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技術 液体クロマトグラフィー用アニオン交換体

出願人 東ソー株式会社
発明者 村中和昭藤井智
出願日 2012年4月11日 (8年2ヶ月経過) 出願番号 2012-090113
公開日 2013年10月24日 (6年8ヶ月経過) 公開番号 2013-216821
状態 未査定
技術分野 クロマトグラフィによる材料の調査、分析 高分子物質の処理方法 高分子成形体の製造 イオン交換
主要キーワード シード溶液 エポキシ部位 非多孔性粒子 弱アルカリ性条件下 弱アルカリ条件下 改善要求 非多孔性基材 イオン交換基密度
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図面 (3)

課題

分離、分析する対象に対して高い保持力を有する、十分な対象の吸着容量を有する、高い分離能を有する、機械強度を有する、低操作圧である、そしてアルカリ定性である液体クロマトグラフィーアニオン交換体を提供する提供する。

解決手段

非多孔性粒子の表面に、四級アミノ基が導入されたポリアリルアミンが固定されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用アニオン交換体により、前記課題を解決する。

概要

背景

アニオン交換クロマトグラフィーアニオン交換体には、(1)試料中に含まれる塩濃度の影響を受けにくくするために、タンパク質等の対象物質(以下単に「対象」ということがある)に対して高い「保持力」を有すること、(2)微量成分の分離性能を保つために十分な対象の「吸着容量」を有すること、(3)分離・分析精度向上のために高い「分離能」を有すること、(4)分離・分析時間短縮のために速い操作流速で使用できること(速い操作流速に伴う高圧に耐えるための「機械強度」を有すること)、(5)操作流速の低下を招かないこと(「低操作圧」であること)、そして、対象をイオン解離させる目的で中性から弱アルカリ性溶離条件を使用するため、(6)弱アルカリ性条件下にて安定であること(「アルカリ定性」)が要求される。

従来、上記(3)の改善を目的として、粒子拡散が無い非多孔性の粒子を使用すること(非特許文献1)や粒径10μm程度のアニオン交換体を使用することが提案されており、粒径については近年、更に微粒子化が進み、粒径5μm以下の交換体が実用化されている。アニオン交換体の微粒子化に伴い、操作圧を高圧化しないと分離・分析時間は長時間化するが、操作圧を高圧化するにあたり、アニオン交換体には100MPaに耐えうる機械的強度も求められている。

合成ポリマー骨格とする非多孔性の粒子(合成ポリマー粒子)を用いたアニオン交体は、上記(3)の改善要求にこたえることが可能(非特許文献1)であり、同時に上記(4)や(6)をも満足し得るものであるが、合成ポリマー粒子にアニオン交換基を導入するにあたり、一般的なリガンドアミノ基)導入法(特許文献1、特許文献2、特許文献3)を適用すると、上記(1)又は(2)の点で十分なアニオン交換体を提供することは困難である。

すなわち合成ポリマーは、通常、後に粒子表面にイオン交換基を導入するための官能基を有したモノマーと、粒子の機械的強度を高めるための、多官能飽和架橋性モノマー共重合体を用いることが一般的である。粒子の機械的強度を高くするために多官能不飽和架橋性モノマーを多く使用すると粒子表面の官能基量が減ってしまい、結果的に粒子表面に十分な量のイオン交換基を導入することができなくなって粒子表面のイオン交換基密度下がり、保持力が十分ではなく(上記(1)が達成できない)、さらに非多孔性であるがゆえの小表面積に起因して特にタンパク質や核酸等の生体高分子に対する吸着容量を大きくできず、上記(2)が損なわれ、結果的に対象の溶出ピークブロード化してしまうという課題がある。

上記(1)や(2)の改善方法として、例えばイオン交換能を有するビニルポリマー鎖を粒子表面にグラフとして担持させる方法等が提案されている(特許文献4から7)。しかし、グラフト結合によってポリマー鎖を粒子表面に導入すると、操作圧が高くなり、上記(5)に反して操作流速の低下を招くという課題がある。また細孔内に水溶性ポリマー固定化する方法も提案されている(特許文献8)が、非多孔性粒子には適用することができない。

