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技術 抗原負荷した樹状細胞ワクチンを前駆体から発生させる迅速ワンステップ法

出願人 ベイラーリサーチインスティテュート
発明者 バンシェロー,ジャック,エフパルッカ,アンナ,ケイ
出願日 2013年6月19日 (7年4ヶ月経過) 出願番号 2013-128381
公開日 2013年10月31日 (7年0ヶ月経過) 公開番号 2013-224313
状態 特許登録済
技術分野 微生物、その培養処理 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード LC成分 遅延応答 同時接触 小フラスコ 分間放射 液前駆体 液ユニット FRC
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2013年10月31日)のものです。
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図面 (19)

課題

単球からexvivoで抗原負荷した抗原提示細胞を産生させるワンステップ法の提供。

解決手段

第1時点でTNFαおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに次に第2時点で可溶性または粒子状抗原性物質を抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって、exvivoで単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させる。抗原提示細胞は、表面マーカー(CD1a+CD207+)を有するランゲルハンス細胞、表面マーカー(CD1a+CD207−)を有する間質樹状細胞、表面マーカー(CD1a−CD14−)を有するダブルネガティブ樹状細胞、および表面マーカー(CD14+CD1a−CD209+)を有する樹状細胞からなる群から選択される2つ以上のサブセットから構成される。

概要

背景

本出願は、2002年12月4日に出願した米国特許仮出願第60/430791号の利権を主張する。

癌免疫療法という概念は、ヒト癌抗原分子が同定されたことにより過去10年間に勢いづいた。これらの治療上の取り組みは、細胞上で癌抗原をT細胞に提示することができる樹状細胞(DC)を多数発生させるin vitro培養法を突き止めることによってさらに容易になった。動物を用いた無数の研究から、DC上に送達された腫瘍抗原を免疫することが防御性抗腫瘍応答誘導することが実証された。先駆的な臨床治験血液由来DCまたは単球由来DCを使用し、いくらかの臨床応答と、さらに最近では免疫応答も示した。(Bellら、1999「Dendriticcells」、Adv Immunol 72:255頁;Boczkowskiら、1996「Dendritic cellspulsed with RNA are potentantigen−presenting cells in vitro and in vivo」、J Exp Med 184:465〜472頁;Celluzziら、1996「Peptide−pulsed dendritic cells induceantigen−specific CTL−mediatedprotective tumor immunity」、J Exp Med 183:283〜287頁;Flamandら、1994「Murinedendritic cells pulsed in vitro with tumor antigeninduce tumor resistance in vivo」、Eur J Immunol 24:605〜610頁;Gilboaら、1998「Immunotherapyof cancer with dendritic−cell−based vaccines」、Cancer Immunol Immunother 46:82頁;Gilboa、E.1999「The makings of a tumor rejection antigen」、Immunity11:263〜270頁;Hsuら、1996「Vaccination of patients withB−cell lymphoma using autologous antigen−pulsed dendritic cells」、Nat Med 2:52頁;Mayordomoら、1995「Bonemarrow−derived dendriticcells pulsed with synthetic tumourpeptides elicit protective and therapeuticantitumour immunity」、NatMed 1:1297〜1302頁;Mayordomoら、1997「Bonemarrow−derived dendriticcells serve as potent adjuvantsfor peptide−basedantitumor vaccines」、StemCells 15:94〜103頁;Mukherjiら、1995「Inductionof antigen−specificcytolytic T cells in situ in human melanomaby immunizationwith synthetic peptide−pulsed autologous antigen presenting cells」、Proc Natl Acad Sci USA92:8078頁;Nestleら、1998「Vaccination of melanoma patientswith peptide− or tumor lysate−pulseddendritic cells」、Nat Med 4:328頁;Porgador、A.およびGilboa、E.1995「Bonemarrow−generated dendriticcells pulsed with a class I−restricted peptide are potent inducersof cytotoxic T lymphocytes」、J Exp Med 182:255〜260頁;Songら、1997「Dendriticcells geneticallymodified with an adenovirus vector encoding thecDNAfor a model antigeninduce protective and therapeutic antitumor immunity」、J Exp Med 186:1247〜1256頁;Song、J.A.1998「Tumorimmunology:the glassis half full」、Immunity 9:757〜763頁;Spechtら、1997「Dendriticcells retrovirallytransduced with a model antigengene are therapeutically effective against established pulmonary metastases」、J Exp Med 186:1213〜1221頁;Tjoaら、1998「Evaluationof phase I/II clinical trialsin prostate cancer with dendriticcells and PSMA peptides」、Prostate 36:39〜44頁;Toesら、1996「Protective antitumor immunity induced byimmunization withcompletely allogeneic tumor cells」、Cancer Res 56:3782〜3787頁;Zitvogelら、1996「Therapyof murine tumors with tumorpeptide−pulsed dendriticcells:dependence onT cells,B7 costimulation,and T helper cell 1−associatedcytokines」、J ExpMed 183:87〜97頁;Schuler−Thurnerら、2000「Mage−3and influenza−matrixpeptide−specific cytotoxicT cells are inducible interminal stageHLA−A2.1+ melanoma patientsby mature monocyte−derived dendritic cells」、J Immunol 165:3492〜3496頁;Mackensenら、2000「PhaseI study in melanoma patientsof a vaccine with peptide−pulseddendritic cells generated in vitro from CD34(+)hematopoietic progenitor cells」、Int J Cancer 86:385〜392頁;Geigerら、2001「Vaccinationof pediatric solid tumor patientswith tumor lysate−pulsed dendritic cells can expandspecific T cells and mediatetumor regression」、CancerRes 61:8513〜8519頁;Heiserら、2002「Autologousdendritic cells transfected with prostate−specific antigen RNA stimulate CTLresponses against metastatic prostate tumors」、JClin Invest 109:409〜417頁;Lodgeら、2000「Dendritic cell−basedimmunotherapy ofprostate cancer:immunemonitoring of a phase IIclinical trial」、CancerRes 60:829〜833頁;Fongら、2001「Dendriticcells injected via different routesinduce immunity in cancer patients」、Jlmmunol 166:4254〜4259頁;およびBanchereauら、2002「Dendriticcells as vectors for therapy」、Cell106:271〜274)。これらの結果は有望であるものの、とりわけDCの種類を含めたDCワクチン接種のいくつかのパラメーター確立する必要がある。

現在、長期培養造血前駆細胞から、または血液前駆体すなわち単球からDCを作製している。(Cauxら、1992「GMCSFand TNF−alpha cooperate in the generation of dendritic Langerhans cells」、Nature 360:258〜261頁;Romaniら、1994「Proliferating dendriticcell progenitorsin human blood」、J Exp Med180:83〜93頁;Sallusto、F.およびLanzavecchia、A.1994「Efficientpresentation ofsoluble antigen by cultured humandendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony−stimulating factor plus interleukin 4 and downregulatedby tumor necrosis factor alpha」、JExp Med 179:1109〜1118頁;Reidら、1992「Interaction oftumor necrosis factor with granulocyte−macrophagecolony−stimulating factor andothercytokines in the regulation of dendritic cellgrowth in vitro form bipotentCD34+ progenitorsin human bone marrow」、J lmmunol149:2681〜2688頁;Arrighiら、1999「Long−term culture of human CD34(+)progenitors withFLT3−ligand,thrombopoietin,and stem cell factor inducesextensive amplificationof a CD34(−)CD14(−)and a CD34(−)CD14(+)dendritic cell precursor」、Blood 93:2244〜2252頁;Cauxら、1990「Tumornecrosis factor α strongly potentiatesinterleukin−3 andgranulocyte−macrophage colony−stimulating factor−inducedproliferation ofhuman CD34+ hematopoietic progenitor cells」、Blood 75:2292〜2298頁;Changら、2000「Monocyte−derivedCD1a+ and CD1a− dendritic cellsubsets differ in their cytokineproduction profiles,susceptibilitiesto transfection,andcapacities to direct Th cell differentiation」、Immunology 165:3584〜3591頁;およびWeissmanら、2000「HIVgagmRNAtransfection of dendritic cells(DC)delivers encoded antigen toMHCclass I and IImolecules,causes DCmaturation,and inducesa potent human in vitro primary immune response」、Immunology165:4710〜4717頁)。

CD34+造血前駆細胞(HPC)をGM−CSFおよびTNFと共に(GM−CSF/TNF)培養すると、2つの異なるDCサブセットであるランゲルハンス細胞(LC)および間質DC(intDC)から構成されるDC調製物が得られる。これは、単球をGM−CSFおよびIL−4と共に(GM−CSF/IL−4)培養することにより発生する、intDCに類似した未熟DCの均一集団を含んだDCとは対照的である。GM−CSF/IL−4により誘導されたDCは追加の成熟因子を必要とするが、DC活性化因子であるTNFαの存在下で発生するCD34−DCは必要としない。米国特許第6004807号は、10%(v/v)熱不活性化ウシ胎仔血清を補充した組織培養培地を用いてCD34造血前駆細胞から樹状細胞を発生させることについて教示している。

別個生物学的機能を有する2つのDCサブセットがさい帯血CD34+HPCの培養物から出現する:さい帯血CD34+HPCを用いて初期の研究が実施され、GM−CSF/TNFまたはIL−3/TNFと共に培養した場合それらの細胞の分化はDCに向いた。これらの培養条件では、TNF−αとGM−CSF/IL−3との間の協同がCD34+HPCからのDCの発生に重大である。実際、初期の研究はTNFが造血阻害物質であることを示唆したが、最近になるとTNFはIL−3またはGM−CSFの一方に誘導されるCD34+HPCの増殖の刺激物質であることが観察された。限界希釈分析は、TNFがIL−3応答細胞数とIL−3依存性クローンの平均サイズとの両方を増加させることを示した。液体培養を12日間行った後で、GM−CSFおよびTNFと共に培養したCD34+HPCは樹状形態を有する接着細胞非接着細胞との両方を生じる。DCを最適に発生させるためには、GM−CSF/IL−3/IL−5受容体の共通鎖サブユニット発現アップレギュレーションされる培養開始後の数日にTNFが主に必要である。CD34+HPCの培養におけるTNFの別の重要な作用部位は、顆粒球を生成する分化および増殖の阻害である。具体的には、TNFは分化の方向付けがされていないCD13−CD15−芽細胞のレベルで顆粒球への分化を可逆的に遮断し、芽細胞がTNF強化培養物中に蓄積する。さらに、分化の方向付けが終わった顆粒球前駆細胞(CD15+)の成長は、G0/G1に細胞周期が停止することで阻害される(Cauxら、1991「Potentiationof early hematopoiesis by tumor necrosis factor−alphais followed by inhibition of granulopoietic differentiation and proliferation」、Blood 78:635〜644頁;Jacobsenら、1992「Tumornecrosis factor alpha directly andindirectly regulates hematopoietic progenitor cell proliferation:role of colony−stimulating factor receptor modulation」、JExp Med 175:1759〜1772頁)。TNFはこれらの培養における赤血球生成も遮断する。成長中のCD34+HPCに及ぼすTNFのこれらの作用は、p55TNF受容体に仲介される(Rustenら、1994「Bifunctionaleffects of tumor necrosis factoralpha(TNF alpha)on the growth ofmature and primitive human hematopoieticprogenitor cells:involvementof p55 and p75 TNFreceptors」、Blood83:3152〜3159頁)。

上記のように、これらの培養条件で前駆体の2つの亜細胞集団であるCD1a+およびCD14+が出現し、これらの亜集団はそれぞれLCおよびintDCに分化できる(Cauxら、1996「CD34+hematopoietic progenitorsfrom human cord blood differentiatealong two independent dendritic cells pathways inresponse toGM−CSF+TNF alpha」、J ExpMed 184:695〜706頁;Cauxら、1997「CD34+hematopoietic progenitorsfrom human cord blood differentiatealong two independent dendritic cell pathways inresponse to granulocyte−macrophage colony−stimulatingfactor plus tumor necrosis factoralpha:II.Functional analysis」、Blood 90:1458〜1470頁)。両前駆体サブセットは第12〜14日に典型的な形態、表現型(CD80、CD83、CD86、CD58、高HLAクラスII)および機能を有するDCに分化する。CDla+前駆体はランゲルハンス細胞の特徴を有する細胞を生じる(バーベック顆粒、Lag抗原およびE−カドヘリン)。対照的に、CD14+前駆体は、バーベック顆粒、E−カドヘリンおよびLag抗原を欠くが、CD2、CD9、CD68および凝固因子XIIIaを発現するCD1a+DCに成熟することが皮膚樹状細胞では記載されている。興味深いことに、CD1a+前駆体ではなくCD14+前駆体は、M−CSFに応答して誘導されT細胞のための補助機能を欠くマクロファージ様細胞に分化できる両能細胞を表す。これらのDCサブセットは以下の点で異なる:(1)抗原捕捉(intDCはLCよりもデキストランの取り込みおよび免疫複合体との結合に有効である)、(2)リソソーム活性(intDCの方が高レベル酵素活性を発現する)、(3)ナイーブB細胞分化誘導能(intDCはIL−12の分泌を介してナイーブB細胞のプライミングおよびそれらのIgM分泌形質細胞への分化を独自に誘導できる)(Duboisら、1997「Dendriticcells enhance growth and differentiationof CD40−activatedB lymphocytes」、JExp Med 185:941〜951頁;Duboisら、1998「Critical roleof IL−12 in dendritic cell−induceddifferentiation ofnaive B lymphocytes」、J lmmunol 161:2223〜2231頁)、および(4)両サブセットはCD40が連結した際にIL−12を発現するがintDCだけがIL−10を発現する。LCの独特な機能を今後確立すべきであるが、LC成分を有するCD34−DCの方が単球由来DCよりもCD8T細胞のプライミングに有効であることを示唆する報告がいくつかある(Mortariniら、1997「Autologousdendritic cells derived from CD34+progenitors andfrom monocytes are not functionallyequivalent antigen−presentingcells in the induction ofmelan−A/Mart−1(27−35)−specific CTLs from peripheralblood lymphocytesof melanoma patients with lowfrequency of CTL precursors」、Cancer Res 57:5534〜5541頁;およびFerlazzoら、2000「Dendriticcells generated from CD34+ progenitorcells with flt3 ligand,c−kit ligand,GM−CSF,IL−4,and TNF−alpha are functional antigen−presenting cells resembling mature monocyte−deriveddendritic cells」、J Immunother23:48〜58頁)。 GM−CSFおよびIL−15の存在下で単球を培養することによる誘導したランゲルハンス細胞の表現型を有するDCが、GM−CSF/IL−4DCよりもin vitroのCTL応答の誘導に有効であると実証した我々自身の研究において、これらの観察を確認している(Mohamadzadehら、2001「Interleukin15 skews monocyte differentiation into dendritic cellswith features of Langerhans cells」、J Exp Med194:1013〜20頁)。このように、腫瘍特異的CTLを誘導するような状況では、CD34−DCまたはランゲルハンス細胞を含む他の任意のDC調製物が有利である可能性がある。

