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図面 (17)

課題・解決手段

ビフィズス菌株AH121Aは、経口摂取された後、著しく免疫調節性である。この菌株は、免疫調節性生体治療剤として有用である。

概要

背景

腸内細菌によるコロニー形成からヒト胃腸管を保護する防御機構は非常に複雑であり、免疫学的観点及び非免疫学的観点の両方に関与する(1)。生来の防御機構は、の低pH、胆汁塩、蠕動ムチン層、及びリゾチームのような抗菌化合物を含む(2)。免疫機構は、小腸及び結腸全体に分布するパイエル板と呼ばれる、特殊なリンパ会合体、潜在的M細胞を含む(3)。これらの部位にある内腔抗原は、サイトカインネットワーク確立及び胃腸管への抗体の分泌を伴う適切なT及びB細胞サブセット刺激をもたらす(4)。加えて、抗原提示は、上皮細胞を介して上皮内リンパ球及び潜在的固有層免疫細胞に対して生じ得る(5)。したがって、宿主は実質的に胃腸管の免疫防御に投じる。しかし、胃腸管粘膜は宿主が外部環境相互作用する最大の表面であるので、平均寿命にかけて胃腸管が処理する100トンもの食物に対する免疫応答性を調節するためには、特定の制御機構を有する必要がある。更に、消化管では、胃腸内に500種を超える1011〜1012/gもの数の細菌がコロニー形成される。したがって、これらの制御機構は、非病原性付着細菌を、宿主に相当な損傷を引き起こすであろう侵襲病原から区別する能力を有する必要がある。事実、腸内フローラは、新たに摂取された潜在的病原性微生物立ち向かうことによって宿主の防御に寄与する。

プロバイオティク細菌は、治療が意図される種、又はそれに近い種に由来する場合、より有効であると一部で考えられている。したがって、ヒトに由来するものとは異なる、コンパニオンアニマルのために使用されるべきコンパニオンアニマル由来のプロバイオティク菌株が必要とされている。

PCT国際公開特許WO 01/90311は、プロバイオティク活性を有する、ネコから得られた糞便試料から単離されたプロバイオティク微生物を開示している。しかし、これらの細菌は、糞便試料から得られたものであり、GI管の上部に存在する自然の腸内マイクロフローラの一部を形成しない可能性がある。

概要

ビフィズス菌株AH121Aは、経口摂取された後、著しく免疫調節性である。この菌株は、免疫調節性生体治療剤として有用である。

目的

PCT国際公開特許WO 01/90311






したがって、プロバイオティク特性及び加工に対する生存能力で選択された、特にネコに適合する、GI管の上部に存在する自然の腸内マイクロフローラから単離することにより得られる細菌株を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

ビフィズス菌NCIMB41675の単離株

請求項2

生存細胞形態である、請求項1に記載のビフィズス菌株

請求項3

非生存細胞形態である、請求項1に記載のビフィズス菌株。

請求項4

前記ビフィズス菌が、ネコ科動物被験体からの大腸生検組織から単離される、請求項1〜3のいずれか一項に記載のビフィズス菌株。

請求項5

前記菌株が、経口摂取後に著しく免疫調節性である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のビフィズス菌株。

請求項6

請求項1〜5のいずれか一項に記載のビフィズス菌株を含む、製剤。

請求項7

プロバイオティク材料を更に含む、請求項6に記載の製剤。

請求項8

プレバイオティク材料を更に含む、請求項6又は7のいずれか一項に記載の製剤。

請求項9

摂取可能な担体を更に含む、請求項6〜8のいずれか一項に記載の製剤。

請求項10

前記摂取可能な担体が、カプセル錠剤、又は粉末のような薬学的に許容可能な担体である、請求項9に記載の製剤。

請求項11

前記摂取可能な担体が、油懸濁液、乳ベース懸濁液、チーズカカオバターベース組成物グレービー及び/又はヨーグルトベース組成物のような食料製品である、請求項9に記載の製剤。

請求項12

請求項1〜5のいずれか一項に記載のビフィズス菌株又は請求項6〜11のいずれか一項に記載の製剤を含む、食品

請求項13

前記食品が乾燥食品である、請求項12に記載の食品。

請求項14

前記食品が湿潤食品である、請求項12に記載の食品。

請求項15

プロバイオティク材料を更に含む、請求項12〜14のいずれか一項に記載の食品。

請求項16

プレバイオティク材料を更に含む、請求項12〜15のいずれか一項に記載の食品。

請求項17

前記食品がコンパニオンアニマル食品である、請求項12〜16のいずれか一項に記載の食品。

請求項18

薬剤として使用するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項6〜11のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項12〜17のいずれか一項に記載の食品。

請求項19

望ましくない炎症活性の予防及び/又は治療に使用するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項6〜11のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項12〜17のいずれか一項に記載の食品。

請求項20

望ましくない胃腸管炎症活性の予防及び/又は治療に使用するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項6〜11のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項12〜17のいずれか一項に記載の食品。

請求項21

望ましくない炎症活性による自己免疫不全の予防及び/又は治療に使用するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項6〜11のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項12〜17のいずれか一項に記載の食品。

請求項22

望ましくない炎症活性による下痢疾患の予防及び/又は治療に使用するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項6〜11のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項12〜17のいずれか一項に記載の食品。

請求項23

コンパニオンアニマルの免疫系の調節又は改善に使用するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項6〜11のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項12〜17のいずれか一項に記載の食品。

請求項24

コンパニオンアニマルの自己免疫疾患の予防及び/又は治療に使用するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項6〜11のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項12〜17のいずれか一項に記載の食品。

請求項25

コンパニオンアニマルの炎症の予防及び/又は治療に使用するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載のビフィズス菌株、又は請求項6〜11のいずれか一項に記載の製剤、又は請求項12〜17のいずれか一項に記載の食品。

技術分野

0001

本発明は、ビフィズス菌株、及びとりわけ免疫調節性生物学的薬剤としてのプロバイオティク細菌としてのその使用に関する。

背景技術

0002

腸内細菌によるコロニー形成からヒト胃腸管を保護する防御機構は非常に複雑であり、免疫学的観点及び非免疫学的観点の両方に関与する(1)。生来の防御機構は、の低pH、胆汁塩、蠕動ムチン層、及びリゾチームのような抗菌化合物を含む(2)。免疫機構は、小腸及び結腸全体に分布するパイエル板と呼ばれる、特殊なリンパ会合体、潜在的M細胞を含む(3)。これらの部位にある内腔抗原は、サイトカインネットワーク確立及び胃腸管への抗体の分泌を伴う適切なT及びB細胞サブセット刺激をもたらす(4)。加えて、抗原提示は、上皮細胞を介して上皮内リンパ球及び潜在的固有層免疫細胞に対して生じ得る(5)。したがって、宿主は実質的に胃腸管の免疫防御に投じる。しかし、胃腸管粘膜は宿主が外部環境相互作用する最大の表面であるので、平均寿命にかけて胃腸管が処理する100トンもの食物に対する免疫応答性を調節するためには、特定の制御機構を有する必要がある。更に、消化管では、胃腸内に500種を超える1011〜1012/gもの数の細菌がコロニー形成される。したがって、これらの制御機構は、非病原性付着細菌を、宿主に相当な損傷を引き起こすであろう侵襲病原から区別する能力を有する必要がある。事実、腸内フローラは、新たに摂取された潜在的病原性微生物立ち向かうことによって宿主の防御に寄与する。

0003

プロバイオティク細菌は、治療が意図される種、又はそれに近い種に由来する場合、より有効であると一部で考えられている。したがって、ヒトに由来するものとは異なる、コンパニオンアニマルのために使用されるべきコンパニオンアニマル由来のプロバイオティク菌株が必要とされている。

0004

PCT国際公開特許WO 01/90311は、プロバイオティク活性を有する、ネコから得られた糞便試料から単離されたプロバイオティク微生物を開示している。しかし、これらの細菌は、糞便試料から得られたものであり、GI管の上部に存在する自然の腸内マイクロフローラの一部を形成しない可能性がある。

先行技術

0005

PCT国際公開特許WO 01/90311

発明が解決しようとする課題

0006

したがって、プロバイオティク特性及び加工に対する生存能力で選択された、特にネコに適合する、GI管の上部に存在する自然の腸内マイクロフローラから単離することにより得られる細菌株を提供すること、並びにこれらの菌株を、使用に好適な組成物に組み込むことが必要である。

課題を解決するための手段

0007

本発明により、ビフィズス菌NCIMB 41675の単離株が提供される。

0008

このビフィズス菌株は、生存細胞形態であってもよいし、非生存細胞形態であってもよい。

0009

このビフィズス菌株は、ネコ科動物検体からの大腸生検組織から単離されることができる。

0010

このビフィズス菌株は、経口摂取後に著しく免疫調節性であり得る。

0011

本発明は、本明細書に記載されているようなビフィズス菌株を含む製剤も提供する。

0012

この製剤は、プロバイオティク材料を更に含んでもよい。この製剤は、プレバイオティク材料を更に含んでもよい。この製剤は、摂取可能な担体を更に含んでもよい。この摂取可能な担体は、カプセル錠剤、又は粉末のような薬学的に許容可能な担体であってもよい。この摂取可能な担体は、油懸濁液、乳ベース懸濁液、チーズカカオバターベース組成物グレービー及び/又はヨーグルトベース組成物のような食料製品であってもよい。

0013

本発明は、本明細書に記載されるようなビフィズス菌株又は製剤を含む食品を更に提供する。

0014

この食品は乾燥食品であってもよい。この食品は湿潤食品であってもよい。この食品は、プロバイオティク材料を更に含んでもよい。この食品は、プレバイオティク材料を更に含んでもよい。この食品はコンパニオンアニマル食品であってもよい。

0015

本発明は、薬剤として使用するための、本発明に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。

0016

本発明は、望ましくない炎症活性の予防及び/又は治療に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。

0017

本発明は、望ましくない胃腸管炎症活性の予防及び/又は治療に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。

0018

本発明は、望ましくない炎症活性による自己免疫疾患の予防及び/又は治療に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。

0019

本発明は、望ましくない炎症活性による下痢疾患の予防及び/又は治療に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。

0020

本発明は、コンパニオンアニマルの免疫系の調節又は改善に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。

