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技術 指向性バイオマーカーシグナル増幅のための新規の試薬

出願人 シリゲンセカンドリミテッド
発明者 ゲイロード,ブレント,エス.バーソロミュー,グレン,ピー.バルドッチ,ラッセル,エー.ホン,ジャニス,ダブリュー.ホイスマン,ウィリアム,エイチ.リャン,ヨンチャオグエン,トラントラン,ラン,ピー.ホイーラー,ジーン,エム.プラマー,エイドリアン,チャールズ,バーノンユッカート,フランク,ピーター
出願日 2011年1月19日 (10年1ヶ月経過) 出願番号 2012-550095
公開日 2013年5月16日 (7年9ヶ月経過) 公開番号 2013-517374
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析 ポリオキシメチレン、炭素-炭素結合重合体
主要キーワード 各部分範囲 推進要素 光電子センサー サンドイッチ配置 最良性能 事前較正 陥没領域 ドロップ型
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2013年5月16日)のものです。
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図面 (20)

課題・解決手段

本明細書には、中性共役ポリマーを含む、方法、組成物および製造品が記載されており、ポリマー主鎖構造に沿ったリンカーと、末端部キャッピング単位とを有する中性共役水溶性ポリマー合成方法が含まれる。このようなポリマーは、新規光電子デバイスの製造および高効率バイオセンサーの開発において役立つことができる。本発明はさらに、アッセイ法におけるこれらのポリマーの適用に関する。

概要

背景

発明の背景
蛍光ハイブリダイゼーションプローブは、DNAおよびRNAの配列特異的検出における重要な手段となっている。付加された蛍光標識(または色素)によって発生されるシグナルリアルタイム監視することができ、生物学的標的および事象を検出するための簡単で高速、そして頑強な方法が提供され得る。マイクロアレイおよびリアルタイムPCRから蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)まで様々な用途における実用性が示されている。

多発色団の分野、特に共役ポリマー(CP)に関する最近の研究では、このような方法の検出感度の大幅な改善においてこれらの材料が有する可能性が取り上げられている(Liu and Bazan, Chem. Mater., 2004)。これらの材料の集光構造水溶性にして、種々のプローブ標識の蛍光出力増幅するように適合させることができる(2003年6月20日に出願された米国特許出願第10/600,286号、およびGaylord, Heeger, and Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci.,2002 を参照、これらはいずれも参照によってその全体が本明細書中に援用される)。

このような結果は、核酸診断の分野において、特にサンプル量が乏しい場合に、CPが非常に有望であることを示す。しかしながら、核酸標的を増幅(または複製)するための方法(すなわち、PCR)は存在している。比較的に、タンパク質認識の分野では、標的材料を増幅するためのこのような簡単な方法は存在しない。従って、CPの適用から生じるシグナルの増強は、この分野において非常に重要である。

色素標識抗体は、免疫組織化学、タンパク質アッセイELISA試験、およびフローサイトメトリーなどの用途において、タンパク質標的の検出のために定型的に使用されている。このような方法論にCP材料を組み込むと、このようなアッセイの性能の劇的な向上が提供される見込みがあり、従来の蛍光レポーター(例えば、色素)ではこれまで達成できなかった検出レベルが可能になる。

付加シグナル以上に、生物学的検出形式における他の重要な推進要素の1つは、同じ試験で多数の分析物を検出できること、すなわち多重化である。これは、一般に、種々の識別可能波長で作用する蛍光レポーターを用いることにより達成される。CP材料は、理想的に、多重化の拡張のための基盤を提供するのに適している。これは、異なるCPの構造が異なる波長で作用するように調整することによって、あるいはポリマー生体分子コンジュゲート(conjugate)内に色素を取り込むことによって達成することができる。

概要

本明細書には、中性共役ポリマーを含む、方法、組成物および製造品が記載されており、ポリマー主鎖構造に沿ったリンカーと、末端部キャッピング単位とを有する中性共役水溶性ポリマー合成方法が含まれる。このようなポリマーは、新規光電子デバイスの製造および高効率バイオセンサーの開発において役立つことができる。本発明はさらに、アッセイ法におけるこれらのポリマーの適用に関する。

目的

本明細書には、標的生体分子を含有する疑いのあるサンプルを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
3件
牽制数
3件

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請求項1

式(Ia):の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、Rがそれぞれ独立して、10mg/mLを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基であり、MUが、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダム分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲンヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキル、C1〜C12ハロアルキル、C1〜C12アルコキシ、C2〜C18(ヘテロアリールオキシ、C2〜C18(ヘテロ)アリールアミノ、(CH2)x’(OCH2CH2)y’OCH3(ここで、x’はそれぞれ独立して0〜20の整数であり、y’は独立して0〜50の整数である)、またはC2〜C18(ヘテロ)アリール基から選択される1つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、任意リンカーL1およびL2がそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、別の基質分子または生体分子への共役のために、アミンカルバメートカルボン酸カルボキシレートマレイミド活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジルヒドラジンヒドラジドヒドラゾンアジド、アルキン、アルデヒドチオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基終結された1つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、G1およびG2がそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリールハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール(別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された1つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている)から選択され、ここで、前記ポリマーが、別の分子、基質または生体分子への官能性共役を可能にするために、G1、G2、L1またはL2内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも1つの官能基を含み、nが、1〜約10,000の整数であり、そしてa、b、cおよびdが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル%を定義し、aが10〜100%のモル%であり、bが0〜90%のモル%であり、cおよびdがそれぞれ0〜25%のモル%である、水溶性共役ポリマー。

請求項2

Rがそれぞれ独立して、(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3(ここで、xはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、yはそれぞれ独立して0〜50の整数である)、または場合により1つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルコキシ、もしくは(OCH2CH2)zOCH3(ここで、zはそれぞれ独立して0〜50の整数である)によって置換されていてもよいベンジルである、請求項1に記載のポリマー。

請求項3

Rがそれぞれ(CH2)3(OCH2CH2)11OCH3である、請求項1に記載のポリマー。

請求項4

前記任意リンカーL1またはL2が、構造:(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)を有するa〜hからなる群から選択され、前記式中、R’が独立して、H、ハロゲン、C1〜C12アルキル、(C1〜C12アルキル)NH2、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキル、C1〜C12ハロアルキル、C2〜C18(ヘテロ)アリール、C2〜C18(ヘテロ)アリールアミノ、−[CH2−CH2]r’−Z1、もしくは(C1〜C12)アルコキシ−X1(ここで、Z1は−OHまたは−COOHであり、X1は−NH2、−NHCOOH、−NHCOOC(CH3)3、−NHCO(C3〜C12)シクロアルキル(C1〜C4)アルキル−N−マレイミド、または−NHCO[CH2−CH2−O]s’(CH2)s’NH2であり、r’は1〜20の整数であり、そしてs’はそれぞれ独立して1〜20の整数である)、(CH2)3(OCH2CH2)x”OCH3(ここで、x”は独立して0〜50の整数である)、または場合により1つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルコキシ、もしくは(OCH2CH2)y”OCH3(ここで、y”はそれぞれ独立して0〜50の整数である)によって置換されていてもよいベンジルであり、そしてR’がRとは異なり、kが、2、4、8、12または24であり、R15が、構造:(*=骨格への共有結合のための部位)を有するl〜tからなる群から選択される、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項5

前記任意リンカーL1またはL2が、である、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項6

G1およびG2がそれぞれ独立して、構造を有し、前記式中、R11が、結合、C1〜C20アルキル、C1〜C20アルコキシ、C2〜C20アルケン、C2〜C20アルキン、C3〜C20シクロアルキル、C1〜C20ハロアルキル、(CH2)x(OCH2CH2)p(CH2)x(ここで、xはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、pは独立して0〜50の整数である)、アリール、C2〜C18(ヘテロ)アリール、フェノキシアミドアミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネートスルフィドジスルフィド、またはイミド基のいずれか1つまたはこれらの組み合わせであり、別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボキシレート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結されている、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項7

G1およびG2がそれぞれ独立して、構造:(*=骨格への共有結合のための部位)を有する1〜31からなる群から選択され、前記式中、R15が、構造:を有するl〜tからなる群から選択され、kが2、4、8、12または24である、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項8

前記ポリマーが、ポリマー鎖のただ1つの終端G1またはG2において単一の共役部位を含有する、請求項1に記載のポリマー。

請求項9

G1およびG2が、またはである、請求項1に記載のポリマー。

請求項10

MUが、構造:(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)を有するa’〜k’からなる群から選択され、前記式中、Rが、10mg/mLを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基である、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項11

式:の構造を有し、G1またはG2の少なくとも1つが官能性共役部位を含む、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項12

式:の構造を有し、L1が官能性共役部位を含む、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項13

式:の構造を有し、G1またはG2の少なくとも1つが官能性共役部位を含む、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項14

式:の構造を有する、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項15

構造:を有する、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項16

構造:を有する、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項17

構造:を有する、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項18

構造:を有する、請求項1に記載のポリマー。

請求項19

構造:を有する、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項20

構造:を有する、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項21

前記ポリマーがさらに、Cy3またはDylight 594色素であるシグナル伝達発色団を含む、請求項20に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項22

前記ポリマーが二次色素レポーターおよび抗体に共役される、請求項20に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項23

前記リンカーが、前記ポリマー全体の約10%である、請求項20に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項24

前記ポリマーがストレプトアビジン、抗体または核酸に共役され、直接蛍光レポーターとして使用される、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項25

前記ポリマーが、抗体のヒンジ領域においてチオール基に共役される、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項26

前記ポリマーが、ヘテロ二官能性リンカーによって修飾されたタンパク質においてアミン基に共役される、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項27

前記ポリマーが抗体に共役される、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項28

前記ポリマー抗体コンジュゲートフローサイトメトリーアッセイにおいて約405nmで励起され、その際、特異的シグナルが、Pacific Blueに共役された同じ抗体よりも少なくとも3倍大きい、請求項27に記載のポリマー抗体コンジュゲート。

請求項29

前記ポリマーが95%以上純粋である、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項30

前記ポリマーが、異なる細胞マーカーまたは細胞型を同定するためにフローサイトメトリーアッセイにおいて使用される、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項31

前記ポリマーが細胞内染色のために使用される、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項32

40,000g/molよりも大きい最小数平均分子量と、純水またはリン酸緩衝食塩水溶液中の50mg/mLよりも大きい水溶性とを含む、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項33

2つの独特の材料に共役することができる少なくとも2つの独特の共役リンカーを含む、請求項1に記載の水溶性共役ポリマー。

請求項34

センサー生体分子、バイオコンジュゲートおよび標的生体分子からなる群から選択される少なくとも1つの生体分子に結合されたポリマーを含む共役ポリマー複合体であって、前記ポリマーが、それに垂下する少なくとも1つのバイオコンジュゲーション部位によって共有結合されており、前記ポリマーがシグナル伝達発色団を含むか、あるいはシグナル伝達発色団が場合によりポリマーまたはセンサー生体分子に共有結合されていてもよく、前記ポリマーが、式:の構造を含み、前記式中、Rがそれぞれ、10mg/mLを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基であり、MUが、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキル、C1〜C12ハロアルキル、C1〜C12アルコキシ、C2〜C18(ヘテロ)アリールオキシ、C2〜C18(ヘテロ)アリールアミノ、(CH2)x’(OCH2CH2)y’OCH3(ここで、x’はそれぞれ独立して0〜20の整数であり、y’は独立して0〜50の整数である)、またはC2〜C18(ヘテロ)アリール基から選択される1つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、任意リンカーL1およびL2がそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、別の分子、基質または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された1つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、G1およびG2がそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール(別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された1つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている)から選択され、ここで、前記ポリマーが、別の分子、基質または生体分子への官能性共役を可能にするために、G1、G2、L1またはL2内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも1つの官能基を含み、nが、1〜約10,000の整数であり、そしてa、b、cおよびdが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル%を定義し、aが10〜100%のモル%であり、bが0〜90%のモル%であり、cおよびdがそれぞれ0〜25%のモル%である、共役ポリマー複合体。

請求項35

前記センサー生体分子が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジンDN、およびアビジンDからなる群から選択される、請求項34に記載の共役ポリマー複合体。

請求項36

さらに、ビオチン標識抗体ビオチン標識タンパク質、およびビオチン標識標的生体分子からなる群から選択される複合体に結合するように構成された、請求項34に記載の共役ポリマー複合体。

請求項37

前記センサー生体分子が抗体である、請求項34に記載の共役ポリマー複合体。

請求項38

前記シグナル伝達発色団および前記センサー生体分子がいずれも複数のリンカーを介して多発色団に共有結合される、請求項34に記載の共役ポリマー複合体。

請求項39

前記ポリマーまたは前記センサー生体分子に共有結合される場合、前記シグナル伝達発色団が有機色素である、請求項34に記載の共役ポリマー複合体。

請求項40

式(Ia):の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、Rがそれぞれ独立して、(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3(ここで、xはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、yは独立して0〜50の整数である)、または場合により1つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルコキシ、もしくは(OCH2CH2)zOCH3(ここで、zはそれぞれ独立して0〜50の整数である)によって置換されていてもよいベンジルであり、任意リンカーL1またはL2がそれぞれ、構造:(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)を有するa〜hからなる群から選択され、ここで、R’が独立して、H、ハロゲン、C1〜C12アルキル、(C1〜C12アルキル)NH2、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキル、C1〜C12ハロアルキル、C2〜C18(ヘテロ)アリール、C2〜C18(ヘテロ)アリールアミノ、−[CH2−CH2]r’−Z1、もしくは(C1〜C12)アルコキシ−X1(ここで、Z1は−OHまたは−COOHであり、X1は−NH2、−NHCOOH、−NHCOOC(CH3)3、−NHCO(C3〜C12)シクロアルキル(C1〜C4)アルキル−N−マレイミド、または−NHCO[CH2−CH2−O]s’(CH2)s’NH2であり、r’は1〜20の整数であり、そしてs’はそれぞれ独立して1〜20の整数である)、(CH2)3(OCH2CH2)x”OCH3(ここで、x”は独立して0〜50の整数である)、または場合により1つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルコキシ、もしくは(OCH2CH2)y”OCH3(ここで、y”はそれぞれ独立して0〜50の整数である)によって置換されていてもよいベンジルであり、そしてR’がRとは異なり、R15が、構造:(*=骨格への共有結合のための部位)を有するl〜tからなる群から選択され、そして、kが、2、4、8、12または24であり、MUが、構造:(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)を有するa’〜k’からなる群から選択されるポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、ここで、Rが、10mg/mLを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基であり、G1およびG2がそれぞれ独立して、構造:を有する1〜31からなる群から選択され、ここで、前記ポリマーが、別の分子、基質または生体分子への官能性共役を可能にするために、G1、G2、L1またはL2内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも1つの官能基を含み、nが、1〜約10,000の整数であり、そしてa、b、cおよびdが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル%を定義し、aが10〜100%のモル%であり、bが0〜90%のモル%であり、cおよびdがそれぞれ0〜25%のモル%である、水溶性共役ポリマー。

技術分野

0001

相互参照
本出願は、2010年1月19日に出願された米国仮特許出願第61/296,379号および2010年6月24日に出願された米国仮特許出願第61/358,406号(これらの出願は参照によって本明細書中に援用される)の利益を主張する。

背景技術

0002

発明の背景
蛍光ハイブリダイゼーションプローブは、DNAおよびRNAの配列特異的検出における重要な手段となっている。付加された蛍光標識(または色素)によって発生されるシグナルリアルタイム監視することができ、生物学的標的および事象を検出するための簡単で高速、そして頑強な方法が提供され得る。マイクロアレイおよびリアルタイムPCRから蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)まで様々な用途における実用性が示されている。

0003

多発色団の分野、特に共役ポリマー(CP)に関する最近の研究では、このような方法の検出感度の大幅な改善においてこれらの材料が有する可能性が取り上げられている(Liu and Bazan, Chem. Mater., 2004)。これらの材料の集光構造水溶性にして、種々のプローブ標識の蛍光出力増幅するように適合させることができる(2003年6月20日に出願された米国特許出願第10/600,286号、およびGaylord, Heeger, and Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci.,2002 を参照、これらはいずれも参照によってその全体が本明細書中に援用される)。