G−CSFにより動員した血液CD34+HPCも2つのDCサブセットをもたらす:G−CSFにより動員され進行メラノーマ患者から単離された末梢血は、さい帯血で認識された分化経路にしたがい、培養第9日で2つの細胞集団、すなわちCD1a+CD14−LCおよびCD1a−CD14+intDCを確認できる。しかし、これらの培養物中の細胞の約50%が前駆細胞/前駆体段階に留まり、さらなる培養でDCを生じることができる。このように、これらの培養物は非同調性であり、このことはこれらのDC調製物をワクチンとして使用する場合に考慮する必要のあるパラメーターである。両サブセットはCD83lowCD86+HLA−DR+、MHCクラスI+であり(intDCの方がわずかに高レベルのクラスIを発現する)、LCの方が高レベルのCD11cおよびCD80を発現する。Lagの発現およびバーベック顆粒に対応する細胞質構造はどちらも主にLCにみられるが、それらを示す共焦点顕微鏡像から、それらがランゲルハンス細胞の表現型であることを確認した。第9日の培養物から選別したLCおよびintDCは、1)形態(ギムザ染色で顕著な樹枝状突起を有する明瞭な核および細胞質構造を示す)、2)抗原の捕捉(intDCの方がLCよりもかなり多くのFITC−デキストランを捕捉する)、および3)T細胞応答の誘導(CD1a+CD14−細胞およびCD1a−CD14+細胞の両方が同種T細胞の増殖を誘導できるが、選別されたCD1a+細胞の方がCD14+細胞よりも(自己CD4T細胞を使用した)TTに対するリコール応答および同種CD8T細胞の増殖の誘導がずっと効果的である)から決定されるようにDCの性質を示す。CD40L、IFNαまたは合成dsRNA(ポリI:C)により、LCおよびintDCは誘導されて成熟し、T細胞の増殖応答の同等な増加を生じる。

抗原負荷したCD34+HPCから得られたDCは免疫応答および臨床応答を誘発する:国際出願第PCT/US02/07232号(WO02/072013)に開示されたように、6つのAg、すなわちインフルエンザマトリックスペプチド(Flu−MP)、KLH、ならびに4つのメラノーマAgであるMART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼおよびMAGE−3から得られたペプチドをパルスしたCD34+HPC由来DCを、ステージIVメラノーマのHLAA*0201+患者18人にワクチン接種した。KLH、Fluマトリックスペプチド、ならびに4つのメラノーマ抗原MAGE−3、MART−1/MELANA、GP−100およびチロシナーゼから得られたHLA−A2結合ペプチドをDCに負荷し、6週間にわたり隔週(s.c.注射4回)投与した。上記のように、これらのDCはランゲルハンス細胞構成要素を含む。抗原をパルスしたCD34−DCを用いた、進行メラノーマを有する患者に対するワクチン接種は耐容性が良好であり、「非自己」抗原(ウイルスペプチドおよびKLHタンパク質)と「自己」抗原(メラノーマペプチド)との両方に対する免疫の強化を生じることが証明された。血液における免疫応答のレベルは腫瘍部位での早期の転帰相関することが観察されたため、血液における免疫応答の測定がワクチンの有効性の評価を助けるという考えをさらに刺激した。実際に、抗原をパルスしたCD34+HPC由来DCは直接血液から検出できる一次免疫応答およびリコール免疫応答を誘導した。抗原(KLH、Flu−MP)を防除するための免疫応答を患者18人中16人で観察した。これらと同じ患者16人で1つまたは複数のメラノーマ抗原(MelAg)に対する免疫応答の強化がみられ、そのうち患者10人は2つを上回るMelAgに対して応答した。MelAg特異的T細胞はDCワクチンが機能的となり、予めex vivoで増大する必要なしにエフェクター細胞アッセイで検出できた後に誘発した。それらのT細胞は、外来サイトカインまたは抗原による多数回の再刺激を必要とせずに抗原保有DCと短期間(1週間)共培養した後で増殖できエフェクター機能を示すこともできた。対照抗原および腫瘍抗原のどちらにも応答しなかった患者2人は腫瘍の急速な進行を経験した。評価できる疾患を有する患者17人の内、2つ以下のMelAgに対する免疫を有する患者7人中6人が、研究に参加した10週間後に進行性の疾患を有した。これは、2つを超えるMelAgに対して免疫を有する患者10人中わずか1人に腫瘍の進行を認めたこととは対照的である。1つを超える腫瘍転移退縮をこれらの患者の内7人で観察した。DCワクチン接種後のメラノーマ抗原に対する全体的免疫は臨床転帰と関連していた(p=0.015)。

血中免疫応答の分析から、AgをパルスしたCD34−DCがCD4+およびCD8+T細胞免疫を速やかに誘導できることが実証された。実際、DCの単回ワクチン接種が患者6人でのKLH特異的応答および患者8人でのFlu−MP特異的応答を十分に誘導できた。単回のDCワクチンは、患者5人に1つ以上のメラノーマ抗原に対して腫瘍特異的エフェクターを十分に誘導できた。これらの5人の患者のうち1人も疾患の早期の進行を示さなかった。急速なKLH応答を有する患者6人のうちわずか1人が疾患の早期の進行を経験した。Flu−MPに対する迅速応答者遅延応答者は疾患の進行に差を示さなかった。このように、患者がCD4エピトープまたはメラノーマAgに迅速に応答する能力は、DCに基づくワクチン接種後の臨床転帰の早期の指標になり得た。

患者11人に追加の「ブースト」接種を4回行った。研究に参加してからの全体的な生存の分析から、1年目に18人中12人の患者が生存し、2年目に18人中9人の患者が生存していることが示された。研究に参加してからの全体的な生存は、第10週で検出されたワクチン特異的免疫応答のレベル、すなわち、最初の4回の接種後の(1)強度、すなわちメラノーマAg特異的IFNγのELISPOTの数および(2)幅、すなわちT細胞が応答するメラノーマ抗原数により測定されたレベルと関係していた。最後に、長期持続性の腫瘍退縮はエピトープの分散と関連していた。このように、DCワクチン中のランゲルハンス細胞構成要素は有益であることが示された。

概要

単球からexvivoで抗原負荷した抗原提示細胞を産生させるワンステップ法の提供。第1時点でTNFαおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに次に第2時点で可溶性または粒子状抗原性物質を抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって、exvivoで単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させる。抗原提示細胞は、表面マーカー(CD1a+CD207+)を有するランゲルハンス細胞、表面マーカー(CD1a+CD207−)を有する間質樹状細胞、表面マーカー(CD1a−CD14−)を有するダブルネガティブ樹状細胞、および表面マーカー(CD14+CD1a−CD209+)を有する樹状細胞からなる群から選択される2つ以上のサブセットから構成される。なし

目的

未熟DCの主な機能は、抗原の捕捉および細胞表面への抗原の提示の過程における初発第一ステップとして抗原を捕捉することである

効果

実績

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請求項1

単球由来抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンであって、前記抗原提示細胞が表面マーカー(CD1a+CD207+)を有する細胞、表面マーカー(CD1a+CD207−)を有する細胞、表面マーカー(CD1a−CD14−)を有する細胞、および表面マーカー(CD14+CD1a−CD209+)を有する細胞からなる群から選択される2つ以上のサブセットからなるワクチン。

技術分野

0001

本発明は、前駆体、具体的には単球と、可溶性または粒子状抗原、さらに具体的には死滅した腫瘍細胞とから抗原負荷した樹状細胞を迅速に産生させるための組成物および方法に関する。

背景技術

0002

本出願は、2002年12月4日に出願した米国特許仮出願第60/430791号の利権を主張する。

0003

癌免疫療法という概念は、ヒト癌抗原分子が同定されたことにより過去10年間に勢いづいた。これらの治療上の取り組みは、細胞上で癌抗原をT細胞に提示することができる樹状細胞(DC)を多数発生させるin vitro培養法を突き止めることによってさらに容易になった。動物を用いた無数の研究から、DC上に送達された腫瘍抗原を免疫することが防御性抗腫瘍応答誘導することが実証された。先駆的な臨床治験血液由来DCまたは単球由来DCを使用し、いくらかの臨床応答と、さらに最近では免疫応答も示した。(Bellら、1999「Dendriticcells」、Adv Immunol 72:255頁;Boczkowskiら、1996「Dendritic cellspulsed with RNA are potentantigen−presenting cells in vitro and in vivo」、J Exp Med 184:465〜472頁;Celluzziら、1996「Peptide−pulsed dendritic cells induceantigen−specific CTL−mediatedprotective tumor immunity」、J Exp Med 183:283〜287頁;Flamandら、1994「Murinedendritic cells pulsed in vitro with tumor antigeninduce tumor resistance in vivo」、Eur J Immunol 24:605〜610頁;Gilboaら、1998「Immunotherapyof cancer with dendritic−cell−based vaccines」、Cancer Immunol Immunother 46:82頁;Gilboa、E.1999「The makings of a tumor rejection antigen」、Immunity11:263〜270頁;Hsuら、1996「Vaccination of patients withB−cell lymphoma using autologous antigen−pulsed dendritic cells」、Nat Med 2:52頁;Mayordomoら、1995「Bonemarrow−derived dendriticcells pulsed with synthetic tumourpeptides elicit protective and therapeuticantitumour immunity」、NatMed 1:1297〜1302頁;Mayordomoら、1997「Bonemarrow−derived dendriticcells serve as potent adjuvantsfor peptide−basedantitumor vaccines」、StemCells 15:94〜103頁;Mukherjiら、1995「Inductionof antigen−specificcytolytic T cells in situ in human melanomaby immunizationwith synthetic peptide−pulsed autologous antigen presenting cells」、Proc Natl Acad Sci USA92:8078頁;Nestleら、1998「Vaccination of melanoma patientswith peptide− or tumor lysate−pulseddendritic cells」、Nat Med 4:328頁;Porgador、A.およびGilboa、E.1995「Bonemarrow−generated dendriticcells pulsed with a class I−restricted peptide are potent inducersof cytotoxic T lymphocytes」、J Exp Med 182:255〜260頁;Songら、1997「Dendriticcells geneticallymodified with an adenovirus vector encoding thecDNAfor a model antigeninduce protective and therapeutic antitumor immunity」、J Exp Med 186:1247〜1256頁;Song、J.A.1998「Tumorimmunology:the glassis half full」、Immunity 9:757〜763頁;Spechtら、1997「Dendriticcells retrovirallytransduced with a model antigengene are therapeutically effective against established pulmonary metastases」、J Exp Med 186:1213〜1221頁;Tjoaら、1998「Evaluationof phase I/II clinical trialsin prostate cancer with dendriticcells and PSMA peptides」、Prostate 36:39〜44頁;Toesら、1996「Protective antitumor immunity induced byimmunization withcompletely allogeneic tumor cells」、Cancer Res 56:3782〜3787頁;Zitvogelら、1996「Therapyof murine tumors with tumorpeptide−pulsed dendriticcells:dependence onT cells,B7 costimulation,and T helper cell 1−associatedcytokines」、J ExpMed 183:87〜97頁;Schuler−Thurnerら、2000「Mage−3and influenza−matrixpeptide−specific cytotoxicT cells are inducible interminal stageHLA−A2.1+ melanoma patientsby mature monocyte−derived dendritic cells」、J Immunol 165:3492〜3496頁;Mackensenら、2000「PhaseI study in melanoma patientsof a vaccine with peptide−pulseddendritic cells generated in vitro from CD34(+)hematopoietic progenitor cells」、Int J Cancer 86:385〜392頁;Geigerら、2001「Vaccinationof pediatric solid tumor patientswith tumor lysate−pulsed dendritic cells can expandspecific T cells and mediatetumor regression」、CancerRes 61:8513〜8519頁;Heiserら、2002「Autologousdendritic cells transfected with prostate−specific antigen RNA stimulate CTLresponses against metastatic prostate tumors」、JClin Invest 109:409〜417頁;Lodgeら、2000「Dendritic cell−basedimmunotherapy ofprostate cancer:immunemonitoring of a phase IIclinical trial」、CancerRes 60:829〜833頁;Fongら、2001「Dendriticcells injected via different routesinduce immunity in cancer patients」、Jlmmunol 166:4254〜4259頁;およびBanchereauら、2002「Dendriticcells as vectors for therapy」、Cell106:271〜274)。これらの結果は有望であるものの、とりわけDCの種類を含めたDCワクチン接種のいくつかのパラメーター確立する必要がある。

0004

現在、長期培養造血前駆細胞から、または血液前駆体すなわち単球からDCを作製している。(Cauxら、1992「GMCSFand TNF−alpha cooperate in the generation of dendritic Langerhans cells」、Nature 360:258〜261頁;Romaniら、1994「Proliferating dendriticcell progenitorsin human blood」、J Exp Med180:83〜93頁;Sallusto、F.およびLanzavecchia、A.1994「Efficientpresentation ofsoluble antigen by cultured humandendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony−stimulating factor plus interleukin 4 and downregulatedby tumor necrosis factor alpha」、JExp Med 179:1109〜1118頁;Reidら、1992「Interaction oftumor necrosis factor with granulocyte−macrophagecolony−stimulating factor andothercytokines in the regulation of dendritic cellgrowth in vitro form bipotentCD34+ progenitorsin human bone marrow」、J lmmunol149:2681〜2688頁;Arrighiら、1999「Long−term culture of human CD34(+)progenitors withFLT3−ligand,thrombopoietin,and stem cell factor inducesextensive amplificationof a CD34(−)CD14(−)and a CD34(−)CD14(+)dendritic cell precursor」、Blood 93:2244〜2252頁;Cauxら、1990「Tumornecrosis factor α strongly potentiatesinterleukin−3 andgranulocyte−macrophage colony−stimulating factor−inducedproliferation ofhuman CD34+ hematopoietic progenitor cells」、Blood 75:2292〜2298頁;Changら、2000「Monocyte−derivedCD1a+ and CD1a− dendritic cellsubsets differ in their cytokineproduction profiles,susceptibilitiesto transfection,andcapacities to direct Th cell differentiation」、Immunology 165:3584〜3591頁;およびWeissmanら、2000「HIVgagmRNAtransfection of dendritic cells(DC)delivers encoded antigen toMHCclass I and IImolecules,causes DCmaturation,and inducesa potent human in vitro primary immune response」、Immunology165:4710〜4717頁)。

