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図面 (10)

課題

虚血現象に起因する損傷から組織を保護する方法、虚血プレコンディショニング誘導のためにεPKペプチドアゴニスト投与する方法、虚血現象により引き起こされる組織に対する損傷を緩和する方法を提供すること。

解決手段

虚血状態または低酸素状態曝露されたインビボ器官への損傷を減少させる組成物であって、ψεRACKペプチドおよび薬学的賦形剤を含む、組成物。虚血状態または低酸素状態に曝露されたインビボ器官の処置のための医薬の製造のための、ψεRACKペプチドを含む組成物の、使用。

概要

背景

(参考文献)

(発明の背景
プロテインキナーゼCPKC)は、細胞増殖遺伝子発現の調節、およびイオンチャネル活性の調節を含む、種々の細胞機能関与するシグナル伝達において重要な酵素である。PKCファミリーアイソザイムとして、少なくとも11の異なるプロテインキナーゼが挙げられ、これらはそれらの相同性およびアクチベーターに対する感受性に基づき少なくとも3つのサブファミリーメンバー分類され得る。古典的なサブファミリーつまりcPKCサブファミリー(α、βI、βII、およびγPKC)は、アイソザイム固有の領域(可変領域またはV領域)により間隔を空けられた4つの相同ドメイン(C1、C2、C3、およびC4)を含み、活性化のためにカルシウムホスファチジルセリン(PS)、およびジアシルグリセロール(DG)またはホルボールエステルを必要とする。新規のサブファミリーつまりnPKCサブファミリーのメンバー(δ、ε、η、およびθPKC)はC2相同ドメインを欠き、活性化のためにカルシウムを必要としない。最後に、変則的なサブファミリーつまりαPKCサブファミリーのメンバー(ζおよびλ/ιPKC)はC2相同ドメインとC1相同ドメインの半分とを欠き、DG、ホルボールエステル、およびカルシウムに非感受性である。

PKCアイソザイムの細胞下分布に関する研究により、PKCの活性化が、細胞中でのその再分布を引き起こし(転位とも呼ばれる)、それによって、活性化されたPKCアイソザイムが、原形質膜細胞骨格エレメント、核、および他の細胞下画分と結合することが実証されている(Saitoら、1989;PapadopoulosおよびHall、1989;Mochly−Rosenら、1990)。

異なるPKCアイソザイムの固有の細胞機能は、それらの細胞下での位置によって決定されるようである。例えば、活性化されたβIPKCは核の内部で見出され、活性化されたβIIPKCは核周囲および心筋細胞細胞末梢で見出される(Disatnikら、1994)。さらに、同じ細胞において、εPKCは、活性化後または固定細胞への外因性活性化εPKCの添加後に横紋構造(おそらく収縮性エレメント)および細胞−細胞接触部に結合する(Mochly−Rosenら、1990;Disatnikら、1994)。細胞の異なる領域への異なるPKCアイソザイムの局在化は、活性化C−キナーゼに対するレセプター(RACK)と呼ばれる特異的なアンカー分子への活性化アイソザイムの結合に起因するようである。

RACKは、活性化PKCアイソザイムをそれぞれの細胞下部位に選択的に固定することにより機能すると考えられている。RACKは完全に活性化したPKCにのみ結合するが、RACKは必ずしもこの酵素の基質であるわけでなく、RACKへの結合が、必ずしもこのキナーゼの触媒ドメインを介して媒介されるわけでもない(Mochly−Rosenら、1991)。PKCの転位は、細胞粒子画分に固定されたRACKに対するこの活性化された酵素の結合を反映し、RACKへの結合は、PKCがその細胞応答を生じるのに必要とされる(Mochly−Rosen、1995)。インビボでのRACKへのPKC結合の阻害は、PKCの転位およびPKCが媒介する機能を阻害する(Johnsonら、1996;Ronら、1995;SmithおよびMochly−Rosen、1992)。

RACK1およびRACK2をコードするcDNAクローンが同定されている(米国特許第5,519,003号;Ronら、1994;Csukaiら、1995)。両者は、別の転位プロテインキナーゼ(β−アドレナリン作用性レセプターキナーゼ、βARK)に対するレセプターである、Gタンパク質のβサブユニットホモログである(Pitcherら、1992)。Gβと同様に、RACK1およびRACK2は、7つのWD40リピートを有する(Ronら、1994;Csukaiら、1995)。近年のデータは、RACK1がβIIPKC−特異的RACKであり(Stebbinsら、2001)、RACK2が活性化εPKCに対して特異的である(Csukaiら、1997)ことを示唆する。