上記(2)と(5)を改善する目的で、粒子表面にポリエチレンイミン等を固定したアニオン交換体(特許文献9)、粒子表面に緩く架橋したイオン交換膜を作製したアニオン交換体(特許文献10、11)、粒子表面とポリマー鎖等をポリオールグリシジル付加物を介して結合したアニオン交換体(特許文献12)も提案されている。しかし、ポリエチレンイミンを固定したものではpHによるアニオン交換基の解離度変化が小さい四級アミノ基を導入することが困難であるほか、いずれの提案も、上記(3)の改善を目的として微粒子化された粒子に適用すると、操作圧が高くなり、上記(5)に反して操作流速の低下を招くという課題がある。

概要

分離、分析する対象に対して高い保持力を有する、十分な対象の吸着容量を有する、高い分離能を有する、機械強度を有する、低操作圧である、そしてアルカリ安定性である液体クロマトグラフィー用アニオン交換体を提供する提供する。非多孔性粒子の表面に、四級アミノ基が導入されたポリアリルアミンが固定されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用アニオン交換体により、前記課題を解決する。 なし

目的

合成ポリマーを骨格とする非多孔性の粒子(合成ポリマー粒子)を用いたアニオン交体は、上記(3)の改善要求にこたえることが可能(非特許文献1)であり、同時に上記(4)や(6)をも満足し得るものであるが、合成ポリマー粒子にアニオン交換基を導入するにあたり、一般的なリガンド(アミノ基)導入法(特許文献1、特許文献2、特許文献3)を適用すると、上記(1)又は(2)の点で十分なアニオン交換体を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
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請求項1

非多孔性粒子の表面に、四級アミノ基が導入されたポリアリルアミンが固定されていることを特徴とする液体クロマトグラフィーアニオン交換体

請求項2

非多孔性粒子が、単官能性ビニルモノマー多官能性ビニルモノマー共重合体からなり、その粒径が5μm以下である、請求項1記載の液体クロマトグラフィー用アニオン交換体。

請求項3

ポリアリルアミンの分子量が3,000以上、15,000以下であることを特徴とする請求項1記載の液体クロマトグラフィー用アニオン交換体。

請求項4

ポリアリルアミンの導入量が、非多孔性粒子の30重量%以下であることを特徴とする請求項1乃至3に記載の液体クロマトグラフィー用アニオン交換体。

請求項5

請求項1乃至4のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用アニオン交換体を充填して成る液体クロマトグラフィー用カラム

技術分野

0001

本発明は、非多孔性粒子の表面に、四級アミノ基が導入されたポリアリルアミンが導入されていることを特徴とするアニオン交換体に関するものである。

背景技術

0002

アニオン交換クロマトグラフィー用アニオン交換体には、(1)試料中に含まれる塩濃度の影響を受けにくくするために、タンパク質等の対象物質(以下単に「対象」ということがある)に対して高い「保持力」を有すること、(2)微量成分の分離性能を保つために十分な対象の「吸着容量」を有すること、(3)分離・分析精度向上のために高い「分離能」を有すること、(4)分離・分析時間短縮のために速い操作流速で使用できること(速い操作流速に伴う高圧に耐えるための「機械強度」を有すること)、(5)操作流速の低下を招かないこと(「低操作圧」であること)、そして、対象をイオン解離させる目的で中性から弱アルカリ性溶離条件を使用するため、(6)弱アルカリ性条件下にて安定であること(「アルカリ定性」)が要求される。

0003

従来、上記(3)の改善を目的として、粒子拡散が無い非多孔性の粒子を使用すること(非特許文献1)や粒径10μm程度のアニオン交換体を使用することが提案されており、粒径については近年、更に微粒子化が進み、粒径5μm以下の交換体が実用化されている。アニオン交換体の微粒子化に伴い、操作圧を高圧化しないと分離・分析時間は長時間化するが、操作圧を高圧化するにあたり、アニオン交換体には100MPaに耐えうる機械的強度も求められている。

0004

合成ポリマー骨格とする非多孔性の粒子(合成ポリマー粒子)を用いたアニオン交体は、上記(3)の改善要求にこたえることが可能(非特許文献1)であり、同時に上記(4)や(6)をも満足し得るものであるが、合成ポリマー粒子にアニオン交換基を導入するにあたり、一般的なリガンド(アミノ基)導入法(特許文献1、特許文献2、特許文献3)を適用すると、上記(1)又は(2)の点で十分なアニオン交換体を提供することは困難である。

