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技術 オステオプロテゲリン結合タンパク質のアンタゴニスト性選択的結合因子

出願人 アムジエン・インコーポレーテツド
発明者 ラジエンドラ・ブイ・デシユパンデアナ・ヒツツウイリアム・ジエイ・ボイルジヨン・ケビン・サリバン
出願日 2013年1月10日 (8年5ヶ月経過) 出願番号 2013-002331
公開日 2013年7月11日 (7年11ヶ月経過) 公開番号 2013-135670
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード ログ関数 吸収比率 プレート室 沈着速度 カッタウェイ 中高年者 E領域 表面配置
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2013年7月11日)のものです。
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図面 (20)

課題

解決手段

OPGbpに選択的に結合し、そして骨量喪失に関連する状態を防止または処置するために使用することができる抗体および抗原結合ドメイン。前記の抗体および抗原結合ドメインをコードする核酸分子、ならびにそれらを製造するための発現ベクターおよび宿主細胞

概要

背景

(発明の背景
生きている骨組織は、骨の沈着再吸収との動的な平衡を示している。これらのプロセスは、骨の有機マトリックスを含む様々な分子分泌する骨芽細胞と、骨マトリックスの溶解および骨塩可溶化を促進する破骨細胞との2つの細胞タイプによって主に媒介されている。骨が成長中である若年者では、骨沈着速度骨溶解速度を上回っているが、中高年者では、再吸収速度が沈着を上回ることがある。後者の状況では、骨分解の増大は、骨量および骨強度の低下、骨折の危険性の増大、および折れた骨の遅い修復または不完全な修復をもたらす。

破骨細胞は、骨髄内の造血系前駆体細胞から形成される大きな食作用多核細胞である。成熟した機能的な骨芽細胞の増殖および形成は十分に理解されていないが、破骨細胞は、様々な増殖促進因子にさらされることに応答して単球マクロファージ細胞系統に沿って成熟すると考えられている。骨髄の前駆体細胞が前破骨細胞に発達する初期段階は、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)、腫瘍壊死因子−β(TNF−β)、インターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−4(IL−4)、インターロイキン−6(IL−6)および白血病阻害因子(LIF)などの可溶性因子によって媒介されると考えられている。培養では、前破骨細胞は、添加されたマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)の存在下で形成される。これらの因子は、主に破骨細胞発達の初期段階で作用している。

破骨細胞の形成および骨の再吸収を刺激し、そして発達の後期段階で作用すると考えられるポリペプチド因子オステオプロテゲリン結合タンパク質(OPGbp)が記載されている。PCT国際特許出願公開WO98/46751を参照のこと。OPGbpは、間質細胞株の存在下で同時培養することを必要とすることなく、骨髄前駆体細胞からの破骨細胞の形成を刺激する。OPGbpによる骨再吸収の刺激は、その同族受容体である、オステオプロテゲリンの分化および活性化受容体ODAR)との相互作用を必要とし、そしてオステオプロテゲリン(OPG)によるODAR/OPGbpの相互作用の阻害は骨の再吸収をも阻害した。従って、ODARに対するOPGbpの結合を調節することにより、破骨細胞の形成および骨の喪失は影響を受ける。

OPGbpとODARとの相互作用を調節する選択的結合因子、特に、OPGbpとODARとの相互作用を阻止し、かつ/または骨の再吸収などのOPGbpの少なくとも1つの活性を阻害するそのような因子を同定することは本発明の目的の1つである。骨量の喪失を防止および処置するために使用することができるそのような選択的結合因子を同定することは本発明のさらなる目的である。OPGbpとODARとの相互作用を調節し、かつOPGbpの少なくとも1つの活性を中和する抗体または抗原結合ドメインまたはそのフラグメントもしくは変化体を同定することは本発明のさらなる目的である。本発明の抗体は、骨量の喪失を防止および処置するために使用することができる。

概要

オステオプロテゲリン結合タンパク質(OPGbp)の選択的結合因子を提供する。OPGbpに選択的に結合し、そして骨量の喪失に関連する状態を防止または処置するために使用することができる抗体および抗原結合ドメイン。前記の抗体および抗原結合ドメインをコードする核酸分子、ならびにそれらを製造するための発現ベクターおよび宿主細胞。なし

目的

本発明のさらなる目的である

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

抗体または抗原結合ドメインであって、(a)配列番号51または配列番号53に示されるFab重鎖アミノ酸配列、(b)(a)における配列の保存的アミノ酸置換を含む重鎖アミノ酸配列、(c)(a)における配列に対する同一性が少なくとも約80%である重鎖アミノ酸配列、あるいは(d)(a)、(b)または(c)のフラグメントまたは誘導体を含み、かつOPGbpに選択的に結合する抗体または抗原結合ドメイン。

請求項2

κ軽鎖またはλ軽鎖をさらに含む、請求項1に記載の抗体。

請求項3

ヒトのFc領域をさらに含む、請求項1に記載の抗体。

請求項4

可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含む抗体または抗原結合ドメインであって、それぞれのVl鎖が、フレームワークアミノ酸配列により隔てられている、CDR1(Vl)、CDR2(Vl)およびCDR3(Vl)と呼ばれるCDRアミノ酸配列を含み、CDR1(Vl)が、からなる群から選択され、CDR2(Vl)が、からなる群から選択され、そしてCDR3(Vl)が、からなる群から選択され、CDR1(Vl)、CDR2(Vl)およびCDR3(Vl)が互いに独立的に選択され、かつそれぞれのVh鎖が、フレームワークアミノ酸配列により隔てられている、CDR1(Vh)、CDR2(Vh)およびCDR3(Vh)と呼ばれるCDRアミノ酸配列を含み、CDR1(Vh)が、からなる群から選択され、CDR2(Vh)が、からなる群から選択され、そしてCDR3(Vh)が、からなる群から選択され、CDR1(Vh)、CDR2(Vh)およびCDR3(Vh)が互いに独立的に選択される、抗体または抗原結合ドメイン。

請求項5

可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含み、Vl鎖が、配列を有するCDR1と、配列を有するCDR2と、配列を有するCDR3とを含み、かつVh鎖が、配列を有するCDR1と、配列を有するCDR2と、配列を有するCDR3とを含み、それぞれのVl鎖およびVh鎖におけるCDR1、CDR2およびCDR3がフレームワークアミノ酸配列により隔てられている、請求項4に記載の抗体。

請求項6

ヒトのFcv領域をさらに含む、請求項4または5に記載の抗体。

請求項7

可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含み、オステオプロテゲリン結合タンパク質に選択的に結合する抗体であって、Vl鎖が生殖系列配列(配列番号66)の再配置変化体または体細胞変化体を含み、かつVh鎖が生殖系列配列(配列番号59)の再配置変化体または体細胞変化体を含む、抗体。

請求項8

可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含み、オステオプロテゲリン結合タンパク質に選択的に結合する抗体であって、Vl鎖が生殖系列配列(配列番号68)の再配置変化体または体細胞変化体を含み、かつVh鎖が生殖系列配列(配列番号59)の再配置変化体または体細胞変化体を含む、抗体。

請求項9

可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含み、オステオプロテゲリン結合タンパク質に選択的に結合する抗体であって、Vl鎖が生殖系列配列(配列番号70)の再配置変化体または体細胞変化体を含み、かつVh鎖が生殖系列配列(配列番号62)の再配置変化体または体細胞変化体を含む、抗体。

請求項10

可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含み、オステオプロテゲリン結合タンパク質に選択的に結合する抗体であって、Vl鎖が生殖系列配列(配列番号72)の再配置変化体または体細胞変化体を含み、かつVh鎖が生殖系列配列(配列番号64)の再配置変化体または体細胞変化体を含む、抗体。

請求項11

請求項1、4、5又は7〜10のいずれかに記載される抗体をコードする単離された核酸分子

請求項12

請求項11に記載される核酸分子を含む発現ベクター

請求項13

請求項12に記載される発現ベクターを含む宿主細胞

請求項14

CHO細胞である、請求項13に記載の宿主細胞。

請求項15

請求項14に記載される宿主細胞を、核酸分子の発現を可能にする条件のもとで培養することを含む、抗体を製造する方法。

請求項16

IgGイソタイプが、IgG、IgMIgAIgEおよびIgDからなる群から選択される、請求項1、4、5又は7〜10に記載の抗体。

請求項17

イソタイプがIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である、請求項13に記載の抗体。

請求項18

請求項1、4、5又は7〜10のいずれかに記載される抗体または抗原結合ドメイン、あるいはそのフラグメント、変化体または誘導体と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物

請求項19

請求項18に記載される組成物を含む、破骨細胞の形成または活性化を阻害するための医薬用組成物

請求項20

請求項18に記載される組成物を含む、骨の再吸収を阻害するための医薬用組成物。

請求項21

請求項18に記載される組成物を含む、骨量喪失を防止または処置するための医薬用組成物。

請求項22

骨量の喪失が、骨粗鬆症、骨へのガン転移慢性関節リウマチ悪性高カルシウム血症、およびステロイド誘導型骨粗鬆症から生じる、請求項21に記載の医薬用組成物。

請求項23

少なくとも1つのさらなる骨再吸収防止剤を含む組成物を投与することをさらに含む、請求項19〜22のいずれかに記載の医薬用組成物。

請求項24

骨再吸収防止剤がエストロゲンビスホスホナートまたは選択的エストロゲン受容体調節剤である、請求項23に記載の医薬用組成物。

請求項25

骨に対する同化剤を含む組成物をさらに含む、請求項19〜22のいずれかに記載の医薬用組成物。

請求項26

同化剤が、副甲状腺ホルモン、またはインスリン様増殖因子とインスリン様増殖因子結合タンパク質との複合体である、請求項25に記載の医薬用組成物。

請求項27

インターロイキン−1阻害剤または腫瘍壊死因子−α阻害剤をさらに含む、請求項19〜22のいずれかに記載の医薬用組成物。

請求項28

請求項18に記載される組成物を含む、骨における腫瘍細胞成長を防止または処置するための医薬用組成物。

請求項29

可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含み、オステオプロテゲリン結合タンパク質に選択的に結合する抗体であって、Vl鎖が、配列を有するCDR1と、配列を有するCDR2と、配列を有するCDR3とを含み、それぞれのVl鎖におけるCDR1、CDR2およびCDR3がフレームワークアミノ酸配列により隔てられている、抗体。

請求項30

可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含み、オステオプロテゲリン結合タンパク質に選択的に結合する抗体であって、Vh鎖が、配列を有するCDR1と、配列を有するCDR2と、配列を有するCDR3とを含み、それぞれのVh鎖におけるCDR1、CDR2およびCDR3がフレームワークアミノ酸配列により隔てられている、抗体。

請求項31

可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含み、オステオプロテゲリン結合タンパク質に選択的に結合する抗体であって、Vl鎖が、配列を有するCDR1と、配列を有するCDR2と、配列を有するCDR3とを含み、かつVh鎖が、配列を有するCDR1と、配列を有するCDR2と、下記の配列:からなる群から選択される配列を有するCDR3とを含み、それぞれのVl鎖およびVh鎖におけるCDR1、CDR2およびCDR3がフレームワークアミノ酸配列により隔てられており、Xが、その位置において通常存在するアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸である、抗体。

請求項32

可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含み、オステオプロテゲリン結合タンパク質に選択的に結合する抗体であって、Vh鎖が、配列を有するCDR1と、配列を有するCDR2と、下記の配列:からなる群から選択される配列を有するCDR3とを含み、それぞれのVl鎖およびVh鎖におけるCDR1、CDR2およびCDR3がフレームワークアミノ酸配列により隔てられており、Xが、その位置において通常存在するアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸である、抗体。

請求項33

可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含み、オステオプロテゲリン結合タンパク質に選択的に結合する抗体であって、Vl鎖が、配列を有するCDR1と、配列を有するCDR2と、配列を有するCDR3とを含み、Vh鎖が、配列を有するCDR1と、配列を有するCDR2と、配列における1つ以上のアミノ酸置換を有するCDR3とを含み、それぞれのVl鎖およびVh鎖におけるCDR1、CDR2およびCDR3がフレームワークアミノ酸配列により隔てられている、抗体。

請求項34

可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含み、オステオプロテゲリン結合タンパク質に選択的に結合する抗体であって、Vh鎖が、配列を有するCDR1と、配列を有するCDR2と、配列における1つ以上のアミノ酸置換を有するCDR3とを含み、それぞれのVl鎖およびVh鎖におけるCDR1、CDR2およびCDR3がフレームワークアミノ酸配列により隔てられている、抗体。

技術分野

0001

(発明の分野)
本発明は、オステオプロテゲリン結合タンパク質(OPGbp)に対する選択的結合因子に関する。より詳細には、本発明は、OPGbpに選択的に結合し、かつ骨量喪失に関連する状態を防止または処置するために使用することができる抗体および抗原結合ドメインに関する。本発明の選択的結合因子を製造するための核酸分子ベクターおよび宿主細胞もまた提供される。

背景技術

0002

(発明の背景
生きている骨組織は、骨の沈着再吸収との動的な平衡を示している。これらのプロセスは、骨の有機マトリックスを含む様々な分子分泌する骨芽細胞と、骨マトリックスの溶解および骨塩可溶化を促進する破骨細胞との2つの細胞タイプによって主に媒介されている。骨が成長中である若年者では、骨沈着速度骨溶解速度を上回っているが、中高年者では、再吸収速度が沈着を上回ることがある。後者の状況では、骨分解の増大は、骨量および骨強度の低下、骨折の危険性の増大、および折れた骨の遅い修復または不完全な修復をもたらす。

0003

破骨細胞は、骨髄内の造血系前駆体細胞から形成される大きな食作用多核細胞である。成熟した機能的な骨芽細胞の増殖および形成は十分に理解されていないが、破骨細胞は、様々な増殖促進因子にさらされることに応答して単球マクロファージ細胞系統に沿って成熟すると考えられている。骨髄の前駆体細胞が前破骨細胞に発達する初期段階は、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)、腫瘍壊死因子−β(TNF−β)、インターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−4(IL−4)、インターロイキン−6(IL−6)および白血病阻害因子(LIF)などの可溶性因子によって媒介されると考えられている。培養では、前破骨細胞は、添加されたマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)の存在下で形成される。これらの因子は、主に破骨細胞発達の初期段階で作用している。

0004

破骨細胞の形成および骨の再吸収を刺激し、そして発達の後期段階で作用すると考えられるポリペプチド因子のオステオプロテゲリン結合タンパク質(OPGbp)が記載されている。PCT国際特許出願公開WO98/46751を参照のこと。OPGbpは、間質細胞株の存在下で同時培養することを必要とすることなく、骨髄前駆体細胞からの破骨細胞の形成を刺激する。OPGbpによる骨再吸収の刺激は、その同族受容体である、オステオプロテゲリンの分化および活性化受容体ODAR)との相互作用を必要とし、そしてオステオプロテゲリン(OPG)によるODAR/OPGbpの相互作用の阻害は骨の再吸収をも阻害した。従って、ODARに対するOPGbpの結合を調節することにより、破骨細胞の形成および骨の喪失は影響を受ける。