PKCの転位は、PKCアイソザイムの適切な機能に必要とされる。RACK上のPKC結合部位(Mochly−Rosen、1991a;Mochly−Rosen、1995)またはPKC上のRACK結合部位(Ronら、1995;Johnsonら、1996)のいずれかを模倣するペプチドは、インビボでのこの酵素の機能を選択的に阻害するPKCのアイソザイム特異的転位インヒビターである。例えば、εPKCに由来する8アミノ酸のペプチド(ペプチドεV1−2;配列番号1、Glu Ala Val Ser Leu Lys Pro Thr)が、米国特許第6,165,977号に記載されている。このペプチドは、εPKC上のRACK結合部位の一部を含み、心筋細胞における特異的なεPKCにより媒介される機能を選択的に阻害する。

近年、PKC、より具体的にはεPCKが、虚血性損傷に対する保護を提供するための心臓プレコンディショニングに関与することが示されている。長期の虚血は、梗塞部位での細胞の死に主に起因する、不可逆的な心筋層の損傷を引き起こす。動物モデル、単離された心臓調製物および培養物中の単離された心筋細胞における研究により、短い期間の心筋の虚血が、その後の長期の虚血におけるこのような組織損傷を減少することが実証されている(Liu,Y.ら、1995、1996;Huら、1995;Brewら、1995;Schultzら、1996)。この保護は、天然ではアンギナの後に生じそしてプレコンディショニングと呼ばれており、種々の非特異的PKCアゴニストにより模倣され得る(Mitchellら、1993;Mitchellら、1995;Murryら、1986;Speechly−Dickら、1994)。δPKCおよびεPKCの両方の活性化は、プレコンディショニングの後に生じる(Grayら、1997)が、εPKC活性化は、虚血により誘導される細胞死からの心筋細胞の保護のために必要とされる(米国特許第6,165,977号)。

近年の研究において、εPKC選択的ペプチドアゴニストが、単離された新生児および成人の心筋細胞に細胞内投与された場合ならびにトランスジェニックマウスにおいてインビボで細胞内産生された場合に、虚血からの心臓保護を提供することが示された(Dorn G.ら、1999)。この研究において、εPKCペプチドアゴニストは、細胞レベルに適した実験技術または遺伝子トランスフェクションにより、インビトロで単離された細胞に細胞内投与された。残念ながら、これらの技術のいずれも、ヒトの治療に適切でないし、成功する可能性もない。さらに、この研究から、εPKCが、インビボで全組織またはインタクト器官細胞外送達されて治療効果を達成し得るか否かは不明である。

概要

虚血現象に起因する損傷から組織を保護する方法、虚血のプレコンディショニングの誘導のためにεPKCペプチドアゴニストを投与する方法、虚血現象により引き起こされる組織に対する損傷を緩和する方法を提供すること。虚血状態または低酸素状態曝露されたインビボ器官への損傷を減少させる組成物であって、ψεRACKペプチドおよび薬学的賦形剤を含む、組成物。虚血状態または低酸素状態に曝露されたインビボ器官の処置のための医薬の製造のための、ψεRACKペプチドを含む組成物の、使用。なし

目的

近年、PKC、より具体的にはεPCKが、虚血性損傷に対する保護を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

本明細書に記載の発明。

技術分野

0001

(発明の背景
本発明は、虚血現象に起因する損傷から細胞および組織を保護する方法に関する。本発明の方法は、プロテインキナーゼCペプチドアゴニスト投与する工程、より詳細にはプソイドイプシロンACK(ψεRACK)ペプチドを投与する工程を包含する。

背景技術

0002

(参考文献)

0003

(発明の背景)
プロテインキナーゼC(PKC)は、細胞増殖遺伝子発現の調節、およびイオンチャネル活性の調節を含む、種々の細胞機能関与するシグナル伝達において重要な酵素である。PKCファミリーアイソザイムとして、少なくとも11の異なるプロテインキナーゼが挙げられ、これらはそれらの相同性およびアクチベーターに対する感受性に基づき少なくとも3つのサブファミリーメンバー分類され得る。古典的なサブファミリーつまりcPKCサブファミリー(α、βI、βII、およびγPKC)は、アイソザイム固有の領域(可変領域またはV領域)により間隔を空けられた4つの相同ドメイン(C1、C2、C3、およびC4)を含み、活性化のためにカルシウムホスファチジルセリン(PS)、およびジアシルグリセロール(DG)またはホルボールエステルを必要とする。新規のサブファミリーつまりnPKCサブファミリーのメンバー(δ、ε、η、およびθPKC)はC2相同ドメインを欠き、活性化のためにカルシウムを必要としない。最後に、変則的なサブファミリーつまりαPKCサブファミリーのメンバー(ζおよびλ/ιPKC)はC2相同ドメインとC1相同ドメインの半分とを欠き、DG、ホルボールエステル、およびカルシウムに非感受性である。

