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課題

良性および悪性腫瘍のような、患者に有害なまたは望ましくない細胞の除去または破壊を必要とする状態を処置する方法を提供する。

解決手段

本発明は、神経糸タンパク質アミノ酸配列の一部分を含むペプチドNTPペプチド)を含有する化合物を使用する方法に関し、該ペプチドが膵臓タンパク質のアミノ酸配列に由来しており、細胞の除去または破壊を必要とする患者の状態を処置するための医薬組成物に関する。更に、上記ペプチドに対応するアミノ酸配列をコードしている核酸を提供。

概要

背景

発明の背景
多くの医学的処置および手順の本質は、有害なまたは望ましくない組織の除去または破壊を必要とする。このような重要な処置の例には、癌成長外科的除去、化学療法による転移性腫瘍の破壊、および(例えば、前立腺過形成の減少が含まれる。他の例には、望ましくない顔面毛、いぼ皮下組織リンパ組織または脂肪組織の除去が含まれる。

有害なまたは望ましくない細胞および組織を破壊し、したがって、その除去を容易にするかまたは更なる成長を阻止するであろうが、主に限局作用を有し且つ全身毒性がないまたは最小限しかないであろう有効な薬剤が要求されている。神経糸タンパク質およびそれらの関連分子は、本明細書中にその開示がそのまま援用される2002年3月8日出願の
Methodsof Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins という表題の係属米国特許出願第10/092,934号に開示されているこのような薬剤の一つのクラスである。神経糸タンパク質AD7c−NTPのアミノ酸配列の一部分に対応するアミノ酸配列を含有するペプチドも、このような薬剤である。これらペプチドは、本明細書中にその開示がそのまま援用される2002年5月24日出願の Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or
Destruction of Cells という表題の係属米国特許出願第10/153,334号に開示されている。

本明細書中に開示されているのは、細胞の除去または破壊を必要とする腫瘍および他の状態を処置する場合にも有用である神経糸タンパク質の若干の他のフラグメントである。
癌は、細胞の未制御の成長および再生を引き起こす細胞の内部調節機構の異常である。正常な細胞は、組織を構成しているが、これら細胞が、特殊化した、制御されたおよび協調した単位として挙動するそれらの能力を失った場合(脱分化)、その欠損は、細胞集団の中に混乱をもたらす。これが起こると、腫瘍が形成される。

組織の良性過成長は、ある器官から細胞を除去することが望まれる異常である。良性腫瘍は、身体のいたるところに転移することはないが、しかしながら、疾患症状を引き起こす細胞増殖である。このような腫瘍は、脳のような近づき難い器官内部位に位置する場合、致命的でありうる。、脳、皮膚、下垂体甲状腺副腎皮質および髄質卵巣子宮精巣結合組織筋肉腸管咽頭扁桃、口、肝、胆嚢膵臓、前立腺、心臓および他の器官を含めた器官の良性腫瘍が存在する。

外科手術は、しばしば、癌の処置の第一段階である。外科手術の目的は様々である。時々、それは、できるだけ多くの顕性腫瘍を除去するのに、またはそれを少なくとも縮小する(debulk)(他の手段によって処置する必要がほとんどないように腫瘍の一つまたは複数の大部分を除去する)のに用いられる。癌のタイプおよび場所に依って、拡大している脳腫瘍の大部分を外科医が除去することができるならば、頭蓋内圧は減少し、患者の症状の改善をもたらすであろう。

すべての腫瘍が外科手術を行いやすいわけではない。あるものは、完全に除去することを不可能にする身体部分に位置することがありうる。これらの例は、脳幹呼吸を制御している脳部分)の腫瘍または主要血管中および周囲で成長した腫瘍であると考えられる。これらの場合、外科手術の役割は、腫瘍除去に関連した高い危険性のために限定される。

ある場合には、腫瘍を縮小するのに、外科手術は必要がないので用いられない。一例は、化学療法および放射線療法組合せにきわめて充分に応答するリンパ節の癌であるホジキンリンパ腫である。ホジキンリンパ腫の場合、外科手術は、治癒に達するのに希に必要とされるが、診断を決定するのにはほとんど常に用いられる。

化学療法は、身体のいたるところで急速に分裂している細胞(腫瘍中で見出されるものなど)を特異的に攻撃する薬剤(通常は、口でまたは注射によって与えられる)の使用を伴う癌処置の一般的な形態である。これは、既に転移した癌、更には、血液およびリンパ系によって広がる高い可能性があるが、一次腫瘍を越える顕性ではない腫瘍を処置する場合に化学療法を有用にする。化学療法は、限局した腫瘍の外科手術および放射線療法への応答を増大させるのに用いることもできる。これは、例えば、頭部および頸部の若干の癌の場合である。

残念ながら、通常でも急速に分裂しているヒト体内の他の細胞(内壁および毛など)も、化学療法によって影響される。この理由で、多数の化学療法薬は、悪心嘔吐貧血、失毛または他の症状などの望ましくない副作用を引き起こす。これら副作用は一時的であり、これら副作用の多くを軽減するのに役立ちうる薬剤が存在する。本発明者の知識が増え続けるにつれて、研究者は、癌細胞死滅させるのにより良いだけでなく、患者への副作用もより少ない、より新しい化学療法薬を考案している。

化学療法は、いろいろな方法で患者に投与される。あるものは丸剤であり、そしてあるものは、静脈内注射または他の注射によって投与される。注射可能な化学療法については、患者は、処置のために診療室または病院に行く。他の化学療法薬は、血流中への連続注入を1日24時間必要とする。これらタイプの化学療法については、患者が着用する小ポンプ植込むために、僅かな外科的方法を行うことがありうる。次に、このポンプは、薬剤を徐々に投与する。多くの場合、永久口を患者の静脈に入れて、繰り返し針を刺す必要をなくする。

放射線療法は、癌に対する戦いで一般的に用いられるもう一つの武器である。放射線は、腫瘍細胞内のDNAを損傷することによって癌を死滅させる。放射線は、いろいろな方法で供給される。最も一般的なものは、腫瘍に集中するきわめて正確な方法で放射線ビー
ムを患者に向けることを伴う。これを行うには、患者は台の上に横になり、その患者の周囲をビームが移動する。この手順は、何分か続けるが、処方される具体的な全線量に達しさせるために、(腫瘍のタイプに依って)毎日数週間行われてよい。

時々用いられる、近接照射療法と称されるもう一つの放射線法は、放射性ペレットシード)またはワイヤを得且つそれらを体内腫瘍部位に植込むことを伴う。永久インプラントについては、シード中の放射線が何日間かまたは何週間かにわたって崩壊するので、患者は放射性にはならない。一時的インプラントについては、通常は、放射線の全線量が数日で供給されるので、患者は、その期間中入院していなければならない。近接照射療法のどちらのタイプについても、概して、放射線はまさに標的の部位に供給されて、(化学療法のように全身を処置することに対立するものとして)癌への限局制御を得る。

若干の高度に選択された患者は、骨髄移植に委ねられることがありうる。この方法は、通常は、患者が、特に攻撃性である癌を有するからかまたは、彼らが、慣用的な療法で処置された後に再発した癌を有するから行われる。骨髄移植は、複雑な方法である。多数のタイプがあるが、それらは、副作用と治癒を引き起こす可能性が様々である。大部分の移植は、専門施設で行われるが、多くの場合、それらの使用は研究用と考えられる。

多数の他の療法が存在するが、それらの大部分は、臨床試験でなお調べられていて、まだ標準的なケアになっていない。例には、免疫療法単クローン性抗体抗血管新生因子および遺伝子治療の使用が含まれる。

免疫療法:放射線または化学療法とは全く別個に、患者自身の免疫系が癌と戦うのを助けるように設計されたいろいろな技術がある。しばしば、この目的を達成するために、研究者は、特別な由来ワクチンを患者に注射する。

単クローン性抗体:これらは、癌細胞と非癌細胞との間の抗原性および/または他の特性の違いを利用することによって癌細胞(および非正常細胞)に付着するように設計された抗体である。これら抗体は、その抗体が癌細胞を優先的に標的とするように、患者に単独でまたは種々の細胞毒性化合物抱合されてまたは放射性の形で投与されることによって、所望の細胞にその毒性薬または放射能を供給することができる。

抗血管新生因子:癌細胞が急速に分裂し、腫瘍が成長するにつれて、それらの血液供給はすぐに増加することがありうる。これを埋め合わせるために、若干の腫瘍は、それらの周辺の血管を成長させるのに役立つと考えられる物質分泌し、したがって、癌細胞に血管栄養源を与える。実験的療法は、腫瘍への血管の成長を阻止するように設計されている。

遺伝子治療:癌は、癌細胞の生産およびその過剰の増殖を最終的にもたらす一連突然変異の産物である。癌は、癌の増殖を抑えるかまたは止めるように作用する、細胞を破壊する細胞のプログラム化された細胞機作を作動させる、細胞の免疫認識を促す、または毒性代謝産物に変換するプロドラッグまたは腫瘍成長阻害するサイトカイン発現するであろう遺伝子を癌細胞に導入することによって処置することができる。

良性腫瘍および奇形は、外科手術、放射線療法、薬物療法、熱または電気剥離寒冷療法およびその他を含めたいろいろな方法によって処置することもできる。良性腫瘍は、転移することはないが、それらは大きく成長することがありうるし、再発することがありうる。良性腫瘍の外科的摘出は、いずれも、概して外科手術が難しく且つ副作用があるが、下垂体腺腫、脳の髄膜腫、前立腺過形成およびその他のような若干の良性腫瘍については、しばしば繰り返し行われなければならない。

選択的細胞除去が望まれる望ましくない細胞要素を伴う他の状態がなお存在する。例えば、心疾患および発作は、一般的には、アテローム性動脈硬化症によって引き起こされるが、これは、血管壁を歪め、管腔を狭くし、血流を圧迫し、病巣血餅素因を与え、そして最終的には、遮断および梗塞をもたらす線維脂肪要素および改変された平滑筋要素の増殖性病変である。アテローム性動脈硬化症のためのいろいろな処置には、バイパス移植片人工移植片再疎通掻爬、放射線、レーザーまたは他の除去での血管形成;脂質減少によってアテローム性動脈硬化症を阻止する薬物療法;抗凝血療法;および食事運動およびライフスタイルの一般的な測定が含まれる。外科的方法の危険および副作用を伴うことなくアテローム性動脈硬化症病変を除去する方法が要求されている。

選択的細胞除去が望まれる望ましくない細胞要素の他の例には、いぼのような、ウイルス誘導される成長が含まれる。もう一つの例は、炎症状態で見出される肥大性炎症性塊、および肥大性瘢痕またはケロイドである。なお他の例は、望ましくない毛、例えば、顔毛の除去のような美容の場合に、または顔の皮膚および結合組織または手足の皮膚および結合組織などにおける美容目的のための望ましくない組織部位の縮小について見出される。

なお他の例は、本明細書中の開示を読むことで、当業者に明らかになるであろう。これら例のすべてまたは大部分において、慣用的な療法の危険および副作用を伴うことなく、望ましくない細胞要素を除去するまたは破壊することができる処置、または望ましくない細胞要素をより正確に除去する処置が要求される。

神経糸タンパク質(NTP)は、最近特性決定された脳タンパク質ファミリーである。このファミリーの一つのメンバーであるAD7c−NTPは、神経突起萌芽に関連した機能を有する約41kD膜関連リンタンパク質である(de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997); de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999); de la
MonteSMand WandsJR, Journal of Alzheimer's Disease, 3:345-353(2001))。AD
7c−NTPおよび予想されるAD7c−NTPのタンパク質配列をコードしている遺伝子は、識別され且つ記載されている(de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997))。約41kDの種類に加えて、神経糸タンパク質の他の種類(約26kD、
約21kD、約17kDおよび約15kD)が識別されていて、神経外胚葉腫瘍星状膠細胞腫および神経膠芽細胞腫に、および低酸素症スキーマ(schema)または脳梗塞による傷害に関連している(Xu et al., Cancer Research, 53:3823-3829(1993); de la Monte et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol., 55(10):1038-50(1996), de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 138(1-2):26-35(1996); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 135(2):118-25(1996); de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997); and de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999))。

神経糸タンパク質の種類は、いずれも「Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease」についての米国特許第5,948,634号;第5,948,888号;および第5,830,670号に、および「Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction」についての米国特許第6,071,705号に
記載され且つ請求の範囲に記載されている。これら特許の開示は、本明細書中にそのまま具体的に援用される。それらに記載されているように、NTPは、細胞死の際にアップレギュレーションされ且つ生産される。例えば、死滅したおよび死滅する神経細胞は、NTPを過剰生産すると記載され、したがって、その存在は、神経細胞の死およびアルツハイマー病(AD)の始まりを示している。

神経糸タンパク質の他の種類は、AD7c−NTP遺伝子の他の産物(例えば、NC
I Entrez-ProteinデータベースAccession #XP 032307 PID g159
28971に記載の112アミノ酸タンパク質)としてまたは神経糸タンパク質に類似している(例えば、NCBI Entrez-Protein データベース Accession #AAH1495
1 PID g15928971に記載の106アミノ酸タンパク質、NCBI Entrez-Protein データベース Accession #XP 039102 PID g18599339
に記載のもう一つの106アミノ酸タンパク質、およびNCBI Entrez-Protein データベース Accession #AAH02534 PID g12803421に記載の61アミ
ノ酸タンパク質)として識別されている。

神経糸タンパク質は、ADに関連していて、NTPは、ADにおける細胞死に関連してアップレギュレーションされる。AD7c−NTPmRNAは、対照と比較して、AD脳中でアップレギュレーションされ;脳およびCSF中のAD7c−NTPタンパク質ベルは、対照よりもADにおいて高く;そしてAD7c−NTP免疫反応性は、老人斑において、神経原線維変化(NFT)において、変性ニューロン神経網糸、およびADおよびダウン症候群の脳でのジストロフィー性神経症萌芽において見出される(Ozturk et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86:419-423(1989); de la Monte et al., J.Clin.Invest., 86(3):1004-13(1990); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 113(2):152-64(1992); de la Monte et al., Ann.Neurol., 32(6):733-42(1992); de la Monte et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol., 55(10):1038-50(1996), de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 138(1-2):26-35(1996); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 135(2):118-25(1996); de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997); and de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999))。NTPは、細胞内、神経網内の微細突起中に局在している
、またはADおよびダウン症候群双方の脳の細胞外にある。de la Monte et al., Ann.Neurol., 32(6):733-42(1992)。

上昇したレベルのAD7c−NTPタンパク質は、AD患者のCSFおよび尿の双方で見出されている(de la Monte and Wands, Front Biosci 7:989-96(2002); de la Monte and Wands, Journal of Alzheimer's Disease 3:345-353(2001); Munzar et al, Alzheimer's Reports 4:61-65(2001); Kahle et al, Neurology 54:1498-1504(2000); Munzar et
al, Alzheimer Reports 3:155-159(2000); de la Monte et al, Alzheimer's Reports 2:327-332(1999); and de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997))。

NTPの過発現は、アルツハイマー病での細胞死の過程にも関連している(de la Monte and Wands, J.Neuropathol.Exp.Neurol., 60:195-207(2001); de la Monte and Wands,
Cell Mol Life Sci 58:844-49(2001))。AD7c−NTPは、ダウン症候群脳組織においても識別されている(Wands et al.,国際特許公開WO90/06993号;de la Monte et al, J Neurol Sci 135:118-25(1996); de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999))。NTPの過発現が正常眼圧緑内障に関連することもありうるという若干の証拠が存在する(Golubnitschaja-Labudova et al, Curr Eye Res 21:867-76(2000))。

NTPは、in vitro の神経膠腫および神経芽細胞腫細胞培養物においても、in vivo
の正常齧歯類動物筋組織皮下結合組織および皮膚、および乳癌皮膚癌および乳頭
腫、結腸癌脳神経膠腫、および齧歯類動物モデルにおけるその他を含めた種々の異なったヒトおよび非ヒト由来腫瘍においても、細胞死を引き起こすのに有効な物質であると証明されている。2002年3月8日出願の係属米国特許出願第10/092,934号、Methodsof Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins
を参照されたい。

AD7c−NTPの若干のペプチド配列(「AD7c−NTPペプチド」)も、in vitro の神経膠腫および神経芽細胞腫の細胞培養物および/または in vivo の正常齧歯類動
物の筋組織、皮下結合組織、皮膚および他の組織の双方において細胞死を引き起こすのに有効な物質であると証明されている。2002年5月24日出願の、Peptides Effective
in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells という表題の米国特許出願第10/153,334号を参照されたい。