0005

OPGbpとODARとの相互作用を調節する選択的結合因子、特に、OPGbpとODARとの相互作用を阻止し、かつ/または骨の再吸収などのOPGbpの少なくとも1つの活性を阻害するそのような因子を同定することは本発明の目的の1つである。骨量の喪失を防止および処置するために使用することができるそのような選択的結合因子を同定することは本発明のさらなる目的である。OPGbpとODARとの相互作用を調節し、かつOPGbpの少なくとも1つの活性を中和する抗体または抗原結合ドメインまたはそのフラグメントもしくは変化体を同定することは本発明のさらなる目的である。本発明の抗体は、骨量の喪失を防止および処置するために使用することができる。

先行技術

0006

国際公開第98/46751号

0007

(発明の概要
本発明は、オステオプロテゲリン結合タンパク質(OPGbp)の選択的結合因子を提供する。1つの実施形態において、本発明の選択的結合因子は、OPGbpの少なくとも1つの活性を部分的または完全に阻害する。すなわち、選択的結合因子はOPGbpのアンタゴニストである。別の実施形態において、選択的結合因子は、OPGと、その同族受容体である、オステオプロテゲリンの分化および活性化受容体(すなわち、ODAR)との相互作用を部分的または完全に阻害し、かつそれによりOPGbpの活性を部分的または完全に阻害する様式でOPGbpに結合する。本発明の選択的結合因子は、現実にはタンパク質であり得るし、本明細書中ではタンパク質性選択的結合因子として示される。

0008

本発明はまた、OPGbpにおけるエピトープに結合し、かつOPGbpの少なくとも1つの活性を部分的または完全に阻害する抗体またはその抗原結合ドメインあるいはそのフラグメント、変化体または誘導体を提供する。すなわち、本発明の抗体はアンタゴニスト抗体である。好ましくは、OPGbpは哺乳動物のOPGbpである。より好ましくは、OPGbpは、可溶型または細胞表面結合型であり得るヒトOPGbp、またはそのフラグメント、誘導体および変化体である。

0009

選択的結合因子が抗体である場合、そのような抗体は、ネズミOPGbpまたはヒトOPGbpなどのOPGbp(好ましくは、ヒトOPGbp)で、あるいはその免疫原性のフラグメント、誘導体または変化体で動物免疫化することによって調製することができる。さらに、動物は、OPGbpを発現して、OPGbpがトランスフェクション細胞の表面に結合するように、OPGbpをコードする核酸分子を含有するベクターでトランスフェクションされた細胞で免疫化することができる。あるいは、抗体である選択的結合因子は、OPGbpに結合するための抗体または抗原結合ドメイン配列を含むライブラリースクリーニングすることによって得ることができる。そのようなライブラリーは、組み立てられたファージ粒子の表面に発現するバクテリオファージコートタンパク質に対するタンパク質融合体またはペプチド融合体としてバクテリオファージにおいて都合よく調製される。この場合、コードするDNA配列はファージ粒子内に含有される(いわゆる「ファージディスプレイライブラリー」)。一例において、ファージディスプレイライブラリーは、可変軽鎖および可変重鎖などのヒト抗体をコードするDNA配列を含有する。

0010

抗体または抗原結合ドメインである選択的結合因子は、天然の抗体に類似する四量体糖タンパク質であり得るか、あるいはOPGbpに結合することができ、かつOPGbpの活性を部分的または完全に中和する単鎖抗体(Fvフラグメント、Fabフラグメント、Fab’フラグメントまたはF(ab)’フラグメント)、二重特異性抗体、ヘテロ抗体、またはそれらの他のフラグメント、変化体もしくは誘導体であり得る。抗体または抗原結合ドメインは、ハイブリドーマ細胞株(例えば、マウスミエローマ細胞に融合させた脾臓細胞などの抗体産生細胞)において産生させることができ、あるいは前記の抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子でトランスフェクションされた異種の細胞株において産生させることができる。

0011

本発明の抗体または抗原結合ドメインは、
(a)図9(配列番号51)または図10(配列番号53)に示されるFab重鎖アミノ酸配列
(b)(a)における配列の保存的アミノ酸置換を含む重鎖アミノ酸配列、
(c)(a)における配列に対する同一性が少なくとも約80%である重鎖アミノ酸配列、あるいは
(d)(a)、(b)または(c)のフラグメントまたは誘導体
を含み、
そしてこの抗体または抗原結合ドメインはOPGbpに選択的に結合する。

0012

別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、図9(配列番号51)または図10(配列番号53)に示されるFab重鎖アミノ酸配列と、図5(配列番号43)または図6(配列番号45)に示されるFab軽鎖アミノ酸配列とを含む抗体または抗原結合ドメインによって認識されるヒトOPGbpにおけるエピトープを認識する。また、OPGbpにおけるDEエピトープを認識する抗OPGbp抗体または抗原結合ドメインも提供される。

0013

別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含み、そして、
それぞれのVl鎖が、フレームワークアミノ酸配列により隔てられている、CDR1(Vl)、CDR2(Vl)およびCDR3(Vl)と呼ばれるCDRアミノ酸配列を含み、
CDR1(Vl)が、

0014

0015

からなる群から選択され、
CDR2(Vl)が、

0016

0017

からなる群から選択され、そして
CDR3(Vl)が、

0018

0019

からなる群から選択され、
CDR1(Vl)、CDR2(Vl)およびCDR3(Vl)が互いに独立的に選択され、かつ
それぞれのVh鎖が、フレームワークアミノ酸配列により隔てられている、CDR1(Vh)、CDR2(Vh)およびCDR3(Vh)と呼ばれるCDRアミノ酸配列を含み、
CDR1(Vh)が、

0020

0021

からなる群から選択され、
CDR2(Vh)が、

0022

0023

からなる群から選択され、そして
CDR3(Vh)が、

0024

0025

からなる群から選択され、
CDR1(Vh)、CDR2(Vh)およびCDR3(Vh)が互いに独立的に選択される。

0026

別の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合ドメインは、可変軽鎖(Vl)および可変重鎖(Vh)を含み、そして、
Vl鎖が、配列RASQSISRYLN(配列番号01)を有するCDR1と、配列GASSLQS(配列番号05)を有するCDR2と、配列QHTRA(配列番号09)を有するCDR3とを含み、かつ
Vh鎖が、配列NYAIH(配列番号13)を有するCDR1と、配列WINAGNGNTFSQKFQG(配列番号16)を有するCDR2と、配列DSSNMVRGIIIAYYFDY(配列番号19)を有するCDR3とを含み、
それぞれのVl鎖およびVh鎖におけるCDR1、CDR2およびCDR3がフレームワークアミノ酸配列により隔てられている。

0027

本発明の抗体および抗原結合ドメインは、軽鎖アミノ酸配列および重鎖アミノ酸配列をコードする、ゲノムDNAに存在する生殖系列核酸配列由来する。抗体は、生殖系列配列再配置および体細胞変異生成物である核酸配列によってコードされる。

0028

1つの実施形態において、本発明の抗体および抗原結合ドメインは、Vl鎖およびVh鎖を含み、Vl鎖が、図19などにおけるVh1生殖系列遺伝子(配列番号66)の再配置変化体または体細胞変化体を含み、そしてVh鎖が、図16などにおけるVh1生殖系列遺伝子(配列番号59)の再配置変化体または体細胞変化体を含み、そして抗体はOPGbpポリペプチドに選択的に結合する。

0029

別の実施形態において、Vl鎖は、図20などにおけるVk3生殖系列遺伝子(配列番号68)の再配置変化体または体細胞変化体を含み、そしてVh鎖は、図16などにおけるVh1生殖系列遺伝子(配列番号59)の再配置変化体または体細胞変化体を含む。

0030

別の実施形態において、Vl鎖は、図21などにおけるVk3生殖系列遺伝子(配列番号70)の再配置変化体または体細胞変化体を含み、そしてVh鎖は、図17などにおけるVh3生殖系列遺伝子(配列番号62)の再配置変化体または体細胞変化体を含む。

0031

別の実施形態において、Vl鎖は、図22などにおけるVl3生殖系列遺伝子(配列番号72)の再配置変化体または体細胞変化体を含み、そしてVh鎖は、図18などにおけるVh3生殖系列遺伝子(配列番号64)の再配置変化体または体細胞変化体を含む。

0032

本発明の選択的結合因子(抗体または抗原結合ドメイン)は、ODARに対するOPGbpの結合、破骨細胞の形成または活性化、あるいはOPGbpにより媒介される骨再吸収などの、OPGbpの少なくとも1つの活性を部分的または完全に阻害し、そして骨疾患を防止し、かつ/または処置するために使用される。1つの実施形態において、抗体または抗原結合ドメインなどのOPGbpアンタゴニストは、骨量の喪失を防止し、かつ/または処置するために、骨量の喪失を受けている動物、または骨量の喪失に対する危険性を有する動物に投与される。OPGbpアンタゴニストは、骨粗鬆症、骨へのガン転移による骨量の喪失;慢性関節リウマチ悪性高カルシウム血症、およびステロイド誘導型骨粗鬆症による骨量の喪失を防止し、かつ/または処置するために使用することができる。

0033

また、本発明の抗体または抗原結合ドメインと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む組成物も提供される。

図面の簡単な説明

0034

ヒトOPGbp[143−317]に対する反応性についての優勢なFabパターンELISAを示す。力価測定を、ELISAにおいて109個〜1011個のファージウエルの典型的な範囲を得るためにウエルあたり最大で50μlのファージ溶液を使用して行った。ELISA用のファージストックは実施例1に記載されるように調製された。値を1点の測定から得た。「AB」および「X」のパターンは同じ線に重なった。
「AT」および「Y」の各FabによるODARに対するOPGbp結合の阻害を示す。Fabは、実施例4に記載されるように精製され、そして図に示される最終ウエル濃度に添加された。OPGbp/ODAR結合アッセイの詳細は実施例1に示される。値は二連の測定の平均値であった。
「AT」、「Y」および「P」の各Fabの骨髄アッセイを示す。「AT」、「Y」および「P」の各Fabのそれぞれの、1つのエンドトキシン非含有調製物(0.5EU/ml以下)の結果を示した。Fabは、実施例4に記載されるように精製され、そして図に示される最終ウエル希釈に添加された(Fabストック溶液は750μg/ml〜1mg/mlであった)。アッセイ形式は、抗hu−OPGbp Fabを10ng/mlの最終細胞ウエル濃度のヒトOPGbp[143−317]で1時間プレインキュベーションすることを含む。値は三連の測定の平均値であった。
「AT」、「Y」および「P」の各FabのRaw細胞アッセイを示す。「AT」、「Y」および「P」の各Fabのそれぞれの、1つのエンドトキシン非含有調製物(0.5EU/ml以下)の結果を示した。Fabは、実施例4に記載されるように精製された。Fabは、グラフに示される最終細胞ウエル濃度に1/20希釈される前に、ヒトOPGbp[143−317]と室温で1時間プレインキュベーションされた。OPGbpの最終細胞ウエル濃度は20ng/mlであった。細胞濃度は1×105/mlであった。値は三連の測定から得られ、誤差バーは2標準偏差(2STD)を示している。
Fab「AT」軽鎖ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
Fab「Y」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
Fab「P」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
Fab「S」軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
Fab「AT」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
Fab「AT」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
Fab「Y」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
Fab「Y」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
Fab「P」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
Fab「S」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
Fab「S」重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
図5〜図12に示されるFabアミノ酸配列の比較を示す。「AT」、「Y」、「P」および「S」の各Fabの重鎖および軽鎖の予測されるアミノ酸配列を同一性および類似性について比較した。「AT」および「Y」の重鎖は1つのアミノ酸位置のみで異なる。ライブラリーが示しているように、4つのFabはすべて同一の重鎖CH1領域を有し、この領域は、同一性および類似性の計算において含められた重鎖のカルボキシ側半分を含んでいる。「AT」、「Y」および「P」の軽鎖は、同じであるか、または類似するVκファミリーをともに有し、従って、計算において含められた鎖のカルボキシル側半分において1個〜2個のアミノ酸のみが異なる。
「AT」、「Y」、「P」および「S」の各Fabの予測される重鎖および軽鎖の相補性決定領域(CDR)の比較を示す。重鎖を比較する場合、CDR1は、すべてのFabについてアミノ酸残基32〜36(36を含む)を含み、CDR2は、すべてのFabについてアミノ酸残基51〜67(67を含む)を含み、CDR3は、「AT」および「Y」のFabについてはアミノ酸残基100〜116(116を含む)を含み、「P」のFabについてはアミノ酸残基100〜106(106を含む)を含み、「S」のFabについてはアミノ酸残基100〜113(113を含む)を含む。軽鎖を比較する場合、CDR1は、「AT」および「Y」のFabについてはアミノ酸残基29〜39(39を含む)を含み、「P」のFabについてはアミノ酸残基28〜39(39を含む)を含み、「S」のFabについてはアミノ酸残基27〜35(35を含む)を含み、CDR2は、「AT」、「Y」および「P」のFabについてはアミノ酸残基55〜61(61を含む)を含み、「S」のFabについてはアミノ酸残基53〜59(59を含む)を含み、CDR3は、「AT」、「Y」および「P」のFabについてはアミノ酸残基94〜98(98を含む)を含み、「S」のFabについてはアミノ酸残基92〜102(102を含む)を含む。
Fabクラスの比較を示す。Fabクラスの比較をV−Base DNAPLOT分析から得た。記号(*)は、最も近い一致した多様性(D)領域が、既知の生殖系列配列に関連しているにもかかわらず、決定できなかったことを示す。記号(**)は、最も近く一致した生殖系列可変(V)領域配列が同定されたが、現在まで正式に名付けられておらず、より希なλファミリーであることを示す。
「AT」および「Y」の各Fabの予測される重鎖アミノ酸配列(それぞれ、図9および図10における残基2〜127(127を含む))と、VH1ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列は、V領域配列1〜03、D領域配列3〜10およびJ領域配列JH4(配列番号44)を含む。FR1、FR2およびFR3は3つのフレームワーク領域を示し、CDR1、CDR2およびCDR3は3つの相補的決定領域を示し、H1、H2およびH3はフレームワーク領域とCDRとの間における対応する接合配列を示す。「AT」、「Y」と生殖系列のV配列、D配列またはJ配列との違いが太字で示される。図16図22における生殖系列アミノ酸残基の番号付けは、Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest(米国厚生省、第4版、1991年)に記載される通りである。
Fab「P」の予測される重鎖アミノ酸配列(図11における残基2〜117(117を含む))と、VH3ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。配列はV領域配列3〜30およびJ領域配列JH4を含む。D領域配列は不明である。
Fab「S」の予測される重鎖アミノ酸配列(図12における残基2〜124(124を含む))と、VH3ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列は、V領域配列3〜09、D領域配列6〜19およびJ領域配列JH4を含む。
Fab「AT」の予測される軽鎖アミノ酸配列(図5における残基6〜108(108を含む))と、Vκ1ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列はV領域配列012およびJ領域配列JK1を含む。
Fab「Y」の予測される軽鎖アミノ酸配列(図6における残基6〜108(108を含む))と、Vκ3ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列はV領域配列L6およびJ領域配列JK2を含む。
Fab「P」の予測される軽鎖アミノ酸配列(図7における残基5〜108(108を含む))と、Vκ3ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列はV領域配列A27およびJ領域配列JK4を含む。
Fab「S」の予測される軽鎖アミノ酸配列(図8における残基5〜112(112を含む))と、VL3ファミリーに由来する生殖系列配列との比較を示す。生殖系列配列はV領域配列3mおよびJ領域配列JL2を含む。
「AT」405、「AT」406および「AT」407の各単離物のRAW細胞アッセイを示す。Fan「AT」をコードするcDNAを、実施例7に記載されるように、ヒトIgG1のCH1領域、CH2領域およびCH3領域をコードするcDNAに融合した。異なるリーダー配列を使用して、「AT」405、「AT」406および「AT」407と呼ばれる、得られる単離物を作製した。「AT」405〜407を、グラブに示される最終細胞ウエル濃度に希釈する前に、OPGbpと室温で1時間プレインキュベーションした。OPGbpの最終細胞ウエル濃度は40ng/mlであった。値は三連の測定から得られ、誤差バーは2標準偏差(2STD)を示している。
「AT」405および「AT」407の骨髄アッセイを示す。「AT」405および「AT」407の、1つのエンドトキシン非含有調製物(0.5EU/ml以下)の結果を示した。サンプルをヒトOPGbp[143−317]と室温で1時間プレインキュベーションし、その後、細胞に加えた。サンプルストックからの「AT」405および「AT」407に対する最終細胞ウエル希釈度がx軸に示される。OPGbpの最終細胞ウエル濃度は20ng/mlであった。
「AT」406の骨髄アッセイを示す。「AT」406の、1つのエンドトキシン非含有調製物(0.5EU/ml以下)の結果を示す。サンプルをヒトOPGbp[143−317]と室温で1時間プレインキュベーションし、その後、細胞に加えた。サンプルの最終細胞ウエル濃度がx軸に示される。OPGbpの最終細胞ウエル濃度は20ng/mlであった。
「S」435および「Y」429の骨髄アッセイを示す。「S」435および「Y」429の構築は実施例7に記載される。「S」435および「Y」429のそれぞれの、1つのエンドトキシン非含有調製物(0.5EU/ml以下)の結果を示す。サンプルをヒトOPGbp[143−317]と室温で1時間プレインキュベーションし、その後、細胞に加えた。サンプルの最終細胞ウエル濃度がx軸に示される。OPGbpの最終細胞ウエル濃度は20ng/mlであった。
「Y」442および「P」444の骨髄アッセイを示す。「Y」442および「P」444の構築および発現は実施例7に記載される。「Y」442および「P」444のそれぞれの、1つのエンドトキシン非含有調製物(0.5EU/ml以下)の結果を示す。サンプルをヒトOPGbp[143−317]と室温で1時間プレインキュベーションし、その後、細胞に加えた。サンプルの最終細胞ウエル濃度がx軸に示される。OPGbpの最終細胞ウエル濃度は20ng/mlであった。
FLAG−ネズミ[153−316]OPGbp/DEの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
DEループの領域における、ヒトOPGbp[143−317]、ネズミOPGbp[158−316]およびFLAG−ネズミ[158−316]OPGbp/DEのアミノ酸配列のアラインメントである。下線部は、FLAG−マウスOPGbp/DE分子を作製するためにマウスOPGbpに導入されたヒトOPGbpのアミノ酸残基である。
ヒトOPGbp[143−317]、ネズミOPGbp[158−316]またはFLAG−ネズミ[158−316]OPGbp/DEのいずれかがコーティングされたプレートに対するAT抗体の結合および反応性を調べる酵素免疫アッセイである。