0021

本発明は、コンパニオンアニマルの自己免疫疾患の予防及び/又は治療に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。

0022

本発明は、コンパニオンアニマルの炎症の予防及び/又は治療に使用するための、本明細書に記載のビフィズス菌株、又は製剤、又は食品も提供する。

0023

我々は、ビフィズス菌株AH121A(NCIMB 41675)又はその変種若しくは変異型について説明する。

0024

株は、切除及び洗浄したネコ科動物の胃腸管からの単離によって得られる。

0025

変種は、遺伝組み換えされた変種であってもよい。変異型は、天然に発生するビフィズス菌の変異型であってもよい。

0026

株はプロバイオティクであってもよい。株は生物学的に純粋な培養物の形態であってもよい。

0027

また、ビフィズス菌NCIMB 41675の単離株についても説明する。

0028

ビフィズス菌株は生存細胞形態であってもよい。あるいは、ビフィズス菌株は非生存細胞形態であってもよい。

0029

プロバイオティク菌は、生存細胞形態で一般に使用され得る。しかし、プロバイオティク菌により発現される有益な因子を含有する、死滅した培養物又は組成物のような非生存細胞にも及ぶことができる。これには、熱で死滅した微生物、あるいはpH変化に曝されることにより又は圧力を受けることにより死滅した微生物が含まれ得る。非生存細胞製品の調製はより単純であり得るので、細胞を容易に医薬品に組み込むことができ、生存細胞に比べ保管要件の制限ははるかに少ない。米国特許第4347240号に記載のように、乳酸カセイ菌YIT 9018は、腫瘍成長の治療及び/又は予防のための方法として、熱によって死滅した細胞の有効な使用の例を提供する。

0030

我々は、コンパニオンアニマルの健康を維持及び改善するための、切除及び洗浄されたネコ科動物の胃腸管から単離することによって得られる細菌の使用、並びにこの乳酸菌を含む組成物についても説明する。

0031

我々は、本明細書に記載のビフィズス菌株を含む製剤について説明する。この製剤は別のプロバイオティク材料を含んでもよく、この製剤はプレバイオティク材料を含んでもよい。

0032

ビフィズス菌は共生微生物である。ビフィズス菌は、ヒトの胃腸管内の微生物フローラから単離されてきた。胃腸管内の免疫系がこのフローラの員に対して顕著な反応を有することができないのは、その結果生じる炎症活性のために宿主細胞及び組織機能もまた破壊されることになるからである。このため、免疫系が胃腸管フローラの共生非病原性員を病原性微生物と異なるものとして認識することを可能にするいくつかの作用が存在する。これによって、確実に宿主組織への損傷が制限され、防御バリアがなお維持される。

0033

本明細書全体を通して、用語「変種」、「変異型」、及び「遺伝子組み換えされた変種」は、親株と比べて遺伝的特性及び/又は表現型特性が変更されたビフィズス菌株を含む。ビフィズス菌ロンガム自然発生変異型は、選択的に単離された標的特性自発的変化を含む。親株特性の意図的変更は、遺伝子破壊接合伝達などのような従来的(インビトロ遺伝子操作技術によって実現される。遺伝子組み換えは、ビフィズス菌株のゲノムへの外因性及び/又は内因性DNA配列の導入を含み、例えば、プラスミドDNA又はバクテリオファージなどのベクターによるこの細菌株のゲノムへの挿入による。

0034

自然変異又は誘導変異は、削除、挿入、トランスバージョン、又は他のDNA組み換えのような、DNA配列によってエンコードされるアミノ酸配列の変化を結果としてもたらし得る少なくとも1つの塩基の変化を含む。

0035

変種、変異型、及び遺伝子組み換えされた変種という用語は、また、自然において全ての微生物に関して一貫している速度でゲノムに蓄積する遺伝子変化、及び/又は自然突然変異によって生じる遺伝子変化、及び/又は遺伝子の獲得、及び/又はゲノムの意図的(インビトロ)操作によってではなく変異型の自然選択によって達成される遺伝子損失を経たビフィズス菌株、並びに/あるいは抗生物質のような環境的圧力に曝されたときに細菌の生存を支持する選択的利点を提供する変異型もまた含む。30変異型は、その生物の生化学的機能性を本質的に変えないが、例えば抗生物質耐性など、細菌の識別又は選択のためにそれらの生成物を使用することができる、ゲノムへの特定の遺伝子の意図的(インビトロ)挿入によって作り出すことができる。

0036

業者は、親株を使ったDNA配列相同性分析によってビフィズス菌の変種株又は変異株を識別できることを理解するであろう。親株と近い配列同一性を有するビフィズス菌株は、変種株又は変異株とみなされる。親株DNA配列と97%以上、98%以上、又は99%以上など96%以上の配列同一性(相同性)を有するビフィズス菌株は、変種又は変異型であるとみなされ得る。配列相同性は、http://www.ncbi.nlm.nih,gov/BLAST/で公的に入手可能なオンライン相同性アルゴリズム「BLAST」プログラムを使用して決定することができる。

0037

親株の変種は、親株の16s〜23s遺伝子間スペーサポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも90%の配列相同性又は少なくとも95%の配列相同性など少なくとも85%の配列相同性を有する、誘導されたビフィズス菌株も含む。これらの変種は、その細菌ゲノムの他のDNA配列におけるDNA変異も更に含み得る。

図面の簡単な説明

0038

本発明は、添付の図を参照してあくまで例として与えられる以下の説明によって、より明瞭に理解されるであろう。
コンゴレッド寒天平板上で増殖したビフィズス菌ロンガムAH121Aの写真
ビフィズス菌ロンガム121A(ビフィズス菌121A)で刺激されたPBMCでのIL−10:IL−12p70の比率を図示する棒グラフ
低pH環境での株121Aの生存を図示するプロット。pH2.5の環境には、株を6時間被曝させ、生菌数を用いて生存率を評価した。
インビトロ培養末梢血単核細胞(PBMC)からのサイトカイン分泌のプロット。
インビトロ培養末梢血単核細胞(PBMC)からのサイトカイン分泌のプロット。
インビトロ培養末梢血単核細胞(PBMC)からのサイトカイン分泌のプロット。
A〜Eは、121A及びBif 35624の濃度の増加によるインビトロ刺激後のPBMCにおけるIL−10の誘導プロファイルを示す線グラフ
A〜Dは、121A及びBif 35624の濃度の増加によるインビトロ刺激後のPBMCにおけるIL−Iβの誘導プロファイルを示す線グラフ。
A〜Dは、121A及びBif 35624の濃度の増加によるインビトロ刺激後のPBMCにおけるIL−6の誘導プロファイルを示す線グラフ。
A〜Dは、121A及びBif 35624の濃度の増加によるインビトロ刺激後のPBMCにおけるIL−8の誘導プロファイルを示す線グラフ。
A〜Dは、121A及びBif 35624の濃度の増加によるインビトロ刺激後のPBMCにおけるIL−12 p70の誘導プロファイルを示す線グラフ。
A〜Eは、121A及びBif 35624の濃度の増加によるインビトロ刺激後のPMBCにおけるTNF−αの誘導プロファイルを示す線グラフ。
A〜Cは、121A及びBif 35624の濃度の増加によるインビトロ刺激後のPMBCにおけるIFN−γの誘導プロファイルを示す線グラフ。
A〜Dは、121A及びBif 35624の濃度の増加によるインビトロ刺激後のPBMCにおけるG−CSFの誘導プロファイルを示す線グラフ。
ヒト骨髄樹枝状細胞によるIL−10及びIL−12 p70の分泌への121Aの影響を示す棒グラフ。
ヒト未感作CD4+ T細胞への121Aの影響を示す棒グラフ。

0039

ビフィズス菌ロンガム株AH121Aの堆積物は、2009年11月5日にNational Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland,UKで作製され、受け入れ番号NCIMB 41675を与えられた。

0040

ビフィズス菌ロンガム株UCC 35624の堆積物は、1999年1月13日にNational Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(NCIMB)Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland,UKで作製され、受け入れ番号NCIMB 41003を与えられた。

0041

ビフィズス菌ロンガムは遺伝子が組み換えられた変種でもよく、自然発生するその変異型でもよい。

0042

ビフィズス菌ロンガムは生存細胞形態であることが好ましい。

0043

あるいは、ビフィズス菌ロンガムは非生存細胞形態であってもよい。

0044

本明細書で使用する時、「コンパニオンアニマル」とは家畜を意味する。好ましくは、「コンパニオンアニマル」は、家庭で飼われるネコ科動物(ネコ)、イヌ科動物イヌ)、ウサギ、白イタチウマウシなどを意味する。より好ましくは、「コンパニオンアニマル」は、家庭で飼われるネコ科動物を意味する。

0045

乳酸ビフィズス菌株
本発明の第一の態様は、動物内でプロバイオティク活性を有する切除及び洗浄されたネコ科動物の胃腸管から単離することにより得られる、ビフィズス菌属乳酸菌株を含む。プロバイオティクは、生存微生物又は死滅微生物、微生物の加工組成物、タンパク質又は炭水化物のようなそれらの構成成分、あるいは宿主に有益な作用を及ぼす細菌発酵精製画分である。プロバイオティク菌は、生存細胞形態で一般に使用される。しかし、プロバイオティク菌により発現される有益な因子を含有する、死滅した培養物又は組成物のような非生存細胞にも及ぶことができる。これには、熱で死滅した微生物、あるいは、pH変化に曝されることにより又は圧力を受けることにより死滅した微生物が含まれ得る。本発明の目的では、「プロバイオティク」は、特に指定がない限り、本発明の微生物によって発酵中に産生される代謝産物を更に含むことが意図される。これらの代謝産物は、発酵の媒質に放出されてもよいし、微生物内に蓄えられてもよい。本明細書で使用する時、「プロバイオティク」は、また、治療的用量で与えられた場合に宿主動物に有益な機能を果たす、細菌、細菌性ホモジネート、細菌性タンパク質、細菌抽出物、細菌発酵上清、及びこれらの混合物も含む。