関連出願の前述の説明を含めた本明細書を通して、いずれかのおよびすべての米国特許を含めた本明細書中に記載のいずれかのおよびすべての公的に入手可能な論文は、本明細書中にそのまま具体的に援用される。関連出願の前述の説明は、いずれにせよ、係属米国特許出願を含めたそれらに記載されるいずれかの論文が、本発明の先行技術であると承認するものではない。

当該技術分野において、望ましくない細胞要素を処置するための新しい、毒性がより少ない処置が依然として要求されている。本発明は、これら要求を満たしている。

概要

良性および悪性の腫瘍のような、患者に有害なまたは望ましくない細胞の除去または破壊を必要とする状態を処置する方法を提供する。本発明は、神経糸タンパク質のアミノ酸配列の一部分を含むペプチド(NTPペプチド)を含有する化合物を使用する方法に関し、該ペプチドが膵臓糸タンパク質のアミノ酸配列に由来しており、細胞の除去または破壊を必要とする患者の状態を処置するための医薬組成物に関する。更に、上記ペプチドに対応するアミノ酸配列をコードしている核酸を提供。なし

目的

三番目の
方法は、タンパク質分解耐性を与えるプソイドペプチド結合によってNTPペプチド中のペプチド結合置換することである

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

ペプチドであって、(a)配列番号10(Pro−Gly−Phe−Phe−Lys−Leu−Phe−Ser−Cys−Pro−Ser−Leu−Leu−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(b)配列番号11(Pro−Glu−Leu−Lys−Gln−Ser−Thr−Cys−Leu−Ser−Leu−Pro−Lys−Cys−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(c)配列番号12(Pro−Pro−Gly−Leu−Lys−Arg−Phe−Ser−Cys−Leu−Ser−Leu−Pro−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Gly)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(d)配列番号13(Phe−Ser−Cys−Leu−Ser−Leu−Pro−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Gly−His)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(e)配列番号14(Ser−Thr−Cys−Leu−Ser−Leu−Pro−Lys−Cys−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(f)配列番号15(Phe−Ser−Cys−Pro−Ser−Leu−Leu−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(g)配列番号16(Leu−Ser−Leu−Pro−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Gly)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(h)配列番号17(Leu−Ser−Leu−Pro−Lys−Cys−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(i)配列番号18(Ser−Leu−Leu−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(j)配列番号19(Leu−Pro−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(k)配列番号20(Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(l)配列番号21(Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(m)配列番号22(Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg−Phe−Ile−Leu−Phe−Phe−Leu)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(n)配列番号23(Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg−Phe−Ile−Phe−Asn−Phe−Leu)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(o)配列番号24(Phe−Asn−Phe−Cys−Leu−Phe)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(p)配列番号25(Phe−Ile−Phe−Asn−Phe−Leu)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(q)配列番号26(Pro−Ala−Ser−Ala−Ser−Pro−Val−Ala−Gly−Ile−Thr−Gly−Met)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(r)配列番号27(Pro−Ala−Ser−Ala−Ser−Gln−Val−Ala−Gly−Thr−Lys−Asp−Met)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;(s)配列番号28(Pro−Ala−Ser−Ala−Ser−Gln−Ser−Ala−Gly−Ile−Thr−Gly−Val)のアミノ酸配列によって表されるペプチド;から成る群より選択される少なくとも一つのペプチドを含むペプチド。

請求項2

請求項1に記載の一つまたはそれを超えるペプチドおよびそのための担体を含む組成物

請求項3

請求項1に記載のペプチドのホモログ誘導体フラグメントまたは変異体を含むペプチド。

請求項4

請求項1に記載のペプチドのアミノ酸配列に基づく逆D順序アミノ酸を含むペプチド。

請求項5

ペプチドの3’末端かまたは5’末端に隣接する1〜25個の追加のアミノ酸によって修飾された請求項1に記載のペプチドを含むペプチド。

請求項6

少なくとも二つの請求項1に記載のペプチドを含むペプチド。

請求項7

請求項1に記載のペプチドの少なくとも二つの反復を含むペプチド。

請求項8

請求項1に記載のペプチドの模擬体

請求項9

抗体、抗体のフラグメントまたは抗体様分子に融合した請求項1に記載のペプチドを含むペプチド。

請求項10

請求項1に記載のペプチドおよびそのホモログ、フラグメントおよび変異体に対応するアミノ酸配列をコードしている核酸

請求項11

一つまたはそれを超える請求項10に記載の核酸およびそのための薬学的に許容しうる担体を含む組成物。

請求項12

細胞の除去または破壊を必要とする患者の状態を処置する方法であって、要求がある哺乳動物に、治療的有効量の請求項1に記載のペプチドを投与することを含む方法。

請求項13

投与することが、経口、皮下、皮内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、脊髄内、鼻腔内、腫瘍内、局所および経皮から成る群より選択される方法を含んで成る請求項12に記載の方法。

請求項14

処置を、外科切除移植(transplantation)、移植片移植(grafting)、化学療法免疫療法ワクチン接種、熱または電気剥離寒冷療法レーザー療法、光線療法遺伝子治療および放射線から成る処置の群より選択される処置で患者を処置する前に、際にまたは後に、患者に投与する請求項12に記載の方法。

請求項15

状態が、乳房膵臓前立腺膀胱、骨、卵巣、皮膚、、洞、結腸腸管、胃、直腸食道心臓脾臓唾液腺、血液、脳およびその被膜脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織副腎副甲状腺甲状腺子宮精巣下垂体生殖器、肝、胆嚢、眼、咽頭扁桃、口、リンパ節およびリンパ組織から成る群より選択される組織良性および悪性の腫瘍である請求項12に記載の方法。

請求項16

状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、心臓,脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、リンパ節およびリンパ組織から成る群より選択される組織の過形成肥大または過成長である請求項12に記載の方法。

請求項17

状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、心臓,脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、リンパ節およびリンパ組織から成る群より選択される、ウイルス、細菌または寄生生物によって変化した組織である請求項12に記載の方法。

請求項18

状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、心臓,脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、リンパ節およびリンパ組織から成る群より選択される組織の奇形である請求項12に記載の方法。

請求項19

組織がリンパ組織である請求項15に記載の方法。

請求項20

状態が扁桃肥大である請求項12に記載の方法。

請求項21

状態が前立腺過形成である請求項12に記載の方法。

請求項22

状態が乾癬である請求項12に記載の方法。

請求項23

状態が湿疹である請求項12に記載の方法。

請求項24

状態が皮膚病である請求項12に記載の方法。

請求項25

状態が、組織への美容修正である請求項12に記載の方法。

請求項26

組織が、皮膚、眼、耳、鼻、咽頭、口、筋肉、結合組織、毛および乳房である請求項15に記載の方法。

請求項27

状態が血管疾患である請求項12に記載の方法。

請求項28

状態が痔核である請求項12に記載の方法。

請求項29

状態が拡張蛇行静脈である請求項12に記載の方法。

請求項30

血管疾患が、アテローム性動脈硬化症または動脈硬化症である請求項27に記載の方法。

請求項31

状態が、炎症性疾患自己免疫疾患代謝性疾患遺伝性遺伝学的疾患、外傷性疾患または身体的外傷栄養欠乏性疾患、感染性疾患アミロイド症線維症蓄積症先天性奇形酵素欠乏性疾患被毒(poisoning)、中毒(intoxication)、環境性疾患、放射線疾患、内分泌性疾患変性疾患および機械的疾患の内の一つである請求項12に記載の方法。

請求項32

前記ペプチドが、膵臓糸タンパク質のアミノ酸配列に由来している請求項12に記載の方法。

請求項33

ペプチドが、抗体、抗体フラグメントおよび抗体様結合分子から成る群より選択される分子であって、腫瘍または他の標的への結合について、他の細胞への結合より高い親和性を有する分子に抱合されている、連結しているまたは結合している請求項12に記載の方法。

請求項34

ペプチドが、抗体、抗体フラグメントおよび抗体様結合分子から成る群より選択される分子であって、腫瘍または他の標的への結合について、他の細胞への結合より高い親和性を有する分子とペプチドとから成る単一の新しいクローン化リコンビナント分子の一部分である請求項12に記載の方法。

技術分野

0001

本出願は、本明細書中に各々の開示がそのまま援用される、2001年7月19日出願の「Proteins and peptides effective in the treatment of tumors andotherconditions requiring the removal or destruction of cells」という表題予備出願第60/
306,161号、2001年7月19日出願の「Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells」という表題の予備特許出願第60/306,150号および2001年11月16日出願の「Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring
the removal or destruction of cells」という表題の予備特許出願第60/331,477号に優先権を主張する。

0002

発明の分野
本発明は、ヒトの良性または悪性腫瘍のような細胞要素の除去または破壊を必要とする状態を処置する方法であって、神経糸タンパク質アミノ酸配列の一部分に対応する、類似したまたは相同のアミノ酸配列を含むペプチドに基づく化合物を使用する方法に関する。この方法には、これら化合物を単独でかまたは担体抱合させて、筋肉内、経口、静脈内、脊髄内、腫瘍内、鼻腔内、局所経皮等で投与することが含まれるが、これに制限されるわけではない。

背景技術

0003

発明の背景
多くの医学的処置および手順の本質は、有害なまたは望ましくない組織の除去または破壊を必要とする。このような重要な処置の例には、癌成長外科的除去、化学療法による転移性腫瘍の破壊、および(例えば、前立腺過形成の減少が含まれる。他の例には、望ましくない顔面毛、いぼ皮下組織リンパ組織または脂肪組織の除去が含まれる。

0004

有害なまたは望ましくない細胞および組織を破壊し、したがって、その除去を容易にするかまたは更なる成長を阻止するであろうが、主に限局作用を有し且つ全身毒性がないまたは最小限しかないであろう有効な薬剤が要求されている。神経糸タンパク質およびそれらの関連分子は、本明細書中にその開示がそのまま援用される2002年3月8日出願の
Methodsof Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins という表題の係属米国特許出願第10/092,934号に開示されているこのような薬剤の一つのクラスである。神経糸タンパク質AD7c−NTPのアミノ酸配列の一部分に対応するアミノ酸配列を含有するペプチドも、このような薬剤である。これらペプチドは、本明細書中にその開示がそのまま援用される2002年5月24日出願の Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or
Destruction of Cells という表題の係属米国特許出願第10/153,334号に開示されている。

0005

本明細書中に開示されているのは、細胞の除去または破壊を必要とする腫瘍および他の状態を処置する場合にも有用である神経糸タンパク質の若干の他のフラグメントである。
癌は、細胞の未制御の成長および再生を引き起こす細胞の内部調節機構の異常である。正常な細胞は、組織を構成しているが、これら細胞が、特殊化した、制御されたおよび協調した単位として挙動するそれらの能力を失った場合(脱分化)、その欠損は、細胞集団の中に混乱をもたらす。これが起こると、腫瘍が形成される。

0006

組織の良性過成長は、ある器官から細胞を除去することが望まれる異常である。良性腫瘍は、身体のいたるところに転移することはないが、しかしながら、疾患症状を引き起こす細胞増殖である。このような腫瘍は、脳のような近づき難い器官内部位に位置する場合、致命的でありうる。、脳、皮膚、下垂体甲状腺副腎皮質および髄質卵巣子宮精巣結合組織、筋肉、腸管咽頭扁桃、口、肝、胆嚢膵臓、前立腺、心臓および他の器官を含めた器官の良性腫瘍が存在する。

0007

外科手術は、しばしば、癌の処置の第一段階である。外科手術の目的は様々である。時々、それは、できるだけ多くの顕性腫瘍を除去するのに、またはそれを少なくとも縮小する(debulk)(他の手段によって処置する必要がほとんどないように腫瘍の一つまたは複数の大部分を除去する)のに用いられる。癌のタイプおよび場所に依って、拡大している脳腫瘍の大部分を外科医が除去することができるならば、頭蓋内圧は減少し、患者の症状の改善をもたらすであろう。

0008

すべての腫瘍が外科手術を行いやすいわけではない。あるものは、完全に除去することを不可能にする身体部分に位置することがありうる。これらの例は、脳幹呼吸を制御している脳部分)の腫瘍または主要血管中および周囲で成長した腫瘍であると考えられる。これらの場合、外科手術の役割は、腫瘍除去に関連した高い危険性のために限定される。

0009

ある場合には、腫瘍を縮小するのに、外科手術は必要がないので用いられない。一例は、化学療法および放射線療法組合せにきわめて充分に応答するリンパ節の癌であるホジキンリンパ腫である。ホジキンリンパ腫の場合、外科手術は、治癒に達するのに希に必要とされるが、診断を決定するのにはほとんど常に用いられる。

0010

化学療法は、身体のいたるところで急速に分裂している細胞(腫瘍中で見出されるものなど)を特異的に攻撃する薬剤(通常は、口でまたは注射によって与えられる)の使用を伴う癌処置の一般的な形態である。これは、既に転移した癌、更には、血液およびリンパ系によって広がる高い可能性があるが、一次腫瘍を越える顕性ではない腫瘍を処置する場合に化学療法を有用にする。化学療法は、限局した腫瘍の外科手術および放射線療法への応答を増大させるのに用いることもできる。これは、例えば、頭部および頸部の若干の癌の場合である。

0011

残念ながら、通常でも急速に分裂しているヒト体内の他の細胞(内壁および毛など)も、化学療法によって影響される。この理由で、多数の化学療法薬は、悪心嘔吐貧血、失毛または他の症状などの望ましくない副作用を引き起こす。これら副作用は一時的であり、これら副作用の多くを軽減するのに役立ちうる薬剤が存在する。本発明者の知識が増え続けるにつれて、研究者は、癌細胞死滅させるのにより良いだけでなく、患者への副作用もより少ない、より新しい化学療法薬を考案している。

0012

化学療法は、いろいろな方法で患者に投与される。あるものは丸剤であり、そしてあるものは、静脈内注射または他の注射によって投与される。注射可能な化学療法については、患者は、処置のために診療室または病院に行く。他の化学療法薬は、血流中への連続注入を1日24時間必要とする。これらタイプの化学療法については、患者が着用する小ポンプ植込むために、僅かな外科的方法を行うことがありうる。次に、このポンプは、薬剤を徐々に投与する。多くの場合、永久口を患者の静脈に入れて、繰り返し針を刺す必要をなくする。

0013

放射線療法は、癌に対する戦いで一般的に用いられるもう一つの武器である。放射線は、腫瘍細胞内のDNAを損傷することによって癌を死滅させる。放射線は、いろいろな方法で供給される。最も一般的なものは、腫瘍に集中するきわめて正確な方法で放射線ビー
ムを患者に向けることを伴う。これを行うには、患者は台の上に横になり、その患者の周囲をビームが移動する。この手順は、何分か続けるが、処方される具体的な全線量に達しさせるために、(腫瘍のタイプに依って)毎日数週間行われてよい。

0014

時々用いられる、近接照射療法と称されるもう一つの放射線法は、放射性ペレットシード)またはワイヤを得且つそれらを体内腫瘍部位に植込むことを伴う。永久インプラントについては、シード中の放射線が何日間かまたは何週間かにわたって崩壊するので、患者は放射性にはならない。一時的インプラントについては、通常は、放射線の全線量が数日で供給されるので、患者は、その期間中入院していなければならない。近接照射療法のどちらのタイプについても、概して、放射線はまさに標的の部位に供給されて、(化学療法のように全身を処置することに対立するものとして)癌への限局制御を得る。

0015

若干の高度に選択された患者は、骨髄移植に委ねられることがありうる。この方法は、通常は、患者が、特に攻撃性である癌を有するからかまたは、彼らが、慣用的な療法で処置された後に再発した癌を有するから行われる。骨髄移植は、複雑な方法である。多数のタイプがあるが、それらは、副作用と治癒を引き起こす可能性が様々である。大部分の移植は、専門施設で行われるが、多くの場合、それらの使用は研究用と考えられる。

0016

多数の他の療法が存在するが、それらの大部分は、臨床試験でなお調べられていて、まだ標準的なケアになっていない。例には、免疫療法単クローン性抗体抗血管新生因子および遺伝子治療の使用が含まれる。

0017

免疫療法:放射線または化学療法とは全く別個に、患者自身の免疫系が癌と戦うのを助けるように設計されたいろいろな技術がある。しばしば、この目的を達成するために、研究者は、特別な由来ワクチンを患者に注射する。

0018

単クローン性抗体:これらは、癌細胞と非癌細胞との間の抗原性および/または他の特性の違いを利用することによって癌細胞(および非正常細胞)に付着するように設計された抗体である。これら抗体は、その抗体が癌細胞を優先的に標的とするように、患者に単独でまたは種々の細胞毒性化合物に抱合されてまたは放射性の形で投与されることによって、所望の細胞にその毒性薬または放射能を供給することができる。