0035

(発明の詳細な説明)
本発明は、OPG結合タンパク質(OPGbp)に選択的に結合する因子を提供する。好ましくは、この因子は、OPGbpのその同族受容体ODARに対する結合、破骨細胞の形成および/または活性化、あるいは骨の再吸収などの、OPGbpの少なくとも1つの活性を部分的または完全に阻害するOPGbpアンタゴニストまたは阻害剤である。1つの実施形態において、選択的結合因子は、OPGbpのその同族受容体に対する結合を部分的または完全に阻止し、かつ破骨細胞の形成および/または骨の再吸収を部分的または完全に阻害するようにOPGbpに選択的に結合する抗体である。

0036

用語「選択的結合因子」は、OPGbpに優先的に結合する分子をいう。選択的結合因子には、タンパク質、ペプチド核酸炭水化物、脂質または低分子量化合物が含まれる。好ましい実施形態において、選択的結合因子は抗体であり、例えば、ポリクローナル抗体モノクローナル抗体(mAb)、キメラ抗体、CDRグラフト抗体、可溶型形態または結合型形態で標識され得る抗体に対する抗イディオタイプ(抗Id)抗体、ならびにそのフラグメント、領域または誘導体などであり、これらは、酵素的切断、ペプチド合成または組換え技術(これらに限定されない)を含む既知の様々な技術によって提供される。本発明の抗OPGbp選択的結合因子は、ODAR受容体に対するOPGbpの結合を阻害するOPGbpの様々な部分に結合することができる。

0037

本発明の抗体および抗原結合ドメインはOPGbpに選択的に結合する。すなわち、本発明の抗体および抗原結合ドメインは、他の抗原に対するよりも大きな結合親和性でOPGbpに対して優先的に結合する。本発明の抗体は、ヒトOPGbpに選択的に結合し得るが、ネズミOPGbpなどのヒト以外のOPGbpにも検出可能であるように結合し得る。あるいは、本発明の抗体は、ヒト以外のOPGに選択的に結合し得るが、ヒトOPGにも検出可能であるように結合し得る。あるいは、本発明の抗体は、ヒトOPGbpにだけ結合することができ、ヒト以外のOPGbpには検出可能であるように結合しない。

0038

用語「モノクローナル抗体」は、それぞれのモノクローナル抗体が典型的には抗原上の1つのエピトープを認識する実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいう。用語「モノクローナル」は、抗体を作製するいずれかの特定の方法に限定されない。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、Kohler他、Nature、256、495(1975)に記載されるようなハイブリドーマ法によって作製することができ、あるいは例えば、本明細書中に記載されるような技術を使用してファージライブラリーから単離することができる。

0039

用語「抗原結合ドメイン」または用語「抗原結合領域」は、抗原と相互作用し、かつ結合因子に抗原に対するその特異性および親和性を与えるアミノ酸残基を含有する選択的結合因子(抗体分子など)のそのような部分をいう。好ましくは、抗原結合領域はヒト起源である。他の実施形態において、抗原結合領域は、他の哺乳動物種、特に、ウサギラットまたはハムスターなどの齧歯類に由来し得る。

0040

用語「エピトープ」は、結合因子の抗原結合領域の1つまたは複数において、選択的結合因子(抗体など)が認識して結合することができる任意の分子のそのような部分をいう。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な様々な表面配置から構成され、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。「阻害性および/または中和性のエピトープ」により、選択的結合因子が結合したときに、エピトープを含有する分子または生物生物学的活性(OPGbpのその受容体に対する結合を含む)の喪失を、インビボインビトロまたはインシトゥーで、より好ましくはインビボで生じさせるエピトープが意味される。

0041

用語「軽鎖」は、抗体に関連して使用されるとき、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ(κ)またはラムダ(λ)と呼ばれる2つの異なるタイプをいう。

0042

用語「重鎖」は、抗体に関連して使用されるとき、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる5つの異なるタイプをいう。重鎖のこれらの異なるタイプは、5クラスの抗体、それぞれ、IgAIgDIgE、IgGおよびIgMをもたらす。これには、IgGの4つのサブクラス、すなわち、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4が含まれる。

0043

用語「可変領域」または用語「可変ドメイン」は、軽鎖および重鎖の一部分で、配列が抗体間で大きく異なり、かつそれぞれの特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用される、典型的には、重鎖におけるアミノ末端の約120アミノ酸〜130アミノ酸の部分、および軽鎖におけるアミノ末端の約100アミノ酸〜110アミノ酸の部分をいう。配列における変動性は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれるそのような領域に集中しているが、可変ドメインにおけるより高度に保存された領域はフレームワーク領域(FR)と呼ばれている。軽鎖および重鎖のCDRは抗体と抗原との相互作用を担っている。

0044

用語「定常領域」または用語「定常ドメイン」は、抗体が抗原に結合することに直接的には関与していないが、様々なエフェクター機能Fc受容体との相互作用など)を示す、軽鎖および重鎖のカルボキシ末端部分をいう。

0045

用語「OPGbp」または用語「OPGbpポリペプチド」は、PCT国際特許出願公開WO/46757(その開示は参考として組み込まれる)の図4に示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチド、および関連ポリペプチドをいう。関連ポリペプチドには、対立遺伝子変化体;スプライシング変化体;フラグメント;誘導体;置換変化体、欠失変化体および挿入変化体;融合ポリペプチド;ならびに種間ホモログが含まれる。また、ヒトOPGbpの残基69〜317(317を含む)(WO98/46757における番号付けに従う)などのOPGbpの可溶型形態、または免疫学的応答を生じさせるのに十分なそのサブセット包含される。1つの実施形態において、可溶型のヒトOPGbpには、残基140〜317(317を含む)、残基143〜317(317を含む)、またはそれらの免疫原性フラグメントが含まれる。OPGbpは、本明細書中に定義されるように成熟ポリペプチドであってもよく、そして調製方法に依存してアミノ末端のメチオニン残基を有してもよく、または有しなくてもよい。

0046

用語「フラグメント」は、OPGbpまたはOPGbpのタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、全長未満の長さのアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドをいう。そのようなフラグメントは、例えば、アミノ端における短縮化、カルボキシ端における短縮化、および/またはアミノ酸配列からの残基(1つまたは複数)の内部欠失から生じ得る。フラグメントは、選択的RNAスプライシングから、またはインビボでのプロテアーゼ活性から生じ得る。

0047

用語「変化体」は、OPGbpまたはOPGbpのタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、天然または非修飾の配列と比較して、1つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失および/または付加を含むペプチドまたはポリペプチドをいう。例えば、OPGbp変化体は、天然OPGbpのアミノ酸配列に対する1つ以上の変化から生じ得る。また、例として、OPGbpの選択的結合因子の変化体は、天然または以前の非修飾の選択的結合因子のアミノ酸配列に対する1つ以上の変化からも生じ得る。変化体は、対立遺伝子変化体またはスプライシング変化体などのように天然に存在し得るし、あるいは人工的に構築することができる。ポリペプチド変化体は、前記変化体をコードする対応する核酸分子から調製することができる。

0048

用語「誘導体」は、OPGbpまたはOPGbpのタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、化学的に修飾されているポリペプチドまたはペプチド、あるいはその変化体、フラグメントまたは誘導体をいう。例には、1つ以上のポリマー水溶性ポリマーなど)、N結合型もしくはO結合型の炭水化物、糖、リン酸塩、および/または他のそのような分子を共有結合的に結合することが含まれる。誘導体は、結合した分子のタイプまたは位置のいずれかにおいて、天然に存在するペプチドまたはポリペプチドあるいは出発のペプチドまたはポリペプチドとは異なる様式で修飾される。誘導体は、ペプチドまたはポリペプチドに天然で存在する1つ以上の化学基の欠失をさらに含む。

0049

用語「融合」は、OPGbpまたはOPGbpのタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、ペプチドまたはポリペプチド、あるいはそのフラグメント、変化体および/または誘導体を異種のペプチドまたはポリペプチドと連結することをいう。

0050

用語「生物学的に活性な」は、OPGbpまたはタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、OPGbpまたは選択的結合因子に特徴的な少なくとも1つの活性を有するペプチドまたはポリペプチドをいう。OPGbpの選択的結合因子は、OPGbpの少なくとも1つの生物学的活性に関して、アゴニスト活性アンタゴニスト活性または中和活性を有し得る。

0051

用語「天然に存在する」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などの生物学的材料とともに使用されるとき、自然界に見出されるもので、ヒトによって操作されていないものをいう。

0052

用語「単離された」は、OPGbpまたはOPGbpのタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、その天然の環境で見出される少なくとも1つの混在ポリペプチドを含まないペプチドまたはポリペプチド、好ましくは、その治療的または診断的な使用を妨げる何らかの他の混在哺乳動物ポリペプチドを実質的に含まないペプチドまたはポリペプチドをいう。

0053

用語「成熟」は、OPGbpまたはOPGbpのタンパク質性選択的結合因子に関連して使用されるとき、リーダー配列を失っているペプチドまたはポリペプチドをいう。この用語はまた、アミノ端(リーダー配列を伴うか、またはリーダー配列を伴わない)および/またはカルボキシ端のタンパク質分解的プロセシング、より大きな前駆体からのより小さいポリペプチドの切断、N結合型および/またはO結合型のグリコシル化などの、ペプチドまたはポリペプチドの他の修飾を含む場合がある。

0054

用語「効果的な量」および用語「治療的に効果的な量」は、OPGbpの選択的結合因子に関連して使用されるとき、OPGbpの1つ以上の生物学的活性のレベル観測可能な変化を維持するために有用であるか、または必要である選択的結合因子の量をいう。前記の変化は、OPGbp活性のレベルの増大または低下のいずれかであり得る。

0055

用語「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に対する影響をほとんど有しないような、非天然残基による天然アミノ酸残基の置換をいう。例えば、保存的置換は、ポリペプチド内の非極性残基が任意の他の非極性残基により置換されることから生じる。さらに、ポリペプチド内の任意の天然の残基はまた、アラニン走査変異誘発(Cunningham他、Science、244、1081〜1085、1989)について以前に記載されているようにアラニンで置換することができる。保存的アミノ酸置換に関する例示的な規則を表Iに示す。

0056

0057

保存的アミノ酸置換はまた、生物学的システムにおける合成によってではなく、化学的なペプチド合成によって典型的に取り込まれる、天然に存在しないアミノ酸残基を含む。このような残基には、ペプチドミメティクス、およびアミノ酸成分の他の逆形態または反転形態が含まれる。

0058

アミノ酸配列に対する様々な保存的修飾(およびコードするヌクレオチドに対する対応する様々な修飾)により、天然に存在するOPGbpまたは選択的結合因子の機能的および化学的な特性に類似する機能的および化学的な特性を有するOPGbpポリペプチド(およびそのタンパク質性選択的結合因子)を製造することができる。それに反して、OPGbp(およびそのタンパク質性選択的結合因子)の機能的および/または化学的な特性における実質的な様々な改変を、(a)例えば、シートまたはらせんの立体配座としての置換領域における分子骨格の構造、(b)標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは(c)側鎖の嵩張りを維持したときにその作用が著しく変化する置換を選択することによって達成することができる。天然に存在する残基は、側鎖の共通した性質に基づいて様々なグループに分けることができる:
1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
2)中性親水性:Cys、Ser、Thr;
3)酸性:Asp、Glu;
4)塩基性:Asn、Gln、His、Lys、Arg;
5)鎖の配向に影響する残基:Gly、Pro;および
6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。