0005

すなわち合成ポリマーは、通常、後に粒子表面にイオン交換基を導入するための官能基を有したモノマーと、粒子の機械的強度を高めるための、多官能飽和架橋性モノマー共重合体を用いることが一般的である。粒子の機械的強度を高くするために多官能不飽和架橋性モノマーを多く使用すると粒子表面の官能基量が減ってしまい、結果的に粒子表面に十分な量のイオン交換基を導入することができなくなって粒子表面のイオン交換基密度下がり、保持力が十分ではなく(上記(1)が達成できない)、さらに非多孔性であるがゆえの小表面積に起因して特にタンパク質や核酸等の生体高分子に対する吸着容量を大きくできず、上記(2)が損なわれ、結果的に対象の溶出ピークブロード化してしまうという課題がある。

0006

上記(1)や(2)の改善方法として、例えばイオン交換能を有するビニルポリマー鎖を粒子表面にグラフとして担持させる方法等が提案されている(特許文献4から7)。しかし、グラフト結合によってポリマー鎖を粒子表面に導入すると、操作圧が高くなり、上記(5)に反して操作流速の低下を招くという課題がある。また細孔内に水溶性ポリマー固定化する方法も提案されている(特許文献8)が、非多孔性粒子には適用することができない。

0007

上記(2)と(5)を改善する目的で、粒子表面にポリエチレンイミン等を固定したアニオン交換体(特許文献9)、粒子表面に緩く架橋したイオン交換膜を作製したアニオン交換体(特許文献10、11)、粒子表面とポリマー鎖等をポリオールグリシジル付加物を介して結合したアニオン交換体(特許文献12)も提案されている。しかし、ポリエチレンイミンを固定したものではpHによるアニオン交換基の解離度変化が小さい四級アミノ基を導入することが困難であるほか、いずれの提案も、上記(3)の改善を目的として微粒子化された粒子に適用すると、操作圧が高くなり、上記(5)に反して操作流速の低下を招くという課題がある。

0008

米国特許3905954
米国特許3573277
特表8−503161
米国特許5453186
米国特許3723306
特公昭57−23694
特公昭57−58373
特開2008−232764
特開2002−210377
特開2002−219367
特開2009−113034
特開平5−64748

先行技術

0009

High−performance ion−exchange chromatography of proteins on non−porous ion exchangers, Journal of Chromatography A Volumn398, 1987, Page 327−334

発明が解決しようとする課題

0010

本発明の目的は、上記(1)から(6)の要請応え、対象に対して高い保持力を有する、十分な対象の吸着容量を有する、高い分離能を有する、機械強度を有する、低操作圧である、そしてアルカリ安定性である液体クロマトグラフィー用アニオン交換体を提供することにある。

課題を解決するための手段

0011

前記課題を解決するためになされた本発明の液体クロマトグラフィー用アニオン交換体は、非多孔性粒子の表面に、四級アミノ基が導入されたポリアリルアミンが導入されていることを特徴とするものである。以下、本発明を詳細に説明する。

0012

本発明のアニオン交換体は、上記(3)の分離能の向上のため、非多孔性粒子を基材とするものである。本発明における「非多孔性」とは、微孔が存在しない粒子のみならず、アニオン交換体を用いて分離等しようとする対象が入り込めないサイズの孔がある粒子をも意味する。なお、粒子の孔のサイズを制御する方法は、例えばUS4382124等、従来から公知である。

0013

非多孔性粒子は、例えば無機基材(例えば、シリカジルコニアアルミナ等)や、有機基材(例えば、架橋多糖や、アクリルアミドアクリルテルスチレン等のビニルモノマー架橋体)であれば良い。粒子は、例えば特公昭58−058026や特開昭53−090991に開示されたような、単官能ビニルモノマーグリシジルメタクリレートビニルベンジルグリシジルエーテル等)と、多官能ビニルモノマーエチレングリコールジメタクリレートポリエチレングリコールジメタクリレートグリセンポリメタクリレートジビニルベンゼン等)を組み合わせた混合液懸濁重合により製造する方法、例えば特開2001−002716に記載されたようなシード重合により製造する方法によって製造することができる。