0004

PKCアイソザイムの細胞下分布に関する研究により、PKCの活性化が、細胞中でのその再分布を引き起こし(転位とも呼ばれる)、それによって、活性化されたPKCアイソザイムが、原形質膜細胞骨格エレメント、核、および他の細胞下画分と結合することが実証されている(Saitoら、1989;PapadopoulosおよびHall、1989;Mochly−Rosenら、1990)。

0005

異なるPKCアイソザイムの固有の細胞機能は、それらの細胞下での位置によって決定されるようである。例えば、活性化されたβIPKCは核の内部で見出され、活性化されたβIIPKCは核周囲および心筋細胞の細胞末梢で見出される(Disatnikら、1994)。さらに、同じ細胞において、εPKCは、活性化後または固定細胞への外因性活性化εPKCの添加後に横紋構造(おそらく収縮性エレメント)および細胞−細胞接触部に結合する(Mochly−Rosenら、1990;Disatnikら、1994)。細胞の異なる領域への異なるPKCアイソザイムの局在化は、活性化C−キナーゼに対するレセプター(RACK)と呼ばれる特異的なアンカー分子への活性化アイソザイムの結合に起因するようである。

0006

RACKは、活性化PKCアイソザイムをそれぞれの細胞下部位に選択的に固定することにより機能すると考えられている。RACKは完全に活性化したPKCにのみ結合するが、RACKは必ずしもこの酵素の基質であるわけでなく、RACKへの結合が、必ずしもこのキナーゼの触媒ドメインを介して媒介されるわけでもない(Mochly−Rosenら、1991)。PKCの転位は、細胞粒子画分に固定されたRACKに対するこの活性化された酵素の結合を反映し、RACKへの結合は、PKCがその細胞応答を生じるのに必要とされる(Mochly−Rosen、1995)。インビボでのRACKへのPKC結合の阻害は、PKCの転位およびPKCが媒介する機能を阻害する(Johnsonら、1996;Ronら、1995;SmithおよびMochly−Rosen、1992)。

0007

RACK1およびRACK2をコードするcDNAクローンが同定されている(米国特許第5,519,003号;Ronら、1994;Csukaiら、1995)。両者は、別の転位プロテインキナーゼ(β−アドレナリン作用性レセプターキナーゼ、βARK)に対するレセプターである、Gタンパク質のβサブユニットホモログである(Pitcherら、1992)。Gβと同様に、RACK1およびRACK2は、7つのWD40リピートを有する(Ronら、1994;Csukaiら、1995)。近年のデータは、RACK1がβIIPKC−特異的RACKであり(Stebbinsら、2001)、RACK2が活性化εPKCに対して特異的である(Csukaiら、1997)ことを示唆する。

0008

PKCの転位は、PKCアイソザイムの適切な機能に必要とされる。RACK上のPKC結合部位(Mochly−Rosen、1991a;Mochly−Rosen、1995)またはPKC上のRACK結合部位(Ronら、1995;Johnsonら、1996)のいずれかを模倣するペプチドは、インビボでのこの酵素の機能を選択的に阻害するPKCのアイソザイム特異的転位インヒビターである。例えば、εPKCに由来する8アミノ酸のペプチド(ペプチドεV1−2;配列番号1、Glu Ala Val Ser Leu Lys Pro Thr)が、米国特許第6,165,977号に記載されている。このペプチドは、εPKC上のRACK結合部位の一部を含み、心筋細胞における特異的なεPKCにより媒介される機能を選択的に阻害する。

0009

近年、PKC、より具体的にはεPCKが、虚血性損傷に対する保護を提供するための心臓プレコンディショニングに関与することが示されている。長期の虚血は、梗塞部位での細胞の死に主に起因する、不可逆的な心筋層の損傷を引き起こす。動物モデル、単離された心臓調製物および培養物中の単離された心筋細胞における研究により、短い期間の心筋の虚血が、その後の長期の虚血におけるこのような組織損傷を減少することが実証されている(Liu,Y.ら、1995、1996;Huら、1995;Brewら、1995;Schultzら、1996)。この保護は、天然ではアンギナの後に生じそしてプレコンディショニングと呼ばれており、種々の非特異的PKCアゴニストにより模倣され得る(Mitchellら、1993;Mitchellら、1995;Murryら、1986;Speechly−Dickら、1994)。δPKCおよびεPKCの両方の活性化は、プレコンディショニングの後に生じる(Grayら、1997)が、εPKC活性化は、虚血により誘導される細胞死からの心筋細胞の保護のために必要とされる(米国特許第6,165,977号)。