0059

非保存的置換には、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスに由来するメンバーに交換することが含まれることがある。

0060

2つ以上の核酸分子および/またはポリペプチドの「同一性または類似性」により、2つ以上の異なる配列の関連性の大きさが提供される。用語「同一性」は、2つの異なるアミノ酸配列における対応する位置において同一であるアミノ酸をいう。用語「類似性」は、2つの異なるアミノ酸配列における対応する位置において同一であるか、または上記に定義されるような保存的置換であるかのいずれかであるアミノ酸をいう。

0061

同一性または類似性の程度は、Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.編、Oxford University Press、New York、1988);Biocomuting:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.編、Academic Press、New York、1993);Computer Analysis of Sequence Data,Part 1(Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994);Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.、Academic Press、1987);Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.およびDevereux,J.編、M.Stockton Press、New York、1991);Carillo他、SIAM J.Applied Math.、48、1073(1988)に記載される様々な方法(これらに限定されない)を含む知られている方法によって容易に計算することができる。

0062

同一性および/または類似性を決定する好ましい方法は、調べている配列の間における最長の一致をもたらすように設計されている。同一性および類似性を決定する様々な方法が、公開されているコンピュタープログラムコード化されている。2つの配列の間における同一性および類似性を決定するための例示的なコンピュータープログラム法には、GAP(Devereux他、Nucleic AcidsResearch、12、387(1984);Genetics Computer Group、ウィスコシン大学、Madison、WI)、BLASTP、BLASTNおよびFASTA(Altschul他、J.Mol.Biol.、215、403〜410(1990))を含むGCプログラムパッケージが含まれるが、これに限定されない。BLASTXプログラムは、National Center for Biotechnology Information(NCBI)および他の供給源から公開されている(BLASTマニュアル、Altschul他、NCBNLM NIH Bethesda、MD)。よく知られているSmith Watermanアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用することができる。

0063

OPGbpポリペプチド
OPGbpポリペプチドならびにそのフラグメント、変化体および誘導体は、本発明の選択的結合因子をスクリーニングして同定するための標的分子として使用される。抗体を選択的結合因子として調製することが所望される場合、OPGbpポリペプチドは好ましくは免疫原性である。すなわち、OPGbpポリペプチドは、動物に投与されたときに免疫応答を誘発する。あるいは、抗体がインビトロ技術によって調製される場合、標的分子として使用されるOPGbpポリペプチドは、抗体または抗原結合ドメインに検出可能なほどに結合することができる。

0064

OPGbpポリペプチドは生物学的方法または化学的方法で調製される。組換えOPGbpをコードするDNA配列の発現などの生物学的方法はこの分野では知られている(例えば、Sambrook他(上記)を参照のこと)。Merrifield他、J.Am.Chem.Soc.、85:2149(1963);Houghton他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82:5132(1985);StewartおよびYoung、Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical Co.、Rockford、IL(1984))によって示される方法などの化学的合成方法もまた、本発明のOPGbpポリペプチドを調製するために使用することができる。そのようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを伴って、またはアミノ末端にメチオニンを伴うことなく合成することができる。化学合成されたOPGbpポリペプチド、あるいはそのフラグメントまたは変化体は、ジスルフィド架橋を形成させるために、これらの参考文献に示されるような方法を使用して酸化することができる。化学合成により調製された本発明のOPGbpポリペプチドは、組換え製造されたか、または天然供給源から精製された対応するOPGbpポリペプチドに匹敵し得る少なくとも1つの生物学的活性を有する。

0065

OPGbpポリペプチドは、OPGbpポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および/または体液などの生物学的サンプルから単離することによって得ることができる。OPGbpポリペプチドの供給源は起源がヒトまたは非ヒトであり得る。天然に存在するOPGbpポリペプチドの単離は、電気泳動、その後の電気溶出、様々なタイプのクロマトグラフィーアフィニティー、免疫アフィニティー、分子ふるいおよび/またはイオン交換)および/または高圧液体クロマトグラフィーによる分離などのこの分野で知られている様々な方法を使用して達成することができる。精製途中のOPGbpポリペプチドの存在は、例えば、組換え製造されたOPGbpポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製された抗体を使用してモニターすることができる。

0066

本発明のポリペプチドには、単離されたOPGbpポリペプチドおよびそれに関連するポリペプチド(これには、本明細書中上記に規定されるようなフラグメント、変化体、融合ポリペプチドおよび誘導体が含まれる)が含まれる。本発明のOPGbpフラグメントは、アミノ端における短縮化(リーダー配列を有するものまたはリーダー配列を有しないもの)、カルボキシル端における短縮化、および/またはポリペプチドに対する内部の欠失から生じ得る。そのようなOPGbpポリペプチドフラグメントは必要に応じてアミノ末端メチオニン残基を含むことができる。本発明のポリペプチドは、抗体応答を誘発することができる点で免疫原性である。

0067

本発明のOPGbpポリペプチド変化体は、天然のOPGbpアミノ酸配列と比較して、1つ以上のアミノ酸の置換、付加および/または欠失を含む。アミノ酸の置換は、上記に規定されるように保存的、または非保存的、またはそれらの任意の組合せであり得る。変化体は、アミノ酸残基の付加をカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに有し得る(この場合、アミノ末端はリーダー配列を有してもよく、または有しなくてもよい)。

0068

本発明の実施形態には、OPGbpのグリコシル化変化体およびシステイン変化体が含まれる。OPGbpグリコシル化変化体には、グリコシル化部位の数および/またはタイプが、天然のOPGbpポリペプチドと比較して変化している変化体が含まれる。1つの実施形態において、OPGbpグリコシル化変化体は、天然のOPGbpと比較して、それよりも多い数またはそれよりも少ない数のN結合型グリコシル化部位を含む。N結合型炭水化物鎖の転位を含むOPGbpグリコシル化変化体もまた提供される。この場合、1つ以上のN結合型グルコシル化部位(典型的には、天然に存在するN結合型グルコシル化部位)が除去され、そして1つ以上の新しいN結合型部位が作出されている。OPGbpシステイン変化体は、天然OPGbpと比較して、それよりも多い数のシステイン残基、あるいはそれよりも少ない数のシステイン残基を含む。1つの実施形態において、1つ以上のシステイン残基が欠失されるか、または別のアミノ酸(例えば、セリン)で置換される。OPGbpのシステイン変化体は、変性した状態から単離した後、生物学的に活性な立体配座へのOPGbpのリフォールディングを助けることによって生物学的に活性なOPGbpの回収を改善させることができる。

0069

OPGbpポリペプチド変化体を調製することは当業者のレベルの範囲内である。1つの方法において、1つ以上のアミノ酸の置換、欠失および/または付加を天然のOPGbpにおいて導入することができる。この場合、OPGbp変化体はOPGbpの天然の構造および少なくとも1つの生物学的活性を保持している。1つの方法は、同一性および/または類似性が比較的低い領域および比較的高い領域を同定するために、様々な異なる種に由来するOPGポリペプチドの配列を比較することである。比較的低い同一性および/または類似性を有するOPGbpポリペプチドのそのような領域は、構造および活性に必須である可能性は低く、従って、アミノ酸の変化に対して、特に、非保存的である変化に対してより大きな許容性を有し得ることが理解される。比較的保存された領域においてさえ、活性を保持しながら、保存的なアミノ酸置換を導入できることもまた理解される。

0070

別の方法では、構造−機能の様々な関係を使用して、活性または構造にとって重要な残基を類似するポリペプチドにおいて同定することができる。例えば、OPGbpと、構造−機能分析が可能である腫瘍壊死因子ファミリーの他のメンバーとの間で保存されたアミノ酸残基を比較することができ、そのような比較に基づいて、OPGbp内のどのアミノ酸残基が活性または構造にとって重要であるかを予測することができる。当業者は、OPGbpのそのような予測された重要なアミノ酸残基のために、化学的に類似するアミノ酸置換を選ぶことができる。

0071

さらに別の方法では、OPGbpの二次構造または三次構造(これはOPGbp結晶のx線回折または構造予測方法のいずれかにより決定される)の分析を行い、実際の構造または予測された構造に関連して特異的なアミノ酸残基の位置をOPGbpポリペプチド内において決定することができる。この情報を使用して、アミノ酸の変化を、OPGbpポリペプチドの二次構造および/または三次構造をできる限り保持しようとする様式で導入することができる。

0072

さらに別の方法では、アミノ酸を特定の位置で変化させることの影響を、アミノ酸置換を導入し、そして本明細書中に記載されるアッセイを使用して、変化したOPGbpポリペプチドを生物学的活性について調べることによって実験的に調べることができる。アラニン走査変異誘発(Cunnigham他、上記)などの技術がこの方法には特に適している。多くの変化した配列を、多くの置換をOPGbp内の様々なアミノ酸位置において導入し、そしてファージディスプレイライブラリーの一部として変化したポリペプチドの集団をスクリーニングすることによって都合よく調べることができる。この方法を使用して、活性にとって必須であるOPGbpポリペプチドのそのような領域を容易に決定することができる。

0073

上記の方法は、天然の構造を保持するOPGbp変化体を作製するために有用である。従って、それぞれの変化体に対して惹起される抗体は、OPGbpの天然の構造的決定基、すなわちエピトープを認識する可能性があり、そしてまた天然のOPGbpに結合する可能性もある。しかし、場合により、天然のOPGbp構造を保持しないOPGbp変化体、または部分的もしくは完全に満たされていないOPGbp変化体を製造することが望ましい場合がある。そのようなタンパク質に対して惹起される抗体により、OPGbp上の隠れたエピトープが認識される。

0074

本発明はまた、異種のペプチドまたはタンパク質に融合したOPGbpポリペプチドならびにそのフラグメント、変化体および誘導体を含むOPGbp融合ポリペプチドを提供する。異種のペプチドおよびタンパク質には、OPGbp融合ポリペプチドの検出および/または単離を可能にするエピトープ;膜貫通受容体タンパク質またはその一部(細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインなど);膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンドまたはその一部;触媒作用的に活性である酵素またはその一部;オリゴマー化を促進するタンパク質またはその一部(ロイシンジッパードメインなど);ならびに安定性を増大させるタンパク質またはペプチド(免疫グロブリンの定常領域など)が含まれるが、これらに限定されない。OPGbpポリペプチドは、自身に、またはそのフラグメント、変化体もしくは誘導体に融合させることができる。融合は、OPGbpポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいて行うことができ、そしてリンカー分子またはアダプター分子を用いることなく直接的であり得るか、あるいはリンカー分子またはアダプター分子を介して行うことができる。リンカー分子またはアダプター分子はまた、融合成分の分離を可能にするDNA制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼに対する切断部位を伴って設計することができる。

0075

本発明のさらなる実施形態において、OPGbpポリペプチド、フラグメント、変化体および/または誘導体は、ヒトIgGのFc領域に融合させられる。一例において、ヒトIgGのヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域を、当業者に知られている方法を使用してOPGbpポリペプチドのN末端またはC末端のいずれかにおいて融合することができる。別の例では、ヒンジ領域およびCH2領域およびCH3領域の一部を融合することができる。そのようにして製造されたOPGbp−Fc融合ポリペプチドは、プロテインAアフィニティーカラムの使用によって精製することができる。さらに、Fc領域に融合させたペプチドおよびタンパク質は、非融合の対応物よりも実質的に大きいインビボでの半減期を示すことが見出されている。また、Fc領域への融合により、融合ポリペプチドの二量体化マルチマー化が可能になる。Fc領域は、天然に存在するFc領域であり得るか、あるいは治療の質、循環時間、低下した凝集などのいくつかの性質を改善するために変化させることができる。

0076

OPGbpポリペプチドの誘導体は本発明の範囲に含まれる。そのような誘導体は、OPGbpポリペプチドがポリマーに結合している化学的に修飾されたOPGbpポリペプチド組成物である。選択されるポリマーは、結合しているタンパク質が生理学的な環境などの水性の環境で沈殿しないように典型的には水溶性である。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、そして分枝状または非分枝状であってもよい。OPGbpポリペプチドポリマーの範囲には、ポリマーの混合物が含まれる。好ましくは、最終生成物の調製物が治療的に使用される場合、ポリマーは薬学的に受容可能である。

0077

水溶性ポリマーまたはその混合物としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシポリエチレングリコールデキストラン(例えば、約6kDの低分子量デキストランなど)、セルロース、または他の炭水化物系ポリマー、ポリ(N−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマーポリプロピレンオキシドエチレンオキシド共重合体ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)およびポリビニルアルコールを挙げることができる。

0078

好ましい水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである。本明細書中で使用されるポリエチレングルコールは、モノ(C1〜C10)アルコキシポリエチレングリコールまたはアリールオキシポリエチレングリコールなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されている様々な形態のPEGのいずれをも包含することが意味される。共有結合的に結合したOPGbpマルチマーを調製するために使用され得る二官能性のPEG架橋分子もまた本発明により包含される。

0079

化学的に誘導体化されたOPGbpポリペプチドを調製する様々な方法がこの分野では十分に知られている。例として、PEGを用いたOPGbpポリペプチドの誘導体化を、Francis他、Focus on Growth Factors、3、4〜10(1992);欧州特許EP0154316;同EP0401384;および米国特許第4,179,337号に記載される手順を使用して行うことができる。好ましい実施形態において、OPGbpポリペプチド誘導体は1つのPEG成分をアミノ末端に有する。米国特許第5,234,784号を参照のこと(これは参考として組み込まれる)。

0080

本明細書中に開示されるOPGbpポリペプチド誘導体は、非修飾のポリペプチドと比較して、OPGbpの少なくとも1つの生物学的活性の増強または低下を示し得るか、あるいは半減期または安定性の増大または低下を示し得る。

0081

OPGbp選択的結合因子
OPGbpポリペプチドならびにそのフラグメント、変化体および誘導体は、OPGbpの選択的結合剤を同定するために使用することができる。上記に定義されているように、OPGbpの選択的結合因子はタンパク質性および非タンパク質性の両方の結合因子を包含し、本発明の1つの好ましい実施形態において、選択的結合因子はタンパク質性である。さらに別の好ましい実施形態において、選択的結合因子は、OPGbp(好ましくは、ヒトOPGbp)に結合する抗体またはそのフラグメントである。本発明の抗体は、OPGbpの少なくとも1つの生物学的活性のレベルを増強するアゴニスト抗体であり得るか、あるいはOPGbpの少なくとも1つの生物学的活性のレベルを低下させるアンタゴニスト抗体であり得る。OPGbpのアンタゴニスト抗体はまた、OPGbpの阻害抗体または中和抗体と呼ばれることがある。そのような抗体は本発明の好ましい実施形態であるが、OPGbp活性のアゴニストまたはアンタゴニストである他のタンパク質性選択的結合因子もまた本発明により包含されることが理解される。