0014

非多孔性粒子としては、上記(6)のアルカリ安定性(中・弱アルカリ性のpH領域で安定であること)の達成、および、上記(4)の機械的強度の確保という観点から、非多孔性粒子は有機基材であることが好ましく、特にアクリルアミド、アクリルエステル及びスチレン等のビニルモノマー架橋体が好ましい。特に、単官能ビニルモノマーと多官能ビニルモノマーの共重合体を好適な基材として例示できるが、当該共重合体において単官能性ビニルモノマー由来構造単位が下記式(1)で示されるものが特に好ましい(式中、R1は水素原子又はCH3を表す。R2は、ポリオキシアルキレン結合を介して、又は直接導入されたポリアリルアミンへの結合を表す)。

0015

単官能ビニルモノマーと多官能ビニルモノマーの共重合体を基材とする場合、多官能ビニルモノマーの割合は5重量%以上とすることが好ましい。また、後述するように、ポリアリルアミンを非多孔性粒子に固定するために非多孔性粒子は官能基を有していることが必要であるが、かかる官能基を十分に確保するために、多官能性ビニルモノマーの割合は50重量%以下とすることが好ましい。例えば前記したビニルモノマー架橋体である場合には、エポキシ部位加水分解して開環し、水溶性多価アルコール等で親水化を行うことにより、表面に水酸基を有する粒子を得ることが可能であり、グリシジルメタクリレート等のエポキシ基を有する単官能性ビニルモノマーと多官能ビニルモノマーとの共重合体であればエポキシ基を直接利用する使用することが可能であり、また水酸基を有する非多孔性粒子であれば、例えばエピクロルヒドリンエチレングリコールジグリシジルエーテル等の多官能エポキシ化合物などを既知の方法でエポキシ基を導入することが可能である。

0016

本発明のアニオン交換体では、上記(3)の分解能を更に向上するために、粒子径が5μm以下の非多孔性粒子を使用することが好ましい。

0017

本発明のアニオン交換体は、アニオン交換基として四級アミノ基を導入したポリアリルアミンを固定化したものであるが、ポリアリルアミンは、好ましくはその構造単位が、下記式(2)で示されるものを例示できる([式中、nはポリアリルアミン主鎖の繰り返し数を表す)。

0018

本発明に使用するポリアリルアミンは、上記(2)の吸着容量確保の観点や、非多孔性粒子に固定するためのアミノ基と四級アミノ基を導入するためのアミノ基の両者を十分量提供するためには高分子量のものが好ましい一方で、上記(5)の低操作圧を達成する観点からは低分子量のものが好ましい。従って、両者を比較考量して決定すれば良いが、分子量3,000から15,000のものが特に好ましい。このような分子量を有するポリアリルアミンは、従来から市販されているものを使用することができる。なお、従来から市販されているポリアリルアミンはポリアリルアミンアミド硫酸塩重合体など、多種多様であるが、後述する四級アミノ基の導入のため、アリルアミン塩酸塩重合体又はアリルアミンホモ重合体を用いることが好ましい。

0019

非多孔性粒子に対するポリアリルアミンの導入量としては、上記(5)の低操作圧を達成する観点から上記したように分子量3,000から15,000の範囲のものを使用する場合には非多孔性粒子の30重量%以下とすることが好ましく、さらに好ましくは0.4から10重量%である。

0020

本発明のアニオン交換体は、まずポリアリルアミンのアミノ基の一部に四級アミノ基を導入し、次に非多孔性粒子に固定する方法や、まずポリアリルアミンを非多孔性粒子に固定し、次に固定されたポリアリルアミン中に残存する未反応のアミノ基に四級アミノ基を導入する方法のいずれを用いても製造することができる。しかし、上記(5)の低操作圧の達成のためには、非多孔性粒子とポリアリルアミンをまず結合させ、残存するポリアリルアミンのアミノ基に四級アミノ基を導入することが好ましい。