0004

このような結果は、核酸診断の分野において、特にサンプル量が乏しい場合に、CPが非常に有望であることを示す。しかしながら、核酸標的を増幅(または複製)するための方法(すなわち、PCR)は存在している。比較的に、タンパク質認識の分野では、標的材料を増幅するためのこのような簡単な方法は存在しない。従って、CPの適用から生じるシグナルの増強は、この分野において非常に重要である。

0005

色素標識抗体は、免疫組織化学、タンパク質アッセイELISA試験、およびフローサイトメトリーなどの用途において、タンパク質標的の検出のために定型的に使用されている。このような方法論にCP材料を組み込むと、このようなアッセイの性能の劇的な向上が提供される見込みがあり、従来の蛍光レポーター(例えば、色素)ではこれまで達成できなかった検出レベルが可能になる。

0006

付加シグナル以上に、生物学的検出形式における他の重要な推進要素の1つは、同じ試験で多数の分析物を検出できること、すなわち多重化である。これは、一般に、種々の識別可能波長で作用する蛍光レポーターを用いることにより達成される。CP材料は、理想的に、多重化の拡張のための基盤を提供するのに適している。これは、異なるCPの構造が異なる波長で作用するように調整することによって、あるいはポリマー生体分子コンジュゲート(conjugate)内に色素を取り込むことによって達成することができる。

発明が解決しようとする課題

0007

分子(核酸)およびイムノアッセイ形式の両方において、より高感度の生物学的アッセイを生じ、そして多重化を高めるための材料および方法が非常に所望されている。

課題を解決するための手段

0008

発明の概要
本明細書では、式(I):




水溶性共役ポリマーが提供されており、式中、
Rはそれぞれ独立して、10mg/mLを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基であり、
MUは、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダム分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲンヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキル、C1〜C12ハロアルキル、C1〜C12アルコキシ、C2〜C18(ヘテロアリールオキシ、C2〜C18(ヘテロ)アリールアミノ、(CH2)x’(OCH2CH2)y’OCH3(ここで、x’はそれぞれ独立して0〜20の整数であり、y’は独立して0〜50の整数である)、またはC2〜C18(ヘテロ)アリール基から選択される1つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
任意リンカーL1およびL2はそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミンカルバメートカルボン酸カルボキシレートマレイミド活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジルヒドラジンヒドラジドヒドラゾンアジド、アルキン、アルデヒドチオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基終結された1つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、
G1およびG2はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリールハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフルオレン、およびアリールまたはヘテロアリール(別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された1つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている)から選択され、
ここで、ポリマーは、別の分子、基質または生体分子への官能性共役(functional conjugation)を可能にするために、G1、G2、L1またはL2内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも1つの官能基を含み、
破線の結合− − − − − −はそれぞれ独立して、単結合三重結合、または場合により置換され得るビニレン(−CR5=CR5−)であり、ここで、R5はそれぞれ独立して、水素、シアノ、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキルまたはC2〜C18(ヘテロ)アリール基であり、ここで、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキルまたはC2〜C18(ヘテロ)アリール基はそれぞれ、場合により、1つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル基、C1〜C12アルコキシ、またはC1〜C12ハロアルキルによって置換されていてもよく、
nは、1〜約10,000の整数であり、そして
a、b、cおよびdは、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル%を定義し、aは10〜100%のモル%であり、bは0〜90%のモル%であり、cおよびdはそれぞれ0〜25%のモル%である。

0009

1つの態様では、式(I)の水溶性共役ポリマーは、式(Ia):




の構造を有し、式中、R、L1、L2、G1、G2、MU、a、b、c、dおよびnは、式(I)に対して既に記載されている。

0010

いくつかの実施形態では、Rはそれぞれ独立して、(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3(ここで、xはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、yはそれぞれ独立して0〜50の整数である)、または場合により1つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルコキシ、もしくは(OCH2CH2)zOCH3(ここで、zはそれぞれ独立して0〜50の整数である)によって置換されていてもよいベンジルである。いくつかの例では、Rはそれぞれ、(CH2)3(OCH2CH2)11OCH3である。

0011

他の実施形態では、Rはそれぞれ、少なくとも1つの(OCH2CH2)10OCH3基で置換されたベンジルである。いくつかの例では、ベンジルは、2つの(OCH2CH2)10OCH3基によって置換されている。他の例では、ベンジルは、3つの(OCH2CH2)10OCH3基によって置換されている。

0012

いくつかの実施形態では、任意リンカーL1またはL2は、構造:




(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)
を有し、式中、R3は独立して、水素、ハロゲン、アルコキシ(C1〜C12)、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキルまたはC2〜C18(ヘテロ)アリール基であり、ここで、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキルまたはC2〜C18(ヘテロ)アリール基はそれぞれ、場合により、1つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル基、C1〜C12アルコキシ、またはC1〜C12ハロアルキルによって置換されていてもよく、そしてqは、0〜4の整数である。

0013

他の実施形態では、任意リンカーL1またはL2は、構造:




(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)
を有し、式中、Aは、共役、鎖延長または架橋のための部位であり、−[O−CH2−CH2]q−W、または(C1〜C12)アルコキシ−XまたはC2〜C18(ヘテロ)アリール、フェノキシアミドアミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネートスルフィドジスルフィド、またはイミド基(別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボキシレート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結される)であり、Wは、−OHまたは−COOHであり、Xは、−NH2、−NHCOOH、−NHCOOC(CH3)3、−NHCO(C3〜C12)シクロアルキル(C1〜C4)アルキル−N−マレイミド、または−NHCO[CH2−CH2−O]tNH2であり、qは、1〜20の整数であり、そしてtは、1〜8の整数である。

0014

さらに他の実施形態では、任意リンカーL1またはL2は、構造:




(*=骨格への共有結合のための部位)
を有し、式中、
R25はそれぞれ独立して、結合、C1〜C20アルキル、C1〜C20アルコキシ、C2〜C20アルケン、C2〜C20アルキン、C3〜C20シクロアルキル、C1〜C20ハロアルキル、(CH2)x(OCH2CH2)p(CH2)x(ここで、xはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、pは独立して0〜50の整数である)、アリール、C2〜C18(ヘテロ)アリール、フェノキシ、アミド、アミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネート、スルフィド、ジスルフィド、またはイミド基のいずれか1つまたはこれらの組み合わせであり、
ここで、少なくとも1つのR25は、別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボキシレート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結される。

0015

さらなる実施形態では、任意リンカーL1またはL2は、構造:




(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)
を有し、式中、
R35は、結合、C1〜C20アルキル、C1〜C20アルコキシ、C2〜C20アルケン、C2〜C20アルキン、C3〜C20シクロアルキル、C1〜C20ハロアルキル、(CH2)x(OCH2CH2)p(CH2)x(ここで、xはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、pは独立して0〜50の整数である)、アリール、C2〜C18(ヘテロ)アリール、フェノキシ、アミド、アミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネート、スルフィド、ジスルフィド、またはイミド基のいずれか1つまたはこれらの組み合わせであり、別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボキシレート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結される。

0016

さらなる実施形態では、任意リンカーL1またはL2は、構造:




(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)
を有するa〜hからなる群から選択され、式中、
R’は独立して、H、ハロゲン、C1〜C12アルキル、(C1〜C12アルキル)NH2、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキル、C1〜C12ハロアルキル、C2〜C18(ヘテロ)アリール、C2〜C18(ヘテロ)アリールアミノ、−[CH2−CH2]r’−Z1、もしくは(C1〜C12)アルコキシ−X1(ここで、Z1は−OHまたは−COOHであり、X1は−NH2、−NHCOOH、−NHCOOC(CH3)3、−NHCO(C3〜C12)シクロアルキル(C1〜C4)アルキル−N−マレイミド、または−NHCO[CH2−CH2−O]s’(CH2)s’NH2であり、r’は1〜20の整数であり、そしてs’はそれぞれ独立して1〜20の整数である)、(CH2)3(OCH2CH2)x”OCH3(ここで、x”は独立して0〜50の整数である)、または場合により1つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルコキシ、もしくは(OCH2CH2)y”OCH3(ここで、y”はそれぞれ独立して0〜50の整数である)によって置換されていてもよいベンジルであり、そしてR’はRとは異なり、
kは、2、4、8、12または24であり、
R15は、構造:




(*=骨格への共有結合のための部位)
を有するl〜tからなる群から選択される。

0017

またさらなる実施形態では、任意リンカーL1またはL2は、




である。

0018

いくつかの実施形態では、G1およびG2はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール(別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された1つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている)から選択される。

0019

いくつかの実施形態では、G1およびG2はそれぞれ独立して、構造




を有し、式中、R11は、結合、C1〜C20アルキル、C1〜C20アルコキシ、C2〜C20アルケン、C2〜C20アルキン、C3〜C20シクロアルキル、C1〜C20ハロアルキル、(CH2)x(OCH2CH2)p(CH2)x(ここで、xはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、pは独立して0〜50の整数である)、アリール、C2〜C18(ヘテロ)アリール、フェノキシ、アミド、アミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネート、スルフィド、ジスルフィド、またはイミド基のいずれか1つまたはこれらの組み合わせであり、別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボキシレート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結される。

0020

他の実施形態では、G1およびG2はそれぞれ独立して、構造:




(*=骨格への共有結合のための部位)
を有する1〜31からなる群から選択され、式中、R15は、構造:




を有するl〜tからなる群から選択され、
kは、2、4、8、12または24である。

0021

さらなる実施形態では、G1およびG2は、場合により置換され得るアリールまたはヘテロアリールであり、ここで、任意置換基は、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、ボロン酸、ボロン酸ラジカル、ボロン酸エステル、および場合により置換され得るフルオレンから選択される。

0022

いくつかの実施形態では、G1およびG2は同一である。他の実施形態では、G1およびG2は異なる。さらなる実施形態では、ポリマーは、ポリマー鎖のただ1つの終端G1またはG2において単一の共役部位を含有する。

0023

またさらなる実施形態では、G1およびG2は、




または




である。

0024

いくつかの実施形態では、MUは、構造:




(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)
を有するa’〜k’からなる群から選択され、式中、
Rは、10mg/mLを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基である。

0025

いくつかの実施形態では、水溶性共役ポリマーは、式:




の構造を有し、式中、G1またはG2の少なくとも1つは官能性共役部位を含む。

0026

いくつかの実施形態では、水溶性共役ポリマーは、式:




の構造を有し、式中、L1は官能性共役部位を含む。

0027

いくつかの実施形態では、水溶性共役ポリマーは、式:




の構造を有し、式中、G1またはG2の少なくとも1つは官能性共役部位を含む。

0028

他の実施形態では、ポリマーは、式:




の構造を有する。

0029

他の実施形態では、ポリマーは、式:




の構造を有する。

0030

他の実施形態では、ポリマーは、式:




の構造を有する。

0031

他の実施形態では、ポリマーは、式:




の構造を有する。

0032

他の実施形態では、ポリマーは、式:




の構造を有する。

0033

他の実施形態では、ポリマーは、式:




の構造を有する。

0034

他の実施形態では、ポリマーは、式:




の構造を有する。

0035

他の実施形態では、ポリマーは、式:




の構造を有する。

0036

いくつかの例では、シグナル伝達発色団は、NH2基を介してポリマーに結合される。特定の例では、シグナル伝達発色団は、Cy3またはDylight 594色素である。特定の例では、リンカー




は、ポリマー全体の約10%である。他の例では、ポリマーは二次色素レポーターおよび抗体に共役される。

0037

本明細書に記載される共役ポリマーのいくつかの実施形態では、ポリマーはさらに付加的な分子に共役される。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ストレプトアビジン、抗体または核酸に共役され、直接的な蛍光レポーターとして使用される。特定の実施形態では、ポリマーは、ストレプトアビジンに共役される。他の実施形態では、ポリマーは、抗体のヒンジ領域のチオール基に共役される。さらに他の実施形態では、ポリマーは、ヘテロ二官能性リンカーにより修飾されたタンパク質において、アミン基に共役される。さらなる実施形態では、ポリマーは核酸に共役される。またさらなる実施形態では、ポリマーは抗体に共役される。特定の例では、ポリマーは、モノクローナル抗体二次抗体または一次抗体に共役される。他の例では、ポリマー抗体コンジュゲートはフローサイトメトリーアッセイにおいて約405nmで励起され、その際、特異的シグナルは、Pacific Blueに共役された同じ抗体よりも少なくとも3倍大きい。

0038

本明細書に記載される共役ポリマーのいくつかの実施形態では、ポリマーはイオン交換クロマトグラフィによって精製される。他の実施形態では、ポリマーは、95%以上純粋である。

0039

本明細書に記載される共役ポリマーのいくつかの実施形態では、ポリマーは、異なる細胞マーカーまたは細胞型を同定するために、フローサイトメトリーアッセイにおいて使用される。他の実施形態では、ポリマーは、細胞分類するために使用される。さらに他の実施形態では、ポリマーは、治療で使用するための細胞を分類するために使用される。

0040

本明細書に記載される共役ポリマーのいくつかの実施形態では、ポリマーは、細胞内染色のために使用される。特定の例では、ポリマーは、異なる細胞マーカーまたは細胞型を同定するためにフローサイトメトリーアッセイにおいて使用される。

0041

本明細書に記載される共役ポリマーのいくつかの実施形態では、ポリマーは、40,000g/molよりも大きい最小数平均分子量と、純水またはリン酸緩衝食塩水溶液中の50mg/mLよりも大きい水溶性とを含む。

0042

本明細書に記載される共役ポリマーのいくつかの実施形態では、ポリマーは、2つの独特の材料に共役することができる少なくとも2つの独特の共役リンカーを含む。

0043

本明細書には、標的生体分子を含有する疑いのあるサンプルを提供するステップと、少なくとも1つのシグナル伝達発色団に共役され、標的生体分子または標的関連生体分子と相互作用することができるセンサータンパク質を提供するステップと、本明細書に記載される水溶性共役ポリマーを提供するステップと、センサータンパク質が標的生体分子または標的関連生体分子(存在すれば)に結合できる条件下でサンプルを溶液中でセンサータンパク質および共役ポリマーと接触させるステップと、共役ポリマーを励起させることができる光源をサンプルに適用するステップと、シグナル伝達発色団から光が放出されるかどうかを検出するステップとを含む、アッセイ法も提供されている。

0044

いくつかの実施形態では、センサータンパク質は抗体である。他の実施形態では、センサータンパク質は、複数のシグナル伝達発色団に共役された複数のセンサータンパク質を含み、複数の発色団のうちの少なくとも2つは、多発色団からのエネルギー移動の際に異なる波長の光を放出する。

0045

また、本明細書には、センサー生体分子、バイオコンジュゲートおよび標的生体分子からなる群から選択される少なくとも1つの生体分子に結合されたポリマーを含む共役ポリマー複合体も提供されており、ここで、ポリマーは、それに垂下する少なくとも1つのバイオコンジュゲーション部位によって共有結合されており、ポリマーはシグナル伝達発色団を含むか、あるいはシグナル伝達発色団は場合によりポリマーまたはセンサー生体分子に共有結合されていてもよく、ポリマーは、式:




の構造を含み、式中、
Rはそれぞれ、10mg/mLを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基であり、
MUは、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキル、C1〜C12ハロアルキル、C1〜C12アルコキシ、C2〜C18(ヘテロ)アリールオキシ、C2〜C18(ヘテロ)アリールアミノ、(CH2)x’(OCH2CH2)y’OCH3(ここで、x’はそれぞれ独立して0〜20の整数であり、y’は独立して0〜50の整数である)、またはC2〜C18(ヘテロ)アリール基から選択される1つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
任意リンカーL1およびL2はそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、別の分子、基質または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された1つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、
G1およびG2はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフルオレン、およびアリールまたはヘテロアリール(別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された1つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている)から選択され、
ここで、ポリマーは、別の分子、基質または生体分子への官能性共役を可能にするために、G1、G2、L1またはL2内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも1つの官能基を含み、
nは、1〜約10,000の整数であり、そして
a、b、cおよびdは、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル%を定義し、aは10〜100%のモル%であり、bは0〜90%のモル%であり、cおよびdはそれぞれ0〜25%のモル%である。