0005

CD34+造血前駆細胞(HPC)をGM−CSFおよびTNFと共に(GM−CSF/TNF)培養すると、2つの異なるDCサブセットであるランゲルハンス細胞(LC)および間質DC(intDC)から構成されるDC調製物が得られる。これは、単球をGM−CSFおよびIL−4と共に(GM−CSF/IL−4)培養することにより発生する、intDCに類似した未熟DCの均一集団を含んだDCとは対照的である。GM−CSF/IL−4により誘導されたDCは追加の成熟因子を必要とするが、DC活性化因子であるTNFαの存在下で発生するCD34−DCは必要としない。米国特許第6004807号は、10%(v/v)熱不活性化ウシ胎仔血清を補充した組織培養培地を用いてCD34造血前駆細胞から樹状細胞を発生させることについて教示している。

0006

別個生物学的機能を有する2つのDCサブセットがさい帯血CD34+HPCの培養物から出現する:さい帯血CD34+HPCを用いて初期の研究が実施され、GM−CSF/TNFまたはIL−3/TNFと共に培養した場合それらの細胞の分化はDCに向いた。これらの培養条件では、TNF−αとGM−CSF/IL−3との間の協同がCD34+HPCからのDCの発生に重大である。実際、初期の研究はTNFが造血阻害物質であることを示唆したが、最近になるとTNFはIL−3またはGM−CSFの一方に誘導されるCD34+HPCの増殖の刺激物質であることが観察された。限界希釈分析は、TNFがIL−3応答細胞数とIL−3依存性クローンの平均サイズとの両方を増加させることを示した。液体培養を12日間行った後で、GM−CSFおよびTNFと共に培養したCD34+HPCは樹状形態を有する接着細胞非接着細胞との両方を生じる。DCを最適に発生させるためには、GM−CSF/IL−3/IL−5受容体の共通鎖サブユニット発現アップレギュレーションされる培養開始後の数日にTNFが主に必要である。CD34+HPCの培養におけるTNFの別の重要な作用部位は、顆粒球を生成する分化および増殖の阻害である。具体的には、TNFは分化の方向付けがされていないCD13−CD15−芽細胞のレベルで顆粒球への分化を可逆的に遮断し、芽細胞がTNF強化培養物中に蓄積する。さらに、分化の方向付けが終わった顆粒球前駆細胞(CD15+)の成長は、G0/G1に細胞周期が停止することで阻害される(Cauxら、1991「Potentiationof early hematopoiesis by tumor necrosis factor−alphais followed by inhibition of granulopoietic differentiation and proliferation」、Blood 78:635〜644頁;Jacobsenら、1992「Tumornecrosis factor alpha directly andindirectly regulates hematopoietic progenitor cell proliferation:role of colony−stimulating factor receptor modulation」、JExp Med 175:1759〜1772頁)。TNFはこれらの培養における赤血球生成も遮断する。成長中のCD34+HPCに及ぼすTNFのこれらの作用は、p55TNF受容体に仲介される(Rustenら、1994「Bifunctionaleffects of tumor necrosis factoralpha(TNF alpha)on the growth ofmature and primitive human hematopoieticprogenitor cells:involvementof p55 and p75 TNFreceptors」、Blood83:3152〜3159頁)。

0007

上記のように、これらの培養条件で前駆体の2つの亜細胞集団であるCD1a+およびCD14+が出現し、これらの亜集団はそれぞれLCおよびintDCに分化できる(Cauxら、1996「CD34+hematopoietic progenitorsfrom human cord blood differentiatealong two independent dendritic cells pathways inresponse toGM−CSF+TNF alpha」、J ExpMed 184:695〜706頁;Cauxら、1997「CD34+hematopoietic progenitorsfrom human cord blood differentiatealong two independent dendritic cell pathways inresponse to granulocyte−macrophage colony−stimulatingfactor plus tumor necrosis factoralpha:II.Functional analysis」、Blood 90:1458〜1470頁)。両前駆体サブセットは第12〜14日に典型的な形態、表現型(CD80、CD83、CD86、CD58、高HLAクラスII)および機能を有するDCに分化する。CDla+前駆体はランゲルハンス細胞の特徴を有する細胞を生じる(バーベック顆粒、Lag抗原およびE−カドヘリン)。対照的に、CD14+前駆体は、バーベック顆粒、E−カドヘリンおよびLag抗原を欠くが、CD2、CD9、CD68および凝固因子XIIIaを発現するCD1a+DCに成熟することが皮膚樹状細胞では記載されている。興味深いことに、CD1a+前駆体ではなくCD14+前駆体は、M−CSFに応答して誘導されT細胞のための補助機能を欠くマクロファージ様細胞に分化できる両能細胞を表す。これらのDCサブセットは以下の点で異なる:(1)抗原捕捉(intDCはLCよりもデキストランの取り込みおよび免疫複合体との結合に有効である)、(2)リソソーム活性(intDCの方が高レベル酵素活性を発現する)、(3)ナイーブB細胞分化誘導能(intDCはIL−12の分泌を介してナイーブB細胞のプライミングおよびそれらのIgM分泌形質細胞への分化を独自に誘導できる)(Duboisら、1997「Dendriticcells enhance growth and differentiationof CD40−activatedB lymphocytes」、JExp Med 185:941〜951頁;Duboisら、1998「Critical roleof IL−12 in dendritic cell−induceddifferentiation ofnaive B lymphocytes」、J lmmunol 161:2223〜2231頁)、および(4)両サブセットはCD40が連結した際にIL−12を発現するがintDCだけがIL−10を発現する。LCの独特な機能を今後確立すべきであるが、LC成分を有するCD34−DCの方が単球由来DCよりもCD8T細胞のプライミングに有効であることを示唆する報告がいくつかある(Mortariniら、1997「Autologousdendritic cells derived from CD34+progenitors andfrom monocytes are not functionallyequivalent antigen−presentingcells in the induction ofmelan−A/Mart−1(27−35)−specific CTLs from peripheralblood lymphocytesof melanoma patients with lowfrequency of CTL precursors」、Cancer Res 57:5534〜5541頁;およびFerlazzoら、2000「Dendriticcells generated from CD34+ progenitorcells with flt3 ligand,c−kit ligand,GM−CSF,IL−4,and TNF−alpha are functional antigen−presenting cells resembling mature monocyte−deriveddendritic cells」、J Immunother23:48〜58頁)。 GM−CSFおよびIL−15の存在下で単球を培養することによる誘導したランゲルハンス細胞の表現型を有するDCが、GM−CSF/IL−4DCよりもin vitroのCTL応答の誘導に有効であると実証した我々自身の研究において、これらの観察を確認している(Mohamadzadehら、2001「Interleukin15 skews monocyte differentiation into dendritic cellswith features of Langerhans cells」、J Exp Med194:1013〜20頁)。このように、腫瘍特異的CTLを誘導するような状況では、CD34−DCまたはランゲルハンス細胞を含む他の任意のDC調製物が有利である可能性がある。

0008

G−CSFにより動員した血液CD34+HPCも2つのDCサブセットをもたらす:G−CSFにより動員され進行メラノーマ患者から単離された末梢血は、さい帯血で認識された分化経路にしたがい、培養第9日で2つの細胞集団、すなわちCD1a+CD14−LCおよびCD1a−CD14+intDCを確認できる。しかし、これらの培養物中の細胞の約50%が前駆細胞/前駆体段階に留まり、さらなる培養でDCを生じることができる。このように、これらの培養物は非同調性であり、このことはこれらのDC調製物をワクチンとして使用する場合に考慮する必要のあるパラメーターである。両サブセットはCD83lowCD86+HLA−DR+、MHCクラスI+であり(intDCの方がわずかに高レベルのクラスIを発現する)、LCの方が高レベルのCD11cおよびCD80を発現する。Lagの発現およびバーベック顆粒に対応する細胞質構造はどちらも主にLCにみられるが、それらを示す共焦点顕微鏡像から、それらがランゲルハンス細胞の表現型であることを確認した。第9日の培養物から選別したLCおよびintDCは、1)形態(ギムザ染色で顕著な樹枝状突起を有する明瞭な核および細胞質構造を示す)、2)抗原の捕捉(intDCの方がLCよりもかなり多くのFITC−デキストランを捕捉する)、および3)T細胞応答の誘導(CD1a+CD14−細胞およびCD1a−CD14+細胞の両方が同種T細胞の増殖を誘導できるが、選別されたCD1a+細胞の方がCD14+細胞よりも(自己CD4T細胞を使用した)TTに対するリコール応答および同種CD8T細胞の増殖の誘導がずっと効果的である)から決定されるようにDCの性質を示す。CD40L、IFNαまたは合成dsRNA(ポリI:C)により、LCおよびintDCは誘導されて成熟し、T細胞の増殖応答の同等な増加を生じる。

0009

抗原負荷したCD34+HPCから得られたDCは免疫応答および臨床応答を誘発する:国際出願第PCT/US02/07232号(WO02/072013)に開示されたように、6つのAg、すなわちインフルエンザマトリックスペプチド(Flu−MP)、KLH、ならびに4つのメラノーマAgであるMART−1/MelanA、gp100、チロシナーゼおよびMAGE−3から得られたペプチドをパルスしたCD34+HPC由来DCを、ステージIVメラノーマのHLAA*0201+患者18人にワクチン接種した。KLH、Fluマトリックスペプチド、ならびに4つのメラノーマ抗原MAGE−3、MART−1/MELANA、GP−100およびチロシナーゼから得られたHLA−A2結合ペプチドをDCに負荷し、6週間にわたり隔週(s.c.注射4回)投与した。上記のように、これらのDCはランゲルハンス細胞構成要素を含む。抗原をパルスしたCD34−DCを用いた、進行メラノーマを有する患者に対するワクチン接種は耐容性が良好であり、「非自己」抗原(ウイルスペプチドおよびKLHタンパク質)と「自己」抗原(メラノーマペプチド)との両方に対する免疫の強化を生じることが証明された。血液における免疫応答のレベルは腫瘍部位での早期の転帰相関することが観察されたため、血液における免疫応答の測定がワクチンの有効性の評価を助けるという考えをさらに刺激した。実際に、抗原をパルスしたCD34+HPC由来DCは直接血液から検出できる一次免疫応答およびリコール免疫応答を誘導した。抗原(KLH、Flu−MP)を防除するための免疫応答を患者18人中16人で観察した。これらと同じ患者16人で1つまたは複数のメラノーマ抗原(MelAg)に対する免疫応答の強化がみられ、そのうち患者10人は2つを上回るMelAgに対して応答した。MelAg特異的T細胞はDCワクチンが機能的となり、予めex vivoで増大する必要なしにエフェクター細胞アッセイで検出できた後に誘発した。それらのT細胞は、外来サイトカインまたは抗原による多数回の再刺激を必要とせずに抗原保有DCと短期間(1週間)共培養した後で増殖できエフェクター機能を示すこともできた。対照抗原および腫瘍抗原のどちらにも応答しなかった患者2人は腫瘍の急速な進行を経験した。評価できる疾患を有する患者17人の内、2つ以下のMelAgに対する免疫を有する患者7人中6人が、研究に参加した10週間後に進行性の疾患を有した。これは、2つを超えるMelAgに対して免疫を有する患者10人中わずか1人に腫瘍の進行を認めたこととは対照的である。1つを超える腫瘍転移退縮をこれらの患者の内7人で観察した。DCワクチン接種後のメラノーマ抗原に対する全体的免疫は臨床転帰と関連していた(p=0.015)。

0010

血中免疫応答の分析から、AgをパルスしたCD34−DCがCD4+およびCD8+T細胞免疫を速やかに誘導できることが実証された。実際、DCの単回ワクチン接種が患者6人でのKLH特異的応答および患者8人でのFlu−MP特異的応答を十分に誘導できた。単回のDCワクチンは、患者5人に1つ以上のメラノーマ抗原に対して腫瘍特異的エフェクターを十分に誘導できた。これらの5人の患者のうち1人も疾患の早期の進行を示さなかった。急速なKLH応答を有する患者6人のうちわずか1人が疾患の早期の進行を経験した。Flu−MPに対する迅速応答者遅延応答者は疾患の進行に差を示さなかった。このように、患者がCD4エピトープまたはメラノーマAgに迅速に応答する能力は、DCに基づくワクチン接種後の臨床転帰の早期の指標になり得た。

0011

患者11人に追加の「ブースト」接種を4回行った。研究に参加してからの全体的な生存の分析から、1年目に18人中12人の患者が生存し、2年目に18人中9人の患者が生存していることが示された。研究に参加してからの全体的な生存は、第10週で検出されたワクチン特異的免疫応答のレベル、すなわち、最初の4回の接種後の(1)強度、すなわちメラノーマAg特異的IFNγのELISPOTの数および(2)幅、すなわちT細胞が応答するメラノーマ抗原数により測定されたレベルと関係していた。最後に、長期持続性の腫瘍退縮はエピトープの分散と関連していた。このように、DCワクチン中のランゲルハンス細胞構成要素は有益であることが示された。

発明が解決しようとする課題

0012

樹状細胞は、例えば癌を有する患者に抗原特異的免疫応答を誘導するワクチン接種用のベクターとしてますます使用されてきている。DC上に送達された腫瘍抗原を免疫することが抗腫瘍防御応答を誘導し、抗原負荷したDCを患者にワクチン接種することが腫瘍抗原に対する免疫応答の増加をもたらすことができるという事実を考慮して、抗原負荷したDCのワクチン接種が腫瘍および感染性因子の治療に推奨されてきた。このように、抗原負荷したDCの発生方法の改良はどのようなワクチン接種プロトコルにも有益である。ex vivoでDCワクチンを発生させる現行法は、CD34+造血前駆細胞(米国特許第6004807号)または樹状細胞前駆体を構成する単球(GM−CSFおよびIL−4を加え、その後成熟ステップを行う)の一方を培養することに基づいている。しかし、これらの培養には時間がかかり、前駆細胞および前駆体に対してそれぞれ少なくとも9および7日間を必要とする。さらに、樹状細胞が発生した後に、DCに抗原をパルスする必要があり、これに追加の培養を必要とする。