0021

ポリアリルアミンに四級アミノ基を導入する方法としては、アルキル化剤ヨウ化メチルヨウ化エチルブロモメタンブロモエタンブロモエタノールクロロエタンクロロエタノール等のハロゲン化アルキル硫酸ジメチル等)を用い、ポリアリルアミンの有するアミノ基を直接アルキル化することにより四級アミノ化する方法、四級アミノ基を有する反応性化合物(例えば、グリシジルトリメチルアンモニウム、3−クロロ−2−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム等)をポリアリルアミンのアミノ基に導入する方法を例示できる。四級アミノ基を有する反応性化合物を用いる方法は、反応溶媒として水を用いることができることや、水酸化ナトリウム等をもちいて弱アルカリ性とすることで簡単に反応を進行させることが可能なこと、使用する薬剤の毒性が低いこと、使用する薬剤の沸点が高く取扱いが容易であること、疎水性の上昇を抑えられること、等から、本発明のアニオン交換体を製造する方法として特に好ましい。

0022

非多孔性粒子にポリアリルアミンを固定した後に四級アミノ基を導入する場合も、前記と同様の方法を使用することができるが、この場合には、多孔性粒子に固定したポリアリルアミンに含まれるアミノ基に対し、過剰量の薬剤を使用すれば良い。

0023

非多孔性粒子にポリアリルアミンを固定するためには、非多孔性粒子表面にポリアリルアミンが有するアミノ基と結合する官能基を導入し、両者を結合すれば良い。アミノ基と結合し得る官能基としては、カルボン酸基ホルミル基ハロゲン化アルキル基、エポキシ基等を例示できる。ビニルモノマー架橋体を基材とする非多孔性粒子であれば、前述したようにエポキシ部位を加水分解して開環し水溶性の多価アルコール等で親水化を行うことで水酸基を導入することが可能であり、他の官能基についても公知の方法によって導入することが可能である。カルボン酸基であれば加熱又は水溶性カルボジイミド等の縮合剤を用いアミド結合を生成させることにより、ホルミル基であればシアノ水素化ホウ素ナトリウムピリジンボラン等の還元剤で処理することでアルキルアミノ基として、ハロゲン化アルキル基やエポキシ基であれば弱塩基性条件化でアルキルアミノ基又はヒドロキシアルキルアミノ基として、ポリアリルアミンを非多孔性粒子に固定できる。非多孔性粒子に対して導入しやすいことや、特別の触媒を必要とせず、温和な条件下水溶媒で固定可能なエポキシ基を利用してポリアリルアミンを非多孔性粒子に導入することが特に好ましい。

発明の効果

0024

本発明のアニオン交換体は、非多孔性粒子を基材とするから、分離・分析精度向上のため高い分離能を達成することができる。特に5μm以下という微粒子を基材とする場合には更に高い分離能を実現でき、ビニルモノマー架橋体を基材とする場合には100MPaに耐えうる機械強度とともに、弱アルカリ条件下での安定性も実現できる。

0025

本発明のアニオン交換体は、基材に直接リガンドを導入したものではなく、ポリアリルアミンを介してリガンドを導入したものであるため、前記したビニルモノマー架橋体を基材とした場合にも、対象に対する高い保持力と十分な吸着容量を達成すると同時に、低操作圧をも達成できる。

0026

このように本発明のアニオン交換体は、(1)試料中に含まれる塩濃度の影響を受けにくくするために、対象に対して高い保持力を有し、(2)微量成分の分離性能を保つために十分な対象の吸着容量を有し、(3)分離・分析精度向上のために高い分離能を有し、(4)分離・分析時間短縮のために速い操作流速で使用でき(速い操作流速に伴う高圧に耐えるための機械強度を有し)、(5)操作流速の低下を招かず(低操作圧であり)、そして、(6)弱アルカリ性条件下にて安定で(アルカリ安定性)対象をイオン解離させる目的で中性から弱アルカリ性の溶離条件を使用することができる、という、従来からの要求に応えることのできるアニオン交換体である。

図面の簡単な説明

0027

実施例1、比較例2及び比較例3のタンパク質分離性能検討におけるクロマトグラムを示した図である。
実施例1、比較例2及び比較例3のタンパク質分離性能検討における試料注入量と溶出ピークの分離性能の関係を示した図である。
実施例1から16のタンパク質分離性能検討における、ポリアリルアミン被覆量と溶出ピークの分離性能の関係を示した図である。