0046

いくつかの実施形態では、センサー生体分子は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジンDN、およびアビジンDからなる群から選択される。他の実施形態では、共役ポリマー複合体は、さらに、ビオチン標識抗体ビオチン標識タンパク質、およびビオチン標識標的生体分子からなる群から選択される複合体に結合するように構成される。

0047

さらなる実施形態では、センサー生体分子は抗体である。またさらなる実施形態では、シグナル伝達発色団およびセンサー生体分子はいずれも、複数のリンカーを介して多発色団に共有結合される。いくつかの他の実施形態では、シグナル伝達発色団およびセンサー生体分子はいずれも、ポリマー、シグナル伝達発色団およびセンサー生体分子に共有結合する中央連結部位を介してポリマーに共有結合される。さらに他の実施形態では、ポリマーまたはセンサー生体分子に共有結合される場合、シグナル伝達発色団は有機色素である。

0048

また、本明細書には、
式(Ia):




の構造を有する水溶性共役ポリマーが提供されており、式中、
Rはそれぞれ独立して、(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3(ここで、xはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、yは独立して0〜50の整数である)、または場合により1つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルコキシ、もしくは(OCH2CH2)zOCH3(ここで、zはそれぞれ独立して0〜50の整数である)によって置換されていてもよいベンジルであり、
任意リンカーL1またはL2はそれぞれ、構造




(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)
を有するa〜iからなる群から選択され、ここで、
R’は独立して、H、ハロゲン、C1〜C12アルキル、(C1〜C12アルキル)NH2、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキル、C1〜C12ハロアルキル、C2〜C18(ヘテロ)アリール、C2〜C18(ヘテロ)アリールアミノ、−[CH2−CH2]r’−Z1、もしくは(C1〜C12)アルコキシ−X1(ここで、Z1は−OHまたは−COOHであり、X1は−NH2、−NHCOOH、−NHCOOC(CH3)3、−NHCO(C3〜C12)シクロアルキル(C1〜C4)アルキル−N−マレイミド、または−NHCO[CH2−CH2−O]s’(CH2)s’NH2であり、r’は1〜20の整数であり、そしてs’はそれぞれ独立して1〜20の整数である)、(CH2)3(OCH2CH2)x”OCH3(ここで、x”は独立して0〜50の整数である)、または場合により1つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルコキシ、もしくは(OCH2CH2)y”OCH3(ここで、y”はそれぞれ独立して0〜50の整数である)によって置換されていてもよいベンジルであり、そしてR’はRとは異なり、
R15は、構造:




(*=骨格への共有結合のための部位)
を有するl〜tからなる群から選択され、ここで
kは、2、4、8、12または24であり、
MUは、構造:




(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)
を有するa’〜k’からなる群から選択されるポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、ここで、
Rは10mg/mLを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基であり、
G1およびG2はそれぞれ独立して、構造:




を有する1〜31からなる群から選択され、
ここで、ポリマーは、別の分子、基質または生体分子への官能性共役を可能にするために、G1、G2、L1またはL2内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも1つの官能基を含み、
nは、1〜約10,000の整数であり、そして
a、b、cおよびdは、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル%を定義し、aは10〜100%のモル%であり、bは0〜90%のモル%であり、cおよびdはそれぞれ0〜25%のモル%である。

0049

また、本明細書には、式:




の構造を有する水溶性共役ポリマーも提供されており、式中、Arはアリールまたはヘテロアリールであり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキル、C1〜C12ハロアルキル、C1〜C12アルコキシ、C2〜C18(ヘテロ)アリールオキシ、C2〜C18(ヘテロ)アリールアミノ、(CH2)x’(OCH2CH2)y’OCH3(ここで、x’はそれぞれ独立して0〜20の整数であり、y’は独立して0〜50の整数である)から選択される1つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、そして破線の結合、L1、L2、G1、G2、MU、a、b、c、dおよびnは、式(I)に対して既に記載されている。

0050

参照による援用
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照によって援用されると示された場合と同程度に、参照によって本明細書中に援用される。

図面の簡単な説明

0051

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な記載および添付の図面を参照することによって得られるであろう。

0052

本発明の一実施形態における共役ポリマーの結合の概略図である。
本発明の一実施形態のバイオコンジュゲートポリマーの概略図である。
(A)抗体、(B)アビジン、(C)核酸、(D)色素、例えば発色団と共役された例示的な共役ポリマーの概略図である。
(A)色素標識抗体に共役されて、FRETをもたらすポリマー、(B)色素標識ストレプトアビジンに共役されて、FRETをもたらすポリマー、(C)共役ポリマーに共役された消光剤分子で標識された核酸プローブ配列、(D)消光剤分子共役ポリマー−色素タンデム複合体で標識された核酸プローブ配列の概略図である。
標的生体分子または標的関連生体分子についてアッセイする種々の方法の概略図である。(A)バイオコンジュゲートに連結された共役ポリマー、(B)一般的な標的を認識するポリマーおよび色素標識抗体、(C)色素および第2のバイオコンジュゲートの両方に共役されたセンサー生体分子、(D)いずれも核酸に共役された第2のバイオコンジュゲートおよびシグナル伝達発色団。
ポリマー内の第2の連結部位の付加の概略図である。
色素および生体分子に共役されたポリマー、および得られるエネルギー移動の概略図である。(A)ポリマーはバイオコンジュゲートに共役され、(B)ポリマーはストレプトアビジンおよび色素に共役され、(C)ポリマーは核酸および色素に共役される。
センサー生体分子または標的関連生体分子との間接的な関連の概略図である。(A)共役ポリマーの共有結合コンジュゲートと相互作用するビオチン化抗体、(B)ビオチン化抗体共役ポリマー−色素タンデム複合体、(C)共役ポリマーの共有結合コンジュゲートと相互作用するビオチン化核酸、(D)ビオチン化核酸共役ポリマー−色素タンデム複合体、(E)共役ポリマーの共有結合コンジュゲートと相互作用する、ジゴキシゲニン(digoxygenin)部分を有する核酸、(F)ジゴキシゲニン部分を有する核酸共役ポリマー−色素タンデム複合体。
二次抗体()および一次抗体(B)に共役された例示的な共役ポリマーの概略図である。
サンドイッチ型複合体の概略図である。(A)ストレプトアビジンにバイオコンジュゲートされた共役ポリマー複合体、(B)標的タンパク質を直接探索するために使用されるビオチン標識一次抗体e。
1つまたは2つのフェニルキャッピング単位をフルオレンポリマーに付加する概略図である。
代表例の論理デバイスを示すブロック図である。
キットの代表例を示すブロック図である。
ストレプトアビジンの共役ポリマーとの共役、および得られるコンジュゲート構造の概略図(上)、ならびにストレプトアビジン結合CPを表すクーマシー染色アガロースゲル(下)である。
ビオチン化ポリマー単独またはCy5標識ストレプトアビジンに結合したビオチン化ポリマーの代表的なアクリルアミドゲル描写である。
ビオチン化ミクロスフェアに結合する図14のストレプトアビジン結合共役ポリマーの概略図(上)、ならびに対照ビオチン化ミクロスフェアおよびストレプトアビジン共役ポリマーに結合したミクロスフェアの蛍光励起プロットである。
ビオチン化ミクロスフェアに選択的に結合した図14のストレプトアビジン結合共役ポリマー、および共存されるストレプトアビジン−色素コンジュゲートにおける色素受容体へのエネルギー移動の概略図(上)、ならびにストレプトアビジン結合共役ポリマーから色素受容体へのエネルギー移動のプロット(下)である。
ストレプトアビジン被覆ミクロスフェアに結合する図14のビオチン化ポリマーの概略図(上)、ならびに対照ストレプトアビジン被覆ミクロスフェアおよびビオチン化ポリマーに結合したミクロスフェアの蛍光励起のプロットである。
色素標識ストレプトアビジンコンジュゲートに結合する図14のビオチン化ポリマーおよびFRETの概略図(上)、ビオチン化ポリマーから2つの異なる色素受容体へのエネルギー移動のプロット(左下)、ならびにポリマー飽和の滴定プロット(右下)である。
440nmのポリマー−ストレプトアビジン−コンジュゲートによるCyto-trol細胞のCD4マーキングのフローサイトメトリー分析である。
(A)(左から右へ)FITC、Cy3、DyLight 594およびDyLight 633に共役された実施例38bのポリマー構造、(B)その吸収最大値付近で励起される色素(DyLight 594)の蛍光(下側の曲線)および405nmで励起されるポリマー−色素コンジュゲートの蛍光(上側の曲線)の比較、(C)基本ポリマー(色素なし、420nm付近ピーク発光蛍光シグナルと、ポリマー−色素コンジュゲート(620nm付近のピーク発光)の蛍光シグナルとの比較である。
溶解血液サンプルにおけるモノクローナル抗体(抗CD4)コンジュゲートのフロー試験のプロットである。
594nmにおける色素の励起および380nmにおけるポリマー−色素コンジュゲートの励起による、色素(DyLight 594)およびポリマー−色素コンジュゲートの蛍光のプロットである。
ストレプトアビジン結合共役ポリマーによる蛍光イムノアッセイ(ELISA)のプロットである。
標的とハイブリッド形成したDNAオリゴマーポリマーコンジュゲート蛍光強度対温度のプロットである。
遊離ポリマーを除去するためのポリマー抗体コンジュゲートのイオン交換クロマトグラム(左)および遊離抗体からの最終コンジュゲートの分離を示すSECクロマトグラムである。いずれのクロマトグラムにおいても、吸光度は、280nm(下側の曲線)および407nm(上側の曲線)で監視した。
Luminexアッセイにおけるサンドイッチイムノアッセイ(左)、ならびに共役ポリマーおよびPEストレプトアビジン検出コンジュゲートの両方の532nm励起を用いるLuminexシステムにおける対応する結果である。
左側のデータは補正ビーズにより得られた結果を示し、右側のデータはヒト血液サンプルにおける4色アッセイからの結果を示す。
(A)および(B)は、共役ポリマーの二次抗体への共有結合の概略図である。
蛍光イムノアッセイ(FIA)における共役ポリマーの概略図である。(A)検出抗体に共有結合した共役ポリマー、(B)共役ポリマーに共有結合し、ビオチン化検出抗体と相互作用するビオチン結合タンパク質、(C)共役ポリマーに共有結合し、検出抗体と相互作用する二次抗体。
(A)共役ポリマーに共役された消光剤分子で標識された核酸プローブ配列の概略図、(B)共役ポリマー−色素タンデム複合体に共役された消光剤分子で標識された核酸プローブ配列の概略図である。
HybProbe検出技術の修正の概略図である。(A)供与体プローブに共有結合した共役ポリマーおよび得られる受容体プローブへのエネルギー移動、(B)共役ポリマーが受容体プローブによって消光される、HybProbeアプローチの「シグナルオフ」修正。
Jurkat細胞リンパ球細胞株)モデルにおける種々のポリマーの非特異的結合の比較(上)、純粋に非特異的結合(NSB)により発生されたシグナルに関してポリマーをランク付けするプロット(下)である。
Jurkat細胞株を用いるフローサイトメトリー分析(BD LSR−IIサイトメーターにおいて405nm励起)から集められたヒストグラムであり、(左)非染色細胞および負の対照、アニオン性P4ポリマー、(中央)同じ細胞において試験された様々なポリマーおよびポリマー側鎖の組み合わせ、(右)中性ポリマーP20(未処置の細胞からのオフセットをほとんど示さなかった)である。
ポリマーAA1との共役の程度の関数としてアビジンの相対移動度を示すゲル電気泳動である。
Superdex 200サイズ排除カラムにおける粗製ポリマー−アビジンコンジュゲート混合物分画であり、(上)UV吸光度による画分の監視、(下)アビジンがポリマーに結合された程度を可視化するための、選択された画分のゲル電気泳動である。
ストレプトアビジンに対して種々のモル過剰であるポリマーを用いて実施された共役反応のゲル電気泳動であり、(左)UV照射、(右)532nm励起である。
実施例9に例示されるポリマー(P30で示される)を用いたポリマーストレプトアビジンコンジュゲートの精製を示すプロットであり、(上)粗製サンプル、(下)精製したコンジュゲートである。

0053

発明の詳細な説明
本発明をさらに詳細に説明する前に、記載される特定の方法、デバイス、溶液または装置は当然ながら異なり得るので、本発明はこのような方法論、デバイス、溶液または装置に限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであって、本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解されるべきである。

0054

単数形の「a」、「an」および「the」の使用は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及も含む。従って、例えば、「凝集センサー」への言及は複数の凝集センサーを含み、「プローブ」への言及は複数のプローブを含む、などである。さらに、「2つ」、「3つ」などの特定の複数の言及の使用は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、より大きい数の同じ対象と読み取られる。

0055

「接続される(connected)」、「結合される(attached)」、「共役される(conjugated)」および「連結される(linked)」などの用語は、本明細書では交換可能に使用され、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、直接および間接的な接続、結合、連結または共役を包含する。1つの例では、「共役ポリマー」という語句は、当該技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、拡張された一連不飽和結合を含有するポリマーを指し、そして文脈が指示するように、「共役される」という用語は、単なる直接または間接的な接続、結合または連結以上のものであると解釈されるべきである。

0056

値の範囲が列挙される場合、列挙されるその範囲の上限と下限の間に介在する各整数値およびその各分数も、このような値の間の各部分範囲と共に明確に開示されると理解されるべきである。任意の範囲の上限および下限は独立してその範囲内に含まれてもよいし、その範囲から排除されてもよく、上限および下限のいずれかが含まれる、いずれも含まれない、両方が含まれる範囲もそれぞれ本発明に包含される。議論されている値が固有限界を有する場合、例えば、成分が0〜100%の濃度で存在し得る場合、または水溶液のpHが1〜14の範囲であり得る場合、これらの固有の限界は具体的に開示される。値が明確に列挙される場合、列挙された値とほぼ同じ数または量である値も、それが基づく範囲と同様に、本発明の範囲内に含まれると理解されるべきである。組み合わせが開示される場合その組み合わせの要素の部分的な組み合わせもそれぞれ具体的に開示され、本発明の範囲内に含まれる。反対に、異なる要素または要素の群が開示される場合、これらの組み合わせも開示される。本発明の任意の要素が複数の代替物を有するとして開示される場合、各代替物が単独で排除または他の代替物との任意の組み合わせで排除された発明の例も本明細書に開示され、発明の2つ以上の要素がこのような排除を有することができ、このような排除を有する要素の全ての組み合わせは本明細書で開示される。

0057

他に定義されない限り、または文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料はこれから記載される。

0058

本明細書で言及される全ての刊行物は、その参考文献が引用された特定の材料および方法論を開示および説明するために、参照によって本明細書に援用される。本明細書で議論される刊行物は、本出願の出願日よりも前のその開示についてのみ提供される。本明細書中のものはどれも、本発明が従来の発明によるこのような開示に先行する権利がないと認めることである解釈されるべきではない。

0059

定義
本発明の説明において、以下の用語が使用され得るが、以下に示されるように定義されることが意図される。

0060

「アルキル」は、場合により1つまたは複数の位置で置換されていてもよい、1〜24個の炭素原子を有する分枝状、非分枝状または環状の飽和炭化水素基を指し、多環式化合物を含む。アルキル基の例としては、場合により置換され得るメチルエチル、n−プロピルイソプロピルn−ブチル、s−ブチル、t−ブチル、n−ペンチル、イソペンチルネオペンチルn−ヘキシル、n−ヘプチルn−オクチルn−デシルヘキシルオクチル、テトラデシルヘキサデシルエイコシルテトラコシルなど、ならびにシクロプロピルシクロブチルシクロペンチルシクロヘキシルシクロヘプチルシクロオクチル、アダマンチル、およびノルボルニルなどのシクロアルキル基が挙げられる。「低級アルキル」という用語は、1〜6個の炭素原子、好ましくは1〜4個の炭素原子を有するアルキル基を指す。置換されたアルキル基における例示的な置換基としては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、=O、=S、−NO2、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキルカルボキシアルキル、アミン、アミド、チオエーテルおよび−SHが挙げられる。

0061

「アルコキシ」は「−Oアルキル」基を指し、ここでアルキルは、上記で定義した通りである。「低級アルコキシ」基は、1〜6個、より好ましくは1〜4個の炭素原子を含有するアルコキシ基を意図する。