0010

近年の研究において、εPKC選択的ペプチドアゴニストが、単離された新生児および成人の心筋細胞に細胞内投与された場合ならびにトランスジェニックマウスにおいてインビボで細胞内産生された場合に、虚血からの心臓保護を提供することが示された(Dorn G.ら、1999)。この研究において、εPKCペプチドアゴニストは、細胞レベルに適した実験技術または遺伝子トランスフェクションにより、インビトロで単離された細胞に細胞内投与された。残念ながら、これらの技術のいずれも、ヒトの治療に適切でないし、成功する可能性もない。さらに、この研究から、εPKCが、インビボで全組織またはインタクト器官細胞外送達されて治療効果を達成し得るか否かは不明である。

発明が解決しようとする課題

0011

(発明の要旨)
従って、虚血現象に起因する損傷から組織を保護する方法を提供することが、本発明の目的である。

0012

虚血のプレコンディショニングの誘導のためにεPKCペプチドアゴニストを投与する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。

0013

虚血現象により引き起こされる組織に対する損傷を緩和する方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。

課題を解決するための手段

0014

従って、1つの局面において、本発明は、ψεRACKペプチドを細胞に投与することにより、虚血または低酸素状態に曝された細胞に対する損傷を低減する方法を包含する。1つの実施形態において、このペプチドは、細胞が虚血または低酸素状態に曝される前に投与される。例えば、このペプチドは、細胞が虚血または低酸素症に曝される前に、約1〜180分間の期間をかけて投与される。別の実施形態において、このペプチドは、細胞が虚血または低酸素状態に曝された後に投与される。例えば、このペプチドは、細胞が虚血または低酸素状態に曝された後に、約1〜180分の期間をかけて投与される。別の実施形態において、このペプチドは、虚血または低酸素症の間に細胞に投与される。

0015

1つの実施形態において、ψεRACKペプチドは配列番号2として同定された配列を有する。他の実施形態において、このペプチドは、配列番号6〜18からなる群より選択される配列を有する。

0016

なお別の実施形態において、ψεRACKペプチドは、細胞膜を通過する輸送を容易にするのに効果的な部分(例えば、Tat由来ペプチド(配列番号5)、Antennapediaキャリアペプチド(配列番号3)、またはポリアルギニンペプチド)と連結される。

0017

このペプチドは、静脈内、非経口、皮下、吸入鼻腔内、下、粘膜、および経皮からなる群より選択される経路により投与され得る。

0018

別の局面において、本発明は、上記のように、ψεRACKペプチドを組織に投与することにより、虚血または低酸素状態に曝された組織に対する損傷を低減する方法を包含する。