0046

切除及び洗浄された哺乳類のGI管から直接単離することにより得られるビフィズス菌属の乳酸菌は、生菌細胞の摂食後にGI管に付着すること、並びに生存可能な形態、非生存可能な形態、又は分画された形態で動物に与えると、著しく免疫調節性でもあることが分かっている。理論に束縛されるものではないが、切除及び洗浄されたGI管から単離することにより得られるビフィズス菌は、胃腸粘膜組織と密接に関連していると考えられている。更に理論に束縛されるものではないが、このことは、プロバイオティク作用をもたらす代替的な宿主反応を生み出す本発明のプロバイオティクビフィズス菌をもたらすと考えられている。切除及び洗浄されたGI管からの単離によって得られるプロバイオティク細菌は、粘膜上皮及び宿主の免疫細胞との直接相互作用を介して宿主の免疫系を調節できることが判明している。この免疫調節は、プロバイオティク菌に関連した従来の作用機序、すなわち、閉鎖(occlusion)による胃腸への病原体付着の予防、及び栄養競合と相まって、本発明のビフィズス菌をプロバイオティク生物としてきわめて有効なものにする。

0047

切除及び洗浄されたネコ科動物のGI管から単離することによって得られる本発明のビフィズス菌は、多数の病原菌株/種に対してインビトロ抗菌活性を有する。理論に束縛されるものではないが、このインビトロ抗菌活性は、動物、好ましくはネコ科動物などのコンパニオンアニマルの生体内で潜在的プロバイオティク活性を示すと考えられている。本発明の乳酸菌は、好ましくは、サルモネラティフィムリウムリステリアモノサイトゲネスリステリアイノキュア、又は大腸菌、より好ましくはこれらの株の組み合わせ、更になお好ましくはこれらの株全てに対して、インビトロ抗菌活性を有する。

0048

理論に束縛されるものではないが、本発明の乳酸菌の抗菌活性は、本明細書中の乳酸菌による多数の異なる作用の結果である可能性があると考えられる。これまで、当該技術分野では、糞便試料から単離された幾つかの細菌株が、経口摂取後に、閉鎖(occlusion)によって胃腸粘膜への病原生物の付着を予防することにより、GI管においてそのプロバイオティク効果を及ぼすことが示唆されてきた。これには、胃腸内に細菌のコロニーを形成させるために、「生きている」すなわち生菌細胞の経口摂取が必要である。しかし、切除及び洗浄されたネコ科動物のGI管から単離することにより得られる本発明のビフィズス菌は、生存可能形態で与えられれば閉鎖(occlusion)による何らかのプロバイオティク効果を及ぼすが、インビトロでの発酵時に、病原微生物の増殖を阻害する、若しくは病原微生物を死滅させる、及び/又は宿主動物の免疫能力を変化させる物質単数又は複数)を産生するので、生存可能形態でも非生存可能形態でもかなりのプロバイオティク効果をもたらす可能性があると考えられている。この形態のプロバイオティク活性は、本発明の細菌を生存可能又は非生存可能な培養物あるいは精製発酵産物として与えてもなお宿主動物に有益な治療効果をもたらすので、望ましい。

0049

本発明の乳酸菌は、GI管内を通過した後に生存能力を維持できることが好ましい。このことは、生きた菌の培養物を経口摂取し、食道及び胃を通過後に小腸及び大腸内でコロニー形成を生じさせるために望ましい。本発明の乳酸菌による小腸及び大腸でのコロニー形成は、宿主に長期にわたるプロバイオティク効果をもたらすのに望ましい。非生存細胞又はその精製単離物経口服用は、一時的な効果をもたらすが、細菌は生存可能ではないので、増殖してその場で継続的にプロバイオティク効果をもたらすことができない。結果として、これには、健康上の利益を維持するために宿主に定期的に服用させることが必要になる場合がある。これに対し、生存可能な形態で胃を通過して生き残ることができ、その後胃腸粘膜に付着し腸粘膜上で増殖することによってコロニーを形成する生存細胞は、その場で継続的にプロバイオティク効果をもたらすことが可能である。したがって、本発明の乳酸菌は、pH 2.5の培地に1時間懸濁させた後で生存能力を維持することが好ましい。本明細書で使用するとき、「生存能力を維持する」とは、当業者に既知平板計数法を使用して、初めに試験培地に懸濁させた細菌の少なくとも25%が生存可能であることを意味する。好ましくは、「生存能力を維持する」とは、初めに懸濁させた細菌の少なくとも50%が生存可能であることを意味する。本発明の乳酸菌は、低いpHに曝された後で生存能力を維持することが望ましいが、これは、動物において、経口摂取後に生体内の胃及び腸上部で胃液に曝される状況を模しているからである。

0050

切除及び洗浄されたネコ科動物の胃腸管から単離することによって得られるビフィズス菌属の乳酸菌株は、動物、好ましくはコンパニオンアニマル又はヒトにおける経口摂取後にプロバイオティク効果を供給するのに用いることができる。このプロバイオティク効果は、一般に、動物の全般的な健康を維持及び改善する。治療的な症状緩和若しくは予防による疾患予防のいずれかにおいて利益を受ける、動物の健康的及び生理学的非限定的要素としては、炎症性疾患免疫不全炎症性腸疾患過敏性腸症候群、癌(特に胃腸管及び免疫系の癌)、下痢性疾患、抗生物質起因性の下痢、虫垂炎、自己免疫疾患、多発性硬化症アルツハイマー病アミロイド症リウマチ様関節炎関節炎間接可動性真性糖尿病インスリン耐性細菌性感染症ウイルス性感染症真菌性感染症歯周病泌尿生殖器疾患外科手術による外傷、外科手術による転移性疾患敗血症体重喪失体重増加、過剰な脂肪組織蓄積、拒食症体熱制御、悪液質創傷治癒潰瘍内臓障壁感染症アレルギー喘息呼吸器系疾患循環系疾患冠状動脈性心疾患貧血凝血系統疾患、腎疾患中枢神経系疾患肝臓病虚血、栄養疾患、骨粗鬆症内分泌腺疾患、及び表皮疾患が挙げられる。好ましいのは、下痢の治療又は予防を含む胃腸管の治療、好ましくは自己免疫疾患及び炎症の治療又は予防を含む免疫系調節、好ましくは皮膚のアトピー疾患の治療又は予防である皮膚及び/又はコート系の健康の維持又は改善、精神的意識及び活動レベルを含む加齢の影響の緩和又は軽減、視床下部下垂体アドレナリン軸に関連する疾患の予防、及び関節の健康の改善による可動性の改善である。

0051

以上で開示した疾患の処置は、当業者に既知の技術を使用して測定され得る。例えば、自己免疫疾患及び炎症などの炎症性疾患は、リンパ球幼若化現象ナチュラルキラー細胞活性、ワクチンに対する抗体反応、遅延型過敏症、及びこれらの組み合わせのようなインビボ免疫機能試験を使用して検出及び監視され得る。本明細書でこのような方法について簡単に説明するが、これらは当業者には周知である。

0052

1.リンパ球幼若化現象:このアッセイは、様々なマイトジェンに対する試験動物及び対照動物新鮮全血から単離されたリンパ球のインビトロ増殖反応を測定する、総合的なT細胞及びB細胞の機能の指標である。簡潔に言えば、当業者に既知のフィコールハイパー密度遠心分離法によって、全血から末梢血単核球(PBMC)を単離する。単離したPBMCを、HEES、L−グルタミン、及びペニシリンストレプトマイシンを追加したRPMI1640細胞培地で2回洗浄する。洗浄した細胞を、RPMI 1640中に再懸濁させ、計数し、細胞密度を適切に調節する。2×105個の細胞を、10%ウシ胎児血清(Sigma)を用い、37℃及び5% CO2で72時間にわたって、3回、一連の濃度(0.1μg/mL〜100μg/mL)の様々なマイトジェンに曝す。そのいくつかの例としては、ポークウィードマイトジェン(Gibco)、フィトヘマグルチニン(Gibco)、及びコンカナバリンA(Sigma)が挙げられる。54時間経過後に、細胞を1μCiH−チミジンパルスし、細胞を採集し、72時間後にTopCount NXTでシンチレーションカウントを読み取る。

0053

2.ナチュラルキラー細胞活性:米国特許第6,310,090号に記載されているように、このアッセイは、試験動物及び対照動物の新鮮な全血から単離されたナチュラルキラー細胞のインビトロエフェクター活性を測定する。ナチュラルキラー細胞は、哺乳類の先天性免疫機能の構成成分である。NK細胞細胞毒性活性を評価する際の標的細胞として、ネコ科動物の甲状腺癌細胞を使用した。この細胞株は、既に、ネコ科動物のNK細胞によって死滅しやすいことが示されていた。標的細胞を、10%のウシ胎児血清(FCS)、100U/mLのペニシリン、及び100μg/mLのストレプトマイシンを足した20niL最小必須培地MEM;ミズーリ州St.LouisのSigma Chem.Co.)とともにT75フラスコにて培養した。コンフルエントになった場合、標的細胞をトリプシン処理し、3回洗浄し、完全培地(RPMI−1640+10% FCS+100U/mLのペニシリン+100 10μg/mLのストレプトマイシン)中に細胞数5×105個/mLに再懸濁させた。標的細胞の3つの100μLアリコートを96ウェル底プレートマサチューセッツ州CambridgeのCostar)内にピペットで入れ、8時間インキュベートして、細胞を付着させた。次いで、フィコールハイパーク分離(前述)によって単離されたリンパ球(エフェクター細胞;100μL)を標的細胞に加えて、エフェクター/標的細胞(E:T)比を10:1にした。37℃で10時間インキュベートした後、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミドMTT)を5μg含有する20μLの基質を加えた。この混合物を37℃で4時間インキュベートし、その後、未代謝のMTTを吸引によって除去した。200μLの95%エタノールを加えることによってホルマザン結晶を溶解させた。マイクロプレートリーダーを使用して570nmで光学密度を測定した。NK細胞特有溶菌百分率は次のように計算した。特異的細胞毒性(%)=100×{1−[(標的細胞及びエフェクター細胞のOD−エフェクター細胞のOD)/(標的細胞のOD)]}