0062

「アルケニル」は、少なくとも1つの炭素炭素二重結合を含有し、場合により1つまたは複数の位置で置換されていてもよい、2〜24個の炭素原子を有する分枝状、非分枝状または環状の炭化水素基を指す。アルケニル基の例としては、エテニル、1−プロペニル、2−プロペニル(アリル)、1−メチルビニル、シクロプロペニル、1−ブテニル、2−ブテニル、イソブテニル、1,4−ブタジエニルシクロブテニル、1−メチルブタ−2−エニル、2−メチルブタ−2−エン−4−イルプレニルペンタ−1−エニル、ペンタ−3−エニル、1,1−ジメチルアリルシクロペンテニルヘキサ−2−エニル、1−メチル−1−エチルアリル、シクロヘキセニル、ヘプテニル、シクロヘプテニル、オクテニル、シクロオクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニルなどが挙げられる。本明細書において好ましいアルケニル基は、2〜12個の炭素原子を含有する。「低級アルケニル」という用語は、2〜6個の炭素原子、好ましくは2〜4個の炭素原子を有するアルケニル基を意図する。「シクロアルケニル」という用語は、3〜8個、好ましくは5または6個の炭素原子を有する環状アルケニル基を意図する。置換されたアルケニル基における例示的な置換基としては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、=O、=S、−NO2、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アミン、チオエーテルおよび−SHが挙げられる。

0063

アルケニルオキシ」は「−Oアルケニル」基を指し、ここでアルケニルは、上記で定義した通りである。

0064

アルキルアリール」は、アリール基に共有結合したアルキル基を指す。好ましくは、アルキルは低級アルキルである。例示的なアルキルアリール基としては、ベンジル、フェネチルフェノプロピル、1−ベンジルエチル、フェノブチル、2−ベンジルプロピルなどが挙げられる。

0065

「アルキルアリールオキシ」は「−Oアルキルアリール」基を指し、ここでアルキルアリールは、上記で定義した通りである。

0066

アルキニル」は、少なくとも1つの−C/C−三重結合を含有し、場合により1つまたは複数の位置で置換されていてもよい、2〜24個の炭素原子を有する分枝状または非分枝状の炭化水素基を指す。アルキニル基の例としては、エチニル、n−プロピニルイソプロピニル、プロパルギルブタ−2−イニル、3−メチルブタ−1−イニル、オクチニル、デシニルなどが挙げられる。本明細書において好ましいアルキニル基は、2〜12個の炭素原子を含有する。「低級アルキニル」という用語は、2〜6個、好ましくは2〜4個の炭素原子と、1個の−C=C−三重結合とを有するアルキニル基を意図する。置換されたアルキニル基における例示的な置換基としては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、=O、=S、−NO2、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アミン、チオエーテルおよび−SHが挙げられる。

0067

本明細書において言及される「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、選択された抗原に対する結合活性または親和性を示す限り、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多選択性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および抗体断片(例えば、Fab、F(ab’)2およびFv)を包含する。

0068

「抗原」は、本明細書で使用される場合、免疫応答を誘発することができるあらゆる物質を指す。

0069

「アミド」は、−C(O)NR’R”を指し、ここで、R’およびR”は、水素、アルキル、アリール、およびアルキルアリールから独立して選択される。

0070

「アミン」は、−N(R’)R”基を指し、ここで、R’およびR”は、水素、アルキル、アリール、およびアルキルアリールから独立して選択される。

0071

「アリール」は、共役π電子系を有する少なくとも1つの環を有する芳香族基を指し、炭素環式複素環式、架橋および/または多環式アリール基を含み、場合により、1つまたは複数の位置で置換されていてもよい。典型的なアリール基は1〜5個の芳香環を含有し、これらは縮合および/または連結され得る。例示的なアリール基としては、フェニル、フラニルアゾリルチオフラニル、ピリジルピリミジルピラジニルトリアジニルビフェニルインデニルベンゾフラニル、インドリルナフチルキノリニルイソキノリニルキナゾリニルピリドピリジニルピロロピリジニル、プリニル、テトラリニルなどが挙げられる。場合により置換され得るアリール基における例示的な置換基としては、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルケニルカルボキシ、アリール、アリールオキシ、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、場合により置換され得る縮合飽和または不飽和環、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、−S(O)R、スルホニル、−SO3R、−SR、−NO2、−NRR’、−OH、−CN、−C(O)R、−OC(O)R、−NHC(O)R、−(CH2)nCO2Rまたは−(CH2)nCONRR’が挙げられ、ここで、nは0〜4であり、RおよびR’は独立して、H、アルキル、アリールまたはアルキルアリールである。

0072

「アリールオキシ」は「−Oアリール」基を指し、ここで、アリールは上記で定義した通りである。

0073

「炭素環式」は、少なくとも1つの環を含有し、全ての環原子が炭素である、場合により置換され得る化合物を指し、飽和でも不飽和でもよい。

0074

炭素環式アリール」は、環原子が炭素である、場合により置換され得るアリール基を指す。

0075

ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロクロロ、ブロモまたはヨードを指す。「ハロゲン化物」はハロゲンのアニオン形態を指す。

0076

「ハロアルキル」は、1つまたは複数の位置でハロゲンにより置換されたアルキル基を指し、ただ1つのタイプのハロゲン原子によって置換されたアルキル基、ならびに異なるタイプのハロゲン原子の混合物によって置換されたアルキル基を含む。例示的なハロアルキル基としては、トリハロメチル基、例えばトリフルオロメチルが挙げられる。

0077

「ヘテロアルキル」は、1つまたは複数の炭素原子および関連の水素原子が、場合により置換され得るヘテロ原子によって置換されたアルキル基を指し、ただ1つのタイプのヘテロ原子によって置換されたアルキル基、ならびに異なるタイプのへテロ原子の混合物によって置換されたアルキル基を含む。へテロ原子は、酸素硫黄、および窒素を含む。本明細書で使用される場合、窒素へテロ原子および硫黄へテロ原子は、窒素および硫黄のあらゆる酸化形態、ならびに4つの共有結合を有する窒素のあらゆる形態(プロトン化形態を含む)を含む。場合により置換され得るヘテロ原子は、窒素原子に結合した1つまたは複数の水素の、アルキル、アリール、アルキルアリールまたはヒドロキシルによる置換を指す。

0078

「複素環式」は、少なくとも1つのヘテロ原子を有する少なくとも1つの飽和または不飽和環を含有し、場合により1つまたは複数の位置で置換され得る化合物を指す。典型的な複素環式基は1〜5個の環を含有し、これらは縮合および/または連結されていてもよく、ここで、環はそれぞれ5個または6個の原子を含有する。複素環式基の例としては、ピペリジニルモルホリニルおよびピロリジニルが挙げられる。場合により置換され得る複素環式基のための例示的な置換基は、環炭素においてはアルキルおよびアリールと同様であり、そしてへテロ原子においてはヘテロアルキルと同様である。

0079

「複素環式アリール」は、少なくとも1つの芳香族環中に少なくとも1個のヘテロ原子を有するアリール基を指す。例示的な複素環式アリール基としては、フラニル、チエニル、ピリジル、ピリダジニルピロリル、N−低級アルキル−ピロロ、ピリミジル、ピラジニル、トリアジニル、テトラジニル、トリアゾリルテトラゾリルイミダゾリルビピリジルトリピリジル、テトラピリジル、フェナジニル、フェナントロリニル、プリニル、ペリレンペリレンジイミドジケトピロロピロール、ベンゾチオジアゾール、ベンゾオキサジアゾールチエノピラジンなどが挙げられる。

0080

ヒドロカルビル」は、分枝状、非分枝状および環状の種ならびに飽和および不飽和種を含む、1〜約20個の炭素原子を含有するヒドロカルビル置換基を指し、例えば、アルキル基、アルキリデニル基、アルケニル基、アルキルアリール基、アリール基などである。「低級ヒドロカルビル」という用語は、1〜6個の炭素原子、好ましくは1〜4個の炭素原子を有するヒドロカルビル基を含む。

0081

「置換基」は、炭素または窒素に結合した1つまたは複数の水素を置換する基を指す。例示的な置換基としては、アルキル、アルキリデニル、アルキルカルボキシ、アルコキシ、アルケニル、アルケニルカルボキシ、アルケニルオキシ、アリール、アリールオキシ、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、−OH、アミド、カルボキサミド、カルボキシ、スルホニル、=O、=S、−NO2、ハロゲン、ハロアルキル、場合により置換され得る縮合飽和または不飽和環、−S(O)R、−SO3R、−SR、−NRR’、−OH、−CN、−C(O)R、−OC(O)R、−NHC(O)R、−(CH2)nCO2Rまたは−(CH2)nCONRR’が挙げられ、ここで、nは0〜4であり、RおよびR’は独立して、H、アルキル、アリールまたはアルキルアリールである。また置換基は、炭素原子および1つまたは複数の関連の水素原子の、場合により置換され得るヘテロ原子による置換も含む。

0082

「スルホニル」は−S(O)2Rを指し、ここで、Rはアルキル、アリール、−C(CN)=C−アリール、−CH2CN、アルキルアリール、またはアミンである。

0083

チオアミド」は−C(S)NR’R”を指し、ここで、R’およびR”は、水素、アルキル、アリール、およびアルキルアリールから独立して選択される。

0084

「チオエーテル」は−SRを指し、ここで、Rはアルキル、アリール、またはアルキルアリールである。

0085

本明細書で使用される場合、「結合対」という用語は、サンプル中の他の成分に対するよりも大きい親和性で互いに特異的に結合する第1および第2の分子を指す。結合対のメンバー間の結合は通常は非共有結合である。例示的な結合対としては、免疫学的結合対(例えば、対応する抗体またはその結合部分もしくは断片と組み合わせた任意のハプテンまたは抗原性化合物、例えば、ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン、フルオレセインおよび抗フルオレセイン、ジニトロフェノールおよび抗ジニトロフェノール、ブロモデオキシウリジンおよび抗ブロモデオキシウリジン、マウス免疫グロブリンおよびヤギ抗マウス免疫グロブリン)や、非免疫学的結合対(例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ホルモン[例えば、チロキシンおよびコルチゾール]−ホルモン結合タンパク質、受容体−受容体アゴニストまたはアンタゴニスト(例えば、アセチルコリン受容体アセチルコリンまたはその類似体IgG−タンパク質A、レクチン炭水化物酵素酵素補因子、酵素−酵素−阻害薬、ならびに核酸二重鎖を形成可能な相補的ポリヌクレオチド対)などが挙げられる。結合対のメンバーの一方または両方は、付加的な分子に共役され得る。

0086

ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書では交換可能に使用されて、任意の長さのヌクレオチド重合体形態を指し、リボヌクレオチドデオキシリボヌクレオチド、これらの類似体、またはこれらの混合物を含むことができる。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。従って、これらの用語は、三本鎖、二本鎖および一本鎖デオキシリボ核酸(「DNA」)、ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖のリボ核酸(「RNA」)を含む。また、例えばアルキル化および/またはキャッピングによるポリヌクレオチドの修飾された形態、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含まれる。これらの用語についてのさらなる詳細、ならびに塩基対形成の詳細については、2006年1月31日に出願された米国特許出願第11/344,942号(参照によってその全体が本明細書中に援用される)において見出すことができる。

0087

相補的」または「実質的に相補的」は、ヌクレオチドまたは核酸の間、例えばセンサーペプチド核酸標的ポリヌクレオチドとの間などで、ハイブリッド形成または塩基対を形成する能力を指す。相補的ヌクレオチドは、一般に、AおよびT(またはAおよびU)、またはCおよびGである。2つの一本鎖ポリヌクレオチドまたはPNAは、最適に整列および比較され、適切な挿入または欠失を有する一方のストランド塩基が、他方のストランドの塩基の少なくとも約80%、通常は少なくとも約90%〜95%、そしてより好ましくは約98〜100%と対を形成する場合に、実質的に相補的であると言われる。

0088

あるいは、実質的な相補性は、ポリヌクレオチドまたはPNAが選択的ハイブリダイゼーション条件下でその補体とハイブリッド形成をし得る場合に存在する。通常、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも14〜25個の塩基配列にわたって少なくとも約65%相補的、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約90%相補的である場合に生じ得る。M.Kanehisa Nucleic AcidsRes.12:203(1984)を参照されたい。

0089

優先的結合」または「優先的ハイブリダイゼーション」は、1つのポリヌクレオチドまたはPNAが、サンプル中の非相補的ポリマーと比較して、サンプル中のその補体に結合する傾向の増大を指す。

0090

ポリヌクレオチドのためのハイブリダイゼーション条件は、通常、約1M未満の塩濃度、より一般には約500mM未満、好ましくは約200mM未満の塩濃度を含むであろう。ペプチド核酸とポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションの場合、ハイブリダイゼーションは、塩を少ししかまたは全く含有しない溶液中で行うことができる。ハイブリダイゼーション温度は5℃という低温でもあり得るが、一般的には22℃よりも高く、より一般的には約30℃よりも高く、好ましくは約37℃を超える。より長い断片は、特異的ハイブリダイゼーションのためにより高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。相補鎖塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、ならびに塩基のミスマッチの存在を含むその他の因子がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響することもあり、使用されるパラメータの組み合わせは、いずれか1つだけの絶対尺度よりも重要である。調節可能なその他のハイブリダイゼーション条件としては、緩衝液のタイプおよび濃度、溶液のpH、反復配列などのバックグラウンド結合を低減するための遮断試薬または遮断タンパク質溶液の存在および濃度、洗剤のタイプおよび濃度、ポリヌクレオチドの相対濃度を増大させるポリマーなどの分子、金属イオンおよびその濃度、キレート剤およびその濃度、ならびに当該技術分野において知られている他の条件が挙げられる。

0091

本明細書における「多重化」は、多数の分析物を同時にアッセイすることができるアッセイまたは他の分析方法を指す。

0092

「有する(having)」は、「含む(comprising)」および「含む(including)」のように制約のない語句であり、付加的な要素が含まれる状況および付加的な要素が含まれない状況を含む。

0093

「任意(optional)」または「場合により(optionally)」は、その後に記載される事象または状況が生じても生じなくてもよく、その記載が事象または状況が生じる場合および事象または状況が生じない場合を含むことを意味する。

0094

本明細書において開示される実施形態は、一般に、他の分子や基質などへの共役(または結合)のための活性官能基を含有する共役ポリマー材料の組成に関する。特定の実施形態には、このような官能性部位の取り込みおよびそれに続く共役の特異的な調節を提供する方法および組成物が記載される。リンカーは、共役ポリマー鎖の一方もしくは両方の端部または内部に取り込まれ、重合で使用されるモノマー比率によって調節され得る。このようなリンカーは同一でも異なっていてもよく、2つ以上の別個実体が共役ポリマー構造に結合されることを可能にする。

0095

さらなる実施形態には、活性共役部位を提供するだけでなく、非イオン性側鎖(形式電荷なし)の使用により可溶化される共役ポリマー組成物が記載される。このような実施形態は例外的な水溶性を示し、生物学的分子およびその他の一般的な生物学的アッセイ構成要素との最小限の相互作用を提供する。

0096

本明細書において開示される実施形態はさらに、一般に、その独特の特性によって提供される増強されたシグナルによる標的生体分子または標的分子に関連する生体分子の同定のために有用な共役ポリマーを含むアッセイおよび複合体に関する。

0097

特定の一般的な実施形態では、共役ポリマーは、生体分子、基質またはその他のアッセイ構成要素に結合される光学レポーターとしての機能を直接果たす。共役ポリマーは、励起されたときに従来の有機色素よりも大きいエネルギーを吸収することができる、拡張された集光構造として役立つ。次に、ポリマーは光を再放出し、これを検出または測定することができる。このような共役ポリマー複合体から発生されるシグナルは、他の蛍光レポーターから得られるよりも著しく大きいことが可能である。

0098

他の実施形態では、1つの態様は、共役ポリマーから、ポリマーに結合された色素への、あるいはバイオコンジュゲートを含む生体分子(例えば、抗体、ストレプトアビジンまたは核酸配列)であり得るセンサーへのエネルギー移動を含む。このような実施形態では、共役ポリマーの励起およびその後のエネルギー移動の結果として増幅された色素シグナル直接色素励起に対して)を観察することが一般的である。さらに、様々なエネルギーを有する様々な色素を使用して、多色または多重検出形式のための基礎を築くことが可能である。