0013

抗原負荷した樹状細胞ワクチンを3日という短期間で迅速に発生させる方法が発見された。この方法により発生した抗原負荷した樹状細胞を、任意の治療、診断、予防または研究プロトコルに使用することができる。

課題を解決するための手段

0014

一態様において、本発明はex vivoで単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させる方法であり、その方法は可溶性または粒子状抗原性物質腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球に同時接触させることを含む。好ましくは、抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生する。本方法に有用な抗原性物質は、抗原ペプチドペプチド模倣物、タンパク質、ポリタンパク質、免疫複合体、瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、ウイルスベクターおよびリポソームからなる群から選択される1つまたは複数の物質からなる。好ましい方法では、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましい方法では、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。別の好ましい方法では、表面マーカー(CD1a+CD207+)を有する細胞、表面マーカー(CD1a+CD207−)を有する細胞、表面マーカー(CD1a−CD14−)を有する細胞、および表面マーカー(CD14+CD1a−CD209+)を有する細胞からなる群から選択される1つまたは複数のサブセットを含む画分に、抗原負荷した抗原提示細胞を分けることができる。

0015

別の態様において、本発明はex vivoで単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させる方法であり、その方法は第一時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と接触させて抗原提示細胞を形成させ、第二時点で可溶性または粒子状抗原性物質をその抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させ、その抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生するものである。本方法に有用な抗原性物質は、抗原ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、ポリタンパク質、免疫複合体、瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、ウイルスベクターおよびリポソームからなる群から選択される1つまたは複数の物質からなる。好ましい方法では、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましい方法では、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。別の好ましい方法では、表面マーカー(CD1a+CD207+)を有する細胞、表面マーカー(CD1a+CD207−)を有する細胞、表面マーカー(CD1a−CD14−)を有する細胞、および表面マーカー(CD14+CD1a−CD209+)を有する細胞からなる群から選択される1つまたは複数のサブセットを含む画分に、抗原負荷した抗原提示細胞を分けることができる。

0016

別の態様において、本発明は可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をex vivoで単球と同時接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させるステップにしたがって製造される抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンである。好ましくは、抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生する。このワクチン中の抗原性物質は抗原ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、ポリタンパク質、免疫複合体、瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、ウイルスベクターおよびリポソームからなる群から選択される1つまたは複数の物質からなる。好ましいワクチンでは、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましいワクチンでは、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。

0017

別の態様において、本発明は第一時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させるステップおよび第二時点で可溶性または粒子状抗原性物質をその抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させるステップにしたがって作製される抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンであり、抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生する。このワクチン中の抗原性物質は抗原ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、ポリタンパク質、免疫複合体、瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、ウイルスベクターおよびリポソームからなる群から選択される1つまたは複数の物質からなる。好ましいワクチンでは、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましいワクチンでは、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。

0018

別の態様において、本発明は単球由来の抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンであり、抗原提示細胞はランゲルハンス細胞および間質樹状細胞を含む。

0019

別の態様において、本発明は単球由来の抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンであり、抗原提示細胞は表面マーカー(CD1a+CD207+)を有する細胞、表面マーカー(CD1a+CD207−)を有する細胞、表面マーカー(CD1a−CD14−)を有する細胞、および表面マーカー(CD14+CD1a−CD209+)を有する細胞からなる群から選択される2つ以上のサブセットからなる。

0020

別の態様において、本発明は担腫瘍患者での腫瘍特異的免疫応答の誘導方法であり、その方法は、(1)少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoでその単球から得られる抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンを製造すること、ならびに(2)そのワクチンを患者に投与することを含む。ここで、患者の細胞はワクチン中の抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると成熟して、腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞を形成する。別の実施形態では、第一時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、および第二時点で少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって抗原負荷した抗原提示細胞を作製し、前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生する。好ましい方法では、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましい方法では、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。好ましい一方法では、標的細胞傷害性細胞はCD4ポジティブである。別の好ましい方法では、標的細胞傷害性細胞はCD8ポジティブである。

0021

別の態様において、本発明は担腫瘍患者での腫瘍特異的免疫応答の誘導方法であり、その方法は、(1)患者から単球および細胞傷害性細胞前駆体を単離すること、(2)少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによって患者の単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、(3)抗原負荷した抗原提示細胞と、単離した細胞傷害性細胞前駆体を前駆体が成熟する条件で共培養して細胞傷害性細胞を形成させること、ならびに(4)その細胞傷害性細胞を患者に投与することを含む。ここで、細胞傷害性細胞は腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す。別の実施形態では、第一時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに第二時点で少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって抗原負荷した抗原提示細胞を作製し、前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生する。好ましい方法では、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましい方法では、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。好ましい一方法では、細胞傷害性細胞はCD4ポジティブである。別の好ましい方法では、細胞傷害性細胞はCD8ポジティブである。

0022

別の態様において、本発明は患者に免疫応答を誘導する方法であり、その方法は、(1)免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoでその単球から得られる抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンを製造すること、ならびに(2)患者にそのワクチンを投与することを含む。ここで、患者の細胞はワクチン中の抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると成熟してその抗原に対して免疫活性を表す細胞を形成する。好ましい実施形態において、第一時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに第二時点で免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞に接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって、抗原負荷した抗原提示細胞を作製する。ここで、前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生する。好ましい方法では、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましい方法では、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。好ましい一方法では、標的細胞傷害性細胞はCD4ポジティブである。別の好ましい方法では、標的細胞傷害性細胞はCD8ポジティブである。

0023

別の態様において、本発明は細胞傷害性T細胞により仲介される免疫応答を備えさせる方法であり、その方法は、(1)免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoでその単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、(2)ナイーブT細胞と抗原負荷した抗原提示細胞を、T細胞成熟条件で共培養して細胞傷害性T細胞を形成させること、ならびに(3)抗原を保有する標的細胞を細胞傷害性T細胞と接触させることを含む。ここで、細胞傷害性T細胞は抗原を保有する標的細胞に対して細胞傷害活性を表す。別の実施形態では、第一時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに第二時点で免疫応答が望まれる対象の少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって、抗原負荷した抗原提示細胞を作製する。ここで、前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生する。好ましい方法では、抗原性物質は可溶性抗原性物質からなる。別の好ましい方法では、抗原性物質は瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる。好ましい一方法では、細胞傷害性細胞はCD4ポジティブである。別の好ましい方法では、細胞傷害性細胞はCD8ポジティブである。

0024

別の態様において、本発明は患者における免疫応答の修飾方法であり、その方法は、(1)免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoで単球から得られる抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに(2)抗原提示細胞を患者に投与することを含む。ここで、患者の細胞は抗原負荷した抗原提示細胞と接触した場合その抗原に対して免疫活性を表さないようにモジュレートされる。

0025

そのうえ別の態様において、本発明は2つ以上のサブセットから構成される抗原負荷した抗原提示細胞画分の製造方法であり、その方法は、(1)可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をex vivoで単球と同時に接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させること(2)抗原負荷した抗原提示細胞から2つ以上のサブセットを単離すること、ならびに(3)2つ以上のサブセットを組み合わせて抗原負荷した抗原提示細胞画分を形成させることを含み、ここで、各サブセットは患者に投与された場合に別個のT細胞応答を誘発し別個の免疫応答を備えることができる。