0082

下記の例に記載されるように、OPGbpの少なくとも1つの活性を阻害する抗OPGbp抗体および抗原結合ドメインが同定されている。本発明の実施形態には、図9、図10、図11または図12のいずれかに示されるような重鎖Fab配列を含み、かつκ軽鎖配列またはλ軽鎖配列をさらに含む抗体が含まれる。軽鎖Fab配列は、図5図6図7または図8に示されている通りである。例えば、「AT」抗体は、軽鎖配列および重鎖配列がそれぞれ図5および図9であり、「Y」抗体は、軽鎖配列および重鎖配列がそれぞれ図6および図10であり、「S」抗体は、軽鎖配列および重鎖配列がそれぞれ図7および図11であり、「P」抗体は、軽鎖配列および重鎖配列がそれぞれ図8および図12である。本発明の抗体は、任意のイソタイプ、すなわち、IgG、IgM、IgA、IgEまたはIgDのいずれかに由来するヒトFc領域をさらに含む。好ましくは、Fc領域は、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4などのヒトIgGに由来する。

0083

本発明はまた、本明細書中に開示されるFab配列のフラグメント、変化体または誘導体を含む抗体または抗原結合ドメインを提供する。フラグメントは、典型的には軽鎖定常ドメインまたは重鎖定常ドメインに連結されている軽鎖Fab配列または重鎖Fab配列のいずれかの可変ドメインを含む。変化体には、図5〜8のいずれか1つにおけるFab配列に対して少なくとも約80%、85%、90%、95%、98%または99%の同一性または類似性を有する軽鎖Fab配列、または対応する可変ドメインを含む抗体が含まれるか、あるいは図9〜12のいずれか1つにおけるFab配列に対して少なくとも約80%、85%、90%、95%、98%または99%の同一性または類似性を有する重鎖Fab配列、または対応する可変ドメインを含む抗体が含まれる。これらの抗体は、典型的には、全長型の抗体を形成させるために、重鎖および軽鎖の定常領域と結合させることができる。

0084

本発明の抗体および抗原結合ドメイン、ならびにそのフラグメント、変化体および誘導体は、OPGbpポリペプチドに対して、好ましくはヒトOPGbpポリペプチドに対して選択的に結合する能力を保持している。1つの実施形態において、抗体は、約1nM以下あるいは0.1nM以下あるいは10pM以下あるいは10pM未満解離定数(KD)でOPGbpポリペプチドに結合する。実施例8では、「AT」抗体が約0.33nM〜0.43nMのKDでOPGbpに結合することが認められた。

0085

本発明の抗体には、ポリクローナルの単一特異性ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全にヒトの抗体、単鎖抗体および/または二重特異性抗体が含まれる。抗体フラグメントには、OPGbpポリペプチド上のエピトープに結合する、抗OPGbp抗体の様々なそのような一部分が含まれる。そのようなフラグメントの例として、Fabフラグメント、F(ab’)フラグメント、F(ab)’フラグメント、FvフラグメントおよびsFvフラグメントが含まれる。抗体は、全長型抗体の酵素的切断によって、または抗体の可変領域をコードする核酸配列を含有する組換えプラスミドの発現などの組換えDNA技術によって作製することができる。

0086

ポリクローナル抗体は、抗原で免疫化された動物の血清に由来する抗体分子の不均一な集団である。抗原は、抗体が結合し得る分子または分子の一部分で、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生するように動物を誘導することがさらに可能な分子または分子の一部分である。抗原は1つ以上のエピトープを有し得る。上記に示される特異的な反応は、抗原が、非常に選択的な様式で、その対応する抗体と反応するが、他の抗原によって惹起され得る多数の他の抗体とは反応しないことを示すことが意味される。

0087

OPGbpポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般には、OPGbpおよびアジュバント皮下注射または腹腔内注射を多数回行うことによって動物(例えば、ウサギまたはマウス)において惹起される。本発明に従って、OPGbpポリペプチドあるいはその変化体、フラグメントまたは誘導体を、免疫化される動物種において免疫原性であるキャリアタンパク質キーホルリンペットヘモシアニン血清アルブミンウシチログロブリンまたはダイズトリプシン阻害剤など)にコンジュゲート化することは有用であり得る。また、ミョウバンなどの凝集化剤が、免疫反応を増強するために使用される。免疫化後、動物は採血され、血清が抗OPGbp抗体の力価についてアッセイされる。

0088

モノクローナル抗体(mAb)は、実質的に類似するエピトープ結合部位を含有する、抗原に対して特異的である抗体の実質的に均一な集団を含有する。そのような抗体は免疫グロブリンの任意のクラスであり得るし、これには、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびその任意のサブクラスが含まれる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、インビトロ、インシトゥーまたはインビボで培養することができる。インビボまたはインビトロで高力価体を製造することが好ましい製造方法である。

0089

OPGbpに対するモノクローナル抗体は、培養における連続的な細胞株による抗体分子の製造を提供する任意の方法を使用して製造される。モノクローナル抗体を調製する好ましい方法の例として、Kohler他、Nature、256、495〜497(1975)のハイブリドーマ法、およびヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kozbor、J.Immunol.133、3001(1984);Brodeur他、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51頁〜63頁(Marcel Dekker,Inc.、New York、1987);HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988))が挙げられる:これらの内容は全体が参考として本明細書中に組み込まれる。

0090

好ましい抗OPGbp選択的結合因子には、ヒトOPGbpがその同族受容体のODARに結合することを部分的または完全に阻害するモノクローナル抗体、または同じ特異的な結合特性を実質的に有する抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび領域が含まれる。モノクローナル抗体の特異性および親和性を競合的阻害によって決定するための好ましい様々な方法を、Harlow他、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、1988);Colligan他編、Current Protocols in Immunology、Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience、N.Y.(1992、1993);Muller、Meth.Enzymol.92:589〜601(1983)に見出すことができる。これらの参考文献は参考として本明細書中に組み込まれる。

0091

本発明により、OPGbpポリペプチドとの反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた提供される。

0092

キメラ抗体は、ネズミのモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体などの、種々の部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体は、例えば、ネズミのモノクローナル抗体がハイブリドーマからのより大きな収量を有するが、ヒトにおいてより大きな免疫原性を有する場合、ヒト/ネズミのキメラなモノクローナル抗体が使用されるように、適用における免疫原性を低下させ、かつ製造における収量を増大させるために主に使用される。

0093

キメラ抗体およびその製造方法はこの分野では知られている。Cabilly他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:3273〜3277(1984);Morrison他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:6851〜6855(1984);Boulianne他、Nature、312:643〜646(1984);Neuberger他、Nature、314:268〜270(1985);Liu他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:3439〜3443(1987);HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)。これらの参考文献は参考として本明細書中に組み込まれる。

0094

例えば、本発明のキメラなモノクローナル抗体は治療剤として使用することができる。そのようなキメラ抗体において、重鎖および/または軽鎖の一部分は、所望する生物学的活性を示す限り、特定の種に由来する抗体または1つの特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、または相同的であり、その一方で、鎖(1つまたは複数)の残り部分は、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一であるか、または相同的である(米国特許第4,816,567号;Morrison他、Proc.Natl.Acad.Sci.、81:6851〜6855(1985)を参照のこと)。

0095

本明細書中で使用される用語「キメラ抗体」には、一価二価または多価の免疫グロブリンが含まれる。一価のキメラ抗体は、ジスルフィド架橋によりキメラなL鎖と結合したキメラなH鎖によって形成される二量体(HL)である。二価のキメラ抗体は、少なくとも1つのジスルフィド架橋により結合した2つのHL二量体によって形成される四量体(H2L2)である。多価のキメラ抗体もまた、例えば、(例えば、IgMのH鎖またはμ鎖に由来する)凝集するCH領域を用いることによって製造することができる。

0096

本発明のネズミ抗体およびキメラ抗体、フラグメントおよび領域は、免疫グロブリンの個々の重鎖(H)および/または軽鎖(L)を含むことができる。キメラなH鎖は、OPGbpに対して特異的な非ヒト抗体のH鎖に由来する抗原結合領域で、CH1またはCH2などのヒトH鎖C領域(CH)の少なくとも一部分に結合している抗原結合領域を含む。

0097

本発明によるキメラなL鎖は、OPGbpに対して特異的な非ヒト抗体のL鎖に由来する抗原結合領域で、ヒトL鎖C領域(CL)の少なくとも一部分に結合している抗原結合領域を含む。

0098

選択結合因子、例えば、可変領域の結合特異性が同じであるか、または異なるキメラなH鎖およびL鎖を有する抗体、フラグメントまたは誘導体などもまた、知られている方法工程に従って、例えば、Ausubel他編、Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience、N.Y.、1993)およびHarlow他、Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、1988)に従って、個々のポリペプチド鎖を適切に結合することによって調製することができる。これらの参考文献の内容は全体が参考として本明細書中に組み込まれる。この方法を用いて、キメラなH鎖(またはその誘導体)を発現する宿主が、キメラなL鎖(またはその誘導体)を発現する宿主とは別に培養され、そしてこれらの免疫グロブリン鎖が別々に回収され、その後、結合させられる。あるいは、このような宿主は同時に培養することができ、そして鎖を培養培地中で自発的に結合させ、その後、組み立てられた免疫グロブリン、フラグメントまたは誘導体を回収することができる。

0099

一例として、本発明の選択的結合因子(キメラ抗体など)の抗原結合領域は、好ましくは、ヒトOPGbpに対して特異的な非ヒト抗体に由来する。そのような非ヒト抗体をコードするDNAの好ましい供給源には、ハイブリドーマとして広く知られているハイブリッド細胞株などの、抗体を産生する細胞株が含まれる。

0100

本発明はまた、抗OPGbp抗体のフラグメント、変化体および誘導体ならびに融合体を提供する。この場合、「フラグメント」、「変化体」、「誘導体」および「融合体」の各用語は本明細書中に定義されている。本発明は、修飾されていない抗OPGbp抗体に機能的に類似している抗OPGbp抗体のフラグメント、変化体、誘導体および融合体を包含する。すなわち、それらは、修飾されていない抗体の活性の少なくとも1つを保持している。上記に示された修飾に加えて、植物毒素および細菌毒素などの細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子配列の付加もまた含まれる。OPGbp抗体のフラグメント、変化体、誘導体および融合体は、本発明の宿主のいずれかから製造することができる。

0101

好適なフラグメントには、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、FvおよびscFvが含まれる。これらのフラグメントは、完全な抗体のFcフラグメントを有しておらず、循環からより迅速に除去され、そして完全な抗体よりも小さい非特異的な組織結合性を有し得る。Wahl他、J.Nucl.Med.24:316〜325(1983)を参照のこと。これらのフラグメントは、この分野で十分に知られている方法を使用して、例えば、パパイン(Fabフラグメントを製造するために)またはペプシン(F(ab’)2フラグメントを製造するために)などの酵素を用いたタンパク質分解的切断によって完全な抗体から製造される。本発明のモノクローナル抗体によって認識されるこれらの抗原結合領域および/またはエピトープを同定することにより、本出願の様々な実施形態に匹敵する、類似した結合特性および治療的または診断的な有用性を有するさらなるモノクローナル抗体を作製するために必要な情報が得られる。

0102

本発明は、OPGbp上の阻害エピトープおよび/または中和エピトープを認識して、これに結合する抗OPGbp抗体または抗原結合ドメインを提供する。この結合の結果、抗OPGbp抗体は、OPGbpがその受容体に結合することを部分的または完全に阻害することができ、あるいは破骨細胞の形成、骨の再吸収および/または骨の喪失を部分的または完全に阻害することができる。より詳細には、本発明は、OPGbpのDE領域のアミノ酸配列の一部を含むエピトープ(「DEエピトープ」)を認識して、これに結合する抗OPGbp抗体を提供する。OPGbpのDE領域は、DおよびEのβシート領域にほぼまたがっており、ループ配列(「DEループ」)が介在している。ヒトOPGbpにおけるDE領域は、アミノ酸残基212付近からアミノ酸残基250付近(これを含む)までを含む(図29を参照のこと)。しかし、ヒトOPGbpのDE領域のアミノ酸配列および終点は単なる例示にすぎず、従って、DE領域は、ヒトOPGbpにおける配列および終点とは異なる配列および終点を有し得ることが理解される。本発明は、そのような可変DE領域に結合する抗体を包含する。

0103

抗OPGbp抗体または抗原結合ドメインはDE領域内の任意の位置において結合し得ることが考えられるが、好ましい実施形態は、DEループの少なくとも一部に結合する抗OPGbp抗体である。ヒトOPGbpにおけるDEループは約5個のアミノ酸にまたがり、残基230〜234(234を含む)付近に存在する。ヒトOPGbpにおけるDEループは配列DLATEを有する。しかし、ヒトOPGbpのDEループのアミノ酸配列および終点は単なる例示にすぎず、従って、DEループは、ヒトOPGbpにおける配列および終点とは異なる配列および終点を有し得ることが理解される。本発明は、そのような可変DEループに結合する抗体を包含する。

0104

実施例10に示されているように、配列DLATEをネズミOPGbpの対応するDEループに導入することにより、「AT」抗体の結合がもたらされるが、この抗体は、約2μg/mlの抗体濃度まで、天然のDEループ配列を有するネズミOPGbpに対して検出可能な親和性を有していない。別の実施形態において、抗OPGbp抗体は、ヒトOPGbp内のアミノ酸配列DLATEに対して、または前記配列の一部分に対して結合する。別の実施形態において、抗OPGbp抗体または抗原結合ドメインは、S229D、V230L、P231AおよびD223Eのアミノ酸置換を含むネズミOPGbpには結合するが、類似する条件のもとで、前記置換を有しないネズミOPGbpには結合しない。

0105

本発明の抗体は、部分的には、抗体が結合するOPGbp上のアミノ酸配列によって特徴づけられるが、抗体により認識されるOPGbp上のDEエピトープが、典型的には、DE領域に含まれないアミノ酸を含み得る三次元構造を含むことが当業者によって理解および認識される。OPGbp配列の線状表示では、DEエピトープを含むアミノ酸はDE領域から離れている場合があるが、OPGbpの三次元構造では、DEエピトープのアミノ酸はDE領域の近くに存在する可能性がある。従って、DEエピトープに対する抗OPGbp抗体の結合には、DE領域におけるアミノ酸以外のアミノ酸が関与し得ることが理解される。それにもかかわらず、DEループ内のアミノ酸残基、特に、配列DLATE内の残基の一部または全体がOPGbpに対する抗体結合およびOPGbp活性の阻害に関与していることが示されている。

0106

選択的結合因子の変化体もまた提供される。1つの実施形態において、抗体または抗原結合ドメインの変化体は天然に存在するか、または組換えDNA技術を使用して天然の配列をインビトロ操作することによって導入される、軽鎖および/または重鎖のアミノ酸配列における変化を含む。天然に存在する変化体には、外来抗原に対する抗体応答が生じているときに、対応する生殖系列ヌクレオチド配列内にインビボで生じる「体細胞」変化体が含まれる。配列において本発明の例示的なFabを生じさせる生殖系列の可変軽鎖配列および可変重鎖配列における体細胞変異によってコードされる変化体が、Fab「AT」については図16および図19に示され、Fab「Y」については図16および図20に示され、Fab「P」については図17および図21に示され、Fab「S」については図18および図22に示される。