0028

以下、実施例により、本発明の充填剤製造法を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
非多孔性基材の作成)
特開2001−002716記載のシード重合法により基材を作成した。

0029

シード粒子の作成)
ベンジルメタクリレート和光純薬)20g及びメルカプト酢酸2−エチルヘキシル(和光純薬)0.95gを500mL三つ口フラスコに入れ混合し、イオン交換水200g投入した。マグネティック撹拌子を入れ、85度に設定したオイルバスに取り付け、窒素導入管を設置し、150rpmで撹拌した。これとは別に50mL容器過硫酸カリウム0.6g及びイオン交換水20gを計り取り溶解した。30分経過後、三つ口フラスコに設置したゴム栓から、過硫酸カリウム水溶液注射器投入した。回転数を300rpmとしてソープフリー乳化重合を実施した。2時間重合を継続後、凝集分を取り除いてシード溶液回収した。シード溶液の固形分含有率は、6.98%であり、粒子径は電子顕微鏡による測定で0.39μmであった。

0030

(非多孔性基材の作成)
メタクリル酸2,3−エポキシプロピル(和光純薬)64g、二メタクリル酸エチレン(広島和光)16g、V−65(商品名(和光純薬))0.2g及びドデシル硫酸ナトリウム0.2gを300mLフラスコに計量し、撹拌子を入れ、マグネティックスタラーで混合した。イオン交換水を100mL加え、マグネティックスタラーで撹拌しながら、超音波ホモジナイザー乳化した。シード溶液10.90g(固形分量0.760g)及び50mLの4%濃度のポリビニルアルコール(和光純薬)水溶液をモノマー乳化液に加え、1分間よく撹拌し、静置した。室温下で30分放置後、60度に設定した水浴に静置し、2時間重合を行った。得られた重合液ガラスフィルターでろ過し、温水アセトン、温水の順で洗浄した。得られた非多孔性粒子を500mLセパラブルフラスコに入れ、イオン交換水を300mL加え、90度に設定したオイルバスに設置し、撹拌しながら24時間加熱することにより、エポキシ基の加水分解を行った。得られた非多孔性粒子は電子顕微鏡観察により粒子径1.8μmの粒子径の揃った粒子であった。得られた非多孔性粒子100g(水サクションドライ)、エピクロロヒドリン(キシダ化学)103g及びイオン交換水100gを500mLセパラブルフラスコに入れ、45度に設定した水浴に設置し撹拌した。これとは別に48%水酸化ナトリウム水溶液を88g計量し、ディスポーザブル注射器に入れ、シリンジポンプに設置し、0.5mL/minの速度でセパブルフラスコに撹拌しながら投入した。投入後反応を2時間継続し、反応物をガラスフィルターでろ過し、水、アセトン順で洗浄し、通風乾燥し、エポキシ化非多孔性粒子を得た。

0031

エポキシ化非多孔性粒子4.0g、PAA−HCL−01(ポリアリルアミン日東紡商品名、分子量1,600)0.606g(非多孔性粒子重量の5.0%)及びイオン交換水10gを50mL遠心管に入れよく撹拌した。48%水酸化ナトリウム水溶液187μLを加えさらによく撹拌後、50度に設定した水浴中で1時間振盪した。得られた反応物を遠心し、上澄み除去し、これにイオン交換水10mLを加えよく分散し、さらに遠心分離した。この操作を3回繰り返し、上澄みを除去した。遠心管にイオン交換水4.3g、グリシジルトリメチルアンモニウム水溶液(四日市合成(株)、72%濃度)5.0g及び48%水酸化ナトリウム水溶液150μLを入れよく撹拌した。50度に設定した水浴中で2時間振盪した。得られた反応液をガラスフィルターでろ過し、0.1N水酸化ナトリウム水溶液、0.1N塩化水素水溶液、0.5mol/L塩化ナトリウム水溶液、イオン交換水の順で洗浄し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。
得られたアニオン交換体を10%のイオン交換水分散液として、4.6mm内径x50mm長さの液体クロマトグラフィー用カラムスラリー充填した。
得られたカラムを下記に記載した条件で、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。
[塩濃度グラジエント液体クロマトグラフィー条件]
溶離液A:20mmol/L Tris—HCl緩衝液(pH8.5)
溶離液B:0.5mol/L NaCl in 20mmol/L Tris−HCl緩衝液(pH8.5)
グラジエント:0〜100%B液直線グラジエント、10分
流速: 0.4mL/分
試料: 2g/L卵白由来アルブミン、2g/L大豆由来トリプシンインヒビター混合液
注入量 : 3,5,7,10,20,30,50μL
[操作圧測定条件
塩濃度グラジエントで使用した、溶離液A及びBを流速0.4mL/分で送液した時の操作圧
タンパク質分離性能と試料注入量の関係を図1に、クロマトグラムを図2に示す。また試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離性能であり保持力が強いことがわかった。操作圧は溶離液A通液時、20.9MPa、溶離液B通液時18.0MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0032