0026

すなわち本発明は、
1.単球由来の抗原負荷した抗原提示細胞を有するワクチンであって、前記抗原提示細胞が表面マーカー(CD1a+CD207+)を有する細胞、表面マーカー(CD1a+CD207−)を有する細胞、表面マーカー(CD1a−CD14−)を有する細胞、および表面マーカー(CD14+CD1a−CD209+)を有する細胞からなる群から選択される2つ以上のサブセットからなるワクチン、
2.担腫瘍患者由来の腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞の作製方法であって、
前記患者から単球および細胞傷害性細胞前駆体を単離すること、
少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を前記患者から単離した単球と同時に接触させることによって前記単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに
前記患者から単離した細胞傷害性細胞前駆体と前記抗原負荷した抗原提示細胞を前記前駆体が成熟する条件で共培養して細胞傷害性細胞を形成させること
を含む作製方法、
3.抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で作製される、上記2に記載の方法、
4.上記2又は3に記載の方法にしたがって作製される細胞傷害性細胞の、腫瘍特異的免疫応答誘導用薬剤の製造における使用、
5.以下の(a)又は(b)に記載の方法にしたがって作製される細胞傷害性細胞の、免疫応答を備えさせるための薬剤の製造における使用であって、前記細胞を、抗原を保有する標的細胞と接触させる使用:
(a)免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoで前記単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、及び、
ナイーブT細胞と前記抗原負荷した抗原提示細胞をT細胞が成熟する条件で共培養して細胞傷害性T細胞を形成させることを含む方法であって、
前記細胞傷害性T細胞が前記抗原を保有する前記標的細胞に対して細胞傷害活性を表す方法:
(b)免疫応答を備えさせることができる細胞傷害性T細胞の作製方法であって、
第1時点で腫瘍壊死因子αと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とをex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、および第2時点で免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに
ナイーブT細胞と前記抗原負荷した抗原提示細胞をT細胞が成熟する条件で共培養して細胞傷害性T細胞を形成させること
を含む方法であって、
前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生し、
前記細胞傷害性T細胞が前記抗原を保有する前記標的細胞に対して細胞傷害活性を表す方法、
6.(a)における抗原負荷した抗原提示細胞が、4日未満で作製される、上記5に記載の使用、
7.抗原負荷した抗原提示細胞の、患者のがん治療用ワクチン製造における使用であって、前記抗原負荷した抗原提示細胞が、少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoで前記単球から作製され、
前記患者の細胞が前記ワクチン中の前記抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると、成熟して前記腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞を形成する使用、
8.抗原負荷した抗原提示細胞が、4日未満で作製される、上記7に記載の使用、
9.抗原負荷した抗原提示細胞の、患者のがん治療用ワクチン製造のための使用であって、前記抗原負荷した抗原提示細胞が、第1時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに第2時点で少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって作製され、前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生し、
前記患者の細胞が前記ワクチン中の前記抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると、成熟して前記腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞を形成する使用、
10.以下の(a)又は(b)に記載の方法にしたがって作製される細胞傷害性細胞の、腫瘍特異的免疫応答誘導用薬剤の製造における使用:
(a)担腫瘍患者由来の腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞の作製方法であって、
前記患者から単球および細胞傷害性細胞前駆体を単離すること、
少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を前記患者から単離した単球と同時に接触させることによって前記単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに
前記患者から単離した細胞傷害性細胞前駆体と前記抗原負荷した抗原提示細胞を前記前駆体が成熟する条件で共培養して細胞傷害性細胞を形成させること
を含む作製方法:
(b)担腫瘍患者由来の腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞の作製方法であって、
第1時点で腫瘍壊死因子αと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とを前記患者から単離した単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、および第2時点で少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに
前記患者から単離した細胞傷害性細胞前駆体と前記抗原負荷した抗原提示細胞を前記前駆体が成熟する条件で共培養して細胞傷害性細胞を形成させること
を含み、前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生する作製方法、
11.(a)における抗原負荷した抗原提示細胞が、4日未満で作製される、上記10に記載の使用、
12.抗原負荷した抗原提示細胞の、患者の免疫応答誘導用ワクチン製造のための使用であって、前記抗原負荷した抗原提示細胞が、免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoで前記単球から作製され、
前記患者の細胞が前記ワクチン中の前記抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると、成熟して前記抗原に対する免疫活性を表す細胞を形成する使用、
13.抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で作製される、上記12に記載の使用、
14.抗原負荷した抗原提示細胞の、患者の免疫応答誘導用ワクチン製造における使用であって、前記抗原負荷した抗原提示細胞が、第1時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに第2時点で免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって作製され、
前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生し、
前記患者の細胞が前記ワクチン中の前記抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると、成熟して前記抗原に対する免疫活性を表す細胞を形成する使用、
15.以下の(a)又は(b)に記載の方法にしたがって作製される細胞傷害性細胞の、免疫応答を備えさせるための薬剤の製造における使用であって、前記細胞を、抗原を保有する標的細胞と接触させる使用:
(a)免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoで前記単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、及び、
ナイーブT細胞と前記抗原負荷した抗原提示細胞をT細胞が成熟する条件で共培養して細胞傷害性T細胞を形成させることを含む方法であって、
前記細胞傷害性T細胞が前記抗原を保有する前記標的細胞に対して細胞傷害活性を表す方法:
(b)免疫応答を備えさせることができる細胞傷害性T細胞の作製方法であって、
第1時点で腫瘍壊死因子αと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とをex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、および第2時点で免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに
ナイーブT細胞と前記抗原負荷した抗原提示細胞をT細胞が成熟する条件で共培養して細胞傷害性T細胞を形成させること
を含み、前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生し、
前記細胞傷害性T細胞が前記抗原を保有する前記標的細胞に対して細胞傷害活性を表す方法、
16.(a)における抗原負荷した抗原提示細胞が、4日未満で作製される、上記15に記載の使用、
17.抗原負荷した抗原提示細胞の、患者のがん治療用ワクチン製造における使用であって、前記抗原負荷した抗原提示細胞が、少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoで前記単球から作製され、
前記患者の細胞が前記ワクチン中の前記抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると、成熟して前記腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞を形成する使用であって、
抗原性物質が瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる、使用、
18.抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で作製される、上記17に記載の使用、
19.抗原負荷した抗原提示細胞の、患者のがん治療用ワクチン製造のための使用であって、前記抗原負荷した抗原提示細胞が、第1時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに第2時点で少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって作製され、前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生し、
前記患者の細胞が前記ワクチン中の前記抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると、成熟して前記腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞を形成する使用であって、
抗原性物質が瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる、使用、
20.以下の(a)又は(b)に記載の方法にしたがって作製される細胞傷害性細胞の、腫瘍特異的免疫応答誘導用薬剤の製造における使用:
(a)担腫瘍患者由来の腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞の作製方法であって、
前記患者から単球および細胞傷害性細胞前駆体を単離すること、
少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を前記患者から単離した単球と同時に接触させることによって前記単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに
前記患者から単離した細胞傷害性細胞前駆体と前記抗原負荷した抗原提示細胞を前記前駆体が成熟する条件で共培養して細胞傷害性細胞を形成させること
を含む作製方法であり、
前記抗原性物質が瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる、作製方法:
(b)担腫瘍患者由来の腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞の作製方法であって、
第1時点で腫瘍壊死因子αと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とを前記患者から単離した単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、および第2時点で少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに
前記患者から単離した細胞傷害性細胞前駆体と前記抗原負荷した抗原提示細胞を前記前駆体が成熟する条件で共培養して細胞傷害性細胞を形成させること
を含み、前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生する作製方法であり、
前記抗原性物質が瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる、作製方法、
21.(a)における抗原負荷した抗原提示細胞が、4日未満で作製される、上記20に記載の使用、
22.抗原負荷した抗原提示細胞の、患者の免疫応答誘導用ワクチン製造のための使用であって、前記抗原負荷した抗原提示細胞が、免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoで前記単球から作製され、
前記患者の細胞が前記ワクチン中の前記抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると、成熟して前記抗原に対する免疫活性を表す細胞を形成する使用であって、
抗原性物質が瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる、使用、
23.抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で作製される、上記22に記載の使用、
24.抗原負荷した抗原提示細胞の、患者の免疫応答誘導用ワクチン製造における使用であって、前記抗原負荷した抗原提示細胞が、第1時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに第2時点で免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって作製され、
前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生し、
前記患者の細胞が前記ワクチン中の前記抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると、成熟して前記抗原に対する免疫活性を表す細胞を形成する使用であって、
抗原性物質が瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる、使用、
25.以下の(a)又は(b)に記載の方法にしたがって作製される細胞傷害性細胞の、免疫応答を備えさせるための薬剤の製造における使用であって、前記細胞を、抗原を保有する標的細胞と接触させる使用:
(a)免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoで前記単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、及び、
ナイーブT細胞と前記抗原負荷した抗原提示細胞をT細胞が成熟する条件で共培養して細胞傷害性T細胞を形成させることを含む方法であって、
前記細胞傷害性T細胞が前記抗原を保有する前記標的細胞に対して細胞傷害活性を表し、
及び、抗原性物質が瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる方法:
(b)免疫応答を備えさせることができる細胞傷害性T細胞の作製方法であって、
第1時点で腫瘍壊死因子αと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とをex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、および第2時点で免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに
ナイーブT細胞と前記抗原負荷した抗原提示細胞をT細胞が成熟する条件で共培養して細胞傷害性T細胞を形成させること
を含み、前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生し、
前記細胞傷害性T細胞が前記抗原を保有する前記標的細胞に対して細胞傷害活性を表し、
及び、抗原性物質が瀕死の全細胞体、瀕死の細胞体の断片、またはその両方からなる方法、
26.(a)における抗原負荷した抗原提示細胞が、4日未満で作製される、上記25に記載の使用、
27.抗原負荷した抗原提示細胞の、患者のがん治療用ワクチン製造における使用であって、前記抗原負荷した抗原提示細胞が、少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoで前記単球から作製され、
前記患者の細胞が前記ワクチン中の前記抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると、成熟して前記腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞を形成する使用であって、
前記細胞傷害性細胞がCD4ポジティブ又はCD8ポジティブである、使用、
28.抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で作製される、上記27記載の使用、
29.抗原負荷した抗原提示細胞の、患者のがん治療用ワクチン製造のための使用であって、前記抗原負荷した抗原提示細胞が、第1時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに第2時点で少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって作製され、前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生し、
前記患者の細胞が前記ワクチン中の前記抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると、成熟して前記腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞を形成する使用であって、
前記細胞傷害性細胞がCD4ポジティブ又はCD8ポジティブである、使用、
30.以下の(a)又は(b)に記載の方法にしたがって作製される細胞傷害性細胞の、腫瘍特異的免疫応答誘導用薬剤の製造における使用であって、前記細胞傷害性細胞がCD4ポジティブ又はCD8ポジティブである、使用:
(a)担腫瘍患者由来の腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞の作製方法であって、
前記患者から単球および細胞傷害性細胞前駆体を単離すること、
少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を前記患者から単離した単球と同時に接触させることによって前記単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに
前記患者から単離した細胞傷害性細胞前駆体と前記抗原負荷した抗原提示細胞を前記前駆体が成熟する条件で共培養して細胞傷害性細胞を形成させること
を含む作製方法:
(b)担腫瘍患者由来の腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を表す細胞傷害性細胞の作製方法であって、
第1時点で腫瘍壊死因子αと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とを前記患者から単離した単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、および第2時点で少なくとも1つの腫瘍抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに
前記患者から単離した細胞傷害性細胞前駆体と前記抗原負荷した抗原提示細胞を前記前駆体が成熟する条件で共培養して細胞傷害性細胞を形成させること
を含み、前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生する作製方法、
31.(a)における抗原負荷した抗原提示細胞が、4日未満で作製される、上記30に記載の使用、
32.抗原負荷した抗原提示細胞の、患者の免疫応答誘導用ワクチン製造のための使用であって、前記抗原負荷した抗原提示細胞が、免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoで前記単球から作製され、
前記患者の細胞が前記ワクチン中の前記抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると、成熟して前記抗原に対する免疫活性を表す細胞を形成する使用であって、
前記細胞傷害性細胞がCD4ポジティブ又はCD8ポジティブである、使用、
33.抗原負荷した抗原提示細胞が、4日未満で作製される、上記32に記載の使用、
34.抗原負荷した抗原提示細胞の、患者の免疫応答誘導用ワクチン製造における使用であって、前記抗原負荷した抗原提示細胞が、第1時点で腫瘍壊死因子αおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、ならびに第2時点で免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって作製され、
前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生し、
前記患者の細胞が前記ワクチン中の前記抗原負荷した抗原提示細胞と接触すると、成熟して前記抗原に対する免疫活性を表す細胞を形成する使用であって、
前記細胞傷害性細胞がCD4ポジティブ又はCD8ポジティブである、使用、
35.以下の(a)又は(b)に記載の方法にしたがって作製される細胞傷害性細胞の、免疫応答を備えさせるための薬剤の製造における使用であって、前記細胞傷害性細胞がCD4ポジティブ又はCD8ポジティブであり、前記細胞を、抗原を保有する標的細胞と接触させる使用:
(a)免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質、腫瘍壊死因子α、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を単球と同時に接触させることによってex vivoで前記単球から抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、及び、
ナイーブT細胞と前記抗原負荷した抗原提示細胞をT細胞が成熟する条件で共培養して細胞傷害性T細胞を形成させることを含む方法であって、
前記細胞傷害性T細胞が前記抗原を保有する前記標的細胞に対して細胞傷害活性を表す方法:
(b)免疫応答を備えさせることができる細胞傷害性T細胞の作製方法であって、
第1時点で腫瘍壊死因子αと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とをex vivoで単球と接触させて抗原提示細胞を形成させること、および第2時点で免疫応答が望まれる少なくとも1つの抗原を保有する可溶性または粒子状抗原性物質を前記抗原提示細胞と接触させて抗原負荷した抗原提示細胞を形成させることによって抗原負荷した抗原提示細胞を産生させること、ならびに
ナイーブT細胞と前記抗原負荷した抗原提示細胞をT細胞が成熟する条件で共培養して細胞傷害性T細胞を形成させること
を含み、前記抗原負荷した抗原提示細胞が4日未満で産生し、
前記細胞傷害性T細胞が前記抗原を保有する前記標的細胞に対して細胞傷害活性を表す方法、
36.(a)における抗原負荷した抗原提示細胞が、4日未満で作製される、上記35に記載の使用、
37.細胞傷害性細胞がCD4ポジティブ又はCD8ポジティブである、上記7〜26のいずれかに記載の使用、
に関する。

発明を実施するための最良の形態

0027

本発明は、ex vivoでヒト抗原提示細胞を産生させるための組成物および方法に関する。本発明は、さらに具体的にはTNFαを含むがそれに限定されない活性化物質を、好ましくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)を含むがそれに限定されない増殖因子と組み合わせて用いて抗原提示細胞を産生させるための方法および組成物に関する。本発明は血液前駆体から樹状細胞をex vivoで産生させるために具体的には適している。

0028

本発明は、治療目的(ワクチン)、診断目的(免疫モニタリング)、および研究目的(腫瘍抗原の同定)でex vivoまたはin vitroで単球のような血液前駆体から抗原提示細胞を産生させる方法であり、その方法は腫瘍壊死因子(TNF)αを含むがそれに限定されない活性化物質を、好ましくはGM−CSFを含むがそれに限定されない少なくとも1つの増殖因子と組み合わせて有する組成物を血液前駆体と接触させることを含む。本明細書において使用するように、TNFαはTNFα、または本発明の方法で活性化物質として機能する任意のTNFもしくはTNF様タンパク質として定義される。本発明に関連する増殖因子ならびに/または活性化物質の製剤は、組換え分子ならびに/またはウイルスベクターならびに/またはペプトイドならびに/または増殖因子および/もしくは活性化物質を内因性放出するように前駆体を誘発できる任意の分子を含むがそれらに限定されない。間質DCとランゲルハンス細胞(LC)との混合を含むこれらの樹状細胞を抗原に対して感作して、患者における抗原に対する免疫応答をモジュレートするためにその患者に投与できる。本発明は、本方法にしたがって産生した樹状細胞を有する組成物も含む。本発明に有用な抗原性物質には可溶性および粒子状抗原性物質がある。抗原性物質に腫瘍細胞全体を使用する場合、細胞は死滅していても瀕死であってもよく、本明細書に使用されるようにどちらの用語も同等とみなされる。

0029

一態様において、本発明はex vivoの単球からワクチンを製造するワンステップ法であり、その方法は例えば好ましくは少なくとも1つの増殖因子、例えばGM−CSFおよび少なくとも1つの可溶性または粒子状抗原と組み合わせてTNFαを有する組成物を単球と接触させることを含む。本発明は、本方法にしたがって製造されたワンステップ・ワクチンも含む。本発明の方法にしたがって、抗原負荷した樹状細胞ワクチンを3日間という短期間で発生させることができる。増殖因子(例えばGM−CSF)および活性化物質(例えばTNFα)と共に、単球および可溶性または粒子状抗原(例えば死滅した腫瘍細胞)を培養することによって、これらの樹状細胞を作製する。重要なことには、癌ワクチンとしての単球由来樹状細胞の発生は、インターロイキン4(IL−4)またはIL−13と組み合わせたGM−CSFまたはIL−3の使用を必要とすることが報告されている。これらのサイトカインの両方が2型T細胞または制御性T細胞に向けたT細胞応答の偏向を強く伴い、これは腫瘍ワクチン接種の状況では望ましくないおそれがある。したがって、本発明は樹状細胞ワクチンの発生を容易にし、そのようなワクチンを今や臨床治験で大規模に使用することができる。

0030

GM−CSFおよびTNFαのような前炎症性サイトカインは、樹状細胞の少なくとも4つのサブセット、すなわち表面マーカー(CD1a+CD14−CD207+)を有するランゲルハンス細胞(LC)、表面マーカー(CD1a+CD14+CD207−)を有する間質DC(intDC)、表面マーカー(CD1a−CD14−)を有するダブルネガティブDC(DN−DC)、および表面マーカー(CD1a−CD14+CD209+)を有する第四のサブセットを含む樹状細胞に単球が分化するのを促進することが今や発見された。これらの樹状細胞前駆体は抗原を捕捉した後にex vivoで抗原負荷した抗原提示樹状細胞に分化でき、その細胞を臨床治験に使用できる。さらに、樹状細胞ワクチンの発生に必要な3つの因子、すなわち、樹状細胞前駆体、抗原およびサイトカインを同時に一緒に合わせ抗原負荷した樹状細胞ワクチンを迅速に発生させることができることが今や見出された。時間がかかり3つのステップ(すなわちそれぞれ9および7日かかる前駆細胞または前駆体からの樹状細胞のex vivo発生、その後の抗原負荷、および単球から細胞が発生した場合の樹状細胞の活性化)を要する現行の技術とは異なり、本発明は、本方法に必要な全ての因子を組み合わせた、樹状細胞ワクチンの迅速オールイン・ワンステップ発生を可能にする。

0031

本発明の方法にしたがって、単球が接着または枯渇または正の選択のいずれかにより単離される血中白血球搬出からワクチンを作製する。そのように単離された単球を、次に組織培養バッグまたはプラスチック培養皿またはNuncCellファクトリー登録商標)のいずれかに入れて培養する。第1日にサイトカインを添加し、抗原を例えば死滅した腫瘍細胞の形で第1日または第2日のどちらかで添加し、第3日にワクチンを投与する。

0032

本発明の別の態様において、ワクチンを凍結してブースト注射に用いる。別の態様において、ブースト注射用のエキソソームを製造するためにワクチンを用いる。別の態様において、このワクチンから製造したエキソソームを抗原の製剤として使用して単球およびサイトカインと混合してワクチンを製造する。

0033

本発明の方法にしたがって、血液ユニットからワクチンを作製し、ここで接着または枯渇または正の選択により単球を単離する。そのように単離された単球を次に組織培養バッグまたはプラスチック製培養皿またはNuncCellファクトリー(登録商標)のいずれかに入れて培養する。第1日にサイトカインを添加し、抗原を例えば死滅した腫瘍細胞の形で第1日または第2日のどちらかで添加し、第3日にワクチンを投与する。本発明のこの実施形態では、各注射についてワクチンを新鮮調製し、毎月採血する。

0034

一態様において、本発明はin vitroまたはex vivoで抗原特異的CD4+Tリンパ球を産生させる方法であり、その方法は、例えばTNFαを好ましくは少なくとも1つの増殖因子、例えばGM−CSFと組み合わせて有する組成物を血液前駆体と接触させて樹状細胞を形成させること、少なくとも1つの可溶性または粒子状抗原に対して樹状細胞を感作して抗原感作樹状細胞を形成させること、およびTリンパ球を含む細胞集団を抗原感作樹状細胞と接触させて活性化抗原特異的CD4+Tリンパ球を形成させることによって調製される抗原感作樹状細胞をもたらすことを含む。患者における免疫応答をモジュレートするために、これらの抗原特異的CD4+Tリンパ球をその患者に投与できる。本発明には、本発明にしたがって産生した抗原特異的CD4+Tリンパ球を有する組成物も含む。

