の処理条件に対する耐性がより高いからである。これらのウイルスの大部分は、生物製剤プロセス用のプロセスのプロセス不活化を検証するためのモデルウイルスとして使用されている[59]。

0167

BPLによる種々のウイルスの不活化についてのデータを表14に提供する。表4〜13のデータは、069−1が、殆どの場合、優れた不活化をもたらすことを示す。

0168

不活化によって誘導される細胞DNA損傷の分析
細胞DNAに対する薬剤069−1の効果を、細胞培養産物またはインフルエンザ感染細胞不含MDCK培養産物(残留細胞DNAを含有)を該不活化剤に曝露すること、およびその後、市販の「DNA Damage Quantification Kit」(Biovision)を使用して脱塩基部位APS)について抽出DNAを分析することによって測定した。このキットは、核酸の脱塩基部位のアルデヒド基と特異的に反応するアルデヒド反応性プローブ(ARP)を含有する。未結合ARPの除去後、DNAをマイクロタイタープレートウエルに結合させ、ペルオキシダーゼ反応呈色反応を発現する基質とによって標識部位を染色する。前記試験キットは、検量線の生成に使用するための標準物質も含有する。

0169

DNA抽出は、Complex800_V4プロトコル(Qiagen)を用いてQIAsymphony SP自動抽出でQIAsymphony(登録商標)Virs Bacteria Mini Kitを使用して行った。260nmおよび280nmでの吸収値(adsorption value)に基づきNanoPhotometer(商標)で溶出試料のDNA濃度を決定した。その後、DNA Damage Qauntification Kitのために、すべての試験試料をTris/EDTA(TE)緩衝液で0.1μg/mL DNAの最終濃度に希釈/調整した。TE緩衝液は、陰性対照としての役割を果たした。

0170

DNA損傷およびAPSの測定は、前記試験キットの指示に従って行った。標準曲線の定量的試験範囲をはるかに超える強い反応のため、1つの試験試行のすべての標識および洗浄試料を同じ比で希釈することによってこれを補償するよう試みた。それにもかかわらず、信頼できる定量的試験範囲より上の極度の呈色反応は避け難かった。従って、105塩基対あたり40APSの上部標準曲線範囲より上のAP部位の値は、それより下のものより信頼性が低いだろう。さらに、操作者による誤差または固有の試験不一致に起因すると考えることができない高い試験変動性も観察された。

0171

しかし、インフルエンザウイルス感染細胞からのDNAは、種々のウイルス株を感染のために使用したとき特に高い変動性を示した。これは、アポトーシス的損傷DNAが、正常細胞DNAとは異なって反応し得ることを示している。それ故、試験を半定量的比較方法で、ならびに参照およびコンパレーターとしてBPL不活化試料を含めることによって、試験を適用した。従って、定量的試験結果および絶対値(105塩基対あたりのAPS)は、異なる試験間で比較すべきでなく、1つのおよび同じ試験試行の中で試験した異なる条件を比較するためにのみ使用すべきである。

0172

下に示すデータセットは、別々の表における1つの比較試験試行によって得られた結果を提供するものであり、同じ表中の異なる試験試行からの混合された結果を提供するものではない。直接比較に必要とされる場合を除き、試験キット・マイクロタイター・プレートへの吸着前の試料希釈を考慮しなかった。従って、異なる試験試行において試験した類似の条件について異なるAPS値を示すことがある。1より上のAPS値は、小数点のない丸めた数値として与えた。

0173

BPLの一般に適用される0.05%最終濃度を用いて不活化された試料により、BPL不活化からの比較結果を得た。不活化は、常に、BPLを低温ウイルス調製物に添加することおよび2〜8℃で16時間インキュベートすることによって適用した。その後、温度を37℃に上昇させることおよびさらに2時間インキュベートすることによって、不活化を停止させた。37℃で、最初のうちは不活化が漸増速度続き、同時にBPLが急速に分解される。従って、その上昇した温度はDNA損傷にも影響を及ぼすと予想され、および/または部分的に損傷したDNAに対する二次反応に寄与する。

0174

下の表に示す濃度および温度で16時間の標準不活化時間を用いて069−1での不活化を行った。アスコルビン酸の添加により不活化を停止させた。特定の研究のためおよび直接比較のためだけに、069−1での不活化を、BLPについて用いたようなインキュベーション条件、すなわち2−8℃で16時間、加えて37℃で2時間、にも供した。

0175

表15は、相対APS値を示す(1は未処理試料である)。3つの異なるインフルエンザ株(A/Christchurch/16/10 NIB−74、A/Brisbane/10/2010およびA/California/7/09 X−179A)で感染させた細胞上清からのDNAを使用した。A/Californiaを除き、DNA損傷は、BPLでより069−1でのほうが高く、濃度依存的であった。

0176

表16は、インフルエンザ感染細胞DNA(B/wisconsin/1/2010株)を、単回の不活化の場合の異なる濃度の069−1で処理したときの、または2回の逐次的不活化ラウンドで処理したときの、相対APS値を示す。観察されたDNA損傷は、より低濃度の069−1を使用したときでさえ、BPLよりも069−1でより強く、それらの効果は濃度依存的であった。この2回の不活化は、単回の不活化より強いDNA損傷を明確に生じさせた。