0019

抗血管新生因子:癌細胞が急速に分裂し、腫瘍が成長するにつれて、それらの血液供給はすぐに増加することがありうる。これを埋め合わせるために、若干の腫瘍は、それらの周辺の血管を成長させるのに役立つと考えられる物質分泌し、したがって、癌細胞に血管栄養源を与える。実験的療法は、腫瘍への血管の成長を阻止するように設計されている。

0020

遺伝子治療:癌は、癌細胞の生産およびその過剰の増殖を最終的にもたらす一連突然変異の産物である。癌は、癌の増殖を抑えるかまたは止めるように作用する、細胞を破壊する細胞のプログラム化された細胞機作を作動させる、細胞の免疫認識を促す、または毒性代謝産物に変換するプロドラッグまたは腫瘍成長阻害するサイトカイン発現するであろう遺伝子を癌細胞に導入することによって処置することができる。

0021

良性腫瘍および奇形は、外科手術、放射線療法、薬物療法、熱または電気剥離寒冷療法およびその他を含めたいろいろな方法によって処置することもできる。良性腫瘍は、転移することはないが、それらは大きく成長することがありうるし、再発することがありうる。良性腫瘍の外科的摘出は、いずれも、概して外科手術が難しく且つ副作用があるが、下垂体腺腫、脳の髄膜腫、前立腺過形成およびその他のような若干の良性腫瘍については、しばしば繰り返し行われなければならない。

0022

選択的細胞除去が望まれる望ましくない細胞要素を伴う他の状態がなお存在する。例えば、心疾患および発作は、一般的には、アテローム性動脈硬化症によって引き起こされるが、これは、血管壁を歪め、管腔を狭くし、血流を圧迫し、病巣血餅素因を与え、そして最終的には、遮断および梗塞をもたらす線維脂肪要素および改変された平滑筋要素の増殖性病変である。アテローム性動脈硬化症のためのいろいろな処置には、バイパス移植片人工移植片再疎通掻爬、放射線、レーザーまたは他の除去での血管形成;脂質減少によってアテローム性動脈硬化症を阻止する薬物療法;抗凝血療法;および食事運動およびライフスタイルの一般的な測定が含まれる。外科的方法の危険および副作用を伴うことなくアテローム性動脈硬化症病変を除去する方法が要求されている。

0023

選択的細胞除去が望まれる望ましくない細胞要素の他の例には、いぼのような、ウイルス誘導される成長が含まれる。もう一つの例は、炎症状態で見出される肥大性炎症性塊、および肥大性瘢痕またはケロイドである。なお他の例は、望ましくない毛、例えば、顔毛の除去のような美容の場合に、または顔の皮膚および結合組織または手足の皮膚および結合組織などにおける美容目的のための望ましくない組織部位の縮小について見出される。

0024

なお他の例は、本明細書中の開示を読むことで、当業者に明らかになるであろう。これら例のすべてまたは大部分において、慣用的な療法の危険および副作用を伴うことなく、望ましくない細胞要素を除去するまたは破壊することができる処置、または望ましくない細胞要素をより正確に除去する処置が要求される。

0025

神経糸タンパク質(NTP)は、最近特性決定された脳タンパク質ファミリーである。このファミリーの一つのメンバーであるAD7c−NTPは、神経突起萌芽に関連した機能を有する約41kD膜関連リンタンパク質である(de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997); de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999); de la
MonteSMand WandsJR, Journal of Alzheimer's Disease, 3:345-353(2001))。AD
7c−NTPおよび予想されるAD7c−NTPのタンパク質配列をコードしている遺伝子は、識別され且つ記載されている(de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997))。約41kDの種類に加えて、神経糸タンパク質の他の種類(約26kD、
約21kD、約17kDおよび約15kD)が識別されていて、神経外胚葉腫瘍星状膠細胞腫および神経膠芽細胞腫に、および低酸素症スキーマ(schema)または脳梗塞による傷害に関連している(Xu et al., Cancer Research, 53:3823-3829(1993); de la Monte et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol., 55(10):1038-50(1996), de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 138(1-2):26-35(1996); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 135(2):118-25(1996); de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997); and de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999))。

0026

神経糸タンパク質の種類は、いずれも「Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease」についての米国特許第5,948,634号;第5,948,888号;および第5,830,670号に、および「Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction」についての米国特許第6,071,705号に
記載され且つ請求の範囲に記載されている。これら特許の開示は、本明細書中にそのまま具体的に援用される。それらに記載されているように、NTPは、細胞死の際にアップレギュレーションされ且つ生産される。例えば、死滅したおよび死滅する神経細胞は、NTPを過剰生産すると記載され、したがって、その存在は、神経細胞の死およびアルツハイマー病(AD)の始まりを示している。

0027

神経糸タンパク質の他の種類は、AD7c−NTP遺伝子の他の産物(例えば、NC
I Entrez-ProteinデータベースAccession #XP 032307 PID g159
28971に記載の112アミノ酸タンパク質)としてまたは神経糸タンパク質に類似している(例えば、NCBI Entrez-Protein データベース Accession #AAH1495
1 PID g15928971に記載の106アミノ酸タンパク質、NCBI Entrez-Protein データベース Accession #XP 039102 PID g18599339
に記載のもう一つの106アミノ酸タンパク質、およびNCBI Entrez-Protein データベース Accession #AAH02534 PID g12803421に記載の61アミ
ノ酸タンパク質)として識別されている。

0028

神経糸タンパク質は、ADに関連していて、NTPは、ADにおける細胞死に関連してアップレギュレーションされる。AD7c−NTPmRNAは、対照と比較して、AD脳中でアップレギュレーションされ;脳およびCSF中のAD7c−NTPタンパク質ベルは、対照よりもADにおいて高く;そしてAD7c−NTP免疫反応性は、老人斑において、神経原線維変化(NFT)において、変性ニューロン神経網糸、およびADおよびダウン症候群の脳でのジストロフィー性神経症萌芽において見出される(Ozturk et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86:419-423(1989); de la Monte et al., J.Clin.Invest., 86(3):1004-13(1990); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 113(2):152-64(1992); de la Monte et al., Ann.Neurol., 32(6):733-42(1992); de la Monte et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol., 55(10):1038-50(1996), de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 138(1-2):26-35(1996); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 135(2):118-25(1996); de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997); and de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999))。NTPは、細胞内、神経網内の微細突起中に局在している
、またはADおよびダウン症候群双方の脳の細胞外にある。de la Monte et al., Ann.Neurol., 32(6):733-42(1992)。

0029

上昇したレベルのAD7c−NTPタンパク質は、AD患者のCSFおよび尿の双方で見出されている(de la Monte and Wands, Front Biosci 7:989-96(2002); de la Monte and Wands, Journal of Alzheimer's Disease 3:345-353(2001); Munzar et al, Alzheimer's Reports 4:61-65(2001); Kahle et al, Neurology 54:1498-1504(2000); Munzar et
al, Alzheimer Reports 3:155-159(2000); de la Monte et al, Alzheimer's Reports 2:327-332(1999); and de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997))。

0030

NTPの過発現は、アルツハイマー病での細胞死の過程にも関連している(de la Monte and Wands, J.Neuropathol.Exp.Neurol., 60:195-207(2001); de la Monte and Wands,
Cell Mol Life Sci 58:844-49(2001))。AD7c−NTPは、ダウン症候群脳組織においても識別されている(Wands et al.,国際特許公開WO90/06993号;de la Monte et al, J Neurol Sci 135:118-25(1996); de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999))。NTPの過発現が正常眼圧緑内障に関連することもありうるという若干の証拠が存在する(Golubnitschaja-Labudova et al, Curr Eye Res 21:867-76(2000))。

0031

NTPは、in vitro の神経膠腫および神経芽細胞腫細胞培養物においても、in vivo
の正常齧歯類動物筋組織皮下結合組織および皮膚、および乳癌皮膚癌および乳頭
腫、結腸癌脳神経膠腫、および齧歯類動物モデルにおけるその他を含めた種々の異なったヒトおよび非ヒト由来腫瘍においても、細胞死を引き起こすのに有効な物質であると証明されている。2002年3月8日出願の係属米国特許出願第10/092,934号、Methodsof Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins
を参照されたい。

0032

AD7c−NTPの若干のペプチド配列(「AD7c−NTPペプチド」)も、in vitro の神経膠腫および神経芽細胞腫の細胞培養物および/または in vivo の正常齧歯類動
物の筋組織、皮下結合組織、皮膚および他の組織の双方において細胞死を引き起こすのに有効な物質であると証明されている。2002年5月24日出願の、Peptides Effective
in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells という表題の米国特許出願第10/153,334号を参照されたい。

0033

関連出願の前述の説明を含めた本明細書を通して、いずれかのおよびすべての米国特許を含めた本明細書中に記載のいずれかのおよびすべての公的に入手可能な論文は、本明細書中にそのまま具体的に援用される。関連出願の前述の説明は、いずれにせよ、係属米国特許出願を含めたそれらに記載されるいずれかの論文が、本発明の先行技術であると承認するものではない。

0034

当該技術分野において、望ましくない細胞要素を処置するための新しい、毒性がより少ない処置が依然として要求されている。本発明は、これら要求を満たしている。

課題を解決するための手段

0035

発明の要旨
本発明は、良性および悪性の腫瘍、腺(例えば、前立腺)過形成、望ましくない顔毛、いぼ、および望ましくない脂肪組織などの、望ましくない細胞増殖を処置するペプチド、組成物および方法に関する。このような方法は、要求がある哺乳動物に、細胞死を引き起こすのに有効な薬剤であると知られているNTPペプチドの治療的有効量を投与することを含む。NTPペプチドという表現は、下に定義される。

0036

本発明のペプチドは、ある種の神経糸タンパク質のアミノ酸配列の一部分に対応する少なくとも一つのアミノ酸配列を有する。本発明の組成物には、ペプチドおよび薬学的に許容しうる担体、または担体もしくは類似のものに抱合されたペプチド、またはポリマーマトリックス内に封入されたペプチド等が含まれる。

0037

本発明は、本発明者らが発見したAD7c−NTPに含有されるペプチド配列が、有害なまたは望ましくない細胞の破壊または除去に有効な薬剤である、および、それらの変異体およびホモログが、ヒトおよび他の哺乳動物を含めた他の生物の他のタンパク質中でも見出されるという発見を一部分包含する。これらペプチド配列がいったん発見されると、これらタンパク質は、National Center Biotechnology Information's Proteinデータベースなどの広く利用可能な公的および商業的タンパク質データベースおよびBLAST登録商標)(Basic Local Alignment Search Tool)などの検索プログラムの使用によっ
て当業者が発見することができる。Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic AcidsRes. 25:3389-3402 を参照されたい。

0038

次に、当業者は、本明細書中に記載の検定法を用いることによってこれらタンパク質をスクリーニングして、望ましくないまたは有害な細胞の破壊または除去のための薬剤としてのそれらの有効性を決定することができる。次に、一つまたはそれを超えるこのような有効な薬剤を発見した当業者は、それら薬剤のどの部分が、本明細書中に記載の、または2002年5月24日出願の、Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells という表題の係属中
の米国特許出願第10/153,334号に記載のAD7c−NTPペプチド配列に相同のまたは類似した配列を含有するのかを決定し、それら薬剤の部分を当業者に知られている方法を用いて合成し、そしてそれら合成された薬剤を、望ましくないまたは有害な細胞の破壊または除去のための薬剤としての有効性について調べることができる。更に、当業
者は、いずれかのこのような発見されたタンパク質のアミノ酸配列を用いて、本明細書中に記載の、または2002年5月24日出願の、Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells と
いう表題の係属米国特許出願第10/153,334号に記載のAD7c−NTPペプチド配列に類似していないまたは相同でない他のペプチド配列を決定もしうると考えられる。次に、これら新しい合成された配列は、望ましくないまたは有害な細胞の破壊または除去のための薬剤としての有効性について調べることができる。

0039

本発明のペプチドまたはタンパク質(「細胞死ペプチド」)は、単独で、または担体または抗体に抱合されて投与することができる。この細胞死ペプチドは、筋肉内、経口、静脈内、腹腔内、大脳内(実質内)、脳室内、腫瘍内、病巣内、皮内、脊髄内、鼻腔内、眼内、動脈内、局所、経皮、エアゾル剤、注入ボーラス注射植込装置徐放性ステム等によって、単独でかまたは担体に抱合されて投与することができる。或いは、細胞死ペプチドは、このペプチドを発現する遺伝子を投与することによって、このような生産を引き起こすワクチンを投与することによって、またはこのペプチドを遺伝子修飾のためかまたはそれ以外で in vivo 発現する細胞、細菌またはウイルスを導入することによって、in vivo で発現することができる。

0040

更に、細胞死ペプチドは、良性および悪性の腫瘍、および他の望ましくないまたは有害な細胞増殖を処置するための他の療法と共に用いることができる。前述の一般的な説明および次の詳細な説明は両方とも、代表するものおよび説明するためのものであり、請求の範囲に記載の発明について追加の説明を与えるためのものである。他の目的、利点および新規な特徴は、次の発明の詳細な説明から、当業者に容易に理解されるであろう。

0041

好ましい態様の詳細な説明
本明細書中で用いられる用語およびは、特に断らない限り、下記のように定義される。

0042

「AD7c−NTP」という表現は、de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-104(1997) に、米国特許第5,948,634号、第5,948,888号および第5
,830,670号の配列120および121に、およびGenBankAF010144
に記載の約41kDタンパク質、およびそれをコードする遺伝子および核酸配列を意味し、それについての核酸配列およびアミノ酸配列は、図1に示されている。「AD7c−NTP」という用語は、AD7c−NTPの生物学的に活性なフラグメント、変異体、誘導体、ホモログおよび模擬体包含する。

0043

「NTP」または「神経糸タンパク質」という用語は、神経糸タンパク質および関連分子(膵臓糸タンパク質を含めた)、およびそれらタンパク質をコードする核酸配列を意味し、次のタンパク質およびこれらタンパク質のアミノ酸配列をコードしている核酸配列が含まれる(が、これに制限されるわけではない)。

0044

(a)AD7c−NTP;
(b)約42kD、約26kD、約21kD、約17kD、約14kDおよび約8kDの種類の、米国特許第5,948,634号、第5,948,888号、第5,830,670号および第6,071,705号に、および de la Monte et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol., 55(10):1038-50(1996)、de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 138(1-2):26-35(1996); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 135(2):118-25(1996)、de la Monte
et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997) および de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999) に記載の神経糸タンパク質;
(c)American Type Culture Collection, Manassas, Va. に受託番号HB−1254
6として寄託されている単クローン性抗体#2または American Type Culture Collection, Manassas, Va. に受託番号HB−12545として寄託されている単クローン性抗体
#5によって特異的に認識されるタンパク質;
(d)AD7c−NTP遺伝子によってコードされるタンパク質;
(e)122アミノ酸神経糸タンパク質であって、米国特許第5,830,670号、第5,948,634号および第5,948,888号による配列40に記載され且つNCBI Entrez-Protein Accession #AAE25447,PID g10048540に挙げられた、アミノ酸配列が図2に示されているもの;
(f)112アミノ酸神経糸タンパク質であって、NCBI Entrez-Protein Accession #XP 032307,PIDg 14725132に挙げられた、アミノ酸配列が図3に示されているもの;
(g)106アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質であって、NCBI Entrez-Protein Accession #AAH14951 PID g15928971に挙げられた、アミノ酸配列が図4に示されているもの;
(h)106アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質であって、NCBI Entrez-Protein Accession #XP 039102,PID g18599339に挙げられた、アミノ酸配列が図5に示されているもの;
(i)98アミノ酸神経糸タンパク質であって、米国特許第5,830,670号、第5,948,634号および第5,948,888号による配列30に記載され且つNCBI Entrez-Protein Accession #AAE25445,PID g10048538に挙げられた、アミノ酸配列が図6に示されているもの;
(j)75アミノ酸神経糸タンパク質であって、米国特許第5,830,670号、第5,948,634号および第5,948,888号による配列48に記載され且つNCBI Entrez-Protein Accession #AAE25448,PID g10048541に挙げられた、アミノ酸配列が図7に示されているもの;
(k)68アミノ酸神経糸タンパク質であって、米国特許第5,830,670号、第5,948,634号および第5,948,888号による配列36に記載され且つNCBI Entrez-Protein Accession #AAE25446,PID g10048539に挙げられた、アミノ酸配列が図8に示されているもの;
(l)61アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質であって、NCBI Entrez-Protein Accession #AAH02534,PID g12803421に挙げられた、アミノ酸配列が図9に示されているもの;
(m)膵臓糸タンパク質;
(n)米国特許第6,071,705号に記載の神経膵臓糸タンパク質(nPTP);および
(o)American Type Culture Collection に寄託されたHB9934、HB9935
およびHB9936から成る群によるハイブリドーマによって生産される抗体によって特異的に認識されるタンパク質。