0035

一態様において、本発明はin vitroまたはex vivoで抗原特異的CD4+Tリンパ球を産生させる方法であり、その方法は、例えばTNFαを好ましくは少なくとも1つの増殖因子、例えばGM−CSFおよび少なくとも1つの可溶性または粒子状抗原と組み合わせて有する組成物を血液前駆体と接触させて抗原感作樹状細胞を形成させること、ならびにTリンパ球を含む細胞集団を抗原感作樹状細胞と接触させて活性化抗原特異的CD4+Tリンパ球を形成させることによって調製される抗原感作樹状細胞をもたらすことを含む。患者における免疫応答をモジュレートするために、これらの抗原特異的CD4+Tリンパ球を患者に投与できる。本発明は、本方法にしたがって産生した抗原特異的CD4+Tリンパ球を有する組成物も含む。

0036

一態様において、本発明はin vitroまたはex vivoで抗原特異的CD8+Tリンパ球を産生させる方法であり、その方法は、例えばTNFαを好ましくは少なくとも1つの増殖因子、例えばGM−CSFと組み合わせて有する組成物を血液前駆体と接触させて樹状細胞を形成させること、抗原に対して樹状細胞を感作して抗原感作樹状細胞を形成させること、およびTリンパ球を含む細胞集団を抗原感作樹状細胞と接触させて活性化抗原特異的CD8+Tリンパ球を形成させることによって調製される抗原感作樹状細胞をもたらすことを含む。患者における免疫応答をモジュレートするために、これらの抗原特異的CD8+Tリンパ球を患者に投与できる。本発明は、本方法にしたがって産生した抗原特異的CD8+Tリンパ球を有する組成物も含む。

0037

一態様において、本発明はin vitroまたはex vivoで抗原特異的CD8+Tリンパ球を産生させる方法であり、その方法は、例えばTNFαを好ましくは少なくとも1つの増殖因子、例えばGM−CSFおよび少なくとも1つの可溶性または粒子状抗原と組み合わせて有する組成物を血液前駆体と接触させて抗原感作樹状細胞を形成させること、ならびにTリンパ球を含む細胞集団を抗原感作樹状細胞と接触させて活性化抗原特異的CD8+Tリンパ球を形成させることによって調製される抗原感作樹状細胞をもたらすことを含む。患者における免疫応答をモジュレートするために、これらの抗原特異的CD8+Tリンパ球を患者に投与できる。本発明は、本方法にしたがって産生した抗原特異的CD8+Tリンパ球を有する組成物も含む。

0038

一般的な方法
本明細書において使用される本発明の抗原負荷したDCの迅速発生法を以下に詳述する。これらの方法は代表を意味し、当技術分野で公知であるような変更は、本発明の一部として意図される。

0039

細胞培養。健康志願者または進行メラノーマを有する患者の末梢血からFicoll−Paque密度勾配遠心分離により単核細胞を単離する。マイクロビーズを使った枯渇または2時間プラスチック接着法のどちらかによって単球を濃縮する。2mML−グルタミン、200UI/mlペニシリン、200μg/mlストレプトマイシンを補充し、かつ10%FBSまたは5%自己血清の一方を血清補充したRPMI1640培地3mlを入れた6穴平板に単球を1×106細胞/穴となるように蒔く。その6穴平板に死滅した腫瘍細胞を1×106死細胞/穴の密度で加える。単球をGM−CSF(100ng/ml、Immunex、シアトルワシントン州)およびTNFα(20ng/ml、R&D)と共に3日間培養する。

0040

腫瘍細胞系の死滅
多様な癌細胞系から、腫瘍死細胞を調製できる。腫瘍細胞の起源は、本明細書に挙げたものを含むがそれらに限定されず、追加の細胞系の選択およびこれらの細胞を死滅させる方法の変動は当業者の知識の範囲内に十分入る。本発明に有用な癌細胞の死滅法には、放射線照射のようなDNA損傷を引き起こす条件、またはFas連結、TNF、もしくはTRAILのいずれかを介した受容体介在性細胞死があるが、それに限定されない。例示的な方法を以下に示す。

0041

いったん集密になってから細胞系を回収し、小フラスコに入れて1×106細胞/mlの密度で培養する。1806乳癌細胞系およびColo829メラノーマ細胞系については、TNF−α(100ng/mlで使用)を用いた感作ステップの後に、細胞に90分間放射照射し、無血清培地に入れて48時間培養した。Me275メラノーマ細胞系については、ベツリン酸(BA)(10μg/ml、Sigma Chemical Co.、セントルイス、ミズーリ州)と共に細胞を48時間培養した。FITC−AnnexinVおよびヨウ化プロピジウムを用いた二重染色およびトリパンブルーを用いた排除試験により細胞死を評価した(生存率<25%)。

0042

フローサイトメトリー分析(FRCS)による分析。培養を3日間行った後に、細胞を加工してFITC−CD1aと、PE−CD14、PE−CD80、PE−CD83またはPE−CD86とを用いた二重染色(4℃、30分間)に供した。

0043

自己増殖アッセイ。培養を3日間行った後に、自己CD4T細胞用の刺激物質として細胞を使用した。10%ヒトAB血清を加えた完全RPMI1640培地を入れた微量検査用丸底組織培養平板に1×105個のCD4+T細胞と共に刺激物質である細胞の段階用量を蒔いた。培養を4日間行った後に、[3H]チミジン1μCiで細胞を一晩パルスし、T細胞の増殖を測定した。

0044

細胞傷害性Tリンパ球(CTL)発生アッセイ.培養を3日間行った後に、自己CD8T細胞および/または自己末梢血リンパ球(PBL)用の刺激物質として細胞を使用した。培養物を毎週再刺激し、最初の週にIL−7を、次の週からはIL−2を補充した。メラノーマ細胞を用いた標準クロム放出アッセイでCTL活性を試験し、そのメラノーマ細胞から標的として腫瘍体を発生させた。

0045

ワクチンの発生
免疫応答能のあるDCの発生に有用な本発明のワクチンは、多数のステップと長期の培養時間を要するすでに報告された方法から大きく進歩している。ワンステップ・ワクチンを発生させるための詳細で例示的な方法について以下に記載する。当業者の能力の範囲内である培養条件および調製法の変更または変動は、本発明の一部として意図されることを理解すべきである。

0046

健康志願者または進行メラノーマを有する患者の末梢血から単核細胞を単離する。血液を採取する前に、末梢血幹細胞を動員するために組換えヒトG−CSF(Amgen、サウザンドオークス、カリフォルニア州)を任意選択で個体に投与してもよい(Banchereauら、2001)。Ficoll−Paque密度勾配遠心分離を用いて単球を集め、CM培地に懸濁する。プラスチック皿(Falcon製6穴、フランクリンレークス、ニュージャージー州)上に37℃で2時間接着させることにより単球を濃縮できる。代わりに、Dynal(登録商標)単球ネガティブ単離キット(Dynal、レークサクセス、ニューヨーク州)を製造業者使用説明書にしたがって用い、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、および顆粒球を除くことにより単球を濃縮できる。

0047

2mM L−グルタミン、200UI/mlペニシリン、200μg/mlストレプトマイシン(全てSigma Chemical Co.、セントルイス、ミズーリ州から入手)を補充し、かつ10%ウシ胎仔血清(FBS、Hyclone)または5%自己血清(R&D)の一方を血清補充したRPMI1640培地3mlを入れた6穴平板(Falcon)に単球を1×106細胞/穴となるように蒔く。濃度100ng/mlのGM−CSF(Immunex、シアトル、ワシントン州)および20ng/mlのTNFα(R&D)と共に単球を3日間培養した。その6穴平板に死滅した腫瘍細胞を1×106死細胞/穴の密度で加えた。別の実施形態では、DCの免疫応答能に影響することなしに、死滅した腫瘍細胞を第1日ではなく第2日に加える。培養物を37℃で3日間培養する。

0048

多数の方法で培養物を評価できる:(1)DCの形態検査、(2)下記のFACS分析による細胞マーカーの存在、(3)下の自己増殖アッセイの項に記載するようなCD4+/CD8+T細胞の増殖促進能、および(4)細胞傷害性Tリンパ球(CTL)発生アッセイの項に記載するような細胞傷害性T細胞が誘導する腫瘍細胞の溶解誘導能

0049

GM−CSFおよびTNFαと共に3日間培養した単球は、抗原を捕捉でき免疫応答を誘導できる2つの樹状細胞サブセットを生じる
GM−CSFおよびTNFαと共に3日間培養した単球から発生した2種のDC
枯渇により単球を単離し、GM−CSF/IL−4またはGM−CSF/TNFαの一方と共に3日間培養した。GM−CSF/IL−4培養物およびGM−CSF/TNFα培養物の両方が典型的な樹状細胞の形態を示し、その形態は位相差顕微鏡生細胞を観察すると細胞体から多方向に突出した大きく繊細な突起またはベールを特徴的とする(BanchereauおよびSteinman、1998)。培養した単球はサイトカインの刺激を受けて細胞マーカーを作り出す。蛍光色素で標識したモノクローナル抗体で細胞を染色することによって、これらの新しい細胞マーカーを認めることができ、蛍光顕微鏡で形態および細胞での分布を観察できる。代わりに、細胞集団にある種のマーカーを有する細胞が占める割合を図1A〜1Fのようにフローサイトメトリーで分析できる。

0050

GM−CSFおよびIL−4を加えた対照培養物(以後GM−CSF/IL4−DCと表記)で予想されたように、第3日の細胞はCD14−(ネガティブ)となり、細胞のおよそ50%が、intDCになる運命のDCに分化したことと一致するCD1aの発現を獲得した(図1E)。GM−CSFおよびTNFαを加えた第3日の培養物(以後GM−CSF/TNF−DCと表記)はそれとは異なり、CD1aまたはCD14を主に発現する2つの別々の細胞集団が観察された。CD1a+CD14−およびCD1a−CD14+細胞は、細胞集団のそれぞれおよそ20%および24%となり、それぞれランゲルハンスDCおよびintDCを表している(図1B)。

0051

ランゲルハンス細胞および間質DCを区別するために別のセットのマーカーを使用できる。ランゲルハンス細胞(LC)はランゲリンマーカーだけを発現し、一方、間質DC(intDC)はDC−SIGNのみを発現する。蛍光色素であるFITC標識DC−SIGNまたはPE−CD207で染色した場合、細胞集団についてこれらの2つのマーカーの存在または不在を検査でき、それらの割合をフローサイトメトリーの援助で計算できる。図2Bに示すように、GM−CSF/TNFαと共に培養した第3日の単球は、ランゲルハンス細胞および間質細胞の両方の形成を示すDC−SIGN(%)およびランゲリン(%)を分別発現する細胞を含んでいた。対照的に、GM−CSF/IL4の存在下で培養した第3日の単球は、FITC−DC−SIGNのみに染色され、PE−CD207/ランゲリンに染色されなかった。これはランゲルハンス細胞だけが発生したことを示している(図2A)。上の結果は、TNFが樹状細胞の2つのサブセット、すなわちランゲルハンス細胞および間質DCに単球の分化を誘導したことを示した。

0052

GM−CSF/TNFαに誘導されたDCは抗原の捕捉に効果的である
本発明は、GM−CSF/TNFαの存在下で発生した樹状細胞がGM−CSF/IL4を用いた現行法と同じく抗原の捕捉に有効であることを示した。

0053

未熟DCの主な機能は、抗原の捕捉および細胞表面への抗原の提示の過程における初発第一ステップとして抗原を捕捉することである。DCは、(1)大きな粒子を捕捉できる食作用または(2)受容体介在性エンドサイトーシスを含めたいくつかの異なる方法により抗原を捕捉する。図3A〜3Fは、GM−CSF/TNFまたはGM−CSF/IL−4の存在下で発生した樹状細胞が可溶性抗原または大きな粒子を捕捉する能力を例示している。可溶性抗原については以前に記載されたようにFITC−標識デキストラン(MolecularProbes、Inc.、ユージーンオレゴン州)を使用した(Cauxら、1997「CD34+hematopoietic progenitorsfrom human cord blood differentiatealong two independent dendritic cell pathways inresponse to granulocyte−macrophage colony−stimulatingfactor plus tumor necrosis factoralpha:II.Functional analysis」、Blood 90:1458〜1470頁)。大きな粒子状抗原については、瀕死の腫瘍細胞(メラノーマまたは乳癌)を回収し、リン酸緩衝生理食塩水PBS)で洗浄し、以前に記載されたようにDNA特異的蛍光色素である7−アミノアクチノマイシン(7−AAD)(SigmaChemical Co.、セントルイス、ミズーリ州)で標識した(Nouri−Shiraziら、2000「Dendriticcells capture tumor cell bodiesand process/presenttheir antigens to elicit primaryimmune responses」、Jlmmunol 165:3797〜3803頁;およびBerardら、2000「Primingof naive CD8 T cells against melanoma antigensusing dendritic cells loaded withkilled allogeneic melanoma cells」、J ExpMed 192:1535〜1544頁)。未熟DCを回収し、洗浄し、蛍光色素フィコエリトリン(BDIS)で慣例的な方法を使って標識した抗CD11cモノクローナル抗体で標識した。染色後、DCを洗浄し2×105細胞/mlの濃度となるよう再懸濁した。濃度1mg/mlのFITC−デキストランを4℃または37℃のいずれかでDC細胞と共培養した。一方、死滅した腫瘍細胞をDC細胞と1:1の比で37℃で1時間共培養した。

0054

DCによるFITC−デキストランまたは7−AAD標識腫瘍細胞体の負荷について、CD11cおよびデキストランに対して(図3A、3B、3Dおよび3E)、またはCD11cおよび7−AADに対して(図3Cおよび3F)ダブルポジティブであるDCの割合をフローサイトメトリーで測定した。第3日のGM−CSF/TNF−DCは、GM−CSF/IL−4−DCと類似したレベルの可溶性抗原(FITC−デキストラン)および粒子状抗原(死滅腫瘍細胞)の両方を捕捉した。

0055

GM−CSF/TNFにより発生した第3日のDCは免疫反応を効果的に開始する
本発明は、GM−CSF/TNF法により発生した第3日のDCがCD4+T細胞およびCD8+T細胞の両方の増殖を誘導することにより免疫反応を効果的に開始することを示した。