0099

特定の実施形態では、フローサイトメトリーおよび細胞選別アッセイにおける特異的細胞マーカーおよび細胞型の同定のために、中性共役ポリマーは抗体に結合される。他の実施形態では、共役ポリマーはさらに二次色素レポーターに結合される。さらなる実施形態では、ポリマーおよびポリマー−色素構造はモノクローナル抗体に結合される。

0100

他の実施形態では、中性共役ポリマーは、種々のサンドイッチイムノアッセイにおいて使用するために、抗体に結合される。

0101

一実施形態では、Gaylord, Heeger, and Bazan, J.Am.Chem.Soc., 2003に記載されるような核酸センサーアッセイに関して以下のように形式が修正されたアプローチに従うことができる。具体的には、共役ポリマーのシグナル増幅は結合事象に基づいており、ハイブリダイゼーション事象を示すことができる。確立された任意の共役ポリマーを供与体として選択することができ、1つまたは複数の色素、好ましくは効率的なエネルギー移動の履歴を有する色素、例えばフルオレセインおよびcy3を受容体として選択することができる。色素はセンサー分子に直接共役され得ることが想定される。図1に概略的に示されるように、センサーは溶液中または基質上の生体分子(例えば、抗体)であることができ、これに、共役ポリマーが付加され得る。図1に示される実施形態では、色素は、抗体(Y型構造)に共有結合(バイオコンジュゲート)させることができ、これは、正味負電荷を有する。共役ポリマー(波線で示される)の付加は、共役ポリマーと抗体との間に相互作用または結合をもたらし、共役ポリマーおよび色素を極めて接近させることができる。相互作用または結合は、任意の既知の方法(アビジン/ビオチン標識化を含むがこれに限定されない)によって達することができる。従って、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)のための距離の必要条件を満たすことができ、光(hνで示される)によるポリマーの励起の結果、増幅された色素発光が生じる。色素が顕著な吸光度を有さない波長において共役ポリマーを励起させることができると想定される。一実施形態では、色素発光は、共役ポリマーの発光よりも長い波長で起こり得る。使用の際、アッセイ法は、標的生体分子を含有する疑いのあるサンプルを提供するステップと、シグナル伝達発色団に共役され、標的生体分子と相互作用することができるセンサーを提供するステップと、センサーと相互作用し、励起時にエネルギーをセンサーシグナル伝達発色団に移動させることができる共役ポリマーを提供するステップと、センサーが標的生体分子(存在すれば)に結合できる条件下でサンプルを溶液中でセンサーおよび共役ポリマーと接触させるステップとを含むことができると想定される。次に、方法は、共役ポリマーを励起させることができる光源をサンプルに適用するステップと、シグナル伝達発色団から光が放出されるかどうかを検出するステップとを含むことができる。

0102

本明細書に開示されるように、共役ポリマーと色素標識抗体との間の相互作用または結合は、例えば生体分子標的の検出感度を増大させるための実行可能なアプローチであり得る。さらなる実施形態では、共役ポリマーと、色素、生体分子(例えば、抗体複合体)または両方との共有結合は、バックグラウンドの低下および/またはエネルギー移動の改善を含むいくつかの利点を提供する。生体分子への直接的な連結の場合、非特異的なポリマー相互作用または結合事象(図1において上記したものなど)ではなく生体認識事象が、共役ポリマーの存在を支配するはずである。このようにして、生体分子への共役ポリマーの非特異的結合を排除することができ、共役ポリマー自体から生じるバックグラウンド発光が低減される。上述の生体分子としては、タンパク質、ペプチド親和性リガンド、抗体、抗体断片、糖、脂質、酵素および核酸(ハイブリダイゼーションプローブおよび/またはアプタマーとして)が挙げられるが、これらに限定されない。

0103

一般に、別の態様では、本発明は、親和性リガンド(親和性リガンドは、別の生体分子に対する親和性を有する生体分子を示す)へのポリマーのバイオコンジュゲーションを含む。図2は、共役ポリマー(波線で示される)が色素、生体分子、または生体分子/色素複合体(Xで標識)に連結された類の材料を示す。共役ポリマーへの連結は、生体分子および/または色素(Xを参照)に連結された第2の官能性リンカーA’と共有結合することができるバイオコンジュゲーション部位として機能する共役ポリマー上の第1の官能性リンカーAを介するものであり得る。この構成により、共役ポリマーとXとの間の距離を固定することができ、それにより、ポリマーとXとの間の特異的な相互作用のみが保証される。この実施形態の生体分子成分Xは、本明細書に開示される種々の生体分子(抗体、タンパク質、親和性リガンド、酵素または核酸を含むがこれらに限定されない)のいずれであってもよいことが想定される。

0104

リンカーAは、ポリマーの末端位置、反復サブユニットの内部、反復サブユニットの合間、またはこれらの任意の組み合わせを含む、共役ポリマー上のどこにあってもよい。同様に、リンカーA’は、生体分子および/または色素のどこに連結されてもよい。A−A’のための連結化学には、マレイミド/チオールと、チオール/チオールと、ピリジルジチオール/チオールと、ヨード酢酸スクシンイミジル/チオールと、N−スクシンイミジルエステル(NHSエステル)、スルホジクロロエノールエステル(SDPエステル)、またはペンタフルオロフェニル−エステル(PFPエステル)/アミンと、ビススクシンイミジルエステル/アミンと、イミドエステル/アミンと、ヒドラジンまたはアミン/アルデヒド、ジアルデヒドまたはベンズアルデヒドと、イソシアナート/ヒドロキシルまたはアミンと、炭水化物−過ヨウ素酸/ヒドラジンまたはアミンと、ジアジリン/アリールアジド化学と、ピリジルジチオール/アリールアジド化学と、アルキン/アジドと、カルボキシ−カルボジイミド/アミンと、アミン/Sulfo-SMCC(スルホスクシンイミジル4−[N−マレイミドメチル]シクロヘキサン−1−カルボキシレート)/チオールと、アミン/BMPH(N−[β−マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド・TFA)/チオールとが含まれるが、これらに限定されない。

0105

この文脈におけるXは、色素、蛍光タンパク質ナノマテリアル(例えば、量子ドット)、化学ルミネッセンス発生分子、色素および化学ルミネッセンス発生分子間のコンジュゲート、蛍光タンパク質および化学ルミネッセンス発生分子間のコンジュゲート、ナノマテリアル(例えば、量子ドット)および化学ルミネッセンス発生分子間のコンジュゲート、ストレプトアビジン、アビジン、酵素、酵素のための基質、酵素のための基質類似体、受容体、受容体のためのリガンド、受容体のためのリガンド類似体、DNA、RNA、修飾核酸DNAアプタマーRNAアプタマー、修飾核酸アプタマー、ペプチドアプタマー、抗体、抗原、ファージ、細菌、または上記の項目のいずれか2つのコンジュゲートであり得るが、これらに限定されないことが想定される。

0106

別の態様では、本発明は、直接標識としての共役ポリマーの使用を含む。図3は、標識共役ポリマーの例を示す。一実施形態の図3Aでは、ポリマー(包囲された六角形で示される)は、抗体(例えば、一次または二次抗体であり得る)に共役されて示されている。ポリマーおよび抗体のコンジュゲートは、直接レポーターとして、例えばアッセイにおいて使用することができる。付加的な実施形態では、ポリマーからのシグナルは他のアッセイ構成要素によって調節されないだけでなく、特異的な生体分子認識に応じて、検出時にアッセイにおけるその存在に依存する。光(図示せず)によるポリマーの励起はポリマーの発光をもたらすことができ、アッセイまたはアッセイ溶液中の抗体(一次または二次)の存在が示される。図3Bおよび3Cはさらに、特異的な標的および標的関連生体分子を検出することができる生体分子標識としての共役ポリマーの使用を例示する。図3Bには、ビオチン修飾された分子、生体分子または基質に結合することができるポリマーアビジン(ストレプトアビジン、neutraAvidinなど)コンジュゲートが描かれている。図3Cには、相補的な核酸配列とハイブリッド形成することができる核酸(DNA、RNA、PNAなど)コンジュゲートが描かれている。標的生体分子または標的関連分子図3に例示されるものなど)を認識することができる分子に対する蛍光共役ポリマーの連結または共役は、直接的な検出手段を提供する。付加的な実施形態では、共役ポリマーの励起から発生されるシグナルは、ポリマーに直接共役されるものを除く他のアッセイ構成要素によって調節される。このような実施形態では、ポリマー複合体は蛍光標識としての役割を直接果たしている。

0107

図3Dに示される別の実施形態では、共役ポリマーは、色素、例えば発色団で標識される。この場合、エネルギー移動プロセスにおいて、共役ポリマーは供与体としての役割を果たし、色素は受容体としての役割を果たすことができる。ここで、共役ポリマーは集光体としての役割を果たすことができ、共役ポリマーの励起に続いて、エネルギー移動プロセス(FRETを含むがこれに限定されない)による色素への励起のチャネリングが起こる。この結果、色素発光が増幅される(色素の直接励起と比較して)。供与体共役ポリマーの蛍光は、一実施形態では、消光され得る(例えば、90%よりも大きい消光)。これは、単なる例として、実施例38に例示され、図21に示されている。いくつかの例では、図3D(および本明細書に開示される類似の図面)の共役ポリマーは、ポリマー構造の内部または終端に位置し得る多数の色素の結合を有することができる(単に例示的な目的のためだけに単一の色素が示される)。

0108

色素(図3D)または生体分子/色素複合体(図4に例示される)への直接的な連結の場合、供与体−受容体の距離は、相互作用または結合の強度に依存するのではなく、固定することができ、エネルギー移動効率は著しく増大され得る。これは、色素シグナル伝達(または消光)の改善と、供与体−受容体クロストークに関連するバックグラウンド蛍光の低下との関連で、重要な結果をもたらす。この場合のクロストークは、共役ポリマー(供与体)の発光ピークと色素(受容体)の発光ピークとの間の重複を指す。エネルギー移動のためには大きすぎる距離で非特異的に結合する共役ポリマーは、バックグラウンド蛍光(またはクロストーク)の一因となり得る。供与体と受容体との間のより短い(固定された)距離は、直接的な色素増幅を容易にできるだけでなく、単なる例として図21に示されるように、供与体の発光を大幅に消光することができる。この結果、受容体の発光波長における供与体の発光が少なくなり、続いて、クロストーク補正の必要性が低減されるか、あるいはさらに、排除される。

0109

さらなる実施形態では、共役ポリマーおよびシグナル伝達発色団の局在化は、認識事象によって、例えば2つの親和性対の結合によって、あるいは同じ標的分子または標的関連分子の同時認識によって一緒にされる(図5)。このような実施形態は、溶液ベースの形式で、あるいは要素の1つまたは複数が別の生体分子(細胞、組織、タンパク質、核酸など)または基質(ビーズウェルプレート、表面、管など)に結合されたような配置で実施することができる。

0110

一般に、別の態様では、本発明は、標的生体分子または標的関連生体分子についてアッセイする方法を含む。図5Aに示されるように、一実施形態では、共役ポリマー(波線で示される)は、第2の色素−標識バイオコンジュゲート(例えば、一次抗体)に対して特異的な第1のバイオコンジュゲート(Y型物体として示される)(例えば、二次抗体)に連結され得る。ここで、一次抗体と二次抗体との間の認識事象は、供与体共役ポリマーと受容体色素との間の距離の低減をもたらすであろう。図5Bに描かれる類似の実施形態では、ポリマーおよび色素標識抗体は共通の標的を認識する。これらの認識事象のいずれかの後、光(hνで示される)による供与体共役ポリマーの励起は、受容体色素へのエネルギー移動(例えば、FRET)(湾曲した矢印で示される)をもたらし、増幅された色素発光(色素の直接励起と比較して)が観察されるであろう。使用の際、アッセイ法は、シグナル伝達発色団に共役され、標的生体分子と相互作用することができる第1のバイオコンジュゲート、例えば一次抗体を提供するステップによって、標的生体分子を含有する疑いのあるサンプルを提供することを含み得ることが想定される。この後、ポリマーに共役された第2のバイオコンジュゲート、例えば二次抗体または一次抗体が提供され、ここで、第2のバイオコンジュゲートは第1のバイオコンジュゲートまたは標的に結合することができ、そしてこのような結合の際、共役ポリマーの励起はエネルギーをシグナル伝達発色団に移動させることができる。次に、方法は、第1のバイオコンジュゲートが標的生体分子(存在すれば)に結合できる条件下でサンプルを溶液中で第1のバイオコンジュゲートと接触させることと、溶液を第2のバイオコンジュゲートと接触させることとを含む。方法は、次に、標的生体分子またはタグ付きの標的生体分子に光源(ここで、光源は共役ポリマーを励起させることができる)を適用することと、続いて、シグナル伝達発色団から光が放出されるかどうかを検出することとを含む。

0111

別の態様では、本発明は、共役ポリマーおよびセンサー生体分子複合体を用いてサンプルをアッセイする方法を含む。図5CおよびDに示されるように、ポリマー(波線で示される)は、第1のバイオコンジュゲート、例えばビオチンに対する強力な親和性を有するストレプトアビジン(SA)に共役され得る。図5Cにおいて、センサー生体分子(例えば、一次抗体または二次抗体であり得る抗体)は、色素および第2のバイオコンジュゲート(例えば、ビオチン部分)の両方に共役される。図5Dには、類似の実施形態が描かれており、ここで、第2のバイオコンジュゲート(例えば、ビオチン部分)およびシグナル伝達発色団はいずれも核酸に共役される。第1のバイオコンジュゲートと第2のバイオコンジュゲートとの間(例えば、SAとビオチンとの間)の生体認識事象の後、共役ポリマーおよび色素は極めて接近させられ、供与体共役ポリマーの励起は、受容体色素へのエネルギー移動をもたらすであろう。色素発光は、第1のバイオコンジュゲート(例えば、抗体または核酸)の存在を示すであろう。色素の直接励起と比較して、エネルギー移動プロセス、例えばFRETにより間接的に励起される場合、色素シグナル強度の増幅が観察されるであろう。

0112

図5CおよびDに示される実施形態を用いる方法は、標的生体分子を含有する疑いのあるサンプルを提供するステップと、共有結合した第1のバイオコンジュゲート(例えば、SA)を含む共役ポリマーを提供するステップと、標的分子と相互作用することができるセンサー生体分子、シグナル伝達発色団、および第1のバイオコンジュゲートと結合することができる共有結合した第2のバイオコンジュゲートを含むセンサー生体分子複合体を提供するステップとを含むことができ、このような結合の際、共役ポリマーの励起は、エネルギーをシグナル伝達発色団に移動させることができる。この方法は、さらに、センサー生体分子が標的生体分子(存在すれば)と結合できる条件下でサンプルをセンサー溶液中で生体分子複合体と接触させるステップと、溶液を共役ポリマーと接触させるステップと、共役ポリマーを励起させることができる光源をサンプルに適用するステップと、シグナル伝達発色団から光が放出されるかどうかを検出するステップとを含むことができる。

0113

さらに、共役ポリマーは、2つ以上の種への共役または結合に適した付加的な連結部位を含有することができる。図6は、ポリマー内の第2の連結部位の付加を例示する。このようなリンカーAおよびBは、異なる種の直交共役(orthogonal conjugation)を可能にするために同一であっても異なっていてもよい。リンカーは、末端および内部位置を含む、ポリマー上のどこにあってもよい。A−A’およびB−B’(および場合により、C−C’、D−D’など)のための連結化学には、マレイミド/チオールと、チオール/チオールと、ピリジルジチオール/チオールと、ヨード酢酸スクシンイミジル/チオールと、N−スクシンイミジルエステル(NHSエステル)、スルホジクロロフエノールエステル(SDPエステル)、またはペンタフルオロフェニル−エステル(PFPエステル)/アミンと、ビススクシンイミジルエステル/アミンと、イミドエステル/アミンと、ヒドラジンまたはアミン/アルデヒド、ジアルデヒドまたはベンズアルデヒドと、イソシアナート/ヒドロキシルまたはアミンと、炭水化物−過ヨウ素酸/ヒドラジンまたはアミンと、ジアジリン/アリールアジド化学と、ピリジルジチオール/アリールアジド化学と、アルキン/アジドと、カルボキシ−カルボジイミド/アミンと、アミン/Sulfo-SMCC(スルホスクシンイミジル4−[N−マレイミドメチル]シクロヘキサン−1−カルボキシレート)/チオールと、アミン/BMPH(N−[β−マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド・TFA)/チオールとが含まれるが、これらに限定されない。市販のSulfo-SBEDのスルホスクシンイミジル[2−6−(ビオチンアミド)−2−(p−アジドベンズアミド)−ヘキサノアミド]−エチル−1,3’−ジチオプロピオネートなどの三官能性リンカーは、X、Y、および共役ポリマーの間の三方向の連結において十分に役立つことができる。