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−01を0.040g(非多孔性粒子重量の0.33%)、及び48%水酸化ナトリウム量を70μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、18.7MPa、溶離液B通液時17.1MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0033

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−01を0.080g(非多孔性粒子重量の0.66%)、及び48%水酸化ナトリウム量を76μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、18.1MPa、溶離液B通液時15.6MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0034

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−01を0.160g(非多孔性粒子重量の1.3%)、及び48%水酸化ナトリウム量を93μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、17.7MPa、溶離液B通液時14.3MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0035

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−01を0.320g(非多孔性粒子重量の2.6%)、及び48%水酸化ナトリウム量を127μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、17.0MPa、溶離液B通液時13.8MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0036

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−01を0.364g(非多孔性粒子重量の3.0%)、及び48%水酸化ナトリウム量を136μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、18.5MPa、溶離液B通液時16.2MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0037

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−01を0.848g(非多孔性粒子重量の7.0%)、及び48%水酸化ナトリウム量を238μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、19.8MPa、溶離液B通液時16.4MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0038

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−01を1.212g(非多孔性粒子重量の10.0%)、及び48%水酸化ナトリウム量を314μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、18.4MPa、溶離液B通液時14.8MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0039

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−03(ポリアリルアミン 日東紡商品名、分子量3,000)量を0.040g(非多孔性粒子重量の0.40%)、及び48%水酸化ナトリウム量を70μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、15.1MPa、溶離液B通液時12.9MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0040

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−03量を0.080g(非多孔性粒子重量の0.80%)、及び48%水酸化ナトリウム量を80μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、15.5MPa、溶離液B通液時14.0MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0041

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−03量を0.16g(非多孔性粒子重量の1.6%)、及び48%水酸化ナトリウム量を100μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、20.0MPa、溶離液B通液時17.6MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0042

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−03量を0.32g(非多孔性粒子重量の3.2%)、及び48%水酸化ナトリウム量を141μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、19.5MPa、溶離液B通液時17.2MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0043

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−05(ポリアリルアミン 日東紡商品名、分子量5,000)量を0.040g(非多孔性粒子重量の0.40%)、及び48%水酸化ナトリウム量を70μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、20.0MPa、溶離液B通液時17.2MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0044

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−05を0.080g(非多孔性粒子重量の0.80%)、及び48%水酸化ナトリウム量を80μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、20.0MPa、溶離液B通液時18.2MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0045

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−05を0.160g(非多孔性粒子重量の1.6%)、及び48%水酸化ナトリウム量を100μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、18.4MPa、溶離液B通液時14.8MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0046

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−05を0.32g(非多孔性粒子重量の3.2%)、及び48%水酸化ナトリウム量を141μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、24.6MPa、溶離液B通液時22.4MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0047

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−3L(ポリアリルアミン 日東紡商品名、分子量15,000)を0.032g(非多孔性粒子重量の0.40%)、及び48%水酸化ナトリウム量を70μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、20.9MPa、溶離液B通液時16.4MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0048

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−3Lを0.064g(非多孔性粒子重量の0.80%)、及び48%水酸化ナトリウム量を80μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、24.4MPa、溶離液B通液時19.0MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0049