0054

3.ワクチンに対する抗体反応:少なくとも12週間プロバイオティク又は対照餌を与えた後、被験体にワクチンのアレイ(最大5まで)を与える。ワクチンは、新規ワクチンと余剰ワクチンとの混合物であってよい。使用してよいワクチンアレイの非限定例としては、Fort Dodge Animal Healthによって調製されたワクチンの混合物が挙げられる。本明細書に用いるのに好適なワクチンの非限定例としては、ネコ科動物ジステンパーアデノウイルスコロナウイルスパラインフルエンザ、及びパルボウイルスが挙げられる。被験体のワクチン歴が、使用すべきワクチンを決定するであろう。所与のワクチンに対する特異的抗体を、血液中で3週間にわたって測定し、対照餌群及びプロバイオティク餌群における反応の長さ及び強度を比較する。4.遅延型過敏症:免疫系の状態を評価するインビトロの非侵襲的方法。この試験は、多クローン性マイトジェンであるフィトヘマグルチニン(PHA)と、ヒツジ赤血球多価ワクチンヒスタミン(100μLの0.0275g/Lリン酸ヒスタミン;Greer(ノースカロライナ州Lenoir))、又はPBS(100μLの8.5g/Lリン酸緩衝生理食塩水;Sigma)とを組み合わせた、皮内注射を含む。注射後0、24、48、及び72時間の時間間隔キャリパーを使用した皮下脂肪の厚さとして、抗原に対する免疫反応を記録する。皮下脂肪の厚さの増加は、本発明の細菌による処置によって減少するはずの過敏性反応がより大きいことを示す。

0055

本発明のビフィズス菌の効果を判定するための更なる方法は、米国特許第6,133,323号及び米国特許第6,310,090号に記載されている。

0056

更に、体脂肪量除脂肪量、及び骨塩量などの身体組成を測定するためのデュアルX線吸収法又はCTスキャンを使用して、老化の影響の改善を判定することができる。同様に、この方法を使用して、感染後の被験体における体重減少又は骨密度のような解剖学的変化を判定することができる。

0057

また、本発明のビフィズス菌は、コンパニオンアニマルにおけるストレスレベルを低下させるための方法においても使用することができる。エピネフリンノルエピネフリンドーパミンコルチゾールC反応性タンパク質、及びその他の急性期タンパク質などの血中ストレスホルモンの濃度を測定して、ストレスレベル及びそれらの低下又は維持を判定してもよい。これらのホルモンは、ストレスバイオマーカーとして認識されており、当業者に既知の技術を使用して容易に測定することができる。更に、CT撮像により、視床下部−下垂体−副腎軸線の活性のインビボマーカーとしての副腎サイズを直接測定してもよい。

0058

更に、訓練を受けた2人によって行われる皮膚及び毛皮評価を用いて、アトピー性皮膚疾患を含むコンパニオンアニマルの皮膚及び/又は毛皮系の健康の維持又は改善を測定してもよい。そのような評価中に検査された基準の例には、以下が挙げられる。a)脱毛指数:脱毛指数は、標準化されたブラッシングセッション中に得られた毛髪収集することによって各被験体に割り当てられる。それらの毛髪を保持及び重量測定し、対照と被験体を比較する。b)主観的な皮膚/毛皮評価:脱毛、ふけつや均質性、柔らかさ、及び密度を評価することによって、訓練を受けた評価者が皮膚及び毛皮の状態を主観的に評価する。c)皮膚機能試験:アセトン含浸ガーゼで皮膚表面を拭き取ることによって皮膚バリア機能を評価することができる。この手法は、単一の細胞層及び関連した角質層脂質画分を除去することによって皮膚バリアを効果的に破壊する。当業者に既知の方法を使用して、経表皮水分損失(TEWL)の増加及び被術部位の赤色度を測定することによって、バリアの破壊を定量化する。前述のカメラ及び照明ステムを使用して、発赤紅斑スコアを得る。破壊の直前及び直後、並びに5時間及び24時間エンドポイントにおいて、TEWLの読み値及び発赤スコアを得て、皮膚の保護及び治癒特性を評価する。

0059

更に、コンパニオンアニマルにおける胃腸感染症の処置は、コンパニオンアニマルの微生物生態系の改善を含み得る。コンパニオンアニマルの微生物生態系の改善は、コンパニオンアニマルの糞便中の病原菌の量の低減を含むことが好ましい。コンパニオンアニマルの糞便中に存在する病原菌の量は、当業者に既知の標準的な平板計数法を使用して数えることができる。より好ましくは、病原菌は、クロストリジウムエシェリキア、サルモネラ、バクテロイデス、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。好適な病原菌株の非限定例としては、ウェルシュ菌、クロストリジウムディフィシレ、大腸菌、サルモネラチフィムリウム、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

0060

また、本発明の細菌の使用方法には、哺乳類、好ましくはコンパニオンアニマルの尿路の予防的又は治療的処置も含み得る。尿路の処置の非限定例としては、尿路感染症の治療又は予防、尿路結石を含む腎疾患の治療又は予防、膀胱感染症の治療又は予防等が挙げられる。理論に束縛されるものではないが、本発明のビフィズス菌は、インビトロにて立証されるように、そのシュウ酸分解能の結果としてこれらの疾患の予防に有用であると考えられる。シュウ酸は、腎臓、膀胱、及び他の尿路感染症を引き起こす不溶性沈殿物を形成できる、泌尿器代謝の副産物である。シュウ酸を分解し、その結果尿路でのシュウ酸の沈殿及び蓄積を潜在的に予防することによって、本発明の細菌は、尿路の感染症及びその他の疾患を治療及び予防し得る。シュウ酸の分解は、Boehringer Mannheirn/R−Biopharmから市販されているシュウ酸試験キットカタログ番号755699を使用して、インビトロにて測定できる。

0061

本発明のビフィズス菌は、繊維消化の改善を含む、コンパニオンアニマルの健康を改善又は維持するための方法において使用されることができる。繊維消化の改善は、前記プロバイオティク細菌及び有益な内因性微生物相の増殖を促進し、それがある程度の潜在的な病原菌の抑制に役立つので、望ましい。更に、ヒトにおける腸内発酵に起因した毒性代謝産物及び有害酵素の量の減少が記録されている(6)。各実験において、希釈された糞便試料を使用する代わりに、対象の細菌株の純粋培養物を使用して植菌したこと以外は、Vickersら(7)に記載された方法を使用して、繊維消化を判定してもよい。

0062

本発明のネコ科動物プロバイオティク菌株は、臭いを引き起こす糞便及び尿中の化合物の生成を低減することによって、糞便及び尿の臭い、並びに付随して砂箱トイレ内の臭いを低減するのに使用され得る。臭気を引き起こす化合物の非限定例としては、アンモニアインドールフェノールアミン分枝鎖脂肪酸、及び揮発性硫黄含有化合物が挙げられる。理論に束縛されるものではないが、コンパニオンアニマルの糞便又は尿中のこれら化合物の量を低減することが、糞便又は尿に関連する臭いを低減すると考えられている。更に、砂箱トイレを使用するコンパニオンアニマルにとっては、砂箱トイレの臭いにおいて付随した減少がある。

0063

本発明の乳酸菌の使用方法は、典型的に、動物による経口摂取を伴う。経口摂取は、通常の食餌摂取の一部として、又はそのサプリメントとして行われてもよい。経口摂取は、典型的に、少なくとも月に1回、好ましくは少なくとも週に1回、より好ましくは少なくとも1日に1回行われる。本発明の乳酸菌は、コンパニオンアニマルに治療的に有効な量で与えられて、動物、好ましくはコンパニオンアニマルの健康を維持又は改善することができる。本明細書で使用する場合、乳酸菌に関する用語「治療的に有効な量」とは、処置が必要な宿主動物に所望の効果又は利益をもたらすのに十分であるが、毒性、刺激、又はアレルギー反応のような悪影響を回避するために十分に少ない、本発明の方式で使用した場合に適当な利益/危険比に相応する量を意味する。具体的な「治療的に有効な量」は、処置されている特定の状態、ユーザー身体的状態処置期間併用療法(もしあれば)の性質、使用される具体的な剤形、採用される担体、剤形の溶解度、及び特定の服用レジメンのような因子によって変わるであろう。

0064

乳酸菌は、好ましくは1.0E+04〜1.0E+14CFU/日、より好ましくは1.0E+06〜1.0E+12CFU/日の1回量でコンパニオンアニマルに与えられる。好ましくは組成物は、切除及び洗浄されたネコ科動物のGI管から単離することにより得られる1.0E+04〜1.0E+12CFU/gのビフィズス菌属の乳酸菌を、少なくとも0.001%含有してもよい。乳酸菌は、生存可能な形態で、あるいは死滅細胞、又は留出物、単離物若しくは本発明の乳酸菌の発酵産物の他の画分、あるいはこれらの組み合わせとして、動物に与えることができる。

0065

乳酸菌、あるいはその精製又は単離された画分を用いて、動物の健康の維持又は改善用組成物を調製することが好ましい。前述のように、組成物は、通常の食餌摂取の一部であってもよく、又はサプリメントであってもよい。組成物が通常の食餌摂取の一部を構成する場合、組成物は、ビスケット又はキブルのような乾燥アニマルフード、加工されたグレイン餌、湿潤アニマルフード、ヨーグルト、グレービー、噛み物、トリーツ等の形態であってよい。

0066

このような組成物は、更なる構成成分を含んでもよい。その他の構成成分は、本明細書で使用される組成物に含めるのに有益であるが、本発明の目的には任意である。例えば、フード組成物は、栄養的にバランスが取れていることが好ましい。一実施形態では、フード組成物は、乾燥物質基準で、該フード組成物の約20重量%〜約50重量%の粗タンパク質、好ましくは約22重量%〜約40重量%の粗タンパク質を含んでよい。粗タンパク質材料は、少なくとも約15重量%のタンパク質含有量を有するいずれの材料を含んでもよく、その非限定例としては、大豆綿実、及び落花生のような植物性タンパク質、並びにカゼインアルブミン、及び肉組織のような動物性タンパク質が挙げられる。本明細書で有用な肉組織の非限定例としては、新鮮な肉、及び魚粉家禽粉、肉粉骨粉等の乾燥又は精製粉が挙げられる。他の種類の好適な粗タンパク質源としては、小麦グルテン又はトウモロコシグルテン、及び酵母などの微生物源から抽出されたタンパク質が挙げられる。