0114

図6に示される実施形態では、XまたはYは、色素、蛍光タンパク質、ナノマテリアル(例えば、量子ドット)、化学ルミネッセンス発生分子、色素および化学ルミネッセンス発生分子間のコンジュゲート、蛍光タンパク質および化学ルミネッセンス発生分子間のコンジュゲート、ナノマテリアル(例えば、量子ドット)および化学ルミネッセンス発生分子間のコンジュゲート、ストレプトアビジン、アビジン、酵素、酵素のための基質、酵素のための基質類似体、受容体、受容体のためのリガンド、受容体のためのリガンド類似体、DNA、RNA、修飾核酸、DNAアプタマー、RNAアプタマー、修飾核酸アプタマー、ペプチドアプタマー、抗体、抗原、ファージ、細菌、または上記の項目のいずれか2つのコンジュゲートであり得るが、これらに限定されない。

0115

一般に、別の態様では、本発明は、標的生体分子を同定するためにポリマー、センサー生体分子およびシグナル伝達発色団を含む共役ポリマー複合体を提供する。図6に示されるように、一実施形態では、ポリマー(波線)は、リンカー官能性A−A’を介して色素Xに、そしてリンカー官能性B−B’を介して生体分子Yにバイオコンジュゲートされ得る。図7に描かれるように、一実施形態では、ポリマーは、色素および生体分子、例えば生体認識分子の両方にバイオコンジュゲートされ得る。有用な生体分子は、抗体(図7A)、アビジン誘導体図7B)親和性リガンド、核酸(図7C)、タンパク質、ナノ粒子または酵素のための基質を含むことができるが、これらに限定されない。ポリマーに近接して色素を共有結合する利点は上記で記載されている。受容体色素および生体認識分子の両方をポリマーに付けることによる利点は、受容体が供与体共役ポリマーの近くにあることが保証される(逆も同じである)ように供与体−受容体距離を固定することと、生体認識事象を示すためのポリマー結合特異性を増大させることの両方によって2倍になる。これらの共有結合複合体は、本明細書に記載されるモノマー、ポリマーおよび連結化学によって作製することができる。

0116

使用の際、図6に示される実施形態は標的生体分子を同定するための共役ポリマー複合体であり得るが、ここで、複合体には、共役ポリマー、共役ポリマーに共有結合されたシグナル伝達発色団、および共役ポリマーに共有結合されたセンサー生体分子が含まれる。複合体のシグナル伝達発色団は共役ポリマーの励起時に共役ポリマーからエネルギーを受け取ることができ、センサー生体分子は、標的生体分子と相互作用することができる。生体分子は抗体、タンパク質、親和性リガンド、ペプチド、または核酸を含むことができるが、これらに限定されないと想定される。

0117

図7Aに示される一実施形態では、ポリマーは、バイオコンジュゲート、例えば抗体(1次または2次)と、色素との両方に共役される。供与体共役ポリマーと受容体色素との間の共有結合は、近接を保証する。供与体共役ポリマーの励起は、受容体色素へのエネルギー移動、例えばFRETをもたらす。バイオコンジュゲートが抗体である場合、抗体がその標的(例えば、抗原)に結合すれば、これは、供与体ポリマーの励起時に色素発光によって示されるであろう。代替の実施形態では、図7Bに示されるように、ポリマーは、SAおよび色素の両方に共役され得る。再度、供与体共役ポリマーと受容体色素との共有結合は近接を保証し、供与体共役ポリマーの励起は、受容体色素へのエネルギー移動をもたらす。SA複合体を使用して、ビオチン化抗体または核酸などのビオチン標識生体分子を標識または検出することができる。ポリマー励起に続く色素標識へのエネルギー移動の結果、検出シグナルが大きく増強される(すなわち、より大きい感度)であろう。

0118

図7Aに例示される例は、色素受容体で標識され、さらに抗体に共役された共役ポリマーである。このタンデム配置は、図3Aの構造について記載されるものと同様の形で使用することができるが、多くの場合、多重形式において検出のために二次シグナルを発生させる上で有用である。図7の共役ポリマー複合体は、ポリマー構造の内部または終端に位置し得る多数の色素の結合を有することができる(単に例示的な目的のためだけに単一の色素が示される)。

0119

他の実施形態では、図3Aおよび7Aに示されるように、センサー生体分子、例えば一次抗体(Y型)は、共役ポリマー(包囲された六角形)または共役ポリマー−色素タンデム複合体(垂下する包囲された星形を有する六角形)に共役され共有結合される。共役ポリマーが励起されると、共役ポリマー(図3A)または色素(図7A)からの発光はバイオ複合体の存在を示し、適切なアッセイ設計で拡張することによってセンサー分子により認識される標的の存在を示し、例えばアッセイにおいて、レポーターとしての使用が可能になるであろう。図29Aおよび29Bは共役ポリマーの二次抗体への共有結合を有する比較例を表す。

0120

代替の実施形態として、共役ポリマーは、センサー生体分子または標的関連生体分子と間接的に関連されてもよい。図8Cおよび8Dは、ビオチン部分(ドロップ型)に共有結合的に共役された配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ(波線)を示す。ここで、共役ポリマー(包囲された六角形)または共役ポリマー−色素タンデム複合体(垂下する包囲された星形を有する六角形)は、ビオチン認識タンパク質(例えば、アビジン、ストレプトアビジン、またはリガンドビオチンに対して高い特異親和性を有する類似のもの)に共有結合または共役される。図8Aおよび8Bは、ビオチン認識タンパク質に対する共役ポリマー(図8A)および共役ポリマー−色素タンデム複合体(図8B)の共有結合コンジュゲートと相互作用するビオチン化抗体を有する比較例を示す。標的関連生体分子と共役ポリマーとの間接的な関連は、ビオチンに仲介される相互作用に限定されない。図8EおよびFは、ジゴキシゲニン部分(7角星形)によって共有結合的に標識された配列特異的オリゴヌクレオチド(波線)を表す。そして次に、ジゴキシゲニン部分は、共役ポリマー(図8E)および共役ポリマー−色素タンデム複合体(図8F)に共有結合した一次抗体によって認識されている。絵では示されていないが、共役ポリマー(または共役ポリマー−色素タンデム複合体)に共有結合したビオチン化抗体およびビオチン認識タンパク質、あるいは共役ポリマー(または共役ポリマー−色素タンデム複合体)に共有結合したジゴキシゲニンを認識する非標識一次抗体および適切な二次抗体を使用して、ジゴキシゲニンの間接的な検出を用いるさらなる実施形態が意図される。

0121

多数のさらなる実施形態も共役ポリマーと受容体色素との間のエネルギー移動(例えばFRETであるが、これに限定されない)に基づいている。多重化分析の可能性を考慮すると、共役ポリマーは、フルオレセイン、6−FAM、ローダミン、Texas Red、California Red、iFluor 594、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン6G、カルボキシロドール(carboxyrhodol)、カルボキシローダミン110、Cascade Blue、Cascade Yellow、クマリン、Cy2(登録商標)、Cy3(登録商標)、Cy3.5(登録商標)、Cy5(登録商標)、Cy5.5(登録商標)、Cy7(登録商標)、Cy-Chrome、DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、DyLight 750、DyLight 800、フィコエリトリン、PerCP(ペリジニンクロロフィル−タンパク質)、PerCP-Cy5.5、JOE(6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシフルオレセイン)、NED、ROX(5−(および−6)−カルボキシ−X−ローダミン)、HEX、Lucifer Yellow、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Alexa Fluor(登録商標)350、Alexa Fluor(登録商標)430、Alexa Fluor(登録商標)488、Alexa Fluor(登録商標)532、Alexa Fluor(登録商標)546、Alexa Fluor(登録商標)568、Alexa Fluor(登録商標)594、Alexa Fluor(登録商標)633、Alexa Fluor(登録商標)647、Alexa Fluor(登録商標)660、Alexa Fluor(登録商標)680、7−アミノ−4−メチルクマリン−3−酢酸BODIPY(登録商標)FL、BODIPY(登録商標)FL-Br2、BODIPY(登録商標)530/550、BODIPY(登録商標)558/568、BODIPY(登録商標)564/570、BODIPY(登録商標)576/589、BODIPY(登録商標)581/591、BODIPY(登録商標)630/650、BODIPY(登録商標)650/665、BODPY(登録商標)R6G、BODIPY(登録商標)TMR、BODIPY(登録商標)TR、これらのコンジュゲート、およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、多数の色素またはシグナル伝達発色団に連結され得ることが想定される。これらの実施形態には、受容体色素がアッセイレポーターとしての機能を果たす上記の例の修正が含まれる(図3D、4D、7、8B、8D、8E、29B(包囲された十角星形は色素を表す)に例示される)。

0122

特定の実施形態では、図2〜10、29および30に提供される共役ポリマーコンジュゲートは、フローサイトメトリー、細胞選別、分子診断、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、免疫組織化学(IHC)、ポリメラーゼ鎖反応、顕微鏡(蛍光、共焦点、2二光子など)、ブロッティング(例えば、ノーザンサザンウエスタン)、サイトミックビーズアレイ(cytomic bead array)(Luminex形式など)、蛍光免疫アッセイ(FIAまたはELISA)、核酸配列決定およびマイクロアレイにおける使用が意図されるが、これらに限定されない。

0123

また、ポリメラーゼ鎖反応、転写介在性(transcription-mediated)増幅、ローリングサークル(rolling circle)増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性(helicase dependent)増幅、および対数増幅直線増幅(Linear-After-The-Exponential)ポリメラーゼ鎖反応などであるが、これらに限定されない核酸増幅技術と組み合わせて配列特異的蛍光プローブを用いて核酸の検出および定量化を増強するために共役ポリマーが使用される実施形態も想定される。

0124

図32は、HybProbe検出技術の修正を表す。図32Aにおいて、エネルギー移動供与体として従来使用されている色素は、供与体プローブ(より長いらせん波線で示される核酸標的との関連のために右側のらせん二本鎖として表される波状らせん構造)に共有結合された共役ポリマー(六角形の鎖)によって置換される。配列特異的ハイブリダイゼーションの際、供与体および受容体(供与体プローブと同様であるが、核酸標的の左側に表される)プローブは、十分に近接して、対象の標的核酸ストランド上に空間的に並置され、蛍光(fluors)間でエネルギー移動が生じるのを可能にする。励起エネルギーは共役ポリマーを介して伝達され、色素(包囲された十角星形)によって読取可能なシグナルとして放出され、核酸の定量化、検出および/または特徴付けを可能にする。増大されたテンプレートの存在はプローブ同時ハイブリダイゼーション事象の数の増大を可能にし、従って受容体色素からの特異的シグナルの増大と相関する。HybProbe実験において一般に使用される融解曲線(melt curve)技術と組み合わせて、配列多様性に相当する配列特異的情報は、適切に設計された実験において収集可能であり得ることが想定される。図32Bは、HybProbeアプローチの「シグナルオフ」修正を表しており、ここで、共役ポリマーは、小分子蛍光消光剤(例えば、Black Hole Quenchers(商標)、Iowa Black(登録商標)またはDabsylであるが、これらに限定されない)からなる受容体プローブによって消光される。

0125

別の実施形態では、図4Cおよび4Dに記載されるものと同様の共役ポリマーおよび共役ポリマー−色素タンデム複合体が、核酸標的の検出、定量化および/または特徴付けにおいて使用される。消光剤分子(黒丸、例えば、Black Hole Quenchers(商標)、Iowa Black(登録商標)またはDabsylであるが、これらに限定されない)で標識された核酸プローブ配列も共役ポリマー(図4Cおよび31A)および共役ポリマー−色素タンデム複合体(図4Dおよび31B)に共役される。図4CおよびDにおいて、標的配列の認識は、ハイブリダイゼーションと、共役ポリマーまたは共役ポリマー−色素タンデム複合体からの消光剤の分離とをもたらし、ポリマーの励起時に、蛍光シグナルの増大が生じる。図31Aおよび31Bにおいて、核酸プローブコンジュゲートは相補的な標的配列にハイブリッド形成することができ、特異的酵素による処理によって、プローブ配列は切断されるかあるいはハイブリッド形成され、共役ポリマーまたは共役された共役ポリマー−色素タンデム複合体が消光剤から解放され、ポリマーの励起時に、蛍光シグナルの増大が生じる。図31に記載される方法の最も一般的な例は、ヌクレアーゼ活性を含有するDNAポリメラーゼ酵素の使用である(例えば、TaqManPCRアッセイ)。

0126

図9は、二次抗体(図9A)および一次抗体(図9B)(抗体はY型構造で示される)に共役された共役ポリマー(六角形)の例を示す。アッセイにおいて、非標識一次抗体は、抗原、例えば標的タンパク質(黒色三角形で示される)に結合することができる。ポリマーに共役される二次抗体の付加は、一次抗体に特異的に結合することができる。洗浄して非結合の二次抗体を除去した後、そして適切な励起波長の光の適用時、ポリマー発光の観察は、特異的な結合を示す(図9A)。他のアッセイ実施形態では、ポリマー−標識一次抗体は、黒色三角形で示される標的タンパク質に直接結合することができ、洗浄して非結合の一次抗体を除去した後、そして適切な励起波長の光の適用時、ポリマー発光の観察は、特異的な結合を示す(図9B)。場合により、一次抗体に共役されるか二次抗体に共役されるかに関わらず、ポリマーはさらに色素に共役されてもよい。このような場合、共役ポリマーの光学的励起の結果、色素へのエネルギー移動と、直接色素励起で生じる場合と比較して増幅された色素発光とが生じ得る。色素発光の観察は、特異的な結合を示す。

0127

図10は、本発明の一実施形態のサンドイッチ型複合体の一例を示す。図10Aに示されるアッセイにおいて、共役ポリマー複合体は、生体分子、例えばストレプトアビジン(X型)にバイオコンジュゲートされたポリマー(六角形で示される)で構成される。非標識一次抗体が、黒色三角形で示される標的(例えば、タンパク質)に結合した後、ビオチン標識二次抗体が一次抗体に特異的に結合する。別のステップでは、共役ポリマー複合体の付加は、ビオチンとストレプトアビジンとの間の特異的結合をもたらし得る。共役ポリマーの励起の結果、ポリマーの発光が生じ、標的タンパク質の存在が示されるであろう。さらに、別の実施形態において、ビオチン標識一次抗体は、標的タンパク質を直接探索するために使用され得る(図10B)。この結合事象が生じた後、ストレプトアビジン−ポリマー複合体の付加は、ビオチンとストレプトアビジンとの間の特異的結合をもたらし、共役ポリマーの励起の結果、ポリマーの発光が生じ、標的タンパク質の存在が示されるであろう。場合により、ポリマーはさらに色素と共役されてもよい。このような場合、ポリマーの光学的励起の結果、色素の直接励起と比較して増幅された色素発光が生じ得る。色素の発光から生じるシグナルは、標的タンパク質の存在を示すであろう。