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−3Lを0.128g(非多孔性粒子重量の1.6%)、及び48%水酸化ナトリウム量を100μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時30.3MPa、溶離液B通液時22.8MPaであり、低操作圧であることがわかった。

0050

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−3Lを0.256g(非多孔性粒子重量の3.2%)、及び48%水酸化ナトリウム量を141μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。試料を10μL注入した時の分離能を図3に示す。実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液A通液時、34.1MPa、溶離液B通液時24.0MPaであり、低操作圧であることがわかった。
(比較例1)

0051

ポリアリルアミン導入時のPAA−HCL−10L(ポリアリルアミン 日東紡商品名、分子量150,000)を0.016g(非多孔性粒子重量の0.40%)、及び48%水酸化ナトリウム量を70μL変更した以外は、実施例1と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、4.6mm内径x50mm長さの液体クロマトグラフィー用カラムにスラリー充填したが、操作圧が溶離液A通液時に60MPa以上の高圧となり分離性能を測定できなかった。
(比較例2)

0052

エポキシ化非多孔性粒子30g、48%水酸化ナトリウム水溶液59g及びイオン交換水20gを300mLセパラブルフラスコに入れ、40度に設定したオイルバスにセットし、撹拌した。エピクロロヒドリン70g、ジエチルアミノエタノール70gを個別に計量し、ペリスターポンプを用いそれぞれ4時間かけて滴下した。滴下終了後、6時間反応を継続した。得られた反応液をガラスフィルターでろ過し、0.1N水酸化ナトリウム水溶液、0.1N塩化水素水溶液、0.5mol/L塩化ナトリウム水溶液、イオン交換水の順で洗浄し、DEAE化アニオン交換体を得た。

0053

実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。タンパク質分離性能と試料注入量の関係を図1に、クロマトグラムを図2に示す。保持力が弱く、分離能の試料負荷量依存性も悪いことが分かった。操作圧は溶離液A通液時、18MPa、溶離液B通液時18MPaであり、低操作圧であることがわかった。
(比較例3)

0054

エポキシ化非多孔性粒子4.0g、イオン交換水4.3g、グリシジルトリメチルアンモニウム水溶液(四日市合成(株)、72%濃度)5.0g及び48%水酸化ナトリウム水溶液150μLを入れよく撹拌した。50度に設定した水浴中で2時間振盪した。得られた反応液をガラスフィルターでろ過し、0.1N水酸化ナトリウム水溶液、0.1N塩化水素水溶液、0.5mol/L塩化ナトリウム水溶液、イオン交換水の順で洗浄し、四級アミノ基が導入されたアニオン交換体を得た。

0055

実施例1と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。タンパク質分離性能と試料注入量の関係を図1に、クロマトグラムを図2に示す。保持力が弱く、分離能の試料負荷量依存性も悪いことが分かった。操作圧は溶離液A通液時、22.8MPa、溶離液B通液時18.6MPaであり、低操作圧であることがわかった。
(比較例4)

0056

エポキシ化非多孔性粒子4g、デキストラン3g(和光純薬分子量60,000)、イオン交換水7g及び48%水酸化ナトリウム水溶液60uLを40mL遠心管に入れ、50度に設定した水浴中で16時間振盪した。得られた反応物を遠心し、上澄み除去し、これにイオン交換水10mLを加えよく分散し、さらに遠心分離した。この操作を3回繰り返し、上澄みを除去した。遠心管にイオン交換水4.3g、グリシジルトリメチルアンモニウム水溶液(四日市合成(株)、72%濃度)5.0g及び48%水酸化ナトリウム水溶液150μLを入れよく撹拌した。50度に設定した水浴中で2時間振盪した。得られた反応液をガラスフィルターでろ過し、0.1N水酸化ナトリウム水溶液、0.1N塩化水素水溶液、0.5mol/L塩化ナトリウム水溶液、イオン交換水の順で洗浄し、四級アミノ基を有するデキストランが導入されたアニオン交換体を得た。実施例1と同様に、4.6mm内径x50mm長さの液体クロマトグラフィー用カラムにスラリー充填したが、操作圧が溶離液A通液時に60MPa以上の高圧となり分離性能を測定できなかった。

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