0056

抗原の捕捉およびプロセシング後に、未熟DCは成熟し免疫応答を誘導する能力を獲得する。DCは多様なT細胞の生育および活性化を刺激でき、例えばCD8T細胞がMHCクラスI保持DCを経由して細胞傷害性T細胞に、またはCD4+T細胞がMHCクラスII保持DCを経由してヘルパーT細胞になるのを刺激する(BanchereauおよびSteinman、1998)。

0057

増殖アッセイにおいて、GM−CSF/TNFまたはGM−CSF/IL4から発生した第3日のDCを、1穴あたり0〜2500個の段階用量の抗原提示細胞(APC)の入った96穴平板に蒔いた。健康な個体のPBMCをFicollで分離して精製したCD4+細胞およびCD8+細胞を得、種々のモノクローナル抗体を使って他の種類の細胞を枯渇させ(Nouri−Shiraziら、2000「Dendriticcells capture killed tumor cellsand present their antigens toelicit tumor−specificimmune responses」、Jlmmunol 165:3797〜3803頁)、5×104/穴/200μlの密度でDCを含む穴に加えた。培養を4日行った後に、トリチウムチミジン(Wallace、Inc.、ゲーサーズバーグ、メリーランド州)を1μCi/穴の放射能で加えた。平板を16時間後に回収し、製造業者の取扱説明書にしたがって液体シンチグラフィーで取り込まれた放射能を測定した。

0058

図4に示すように、第3日のGM−CSF/TNF−DCは免疫反応を開始できた。これは、GM−CSF/IL4DCと同じくらい効率的に同種CD4T細胞の増殖を誘導することにより実証され、この能力は用量に依存するようである。GM−CSF/TNFαからのDCおよびGM/CSF/IL4からのDCの両方が比較的低細胞数でCD8型T細胞の増殖を刺激できた(図5)。

0059

まとめると、本発明は、GM−CSFおよびTNFαを加えて3日間培養した単球がランゲルハンス細胞およびintDCの両方を産生し、これらのDCは抗原を捕捉し免疫応答を誘導できることを実証した。

0060

ワンステップ・ワクチンは抗原を捕捉でき免疫応答を誘導できる樹状細胞の2つのサブセットを生じる
本発明は、免疫応答能を有するDCをわずか3日で発生できる新規なワンステップ法を提示している。多数のステップと長期の培養とを必要とする、単球から樹状細胞を作製するすでに報告された方法とは対照的に、本発明の方法はGM−CSF/TNFαの存在下で抗原性物質と共に単球を同時培養することを含み、抗原は初期段階でDCに対して提示される。この方法により発生したDCはいくつかの尺度により成熟している:(1)捕捉されプロセシングされた抗原、(2)CD4細胞およびCD8細胞の増殖誘導能、ならびに(3)T細胞に対する抗原提示能。以下に本ワンステップ・ワクチンの種々の態様を記述する。

0061

単球と腫瘍死細胞とを混合し、GM−CSFの存在下で、IL4もしくはTNFαを添加するかまたは添加せずに3日間培養することによって、本ワンステップ・ワクチンが抗原を捕捉する能力を実証した。第3日にギムザ染色した細胞は死滅した腫瘍細胞の捕捉を示した。具体的には、第3日のGM−CSF/TNF培養において未捕捉の腫瘍体はほとんど残っていなかった。

0062

死滅した腫瘍細胞と共に培養した第3日のGM−CSF/TNF細胞はDCの性質を保持し、CD4型図6Aおよび6B)およびCD8型(図7Aおよび7B)両方の同種T細胞の増殖を誘導できた。死滅した腫瘍細胞と共に培養した第3日のGM−CSF/TNF細胞は、抗原の非存在下で発生したDCよりもCD8型T細胞の増殖を刺激する能力が高かった(図7B)。さらに重要なことには、GM−CSF/TNF−DCが同種CD4T細胞の増殖を誘導する能力から実証されるように、それらの細胞は腫瘍細胞抗原を提示できた(図8B)。このワンステップ・ワクチンを介して発生する際に抗原に出会ったDCは、自己CD4T細胞に対する腫瘍細胞抗原の提示がはるかに優れている。

0063

腫瘍体およびGM−CSF/TNFαと共に培養した単球の表現型の詳細な分析は、単球が樹状細胞の2つのサブセット、すなわちランゲルハンス細胞および間質DCに分化する能力を保持していることを示した(図9A〜9L)。単球:腫瘍死細胞比が1:0.1で最適な分化を認めた。1:1および1:0.3のようなそれよりも高い単球:腫瘍体比では、ランゲリンマーカーの存在で実証されるランゲルハンス細胞の比率が減少する。図10A〜10Iに示すように、腫瘍死細胞を第2日に単球培養物に加えることもできる。この場合単球はランゲルハンス細胞およびintDCに分化する。フローサイトメトリーのフォワードスキャッターサイドスキャッタープロットは、細胞集団がランゲルハンス細胞およびintDCの両方を示すCD14+型およびCD1a型の両方を含むことを示す(図10E〜10F)。これらの実験は、第1日または第2日に抗原を加えることが2つの種類の樹状細胞を発生させるプロセスに影響しないことを例示している。さらに、これらの実験は、現行の希釈力価を案内として使用して特定の抗原比を実験的に測定する必要を例示している。

0064

ワンステップ・ワクチンの細胞も免疫エフェクターの混合に対して腫瘍細胞抗原を提示できた。実際、図11に示すように腫瘍死細胞およびGM−CSF/TNFαと共に3日間培養した単球は自己末梢血リンパ球の増殖を誘導できた。この場合、単球:腫瘍体比は1:0.3で最適である。

0065

ワンステップ・ワクチンは細胞傷害性T細胞を誘導してメラノーマを死滅させる
本発明のワンステップ・ワクチンはメラノーマに対して細胞傷害効果を誘導する能力が実証された。抗原性物質としてメラノーマColo829死細胞が単球培養物中に存在したことを除き、ワンステップ・ワクチンの発生を実施例1および2に記載したように行う。

0066

いったん集密になってから、Colo829メラノーマ細胞系を回収し、小フラスコに入れて1×106細胞/mlの密度で培養した。TNF−α(100ng/ml)を用いた感作ステップ後に、細胞を90分間放射線照射し、無血清培地に入れて48時間培養した。FITC−AnnexinVおよびヨウ化プロピジウムを用いた二重染色およびトリパンブルーを用いた排除試験により細胞死を評価した(生存率<25%)。

0067

CTL発生アッセイ。培養を3日間行った後に、自己CD8T細胞および/または自己末梢血リンパ球(PBL)の刺激物質として細胞を使用した。培養物を毎週再刺激し、最初の週にIL−7を、次の週からはIL−2を補充した。メラノーマ細胞を用いた標準クロム放出アッセイでCTL活性を試験し、そのメラノーマ細胞から標的として腫瘍体を発生させた。

0068

最後に、ワンステップ・ワクチンの細胞は、自己CD8T細胞を誘導して抗原として使用したメラノーマ細胞を死滅できるCTLに分化させた(図12A、12B、13A、13B、14Aおよび14B)。抗原(Colo829メラノーマ死細胞)をパルスされなかったワクチンは、K562およびColoメラノーマ腫瘍のうち一方の腫瘍細胞の細胞傷害性T細胞介在性溶解を誘導できなかった。Colo829メラノーマ死細胞でパルスしたワンステップ・ワクチンは、細胞傷害性T細胞の刺激により、対照腫瘍細胞系K562ではなくメラノーマ腫瘍細胞の溶解を選択的に引き起こした。細胞傷害性T細胞の2回刺激は3回刺激と同程度に有効であった(図13Bおよび14B)。さらに、このワンステップ・ワクチンがメラノーマ細胞に仲介される細胞傷害性T細胞を誘導する能力は以前に報告された方法のGM−CSF/IL−4ワクチンと同様であった。

0069

ここに示した方法を用いて、他の種類の腫瘍細胞をDC細胞のパルスに使用でき、そうするとこれらの腫瘍に及ぼす毒性をここに概略を述べたアッセイを用いて測定でき、エフェクター対標的比として最適な比を本明細書において概略を述べた方法および範囲を用いて実験的に決定できよう。全体的にみて、本明細書において提示されたデータから、メラノーマの治療及び根絶においてワンステップ・ワクチンがメラノーマに対して発揮する能力が実証された。さらに、本明細書において概略を述べた方法を用いて、本方法が他の種類の癌を治療する可能性が実証されている。

0070

GM−CSFおよびTNFαと共に3日間培養した単球から得られた樹状細胞のさらなるキャラクタリゼーション
別の研究では、枯渇により単球を単離しGM−CSF/TNFαと共に3日間培養した。生じたGM−CSF/TNF−DCは自己T細胞に抗原を提示できた。図15Dに示すように、Flu−MPペプチドをパルスされたGM−CSF/TNF−DCは1週間培養物中のFlu−MP特異的CD8T細胞の増大を誘導するために有効であった。

0071

さらなる検査で、GM−CSF/TNF−DCは異なる生物的性質を有する別個のサブセットであるLC(CD1a+CD14−CD207+)、intDC(CD1a+CD14+CD207−)およびDN−DC(CD1a−CD14−)からなることが分かった。表示した表面マーカーCD1a(Biosource)、CD207(Beckman−Coulter)、CD14(BDIS)に対する抗体で表面染色しフローサイトメトリー(FACSVantage、BDIS)を用いて選別してこれらのサブセットを分離する。マイクロアレイ分析から、これらのDCサブセットは、独特の生物学的機能に変換されうる独特の分子シグネチャー表出することを確認した。特異的遺伝子ファミリー予備分析は抗原プロセシング分子、ケモカインおよびそれらの受容体、サイトカインおよびそれらの受容体、ならびに接着分子が分別発現していることを示した。分別発現の2、3の例を図16および17に示す。図16に示すように表面表現型と一致してGM−CSF/TNF−DCのCD1a+サブセットは高レベルのCD1aおよびランゲリンmRNA(CD207+)を発現し、ランゲルハンス細胞に分化したことを示す。CD14+サブセットはDC−SIGNのmRNA(CD209+)を発現し、間質DCに分化したことと一致した。DN−DCは選択したマーカーのどれもあまり発現しなかった。図17に示すように、3つのサブセットは異なるサイトカインを発現し、CD1a+DCはTGFαおよびIL−8を専ら発現し、CD14+DCはIL−1を発現した。興味深いことにDN−DCは高レベルのリンホトキシンβ(LTB)のmRNA、およびCD8+エフェクター/記憶T細胞の成熟に必須のサイトカインであるIL−15を発現した。

0072

GM−CSF/TNF−DCの別個のサブセットが異なるT細胞応答を誘導することにより異なる機能を示した。非活性化GM−CSF/TNF−DCの選別後のサブセットを同種ナイーブCD8T細胞またはCD4T細胞と共に培養した。T細胞応答を2つのレベルで分析した:(a)培養5日後の増殖(トリチウムチミジンの取り込み)および(b)Affymetrixマイクロアレイチップを用いた全体的mRNA分析。GM−CSF/TNF−DCの全てのサブセットは同種ナイーブCD8T細胞の活発な増殖を誘導した。全てのサブセットはナイーブCD4T細胞をプライミングすることもできたが、intDC(CD14+)を加えた培養物中のCD4T細胞の増殖はあまり顕著ではなかった(図18)。CD4T細胞における全体的なmRNAの発現の分析は、intDC(CD14+)に対するCD4T細胞応答が他のGM−CSF/TNF−DCサブセットに比べて著しい差を示した。例えばGM−CSF/TNF−DCの別個のサブセットによりプライミングされたCD4T細胞ではケモカイン受容体(CXCR4、CCR5、CCR2、およびCCR7)が分別発現することを観察した(図19)。これは、これらのT細胞が異なる遊走能を表す可能性があることを示している。

0073

GM−CSF/TNF−DCのさらなる検討では、第4のサブセットを(CD1a− CD14+CD209+)とキャラクタリゼーションした。

0074

単球由来ワクチンを用いたメラノーマを有する患者の治療
本発明の単球由来ワクチンを用いてメラノーマを有する患者の治療を実証するために、CD34+前駆細胞由来DCを用いた治験と類似したプロトコルで、生検により証明されたステージIVのメラノーマを有する患者にワクチンを投与する(Banchereauら、2001「Immune andclinical responses in patients withmetastatic melanoma to CD34(+)progenitor−derived dendritic cell vaccine」、CancerRes 61:6451〜6458頁)。

0075

ワクチンを調製するために、Ficoll−Paque密度勾配遠心分離により各患者の末梢血から単球を単離し、枯渇法または接着法により濃縮し、GM−CSFおよびTNFαを含む培地を入れたマイクロプレートに蒔く。以下の方法の1つによりワクチンを作製する:(1)第1日に当技術分野で公知の好ましい方法により(Colo829細胞系またはそれぞれの患者からの)メラノーマ細胞を死滅させ、単球およびGM−CSF/TNFαを含む培地に加える、(2)第1日に全ての細胞にキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を曝露し、細胞のサブセットすなわち20%に限定的なインフルエンザマトリックスペプチド(Flu−MP)をパルスし、残りの細胞(すなわち80%)にMalanA/MART−1、チロシナーゼ、MAGE−3およびgp100のような4つのメラノーマ抗原に由来するペプチドをパルスする、(3)第2日に放射線照射により(Colo829細胞系またはそれぞれの患者からの)メラノーマ細胞を死滅させ、単球およびGM−CSF/TNFαを含む培地に加える、または(4)第2日に全ての細胞にキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を曝露し、細胞のサブセットすなわち20%に限定的なインフルエンザマトリックスペプチド(Flu−MP)をパルスし、残りの細胞(すなわち80%)にMalanA/MART−1、チロシナーゼ、MAGE−3およびgp100のような4つのメラノーマ抗原に由来するペプチドをパルスする。培養第3日に抗原負荷した抗原提示細胞を回収し、洗浄し、ワクチンに製剤化する。次に実施例1および2に十分定義された方法を用いて以下を含めるがそれに限定されない基準により患者に使用する前にワクチンを評価する:DCの形態、表現型分析により測定された細胞調製物中のDC最小値が少なくとも20%であること(残りの部分はDC前駆体などを含む)、ならびに/または細胞マーカーを決定するためのモノクローナル抗体パネルとの反応性および/もしくはリンパ球の反応を刺激する能力。