0045

「NTPペプチド」という表現は、NTPのアミノ酸配列の少なくとも一部分またはNTPのフラグメントに対応するアミノ酸配列を含むペプチドを意味し、特に断らない限り、このようなペプチドのホモログ、誘導体、変異体、融合タンパク質およびペプチド模擬体が含まれる。「NTPペプチド」という表現には、米国特許出願第10/092,934号および第10/153334号に具体的に挙げられたペプチドも含まれる(が、それに制限されるわけではない)。「NTPペプチド」という表現には、好ましくは、NTPの次のアミノ酸配列:
(a)NTPペプチド#1[配列番号10]、AD7c−NTP p227−245に類似し、p228の後に追加のフェニルアラニン残基の挿入を有する。

0046

PGFFLFSCPLLSSWDYRR
Pro−Gly−Phe−Phe−Lys−Leu−Phe−Ser−Cys−Pro−Ser−Leu−Leu−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg
対応する核酸配列[配列番号10A]
CCCGGTTTTCAAGTTATTCTCCTGCCCCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGACTACAGGCGC
(b)NTPペプチド#2[配列番号11]、AD7c−NTP p114−132
PELKQSTCLSLPKCWDYRR
Pro−Glu−Leu−Lys−Gln−Ser−Thr−Cys−Leu−Ser−Leu−Pro−Lys−Cys−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg
対応する核酸配列[配列番号11A]
CCTGAGCTCAAGCAGTCCACCTGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGT
(c)NTPペプチド#3[配列番号12]、AD7c−NTP p326−344
PPGLKRFSCLSLPSSWDYG
Pro−Pro−Gly−Leu−Lys−Arg−Phe−Ser−Cys−Leu−Ser−Leu−Pro−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Gly
対応する核酸配列[配列番号12A]
CCTCCCGGGCTCAAGCGATTCTCCTGTCTCAGCCTCCCAAGCAGCTGGGATTACGGG
(d)NTPペプチド#4[配列番号13]、AD7c−NTP p332−345
FSCLSLPSSWDYGH
Phe−Ser−Cys−Leu−Ser−Leu−Pro−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Gly−His
対応する核酸配列[配列番号13A]
TTCTCCTGTCTCAGCCTCCCAAGCAGCTGGGATTACGGGCAC
(e)NTPペプチド#5[配列番号14]、AD7c−NTP p119−132
STCLSLPKCWDYRR
Ser−Thr−Cys−Leu−Ser−Leu−Pro−Lys−Cys−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg
対応する核酸配列[配列番号14A]
TCCACCTGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGT
(f)NTPペプチド#6[配列番号15]、AD7c−NTP p232−245
FSCPSLLSSWDYRR
Phe−Ser−Cys−Pro−Ser−Leu−Leu−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg
対応する核酸配列[配列番号15A]
TTCTCCTGCCCCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGACTACAGGCGC
(g)NTPペプチド#7[配列番号16]、AD7c−NTP p335−343
LSLPSSWDY
Leu−Ser−Leu−Pro−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Gly
対応する核酸配列[配列番号16A]
CTCAGCCTCCCAAGCAGCTGGGATTAC
(h)NTPペプチド#8[配列番号17]、AD7c−NTP p122−132
LSLPKCWDYRR
Leu−Ser−Leu−Pro−Lys−Cys−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg
対応する核酸配列[配列番号17A]
CTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGT
(i)NTPペプチド#9[配列番号18]、AD7c−NTP p236−245
SLLSSWDYRR
Ser−Leu−Leu−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg
対応する核酸配列[配列番号18A]
AGCCTCCTGAGTAGCTGGGACTACAGGCGC
(j)NTPペプチド#10[配列番号19]、N末端ロイシン残基およびプロリン残基の追加を有する、AD7c−NTP p239−245。

0047

LPSSWDYRR
Leu−Pro−Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg
対応する核酸配列[配列番号19A]
CTCCCAGAGTAGCTGGGACTACAGGCGC
(k)NTPペプチド#11[配列番号20]、AD7c−NTP p239−245
SSWDYRR
Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg
対応する核酸配列[配列番号20A]
GAGTAGCTGGGACTACAGGCGC
(l)NTPペプチド#12[配列番号21]、AD7c−NTP p239−243,p339−343
SSWDY
Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr
対応する核酸配列[配列番号21A]
AGCAGCTGGGATTAC
(m)NTPペプチド#13[配列番号22]、AD7c−NTP p239−245
+ AD7c−NTP p139−144
SSWDYRRFILFFL
Ser−Ser−Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg−Phe−Ile−Leu−Phe−Phe−Leu
対応する核酸配列[配列番号22A]
GAGTAGCTGGGACTACAGGCGCTTTATTTTATTTTTTTTA
(n)NTPペプチド#14[配列番号23]、AD7c−NTP p241−245
+ AD7c−NTP p197−202
WDYRRFIFNFL
Trp−Asp−Tyr−Arg−Arg−Phe−Ile−Phe−Asn−Phe−Leu
対応する核酸配列[配列番号23A]
TGGGACTACAGGCGCTTTATTTTTAATTTTTTG
(o)NTPペプチド#15[配列番号24]、AD7c−NTP p297−302
FNFCLF
Phe−Asn−Phe−Cys−Leu−Phe
対応する核酸配列[配列番号24A]
TTTAATTTTTGTTTGTTT
(p)NTPペプチド#16[配列番号25]、AD7c−NTP p197−202
FIFNFL
Phe−Ile−Phe−Asn−Phe−Leu
対応する核酸配列[配列番号25A]
TTTATTTTTAATTTTTTG
(q)NTPペプチド#17[配列番号26]、AD7c−NTP p31−43
PASASPVGIGM
Pro−Ala−Ser−Ala−Ser−Pro−Val−Ala−Gly−Ile−Thr−Gly−Met
対応する核酸配列[配列番号26A]
CCTGCCTCAGCCTCCCCAGTAGCTGGGATTACAGGCATG
(r)NTPペプチド#18[配列番号27]、AD7c−NTP p175−187
PASASQVAGTKDM
Pro−Ala−Ser−Ala−Ser−Gln−Val−Ala−Gly−Thr−Lys−Asp−Met
対応する核酸配列[配列番号27A]
CCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACCAAAGACAT
(s)NTPペプチド#19[配列番号28]、AD7c−NTP p277−289
PASASQSAGITGV
Pro−Ala−Ser−Ala−Ser−Gln−Ser−Ala−Gly−Ile−Thr−Gly−Val
対応する核酸配列[配列番号28A]
CCTGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGも含まれ(が、これに制限されるわけではない)、および、これら具体的に挙げられたNTPペプチドおよびそれらの対応する核酸配列のホモログ、誘導体、変異体、フラグメント、融合タンパク質およびペプチド模擬体も含まれる。

0048

「フラグメント」という用語は、NTPタンパク質またはNTPペプチドのアミノ酸配列の連続部分配列から成るタンパク質またはポリペプチドを意味し、スプライス変異体のような天然に存在するフラグメントおよび天然に存在する in vivoプロテアーゼ活性
よって得られるフラグメントが含まれる。このようなフラグメントは、アミノ末端カルボキシ末端および/または内部で(自然スプライシングによるように)切り取られていてよい。このようなフラグメントは、アミノ末端メチオニンを含んでまたは含むことなく調製することができる。「フラグメント」という用語には、同一であろうと異なっていようと、同じNTPタンパク質またはNTPペプチドからのものであり、直接的にかまたはリンカーを介して互いに連結された、共通したまたはしない連続アミノ酸配列を含むフラグメントが含まれる。

0049

「変異体」という用語は、NTPタンパク質またはNTPペプチドのアミノ酸配列と比較したところ、一つまたはそれを超えるアミノ酸の置換欠失および/または挿入が存在するタンパク質またはポリペプチドを意味し、NTPタンパク質またはNTPペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体または別のスプライス変異体を包含する。「変異体」という用語は、一つまたは複数の類似のもしくは相同のアミノ酸、または一つまたは複数の類似していないアミノ酸での、ペプチド配列中の一つまたはそれを超えるアミノ酸の置換を包含する。アミノ酸を、類似しているまたは相同であると格付けしうる多数の尺度が存在する。(Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, p.123-39 (Academic Press, New York, NY 1987。)好ましい変異体は、一つまたはそれを超えるアミノ酸位置におけるアラニン置換を包含する。他の好ましい置換には、そのタンパク質の全体の正味電荷極性または疎水性にほとんどまたは全く作用しない保存的置換が含まれる。保存的置換は、下の表2に示される。

0050

0051

表3は、アミノ酸置換のもう一つのスキームを示す。

0052

0053

他の変異体は、(a)置換部位におけるポリペプチド主鎖の、例えば、シートまたはヘリックスコンホメーションとしての構造、(b)標的部位における分子電荷または疎水性、または(c)側鎖の嵩、を維持することへの作用が一層有意に異なる残基を選択することなどの、あまり保存的でないアミノ酸置換から成ることがありうる。概して、機能に一層有意に作用すると考えられる置換は、(a)グリシンおよび/またはプロリンが、別のアミノ酸で置換されている、または欠失しているまたは挿入されている;(b)親水性
残基、例えば、セリルまたはトレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシルイソロイシルフェニルアラニルバリルまたはアラニルの代わりに(またはによって)置換されている;(c)システイン残基が、いずれか他の残基の代わりに(またはによって)置換されている;(d)陽電性側鎖を有する残基、例えば、リシルアルギニルまたはヒスチジルが、陰電荷を有する残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルの代わりに(またはによって)置換されている;または(e)嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、このような側鎖を有していないもの、例えば、グリシンの代わりに(またはによって)置換されている置換である。他の変異体には、一つまたは複数の新規なグリコシル化および/またはリン酸化部位を生じるように設計されたものかまたは、一つまたは複数の既存のグリコシル化および/またはリン酸化部位を欠失するように設計されたものが含まれる。変異体は、グリコシル化部位タンパク質分解切断部位および/またはシステイン残基に少なくとも一つのアミノ酸置換を包含する。変異体には、リンカーペプチド上のNTPまたはNTPペプチドアミノ酸配列の前または後に追加のアミノ酸残基を含むNTPタンパク質またはNTPペプチドも含まれる。例えば、システイン残基は、ジスルフィド結合の形成によって環化させるために、アミノ末端とカルボキシ末端の両方に加えることができる。「変異体」という用語は、NTPペプチドの3’末端かまたは5’末端に隣接する少なくとも1個〜25個またはそれを超える追加のアミノ酸を含むNTPペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。

0054

「誘導体」という用語は、プロセシングおよび他の翻訳後修飾のような自然過程によって、また、例えば、一つまたはそれを超えるポリエチレングリコール分子、糖、リン酸および/または他のこのような分子であって、この一つまたは複数の分子は野生型NTPタンパク質またはペプチドに本来結合していない分子、の付加のような化学修飾技術のいずれによっても化学修飾されている化学修飾タンパク質またはポリペプチドを意味する。誘導体には塩が含まれる。このような化学修飾は、基本的教本におよびより詳細なモノグラフに、更には、多くの研究文献に充分に記載されており、当業者に周知である。同じタイプの修飾が、ある与えられたタンパク質またはポリペプチドのいくつかの部位に同じまたはいろいろな程度で存在してよいということは理解されるであろう。更に、ある与えられたタンパク質またはポリペプチドは、多数のタイプの修飾を含有してよい。修飾は、ペプチド主鎖アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めた、タンパク質またはポリペプチド中のどこにでも起こりうる。修飾には、例えば、アセチル化アシル化ADPリボシル化アミド化フラビン共有結合性付着、ヘム部分の共有結合性付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合性付着、脂質または脂質誘導体の共有結合性付着、ホスホチジルイノシトールの共有結合性付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成脱メチル化共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化ヨウ素化メチル化ミリストイル化酸化タンパク質分解プロセシングリン酸化フェニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質付着、硫酸化グルタミン酸残基のγカルボキシル化、ヒドロキシル化およびADP−リボシル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような転移RNAに媒介されるアミノ酸のタンパク質への付加、ならびにユビキチン化が含まれる。例えば、Proteins--Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., T.E.Creighton, W.H.Freeman and Company, New York (1993) and Wold,F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects," pgs.1-12 in Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B.C.Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth.Enzymol. 182:626-646(1990) and Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging," Ann.N.Y.Acad.Sci. 663:48-62(1992) を参照されたい。「誘導体」という用語は、分岐状になる、または分岐を含んでまたは含むことなく環状になるタンパク質またはポリペプチドを生じる化学修飾を包含する。環状、分岐状および分岐環状のタンパク質またはポリペプチドは、翻訳後自然過程によって生じてよいし、完全な合成法によって製造されてもよい。

0055

「ホモログ」という用語は、場合により、二つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するのに一般的に用いられる標準法によって決定したところ、NTPタンパク質またはNTPペプチドのアミノ酸配列が少なくとも60%一致しているタンパク質を意味する。二つのタンパク質間の類似性または同一性の程度は、Computational Molecular Biology, Lesk,A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith,D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin,A.M., and Griffin,H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje,G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov,M. and Devereux,J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo H. and Lipman,D., SIAM, J.Applied Math., 48:1073(1988) に記載のものが含まれるがこれに制限されるわけで
はない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定する好ましい方法は、調べられる配列間に最大の対合を与えるように設計されている。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能な計算機プログラム体系化される。

0056

二つの配列間の同一性および類似性を決定するのに有用な好ましい計算機プログラム方法には、GCGプログラムパッケージ(Devereux,J., et al., Nucleic AcidsResearch,
12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTNおよびFASTA(Atschul,S.F. et al., J.Molec.Biol., 215:403-410(1990))が含まれるが、これに制限されるわけではな
い。BLAST Xプログラムは、NCBIおよび他の源から公的に入手可能である(BLAST Manual, Altschul,S., et al., NCBINLM NIH Bethesda, Md. 20894; Atschul,S., et al., J.Mol.Biol., 215:403-410(1990))。例として、GAP(Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)のような計算機アルゴリズムを用いて、配列同一性%が決定される予定の二つのタンパク質またはポリペプチドを、それぞれのアミノ酸を最適に対合させるために整列させる(アルゴリズムによって決定される「対合スパン」)。

0057

ギャップオープニングペナルティー(gap opening penalty)(3x(倍)平均ダイア
ゴナルとして計算される;「平均ダイアゴナル」は、用いられている比較マトリックスのダイアゴナルの平均である;「ダイアゴナル」は、具体的な比較マトリックスによって各々の完全なアミノ酸に割り当てられるスコアまたは数である)およびギャップエクステンションペナルティー(gap extension penalty)(通常は、ギャップオープニングペナル
ティーの1/10倍である)、更には、PAM250またはBLOSUM62のような比較マトリックスを、このアルゴリズムと共に用いる。標準的な比較マトリックス(PAM250比較マトリックスについては、Dayhoff et al. in: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.5, supp.3[1978] を参照されたい;BLOSUM62比較マトリックスについては、Henikoff et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA, 89:10915-10919[1992] を参照されたい)も、このアルゴリズムによって用いることができる。次に、同一性%を、このアルゴリズムによって計算する。典型的には、ホモログは、場合により、比較NTPタンパク質またはNTPペプチドと比較すると、一つまたはそれを超えるアミノ酸の置換、欠失および/または挿入を有するであろう。

0058

「ペプチド模擬体」または「模擬体」という用語は、あるペプチドまたはタンパク質の生物学的活性模擬しているが、化学的性質がもはやペプチドでない、すなわち、ペプチド結合(すなわち、アミノ酸間のアミド結合)をもはや全く含有していない生物学的に活性な化合物を意味する。ここで、ペプチド模擬体という用語は、より広い意味で、プソイドペプチド、半ペプチドおよびペプトイドのような、性質がもはや完全にペプチドではない分子を包含するのに用いられる。このより広い意味でのペプチド模擬体(ペプチドの一部分が、ペプチド結合を欠いた構造によって置き換えられている場合)の例を、下に記載
する。完全に非ペプチドであれ部分的に非ペプチドであれ、本発明によるペプチド模擬体は、そのペプチド模擬体が基づいているNTPペプチド中の活性基の三次元配置にきわめて似ている反応性化学部分空間的配置を与える。この類似した活性部位幾何学的形の結果として、ペプチド模擬体は、NTPペプチドの生物学的活性に類似している生体系への作用を有する。