0107

抗OPGbp抗体および抗原結合ドメインの変化体はまた、この分野で知られている変異誘発技術に調製される。一例において、アミノ酸の変化を抗体コード領域の全体にランダムに導入することができ、そして得られる変化体を、OPGbpに対する結合親和性などの所望する活性についてスクリーニングすることができる。あるいは、アミノ酸の変化を、OPGbp抗体の選択された領域に、例えば、軽鎖および/または重鎖のCDRならびにフレームワーク領域などに導入することができ、そして得られる抗体を、OPGbpに対する結合または何らかの他の活性についてスクリーニングすることができる。アミノ酸の変化には、CDRにおける1つまたは複数のアミノ酸置換が含まれ、これは、1つのアミノ酸の違いから、所与CDR(CDR3など)内のアミノ酸のすべての可能な置換の導入にまで及ぶ。別の方法では、OPGbp結合に対するCDR内の各残基の寄与を、CDR内の少なくとも1つの残基をアラニンで置換することによって評価することができる(Lewis他、Mol.Immunol.32、1065〜1072(1995))。その後、より最適な配列を決定するために、OPGbpに対する結合に関して最適でない残基を変化させることができる。CDR3などのCDRのサイズを大きくするためにアミノ酸を挿入することによって作製される変化体もまた包含される。例えば、ほとんどの軽鎖CDR3配列は長さが9アミノ酸である。9残基よりも短い抗体内の軽鎖CDR3配列を、CDRの長さを大きくするために適切なアミノ酸を挿入することによってOPGbpに対する結合について最適化することができる。

0108

1つの実施形態において、抗体または抗原結合ドメインの変化体は、1つまたは複数のアミノ酸変化を、重鎖または軽鎖のCDR1、CDR2またはCDR3の1つ以上に含み、そして必要な場合には、重鎖または軽鎖のフレームワーク領域のFR1、FR2またはFR3の1つ以上に含む。アミノ酸の変化は、アミノ酸残基の置換、欠失および/または挿入を含む。例示的な変化体には、配列NYAIH(配列番号13)または配列WINAGNGNTIKFSQKFQG(配列番号16)または配列DSSNMVRGIIIAYYFDY(配列番号19)における1つ以上のアミノ酸変化を有する「AT」の重鎖可変領域変化体、あるいは配列RASQSISRYLN(配列番号01)または配列GASSLQS(配列番号05)または配列QHTRA(配列番号09)における1つ以上のアミノ酸変化を有する「AT」の軽鎖可変領域変化体が含まれる。上記の「AT」の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の変化体は、フレームワーク領域における1つ以上のアミノ酸変化をさらに含むことができる。一例において、1つ以上のアミノ酸変化を、体細胞的に変異したフレームワーク残基をその位置において生殖系列残基で置換するために導入することができる。上記のアミノ酸変化が置換である場合、そのような変化は保存的な置換または非保存的な置換であり得る。

0109

実施例11および12により、AT抗体の軽鎖CDR3領域および重鎖CDR3領域における変化体が提供される。1つの実施形態において、本発明は、得られる抗体または抗原結合ドメインがOPGbp結合タンパク質に選択的に結合するように、配列番号19(重鎖CDR3)または配列番号9(軽鎖CDR3)のいずれかにおける変化体を提供する。1つの実施形態において、OPGbpはヒトOPGbpである。

0110

本発明は、可変軽鎖および可変重鎖を含み、かつ下記の配列からなる群から選択される配列を有する重鎖CDR3領域をさらに含む抗OPGbp抗体を提供する:

0111

配列中、Xは、その位置において通常存在するアミノ酸残基とは異なる任意のアミノ酸であり、そして得られる抗体はOPGbpに選択的に結合する。

0112

本発明はまた、可変軽鎖および可変重鎖を含み、かつ5アミノ酸から9アミノ酸まで大きくなっている軽鎖CDR3配列をさらに含む抗OPGbp抗体を提供する。より詳細には、軽鎖CDR3配列は、下記の配列からなる群から選択される選択される:
QHTXXXXRA(配列番号97)
配列中、左から右へのXの最初の存在は、アルギニン以外の任意のアミノ酸残基を表し、Xの2番目、3番目および4番目の存在は任意のアミノ酸残基を表すが、好ましくはアラニンを表し、そして得られる抗体はOPGbpに選択的に結合する。本発明の別の実施形態において、軽鎖CDR3配列は、下記の配列からなる群から選択される選択される:
QHTXAAARA(配列番号98)
(配列中、Xは、アラニン以外の任意のアミノ酸残基である)。

0113

別の実施形態において、本発明の抗体変化体は、配列番号1におけるようなCDR1配列と、配列番号5におけるようなCDR2配列とを有するVl鎖を含み、そして、配列番号13におけるようなCDR1配列と、配列番号16におけるようなCDR2配列とを有するVh鎖を含む。別の実施形態において、本発明の抗体変化体は、上記の軽鎖CDR3変化体を有する「AT」抗体に由来するVl鎖と、上記の重鎖CDR3変化体を有する「AT」抗体に由来するVh鎖とを含む。変化体はまた、軽鎖または重鎖の「鎖シャフリング」(Marks他、Biotechnology、10、779〜783(1992))によって調製することができる。典型的には、1つの軽鎖(または重鎖)が、重鎖(または軽鎖)のレパートリーを有するライブラリーと組合せられ、そして得られる集団が、OPGbpに対する結合などの所望する活性についてスクリーニングされる。この技術により、1つの軽鎖(または重鎖)との組合せで、重鎖および軽鎖の両方のレパートリーを含むライブラリーに関して可能になるよりも大きな、種々の重鎖(または軽鎖)のサンプルをスクリーニングすることが可能になる。

0114

本発明の選択的結合因子は二重特異性であり得る。本発明の二重特異的な選択的結合因子はいくつかの形態であり得る。例えば、二重特異性抗体は、単一抗体(または抗体フラグメント)に類似しているが、2つの異なる抗原結合部位(可変領域)を有する。二重特異性抗体は、化学的技術(例えば、Kranz他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78:5807(1981)を参照のこと)によって、「ポリドーマ」技術(米国特許第4,478,893号(Reading)を参照のこと)によって、または組換えDNA技術によって製造することができる。

0115

本発明の選択的結合因子はまたヘテロ抗体であり得る。ヘテロ抗体は、それぞれの抗体またはフラグメントが異なる特異性を有する2つ以上の抗体または抗体結合フラグメント(Fab)が一緒に連結されているものである。

0116

本発明はまた「ヒト化」抗体に関する。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法がこの分野では十分に知られている。一般に、ヒト化抗体は、1つ以上のアミノ酸残基が、非ヒトである供給源に由来するヒト抗体に導入されている。一般に、非ヒトの残基はCDRに存在する。ヒト化は、この分野で知られている様々な方法(Jones他、Nature、321、522〜525(1986);Riechmann他、Nature、332、323〜327(1988);Verhoeyen他、Science、239、1534〜1536(1988)に従い、齧歯類の相補性決定領域(CDR)をヒト抗体の対応する領域の代わりに使用することによって行うことができる。

0117

本発明の選択的結合因子(キメラ抗体、CDRグラフト化抗体およびヒト化抗体を含む)はこの分野で知られている様々な組換え方法によって製造することができる。抗体をコードする核酸が、本明細書中に記載される材料および手順ならびにこの分野で知られている材料および手順を使用して、宿主細胞に導入され、そして発現させられる。好ましい実施形態において、抗体は、CHO細胞などの哺乳動物宿主細胞において製造される。完全なヒト抗体は、宿主細胞にトランスフェクションされた組換えDNAを発現させることによって、または上記に記載されるようにハイブリドーマ細胞において発現させることによって製造することができる。

0118

モノクローナル抗体の生成を回避する、抗体分子の抗原結合領域の組換えDNA型を作製するための技術は本発明の実施の範囲に包含される。そうするために、抗体に特異的なメッセンジャーRNA分子が、免疫化動物から取り出された免疫系細胞から抽出され、相補的なDNA(cDNA)に転写される。その後、このcDNAは細菌発現システムクローン化される。本発明の実施に好適なそのような技術の一例では、発現したFabタンパク質を細胞周辺腔空間(細菌の細胞膜細胞壁との間)に移動または分泌させるリーダー配列を有する、バクテリオファージλベクターシステムが使用される。非常に多くの機能的なFabフラグメントを迅速に作製し、そして抗原に結合するフラグメントについてそれらをスクリーニングすることができる。そのようなOPGbp選択的結合因子(OPGbpポリペプチドに対する特異性を有するFabフラグメント)は、本明細書中おいて定義、議論および特許請求されているように、用語「抗体」に特に包含される。

0119

本発明の範囲にはまた、適切な抗原特異性マウス抗体分子に由来する遺伝子を、ヒト補体を活性化してADCCを媒介する能力などの適切な生物学的活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子と一緒にスプライシングすることによってキメラ抗体を製造するために開発された様々な技術も含まれる。(Morrison他、Proc.Natl.Acad.Sci.、81:6851(1984);Neuberger他、Nature、312:604(1984))。一例は、Fc領域を異なるイソタイプのFc領域で置換することである。この技術によって製造される抗体などの選択的結合因子は本発明の範囲内である。

0120

本発明の好ましい実施形態において、抗OPGbp抗体は完全なヒト抗体である。従って、本発明により、OPGbpポリペプチドに結合する抗体であって、ヒト生殖系列の免疫グロブリン核酸配列の天然に存在する体細胞変化体、ならびにそのフラグメント、合成的変化体、誘導体および融合体である核酸配列によってコードされる抗体が包含される。そのような抗体は、この分野で知られている任意の方法によって製造することができる。例示的な方法には、内因性の免疫グロブリン産生が存在しないもとでヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物(例えば、マウス)のOPGbp抗原(必要な場合にはキャリアにコンジュゲート化された、免疫応答を誘発し得る任意のOPGbpポリペプチド)による免疫化が含まれる。例えば、Jakobovits他、Proc.Natl.Acad.Sci.、90、2551〜2555(1993);Jakobovits他、Nature、362、255〜258(1993);Bruggermann他、Year in Immunol.、7、33(1993)を参照のこと。

0121

あるいは、ヒト抗体は、ファージディスプレイ抗体ライブラリーをインビトロでスクリーニングすることによって得ることができる。Hoogenboom他、J.Mol.Biol.、227、381(1991);Marks他、J.Mol.Biol.、222、581(1991)を参照のこと(これらは参考として本明細書中に組み込まれる)。様々な抗体含有ファージディスプレイライブラリーが、当業者によって記載されており、そして容易に調製され得る。ライブラリーは、適切な標的に対して分泌され得る多様なヒト抗体配列(ヒトのFabフラグメント、FvフラグメントおよびscFvフラグメントなど)を含有することができる。実施例1には、OPGbpに選択的に結合するそのような分子を同定するために、OPGbpに対するFabファージライブラリーのスクリーニングが記載される。ファージディスプレイライブラリーは、OPGbpの選択的結合因子を同定するためにスクリーニングされ得る抗体以外のペプチドまたはタンパク質を含む得ることが理解される。

0122

抗イディオタイプ(抗Id)抗体は、抗体の抗原結合部位に一般に関連する特徴的な決定基を認識する抗体である。Id抗体は、抗Idが調製されるモノクローナル抗体を用いて、そのモノクローナル抗体の供給源と同じ種および遺伝子タイプの動物(例えば、マウス株)を免疫化することによって調製することができる。免疫化された動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体(抗Id抗体)を産生することによって、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これに応答する。例えば、米国特許第4,699,880号(これは全体が参考として本明細書中に組み込まれる)を参照のこと。抗Id抗体はまた、さらに別の動物における免疫応答を誘導するための「免疫原」としても使用することができ、いわゆる抗−抗Id抗体を製造することができる。抗−抗Idは、抗Id抗体が誘導された元のモノクローナル抗体とエピトープ的に同一であり得る。従って、mAbのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。

0123

OPGbpの選択的結合物質の製造
調製すべきOPGbpの選択的結合物質がタンパク質様選択的結合物質、例えば抗体または抗原結合ドメインである場合、該物質を製造するために種々の生物学的または化学的方法を利用できる。

0124

治療用途のための選択的結合物質を十分量製造するためには生物学的方法が好ましい。本発明の抗体および抗原結合ドメインの製造には標準的な組換えDNA技術がとりわけ有用である。発現ベクター、宿主細胞および発現した生成物の回収方法の例を以下に記載する。

0125

標準的なライゲーション技術を用いてOPGbp抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子を適当な発現ベクターに挿入する。ベクターは典型的には用いる特定の宿主細胞において機能的であるように選択する(すなわちベクターは宿主細胞機構適合し、遺伝子の増幅および/または遺伝子の発現を生じることができる)。抗OPGbp抗体をコードする核酸分子を原核細胞酵母昆虫バキュロウイルス系)および/または真核宿主細胞において増幅/発現できる。宿主細胞の選択は抗OPGbp抗体を翻訳後修飾(例えばグリコシル化および/またはリン酸化)するかどうかに一部依存する。その場合、酵母、昆虫または哺乳動物宿主が好ましい。発現ベクターの概説に関してはMeth.Enz.v.185、D.V.Goeddel編、アカミックプレスインコーポレーティッド、サンディエゴ、カルフォニア州(1990)を参照されたい。

0126

典型的には、いずれかの宿主細胞で使用される発現ベクターは1つまたはそれ以上の以下の構成成分:プロモーター、1つまたはそれ以上のエンハンサー配列複製起点転写終止配列ドナーおよびアクセプタースプライシング部位を含有する完全イントロン配列、分泌のためのリーダー配列、リボソーム結合部位ポリアデニル化配列、発現すべきポリペプチドをコードする核酸配列を挿入するためのポリリンカー領域、および選別マーカーエレメントを含有する。これらの配列の各々について以下でより詳細に記載する。

0127

ベクター成分は同種性(すなわち宿主細胞と同一の種および/または株に由来する)、異種性(すなわち宿主細胞種または株以外の種に由来する)、ハイブリッド(すなわち1つ以上の供給源に由来する異なる配列の組み合わせ)、合成、または通常免疫グロブリン発現を制御するように機能する元来の配列でよい。このように、ベクター成分の供給源は、成分が宿主細胞機構の中で機能的であり、それにより活性化されるならば、原核もしくは真核生物、いずれかの脊椎もしくは無脊椎生物、またはいずれかの植物でよい。

0128

複製起点は発現に用いられる宿主細胞の型に基づいて選択される。例えば、プラスミドpBR322製品番号303−3s、ニュー・イングランドバイオラブズ、ベバリーマサチューセッツ州)からの複製起点がたいていのグラム陰性細菌に適しているが、SV40ポリオーマアデノウイルス水胞性口内炎ウイルス(VSV)またはパピローマウイルス(例えばHPVまたはBPV)に由来する起点が哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要ではない(例えばSV40起点はしばしば初期プロモーターを含有するという理由だけで使用される)。