0177

表17は、インフルエンザ感染細胞DNA(B/Wisconsin/1/2010株)を先ずBPL(16時間、2−8℃、その後2時間、37℃)で処理し、続けて異なる濃度の069−1で不活化したときの相対APS値を示す。このシリーズでは、069−1も標準BPL不活化についてのものと同じ条件下で使用した。この不活化もアスコルビン酸によって停止させた。多少の注意払うと(二重不活化試料は、すべて、試験の測定可能範囲より高く、従って、試験プレートへの吸着前に10倍希釈しなければならなかった)、DNA損傷は、BPLおよび069−1での二重処理によって明確に増加された。最初の低温相後の069−1についての不活化温度を、2時間、37℃へ上昇させることも、DNA損傷を大きく増進させた。明らかに、BPLによって引き起こされるDNA損傷を二回のBPL処理によってのみ増進させることができるわけではなく、BPLに加えて069−1などのヒドロペルオキシド不活化剤を使用することによってもさらにいっそう増進させることができる。

0178

合成および安定性
ジェミナルジヒドロペルオキシドの一般合成を、理想的には適する触媒の存在下で、次のように行うことができる:

0179

この合成は、安定性によって制限され、構造に依存する。非常に高い酸素含有率(例えば、化合物069−1は68%酸素を有する)にもかかわらず、一部の化合物は著しく安定しているが、それらは、取り扱いを間違えると自然爆発または分解する傾向があり得る。この効果は、アルキル側鎖を短くすることによって増加される。安全性考慮のため、それらの化合物を凍結水溶液または凍結固形物として供給するのが最良だろう。

0180

057の不活化能力は、−20℃での6ヶ月の保管後、喪失することが分かったので、新鮮なものを使用するのが最良である。同じことが他の化合物および/または混合物に言えることがある。

0181

化合物の安定性をNMRによって評価した。結果は次のとおりである:

0182

水性条件でのおよび特に培養培地中での069−1の安定性を研究するためにNMRも用いた。これらの研究は、最高分解能500MHz NMRとDMEM中の0.1%069−1を用いた。

0183

図2は、非常に遅い分解を伴う、25℃での安定性を示す。240時間(10日)後、25%しか分解されなかった。240時間後のアスコルビン酸の添加は、即時分解をもたらし、これは、アスコルビン酸を完全に使い切って分解プロセスにもはや利用できなくなったときに停止した(線が横ばいになる)。2モルより多くのアスコルビン酸を1モルの069−1に添加すると、069−1の完全分解が観察できるだろう。

0184

図3は、37℃での安定性を示す。分解は25℃よりも速く、55時間後、50%が分解された。145時間後のアスコルビン酸の添加は、明瞭に観察することができる即時分解を生じさせる結果となる。

0185

図4は、異なる温度でのおよびグルコースの添加後の安定性を示す。30日より長い間、DMEM中、5℃においては分解が無い。グルコースの添加(8倍モル過剰)および5℃で5日間のさらなる保管の後、依然として分解を観察することはできなかった。温度を25℃に上昇させると、分解プロセスがゆっくりと開始したが、約10%の濃度に下がるためには40日超をなお必要とする。

0186

多くのウイルス成長培地が追加のグルコース(または類似の糖)を含有し、これらが不活化剤を分解するかどうかを知ることは重要であったので、グルコースの添加を試験した。少なくともより低温については、これらの糖の存在は問題であるように思われない。

0187

水性条件での069−1の高い安定性は驚くべきことである。なぜなら、ペルオキシ基は非常に不安定であるので、ペルオキシドが一般に(および特に、1−5個しか炭素原子を有さない短鎖ペルオキシドが)急速に分解されやすいまたは爆発さえしやすいことは非常によく知られているからである。薬剤069−1は、DMEMのような複雑な環境ででさえ種々の温度で溶解状態で予想外に高い安定性を示す。この分子は、68%酸素を含有するので、2個しか炭素原子を含有しないジェミナルビスヒドロペルオキシドに対して最も顕著で予想外の安定性レベルを保有する。溶解状態での予想分解時間尺度は、ほぼ数分〜数時間程度であったが、図2−4は、25℃で250時間より長くにわたって高い安定性を示す。

0188

単なる例として本発明を説明したこと、および本発明の範囲および精神の中にとどまりながら変更を行うことができることは、理解されるであろう。

0189

RVの表

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0199

0200

表中で用いた略語
tIA:不活化時間/持続時間(単位:時間)
TIA:不活化温度
TCID50/ml:1mLあたりの50%組織培養感染単位
LRV:log10低減値
Res.ウイルス試験:より大きな試料体積を用いる残留ウイルスについての試験(上の本文参照)
95%CI:95%信頼区画
RT:17℃〜26℃の範囲であった、周囲温度(室温)
n.d.:行われなかった、または決定されなかった
%値は、不活化剤の最終濃度を示す。

0201

DNA損傷の表

0202

0203

0204

本発明で有用な不活化剤(図1も参照のこと)

0205

参考文献

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0207

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