0019

(配列の簡単な説明)
配列番号1は、εPKCオクタペプチド先行技術(米国特許第6,165,977号)である。

0020

配列番号2は、ψεRACKオクタペプチドである。

0021

配列番号3は、Drosophila Antennapediaホメオドメイン由来のキャリアペプチドである。

0022

配列番号4は、スクランブルψεRACKオクタペプチドである。

0023

配列番号5は、Tat由来のキャリアペプチドである。

0024

配列番号6は、配列番号2の改変体である。

0025

配列番号7は、配列番号2の改変体である。

0026

配列番号8は、配列番号2の改変体である。

0027

配列番号9は、配列番号2の改変体である。

0028

配列番号10は、配列番号2の改変体である。

0029

配列番号11は、配列番号2の改変体である。

0030

配列番号12は、配列番号2の改変体である。

0031

配列番号13は、配列番号2の改変体である。

0032

配列番号14は、配列番号2の改変体である。

0033

配列番号15は、配列番号2の改変体である。

0034

配列番号16は、配列番号2の改変体である。

0035

配列番号17は、配列番号2の改変体である。

0036

配列番号18は、配列番号2のフラグメントである。
・本出願はさらに、以下を提供し得る:
・(項目1)虚血状態または低酸素状態に曝露された細胞もしくは器官に対する損傷を減少させるための組成物であって、
ψεRACKペプチド
を含む、組成物。
・(項目2) 項目1に記載の組成物であって、上記細胞もしくは器官が上記虚血状態または上記低酸素状態に曝露される前に、上記ψεRACKペプチドが投与されることを特徴とする、組成物。
・(項目3) 項目1に記載の組成物であって、上記細胞もしくは器官が上記虚血状態または上記低酸素状態に曝露された後に、上記ψεRACKペプチドが投与されることを特徴とする、組成物。
・(項目4) 項目2または項目3に記載の組成物であって、約1分間〜180分間の期間に、上記ψεRACKペプチドが投与されることを特徴とする、組成物。
・(項目5) 項目1に記載の組成物であって、上記虚血状態または上記低酸素状態への上記細胞もしくは器官の曝露の間に、上記ψεRACKペプチドが投与されることを特徴とする、組成物。
・(項目6) 項目1〜項目5のうちのいずれか1項に記載の組成物であって、上記ペプチドが、配列番号2または配列番号6〜配列番号18として同定された配列を有する、組成物。
・(項目7) 項目6に記載の組成物であって、上記ψεRACKペプチドが、細胞膜を通過する輸送を容易にするために有効な部分に連結されている、組成物。
・(項目8) 項目7に記載の組成物であって、上記部分が、Tat由来ペプチド(配列番号:5)、Antennapediaキャリアペプチド(配列番号:3)、またはポリアルギニンペプチドである、組成物。
・(項目9) 項目1〜項目8のうちのいずれか1項に記載の組成物であって、上記ペプチドが、静脈内経路、非経口経路、皮下経路、吸入経路、鼻腔内経路、舌下経路、粘膜経路、および経皮経路からなる群より選択される経路によって投与されることを特徴とする、組成物。
・(項目10) 項目1〜8のうちのいずれか1項に記載の組成物であって、上記ペプチドが、器官全体である組織に対してエキソビボもしくはインビボにて投与されることを特徴とする、組成物。
・(項目11) 項目10に記載の組成物であって、上記器官が、心臓、肝臓、脳、および腎臓より選択される、組成物。
・(項目12) 項目10に記載の組成物であって、上記ペプチドが、冠状動脈を通じてのインタクトな心臓への注入によって投与されることを特徴とする、組成物。

図面の簡単な説明

0037

図1Aは、虚血現象の前にψεRACK(○)またはスクランブルψεRACK(コントロール、□)で処置したエキソビボラット心臓における、逆灌流中の時間の関数としてのクレアチンホスホキナーゼCPK)の放出を示す。処置された心臓を、コントロールとしての、虚血期間に供したが未処置のままだった心臓(▲)および酸素正常状態下で維持した心臓(虚血なし、ペプチド処置なし、■)と比較した。
図1Bは、図1Aに記載される研究において、30分間の再灌流中に放出されたCPKの総量を示す。
図2Aは、全体虚血の前に、ψεRACKを灌流した活動心臓(working heart)の機能的回復を示す(左心室発生圧(LVP、mmHg)、その一次導関数(dP/dt、mmHg/秒)、および冠動脈灌流圧(PP、mmHg)を示す)。右パネルは、再灌流前(ベースライン)および後の同一トレースの拡大を示す。
図2Bは、虚血前にスクランブルψεRACKを灌流した活動心臓についての、図2Aと同様のスキャンである。
図3Aは、最初の20分間の再灌流の間にψεRACKで処置したエキソビボラット心臓(〇)および虚血後に処置しなかった心臓(▲)における、虚血性傷害後の時間の関数としてのCPK放出を示す。
図3Bは、(i)虚血性傷害後に20分間、ψεRACKでエキソビボ処置したラット心臓全体または(ii)処置しなかったラット心臓全体に対する虚血性傷害後の60分間の再灌流の間の総CPK放出を示す棒グラフである。
図4Aは、30分間の虚血性傷害の最初の10分間にψεRACKを用いてインビボ処置した5日後のブタから採取したブタ心臓切片コンピューターにより作成した写真である。
図4Bは、30分間の虚血性傷害の最初の10分間に、コントロールとしてスクランブルψεRACKペプチドを用いてインビボ処置した5日後のブタから採取したブタ心臓切片のコンピューターにより作製された写真である。
図4Cは、ψεRACKペプチドまたはスクランブルψεRACKペプチド(コントロール)で処置したブタについて、心臓組織グラム数で測定された、危険な領域の割合としての総梗塞領域を示す棒グラフである。
図5は、3つの時点:(1)バルーンカテーテルによる左前下行動脈閉塞前(閉塞前);(2)ψεRACKを用いた再灌流の直後(ψεRACK後);および(3)処置5日後屠殺前(5日後)での、ブタの左心室造影により測定された駆出率を示すグラフである(ψεRACKで処置した動物(▲)およびスクランブルしたペプチドで処置したコントロール動物(〇))。