0129

転写終止配列は典型的にはポリペプチドコーディング領域の3’末端に位置し、転写を終止させる働きをする。通常原核細胞の転写終止配列はG−Cに富むフラグメントであり、後にポリT配列が続く。配列は容易にライブラリーからクローン化されるか、またはベクターの一部として市販により購入されるが、前記したもののように核酸合成の方法を用いて容易に合成することもできる。

0130

選択マーカー遺伝子エレメントは選択培養培地中で成長する宿主細胞の生存および成長に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は(a)原核宿主細胞に関して、抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピシリンテトラシリンまたはカナマイシンに対する抵抗性を賦与する、(b)細胞の栄養要求欠損補足する;または(c)複合培地から利用できない必要な栄養を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーはカナマイシン抵抗性遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子、およびテトラサイクリン抵抗性遺伝子である。ネオマイシン抵抗性遺伝子もまた原核および真核宿主細胞における選択に使用することができる。

0131

その他の選択マーカーを用いて発現される遺伝子を増幅することができる。増幅は成長に重要なタンパク質の産生により必要とされる遺伝子が、組換え細胞の連続した世代の染色体内タンデムに反復される過程である。哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例としてはジヒドロ葉酸リダクターゼ(DHFR)およびチミジンキナーゼなどがある。ベクターに存在するマーカーのために形質転換体のみが生存に唯一適合するという淘汰圧下に哺乳動物細胞形質転換体を置く。培地中の選択物質の濃度が連続的に変化する条件下で形質転換した細胞を培養することにより淘汰圧を賦課し、それにより選択遺伝子および抗OPGbp抗体をコードするDNAの双方を増幅させる。結果的に増幅されたDNAから合成される抗体の量が増加する。

0132

リボゾーム結合部位は通常mRNA翻訳開始に必要であり、Shine−Dalgarno配列(原核細胞)またはKozak配列(真核細胞)により特徴づけられる。典型的にはエレメントはプロモーターの3’および発現すべきポリペプチドのコーディング配列の5’に位置する。Shine−Dalgarno配列は変化するが、典型的にはポリプリンである(すなわちA−G含量が高い)。多くのShine−Dalgarno配列が同定されており、前記の方法を用い、原核細胞ベクターを用いてその各々を容易に合成することができる。

0133

リーダーまたはシグナル配列を用いてポリペプチドを直接分泌させる。シグナル配列はポリペプチドコーディング領域の5’末端内または直ぐ末端に位置し得る。多くのシグナル配列が同定されており、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択できる。本発明では、シグナル配列は抗OPGbp抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸配列に対して同種(天然発生)または異種でよい。選択された異種シグナル配列は宿主細胞により認識されプロセッシングされる、すなわちシグナルペプチダーゼにより切断される配列でなければならない。元来の免疫グロブリンシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞では、例えばアルカリ性ホスファターゼペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核細胞シグナル配列によりシグナル配列が置換される。酵母分泌では、元来の免疫グロブリンシグナル配列が酵母インベルターゼアルファ因子、または酸ホスファターゼリーダーにより置換され得る。哺乳動物細胞発現では元来のシグナル配列で十分であるが、別の哺乳動物シグナル配列が適当である。

0134

たいていの場合、宿主細胞からの抗OPGbp抗体または抗原結合ドメインの分泌により、抗体からシグナルペプチドが除去される。従って、成熟抗体はいずれのリーダーまたはシグナル配列をも欠如する。

0135

例えば真核宿主細胞発現系においてグリコシル化が望ましい場合、種々のプレ配列を操作してグリコシル化または収量を改善できる場合もある。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変化させるか、またはこれもまたグリコシル化に影響するプロ配列を付け加えることができる。最終的なタンパク質生成物は1位置(成熟タンパク質の最初のアミノ酸に相対する)で発現のための1つまたはそれ以上のさらなるアミノ酸事象を有することができ、これは全体的には除去されていない。例えば最終的なタンパク質生成物はN末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見出される1つまたは2つのアミノ酸を有してよい。また別に、酵素が成熟ポリペプチド内のかかる部分で切断する場合、いくつかの酵素切断部位を使用することにより、望ましいOPGbpポリペプチドのわずかにトランケートされた形態になり得る。

0136

本発明の発現ベクターは典型的には宿主生物により認識され、および抗OPGbp抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子に機能的に連結されたプロモーターを含有する。発現に用いる宿主細胞および望ましいタンパク質の収量に依存して、元来のまたは異種性のいずれかのプロモーターを用いることができる。

0137

原核宿主細胞で使用するのに適したプロモーターにはベータラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系;アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系;およびハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーターなどがある。その他の公知の細菌性プロモーターもまた適している。その配列が確立され、それにより当業者は、いずれかの必要な制限部位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを用いて、それらを望ましいDNA配列にライゲートすることができるようになった。

0138

酵母宿主で使用するのに適したプロモーターもまた当業界で公知である。酵母エンハンサーを酵母プロモーターと共に使用するのが有利である。哺乳動物宿主細胞で使用するのに適したプロモーターは公知であり、ウイルス、例えばポリオーマウイルス鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス2)、ウシ乳頭腫ウイルストリ肉腫ウイルスサイトメガロウイルスレトロウイルスB型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス40(SV40)のゲノムに由来するものなどがある。その他の適当な哺乳動物プロモーターには異種性哺乳動物プロモーター、例えば熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターなどがある。

0139

本発明の選択的結合物質を発現するために用いることができる別のプロモーターには、非限定例としては:SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon、Nature 290:304−310(1981));CMVプロモーター;ラウス肉腫ウイルスの3’長末端反復に含まれるプロモーター(Yamamotoら、Cell 22:787−797(1980));ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78:144−1445(1981));メタロチオネイン遺伝子制御配列(Brinsterら、Nature 296:39−42(1982));原核細胞発現ベクター例えばベーターラクタマーゼプロモーター(Villa−Kamaroffら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727−3731(1978));またはtacプロモーター(DeBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21−25(1983))などがある。以下の動物転写調節領域もまた興味深く、これは組織特異性を呈し、トランスジェニック動物において利用されている:膵腺房細胞において活性であるエラスターゼ遺伝子調節領域(Swiftら、Cell 38:639−646(1984);Ornitzら、Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol.50:399−409(1986);MacDonald、Hepatology 7:425−515(1987));膵臓ベータ細胞において活性であるインスリン遺伝子調節領域(Hanahan、Nature 315:115−122(1985));リンパ細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域(Grosschelら、Cell 38:647−658(1984);Adamesら、Nature 318:533−538(1985);Alexanderら、Mol.Cell.Biol.7:1436−1444(1987));精巣乳房リンパおよびマスト細胞において活性であるマウス乳腺癌ウイルス調節領域(Lederら、Cell 45:485−495(1986))、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子調節領域(Pinkertら、Genes and Devel 1:268−276(1987));肝臓において活性であるアルファフェトタンパク質遺伝子調節領域(Krumlaufら、Mol.Cell.Biol.5:1639−1648(1985);Hammerら、Science 235:53−58(1987));肝臓において活性であるアルファ1−アンチトリプシン遺伝子調節領域(Kelseyら、Genes and Devel 1:161−171(1987));脊髄細胞において活性であるベータ・グロブリン遺伝子調節領域(Mogramら、Nature 315:338−340(1985);Kolliasら、Cell 46:89−94(1986));脳の乏突起神経膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域(Readheadら、Cell 48:703−712(1987));骨格筋において活性であるミオシンL鎖−2遺伝子調節領域(Sani、Nature 314:283−286(1985));および視床下部において活性であるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子調節領域(Masonら、Science 234:1372−1378(1986))。

0140

エンハンサー配列をベクターに挿入して真核宿主細胞における転写を増加させることができる。哺乳動物遺伝子から利用できるいくつかのエンハンサー配列が公知である(例えば、グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ・フェト・タンパク質およびインスリン)。しかしながら、典型的にはウイルスからのエンハンサーが用いられる。SV40エンハンサー。サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが真核細胞プロモーターの活性化の増強エレメントの例である。エンハンサーはポリペプチドコーディング領域の5’または3’位置でベクターにスプライシングされ得るが、典型的にはプロモーターから5’の部位に位置する。

0141

本発明を実施するのに好ましいベクターは細菌、昆虫、および哺乳動物宿主に適合するベクターである。かかるベクターにはとりわけ、pCRII、pCR3、およびpcDNA3.1(インビトローゲンカンパニー、サンディエゴ、カリフォルニア州)、pBSII(ストラッタジーン・カンパニー、ラジョーラ、カリフォルニア州)、pET15(ノバゲン、マディソン、ウィスコンシン州)、pGEX(ファルマシア・バイオテックピスカッタウェイ、ニュージャージー州)、pEGFP−N2(クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州)、pETL(BlueBacII、インビトローゲン)、pDSR−アルファ(PCT公開番号WO90/14363)およびpFastBacDual(ギブコBRL、グランドアイランドニューヨーク州)などがある。

0142

さらに可能なベクターには、非限定例としては、コスミド、プラスミド、または修飾ウイルスなどがあるが、ベクター系は選択された宿主細胞と適合していなければならない。かかるベクターには、非限定例としては、プラスミド例えばブルースクリプト・プラスミド誘導体(高コピー数ColE1基盤ファゲミド、ストラッタジーン・クローニング・システム・インコーポレーティッド、ラジョーラ、カリフォルニア州)、クローニングTaq増幅PCR生成物のために設計されたPCRクローニングプラスミド(例えばTOPO(商標)TAクローニング・キット、PCR2.1・プラスミド誘導体、インビトローゲン、カールスバッド、カリフォルニア州)、および哺乳動物、酵母またはウイルスベクター、例えばバキュロウイルス発現系(pBacPAKプラスミド誘導体、クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州)などがある。形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、またはその他の公知の技術により宿主細胞に組換え分子を挿入することができる。

0143

本発明の宿主細胞は原核宿主細胞(例えば大腸菌)または真核宿主細胞(例えば酵母細胞昆虫細胞、または脊椎動物細胞)でよい。宿主細胞を適当な条件下で培養する場合、続いて培養培地から(宿主細胞がそれを培地に分泌する場合)、または直接それを生成する宿主細胞から(それが分泌されない場合)収集できる本発明の抗体または抗原結合ドメインを発現する。適当な宿主の選択は種々の因子、例えば望ましい発現レベル、活性に望ましいかまたは必要とされるポリペプチド修飾、例えばグリコシル化またはリン酸化、および生物学的に活性な分子へのフォールディングの平易さなどに依存する。

0144

多くの適した宿主細胞が当業界で公知であり、アメリカン・タイプ・カルチャーコレクションATCC)、マナサスバージニア州から入手可能である。例としては哺乳動物細胞、例えばチャニーズ・ハムスター卵巣細胞(CHO)(ATCC番号:CCL61)CHO DHFR−細胞(Urlaubら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:4216−4220(1980))、ヒト胎児HEK)293もしくは293T細胞(ATCC番号:CRL1573)、または3T3細胞(ATCC番号:CCL92)などがある。適当な宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび製品製造並びに精製の方法は当業界で公知である。その他の適当な哺乳動物細胞系はサルCOS−1(ATCC番号:CRL1650)およびCOS−7細胞系(ATCC番号:CRL1651)、並びにCV−1細胞系(ATCC番号:CCL70)である。哺乳動物宿主細胞の別の例には霊長類細胞系および齧歯類細胞系などがあり、形質転換された細胞系を含む。通常の二倍体細胞、1次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、および1次外植体もまた適している。候補細胞遺伝子型的に選択遺伝子を欠失しているか、または優性に作用する選択遺伝子を含有していてよい。その他の適当な哺乳動物セルラインには、非限定例としてはマウス神経芽細胞腫N2A細胞、HeLa、マウスL929細胞、スイス由来の3T3ライン、Balb−cまたはNIHマウス、BHKまたはHaKハムスター細胞系などがあり、これらはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)、マナサス、バージニア州から入手可能である。これらの細胞系の各々はタンパク質発現の分野の業者に公知であり、利用可能である。

0145

本発明に適した宿主細胞として同様に有用であるのは細菌細胞である。例えば、大腸菌の種々の株(例えばHB101(ATCC番号:33694)、DH5α、DH10、およびMC1061(ATCC番号:53338))がバイオテクノロジーの分野で宿主細胞として公知である。B.サブチリス(B.subtilis)、シュードモナス(Pseudomonas)種、その他のバシラス(Bacillus)種、ストレプトミセス(Streptomyces)種等もまたこの方法で用いることができる。

0146

当業者に公知の酵母細胞の多くの株もまた本発明のポリペプチドを発現するための宿主細胞として利用できる。好ましい酵母細胞には例えばサッカロミセスセレビジエ(Saccharomyces cervisae)などがある。

0147

さらに、望む場合、昆虫細胞系を本発明の方法において利用することができる。かかる系については例えばKittsら(Biotehniques 14:810−817(1993))、Lucklow(Curr.Opin.Viotechnol.4:810−817(1993))およびLucklowら(J.Virol.67:4566−4579(1993))に記載されている。好ましい昆虫細胞はSf−9およびHi5(インビトローゲン、カールスバッド、カリフォルニア州)である。

0148

抗OPGbp抗体または抗原結合ドメインをコードする核酸分子の選択された宿主への形質転換またはトランスフェクションは、例えば塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションリポフェクションまたはDEAEデキストラン法などの公知の方法により達成できる。選択される方法は用いられる宿主細胞型に一部関係する。これらの方法およびその他の適当な方法は当業者に公知であり、例えば前出のSambrookらに示されている。

0149

またトランスジェニック動物を用いてグリコシル化選択的結合物質、例えば抗体および抗原結合ドメインを発現することもできる。例えば、トランスジェニック乳生成動物(例えば雌ウシまたはヤギ)を用いて動物の乳中にグリコシル化結合物質を得ることができる。また別に、植物を用いてグリコシル化選択的結合物質を生成することができる。

0150

OPGbpの選択的結合物質をコードする発現ベクターを含む宿主細胞(すなわち形質転換またはトランスフェクションされている)を当業者に公知の標準的な培地を用いて培養できる。培地は通常細胞の成長および生存に必要な全ての栄養を含有する。大腸菌を培養するのに適した培地は例えばルリアブロス(LB)および/またはテリフィックブロス(TB)である。真核細胞を培養するのに適した培地はRPMI1640、MEMDMEMであり、これらは全て培養される特定の細胞系に必要とされる血清および/または成長因子を補充されていてよい。昆虫培養に適した培地は、イーストレート、ラクトアルブミン加水分解産物、および/または必要な場合ウシ胎仔血清を補充したグレース培地である。

0151

典型的には、トランスフェクトされたまたは形質転換された細胞の選択的成長に有用な抗生物質またはその他の化合物を培地への補充物質として添加する。使用される化合物は宿主細胞が形質転換されたプラスミドに存在する選択マーカーエレメントにより指示される。例えば選択マーカーエレメントがカナマイシン抵抗性である場合、培養培地に添加される化合物がカナマイシンである。選択的成長のためのその他の化合物にはアンピシリン、テトラシリンおよびネオマイシンなどがある。