0059

本発明のペプチド模擬体は、好ましくは、三次元形状も生物学的活性も、本明細書中に記載のNTPペプチドに実質的に類似している。当該技術分野において知られているペプチドを構造的に修飾してペプチド模擬体を生じる方法の例には、タンパク質分解への増加した安定性を、特にN末端において、活性に悪影響を与えることなくもたらしうるDアミノ酸残基構造をもたらす主鎖キラル中心反転が含まれる。一例は、"Tritriated D-ala1-Peptide T Binding", Smith C.S. et al., Drug Development Res., 15,pp.371-379(1988) という論文に記載されている。二番目の方法は、N−C鎖間イミドおよびラクタム
ような、安定性のために環状構造を変化させることである(Ede et al. in Smith and River (Eds.) "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp.268-270)。これの例は、本明細書中にその開示がそのまま援用される米国特許第4,457,489号(1985年),Goldstein,G. et al. に開示されたものなどの、コンホメーションが制限されたチモペンチン(thymopentin)様化合物において与えられている。三番目の
方法は、タンパク質分解に耐性を与えるプソイドペプチド結合によってNTPペプチド中のペプチド結合を置換することである。

0060

概して、ペプチドの構造および生物学的活性に影響を与えない多数のプソイドペプチド結合が記載されてきている。このアプローチの一つの例は、レトロインベルソ(retro-inverso)プソイドペプチド結合を代用することである(本明細書中に援用される、"Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al in River,J.E. and Marshall,G.R.(eds) "Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pp.722-773) and Dalpozzo, et al. (1993), Int.J.Peptide Protein Res., 41:561-566)。この修飾によれば、これらペプチドのアミノ酸配列は、一つまたはそれを超えるペプチド結合がレトロインベルソプソイドペプチド結合によって置き換えられていることを除いて、上記のNTPペプチドの配列と一致しうる。好ましくは、最もN末端のペプチド結合が置換されるが、それは、このような置換が、N末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に耐性を与えるからである。更に別の修飾も、アミノ酸の化学基を、類似した構造の他の化学基で置き換えることによって行うことができる。生物学的活性をほとんどまたは全く失うことなく酵素的切断への安定性を増加させることが知られているもう一つの適当なプソイドペプチド結合は、還元等配電子体(reduced isostere)プソイドペプチド結合である(本明細書中にそのまま援用される Couder, et al. (1993), Int.J.Peptide Protein Res., 41:181-184)。

0061

したがって、これらペプチドのアミノ酸配列は、一つまたはそれを超えるペプチド結合が等配電子体プソイドペプチド結合によって置き換えられていることを除いて、NTPペプチドの配列と一致しうる。「(一つまたは複数の)アミノ酸配列」という表現は、好ましくは、少なくとも2個のアミノ酸、好ましくは、少なくとも4個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも5個アミノ酸の配列を示すのに用いられる。好ましくは、最もN末端のペプチド結合が置換されるが、それは、このような置換が、N末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に耐性を与えると考えられるからである。一つまたはそれを超える還元等配電子体プソイドペプチド結合を含むペプチドの合成は、当該技術分野において知られている(上に引用される Couder, et al. (1993))。他の例には、ペプチド結合を置き換えるためのケトメチレン結合またはメチルスルフィド結合の導入が含まれる。

0062

NTPペプチドのペプトイド誘導体は、生物学的活性に重要な構造決定基を保持しているがなお、ペプチド結合が除かれていることによって、タンパク質分解への耐性を与えているペプチド模擬体のもう一つのクラスである(本明細書中にそのまま援用される Simon, et al., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:9367-9371)。ペプトイドは、N−置換グリシンのオリゴマーである。天然アミノ酸の側鎖に各々対応する多数のN−アルキル基が記載されてきている(上に引用される Simon, et al. (1992))。NTPペプチドの若干
のまたはすべてのアミノ酸を、置き換えられたアミノ酸に対応するN−置換グリシンで置き換えてもよい。

0063

「ペプチド模擬体」または「模擬体」という表現には、下に定義される逆Dペプチドおよび鏡像異性体も含まれる。「逆Dペプチド」という句は、NTPペプチドのL−アミノ酸配列と比較して逆順序で配置されるD−アミノ酸から成る生物学的に活性なタンパク質またはペプチドを意味する。したがって、L−アミノ酸NTPペプチドのカルボキシ末端残基は、D−アミノ酸ペプチドのアミノ末端等になる。例えば、NTPペプチドSSWDYは、YdDdWdSdSdになり、ここにおいて、Dd、Sd、WdおよびYdは、L−アミノ
酸D、S、WおよびYにそれぞれ対応するD−アミノ酸である。

0064

本明細書中で用いられる「鏡像異性体」は、NTPペプチドのアミノ酸配列中の一つまたはそれを超えるL−アミノ酸残基が、一つまたは複数の対応するD−アミノ酸残基で置き換えられている生物学的に活性なタンパク質またはペプチドを意味する。

0065

本明細書中に記載のアミノ酸およびアミノ酸残基は、下の表に与えられる承認された一文字または三文字コードによって表すことができる。

0066

0067

本発明は、本発明中において上に定義のNTPペプチドを含む組成物に関する。好ましいNTPペプチドは、AD7c−NTPに由来するNTPペプチドに類似しているまたは相同である。しかしながら、NTPタンパク質の他の種類の一部分またはフラグメントに基づく他のNTPペプチドの使用も、本発明によって包含される。例えば、AD7c−N
TPペプチド配列および類似の変異体およびホモログは、広範囲のヒトおよび非ヒトタンパク質(「関連タンパク質」)中でも見出される。具体的には、AD7c−NTP遺伝子は、ヒトおよび他の霊長類ゲノムの他の遺伝子中でも見出されるものにきわめて類似しているAlu型配列を含有する。

0068

したがって、すべてではないとしても若干の関連タンパク質が、AD7c−NTPペプチドに相同のまたはきわめて類似しているペプチド配列を含有するので(「関連ペプチド」)、それらも細胞死を引き起こすのに有効な薬剤であると証明されるであろうと考えるのは妥当である。同様に、当業者は、細胞死を引き起こすのに有効な薬剤であることが判明したいずれかの関連タンパク質のアミノ酸配列に基づく特定の関連ペプチドを合成し、そして細胞死を引き起こすための薬剤としての効力についてそれらを調べることができる。

0069

細胞死を引き起こすのに有効な薬剤であることが判明した関連タンパク質に由来する他のペプチド配列も、細胞死を引き起こすのに有効な薬剤でありうる。当業者は、他の有効なペプチド配列を同定するために、過度の実験を伴うことなく、有効な関連タンパク質のフラグメントをそのタンパク質のアミノ酸配列全体にわたって合成することができる。

0070

本発明の好ましいNTPペプチドには、NTPペプチド配列に一致する、きわめて類似したまたは相同のアミノ酸配列を含有することが知られているタンパク質およびペプチドが含まれる。

0071

本発明によって包含されるNTPペプチドおよびそれらのフラグメント、変異体、誘導体、ホモログおよび模擬体は、組換えDNA技術タンパク質合成、および天然に存在するNTPペプチドおよびそれらのフラグメント、変異体、誘導体およびホモログの単離などの、当業者に知られている方法を用いて調製することができる。

0072

NTPペプチドは、Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989])および/また
は Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N.Y. [1994] に記載された方法などの周知の組換えDNA
技術方法を用いて調製することができる。

0073

NTPペプチドをコードしている遺伝子またはcDNAは、例えば、ゲノムまたはcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって、またはPCR増幅によって得てもよい。このライブラリーをスクリーニングするのに有用なプローブまたはプライマーは、例えば、他のNTPペプチドまたはNTPタンパク質中で見出される保存モチーフなどの同じまたは関連した遺伝子ファミリーからの、他の既知の遺伝子または遺伝子フラグメント配列情報に基づいて生じることができる。更に、NTPペプチドまたはNTPタンパク質をコードしている遺伝子が一つの種から同定されている場合、その遺伝子の全部または一部分をプローブとして用いて、他の種から相同遺伝子を同定することができる。これらプローブまたはプライマーは、NTPペプチドまたはNTPタンパク質遺伝子を発現すると考えられる種々の組織源からcDNAライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。典型的には、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小限にするようにスクリーニングするために、高ストリンジェンシー条件が用いられるであろう。

0074

NTPペプチドまたはNTPタンパク質をコードしている遺伝子を調製するもう一つの手段は、Engels et al. (Angew.Chem.Intl.Ed., 28:716-734[1989]) によって記載された方法のような当業者に周知の方法を用いた化学合成を用いることである。これら方法には、特に、核酸合成のためのホスホトリエステル法、ホスホロアミダイト法およびH−ホス
ホネート法が含まれる。このような化学合成に好ましい方法は、標準的なホスホロアミダイト化学を用いたポリマーに支持された合成である。典型的には、NTPペプチドまたはNTPタンパク質をコードしているDNAは、数百ヌクレオチド長さであろう。約100ヌクレオチドより大の核酸は、これら方法を用いていくつかのフラグメントとして合成することができる。次に、それらフラグメントを互いに連結して、完全長NTPペプチドまたはNTPタンパク質を形成することができる。通常は、タンパク質のアミノ末端をコードしているDNAフラグメントは、メチオニン残基をコードしているATGを有するであろう。このメチオニンは、宿主細胞中で生産されるタンパク質が、その細胞から分泌されるように設計されているかどうかによって、NTPタンパク質またはNTPペプチドの成熟型上に存在してよいしまたはしなくてよい。

0075

NTPタンパク質またはNTPペプチドをコードしている遺伝子、cDNAまたはそのフラグメントは、標準的な連結技術を用いて適当な発現または増幅ベクター中に挿入することができる。このベクターは、典型的には、用いられる具体的な宿主細胞中で機能性であるように選択される(すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および/または遺伝子の発現が起こりうるような宿主細胞機構適合性である)。NTPタンパク質またはNTPペプチドをコードしている遺伝子、cDNAまたはそのフラグメントは、原核生物酵母昆虫バキュロウイルス系)および/または真核生物の宿主細胞中で増幅/発現されてよい。宿主細胞の選択は、このNTPタンパク質またはNTPペプチドが、グリコシル化されるのかおよび/またはリン酸化されるのかどうかに一部分は依存するであろう。そのような場合、酵母、昆虫または哺乳動物の宿主細胞が好適である。

0076

典型的には、いずれかの宿主細胞中で用いられるベクターは、5’フランキング配列プロモーターとも称される)と、一つまたは複数のエンハンサー複製起点要素、転写終結要素、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全なイントロン配列シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位要素、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードしている核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能マーカー要素などの他の調節要素を含有するであろう。これら要素は各々、下で論じる。場合により、ベクターは、タグ配列、すなわち、NTPタンパク質またはNTPペプチドコーディング配列の5’末端または3’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してよく;このオリゴヌクレオチド分子は、ポリHis(ヘキサHisなど)、または商業的に入手可能な抗体が存在するFLAG、HAヘマグルチニンインフルエンザウイルス)またはmycなどの他のタグをコードしている。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合し、そして宿主細胞からのNTPタンパク質またはNTPペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ちうる。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリックスとしてこのタグに対する抗体を用いたカラムクロマトグラフィーによって行うことができる。場合により、タグは、精製されたNTPタンパク質またはNTPペプチドから、ある種のペプチダーゼを用いるようないろいろな手段によってその後除去することができる。

0077

ヒト免疫グロブリンヒンジ領域およびFc領域は、当業者によって、NTPタンパク質またはNTPペプチドのN末端かまたはC末端において融合しうる。その後のFc融合タンパク質は、プロテインAアフィニティーカラムの使用によって精製しうる。Fcは、長い薬物動態学的in vivo半減期を示すことが知られており、Fcに融合したタンパク
質は、未融合の対応物よりも実質的に長い in vivo 半減期を示すことが判明している。
更に、Fc領域への融合は、若干の分子の生物活性に有用でありうる分子の二量体化多量体化を可能にする。

0078

5’フランキング配列は、相同であってよいし(すなわち、宿主細胞と同じ種および/または系統による)、異種であってよいし(すなわち、宿主細胞の種または系統以外の種
による)、ハイブリッド(すなわち、1より多くの源からの5’フランキング配列の組合せ)であってよいし、合成であってよいし、またはそれは、天然のNTPタンパク質またはNTPペプチド遺伝子5’フランキング配列であってよい。そのようなものとして、5’フランキング配列源は、いずれの単細胞原核性生物または真核生物であってもよいし、いずれの脊椎動物または無脊椎動物であってもよいし、またはいずれの植物であってもよいが、但し、その5’フランキング配列は、宿主細胞機構中で機能性であり、しかも宿主細胞機構によって活性化されうるという条件付きである。

0079

本発明のベクター中で有用な5’フランキング配列は、当該技術分野において周知のいくつかの方法のいずれによっても得ることができる。典型的には、NTPタンパク質またはNTPペプチド遺伝子フランキング配列以外の本明細書中で有用な5’フランキング配列は、マッピングによっておよび/または制限エンドヌクレアーゼ消化によって予め同定されているので、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な組織源から単離することができる。ある場合には、5’フランキング配列の完全なヌクレオチド配列を知ることができる。ここで、5’フランキング配列を、核酸の合成またはクローニングについて上に記載された方法を用いて合成することができる。

0080

5’フランキング配列の全部または一部分だけが知られている場合、それは、PCRを用いて、および/または、同じ種または別の種から適当なオリゴヌクレオチドおよび/または5’フランキング配列フラグメントでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。

0081

5’フランキング配列が知られていない場合、5’フランキング配列を含有するDNAのフラグメントは、例えば、コーディング配列または別の一つもしくは複数の遺伝子さえも含有しうるより大きいDNA片から単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化により、適当なDNAフラグメントを単離するために慎重に選択された一つまたはそれを超える酵素を用いて行うことができる。消化後、所望のフラグメントを、アガロースゲル精製、Qiagen(登録商標)カラムまたは当業者に知られている他の方法によって単離することができる。この目的を達成するのに適した酵素の選択は、当業者に容易に理解されるであろう。

0082

複製起点要素は、典型的には、商業的に購入される原核生物発現ベクターの一部分であり、宿主細胞中でのベクターの増幅を助ける。一定のコピー数へのベクターの増幅は、ある場合には、NTPタンパク質またはNTPペプチドの最適発現に重要でありうる。選択されたベクターが複製起点部位を含有していない場合、既知の配列に基づいて化学合成し、そしてベクター中に連結してもよい。転写終結要素は、典型的には、NTPタンパク質またはNTPペプチドコーディング配列の3’末端に位置し、NTPタンパク質またはNTPペプチドの転写を終結するのに役立つ。通常は、原核細胞中の転写終結要素は、G−Cの多いフラグメント後にポリT配列がある。この要素は、ライブラリーからクローン化されてよいしまたはベクターの一部分として商業的に購入されてよいが、上に記載されたような核酸合成の方法を用いて容易に合成することもできる。

0083

選択可能マーカー遺伝子要素は、選択培地中で増殖した宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードしている。典型的な選択マーカー遺伝子は、(a)原核生物宿主細胞に、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリンテトラサイクリンまたはカナマイシンへの耐性を与える、(b)細胞の栄養要求性欠損を補足する;または(c)複合培地から入手できない重大な栄養素を供給する、タンパク質をコードしている。好ましい選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。

0084

Shine-Dalgarno 配列(原核生物)または Kozak 配列(真核生物)と一般的に称されるリボソーム結合要素は、通常は、mRNAの翻訳開始に必要である。この要素は、典型的には、合成されるNTPタンパク質またはNTPペプチドのプロモーターの3’およびコーディング配列の5’に位置している。この Shine-Dalgarno 配列は様々であるが、典型的には、ポリプリンである(すなわち、高いA−G含量を有する)。多数の Shine-Dalgarno 配列が同定されており、各々、上記の方法を用いて当業者が容易に合成することができるし、原核生物ベクター中で用いることができる。

0085

NTPタンパク質またはNTPペプチドが宿主細胞から分泌されることが望まれる場合、シグナル配列は、NTPタンパク質またはNTPペプチドを、それが合成される宿主細胞の外へと指示するのに用いることができ、このタンパク質のカルボキシ末端部分は、膜固定を妨げるために欠失していてよい。典型的には、このシグナル配列は、NTPタンパク質/NTPペプチド遺伝子またはcDNAのコーディング領域中に、またはNTPタンパク質/NTPペプチド遺伝子コーディング領域の5’末端に直接的に位置している。多数のシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞中で機能性であるそれらはいずれも、NTPタンパク質/NTPペプチド遺伝子またはcDNAと共に用いることができる。したがって、このシグナル配列は、NTPタンパク質/NTPペプチド遺伝子またはcDNAに相同であってよいしまたは異種であってよいし、NTPタンパク質/NTPペプチド遺伝子またはcDNAに相同であってよいしまたは異種であってよい。更に、このシグナル配列は、上記の方法を用いて化学合成してもよい。大部分の場合、シグナルペプチドの存在による宿主細胞からのポリペプチドの分泌は、ポリペプチドからのアミノ末端メチオニンの除去を引き起こすであろう。