0038

(発明の詳細な説明)
(I.定義)
明細書中で使用される場合、「組織」は、共通の機能を発揮する同様に専門化した細胞の群をいう。組織は、生存生物の器官および構造成分を構成する。本明細書中で使用される場合、組織は、所定の組織から構成される器官および、個々に又は集合的に、この組織を構成する細胞を含むことを意図する。
・「虚血」または「虚血現象」は、特定の細胞、組織、または器官への血液の不十分な供給をいう。減少した血液供給の結果は、器官または組織への不十分な酸素の供給である(低酸素症)。長期の低酸素血症は、罹患した器官または組織に対する損傷を引き起こし得る。

0039

無酸素症」は、器官または組織中での実質的に完全な酸素の欠乏をいい、長期的である場合、細胞、器官、または組織の死を引き起こし得る。

0040

「低酸素症」または「低酸素状態」は、細胞、器官、または組織が不十分な酸素供給しか受けられない状態をいう。

0041

「虚血性損傷」は、一定期間の虚血の結果としての、器官または組織または細胞に対する細胞性損傷および/または分子性損傷をいう。

0042

無酸素性損傷」は、一定期間の不十分な酸素供給に起因する、細胞、器官、または組織に対する損傷をいう。

0043

「再灌流」は、流れがないかまたは流れが減少されていた一定期間の後の、組織への流体の流れの復帰をいう。例えば、心臓の再灌流においては、流体または血液供給に対する閉塞の除去の後に、流体または血液が、供給ライン(例えば、インビボでの冠動脈)を通って心臓に戻る。

0044

「疾患を処置する」とは、その疾患の症状を低減するためにおよび/または疾患の重篤度を低下させるために効果的な治療物質を投与することをいう。

0045

保存的アミノ酸置換」は、選択されたポリペプチドの活性(例えば、εPKCアゴニストまたはψεRACKアゴニスト活性)または3次構造が有意に変化しない置換である。このような置換は、代表的に、選択されたアミノ酸残基の、それと同様の物理化学的特性を有する異なる残基による置き換えを含む。例えば、AspからGluへの置換は、両者が類似する大きさの負に電荷したアミノ酸であるので、保存的置換であるとみなされる。物理化学的特性によるアミノ酸のグループ化は、当業者に公知である。

0046

特定の配列に関して、「それらの保存的置換」は、1つ以上の位置に保存的アミノ酸置換を有することにより特定の配列とは異なる配列をいう。

0047

「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に使用され、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基の鎖からなる化合物をいう。他に示されない限り、ペプチドの配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への順番で示される。

0048

第1のペプチドまたはポリペプチドが、第2のペプチドまたはポリペプチドフラグメントに対して「対応する」または「相同である」と言われる場合、それは、このペプチドまたはフラグメントが、プログラムALIGN(ミューテイションギャップマトリックスおよび6以上のギャップペナルティーを用いる)を用いて(標準偏差の単位において)5より大きいアラインメントスコアを有する場合にアミノ酸残基における類似性を有することを意味する(Dayhoff,M.O.、ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE(1972)第5巻、National Biomedical Research Foundation、101〜110頁、およびこの巻に対する補遺2、1〜10頁)。より好ましくは、2つの配列(またはそれらの一部)は、それらのアミノ酸が、上記のALIGNプログラムを用いて最適に整列される場合に50%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上同一である場合、相同である。

0049

ポリペプチド配列またはフラグメントは、それが別の配列またはフラグメントの領域と同一のアミノ酸残基の配列を有する場合、その別のポリペプチド配列またはフラグメントに「由来」する。

0050

「εPKCアゴニストペプチド」または「εPKC特異的アゴニストペプチド」は、εPKC由来の約4と約30との間、好ましくは約5と約15との間のアミノ酸長のペプチドを意味すると理解される。1つの実施形態において、εPKCアゴニストペプチドは、εPKCのアミノ酸約70と約120との間の領域、好ましくは、アミノ酸約80と約100との間の領域、より好ましくは、アミノ酸約85と約92との間の領域に由来する。