0067

更に、フード組成物は、乾燥物質基準で、該フード組成物の約5重量%〜約35重量%の脂肪、好ましくは約10重量%〜約30重量%の脂肪を含んでもよい。その上更に、本発明の乳酸菌を含むフード組成物は、食物繊維を合計で約4重量%〜約25重量%含んでもよい。また組成物は、PCT国際公開特許WO99/51108に記載の複数のデンプン源も含んでよい。

0068

本発明の組成物は、更に炭水化物供給源を含んでよい。米、トウモロコシ、ミロ、サトウモロコシ大麦アルファルファ小麦等のグレイン又は穀物が、供給源の例である。加えて、組成物は、乾燥乳清及びその他の酪農副産物のような他の材料を含有していてもよい。

0069

また本発明の細菌を含む組成物は、プレバイオティクも含んでもよい。「プレバイオティク」は、コンパニオンアニマルの腸内細菌相によって発酵され、その結果、病原菌を使ってコンパニオンアニマルの胃腸管内で乳酸菌の増殖及び発達を促進する、物質又は化合物を含む。この発酵の結果、大腸で脂肪酸、特に短鎖脂肪酸が放出される。これは、大腸におけるpH値を低下させる効果を有する。好適なプレバイオティクの非限定例としては、フラクトオリゴ糖ガラクトオリゴ糖キシロオリゴ糖、又はデンプンオリゴ誘導体として一般に知られている、イヌリン及びその加水分解生成物のようなオリゴ糖が挙げられる。プレバイオティクは、任意の好適な形態で提供することができる。例えば、プレバイオティクは、繊維を含有する植物材料の形態で提供されてもよい。好適な植物材料としては、アスパラガスアーティチョーク玉ねぎ、小麦若しくはチコリー、又はこれらの植物材料の残渣が挙げられる。あるいは、プレバイオティク繊維は、イヌリン抽出物として提供されてもよく、例えば、チコリーからの抽出物が好適である。好適なイヌリン抽出物は、ベルギー、Tirlemont 3300のOrafti SAより「Raftiline」の商標名で入手することができる。例えば、イヌリンは、約90〜約94重量%のイヌリン、最大で約4重量%のグルコース及びフルクトース、並びに約4〜9重量%のスクロースを含有する白色微粉末であるRaftiline(g)STの形態で提供されることができる。あるいは、繊維は、ベルギー、Tirlemont 3300のOrafti SAより「Raftilose」の商標名で入手されるようなフラクトオリゴ糖の形態であってもよい。例えば、イヌリンは、Raftilose(g)P95の形態で提供され得る。あるいは、フラクトオリゴ糖は、イヌリンの加水分解酵素的方法、又は微生物の使用により得ることもできる。

0070

乾燥コンパニオンアニマルフードの場合、好適なプロセスは押出調理であるが、ベーキング及びその他の好適なプロセスを使用してもよい。押出調理される場合には、乾燥コンパニオンアニマルフードは、通常、キブルの形態で提供される。プレバイオティクが使用される場合、プレバイオティクは、加工処理前に乾燥コンパニオンアニマルフードのその他の成分と混合されてよい。好適なプロセスは、欧州特許出願第0850569号に記載されている。プロバイオティク微生物が使用される場合、該微生物を乾燥コンパニオンアニマルフード上にコーティングする、又は乾燥コンパニオンアニマルフードに詰め込むことが最善である。好適なプロセスは、欧州特許公開第0 862 863号に記載されている。

0071

湿潤フードの場合、米国特許第4,781,939号及び同第5,132,137号に記載されているプロセスを使用して、擬似肉製品を製造してもよい。例えばスチームオーブンでの調理など、チャンク型製品を製造するためのその他の方法の使用も可能である。あるいは、好適な肉材料乳化させて肉エマルションを製造し、好適なゲル化剤を添加し、該肉エマルションを加熱してから又はその他の容器に詰めることによって、ローフ型の製品を製造してもよい。典型的な湿潤フード組成物は、約5%〜約15%のタンパク質、約1%〜約10%の脂肪、及び約1%〜約7%の繊維を含み得る。湿潤フード組成物において使用できる非限定的な成分としては、鶏肉シチメンチョウ肉、牛肉白身、鶏肉ブロス、シチメンチョウ肉ブロス、牛肉ブロス、鶏の肝臓、発酵用米、コーングリッツ、魚粉、ビートパルプ塩化物亜麻粉、子肉、牛肉副産物、鶏肉副産物、及びこれらの混合物が挙げられる。別の実施形態では、ビスケット、噛み物及びその他のトリーツ等のサプリメント組成物は、乾燥物質基準で、サプリメント組成物の約20重量%〜約60重量%のタンパク質、又は約22重量%〜約40重量%のタンパク質を含んでもよい。別の例として、サプリメント組成物は、乾燥物質基準で、該サプリメント組成物の約5重量%〜約35重量%の脂肪、又は約10重量%〜約30重量%の脂肪を含んでもよい。ネコ科動物用に使用されることを意図するフード及びサプリメント組成物は、当該技術分野において一般的に知られている。

0072

コンパニオンアニマルフードは、長鎖脂肪酸及び亜鉛のようなその他の活性剤を含有してもよい。好適な長鎖脂肪酸としては、α−リノール酸、γ−リノレン酸、リノール酸、エイコサペンタン酸、及びドコサヘキサン酸が挙げられる。魚油は、好適なエイコサペンタン酸及びドコサヘキサン酸の供給源である。

0073

ルリチシャ油、ブラックカレント種子油、及びマツイグサ油は、好適なγ−リノレン酸源である。ベニバナ油ヒマワリ油トウモロコシ油、及び大豆油は、好適なリノール酸源である。また、これらの油を、上で言及したコーティング基材で使用してもよい。亜鉛は、様々な好適な形態で、例えば、硫酸亜鉛又は酸化亜鉛として提供されてもよい。更に、コンパニオンアニマルフードにおいて一般に使用される多くの成分は、脂肪酸及び亜鉛の供給源である。プレバイオティク源としてのチコリーと、大豆油のようなリノール酸の豊富な油とを組み合わせると、相乗効果を示唆する予期せぬ利益がもたらされることが観察されている。

0074

組成物がグレービーの形態の場合、該組成物は、少なくとも10%のブロス又はストックを含むことが好ましく、その非限定例としては、野菜、ビーフ、チキン、又はハムのストックが挙げられる。典型的なグレービー組成物は、約0.5%〜約5%の粗タンパク質、約2%〜約5%の粗脂肪、及び約1%〜約5%の繊維を含んでよい。

0075

本明細書で使用するのに適したサプリメントの更なる非限定例としては、粉末、油懸濁液、乳ベース懸濁液、チーズ、カカオバターベース組成物、及び丸薬又はカプセルが挙げられる。組成物が丸薬の形態の場合、丸薬を固体圧縮形態に維持するために、好適な結合剤が必要である。好適な結合剤の非限定例としては、キサンタンガムペクチンレシチンアルギネート、及び当業者に既知のその他のもののような天然ガムが挙げられる。組成物がカプセルの形態の場合、該組成物は、当業者に既知の技術を使用してカプセル封入されることが好ましい。好適なカプセル封入材料の非限定例としては、ポリビニルアルコールPVA)、ポリビニルピロリドン(PVP)、アルギネート、及びゼラチンが挙げられる。ヨーグルトベース組成物は、約1%〜約5%のタンパク質、約10%〜約20%の炭水化物、約1%〜約5%の繊維、約1%〜約5%の脂肪及び約50%〜約90%のミルクのような液体担体を含んでよい。

0076

以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるものであり、いかなる方法でも本発明の範囲を制限することを意図するものではない。

0077

実施例1−ビフィズス菌ロンガムAH121Aの単離
ビフィズス菌ロンガム菌株AH121aは、ネコ科動物の腸組織から単離した。

0078

飼い主主導による承認済み安楽死のために地元の獣医のところにいる健康なネコから、ネコ科動物の腸試料を得た。全ての動物が健康で無病であった。各ネコの結腸、中間結腸、盲腸、及び回腸切開して粘膜露出させた。

0079

粘膜組織攪拌し(1分間ボルテックス処理)、組織を機械的に均質化した後、上清を除去した。各上清をde Mann Rogosa Sharpe(MRS)寒天培地に蒔いた。これらを、Anerocult GasPakシステムを用いて、37℃で48時間嫌気的にインキュベートした。平板からの単離したコロニーをMRS上に再びストリーキングし、再び同じ条件下で嫌気的に増殖させた。単離したコロニーを更に4回、再びストリーキングして、単一の菌株を精製した。コロニーの形態及び顕微鏡像を評価した。好適な単離物を、グラム反応及びカタラーゼ活性について試験した。API試験(API 5 OCHL、BioMerieux)を使用して、グラム陽性カタラーゼ陰性桿菌の同定を実施した。採集した細胞を0.05Mリン酸緩衝液(pH 6.5)及びシステイン−HCl(500mg/L)で2回洗浄した後、音波処理を実施した。遠心分離細胞破片を除去した。上清をNaF(6mg/mL)及びヨード酢酸Na(10mg/mL)で37℃で30分間インキュベートした。室温で10分間にわたって塩酸ヒドロキシルアミン(pH 6.5)でインキュベートすることによって、反応を停止させた。HCl(4M)、FeCl3.6H2O(0.1MのHCl中5%(W/V))及びフルクトース−6−ホスフェートNa塩)を添加した後、発色を監視した。フルクトース−6−ホスフェートからのアセチルリン酸の形成が、そのヒドロキシメートの第二鉄キレートによって形成される赤みを帯びた色によって証明された。