0152

宿主細胞により生成された抗OPGbp抗体または抗原結合ドメインの量を当業界で公知の標準的な方法を用いて評価することができる。かかる方法には、非限定例としてはウェスターンブロット分析、SDSポリアクルアミドゲル電気泳動非変性ゲル電気泳動、HPLC分離免疫沈澱および/または活性アッセイなどがある。

0153

細胞培地に分泌された抗OPG抗体または抗原結合ドメインの精製はアフィニティイムノアフィニティーまたはイオン交換クロマトグラフィー分子ふるいクロマトグラフィー調製用ゲル電気泳動または等電点電気泳動クロマトフォーカシングおよび高圧液体クロマトグラフィーなどの種々の技術を用いて達成することができる。例えば、Fc領域を含む抗体はFc領域に選択的に結合するプロテインAを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより都合よく精製することができる。抗体または抗原結合ドメインの修飾形態アフィニティータグ、例えばヘキサヒスチジンまたはその他の小型ペプチド例えばFLAG(イーストマンコダック・カンパニー、ニューヘブン、コネティカット州)またはnyc(インビトローゲン)で、そのカルボキシルまたはアミノ末端のいずれかで調製し、ワンステップアフィニティーカラムにより精製することができる。例えばポリヒスチジンは大きな親和性および特異性でニッケルと結合し、従ってニッケルのアフィニティカラム(例えばキアゲン登録商標)ニッケルカラム)をポリヒスチジンタグ化選択的結合物質の精製に使用できる。(例えばAusubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、セクション10.11.8、ジョーン・ウィレイアンド・サンズ、ニューヨーク(1993)を参照)。1つ以上の精製工程が要求される場合もある。

0154

原核宿主細胞に発現させる本発明の選択的結合物質はペリラス間隙もしくは細胞質のいずれかで可溶性形態で、または細胞内封入体の一部として不溶性形態で存在し得る。当業者に公知のいずれかの標準的な技術を用いて宿主細胞から選択的結合物質を抽出することができる。例えば、宿主細胞を溶解してフレンチプレスホモジナイゼーション、および/またはソニケーション、続いて遠心することによりペリプラスム/細胞質の内容物を放出させることができる。

0155

細胞質に存在するか、またはペリプラスム間隙から放出される抗OPGbp抗体または抗原結合ドメインの可溶性形態を当業界で公知の方法を用いてさらに精製でき、例えばFabフラグメントは浸透圧ショック技術により細菌ペリプラスム間隙から放出される。

0156

抗体または抗原結合ドメインが封入体を形成する場合、これらはしばしば細胞膜内および/または外に結合でき、従って遠心後のペレット物質に主に見出される。次いでペレット物質を極端なpHでまたは還元剤例えばジチオスレイトールの存在下、アルカリ性pHで、またはトリスカルキシルホスフィンの存在下酸pHでカオトロピック剤、例えばデタージェントグアニジングアニジン誘導体尿素、または尿素誘導体と反応させ、封入体を放出、粉砕、および可溶化することができる。次いで可溶性選択的結合物質をゲル電気泳動、免疫沈澱等を用いて分析することができる。可溶化抗体または抗原結合ドメインを単離するのが望ましい場合、標準的な方法、例えば以下およびMarstonら(Meth.Enz.182:264−275(1990))に示される方法を用いて単離を行うことができる。

0157

抗体または抗原結合ドメインが単離時に生物学的に活性でない場合もある。「リフォールディング」またはポリペプチドのその3次構造への変換およびジスルフィド結合の作製のための種々の方法を用いて生物学的活性を復活させることができる。かかる方法には可溶化ポリペプチドを通常7以上のpH、および特定の濃度のカオトロープの存在に暴露することなどがある。カオトロープの選択は封入体可溶化に用いられる選択に非常に類似するが、通常カオトロープは低濃度で用いられ、可溶化に用いられるカオトロープと同一である必要はない。たいていの場合、リフォールディング/酸化溶液はまた還元剤または還元剤プラスその酸化形態を特別な比率で含有し、特定のレドックス電位を生じ、ジスルフィドシャッフルされてタンパク質のシステインブリッジの形成を生じることが可能になる。いくつかの一般に用いられるレドックスカップルにはシステイン/シスタミングルタチオン(GSH)/ジチオビスGSH、塩化第2銅、ジチオスレイトール(DTT)/チジアンDTT、および2−メルカプトエタノール(bME)/ビチオ−b(ME)などがある。多くの例ではリフォールディングの効率を高めるためにコソルベントを用いることができるかまたは必要とされ、この目的で用いられるより一般的な試薬しはグリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニン等がある。

0158

本発明の抗体および抗原結合ドメインを化学的方法(例えば固相ペプチド合成)により、当業界で公知の技術、例えばMerrifieldら(J.Am.Chem.Soc.85:2149(1963))、Houghtenら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5132(1985))およびStewartおよびYoung(Solid Phase Peptide Synthesis、ピアースケミカル・カンパニー、ロックフォードイリノイ州(1984))に示される技術を用いて調製することもできる。かかるペプチドをアミノ末端でメチオニンを用いてまたは用いずに合成することができる。これらの参考文献に示す方法を用いて化学的に合成された抗体および抗原結合ドメインを酸化し、ジスルフィドブリッジを形成することができる。このようにして調製された抗体は、元来のまたは組換え的に製造された抗OPGbp抗体または抗原結合ドメインに随伴される少なくとも1つの生物学的活性を保持する。

0159

OPGbpの選択的結合物質に関するアッセイ
OPGbpの少なくとも1つの生物学的活性を部分的または完全に阻止する選択的結合物質を同定するスクリーニング方法が本発明により提供される。OPGbpの生物学的活性の阻止には、非限定例としてはOPGbpのその同族レセプターへの結合の阻止、ODAR、OPGbpによるインビトロもしくはインビボ破骨細胞形成刺激の阻止、および/またはOPGbpにより媒介される骨ターンオーバーもしくは骨再吸収の阻止などがある。本発明の選択的結合物質には抗OPGbp抗体並びにそのフラグメント、変種、誘導体および融合体、ペプチド、ペプチド擬似化合物または有機擬似化合物などがある。

0160

OPGbpの生物学的活性を部分的または完全に阻止し得る選択的結合物質を同定するためのスクリーニング方法にはインビトロまたはインビボアッセイなどがある。インビトロアッセイにはODARに対するOPGbpの結合を検出するアッセイなどがあり、これを用いて、ODARに対するOPGbpの結合の速度または程度を増加または減少させる能力に関してOPGbpの選択的結合物質をスクリーニングできる。アッセイの1つの型ではOPGbpポリペプチド、好ましくはOPGbpの可溶性形態、例えば細胞該ドメインを固体支持体(例えばアガロースまたはアクリルビーズ)に固定し、OPGbpの存在下または不在下のいずれかでODARポリペプチドを添加する。選択的結合物質の存在下または不在下でOPGbpおよびODARの結合の程度を測定する。例えば放射性標識蛍光標識または酵素反応により結合を検出できる。また別に、表面プラスモン共鳴検出器系、例えばBIAコアアッセイ系(ファルマシア、ピスカッタウェイ、ニュージャージー州)を用いて結合反応を実施できる。

0161

インビトロアッセイ例えば前記したアッセイを都合よく用いてODARに対するOPGbpの結合に及ぼす影響に関して多くの選択的結合物質を迅速にスクリーニングできる。アッセイを自動化してファージディスプレイ、合成ペプチドおよび化学合成ライブラリーで生じた化合物をスクリーニングできる。

0162

ODARに対するOPGbpの結合の結合を増加させるかまたは減少させる選択的結合物質を、いずれかのポリペプチドを発現する細胞および細胞系を用いる細胞培養においてスクリーニングすることもできる。細胞および細胞系をいずれかの哺乳動物から得ることができるが、好ましくはヒトもしくはその他の霊長類、イヌ、または齧歯類供給源から得られる。実例を挙げると、表面にODARを発現する細胞に対するOPGbpの結合を選択的結合物質の存在下または不在下で評価し、結合の程度を、例えばOPGbpに対するビオチン化抗体を用いるフローサイトメトリーにより決定できる。

0163

インビトロ活性を用いてOPGbp活性を阻止する選択的結合物質を同定することもできる。アッセイの例としてはOPGbpに依存する細胞成長および増殖の刺激並びにOPGbpに媒介される骨髄細胞からの破骨細胞形成などがあるが、後者は本発明出願の実施例1に記載している。

0164

インビボアッセイもまた選択的結合物質が骨ターンオーバーおよび/または骨再吸収を低下または阻止することができるかどうかを決定するために利用することができる。卵巣切除およびプロ再吸収物質、例えばOPGbpまたはIL−1の投与などの種々の方法により動物における骨再吸収を増強させることができる。WO97/23614およびWO98/46751を参照。OPGインヒビターヒト患者の骨再吸収に及ぼす影響を種々の公知の方法、例えば単一光子吸光光度法(SPA)、二重光子吸光光度法(DPA)、二重エネルギX線吸光光度法(DEXA)、定量用コンピューター断層撮影法QCT)および超音波診断法により測定することができる(Johnstonら、Primer on the Metabolic Bone Disease and Disorders of Mineral Metabolism、第2版、M.J.Favus編、ラーベン・プレス、137〜146頁参照)。特定の生化学的マーカー、例えば血清オステオカルシン、血清アルカリ性ホスファターゼ、血清プロコラーゲン伸長ペプチド、コラーゲンの尿または血清C末端またはN末端テロペプチド、尿カルシウムヒドロキシプロリン並びに尿ピリジノリンおよびデオキシピリジノリンの変化を測定することにより骨ターンオーバーおよび再吸収を決定することもできる。前記の生化学的マーカーのレベルの低下により、骨再吸収が低下し、骨量の損失が減少していることが示されることは一般に認識されている。また別に、骨再吸収に及ぼす影響を骨の機械的強度、とりわけ骨のねじれ捻転)強度の変化を測定することにより決定することもできる。

0165

診断適用に関しては、特定の実施形態では、OPGbpの選択的結合物質、例えばその抗体および抗原結合ドメインを典型的には検出可能部分で標識する。検出可能部分は検出可能なシグナルを直接的かまたは間接的に生成できるいずれかの部分でよい。例えば、検出可能部分は放射性同位元素、例えば3H、14C、32P、35S、または125I、蛍光または化学ルミネセンス化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネートローダミン、またはルシフェリン;または酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたは西ワサビペルオキシダーゼでよい。Bayerら、Meth.Enz.184:138−163(1990)。

0166

OPGbpポリペプチドの検出および定量のために、本発明の選択的結合物質をいずれかの公知のアッセイ方法、例えばラジオイムノアッセイ競合結合アッセイ、直接および間接サンドウィッチアッセイ(ELISA)、および免疫沈澱アッセイ(Sola、Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques、シー・アール・シー・プレス、147〜158頁(1987))に用いることができる。抗体は用いるアッセイ方法に適当な親和性でORGbpポリペプチドに結合する。

0167

本発明の選択的結合物質はまた、検出可能部分で標識された選択的結合物質が動物に、好ましくは血流中に投与され、宿主中の標識抗体の存在および位置が検定されるインビボ撮像にも有用である。核磁気共鳴放射線、または当業界で公知のその他の検出手段のいずれかにより動物中で検出できるいずれかの部分で物質を標識できる。

0168

本発明はまたOPGbpの選択的結合物質、例えば抗体または抗原結合ドメイン、および生物学的サンプル中のIOGbpレベルを検出するのに有用なその他の試薬を含むキットにも関する。かかる試薬は2次作用、検出可能な標識、遮断血清、陽性および陰性対照サンプル、ならびに検出試薬などでよい。

0169

OPGbp選択的結合物質の治療用途
本発明の選択的結合物質を治療用として使用できる。治療用選択的結合物質はOPGbpアゴニストまたはアンタゴニスト、および1つの実施形態では、インビトロまたはインビボでOPGbpポリペプチドの少なくとも1つの生物学的活性を阻止する抗OPGbpアンタゴニスト抗体でよい。例えばOPGbpのアンタゴニストはODARに対するOPGbpの結合を少なくとも約100倍、もしくは約1000倍;または1000倍以上阻止する。また別に、OPGbpアンタゴニストは、例えば実施例1に記載する骨髄アッセイにおいて測定可能なIC50(50%阻止を提供する濃度)により示されるように、インビトロで破骨細胞形成を阻止する。また別に、OPGbpアンタゴニストは基底値と比較して少なくとも20%、または少なくとも50%まで骨ターンオーバーマーカーを低下させる。アンタゴニストOPGbp選択的結合物質(例えば抗体)は本明細書に記載するスクリーニングアッセイにより同定される。

0170

OPGbpアンタゴニスト、例えば抗OPGbpアンタゴニスト抗体および抗原結合ドメインを用いて骨量の損失、または構造的に正常な骨が構造的に異常な骨と置き換えられることにより特徴づけられる骨疾患を予防または処置することができる。OPGbpアンタゴニストを、以下の障害:骨粗鬆症、例えば1次骨粗鬆症、内分泌性骨粗鬆症(甲状腺機能亢進症副甲状腺機能亢進症クッシング症候群、および先端巨大症)、骨粗鬆症の遺伝的および先天的形態(骨形成不全症ホモシスチン尿症メンケス症候群およびライリー・デイ症候群)および四肢の固定による骨粗鬆症;骨髄炎、または骨量損失に至る骨の感染性損傷;充実性腫瘍(乳房、および腎臓)に起因する高カルシウム血症および血液学的悪性病変多発性骨髄腫リンパ腫および白血病)、突発性高カルシウム血症、および甲状腺機能亢進症および腎機能障害に随伴される高カルシウム血症;ステロイド投与により誘起され、小腸および大腸の障害に随伴され、慢性肝炎および腎臓疾患に随伴される手術オステオペニア骨壊死、または外傷性損傷もしくはゴーシェ病鎌状赤血球貧血全身性エリテマトーデスおよびその他の症状に随伴される非外傷性壊死に随伴される骨細胞死;リウマチ性関節炎による骨量損失;骨量の歯周損失;骨関節炎人工装具のゆるみ;並びに溶骨性転移;のいずれかに起因する骨量の損失を有するかまたは骨量の損失を有する可能性がOPGbpアンタゴニストある動物に投与することができる。OPGbpアンタゴニストを用いて、構造的に健常な骨が破壊され構造的に不全な骨と置き換わることにより特徴づけられた特定の骨障害、例えば成人および若年骨ページェット病奇形骨炎);先天性骨障害、例えば繊維性骨異形成における、および骨硬化性骨転移における副甲状腺機能亢進症を予防または処置することもできる。

0171

本発明の実施形態では、OPGbpアンタゴニストを用いて悪性または転移性腫瘍により引き起こされる溶骨性破壊に起因する骨量損失を処置するのに都合よい。本発明のOPGポリペプチドを用いて乳房、前立腺甲状腺、腎臓、肺、食道直腸膀胱頚管卵巣および肝臓癌、ならびに消化管の癌に随伴される骨量の喪失を処置することができる。特定の血液学的悪性病変、例えば多発性骨髄腫およびリンパ腫、例えばホジキン病に随伴される骨量の喪失なども含まれる。

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