0086

多くの場合、NTPタンパク質/NTPペプチド遺伝子またはcDNAの転写は、ベクター中の一つまたはそれを超えるイントロンの存在によって増加するが;これは、特に、NTPタンパク質またはNTPペプチドが真核生物宿主細胞、特に、哺乳動物宿主細胞中で生産される場合に真実である。用いられるイントロンは、特に、用いられる遺伝子が完全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、NTPタンパク質/NTPペプチド遺伝子内に天然に存在していてよい。このイントロンが(大部分のcDNAの場合のように)遺伝子内に天然に存在しない場合、一つまたは複数のイントロンは、別の源から得ることができる。フランキング配列およびNTPタンパク質/NTPペプチド遺伝子に関するイントロンの位置は、このイントロンが有効であるように転写されるべきであるので、概して重要である。そのようなものとして、発現ベクター中に挿入されるNTPタンパク質/NTPペプチド遺伝子がcDNA分子である場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の3’およびポリA転写終結配列の5’である。NTPタンパク質/NTPペプチドcDNAについて、好ましくは、一つまたは複数のイントロンは、それがこのコーディング配列を分断しないように、cDNA一方の側またはもう一方(すなわち、5’または3’)に位置するであろう。いずれかのウイルス、原核生物および真核生物(植物または動物)を含めたいずれかの源からのいずれのイントロンも、本発明を実施するのに用いることができるが、但し、それは、それが挿入される一つまたは複数の宿主細胞と適合性であるという条件付きである。更に、本明細書中に含まれるのは、合成イントロンである。場合により、二つ以上のイントロンをベクター中に用いてよい。

0087

上記の一つまたはそれを超える要素が、用いられるベクター中に既に存在しているのではない場合、それらは、個々に得ることができそしてベクター中に連結することができる。これら要素の各々を得るのに用いられる方法は、当業者に周知であり、上記の方法(すなわち、DNAの合成、ライブラリースクリーニング等)に匹敵する。

0088

本発明を実施するのに用いられる最終ベクターは、典型的には、商業的に入手可能なベクターなどの出発用ベクターから構築される。このようなベクターは、完成したベクター
中に含まれるべき若干の要素を含有してよいしまたは含有しなくてよい。出発用ベクター中に所望の要素が全く存在しない場合、ベクター中に連結される要素の末端およびベクターの末端が連結に適合性であるように、一つまたは複数の適切な制限エンドヌクレアーゼでベクターを切ることによって、各々の要素を個々にベクター中に連結することができる。ある場合には、満足のいく連結を得るために、互いに連結されるこれら末端をブラントにすることが必要でありうる。ブラントにすることは、クレノウDNAポリメラーゼまたはT4 DNAポリメラーゼを全4個のヌクレオチドの存在下で用いて、最初に「付着末端」を埋めることによって行われる。この手順は、当該技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., 上記に記載されている。或いは、ベクター中に挿入される二つ
またはそれを超える要素は、(それらが互いに隣接した位置にあるべきならば)最初に互いに連結した後、ベクター中に連結することができる。

0089

ベクターを構築するさらなる方法は、いろいろな要素の連結をすべて一つの反応混合物中で同時に行うことである。ここでは、これら要素の不適当な連結または挿入のために、多数のナンセンスまたは非機能性ベクターが生じるであろう。しかしながら、機能性ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって同定され且つ選択されてよい。

0090

本発明を実施するのに好ましいベクターは、細菌、昆虫および哺乳動物の宿主細胞と適合性であるものである。このようなベクターには、特に、pCRII、pCR3、およびpcDNA3.1(Invitrogen Company, San Diego, Calif.)、pBSII(Stratagene Company, La Jolla, Calif.)、pET15b(Novagen, Madison, Wis.)、PGEX
(Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.)、pEGFP−N2(Clontech, Palo Alto, Calif.)、pETL(BlueBacII; Invitrogen)およびpFastBacDual(Gibco/BRL,Grand Island, N.Y.)が含まれる。

0091

ベクターを構築し、そして完全長または一部切断されたNTPタンパク質またはNTPペプチドをコードしている核酸分子をベクターの適当な部位に挿入した後、完成したベクターを、増幅および/またはポリペプチド発現に適した宿主細胞中に挿入することができる。宿主細胞は、原核生物宿主細胞(大腸菌(E.coli)など)または真核生物宿主細胞(酵母細胞昆虫細胞または脊椎動物細胞など)であってよい。この宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合、NTPタンパク質またはNTPペプチドを合成することができ、続いて、それを(宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合)培地から、または(それが分泌されない場合)それを生産する宿主細胞から直接的に、集めることができる。

0092

採集後、このNTPタンパク質またはNTPペプチドは、モレキュラーシーブクロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィー等のような方法を用いて精製することができる。NTPタンパク質またはNTPペプチドの生産のための宿主細胞の選択は、一部分は、そのNTPタンパク質またはNTPペプチドがグリコシル化されるのかまたはリン酸化されるのかどうかに(この場合、真核生物宿主細胞が好適である)、および宿主細胞がそのタンパク質を、生物学的に活性なタンパク質が生物学的活性を有するNTPタンパク質またはNTPペプチドによって調製されるようなその天然の三次構造(例えば、ジスルフィド橋の適当な配向等)にフォールディングすることができる方法に依存するであろう。このNTPタンパク質またはNTPペプチドは、合成後に下に論じるような適切な化学的条件を用いてフォールディングされてよい。本発明において有用な適当な細胞または細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、ヒト胚性HEK)293または293T細胞、または3T3細胞などの哺乳動物細胞が含まれる。適当な哺乳動物宿主細胞の選択、および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物の生産および精製の方法は、本明細書中に与えられる指針を用いて当業者が行うことができる。他の適当な哺乳動物細胞系には、サルCOS−1およびCOS−7細胞系、およびCV−1細胞系が含まれる。更に例示的な哺乳動物宿主細胞には、形質転換された細胞系を含めた、
霊長類細胞系および齧歯類細胞系が含まれる。正常二倍体細胞一次組織の in vitro 培養に由来する細胞系統、更には、一次外植体も適している。候補細胞は、遺伝子型に関して選択遺伝子を欠損していてよいし、または優先的に作用する選択遺伝子を含有していてよい。他の適当な哺乳動物細胞系には、マウス神経芽細胞腫N2A細胞、HeLa、マウスL−929細胞、スイス由来3T3系、Balb−cまたはNIHマウス、BHKまたはHaKハムスター細胞系が含まれるが、これに制限されるわけではない。

0093

本発明に適した宿主細胞として同様に有用であるのは、細菌細胞である。例えば、E.coli のいろいろな系統(例えば、HB101、DH5.α、DH10およびMC106
1)は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。枯草菌(B.subtilis)、シュードモナス属(Pseudomonas spp.)、他のバチルス属(Bacillus spp.)
ストレプトミセス属(Streptomyces spp.)等のいろいろな系統も、この方法で用いる
ことができる。当業者に知られている酵母細胞の多数の系統も、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。

0094

更に、望まれる場合、昆虫細胞システムを、本発明の方法で利用することができる。このようなシステムは、例えば、Kitts et al.(Biotechniques, 14:810-817[1993])、Lucklow et al.(Curr.Opin.Biotechnol., 4:564-572[1993])および Lucklow et al.(J.Virol., 67:4566-4579[1993])に記載されている。好ましい昆虫細胞は、Sf−9およびHi5(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)である。

0095

選択された宿主細胞中へのベクターの挿入(形質転換またはトランスフェクションとも称される)は、塩化カルシウムエレクトロポレーションマイクロインジェクションリポフェクションまたはDEAEデキストラン法のような方法を用いて行うことができる。選択される方法は、一部分は、用いられる宿主細胞のタイプと相関関係にあるだろう。これら方法および他の適当な方法は、当業者に周知であり、例えば、Sambrook et al.,
上記に記載されている。

0096

ベクターを含有している(すなわち、形質転換されたまたはトランスフェクションされた)宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を用いて培養することができる。この培地は、通常は、細胞の増殖および生存に必要なすべての栄養素を含有するであろう。E.coli 細胞を培養するのに適した培地は、例えば、Luria Broth(LB)および/または Terrific Broth(TB)である。真核細胞を培養するのに適した培地は、RPMI1640
MEM、DMEMであり、これらはいずれも、培養されている具体的な細胞系によって必要とされる血清および/または増殖因子を補足されていてよい。昆虫培養物に適した培地は、必要とされるようにイーストレート(yeastolate)、ラクトアルブミン加水分解産物および/またはウシ胎児血清を補足された Grace's 培地である。典型的には、形質
換された細胞のみの選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物を、培地への補足物として加える。用いられる化合物は、宿主細胞を形質転換させたプラスミド上に存在する選択可能マーカー要素によって決められるであろう。例えば、選択可能マーカー要素がカナマイシン耐性である場合、培地に加えられる化合物はカナマイシンであろう。

0097

宿主細胞中で生産されたNTPタンパク質またはNTPペプチドの量は、当該技術分野において知られている標準法を用いて評価することができる。このような方法には、制限されることなく、ウェスタンブロット分析、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動非変性ゲル電気泳動HPLC分離、質量分光分析免疫沈降法、および/またはDNA結合ゲルシフト分析のような活性検定が含まれる。

0098

NTPタンパク質またはNTPペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計されていた場合、大部分のNTPタンパク質またはNTPペプチドは、細胞培地中で見出されうる
。この方法で製造されるタンパク質は、細胞からの分泌の際に、アミノ末端メチオニンが除去されるので、典型的には、それを有していないであろう。しかしながら、NTPタンパク質またはNTPペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、それは、細胞質および/または核中に(真核生物宿主細胞について)またはサイトゾル中に(グラム陰性細菌宿主細胞について)存在するであろうし、それはアミノ末端メチオニンを有することがありうる。

0099

宿主細胞の細胞質および/または核中にあるNTPタンパク質またはNTPペプチドについては、典型的には、宿主細胞を、最初に機械的にまたは界面活性剤で破壊して、細胞内内容物を緩衝溶液中に放出させる。次に、NTPタンパク質またはNTPペプチドをこの溶液から単離することができる。

0100

溶液からのNTPタンパク質またはNTPペプチドの精製は、いろいろな技法を用いて行うことができる。タンパク質が、そのカルボキシル末端かまたはアミノ末端に、ヘキサヒスチジン(NTPペプチド/ヘキサHis)のようなタグ、またはFLAG(Sigma-Aldritch, St.Louis,MI)またはカルモジュリン結合ペプチド(Stratagene, La Jolla, CA)のような他の低分子ペプチドを含有するように合成された場合、それは、本質的には、アフィニティーカラムを介して溶液を通過させることによって一段法で精製することができるが、その場合、カラムマトリックスは、このタグにまたは直接的にタンパク質に高親和性を有する(すなわち、NTPペプチドを特異的に認識する単クローン性抗体)。例えば、ポリヒスチジンは、ニッケル亜鉛およびコバルトに高い親和性および特異性で結合し;したがって、ニッケル基アフィニティー樹脂(Qiagen's QIAexpressシ
ステムまたは Invitrogen's Xpress System で用いられる)またはコバルト基剤アフィニティー樹脂(BD Biosciences−CLONTECH’s Talon システムで用いられる)
を用いる固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを、NTPペプチド/ポリHisの精製に用いることができる。(例えば、Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993] を参照されたい)。

0101

NTPタンパク質またはNTPペプチドが、タグが取り付けられることなく製造され、しかも利用可能な抗体がない場合、他の周知の精製方法を用いることができる。このような方法には、制限されることなく、イオン交換クロマトグラフィーヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー疎水性相互作用クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、HPLC、ゲル溶離と組み合わせた未変性ゲル電気泳動、および分取等電点電気泳動(Isoprime machine/technique, Hoefer Scientific)が含まれる。ある場
合には、これらの内二つまたはそれを超える技法を組み合わせて、増加した純度を得ることができる。

0102

NTPタンパク質またはNTPペプチドが主に細胞内で見出されるであろうと考えられる場合、細胞内物質(グラム陰性細菌については封入体を含めた)を、当業者に知られているいずれかの標準的な技法を用いて宿主細胞から抽出することができる。例えば、これら宿主細胞を、フレンチプレスホモジナイゼーションおよび/または超音波処理後遠心分離により、溶解させてペリプラズム/細胞質の内容物を放出させることができる。NTPタンパク質またはNTPペプチドが、サイトゾル中で封入体を形成した場合、それら封入体は、しばしば、細胞の内膜および/または外膜に結合することがありうるので、主に、遠心分離後のペレット材料中で見出されるであろう。次に、このペレット材料を、pH両極において、または界面活性剤、グアニジングアニジン誘導体尿素または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で、アルカリ性pHでのジチオトレイトールまたは酸性pHでのトリスカルボキシエチルホスフィンのような還元剤の存在下において処理して、封入体を放出させ、破砕し、可溶化させることができる。次に、ここで可溶性の形のNTP
タンパク質またはNTPペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降法または類似のものを用いて分析することができる。NTPタンパク質またはNTPペプチドを単離することが望まれる場合、単離は、下におよび Marston et al.(Meth.Enz., 182:264-275[1990])に記
載のものなどの標準法を用いて行うことができる。

0103

ある場合には、NTPタンパク質またはNTPペプチドは、単離時に生物学的に活性でなくてよい。このポリペプチドをその三次構造にリフォールディングするまたは変換するおよびジスルフィド結合を生じるためのいろいろな方法を用いて、生物学的活性を回復することができる。このような方法には、可溶化したポリペプチドを、特定の濃度のカオトロープの存在下において、通常は7を超えるpHに暴露することが含まれる。カオトロープの選択は、封入体可溶化に用いられる選択肢に極めて類似しているが、通常は、より低い濃度であり、必ずしも可溶化に用いられるのと同じカオトロープではない。大部分の場合、リフォールディング/酸化溶液は、還元剤、または酸化型を特定の比率で加えた還元剤も含有して、タンパク質の一つまたは複数のシステイン橋の形成においてジスルフィドシャッフリングを引き起こすことを可能にする特定のレドックス電位を生じるであろう。一般的に用いられる若干のレドックス対には、システイン/シスタミングルタチオン(GSH)/ジチオビスGSH、塩化第二銅、ジチオトレイトール(DTT)/ジチアンDTT、2−メルカプトエタノール(bME)/ジチオ−b(ME)が含まれる。多くの場合、リフォールディングの効率を増加させるのに共溶媒(cosolvent)が必要であり、こ
の目的に用いられるより一般的な試薬には、グリセロール、いろいろな分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンが含まれる。

0104

NTPタンパク質またはNTPペプチド封入体が、宿主細胞中において有意の程度まで形成されない場合、NTPタンパク質またはNTPペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後の上澄み中で見出されることがありうるので、このNTPタンパク質またはNTPペプチドは、下に示されるような方法を用いて上澄みから単離することができる。

0105

NTPタンパク質またはNTPペプチドを部分的にまたは完全に単離することが好ましいそれら状況において、精製は、当業者に周知の標準法を用いて行うことができる。このような方法には、制限されることなく、電気泳動後の電気溶出、各種タイプのクロマトグラフィー(イムノアフィニティー、モレキュラーシーブおよび/またはイオン交換)および/または高速液体クロマトグラフィーが含まれる。ある場合には、完全な精製のために、これら方法の二つ以上を用いるのが好ましいことがありうる。

0106

組換えDNA技術を用いてNTPタンパク質またはNTPペプチドを製造し且つ精製することに加えて、NTPタンパク質またはNTPペプチドおよびそれらのフラグメント、変異体、ホモログおよび誘導体は、Merrifield et al.(J.Am.Chem.Soc., 85:2149[1963])、Houghten et al.(Proc Natl Acad.Sci.USA, 82:5132[1985])および Stewart and Young(Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.[1984])によって記載されたものなどの当該技術分野において知られている技法を用いる、化学合成法固相ペプチド合成など)によって調製してもよい。このようなポリペプチドは、アミノ末端上にメチオニンを含んでまたは含むことなく合成されてよい。化学合成されたNTPタンパク質またはNTPペプチドは、これら参考文献に記載の方法を用いて酸化されて、ジスルフィド橋を形成することができる。これらNTPタンパク質またはNTPペプチドは、組換えによって製造されたまたは天然源から精製されたNTPタンパク質またはNTPペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると考えられるので、リコンビナントまたは天然のNTPタンパク質またはNTPペプチドと交換可能に用いることができる。