0080

種の同定
16s遺伝子間スペーサ(IGS)シークエンシングを行って、単離されたビフィズス菌の種を同定した。簡潔に、100μLの抽出液及び25μLの組織調製液(Sigma、XNAT2 Kit)を用いて、DNAをAH121Aから単離した。試料を室温で5分間インキュベートした後、95℃で2時間インキュベートし、次いで、100μLの中和溶液(XNAT2キット)を添加した。ナノドロップ分光分析装置を使用してゲノムDNA溶液を定量化し、4℃で保存した。PCRは、IGSプライマー、IGS L:5’−GCTGGATCACCCCTTTCT−3’(SEQID NO.3)を用いて行った結果、SEQ ID NO.1が同定され、IGS R:5’−CTGGTGCCAAGGCATCCA−3’(SEQ ID NO.4)ではSEQ ID NO.2が同定された。サイクル条件は、94℃で3分間(1サイクル)、94℃で30秒間、53℃で30秒間、72℃で30秒間(28サイクル)であった。PCR反応は、4μL(50ng)のDNA、PCRミックス(XNAT2キット)、0.4μMのIGS L及びRプライマー(MWG Biotech、ドイツ)を含有していた。PCR反応は、エッペンドルフ熱サイクラー(Eppendorf thermocycler)にて行われた。PCR産物(10μL)を、TAE中2%アガロースEtBr染色ゲル上で分子量マーカー(100bp Ladder、Roche)と並べて分析して、IGSプロファイルを決定した。ビフィズス菌のPCR製品(単一バンド)を、Promega Wizard PCR精製キットを使用して精製した。遺伝子間スペーサ−領域に関して、精製されたPCR製品をプライマー配列(上記)を使用して、配列した。次いで、ヌクレオチド相同性により、菌株の同一性を決定するために、配列データを、NCBIヌクレオチドデータベースに対して検索した。得られたDNA配列データを、NCBI標準ヌクレオチド−ヌクレオチド相同性BLAST検索エンジン(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)にかけた。この配列に最も近い配列を同定し、次いでDNASTAR MegAlignソフトウェアを用いてそれらの配列を整列させて比較した。得られた配列(SEQ ID NO.1[IGS正順]及びSEQ ID NO.2[IGS逆順])は配列一覧で見ることができる。NCIMBデータベースの検索は、AH121Aがビフィズス菌ロンガムに最も近い配列相同性を伴う特有のIGS(SEQ ID NO.1[正順]及びSEQ ID NO.2[逆順])配列を有することを明らかにした。

0081

実施例2−コンゴレッド寒天スクリーン
コンゴレッド寒天スクリーンを使用して、EPS発現菌株を表現型的スクリーニングした。つまり、10mLの変性Rogosaブロス培養基(+0.05%システイン)を、新しく増殖させた菌株のコロニーとともに無菌で植菌し、濁るまで37℃で嫌気的にインキュベートした(約16〜約24時間)。ブロス培養物をコンゴレッド寒天平板上に無菌でストリーキングし、37℃で48時間、嫌気的にインキュベートした。増殖の副生成物として生成されたEPS及び/又は特定の株の代謝が、コンゴレッド染料の摂取を防いだ結果としてクリーム白色コロニー形態をもたらすと考えられる。より少ないEPSを生成する株(Stains)は容易にコンゴレッド染料を摂取し、ピンク/赤色コロニー形態をもたらす。赤色EPSを生成しない株は赤色に染色し、赤色寒天を背景にほとんど透明に見える。

0082

図1を参照すると、ビフィズス菌ロンガムAH121Aのコロニー形態は凸状かつムコイド状明るい白色コロニーである。

0083

実施例3
様々な濃度のブタ胆汁に対するネコ科動物細菌の単離物AHF121Aの耐性を判定し、pH 2.5でのネコ科動物細菌の単離物AHF121Aの生存を6時間及び様々な濃度の胆汁を用いたそれに続く胆汁耐性を評価する。

0084

実験計画
試験株はAHF121Aビフィズス菌ロンガムである。胆汁耐性は、ブタの胆汁を補ったMRS/RCA寒天平板(0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、7.5、及び10%)を用いて検査する。pH 2.5での株の生存を、平板計数法を用いて−5、5、30、60、120、180、及び360分間隔で監視する。pH 2.5で6時間、株に課された後、胆汁耐性を検査する。

0085

方法:
ネコ科胆汁耐性の判定手順の概略を以下に記す。

0086

0.3%〜10%の範囲の様々な濃度のネコ科動物胆汁の存在下での、凍結乾燥された細菌の生存率を評価した。

0087

45%合成胆汁原液を作製し、この胆汁原液を80℃で10分間熱処理して栄養細胞を全て殺し、様々な濃度の合成ネコ科動物胆汁平板を調製した。

0088

2%(6.67mL胆汁原液+143.33の適切な寒天)、
1%(3.33mL胆汁原液+146.67mLの寒天)、
0.5%(1.67mL胆汁原液+148.33mLの寒天)の様々な胆汁濃度を使用した。

0089

各希釈に対して、オートクレーブ法の後、溶融した不要な寒天を取り除き、適切な体積の胆汁原液と置換した。

0090

胆汁平板は毎日新しくしたが、最長1週間は保存することができる。

0091

スプレッドプレート法によって、凍結乾燥された各試験株のCFU/gを定量化した。

0092

109CFU/mLの凍結乾燥した株を10mLの滅菌PBS中に再懸濁することによって試験株をブタ胆汁平板に染み付け、ブタ胆汁平板を4等分し、各平板に4株(10μL)を染み付けた。

0093

平板を作業台で30分間(又は染みが乾燥して寒天になるまで)乾燥させ、適切な条件下でインキュベートした。

0094

低pH環境(pH 2.5)で菌株の生存率を評価する手順の概略を以下に記す。

0095

凍結乾燥粉末の計数は、スプレッドプレート法を用いて行った。100mLのブロスに6M HClを添加してpH 2.5に調節することによって培養基を酸性にした。調整のために必要な体積を記録し、滅菌法を用い、同体積の酸を用いて、4×100mLMRSのブロス(残りのブロス)のpHを調節した。スプレッドプレート法によって、凍結乾燥された各試験株のCFU/gを定量化した。

0096

109CFU/mLの凍結乾燥した細菌を酸性培養基中に再懸濁し、適切な嫌気条件でインキュベートした。5、30、60.120、180、240、360分にアリコートを取り除き、スプレッドプレート法を用いてそのCFU/mLを決定することによって生存率を測定した。

0097

結果:



+++=非常に良好な増殖〜100%
++=良好な増殖〜66%

0098

結論
○ 表1は、ネコ科動物の胆汁が菌株の増殖に与える影響を示す。ネコ科動物の菌株は≦2%の濃度のネコ科動物胆汁に耐性があった。
図3は、pH 2.5での酸への耐性を示す。

0099

実施例4−121AがIL−10:IL−12比に与える影響
BDバキュテイナーCPT管(BDカタログ番号362761)を製造業者の指示にしたがって用い、健康なヒト末梢血から末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。PBMCを洗浄し、DulbeccoのModified Eagle Medium−Glutamax(商標)(Glutamax(グルタミン代用品)+ピルビン酸ブドウ糖4.5g/L(Gibcoカタログ番号10569−010)、10%のウシ胎児血清(Sigmaカタログ番号F4135)、及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Sigmaカタログ番号P0781)に再懸濁した。PBMCを平底96ウェルプレートでインキュベートし(各ウェルに2×105細胞)、20μLの細菌懸濁液(1×107CFU/mLの濃度)を添加した。PBMCをインキュベータ内で37℃/5% CO2にて細菌と48時間共インキュベートした。2日のインキュベーション期間の後、300×gでプレートを遠心分離し、上清を取り除き、−80℃で冷凍保存してから分析した。Meso Scale Discovery(メリーランド州Gaithersburg(カタログ番号K15008B−1))の96ウェルアッセイキットを用いて、培養上清におけるインターロイキン−10(IL−10)及びインターロイキン−12p70(IL−12p70)の濃度を定量化した。

0100

2つの形式共培養実験用に細菌を調製した。(a)DifcoMRS培養基で新しい増殖細菌を増殖し、固定相に入った直後に採集した。全ての細胞は嫌気性条件で37℃で増殖した。(b)Difco MRS培養基にて37℃で嫌気性条件下で細菌を増殖し、固定相に入った直後に採集した。これらの細菌のそれぞれの凍結乾燥粉末を生成し、予めアリコートした100mgバイアル瓶にて−80℃で保存した。使用の直前にそれぞれの菌株のアリコートを冷凍庫から1つ取り出し、室温に戻した。各菌株を10mLのリンガーで3回洗浄し、遠心分離した。その都度、新しいバイアル瓶を使用した。各増殖条件に対して増殖曲線(OD対生存細胞数)を作成し、洗浄した細胞を細胞数で正規化してからPBMCに添加した。全ての実験に、無細菌の対照も含めた。全てのアッセイを3回行った。

0101

図2は、菌株121AがIL−10:IL−12の誘導に与える影響を示す。新しく増殖した凍結乾燥培養物は両方とも同様の効果を呈した。

0102

実施例5−121AがIL−10の分泌に与える影響
宿主の総合的な健康の重要な決定因子における、微生物に対する適切な免疫応答。過剰な応答は炎症性疾患(例えば大腸炎)につながる可能性があり、一方、不十分な応答は病原体の持続及び播種につながる。本明細書に記載の免疫アッセイは、特定の微生物に対する応答としての宿主の免疫活性の決定のための有用な方法として本文献に十分に説明されている。

0103

ヒト末梢血単核細胞(PBMC(単細胞、樹枝状細胞、B細胞、及びT細胞を含む))は健康ドナーから入手し、各菌株を用いてインビトロで刺激した。次いで、培養物上清を取り除き、サイトカイン濃度を定量化した。

0104

IL−10は、異常な炎症性免疫応答を制御するための非常に重要なサイトカインである。IL−10ノックアウトアニマルでは大腸炎及び胃腸管腫瘍が発生し、一方、免疫系の調節性細胞はIL−10を分泌及び活用して、損傷を与える可能性のある免疫応答を制御する。したがって、このサイトカインの分泌の増強は、不適切な炎症活性及び病原体に対する過度の免疫応答に対する保護となるであろう。

0105

インビトロ培養した末梢血単核細胞(PBMC)からのIL10分泌は、各菌株での共インキュベーションの48時間後に判定した。それらの菌株はAHF121A及び35624で記録されたのと同様のIL−10レベルのIL10分泌を誘導した(図4〜6)。