0051

略語:「PKC」、プロテインキナーゼC;「RACK」、活性化C−キナーゼに対するレセプター。

0052

アミノ酸残基の略語は、20個の共通L−アミノ酸の1つを呼ぶために当該分野で使用される標準的な3文字および/または1文字記号である。

0053

(II.ψεRACKペプチドアゴニストの投与)
1つの局面において、本発明は、同族のポリペプチド(例えば、レセプタータンパク質(RACK))に結合することによりインビボで活性化されるシグナル伝達タンパク質(例えば、PKC)を活性化し得るペプチドを投与することにより、虚血現象または低酸素状態に起因する損傷から細胞、組織、または器官を保護する方法を提供する。PKCシグナル伝達ペプチドとそのRACKとの間で相同な領域は、「RACK」配列(ψ−RACK;Ronら、1994、1995)と呼ばれ、そして代表的に、対応するRACKのPKC−結合領域と類似の配列を有する。εPKC特異的アゴニストペプチドとして作用するψ−RACK配列は、本明細書中で、配列番号2として同定される。このペプチド(本明細書中では、ψεRACKと呼ばれている)は、εRACK特異的アゴニストペプチドでありεPKCの転位を誘導する。これまでの研究は、ψεRACKペプチド自体が、器官全体にインビボまたはエキソビボで投与されて、εPCKの転位を誘導し、虚血からの保護を与え得るか否か知られていなかったので、ψεRACKの作用を模倣する薬物およびペプチド模倣物を同定することに注目してきた。本発明を支持する上で実施される研究においては、虚血状態に曝す前後に、ψεRACKをエキソビボおよびインビボで心臓全体に投与した。このペプチドは、本明細書に記載されるように、虚血性損傷の程度を低減させた。

0054

(A.虚血前のψεRACKペプチドアゴニストの投与)
本明細書において配列番号2と同定された配列を有するペプチドを、方法の節に記載される通りに合成および精製した。スクランブルψεRACKペプチド(配列番号4)もまた、ψεRACKペプチドに対する比較またはネガティブコントロールとして利用するために調製した。いくつかの研究において、これらのペプチドをキャリアペプチド(例えば、Drosophila Antennapediaホメオドメイン(配列番号3))に結合させた。キャリアに結合させることにより修飾されていないペプチドであるネイティブのペプチドの投与もまた企図されることが認識される。Drosophila Antennapedia以外のキャリアペプチドもまた企図され、そして他のキャリアペプチドの例として、Tat由来のペプチド(配列番号5、Fawellら、1994、Vivesら、1997)またはポリアルギニンペプチド(Mitchellら、2000;Rolhbardら、2000)、あるいは当該分野で記載されている他の類似のキャリア(Lindgrenら、2000;Schwarlzeら、2000)が挙げられる。

0055

実施例1に記載されるように、動物を麻酔し、そしてそれらの心臓をすばやく取り出し、そしてランゲドルフ装置による灌流のためにカニューレを挿入した。血流力学パラメータを、安定化するまで(代表的に10〜20分間)モニターした。平衡化した後、ψεRACKペプチド(配列番号2)またはスクランブルψεRACKペプチド(配列番号4)を、0.5μMのペプチドを用い、20分間冠状動脈を介して心臓に送達した。

0056

全体虚血を誘導するために、心臓への流れを45分間妨害した。次いで、心臓を30分間再灌流した。再灌流の間に、虚血により誘導される細胞損傷を、灌流中のクレアチンホスホキナーゼの活性(520nmでの吸光度)を測定することにより決定した。クレアチンホスホキナーゼは、心筋細胞におけるサイトゾル酵素であり、灌流液におけるその存在は、虚血により損傷した心筋細胞の数に比例する。この結果を、図1A〜1Bに示す。

0057

図1Aは、虚血現象前に500nM(0.5μM)のψεRACK(〇)または0.5μMのスクランブルψεRACK(□)により処置したエキソビボ心臓の、30分間の再灌流の間の時間の関数としてのクレアチンホスホキナーゼ(CPK)放出を示す。コントロールとして、虚血期間に供されたがペプチドによる処置を行っていない心臓(▲)および酸素正常状態で維持した心臓(虚血なし、ペプチド処置なし;■)についてのCPK放出もまた示される。虚血前にψεRACKで処置した心臓は、酸素正常状態で維持されたコントロール心臓に近いCPKの放出を有する。対照的に、スクランブルψεRACKで処置した心臓は、CPKの有意な放出を有し、これにより、有意な細胞損傷が示される。

0058

図1Bは、ψεRACKで処置した心臓およびスクランブルψεRACKで処置した心臓についての再灌流期間の間の総CPK放出を示す棒グラフである。虚血現象に曝されたが未処置のままの心臓からの総CPK放出もまた示される。