0107

NTPタンパク質またはNTPペプチドがポリマーに連結している化学修飾されたNTPタンパク質またはNTPペプチド組成物は、本発明の範囲内に包含される。選択される
ポリマーは、典型的には、水溶性であるので、それが結合しているタンパク質は、生理学的環境のような水性環境中で沈殿することはない。選択されるポリマーは、通常は、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドのような単一反性基を有するように修飾されるので、重合度は、本方法で与えられるように調節することができる。このポリマーは、いずれの分子量を有してもよいし、分岐状であってよいしまたは未分岐であってよい。//NTPペプチドポリマーの範囲内に含まれるのは、ポリマーの混合物である。

0108

ある場合には、天然に存在するNTPタンパク質またはNTPペプチドの核酸および/またはアミノ酸変異体を調製するのが望ましいことがありうる。核酸変異体は、位置指定突然変異誘発、PCR増幅または他の適当な方法を用いて製造することができるが、この場合、一つまたは複数のプライマーは、所望の点突然変異を有する(突然変異誘発技術の説明については、Sambrook et al., 上記および Ausubel et al., 上記を参照されたい)。Engels et al., 上記によって記載の方法を用いた化学合成も、このような変異体を調
製するのに用いることができる。当業者に知られている他の方法も用いることができる。

0109

好ましい核酸変異体は、NTPタンパク質またはNTPペプチドを製造するのに用いられる宿主細胞中におけるコドン選択(codon preference)が理由となるヌクレオチド置換を含有するものである。このようなコドン最適化は、University of Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, Wis によって提供されるような高度
に発現された細菌遺伝子のコドン選択のための Ecohigh.Cod のようなコドン出現頻度表
を包含する計算機アルゴリサー(algorithers)によって決定することができる。他の有
用なコドン出現頻度表には、Celegans_high.cod、Celegans_low.cod、Drosophila_high.cod、Human_high.cod、Maize_high.cod および Yeast_high.cod が含まれる。他の好まし
い変異体は、野生型と比較される上記のような保存的アミノ酸変化をコードしている(例えば、天然に存在するアミノ酸側鎖の電荷または極性が、異なったアミノ酸での置換によって実質的に変化していない)もの、および/または、新規な一つまたは複数のグリコシル化および/またはリン酸化部位を生じるように設計されたものかあるいは既存の一つまたは複数のグリコシル化および/またはリン酸化部位を欠失するように設計されたものである。

0110

NTPタンパク質、NTPペプチドおよびそれらのフラグメント、ホモログ、変異体、誘導体および塩は、当業者に知られている慣用的なペプチド合成技術を用いて製造することができる。これら技術には、化学カップリング法(Wunsch,E: "Methoden der organischen Chemie", Volume 15, Band 1+2, Synthese von Peptiden, thime Verlag, Stuttgart
(1974), および Barrany,G.; Marrifield,R.B.: "The Peptides", eds. E.Gross, J.Meienhofer, Volume 2, Chapter 1, pp.1-284, Academic Press (1980) を参照されたい)、酵素カップリング法(Widmer,F. Johansen,J.T., Carlsberg Res.Commun., Vol.44, pp.37-46(1979), および Kullmann,W.: "Enzymatic Peptide Synthesis",CRCPress Inc. Boca Raton, Fla. (1987), および Widmer,F., Johansen,J.T. in "Synthetic Peptides in
Biology and Medicines:, eds. Alitalo,K., Partanen,P., Vatieri,A., pp.79-86, Elsevier, Amsterdam (1985) を参照されたい)、または工程設計および経済的にこれが好都合であるならば、化学的および酵素的方法の組合せが含まれる。本開示に与えられる内容を用いて、当業者は、NTPペプチドのペプチド配列を変化させて、元のまたは天然のNTPタンパク質またはNTPペプチドと同じまたは類似の生物学的活性(生物活性)を有するホモログを作ることができる。

0111

ある与えられたNTPタンパク質またはNTPペプチドの模擬体を用いることは、タンパク質自体よりもむしろ好都合でありうる。概して、ペプチド模擬体は、タンパク質およびペプチドよりも生物学的利用能があり、長い作用期間を有し、そして製造するのにより
安価でありうる。

0112

したがって、上記のNTPタンパク質およびNTPペプチドは、類似の生物学的活性を有し、したがって類似の治療的有用性を有するこのような低分子化合物の開発に有用である。NTPタンパク質およびNTPペプチドのペプチド模擬体は、組合せ化学技術および当該技術分野において知られている他の技術を用いて開発することができる(例えば、Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, ed. G.Jung, E.Bayer, pp.289-336 およびその参考文献を参照されたい)。

0113

当該技術分野において知られているペプチドを構造的に修飾してペプチド模擬体を生じる方法の例には、タンパク質分解への増加した安定性を、特にN末端において、活性に悪影響を与えることなくもたらしうるD−アミノ酸残基構造をもたらす主鎖キラル中心の反転が含まれる。一例は、"Tritriated D-ala1-Peptide T Binding," Smith C.S. et al., Drug Development Res., 15,pp.371-379(1988) という論文に記載されている。

0114

第二の方法は、N−C鎖間イミドおよびラクタムのような、安定性のために環状構造を変化させることである(Ede et al. in Smith and River (Eds.) "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp.268-270)。これの例は、本明細書中にその開示がそのまま援用される米国特許第4,457,489号(1985年),Goldstein,G.
et al. に開示されたものなどの、コンホメーションが制限されたチモペンチン様化合物において与えられている。

0115

第三の方法は、NTPタンパク質またはNTPペプチド中のペプチド結合を、タンパク質分解に耐性を与えるプソイドペプチド結合によって置換することである。概して、ペプチドの構造および生物学的活性に影響を与えない多数のプソイドペプチド結合が記載されてきている。このアプローチの一つの例は、レトロインベルソプソイドペプチド結合を代用することである(本明細書中に援用される、"Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al in River,J.E. and Marshall,G.R.(eds) "Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pp.722-773) and Dalpozzo, et al. (1993), Int.J.Peptide Protein Res., 41:561-566)。この修飾によ
れば、これらペプチドのアミノ酸配列は、一つまたはそれを超えるペプチド結合がレトロインベルソプソイドペプチド結合によって置き換えられていることを除いて、上記のNTPタンパク質およびNTPペプチドの配列と一致しうる。好ましくは、最もN末端のペプチド結合が置換されるが、それは、このような置換が、N末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に耐性を与えるからである。

0116

一つまたはそれを超える還元レトロインベルソプソイドペプチド結合を含むペプチドの合成は、当該技術分野において知られている(上に引用される Sisto (1990) および Dalpozzo, et al. (1993))。したがって、ペプチド結合は、ペプチド模擬体が元のペプチドに類似した構造をとり、したがって生物学的活性を示すことを可能にする非ペプチド結合によって置き換えることができる。更に別の修飾を、アミノ酸の化学基を類似した構造の他の化学基で置き換えることによって行うこともできる。生物学的活性をほとんどまたは全く失うことなく酵素的切断への安定性を増加させることが知られているもう一つの適当なプソイドペプチド結合は、還元等配電子体プソイドペプチド結合である(本明細書中にそのまま援用される Couder, et al. (1993), Int.J.Peptide Protein Res., 41:181-184)。したがって、これらペプチドのアミノ酸配列は、一つまたはそれを超えるペプチド結合が等配電子体プソイドペプチド結合によって置き換えられていることを除いて、NTPタンパク質またはNTPペプチドの配列と一致しうる。好ましくは、最もN末端のペプチド結合が置換されるが、それは、このような置換が、N末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に耐性を与えると考えられるからである。一つまたはそれを超え
る還元等配電子体プソイドペプチド結合を含むペプチドの合成は、当該技術分野において知られている(上に引用される Couder, et al. (1993))。他の例には、ペプチド結合を置き換えるためのケトメチレン結合またはメチルスルフィド結合の導入が含まれる。

0117

NTPタンパク質およびNTPペプチドのペプトイド誘導体は、生物学的活性に重要な構造決定基を保持しているがなお、ペプチド結合が除かれていることによってタンパク質分解への耐性を与えているペプチド模擬体のもう一つのクラスである(本明細書中にそのまま援用される Simon, et al., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:9367-9371)。ペプトイドは、N−置換グリシンのオリゴマーである。天然アミノ酸の側鎖に各々対応する多数のN−アルキル基が記載されてきている(上に引用され且つ本明細書中にそのまま援用される Simon, et al. (1992))。NTPタンパク質またはNTPペプチドの若干のまた
はすべてのアミノ酸は、置き換えられたアミノ酸に対応するN−置換グリシンで置き換えられる。

0118

ペプチド模擬体の開発は、元のNTPタンパク質またはNTPペプチドの三次構造を、NMR分光分析結晶学および/または計算機支援分子モデリングによって決定することにより助けられうる。これら技術は、元のペプチドより高い力価および/または大きい生物学的利用能および/または大きい安定性を有する新規な組成物の開発を助ける(いずれも本明細書中にそのまま援用される、Dean (1994), BioEssays, 16:683-687; Cohen and Shatzmiller (1993), J.Mol.Graph., 11:166-173; Wiley and Rich (1993), Med.Res.Rev., 13:327-384; Moore (1994), TrendsPharmacol.Sci., 15:124-129; Hruby (1993), Biopolymers, 33:1073-1082; Bugg et al. (1993), Sci.Am., 269:92-98)。

0119

可能性のあるペプチド模擬体化合物がいったん識別されると、それは、下の実施例に概説される方法を用いて合成し且つ検定して、その活性を評価することができる。NTPタンパク質またはNTPペプチドの生物学的活性および類似した三次元構造を有する、上の方法によって得られるペプチド模擬体化合物は、本発明によって包含される。ペプチド模擬体を、上記の一つまたはそれを超える修飾を有するいずれかのNTPタンパク質またはNTPペプチドから生じることができるということは、当業者に容易に明らかであろう。更に、本発明のペプチド模擬体を、治療的化合物としてのそれらの有用性に加えて、なお一層強力な非ペプチド化合物の開発に更に用いることができるということは明らかであろう。

0120

現在、本明細書中に記載の関連タンパク質、関連ペプチドおよびNTPペプチドを合成することができる多数の組織が存在している。例えば、あるNTPペプチドの配列が与えられると、その組織は、そのペプチドを合成し、そして合成されたペプチドを、そのペプチドの同一性の資料および証明書を添付して発送することができる。

0121

本発明は、更に、哺乳動物組織または体液試料中のNTPペプチド、NTPペプチドDNAまたは対応するRNAの存在について、定性的にかまたは定量的に調べる検定のためのNTPペプチドおよびそれらの該当する核酸分子の使用を包含する。NTPペプチドおよびそれらの対応する核酸分子は、NTPペプチドまたはコードされたNTPペプチドが生物学的活性を示すにせよ示さないにせよ、このような検定における標品に用いることができる。NTPペプチド核酸配列は、哺乳動物組織または体液試料中のNTPペプチドDNAまたは対応するRNAの存在について、定性的にかまたは定量的に調べるのに有用なハイブリダイゼーションプローブ源でありうる。

0122

それ自体は生物学的に活性でないNTPペプチドは、NTPペプチドを認識するおよび/またはそれに結合する抗体を調製するのに有用でありうる。このような抗体は、標準法を用いて製造してもよい。したがって、NTPペプチドと反応する抗体、更には、このよ
うな抗体の短鎖抗体フラグメントおよび他の反応性フラグメントも、本発明の範囲内と考えられる。これら抗体は、多クローン性単クローン性、リコンビナント、キメラ一本鎖および/または二重特異性であってよい。典型的には、抗体またはそのフラグメントは、ヒト由来であるかまたは、ヒト化されている、すなわち、患者に投与された場合に、抗体への免疫反応を妨げるまたは最小限にするように調製されるであろう。好ましい抗体は、多クローン性かまたは単クローン性のヒト抗体である。抗体フラグメントは、Fab、Fab'等のような、本発明のNTPペプチドと反応性であるいずれかのフラグメントであっ
てよい。本発明によって更に提供されるのは、いずれかのNTPペプチドを抗原として、ある選択された哺乳動物に提示後、その哺乳動物の細胞(例えば、脾臓細胞)とある種の癌細胞とを既知の技法によって融合して不死化細胞系を作ることによって生じるハイブリドーマである。NTPペプチドの全部または一部分に対して向けられるこのような細胞系および抗体を生じるのに用いられる方法も、本発明によって包含される。

0123

これら抗体は、更に、体液または細胞試料中のNTPペプチドの存在を検出するための標識された形などで、in vivo および in vitro の診断または研究目的に用いてもよい。
本発明は、更に、哺乳動物組織または体液試料中のNTPペプチド、NTPペプチドDNAまたは対応するRNAの存在について、定性的にかまたは定量的に調べる検定における検量線基準としての一つまたはそれを超えるNTPペプチドの使用を包含する。

0124

本発明は、良性および悪性の腫瘍、腺(例えば、前立腺)過形成、望ましくない顔毛、いぼおよび望ましくない脂肪組織のような、細胞の除去を必要とする状態を処置する新規な方法に関する。このような方法は、要求がある哺乳動物に、治療的有効量のNTPペプチドを投与することを含む。

0125

その状態は、例えば、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸食道、血液、脳およびその被膜脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ系(リンパ組織)、および他の器官の腫瘍でありうる。

0126

本明細書中で用いられる「悪性腫瘍」という用語は、不十分に分化した、中程度に分化したおよび充分に分化した形で生じるすべての形のヒト癌、肉腫および黒色腫を包含する意味である。

0127

本発明は、外科手術の危険が少なく且つ望ましくない副作用もほとんどなく良性腫瘍を除去しうる処置への当該技術分野における要求を満たす。身体の深部(例えば、脳、心臓、肺およびその他)のような外科的に危険な部位の良性腫瘍を除去する方法は、特に要求される。

0128

細胞が除去されなくてはならない状態を処置する方法は、外科的切除、化学療法および放射線などの、このような状態を処置する慣用的な方法と共に用いることができる。NTPペプチドは、このような慣用的な処置の前に、際にまたは後に投与することができる。

0129

処置される状態は、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、およびリンパ節およびリンパ系から成る群より選択される組織の過形成、肥大または過成長でもありうる。

0130

本発明の方法を用いて処置することができる他の状態には、肺、乳房、胃、膵臓、前立
腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、およびリンパ節およびリンパ系から成る群より選択される、ウイルス、細菌または寄生生物によって変化した組織が含まれるが、これに制限されるわけではない。

0131

処置される状態は、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸管、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、およびリンパ節およびリンパ系から成る群より選択される組織の奇形または障害でもありうる。

0132

具体的には、処置される状態は、扁桃肥大、前立腺過形成、乾癬湿疹皮膚病または痔核でありうる。処置される状態は、アテローム性動脈硬化症または動脈硬化症などの血管疾患、または拡張蛇行静脈などの血管性疾患でありうる。処置される状態は、皮膚、眼、耳、鼻、咽喉、口、筋肉、結合組織、毛または乳房組織などの組織への美容修正でもありうる。

0133

NTPペプチドの治療的組成物は、本発明の範囲内である。このような組成物は、治療的有効量のNTPペプチドを薬学的に許容しうる担体との混合物で含んでよい。この担体物質は、好ましくは、哺乳動物への投与用水剤に一般的な他の物質を補足された、注射用水であってよい。典型的には、治療的使用のためのNTPペプチドは、一つまたはそれを超える生理学的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤と共に精製NTPペプチドを含む組成物の形で投与されるであろう。中性緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合される生理食塩水は、代表的な適当な担体である。好ましくは、生成物は、適当な賦形剤(例えば、スクロース)を用いて凍結乾燥物として処方される。他の標準的な担体、希釈剤および賦形剤は、所望されるように含まれてよい。約7.0〜8.5のpHを有するトリス緩衝液または約4.0〜5.5のpHを有する酢酸緩衝液を含めた、適当な範囲のpH値を有する当業者に知られている緩衝剤を含めた組成物は、ソルビトールまたはそれに代わる適当な代用品を更に包含してよい。

0134

望ましくない細胞要素に標的指向するための、抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、または細胞レセプター、シグナルペプチドまたは過発現された酵素などの、特異的腫瘍マーカーに高親和性を有する分子に抱合されたまたは連結したまたは結合したNTPペプチドの使用も、本発明の範囲内に包含される。この抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、または特異的腫瘍マーカーに高親和性を有する分子は、特定の細胞または組織標的にNTPペプチド抱合体を指向させるのに用いられる。例えば、特徴的な表面抗原または発現された抗原を有する腫瘍は、この抗体、抗体フラグメントまたは抗体様結合分子によって標的とされうるし、そして腫瘍細胞は、NTPペプチドによって死滅しうる。抗体ターゲッティングを用いたこのようなアプローチは、投薬量を減少させる、標的細胞に結合し且つそれに取り込まれる可能性を増加させる、および転移性腫瘍および微視的サイズの腫瘍に標的指向し且つそれを処置することへの増加した有用性という予想される利点を有する。