0076

6週間の外来患者コースで本発明のワクチンを用いて患者を治療し、14日毎に合計4回ワクチン接種する。患者のおよび上腕を含めた3つの注射部位にワクチンを投与する。ワクチン接種前の少なくとも2時点、ならびにワクチン接種の各回後5および/または14日ならびに4回目のワクチン接種後14または28日に免疫モニタリングを行う。治験前および4回目のワクチン接種後4週間目に全ての患者について腫瘍状態評定を行う。疾患の進行を標的病巣での25%を超える増加および/または新しい病巣の出現と定義する。患者の応答の分析をいくつかの群、すなわち少なくとも1つのメラノーマ抗原に対する応答、多数のメラノーマ抗原に対する応答、死滅したメラノーマ全細胞に対する応答、ならびにKLHおよびFlu−MPのような対照抗原に対する応答に分割する。免疫応答は腫瘍の進行データと相関する。

0077

単球由来の抗原負荷した抗原提示細胞を用いた抗原特異的非応答性の誘導
本発明にしたがって作製した樹状細胞に抗原性物質を負荷する。その物質に対してT細胞を非応答性にできる。この方法では、GM−CFSおよびTNFαにより発生した抗原負荷したDCのCD14+CD1a−サブセットをT細胞に曝露する。このようにして、T細胞は抗原を認識できるが、非応答性になり同抗原で再刺激した場合に増殖できない。

0078

Ficollで分離した健康被験者のPBMCから精製CD4+T細胞を得て、CD8モノクローナル抗体(mAb)(B9.11)、CD14mAb(RMO52)、CD16mAb(3G8)、CD19mAb(J4.119)、CD56mAb(NKH−1)、抗HLA−DRmAb(B8.12.2)、抗グリコホリンA mAb(D2.10)(Beckman−Coulter、マイアミ、フロリダ州)およびヤギ抗マウスIgGDynabeads(Dynal、レークサクセス、ニューヨーク州)を用いて他の細胞を枯渇させる。濃縮後の細胞集団の純度は>90%であった。抗原負荷したDCを調製し、本明細書に記載したようにナイーブCD4T細胞の刺激に使用した。

0079

本明細書に記載したようにTNFαおよびGM−CSFを用いて調製した単球由来DCのCD14+CD1a−サブセットと共に24穴平板で精製CD4+T細胞(106/穴)を共培養する。その5日後にT細胞を回収し、洗浄し、さらに2日間休止させる。増殖アッセイでは初代培養からのT細胞に適当な抗原を再攻撃誘発し、トリチウムチミジン(最終16時間に1μCi/穴)の取り込みから増殖を測定する。

0080

まとめると、本発明は3日で樹状細胞ワクチンを作製する方法である。好ましい方法では、ワンステップで樹状細胞を発生させ抗原を負荷し、抗原負荷した樹状細胞ワクチンが3日で利用できる。別の方法では、樹状細胞の発生および抗原負荷をツーステップで実施し、抗原負荷した樹状細胞ワクチンを3日で利用できる。好ましい方法では、血中白血球搬出で樹状細胞ワクチンを調製する。別の好ましい方法では、血液ユニットからワクチンを調製する。好ましい方法では、サイトカインを模倣する化学物質/ペプチド/ペプトイドを前駆体に曝露することによってワクチンを作製できる。別の好ましい方法では、単球からのサイトカイン放出を誘発する分子および/または粒子を用いてワクチンを作製できる。本発明の好ましい方法にしたがって作製された樹状細胞ワクチンは、TNFαを含めるがそれに限定されない活性化物質を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)を含めるがそれに限定されない増殖因子と好ましくは組み合わせて用いて、インターロイキン4およびインターロイキン13のどちらも用いずに単球から得られる。好ましくは本発明の好ましい方法にしたがって製造された樹状細胞ワクチンは、ランゲルハンス細胞を含み、TNFαを含めるがそれに限定されない活性化物質を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)を含めるがそれに限定されない増殖因子と好ましくは組み合わせて用いて、インターロイキン4、形質転換増殖因子β、およびインターロイキン15のいずれも用いずに単球から得られる。抗原負荷に関しては、本発明の樹状細胞ワクチンは、免疫複合体のような可溶性タンパク質または腫瘍死細胞を含めるがそれに限定されない可溶性または粒子状抗原性物質を好ましくは負荷している。別の方法では、本発明の樹状細胞ワクチンはエキソソームを用いて負荷している。

0081

これらの方法にしたがって、生じたワクチンは、ランゲルハンス細胞および間質樹状細胞を含めるがそれに限定されない血液前駆体からの樹状細胞の2つのサブセットから好ましくは構成される。以下を含めるがそれに限定されない多様な目的に本発明の方法にしたがって製造された樹状細胞ワクチンを使用できる:(1)癌、感染症ウイルス性疾患、および自己免疫疾患を含めるがそれに限定されない疾患の治療、(2)エキソソームの発生、(3)in vitroアッセイでの腫瘍特異的免疫応答のモニタリング、および(4)in vitroアッセイでの抗原特異的免疫応答のモニタリング。

0082

本発明は、ワンステップ3日の樹状細胞ワクチンをin vitroまたはin vivoで用いて腫瘍細胞に対する細胞傷害性免疫応答を誘導する方法でもある。本発明の方法にしたがって、分配された腫瘍抗原または多数の腫瘍抗原に対して細胞傷害性免疫応答を誘導することができる。生じた免疫エフェクター細胞はCD4ポジティブ細胞、CD8ポジティブ細胞、ナチュラルキラー細胞またはナチュラルキラーT細胞でありうる。好ましい方法では、in vivoで免疫エフェクター細胞を発生させる。別の好ましい方法では、ex vivoで免疫エフェクター細胞を発生させ患者に投与する。別の好ましい方法では、in vitro研究目的で免疫エフェクター細胞を発生させる。

図面の簡単な説明

0083

FSCSSC、CD1a/CD14、およびCD1a/HLA−DRに関して、GM−CSF/TNFαと共に培養した単球の第3日の表現型(図1A〜1C)を、GM−CSF/IL−4と共に培養した単球(図1D〜1F)と比較した図である。GM−CSFおよびIL−4を加えた対照培養で予想されるように、細胞はCD14ネガティブになり、細胞のおよそ50%がDCへの分化と一致するCD1aの発現を獲得した(図1E)。しかし、GM−CSFおよびTNFαを伴う第3日の培養物では2つの別々の細胞集団であるCD1a+CD14−細胞(20%)およびCD1a−CD14+細胞(24%)がみられた(図1B)。
それぞれ間質DC(intDC)およびランゲルハンス細胞(LC)の表面マーカーであるDC−SIGNおよびランゲリンの発現に関して、GM−CSF/TNFαと共に培養した第3日の単球の表現型(図2B)を、GM−CSF/IL−4と共に培養した単球(図2A)と比較した図である。TNF培養物はDC−SIGNおよびランゲリンを分別発現する細胞を含んでいた。TNF−DCとは逆に、IL4−DCは均質で大部分の細胞がintDCへの分化と一致するDC−SIGN+ランゲリン−であった。
GM−CSF/TNFαと共に3日間単球を培養することによって発生した樹状細胞の抗原捕捉の有効性を、GM−CSF/IL−4処理法により作製した樹状細胞と比較した図である。TNF−DCは可溶性抗原(FITC−デキストラン)(図3A〜3B)および粒子状抗原(死滅した腫瘍細胞)(図3C)の両方の捕捉においてGM−CSF/IL−4DCと同様の有効性を示した(可溶性FITC−デキストランを図3Dおよび3Eに、粒子状抗原を図3Fに示す)。
同種CD4T細胞の増殖誘導により実証される第3日のGM−CSF/TNF DCが免疫応答を開始する能力をGM−CSF/IL−4 DCと比較した図である。第3日のGM−CSF/TNFDCおよびGM−CSF/IL−4 DCの両方がCD4T細胞の増殖を誘導する能力を実証した。
第3日のGM−CSF/TNF DCが同種CD8T細胞の増殖を誘導する能力をGM−CSF/IL−4 DCと比較した図である。第3日のGM−CSF/TNFDCおよびGM−CSF/IL−4 DCの両方がCD8T細胞の増殖を誘導する能力を実証した。
腫瘍死細胞の存在下または非存在下で、GM−CSF/TNFα(図6B)またはGM−CSF/IL−4(図6A)の一方と共に3日間培養した単球が、同種CD4T細胞の増殖を誘導する能力を示す図である。第3日のGM−CSF/TNFα/腫瘍死細胞のワンステップ・ワクチンは同種CD4T細胞の増殖を誘導できた。
腫瘍死細胞の存在下または非存在下で、GM−CSF/TNFα(図7B)またはGM−CSF/IL−4(図7A)の一方と共に3日間培養した単球が、同種CD8T細胞の増殖を誘導する能力を示す図である。第3日のGM−CSF/TNFα/腫瘍死細胞のワンステップ・ワクチンは同種CD8T細胞増殖を誘導できた。
腫瘍死細胞の存在下または非存在下で、GM−CSF/TNFα(図8B)またはGM−CSF/IL−4(図8A)の一方と共に3日間培養した単球が、自己CD4T細胞に腫瘍細胞抗原を提示する能力を示す図である。第3日のGM−CSF/TNFα/腫瘍死細胞のワンステップ・ワクチンは、自己CD4T細胞の増殖を誘導できることから実証されるように、自己CD4T細胞に腫瘍細胞抗原を提示できた。
死滅した腫瘍細胞の存在下または非存在下で、GM−CSF/TNFαと共に3日間培養した単球が、樹状細胞の2つのサブセット、すなわちランゲルハンス細胞(ランゲリン+およびDC−SIGN−)および間質樹状細胞(ランゲリン+およびDC−SIGN+)に分化する能力を示す図である。腫瘍体のタイトレーションは単球:腫瘍体比1:0.1で最適な分化を示す(図9L)。
単球培養の第2日に段階用量で加えた腫瘍死細胞の存在下で、GM−CSF/TNFαと共に3日間培養した単球が、樹状細胞の2つのサブセット、すなわちランゲルハンス細胞(ランゲリン+およびDC−SIGN−)および間質樹状細胞(ランゲリン+およびDC−SIGN+)に分化する能力を示す図である。
腫瘍死細胞の存在下または非存在下で、GM−CSF/TNFαと共に3日間培養した単球が、自己免疫エフェクター(末梢血リンパ球)に腫瘍細胞抗原を提示する能力を示す図である。単球:腫瘍体比1:0.3で最適な提示が観察される。
腫瘍死細胞の存在下(図12B)または非存在下(図12A)で、GM−CSF/TNFαと共に3日間培養した単球が、自己CD8+T細胞から、培養2週間後ですでにメラノーマ細胞を死滅できる細胞傷害性T細胞(CTL)への分化を誘導する能力を示す図である。
腫瘍死細胞の存在下(図13B)または非存在下(図13A)で、GM−CSF/TNFαと共に3日間培養した単球が、自己CD8+T細胞から、3回の刺激でメラノーマ細胞を死滅できる細胞傷害性T細胞(CTL)への分化を誘導する能力を示す図である。
腫瘍死細胞の存在下(図14B)または非存在下(図14A)で、GM−CSF/IL−4と共に3日間培養した単球が、自己CD8+T細胞から、2回の刺激でメラノーマ細胞を死滅できる細胞傷害性T細胞(CTL)への分化を誘導する能力を示す図である。
GM−CSF/TNFα DCがペプチド特異的リコールCD8T細胞応答を誘導する能力を示す図である。Flu−MPペプチドをパルスしたGM−CSF/IL−4DCまたはGM−CSF/TNFα DCを自己CD8T細胞と共に1:10の比で、サイトカインを補充して(IL−7およびIL−2、10U/ml)培養した。第10日に抗CD8(横座標)およびFlu−MP四量体縦座標)でT細胞を標識し、特異的CD8T細胞の増大を測定した。Flu−MPペプチドをパルスしたGM−CSF/TNFα DCは、10日培養物中でFlu−MP特異的CD8T細胞の増大の誘導に有効であることが示される(図15D)。
GM−CSF/TNFα DCの別個のサブセットの表面表現型に関してDCの遺伝子発現パターンを示す図であり、CD14+intDC(横縞)、CD1a+LC(水玉)およびCD14−CD1a−DN−DC(縦縞)について表示した遺伝子(横座標)の発現倍率(縦座標)を示している。これらのDCサブセットの間で分別発現する統計的に有意な遺伝子から、表示した遺伝子CD1a、DC−SIGN(CD209とも知られている)、およびランゲリン(CD207としても知られている)を選択した。CD14+サブセットは、intDCであることを示すDC−SIGNを発現した。CD1a+サブセットはLCであることを示すランゲリンを発現した。DN(ダブルネガティブ)サブセットは選択したマーカーのいずれもあまり発現しなかった。
GM−CSF/TNFα DCの別個のサブセットのサイトカインmRNAの分別発現を示す図であり、CD14+intDC(横縞)、CD1a+LC(水玉)およびCD14−CD1a−DN−DC(縦縞)について表示した遺伝子(横座標)の発現倍率(縦座標)を示している。DCサブセットはサイトカインIL−1、IL−15、IL−8、LTB(リンホトキシンβ)およびTGFA(形質転換増殖因子α)の有意に異なる発現を示し、CD14+サブセットはIL−1を発現し、CD1a+DCサブセットは専らTGFAおよびIL−8を発現し、DNサブセットはIL−15およびLTBを発現した。
GM−CSF/TNFα DCサブセットがナイーブ同種CD4T細胞の著しい増殖を誘導する能力を示す図である。DCの総培養物または選別したサブセットをナイーブ(CD45RA+CCR7+CD45RO−)CD4+T細胞と共に段階的な用量(横座標)で平板培養する。第5日にチミジンの取り込み(縦座標)により増殖を測定する。全てのサブセットがナイーブCD4T細胞をプライミングできたが、intDC(CD14+)を加えた培養ではCD4T細胞の増殖はあまり顕著ではない。
GM−CSF/TNFα DCの別個のサブセットでプライミングしたCD4T細胞におけるケモカイン受容体の分別発現を示す図であり、intDC(CD14、横縞)、CD1aDC(LC、水玉)またはDN−DC(縦縞)を加えた培養における発現倍率(縦座標)を示している。

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