0106

実施例6:Bif.AH121aは、ヒト免疫系細胞とインビトロで共インキュベートされたとき、Bif.AH35624と異なる免疫調節活性を有する。

0107

材料及び方法
PBMCサイトカイン誘導アッセイにより、ビフィズス菌ロンガムインファンティス菌株UCC35624(B624)及びビフィズス菌ロンガム菌株121aのアッセイを行った。細菌は、以下の形式で共培養実験用に調製した。DifcoMRS培養基にて37℃で嫌気性条件下で細菌を増殖し、固定相に入った直後に採集する。これらの細菌のそれぞれの凍結乾燥粉末を生成し、予めアリコートした100mgバイアル瓶にて−80℃で保存する。使用の直前に各菌株のアリコートを冷凍庫から1つ取り出し、室温に戻す。各菌株を10mLのリンガーで3回洗浄し、遠心分離する。その都度、新しいバイアル瓶を使用する。

0108

Petroff−Hausser計数チャンバを製造業者の指示に従って用いて直接顕微鏡計数を行い、洗浄した細胞を細胞数によって正規化してからPBMCアッセイに加えた。PBMCの各ウェルに細菌(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に20μL)を加えて、各実験に示されている細菌合計数にする。

0109

PBMC(末梢血単核細胞)サイトカイン誘導アッセイ
BDバキュテイナーCPT管(BDカタログ番号362761)を製造業者の指示に従って用い、健康なヒト末梢血から末梢血単核細胞(PBMC)を単離する。PBMCを洗浄し、DulbeccoのModified Eagle Medium−Glutamax(商標)(Glutamax(グルタミン代用品)+ピルビン酸+ブドウ糖4.5g/L(Gibcoカタログ番号10569−010)、10%のウシ胎児血清(Sigmaカタログ番号F4135)、及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Sigmaカタログ番号P0781)に再懸濁する。PBMCを平底96ウェルプレートでインキュベートし(各ウェルに2×105細胞)、20μLの細菌懸濁液(1×106〜8CFU/mLの濃度範囲)を添加する。最高6つの異なる量の細菌(2.5E+08、1.0E+08、5.0E+07、2.5E+07、1.0E+07、及び1.0E+06)を検査する。無細菌の対照も検査する。全てのアッセイを3回行う。2日のインキュベーション期間の後、300×gでプレートを回転させ、上清を取り除き、−80℃で冷凍保存してから分析する。PBMCをインキュベータ内で37℃/5% CO2にて細菌と48時間共インキュベートする。Meso Scale Discovery(メリーランド州Gaithersburg、カタログ番号K15008B−1)の96ウェルアッセイキットを用いて、培養上清のサイトカインのアッセイを行う。ヒトインターロイキン1β(Il−1β)、ヒトインターロイキン6(Il−β)、ヒトインターロイキン8(Il−8)、ヒトインターロイキン10(Il−10)、ヒトインターロイキン12p70(Il12p70)、ヒトインターロイキンガンマ(IFN−γ)、ヒト腫瘍壊死因子α(TNFα)、及びヒトG−CSFを定量化し、ミリリットル当たりのピコグラム(pg/mL)として報告する。各試料のアッセイを3回〜5回行う(A to E)。

0110

結果
ビフィズス菌ロンガムインファンティス菌株UCC35624(B624)及びビフィズス菌ロンガム菌株121aは、免疫調節のためにPBMCサイトカイン誘導アッセイを用いてアッセイされて、検査された最高6つの異なる量の細菌(2.5E+08、1.0E+08、5.0E+07、2.5E+0、1.0E+07、1.0E+06)での拡張用量応答曲線を生成する。IL−1β、IL−6、IL−8、IL−10、IL−12、TNF−α、IFN−γ、及びG−CSFを含むサイトカインの範囲に関して、上清をアッセイする。最高5人のドナー(A〜E)からのサイトカインの測定値を平均(+/−SEM)として表す。

0111

35624と比較し、菌株121aはIL−10を含むほとんどのサイトカインの誘導に対して非常に類似したパターンを呈したが、IL−6及びIL−8の生成は増加し、かなり異なるパターンを呈した。

0112

IL−10:121aでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のPBMCにおける抗炎症性サイトカインIL−10の用量応答性の増加を誘導する(図7)。IL−10の誘導は、定性的にも定量的にも35624でのインキュベーションと類似している。IL−10の最大誘導は、ウェル当たり最高1.0×109の細菌には満たないようである。

0113

IL−1β:121aでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のPBMCにおける炎症性サイトカインIL−1βの用量応答性の増加を誘導する(図8)。IL−1βの誘導は、定性的にも定量的にも35624でのインキュベーションと類似している。IL−1βの最大誘導は、ウェル当たり最高1.0×109の細菌には満たないようである。

0114

IL−6:121aでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のPBMCにおけるサイトカインIL−6の用量応答性の増加を誘導する(図9)。定量的には、35624と比較して121aではパターンが異なり、121aではより高レベルのIL−6が測定され、ウェル当たりの細菌用量が低いほどそうであった。

0115

IL−8:121aでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のPBMCにおけるサイトカインIL−8の用量応答性の増加を誘導する(図10)。定量的には、35624と比較して121aではパターンが異なり、ウェル当たりの全ての細菌用量で121aではより高レベルのIL−8が測定された。

0116

IL−12:121aでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のPBMCにおける炎症性サイトカインIL−12の用量応答性の増加を誘導する(図11)。121a及び35624でのIL−12の調節のパターンは釣型であり、ピークレベルに上昇してから、細菌濃度が高くなるにつれて下降する。定量的には、そのパターンはIL−12ではやや可変であるが、どちらかといえば、35624と比較して121aでも類似している。

0117

TNF−α:121aでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のPBMCにおける炎症性サイトカインTNF−αの用量応答性の増加を誘導する(図12)。TNF−αの誘導は、5回のうち3回は定性的に定量的にも35624でのインキュベーションと類似であり、2回はより高いレベルのTNF−αが見られた(C & Eを参照)。IL−10の最大誘導は、ウェル当たり最高1.0×108の細菌になるようである。

0118

INF−γ:121aでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のPBMCにおける炎症性サイトカインINF−γの用量応答性の増加を誘導する(図13)。定量的には、そのパターンはINF−γではやや可変であるが、どちらかといえば、35624と比較して121aと類似している。

0119

G−CSF:121aでのインキュベーションは、インビトロ刺激後のPBMCにおけるサイトカインG−CSFの用量応答性の増加を誘導する(図14)。G−CSFの誘導は、定性的にも定量的にも35624でのインキュベーションと類似している。

0120

実施例7−121Aが樹枝状細胞によるサイトカイン生成に与える影響
概要
免疫応答は非常によく調節されたプロセスであり、通常、感染からの保護及び無害な環境抗原の寛容をもたらす。しかし、炎症性疾患では、活性化された免疫応答は、元来の免疫応答の活性化及び有極T細胞サブセットの拡張を特徴とする慢性的炎症性状態をもたらす。炎症性疾患の現在の治療は、主要な炎症メディエータ又は炎症細胞集団の抑制に焦点を当てている。しかし、これらのアプローチ疾患症状の一時的な抑制しか与えない。長期的治療又は予防の成功は、害を与える炎症性応答から守る細胞調節プロセス強化によってのみ可能である。ビフィズス菌AHF121Aは、元来の免疫系(すなわち樹枝状細胞)からのIL−10の分泌を選択的に刺激するプロバイオティク微生物であり、インビトロでFoxp−3陽性調節性T細胞極性化を誘導する。生体内では、IL−10分泌及び調節性T細胞は異常な炎症性応答の強力な抑制剤である。

0121

Treg細胞
免疫寛容の維持における調節性T(Treg)細胞の基本的役割は広範な動物モデルで実証されており、アレルゲン自己抗原、又は同種抗原に対する免疫寛容を回復することによって、アレルギー、喘息性肺炎、自己免疫疾患、及び同種移植片拒絶を含む、T細胞メディエーションによるいくつかの疾患を予防又は治癒するTreg細胞の養子免疫伝達又は意図的な拡張が示された[8]。Tregメディエーションによる免疫抑制のための複数の分子機構では、IL−10の分泌が特に重要であると説明されてきた[9]。Treg細胞の欠如又は機能不良は、ヒトにおけるIgE過多症候群過好酸球増加症、及び自己免疫とも相関されており、一方、それらの存在は免疫寛容と関連づけられている[10]。非病原性の環境抗原に対する免疫応答がアレルギー又は非有害性免疫のいずれかにつながる機構に関する研究は、アレルゲン特有のIL−10生成Tregs(TR1細胞)が健康な個体における支配的なT細胞サブセットであることを実証している[11,12]。アレルギー性でない健康な養蜂家を養蜂シーズン中に蜂毒抗原に繰り返し曝露させることは、毒抗原に対する免疫寛容の機構を確認するために有用な代表的なインビボモデルである[13]。蜂に複数回刺された後、毒抗原特有のTH1及びTH2細胞はIL−10−分泌性TR1細胞に切り替わる。これと並行して、アレルゲンに対する皮膚の後期応答の抑制並びにアレルゲン特有のTH1及びTH2細胞の阻害が生じる。この応答は、毒への曝露が続く限り観察され、養蜂シーズンの終わりから2〜3ヶ月内に初期レベルに戻る。

0122

生体内のTreg機能を強化するように設計された様々な戦略が現在研究されている。これらには、誘導性又は構造性のTreg細胞の養子免疫伝達、及び特定のアジュバント又は免疫調節剤によるそれらの誘導が含まれる。Treg細胞の抗原特有の抑制能力全身性免疫抑制をもたらさず、生体内で長期持続する抗原特有の調節を実際にもたらす可能性があるので、従来の治療に比べ、これらのアプローチは魅力的である。更に、制限された副作用で個々の患者特有の治療が可能である。開発済み又は開発中の多くの免疫調節剤(例えばラパマイシン、CD80/CD86:CD28共刺激遮断剤アバタセプト(Orencia(Bristol−myers Squibb))、非細胞分裂性抗CD3モノクローナル抗体、T細胞欠乏及び抗腫瘍壊死因子−α(TNF−α)mAbs)は、Treg細胞に対して、機能を強化又は抑制し得る直接又は間接の影響を示す[14〜18]。マウスモデルにおける炎症器官において発現したアレルゲン又は自己抗原の認識によってその器官(又はその器官の流入領域リンパ節)を標的とすることができるTreg細胞集団を拡張することには、選択的利点がある[19]。したがって、器官特有のTreg細胞の伝達は、進行中疾患の抑制に有効である可能性があるが、それらのTreg細胞は必ずしも全く同一の自己抗原を自己攻撃性エフェクターT細胞として認識する必要はない[20]。これは、アレルゲン、自己抗原、又は移植物抗原に対する免疫寛容のTreg細胞アームを標的とすることを目的とする治療戦略としての意味を有する。Treg細胞又はTreg細胞を組織内に誘導する小分子化合物の養子免疫伝達の可能性は研究されているが[19]、これまでのところ、二重盲検プラセボ対照治験は報告されていない。これまでのところ、ヒトにおけるTreg細胞生成及び活性化を誘導する抗原特有のアプローチはアレルゲン−SITだけである。アレルゲン−SITはTreg細胞及びIL−10分泌性TR1様細胞を誘導し、グルココルチコイド及びβ2アドレナリンアゴニストでの治療はこれらの細胞の数及び活性を促進するようである[21〜23]。Foxp3プロモータの発現を調節する必須転写要素が最近報告されており、これらは、新規治療の開発のための新しい標的を提供するであろう[24、25]。