0135

本発明は、更に、腫瘍または他の望ましくない細胞の一つまたは複数の部位またはその付近における、腫瘍特異的または部位特異的酵素またはプロテアーゼによる、または腫瘍または他の望ましくない細胞を標的とする抗体抱合体による切断により、腫瘍または他の望ましくない細胞の一つまたは複数の部位またはその付近においてNTPペプチドを放出する組成物を形成するための、タンパク質または他の分子に抱合されたまたは連結したまたは結合したNTPペプチドの使用を包含する。

0136

本発明は、更に、処置される組織を、光線レーザー治療または他の光力学的または光活性化治療の場合のような);赤外線放射紫外線放射、x線またはγ線放射のような他の形の電磁放射;局所熱;αまたはβ線放射;超音波照射;または他の局所エネルギー源への暴露時に、NTPペプチドまたはNTPペプチドの若干の生物学的に活性なフラグメントを放出する組成物を形成するための、タンパク質または他の分子に抱合されたまたは連結したまたは結合したNTPペプチドの使用を包含する。

0137

これらNTPペプチドは、処置されている適応症について適切に、単独で、互いに一緒に、またはサイトカイン、増殖因子、抗生物質、アポトーシス誘発剤抗炎症薬および/または化学療法薬のような他の医薬組成物と組み合わせて用いることができる。

0138

本発明は、更に、デンドリマーフラーレン、および他の合成分子、ポリマーおよび巨大分子を用いたNTPペプチドの治療的組成物を包含するが、この場合、NTPペプチドおよび/またはその対応するDNA分子は、それだけでかまたは、腫瘍特異的マーカーのような他の種の分子と一緒に、その分子、ポリマーまたは巨大分子で抱合されている、それに付いているまたは中に封入されている。例えば、米国特許第5,714,166号、Bioactive and/or Targeted Dendimer Conjugates は、特に、一つまたは複数の標的指示物質を含む少なくとも一つのデンドリマーと、それに抱合された少なくとも一つの生物活性物質とを含んで成る樹状ポリマー抱合体を調製し且つ用いる方法を提供している。

0139

本発明は、更に、NTPペプチドおよび/または遺伝子と、脂質エマルジョンミセルポリマー、ポリマーミクロスフェア電気活性ポリマーヒドロゲルおよびリポソームのようなドラッグデリバリービヒクルとの治療的組成物を包含する。

0140

望ましくない細胞に導入されるNTPペプチドまたは関連遺伝子または遺伝子均等物の使用も、本発明の範囲に包含される。腫瘍内でのNTPペプチドの過発現は、腫瘍中の細胞を死滅させ、それによって腫瘍細胞集団を減少させるのに用いることができる。望ましくない細胞要素を処置するためのNTPペプチドの遺伝子または遺伝子均等物導入は、より少ない投薬量を必要とする、および標的とされる細胞要素が細胞子孫継代され、それによって、より低い頻度の治療を必要とし、および治療の総計がより少ないという利点を有すると予想される。本発明は、更に、望ましくない細胞または隣接細胞への、NTPペプチドを含有する融合タンパク質をコードする遺伝子の導入を包含するが、この場合、遺伝子の発現および融合タンパク質の生産および/または分泌後、この融合タンパク質は、天然の酵素またはプロテアーゼによってかまたはプロドラッグによって切断されて、望ましくない細胞においてまたはその付近でNTPペプチドを放出する。

0141

クローン化リコンビナントNTPペプチド−抗体抱合体;クローン化リコンビナントNTPペプチド−抗体フラグメント抱合体;およびクローン化リコンビナントNTPペプチド−抗体様タンパク質抱合体の使用も、本発明の範囲に包含される。標的指向抱合体(抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、または癌特異的レセプターまたは他の腫瘍マーカーに高親和性を有する分子)と組み合わされたクローン化NTPペプチドの利点は、このような分子が、クローン化抱合分子の製造および規格化生産の利点に加えて、上記の標的指向利点を兼備しているということである。

0142

経口投与用固体剤形には、カプセル剤錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が含まれるが、これに制限されるわけではない。このような固体剤形では、活性化合物は、好ましくは、次の、(a)クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの一つまたはそれを超える不活性賦形剤(または担体);(b)デンプンラクトース、スクロース、グルコースマンニトールおよびケイ酸などの充填剤または増量剤;(c)カルボキシメチルセルロースアルギネートゼラチンポリビニルピロリドン、スクロースおよびアラビア
ムなどの結合剤;(d)グリセロールなどの保湿剤;(e)寒天炭酸カルシウムバレイショまたはタピオカデンプン、アルギン酸、一定の錯ケイ酸塩および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤;(f)パラフィンなどの溶液抑制剤(solution retarders);(g)第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤;(h)アセチルアルコールおよびグリセリンモノステアラートなどの湿潤剤;(i)カオリンおよびベントナイトなどの吸着剤;および(j)タルクステアリン酸カルシウムステアリン酸マグネシウム固体ポリエチレングリコールラウリル硫酸ナトリウムまたはそれらの混合物などの滑沢剤、の内少なくとも一つと混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤について、その剤形は、緩衝剤を含んでいてもよい。

0143

経口投与用の液状剤形には、薬学的に許容しうる乳剤液剤懸濁剤シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。活性化合物に加えて、これら液状剤形は、水または他の溶媒などの当該技術分野において一般的に用いられる不活性希釈剤可溶化剤および乳化剤を含んでいてよい。代表的な乳化剤は、エチルアルコールイソプロピルアルコール炭酸エチル酢酸エチルベンジルアルコール安息香酸ベンジルプロピレングリコール、1,3−ブチレングリコールジメチルホルムアミド綿実油ラッカセイ油(groundnut oil)、トウモロコシ胚芽油オリーブ油ヒマシ油およびゴマ油などの油剤グリ
ロールテトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、またはこれら物質の混合物等である。

0144

このような不活性希釈剤の他に、この組成物には、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤甘味剤着香剤および芳香剤のようなアジュバントも含まれうる。
本発明の組成物中の活性成分の実際投薬量レベルは、具体的な組成物および投与方法について望まれる治療的応答を得るのに有効である一定量のNTPペプチドを得るように変更されてよい。したがって、選択される投薬量レベルは、所望の治療的作用、投与経路、所望の処置期間および他の因子に依存するであろう。

0145

ヒトを含めた哺乳動物について、体表面積を基準として有効量を投与することができる。いろいろなサイズ、種およびヒトの動物用投薬量の相互関係(mg/M2体表面に基づ
く)は、E.J.Freireich et al., Cancer Chemother.Rep., 50(4):219(1966) によって記
載されている。体表面積は、個体の身長と体重からほぼ決定することができる(例えば、Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y. pp.537-538(1970) を参照
されたい)。

0146

宿主に投与されるNTPペプチドの1日用量の総量は、単回または分割用量であってよい。投薬量単位組成物は、1日用量を調製するのに用いることができるような、その約数のような量を含有してよい。しかしながら、いずれかの具体的な患者に特定の用量レベルは、体重、全身の健康状態性別、食事、投与時間および経路、投与される薬物の力価、吸収および排泄の速度、他の薬物との組合せ、および処置されている具体的な疾患の重症度を含めたいろいろな因子に依存するということは理解されるであろう。

0147

本発明によるNTPペプチド組成物を投与する方法には、これら化合物を、筋肉内、経口、静脈内、腹腔内、大脳内(実質内)、脳室内、腫瘍内、病巣内、皮内、脊髄内、鼻腔内、眼内、動脈内、局所、経皮、エアゾル剤、注入、ボーラス注射、植込装置、徐放性システム等によって投与することが含まれるが、これに制限されるわけではない。

0148

本発明のNTPペプチドを投与するもう一つの方法は、経皮または皮膚を通した経路による。このような態様の一つの例は、貼付剤の使用である。具体的には、貼付剤は、例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)中またはDMSOと綿実油の混合物中のNTPペプチドの微細懸濁液で調製し、腫瘍を有する哺乳動物の皮膚ポケット(pouch)内部の腫
瘍部位から離れた皮膚と接触させることができる。他の基剤またはそれらと他の溶媒および固体支持体との混合物も、均等に作用すると考えられる。この貼付剤は、NTPペプチド化合物を溶液または懸濁液の形で含有しうる。次に、貼付剤を患者の皮膚に、例えば、縫合クリップまたは他の保持装置によって皮膚を合わせて折り重ね且つ保持することによって形成される患者の皮膚ポケット中にそれを挿入することによって適用することができる。このポケットは、皮膚との連続接触が、この哺乳動物に妨害されることなく確保されるような方法で用いられるべきである。皮膚ポケットを用いることの他に、皮膚と接触している貼付剤の確定した位置を確保するいずれの装置も用いることができる。例えば、接着ガーゼ包帯を用いて、皮膚上の適所に貼付剤を保持しうると考えられる。

0149

NTPペプチドは、徐放性処方物または調製物で投与してもよい。徐放性調製物の適当な例には、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形の、半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド(U.S.3,773,919号、EP58,481号)、L−グルタミン酸およびγエチル−L−グルタメートコポリマー(Sidman et al, Biopolymers, 22:547-556[1983])、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res., 15:167-277[1981] および Langer, Chem.Tech., 12:98-105[1982])、エチレン酢酸ビニル(Langer et al., 上記)またはポリ−D(−)−3−ヒドロキシ酪酸(E
P133,988号)が含まれる。徐放性組成物には、リポソームも含まれうるが、これは、当該技術分野において知られているいくつかの方法のいずれかによって製造することができる(例えば、Eppstein et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82:3688-3692[1985];
EP36,676号;EP88,046号;およびEP143,949号)。

0150

本発明のNTPペプチドを投与するもう一つの方法は、処置される腫瘍または他の組織中へのNTPペプチドの直接的または間接的注入による。このような態様の一つの例は、処置される腫瘍または他の組織中へのNTPペプチドの直接的注射である。この処置は、処置される腫瘍または他の組織の退行または破壊を、バイオプシー、画像化、または組織増殖監視する他の方法によって監視することを伴う、単回注射、一時に多数回の注射、または何時間か、何日間かまたは何ヶ月間かにわたる一連の注射から成ってよい。処置される腫瘍または他の組織中への注射は、鼻、口、耳、、直腸または尿道などの開口部中に挿入される装置によってよいし、または in vivo の腫瘍または組織に達するために切
開によってよく、しかも1回または複数の注射に適当な部位を決定するために、超音波または光ファイバースコープなどの画像化または光学システムと共に行ってもよい。このような態様のもう一つの例は、組織へのNTPペプチドの一定注入を経時的に行うことができる装置の使用である。

0151

本発明のNTPペプチドを投与するもう一つの方法は、除去されるまたは破壊されることが必要なまたは望まれる腫瘍または他の組織または細胞要素を物理的に切除する、剥離する、またはそれ以外には死滅させるまたは破壊するのに用いられる外科的または類似の方法と連結しているが、この場合、本発明のNTPペプチドは、この方法によって除去されないまたは破壊されないいずれかの腫瘍細胞または他の細胞要素を破壊するまたはその成長を遅らせるために、腫瘍または他の組織が除去された一つまたは複数の部位を取り囲む一つまたは複数の隣接部位に投与される。

0152

本発明のNTPペプチドを投与するもう一つの方法は、処置される腫瘍または他の組織内への装置の植込による。このような態様の一つの例は、処置される腫瘍または他の組織中への、NTPペプチドを含有するウェファーの植込である。このウェファーは、治療的用量のNTPペプチドを組織中に経時的に放出する。或いは、または更に、この組成物は、NTPペプチドが吸収された膜、スポンジまたは他の適当な材料の患部中への植込によって局所的に投与することができる。植込装置が用いられる場合、この装置は、いずれか
の適当な組織または器官中に植込むことができ、そしてNTPペプチドの供給は、この装置を介して直接的に、ボーラスによってよいし、または連続投与によってよいし、または連続注入を用いてカテーテルによってよい。

0153

代わりの投与方法は、NTPペプチド−エンコーディング遺伝子の一つまたはそれを超えるコピーを、標的にされている細胞に導入することであり、そして、必要ならば、その遺伝子の一つまたは複数のコピーに、NTPペプチドを細胞内生産することを開始させることである。遺伝子治療を適用することができる一つの方式は、構成性または誘導性プロモーターに機能的に連結されて遺伝子治療DNAコンストラクトを形成することができるNTPペプチド−エンコーディング遺伝子(NTPペプチド(またはそのフラグメント、変異体、ホモログまたは誘導体)をコードしているゲノムDNA、cDNAおよび/または合成DNA)を使用することである。このプロモーターは、内因性NTPペプチドエンコーディング遺伝子に相同であってよいしまたは異種であってよいが、但し、それは、このコンストラクトが挿入される細胞または組織タイプにおいて活性であるという条件付きである。この遺伝子治療DNAコンストラクトの他の成分には、必要に応じて、部位特異的組込み用に設計されるDNA分子(例えば、相同的組換えに有用な内因性フランキング配列)、組織特異的プロモーター、一つまたは複数のエンハンサーまたはサイレンサー親細胞にまさる選択的利点を与えることができるDNA分子、形質転換された細胞を識別する標識として有用なDNA分子、負の選択システム、細胞特異的結合剤(例えば、細胞ターゲッティングの場合のような)、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を促す転写因子並びにベクター製造を可能にする因子が含まれてもよい。

0154

細胞または組織への in vivo または ex vivo 遺伝子供給手段には、本明細書中にそれら開示がそのまま援用される米国特許第4,970,154号、WO96/40958号、米国特許第5,679,559号、米国特許第5,676,954号および米国特許第5,593,875号に開示されたような、のDNAの直接的注射、弾道法(ballistic method)、リポソーム媒介導入、レセプター媒介導入(リガンドDNA複合体)、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウム沈降が含まれる(が、これに制限されるわけではない)。それらには、レトロウイルスアデノウイルスアデノ関連ウイルス、ポックスウイルスレンチウイルスパピローマウイルスまたは単純ヘルペスウイルスなどのウイルスベクターの使用、DNA−タンパク質複合体の使用、およびリポソームの使用も含まれる。遺伝子治療ベクターの使用は、例えば、本明細書中にそれら開示がそのまま援用される米国特許第5,672,344号、米国特許第5,399,346号、米国特許第5,631,236号および米国特許第5,635,399号に記載されている。

0155

NTPペプチド−エンコーディング遺伝子は、ex vivo で遺伝子操作された若干の細胞を、本明細書中に記載されたような方法を用いて患者に植込むことによって供給されて、NTPペプチドまたはそのフラグメント、変異体、ホモログまたは誘導体を発現し且つ分泌することができる。このような細胞は、動物またはヒトの細胞であってよく、患者自身の組織に由来してよいしまたはヒトかまたは非ヒトの別の源に由来してよい。場合により、これら細胞は、不死化されていてよいしまたは幹細胞であってよい。しかしながら、免疫学的応答の機会を減少させるためには、これら細胞を、周囲組織浸潤を免れるようにカプセル封入するのが好適である。カプセル封入材料は、典型的には、生体適合性の半透過性ポリマー囲いまたは膜であって、一つまたは複数のタンパク質産物を放出させるが、患者の免疫系によるまたは周囲組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を妨げるものである。細胞の膜カプセル封入に用いられる方法は、当業者に公知であり、カプセル封入された細胞の調製および患者へのそれらの植込は、過度に実験することなく行うことができる。例えば、本明細書中にそれら開示がそのまま援用される米国特許第4,892,538号;同第5,011,472号;および同第5,106,627号を参照されたい。
生きている細胞をカプセル封入するシステムは、PCT WO91/10425号に記載されている。リポソーム担体生物侵食性(bio-erodible)粒子またはビーズのようないろいろな他の徐放または制御供給手段を製剤化する技術も、当業者に知られており、例えば、本明細書中にその開示がそのまま援用される米国特許第5,653,975号に記載されている。これら細胞は、カプセル封入されていようといまいと、患者の適当な体組織または器官中に植込むことができる。

0156

次の実施例は、本発明を詳しく説明するために与えられる。しかしながら、本発明が、これら実施例に記載の具体的な条件または詳細に制限されないということは理解されるはずである。本明細書を通して、米国特許を含めた公的に入手可能な論文へのいずれかのおよびすべての参考文献は、具体的に援用される。

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