0128

図30は、蛍光イムノアッセイ(FIA)における共役ポリマーの使用を取り巻く実例の実施形態を描く。図30のパネルA〜Cにおいて、分析物抗原は、マイクロタイタープレートウェルビーズ粒子ガラススライドラテラルフローストリップラミナーフローデバイス、マイクロ流体デバイスウイルス、ファージ、組織または細胞表面を含むことができるがこれらに限定されない表面に固定されている。次に、分析物の分子は、標識検出コンジュゲートまたはセンサー生体分子の使用によって検出される。図30Aでは、検出抗体に共有結合された共役ポリマーが検出のために用いられる。図30Bでは、共役ポリマーに共有結合されて、ビオチン化検出抗体と相互作用するビオチン結合タンパク質(例えば、アビジン、ストレプトアビジンまたはその他の高親和性ビオチン特異的誘導体であるが、これらに限定されない)が検出のために用いられる。図30Cでは、共役ポリマーに共有結合されて、検出抗体と相互作用する二次抗体が検出のために用いられる。図5Bには、2つの別々の抗体がそれぞれ対象の抗原に結合する均質な溶液ベースの例も具体化される。一方の抗体は共役ポリマーに共有結合され、他方は色素に共有結合される。抗原に結合する場合、それぞれのフルオロフォアは、エネルギー移動が生じるように十分に空間的に近接される。図30および図5Bの設計に基づくアッセイでは、サンプルは共役ポリマーの励起に適合された光で調べられ、色素の発光波長においてシグナルが報告される。図30A〜Cにおいて具体化される例では、ポリマー−色素タンデム複合体の使用がさらに開示される。このような場合、ポリマーの光学的励起は、色素の直接励起と比較して増幅された色素発光を生じ得る。色素の発光から生じるシグナルは、標的タンパク質の存在を示すであろう。

0129

さらなる態様において、本発明は、多数の受容体に対する供与体のエネルギー移動の多重化を提供する。エネルギー移動システムにおいて供与体として共役ポリマーを用いることによって、利益は、多重化の能力も含む。単一の供与体がいくつかの色素にエネルギーを移動させることができ、従って、単一の励起源を用いて、多数の色素の強度を監視することができる。これは、細胞イメージング(すなわち、免疫組織化学)、フローサイトメトリーおよび細胞選別を含むがこれらに限定されない用途のために有用であり、この場合、異なるタイプの細胞をタンパク質−抗体認識事象によって監視することができる。

0130

一実施形態では、2つの色素標識抗体が、生物学的材料、例えば培養細胞株組織切片または血液サンプルと共にインキュベートされ得る。抗体は、その表面に標的タンパク質が発現された細胞を認識し、これらのタンパク質にのみ特異的に結合することができる。2つの抗体を異なる色素で標識化することによって、2つの異なるタンパク質または異なる細胞型の発現を同時に監視することが可能である。通常、これは、2回の走査、励起または画像(正しい励起波長によりそれぞれ1回)を必要とし得る。分析の前の最後のステップとして、これらの2回の画像またはデータセットオーバーレイまたは結合されなければならないであろう。色素および共役ポリマーの両方に共役された抗体を使用することによって、共役ポリマーに対して1つの励起波長を使用して両方の色素を励起することができ、単一の画像または走査は、2つの抗体のそれぞれからのデータセットを含み得る。これは、任意の数の抗体の組み合わせによって行うことができるが、ただし得られるシグナルを分解するのに十分な能力を有するものとする。

0131

本明細書に記載される発明は、口腔液サンプルのためのFDA承認HIV診断テストであるOraSure Technologies, Inc.(Bethlehem, PA)により製造されるOraQuick Rapid HIV-1/2 Antibody Testを含むがこれらに限定されない多数の市販の試験のいずれかの感度を増大されるために使用可能であることが想定される。この試験は、わずか20分で99パーセントを超える精度でスクリーニング結果を提供することができる。

0132

共役ポリマー
集光性共役ポリマー系は、近くの発光種のエネルギーを効率的に移動させることができる。エネルギー移動のメカニズムには、例えば、共鳴エネルギー移動(Forster(または蛍光)共鳴エネルギー移動、FRET)、量子電荷交換(quantum charge exchange)(Dexterエネルギー移動)などが含まれる。しかしながら、通常、これらのエネルギー移動メカニズムは比較的短い範囲であり、効率的なエネルギー移動のためにはシグナル伝達発色団に対する集光性共役ポリマー系の近接が必要とされる。発光の増幅は、集光性共役ポリマー系の個々の発色団の数が多い場合に生じ、入射光(「ポンプ光」)が、集光性共役ポリマー系により吸収されてフルオロフォアに移動される波長である場合に、フルオロフォアがポンプ光により直接励起される場合よりも、フルオロフォアからの発光が強い可能性がある。

0133

本発明で使用される共役ポリマーは、電荷中性であっても、カチオン性またはアニオン性であってもよい。いくつかの実施形態では、共役ポリマーはポリカチオン性共役ポリマーである。他の実施形態では、共役ポリマーはポリアニオン性共役ポリマーである。さらなる実施形態では、共役ポリマーは、種々の反復サブユニット中にカチオン性、アニオン性、および/または中性の基を含むことができる。さらに他の実施形態では、共役ポリマーは中性共役ポリマーである。いくつかの例では、共役ポリマーは、水溶液中の溶解性を付与する、エチレングリコールオリゴマーエチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩、および/またはω−スルホネートアルコキシ塩などの基を含有する。いくつかの例では、非イオン性側鎖を有する中性共役ポリマーは、水またはリン酸緩衝食塩水溶液中の溶解度が10mg/mLよりも大きく、特定の場合には、溶解度は50mg/mLよりも大きい。いくつかの実施形態では、共役ポリマーは、末端連結部位(例えば、キャッピング単位)、内部連結部位のいずれかまたは両方を含有する。

0134

いくつかの実施形態では、共役ポリマーは、ポリマーに約450nm〜約1000nmの範囲の吸収を与えるタイプおよび量の「低バンドギャップ繰返し単位」を含むものである。低バンドギャップ繰返し単位は、重合前にこのような吸収を示しても示さなくてもよいが、共役ポリマー内に取り込まれるとその吸収を導入する。このような吸収特性によって、生物学的サンプルの分析およびイメージングならびに/または分子の検出を含む様々な設定において、ポリマーは、より少ないバックグラウンド蛍光を生じる波長で励起されることが可能になる。従って、共役ポリマーの吸光度をより低いエネルギーおよびより長い波長にシフトさせることにより、より高感度で頑強な方法が可能になる。さらに、多くの市販の機器は、このような問題を少なくともある程度回避するためにこのような波長で動作するイメージング部品を組み込んでいる。例えば、この領域で動作する、増幅反応中リアルタイム検出を実施するサーマルサイクラーおよびマイクロアレイリーダー入手可能である。この領域で吸収するポリマーを提供することにより、検出方法をこのような形式に適応させるができ、全く新しい方法を実施することが可能になる。

0135

バンドギャップを低減する繰返し単位を取り込むことにより、このような特徴を有する共役ポリマーを生成することができる。このような波長の光を吸収するポリマーをもたらす、場合により置換さていてもよい例示的な種としては、2,1,3−ベンゾチアジアゾール、ベンゾオキシダゾール、ベンゾセレナジアゾール、ベンゾテルジアゾール(benzotellurodiazole)、ナフトレナジアゾール、4,7−ジ(チエン−2−イル)−2,1,3−ベンゾチアジアゾール、スクアライン色素キノキサリン、ペリレン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、チエノピラジン低バンドギャップ市販色素、オレフィン、およびシアノ置換オレフィン、ならびにこれらの異性体が挙げられる。適切な共役ポリマーの組成、構造、特性および合成に関するさらなる詳細は、米国特許出願公開第2006−0183140A1号として現在公開されている、2006年1月10日に出願された米国特許出願第11/329,495号(参照によって全体が本明細書中に援用される)において見出すことができる。

0136

1つの態様では、式(I):




の共役ポリマーが本明細書で提供されおり、式中、
Rはそれぞれ独立して、10mg/mLを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基であり、
MUは、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキル、C1〜C12ハロアルキル、C1〜C12アルコキシ、C2〜C18(ヘテロ)アリールオキシ、C2〜C18(ヘテロ)アリールアミノ、(CH2)x’(OCH2CH2)y’OCH3(ここで、x’はそれぞれ独立して0〜20の整数であり、y’は独立して0〜50の整数である)、またはC2〜C18(ヘテロ)アリール基から選択される1つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
任意リンカーL1およびL2はそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された1つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、
G1およびG2はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール(別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された1つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている)から選択され、
ここで、ポリマーは、別の分子、基質または生体分子への官能性共役を可能にするために、G1、G2、L1またはL2内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも1つの官能基を含み、
破線の結合− − − − − −はそれぞれ独立して、単結合、三重結合、または場合により置換され得るビニレン(−CR5=CR5−)であり、ここで、R5はそれぞれ独立して、水素、シアノ、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキルまたはC2〜C18(ヘテロ)アリール基であり、ここで、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキルまたはC2〜C18(ヘテロ)アリール基はそれぞれ、場合により、1つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル基、C1〜C12アルコキシ、またはC1〜C12ハロアルキルによって置換されていてもよく、
nは、1〜約10,000の整数であり、そして
a、b、cおよびdは、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル%を定義し、aは10〜100%のモル%であり、bは0〜90%のモル%であり、cおよびdはそれぞれ0〜25%のモル%である。

0137

水中の溶解性を付与することができる非イオン性側基は、本明細書で使用される場合、得られるポリマーを、目に見え微粒子を存在させずに水または水溶液中に可溶性にすることができる、帯電していない側基を指す。いくつかの実施形態では、Rはそれぞれ独立して、10mg/mLを超える、15mg/mLを超える、20mg/mLを超える、25mg/mLを超える、30mg/mLを超える、35mg/mLを超える、40mg/mLを超える、45mg/mLを超える、50mg/mLを超える、60mg/mLを超える、70mg/mLを超える、80mg/mLを超える、90mg/mLを超える、あるいは100mg/mLを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基である。

0138

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される共役ポリマーは、5,000g/molよりも大きい、10,000g/molよりも大きい、15,000g/molよりも大きい、20,000g/molよりも大きい、25,000g/molよりも大きい、30,000g/molよりも大きい、40,000g/molよりも大きい、50,000g/molよりも大きい、60,000g/molよりも大きい、70,000g/molよりも大きい、80,000g/molよりも大きい、90,000g/molよりも大きい、あるいは100,000g/molよりも大きい最小数平均分子量を含む。

0139

いくつかの実施形態では、Rはそれぞれ独立して、(CH2)x(OCH2CH2)yOCH3(ここで、xはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、yはそれぞれ独立して0〜50の整数である)、または場合により1つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルコキシ、もしくは(OCH2CH2)zOCH3(ここで、zはそれぞれ独立して0〜50の整数である)によって置換されていてもよいベンジルである。いくつかの例では、Rはそれぞれ(CH2)3(OCH2CH2)11OCH3である。

0140

他の実施形態では、Rはそれぞれ独立して、少なくとも1つの(OCH2CH2)zOCH3基によって置換されたベンジルであり、ここで、zはそれぞれ独立して0〜50の整数である。いくつかの例では、Rはそれぞれ、少なくとも1つの(OCH2CH2)10OCH3基によって置換されたベンジルである。他の例では、Rはそれぞれ、少なくとも2つの(OCH2CH2)10OCH3基によって置換されたベンジルである。さらなる例では、Rはそれぞれ、少なくとも3つの(OCH2CH2)10OCH3基によって置換されたベンジルである。

0141

さらなる実施形態では、Rはそれぞれ独立して、




(*=共有結合のための部位)
であり、式中、kおよびlは独立して、0〜25の整数である。

0142

またさらなる実施形態では、Rはそれぞれ独立して、場合により末端置換を有する1〜4世代の、PAMAM、PEA、PEHAM、PPI、三分枝状ベンゾエート、またはグリセロールデンドリマーであり、前記場合による末端置換は、(− − − − −)(CH2CH2O)jCH3、または(− − − − −)(OCH2CH2)jCH3であり、jは0〜25の整数であり、点線(− − − − −)はそれぞれ独立して、C1〜C12アルキル、C1〜C12アルコキシ、C2〜C12アルケン、アミド、アミノ、アリール、(CH2)r(OCH2CH2)s(CH2)r(ここで、rはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、sは独立して0〜50の整数である)、カルバメート、カルボキシレート、C3〜C12シクロアルキル、イミド、フェノキシ、またはC4〜C18(ヘテロ)アリール基のいずれか1つまたはこれらの組み合わせから選択される。

0143

代替の実施形態では、Rはそれぞれ独立して、




であり、式中、
kおよびlは独立して0〜25の整数であり、点線(− − − − −)はそれぞれ独立して、C1〜C12アルキル、C1〜C12アルコキシ、C2〜C12アルケン、アミド、アミノ、アリール、(CH2)r(OCH2CH2)s(CH2)r(ここで、rはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、sは独立して0〜50の整数である)、カルバメート、カルボキシレート、C3〜C12シクロアルキル、イミド、フェノキシ、またはC4〜C18(ヘテロ)アリール基のいずれか1つまたはこれらの組み合わせから選択され、*=共有結合のための部位である。

0144

代替の実施形態では、Rはそれぞれ独立して、




であり、式中、
kおよびlは独立して0〜25の整数であり、点線(− − − − −)はそれぞれ独立して、C1〜C12アルキル、C1〜C12アルコキシ、C2〜C12アルケン、アミド、アミノ、アリール、(CH2)r(OCH2CH2)s(CH2)r(ここで、rはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、sは独立して0〜50の整数である)、カルバメート、カルボキシレート、C3〜C12シクロアルキル、イミド、フェノキシ、またはC4〜C18(ヘテロ)アリール基のいずれか1つまたはこれらの組み合わせから選択され、*=共有結合のための部位である。

0145

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される共役ポリマーは、任意リンカーL1および/またはL2を含有しない。他の実施形態では、共役ポリマーは、少なくとも約0.01モル%、少なくとも約0.02モル%、少なくとも約0.05モル%、少なくとも約0.1モル%、少なくとも約0.2モル%、少なくとも約0.5モル%、少なくとも約1モル%、少なくとも約2モル%、少なくとも約5モル%、少なくとも約10モル%、少なくとも約20モル%、または約25モル%の任意リンカーL1および/またはL2を含有する。いくつかの実施形態では、共役ポリマーは全体で最大50モル%の任意リンカーL1およびL2を含有し、約40モル%以下、約30モル%以下、約25モル%以下、約20モル%以下、約15モル%以下、約10モル%以下、または約5モル%以下で含有してもよい。リンカーは、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配され得る。

0146

いくつかの実施形態では、任意リンカーL1またはL2は、構造:




(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)
を有し、式中、
R3は独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキルまたはC2〜C18(ヘテロ)アリール基であり、ここで、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキルまたはC2〜C18(ヘテロ)アリール基はそれぞれ、場合により、1つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル基、C1〜C12アルコキシ、またはC1〜C12ハロアルキルによって置換されていてもよく、そしてqは0〜4の整数である。

0147

いくつかの実施形態では、任意リンカーL1またはL2は:




(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)
によって表される構造を有し、式中、
Aは共役、鎖延長または架橋のための部位であり、−[O−CH2−CH2]t−W、または(C1〜C12)アルコキシ−Xであり、
Wは、−OHまたは−COOHであり、
Xは、−NH2、−NHCOOH、−NHCOOC(CH3)3、−NHCO(C3〜C12)シクロアルキル(C1〜C4)アルキル−N−マレイミド、または−NHCO[CH2−CH2−O]uNH2であり、
tは、1〜20の整数であり、そして
uは、1〜8の整数である。

0148

他の実施形態では、任意リンカーL1またはL2は、構造:




(*=不飽和骨格への共有結合のための部位)
を有するa〜hからなる群から選択され、式中、
R’は独立して、H、ハロゲン、C1〜C12アルキル、(C1〜C12アルキル)NH2、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキル、C1〜C12ハロアルキル、C2〜C18(ヘテロ)アリール、C2〜C18(ヘテロ)アリールアミノ、−[CH2−CH2]r’−Z1、もしくは(C1〜C12)アルコキシ−X1(ここで、Z1は−OHまたは−COOHであり、X1は−NH2、−NHCOOH、−NHCOOC(CH3)3、−NHCO(C3〜C12)シクロアルキル(C1〜C4)アルキル−N−マレイミド、または−NHCO[CH2−CH2−O]s’(CH2)s’NH2であり、r’は1〜20の整数であり、そしてs’はそれぞれ独立して1〜20の整数である)、(CH2)3(OCH2CH2)x”OCH3(ここで、x”は独立して0〜50の整数である)、または場合により1つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルコキシ、もしくは(OCH2CH2)y”OCH3(ここで、y”はそれぞれ独立して0〜50の整数である)によって置換されていてもよいベンジルであり、そしてR’はRとは異なり、
R15は、構造:




(*=骨格への共有結合のための部位)
を有するl〜tからなる群から選択され、
kは2、4、8、12または24である。

0149

特定の実施形態では、任意リンカーL1またはL2は、




である。

0150

いくつかの実施形態では、G1およびG2は、場合により置換されていてもよいアリールであり、ここで、場合による置換基は、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、ボロン酸、ボロン酸ラジカル、ボロン酸エステルおよび場合により置換され得るフルオレンから選択される。

0151

他の実施形態では、G1およびG2は同一である。さらなる実施形態では、G1およびG2は異なる。G1およびG2は、さらなる共役、架橋、またはポリマー鎖延長を可能にする活性化単位であってもよいし、あるいは非活性化末端単位であってもよい。

0152

いくつかの実施形態では、G1およびG2は独立して、




(*=骨格への共有結合のための部位)
によって表される構造から選択され、式中、
R11は、結合、C1〜C20アルキル、C1〜C20アルコキシ、C2〜C20アルケン、C2〜C20アルキン、C3〜C20シクロアルキル、C1〜C20ハロアルキル、(CH2)x(OCH2CH2)p(CH2)x(ここで、xはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、pは独立して0〜50の整数である)、アリール、C2〜C18(ヘテロ)アリール、フェノキシ、アミド、アミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネート、スルフィド、ジスルフィド、またはイミド基のいずれか1つまたはこれらの組み合わせであり、別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボキシレート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結される。

0153

他の実施形態では、G1およびG2は独立して、構造:




(*=骨格への共有結合のための部位)
を有する1〜18からなる群から選択され、式中、R15は、構造:




を有するl〜tからなる群から選択され、
kは2、4、8、12または24である。

0154

さらなる実施形態では、G1およびG2は、




または




である。

0155

いくつかの実施形態では、任意リンカーL1および/またはL2、G1、および/またはG2は、さらに、有機色素、生体分子または基質に共役され得る。共有結合は任意の既知の方法によって導入することができ、マレイミド/チオールと、チオール/チオールと、ピリジルジチオール/チオールと、ヨード酢酸スクシンイミジル/チオールと、N−スクシンイミジルエステル(NHSエステル)、スルホジクロロフエノールエステル(SDPエステル)、またはペンタフルオロフェニル−エステル(PFPエステル)/アミンと、ビススクシンイミジルエステル/アミンと、イミドエステル/アミンと、ヒドラジンまたはアミン/アルデヒド、ジアルデヒドまたはベンズアルデヒドと、イソシアナート/ヒドロキシルまたはアミンと、炭水化物−過ヨウ素酸/ヒドラジンまたはアミンと、ジアジリン/アリールアジド化学と、ピリジルジチオール/アリールアジド化学と、アルキン/アジドと、カルボキシ−カルボジイミド/アミンと、アミン/Sulfo-SMCC(スルホスクシンイミジル4−[N−マレイミドメチル]シクロヘキサン−1−カルボキシレート)/チオールと、アミン/BMPH(N−[β−マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド・TFA)/チオールとを伴う化学を含み得るが、これらに限定されない。

0156

いくつかの実施形態では、MUは、構造:




(=不飽和骨格への共有結合のための部位)
を有するa’〜k’からなる群から選択され、式中、
Rは、10mg/mLを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基である。非イオン性側基には、式(I)のポリマーに対して既に記載されたものが含まれる。

0157

本明細書で使用される場合、いくつかの実施形態では、ペンダント鎖は、結合、C1〜C20アルキル、C1〜C20アルコキシ、C2〜C20アルケン、C2〜C20アルキン、C3〜C20シクロアルキル、C1〜C20ハロアルキル、(CH2)x(OCH2CH2)p(CH2)x(ここで、xはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、pは独立して0〜50の整数である)、アリール、C2〜C18(ヘテロ)アリール、フェノキシ、アミド、アミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネート、スルフィド、ジスルフィド、またはイミド基のいずれか1つまたはこれらの組み合わせであり、ポリマーを別の基質、分子、または生体分子への共役のための官能基と接続させる。

0158

いくつかの実施形態では、式(I)の共役ポリマーは、式(Ia):




の構造を有し、式中、R、L1、L2、G1、G2、MU、a、b、c、dおよびnは式(I)に対して既に記載されている。

0159

さらなる態様では、式Iの共役ポリマーは、式(Ib):




の構造を有し、式中、G1またはG2の少なくとも1つは、官能性共役部位を含む。

0160

さらなる態様では、式Iの共役ポリマーは、式(Ic):




の構造を有し、式中、L1は官能性共役部位を含む。

0161

さらなる態様では、式Iの共役ポリマーは、式(Id):




の構造を有し、式中、G1またはG2の少なくとも1つは官能性共役部位を含む。

0162

さらなる態様では、式Iの共役ポリマーは、式(II):




の構造を有し、式中、L1、G1、G2、a、c、nおよび破線の結合は、式(I)に対して既に記載されている。

0163

いくつかの実施形態では、式(II)の共役ポリマーは、式(IIa):




の構造を有し、式中、L1、G1、G2、a、c、およびnは、式(I)に対して既に記載されている。

0164

さらなる態様では、式Iの共役ポリマーは、式(III):




の構造を有し、式中、L1、G1、G2、a、c、nおよび破線の結合は、式(I)に対して既に記載されている。

0165

いくつかの実施形態では、式(III)の共役ポリマーは、式(IIIa):




の構造を有し、式中、L1、G1、G2、a、c、およびnは、式(I)に対して既に記載されている。

0166

さらなる態様では、式Iの共役ポリマーは、式(IV):




の構造を有し、式中、
R5はそれぞれ独立して、水素、シアノ、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキルまたはC2〜C18(ヘテロ)アリール基であり、ここで、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキルまたはC2〜C18(ヘテロ)アリール基はそれぞれ、場合により、1つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル基、C1〜C12アルコキシ、またはC1〜C12ハロアルキルによって置換されていてもよく、そして
L1、G1、G2、a、c、nおよび破線の結合は、式(I)に対して既に記載されている。

0167

さらなる態様では、式Iの共役ポリマーは、式(V):




の構造を有し、式中、
R5はそれぞれ独立して、水素、シアノ、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキルまたはC2〜C18(ヘテロ)アリール基であり、ここで、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキルまたはC2〜C18(ヘテロ)アリール基はそれぞれ、場合により、1つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル基、C1〜C12アルコキシ、またはC1〜C12ハロアルキルによって置換されていてもよく、そして
L1、G1、G2、a、c、nおよび破線の結合は、式(I)に対して既に記載されている。

0168

また本明細書には、以下の式:




の構造を有するポリマーが提供されており、式中、
G1およびG2はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、場合により置換され得るアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステルおよび場合により置換され得るフルオレンから選択され、
Lは、結合、またはポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールもしくはヘテロアリール基であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケン、C2〜C12アルキン、C3〜C12シクロアルキル、C1〜C12ハロアルキル、C1〜C12アルコキシ、C2〜C18(ヘテロ)アリールオキシ、C2〜C18(ヘテロ)アリールアミノ、(CH2)x(OCH2CH2)pOCH3(ここで、xはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、pは独立して0〜50の整数である)、またはC2〜C18(ヘテロ)アリール基から選択される1つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
L1、L1’、L2およびL2はそれぞれ独立して、共有結合、C1〜C12アルキレン、C3〜C12シクロアルキレン、C2〜C12アルケニレン、C2〜C12アルキニレン、(C6〜C18)アリール(C1〜C12)アルキレン、(C6〜C18)アリール(C2〜C12)アルケニレン、(C6〜C18)アリール(C1〜C12)アルキニレン、C6〜C18アリーレン基、−Y1−[O−Y2]p−、−O−Y1−[O−Y2]p−であり、ここで、C1〜C12アルキレン、C3〜C12シクロアルキレン、(C6〜C18)アリール(C1〜C12)アルキレン、またはC6〜C18アリーレン基はそれぞれ、場合により、1つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル基、C1〜C12アルコキシ、C1〜C12ハロアルキル、−Y1−[O−Y2]p−または−O−Y1−[O−Y2]p−によって置換されていてもよく、
qは、0または1〜8の整数であり、
pは、0または1〜24の整数であり、
Y1およびY2はそれぞれ独立して、共有結合、またはC1〜12アルキレン基、C3〜C12シクロアルキレン、C2〜C18(ヘテロ)アリーレン、(C6〜C18)アリール(C1〜C12)アルキレンであり、ここで、C1〜12アルキレン基、C3〜C12シクロアルキレン、C2〜C18(ヘテロ)アリーレン、(C6〜C18)アリール(C1〜C12)アルキレンはそれぞれ、場合により、1つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルキル、C2〜C12アルケニル、C2〜C12アルキニル基、C1〜C12アルコキシ、またはC1〜C12ハロアルキルによって置換されていてもよく、
E1およびE1’はそれぞれ独立して、水素、C1〜C6アルキル、−OH、−COOH、−SH、−SR、−SHR+、SR2+、−SO3−、−PO4−、Br、−NH2、−NHR、−NR2、−NH3+、−NH2R+、−NHR2+または−NR3+であり、ここで、Rはそれぞれ独立して、C1〜C6アルキルおよび−SHR+、SR2+、−SO3−、−PO4−、−NH3+、−NH2R+、−NHR2+または−NR3+(それぞれ場合により、関連の対イオンを有していてもよい)であり、そして
nは、1〜約1,000の整数である。

0169

また本明細書には、以下の式:




の構造を有するポリマーが提供されており、式中、
Rはそれぞれ独立して、O(CHx)、もしくは(CH2)3(OCH2CH2)pOCH3(ここで、xはそれぞれ独立して0〜20の整数であり、pはそれぞれ独立して0〜50の整数である)、または場合により1つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、C1〜C12アルコキシ、もしくは(OCH2CH2)mOCH3(ここで、mはそれぞれ独立して0〜50の整数である)によって置換されていてもよいベンジルであり、
G1は、水素、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、場合により置換され得るアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステルおよび場合により置換され得るフルオレンから選択され、そして
nは、1〜約10,000の整数である。

0170

共役ポリマーの付加的な実施形態は、以下の実施例において記載されている。

0171

共役ポリマーの調製
本明細書に記載される共役ポリマーの合成は、化学文献に記載される手段を用いて、本明細書に記載される方法方法を用いて、あるいはこれらに組み合わせて達成することができる。

0172

本明細書に記載される共役ポリマーは、当業者に知られている標準的な合成技術を用いて、あるいは本明細書に記載される方法と組み合わせて当該技術分野において既知の方法を用いて合成することができる。さらに、本明細書において提示される溶媒、温度およびその他の反応条件は、当業者の習慣および知識に従って異なり得る。

0173

式(1)の共役ポリマーおよび本明細書中に記載される先行のセクションで記載された構造を有するポリマーの合成のために使用される出発材料は、Aldrich Chemical Co.(Milwaukee,Wis.)、Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo.)などの商業的供給源から入手することもできるし、あるいは出発材料は合成することもできる。本明細書中に記載されるポリマー、および異なる置換基を有する他の関連のポリマーは、例えば、March,ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4th Ed.(Wiley 1992)、Carey and Sundberg, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4th Ed., Vols.A and B(Plenum 2000, 2001)、およびGreen and Wuts, PROTECTIVEGROUPSIN ORGANICSYNTHESIS 3RD ED. (Wiley 1999)(これらは全て、参照によってその全体が援用される)などに記載されるように、当業者に知られている技術および材料を用いて合成することができる。本明細書に開示されるポリマーの調製のための一般的な方法は、当該分野において既知の反応から導くことができ、当業者によって認識されるように、反応は、本明細書で提供される式中に見出される種々の部分の導入のために、適切な試薬および条件の使用によって修正され得る、参考として、以下の合成方法が利用され得る。

0174

一般に、フルオレン高分子構造の重合は、当業者に知られている重合技術を用いて、あるいは本明細書に記載される方法と組み合わせて当該技術分野において知られている方法を用いて達成することができる。例えば、重合は、市販のフルオレン−ジハライドモノマー、例えば2,7−ジブロモフルオレン、およびそのジボロン酸またはエステル誘導体を用いる鈴木カップリングにより達成することができる。

0175

構造A−1およびA−2は金属触媒により触媒されて、終結点の標識Yを有する例示的なポリマーA−3を形成する。Yはそれぞれ独立して、−H、−Br、−B(OH)2、またはボロン酸エステル、例えば4,4,5,5,−テトラメチル−1,3,2−ジオキサボロラニルである。

0176

フルオレン−ジハライドモノマーからのジボロン酸エステル誘導体の合成は、ビス(ピナコラト)ジボロンを用いる鈴木カップリングにより達成することもできる。

0177

エチレングリコールオリゴマーまたはエチレングリコールポリマーなどの置換基は重合の前のモノマーに結合されても、重合後のポリマー自体に結合されてもよい。mPEG化(mPEGylated)基によって置換されたフルオレンモノマーを合成する例示的なスキームは、以下の通りである。

0178

2,7−ジブロモフルオレン(B−1)および3−ブロモプロパノールは、水酸化ナトリウム水酸化カリウムなどの強塩基と、相間移動触媒(例えば、臭化テトラブチルアンモニウム)との存在下で加熱され、完結するまで反応されて、2,7−ジブロモ−9,9−ジ(3’−ヒドロキシプロパニル)フルオレン(B−2)を形成する。B−2の−OH基ピリジンの存在下で塩化トシルによりトシル化され、完結するまで反応させられ、2,7−ジブロモ−9,9−ジ(3’−メチルベンゼンスルホナトプロパニル)フルオレン(B−3)を形成する。次に、B−3は、カリウムtert−ブトキシドの存在下、mPEG(x)アルコールと反応されて、mPEG鎖が結合されたB−4を形成する。mPEGアルコールは、1〜50のmPEG鎖を有することができる。典型的なサイズとしては、mPEG5、mPEG8、mPEG11、mPEG24が挙げられるが、これらに限定されない。代替のスキームでは、mPEGアルコールはまず塩化トシルによりトシル化され、次にB−2と反応されて、B−4を形成することができる。

0179

例示的な構造B−4などの置換されたモノマーは、本明細書に開示されるスキームにおいてさらにジボロン酸エステルに誘導体化することができ、続いて鈴木カップリングなどによる重合のために使用することができる。高分子フルオレンは、有機金属触媒作用を伴う他の反応スキームの使用によって得ることもできる。例えば、山本反応は、例示的な構造B−4のようなハロゲン化アリールモノマーのホモカップリングのためにニッケル(0)ベースの触媒を使用する。さらに、共役ポリマーは、Stille、HeckおよびSonogashiraカップリング反応を用いて合成することができる。例えば、山本反応スキームについては、Yamamoto et al., Macromolecules 25:1214-1223, 1992、Kreyenschmidt et al.,Macromolecules 28:4577-4582, 1995、およびPei et al.,J.Am.Chem.Soc.118:7416-7417, 1996を参照されたい。また、Stille反応スキームについては、Leclerc, Polym.Sci.Part A:Polym.Chem. 39:2867-2873, 2001、Heck反応スキームについては、Mikroyannidis et al., J.Polym.Sci. Part A:Polym.Chem. 45:4661-4670, 2007、そしてSonogashira反応スキームについては、Sonogashira et al., Tetrahedron Lett. 16:4467-4470,1975およびLee et al., Org.Lett. 3:2005-2007, 2001を参照されたい。

0180

リンカーおよびキャッピング単位は、前述と同様のメカニズムによってフルオレンポリマー骨格に共役され得る。例えば、キャッピング単位のブロモ−およびボロン酸エステルは、ポリマーの一方または両方の端部に付加するために使用され得る。キャッピング単位のブロモ−およびボロン酸エステルを両方用いると、ポリマーの両方の端部に付加し得る。一方の形態(キャッピング単位ブロモ−またはボロン酸エステルのいずれか)のみを用いると、そのそれぞれの補体で終結される端部のみに付加され、対称A−A + B−B重合の場合、ポリマーの一端のみを統計的に修飾するために使用することができる。非対称性ポリマーの場合、このアプローチは、ポリマーが単鎖の終端において修飾されるだけであることを化学的に保証するために使用される。図11は、鈴木カップリングを用いて、Y端部を有する例示的なフルオレンポリマーと、ブロモベンゼンフェニルボロン酸またはその両方を有する1つまたは複数のフェニル基とを付加させることを示す。

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