0123

新規治療選択肢としての微生物
異常な炎症活性の治療のための、微生物及び微生物代謝物の意図的な投与への関心が高まっている。現在検討されている典型的な微生物としては、ビフィズス菌、乳酸菌、非病原性大腸菌、及びバクテロイデス菌株が挙げられる[26〜31]。これらの微生物に伴う保護効果は、おそらく、上皮細胞、樹枝状細胞、及びT細胞が関わる複数の機構を媒介としてもたらされるものである。しかし、これらの微生物に共通の特徴であるTreg細胞誘導能力がますます報告されている。例えば、ネズミ科動物の胃腸内の片利共生微生物の混合物(VSL#3プロバイオティクカクテル)との遭遇は、ネズミ科動物モデルの大腸炎における炎症の減衰と関連づけられる粘膜Treg細胞の発育推進することが示されている[32]。加えて、ビフィズス菌インファンティス菌株の摂取は、Treg細胞の転換を促進し、生体内におけるLPS誘導型NF−κB活性から保護し、一方、ラクトバシラスロイテリは、マウスにおけるアレルギー性気道応答から保護するTreg細胞を誘導する[33、34]。Treg細胞は胸腺由来であるが、周辺器官(胃腸粘膜を含む)においても誘導され得る[35、36]。TGF−β及びレチノイン酸依存性プロセスを介するTreg細胞の転換は、主にこの粘膜内のCD103+樹枝状細胞による[37、38]。この転換は、多数の片利共生微生物の存在と関連づけられる胃腸管特有の環境因子によって推進される可能性が高い。しかし、生体内のTreg細胞の誘導において全ての片利共生微生物が同等に効果的である可能性は低い。最近の研究は、複数の片利共生微生物(ビフィズス菌ロンガムAH1206、ビフィズス菌ブレーAH1205、及びラクトバチラスサリバリウスAH102)を比較すると、ネズミ科動物モデルにおいてビフィズス菌ロンガムAH1206がTreg細胞を誘導したこと、及びへの好酸球補充から保護し、血清IgEの誘導を遮断することが可能であったことを示した[39]。その他の菌株はTreg細胞を効果的に誘導せず、同じモデルにおいてアレルギー性炎症から保護することができなかった。したがって、Treg細胞の誘導は、潜在アレルゲンに対する異常な免疫応答性の発症に対する保護という、健康な微生物相の重要な特性であり得る。アレルギーの治療のための生きた微生物の使用に加えて、期待される別の方法は、その有益な効果に関与する微生物因子を特定し、それらの単離された因子を単独で使用することである。例えば、バクテロイデスフラジリス由来の多糖類Aは、粘膜樹枝状細胞による提示の後に無菌マウスにおける適切なTH1/TH2バランスを促進し、IL−10分泌性CD4+ T細胞を介して動物モデルにおいて大腸炎から保護する[29,40]。寛容原生樹枝状細胞及びTreg活性を誘導する新しい微生物化合物の継続的な同定は、臨床試験における評価のための新規な治療用分子を疑いなくもたらすであろう。

0124

樹枝状細胞の差別化及び熟成
Ficoll密度遠心分離及び細胞分離の組み合わせを用い、CD14−特有抗体でコーティングした磁性マイクロビード(MiltentyiBiotec)を使用して、ヒト単球を血液から単離した。単離されたCD14+細胞分画純度は、全ての実験で90%を超えていた。未熟のDC(iDC)を生成するために、精製したCD14+細胞を5日間、IL−4(R&D systems)及びGM−CFS(R&D systems)の存在下で培養して、骨髄樹枝状細胞に差別化した。6日目に、細胞を刺激しないまま残す(iDC)か、LPS(1mg/mL)5×105で細胞を刺激した。MDDC細菌細胞で24時間刺激した。ビフィズス菌ロンガムAHF121A菌株(10:1の細菌対DC比(5×106)、1:1の細菌対DC比(5×105)で24時間。予測したとおり、抗生物質の適用の結果として、この期間中に細菌増殖は観察されなかった。この時点で上清を単離し、Luminexマルチプレックスプラットホームを用いてIL−10及びIL−12p70のレベルを分析した。

0125

ヒトCD4+ T細胞の単離及びDCとの共培養
Lymphoprepグラジエントバフィーコートの遠心分離によりPBMCを単離した。CD4+ T細胞は陰性選択アフィニティカラム(R&D Systems)を製造業者の指示どおりに用いて分離した。分離後、T細胞を洗浄し、加熱不活性化したウシ胎児血清10%、100IU/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、及び2mmol/LのLグルタミンを補ったRPMI1640培養基に再懸濁した。精製したCD4+ T細胞(1×106/mL)を、固定化した抗CD3(1μg/mL)と可溶性抗CD28(5μg/mL)mAbs(Pharmingen)との組み合わせで刺激した。次いで、精製したCD4+ T細胞をDCでインキュベートした。48時間後、CD4+ T細胞は透過性になり、CD25及びFoxp−3に対して染色された。フローサイトメトリを使用して細胞を評価した。

0126

結果は、AHF121Aで刺激した樹枝状細胞が、CD25及びFoxp−3を発現する調節性T細胞サブセットの極性化及び/又は拡張を推進することを示している。

0127

プロバイオティクは、DCによるサイトカイン生成を誘導するのに異なる能力を有する。

0128

放出されるサイトカインのタイプは、T細胞の極性化に影響する可能性がある。したがって、我々は上述のように細菌で24時間処置した後のMoDCによるIL−12p70及びIL−10の生成を分析した。LPSは試験した全てのサイトカインの強力な誘導剤であり、AHF121Aは異なるサイトカイン放出を引き出した(図15)。AHF121AはLPSと比べて低いレベルのIL−10を誘導したが、検出可能なレベルのIL−12p70は誘導しなかった。このように、AHF121Aは、より低い炎症可能性を示していた。

0129

サイトカインの生成における差は、異なるT細胞極性化能力を反映している。

0130

DCによるサイトカインの放出は、Th1、Th2、Th17、又は調節性T細胞に向けたT調節性細胞の極性化を推進することが重要である。サイトカインの生成において観察された差を鑑み、我々は、AHF121Aにより生成されたMDDCがFoxp3+ Tregを誘導する可能性を有するかどうかを更に試験した。DCは、5日間AHF121Aでインキュベートし、次いで、高度に精製された同種異系感作細胞で共培養した。CD4+ T細胞次いで、CD4+Foxp3+ Treg集団をFACSにより分析した。結果は、AHF121Aで刺激した樹枝状細胞が、CD25及びFoxp−3を発現する調節性T細胞サブセットの極性化及び/又は拡張を推進することを示している。(図16

0131

我々は、それを受けて、AHF121Aが生成した寛容原性DCがCD4+Foxp3+ Tregの生成を誘導したと想定する。事実、我々は、AHF121Aで培養されたMDDCがCD4+CD25− T細胞をCD4+CD25−Foxp3+ T細胞に転換し得ることを実証した。要約すると、AHF121Aは、インビトロにおけるMDDCによるTregの生成を上方調節又は増強することによって、強力な免疫調節効果を及ぼした。結果は、インビトロにおけるAHF121Aへの応答としてのCD4+CD25−Foxp3+ Tregの生成の証拠、すなわち生体内での炎症性免疫疾患の調節のための治療的に有用であり得る効果を提示している。(図16

0132

これまでに、いくつかのプロバイオティク(すなわちL.casei及びreuteri)が調節性T細胞の発育を誘導できることが示されている(32、41、42)。3つの異なる動物モデルにおいてビフィズス菌AH1206が調節性T細胞の強力な活性化を媒介することが示された。加えて、ビフィズス菌AH1206の摂取は、肺への好酸球補充から保護し、血清IgEの誘導を遮断した。ここで、調節性T細胞はアレルゲン特有の炎症性応答の調節において重要な役割を果たしていると仮定される(39)。動物モデルにおける複数の研究は、CD4 CD25 Foxp3細胞が肺及び流入領域リンパ節の両方に補充され、アレルゲン誘導性気道好酸球、粘液分泌過多及び気道反応過多を抑制し得ることを示している(43〜48)。

0133

多くのヒト及び動物での研究は、現在、共生細菌に対する寛容の損失によってIBDがもたらされることを示している。Round及びMazmanianの研究(49)は、実験的大腸炎での保護及び治療中にPSAがTregの発育を指示することを示している。これらの結果は、Foxp3+ T細胞によって誘導可能なIL−10生成が、粘膜表面で寛容を媒介し、腸炎を予防するために重要であることを示す研究と一致している(49、50)。

0134

実施例8−組成物の例
以下は、本発明のプロバイオティクビフィズス菌を含む乾燥キブル組成物の例である。

0135

以下は、本発明のプロバイオティクビフィズス菌ロンガムを含む湿潤コンパニオンアニマルフード組成物の例である。

0136

以下は、本発明のプロバイオティクビフィズス菌ロンガムを含むヨーグルトサプリメント組成物の例である。

0137

本発明の特定の実施形態が例示され、記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には明白であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのような全ての変更及び修正を、添付の「特許請求の範囲」で扱うものとする。

実施例

0138

参考文献
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