0059

図1A〜1Bは、虚血現象の前にψεRACKで処置した心臓が、その後の虚血現象から引き起こされる損傷からの保護を提供することを示す。従って、1つの実施形態においては、本発明は、ある量のψεRACKアゴニストペプチドを組織に投与することにより、虚血または低酸素現象に曝された組織に対する損傷を低減または防止する方法を企図する。このペプチドは、虚血現象前1〜180分、より好ましくは虚血現象前の約1〜120分、より好ましくは虚血現象前の約1〜60分に投与され得る。別の実施形態において、約180分未満、より好ましくは120分未満、さらにより好ましくは約60分未満の期間が、ペプチド送達休止と虚血現象との間を隔てている。

0060

本発明を支持する別の研究において、実施例1に記載されるように、虚血現象の後のエキソビボ心臓の機能的回復を、一定の拍動(3.3Hz)および一定の冠状動脈流(coronary flow)(10mL/分)での定積左心室圧(LVP)をモニターすることによって評価した。虚血現象の前に、この心臓を、500nMのψεRACK(配列番号2)またはスクランブルψεRACKペプチド(配列番号4)で処置した。30分間の全体虚血の後、この心臓を、30分間の再灌流期間の間、モニターした。結果を、図2A〜2Bに示す。

0061

図2Aは、全体虚血の前にψεRACKペプチドで処置された心臓に対する結果を示し、そして図2Bは、虚血の前に、スクランブルψεRACKで処置された心臓に対する結果を示す。処置された心臓および未処置の心臓の、ベースラインレベルと再灌流レベルとの比較において、虚血前のψεRACKペプチドの投与による、虚血性損傷の有意な減少が見られる。これは特に、ψεRACKで前処置された心臓における左心室発生圧力(LVP)の回復と、スクランブルペプチドで前処置された心臓におけるそれらとを比較することにより示される。両方のLVPの回復およびその1次導関数(dP/dt)の、4倍の向上を、ψεRACKでの前処置によって達成した。さらに、ψεRACKは、上昇するLVP目標拡張期圧および冠状動脈の灌流圧(PP)を減少させた。

0062

従って、これらの研究(図1および2)は、虚血または低酸素に起因する、組織への細胞損傷が、虚血現象または低酸素現象の前にψεRACKを投与することによって減少することを示す。本研究において、このψεRACKは、虚血状態および/または低酸素状態への曝露の前の期間の間、冠状動脈を通じて器官に投与される。この期間、ならびに投与されるペプチドの用量は、以下でより詳細に考察されるように、かなり変動し得る。

0063

(B.虚血に続くψεRACKペプチドアゴニストの投与)
本発明を支持して行われた別の研究において、ψεRACKを、延長された虚血期間の後、エキソビボ心臓に投与し、そしてψεRACKは、虚血損傷からの保護を提供するために有効であった。実施例2に記載されるように、ラットの心臓全体を、ランゲンドルフ装置上で灌流した。30分間の平衡化期間の後、液流を45分間停止させることによって、全体虚血を誘導した。次いで、この心臓を、ψεRACKペプチドを用いてかまたは用いずに、20分間再灌流し、その後、ペプチドを用いずに40分間灌流した。虚血に続く60分間(20分間のペプチド再灌流+40分間の灌流)の間に、この灌流液におけるCPK活性を分析した。結果を、図3A〜3Bに示す。

0064

図3Aは、ψεRACKで処置された心臓(〇)、および、虚血後に処置されなかった心臓(▲)についての、虚血後の時間の関数としてのCPK放出を示す。図3Bは、ペプチド処置されたエキソビボ心臓および未処置のエキソビボ心臓についての、60分間の灌流の間の総CPK放出を示す棒グラフである。これらのデータは、以前に虚血状態または低酸素状態に曝露された組織への、その後のψεRACKペプチドの投与が、細胞損傷を減少させるために有効であることを示す。図3Bは、ψεRACKペプチドで処置された組織に対して、約2分の1の総CPK放出が存在することを示す。

0065

(C.インビボでのψεRACKペプチドの投与)
本発明を支持する別の研究において、ψεRACKペプチドの、虚血現象または低酸素現象に起因する損傷から組織を保護する能力を、インビボでこのペプチドを投与することによって評価した。実施例3に詳述されるように、ψεRACKペプチド(配列番号2)またはスクランブルψεRACKペプチド(配列番号4)を、30分間の虚血傷害のうちの最初の10分間の間に、成体のブタに投与した。5日後、この心臓を、組織損傷について分析した。結果を、図4A〜4Cに示す。

0066

図4A〜4Bは、ψεRACKを用いて(図4A)、または、コントロールとしてスクランブルψεRACKペプチドを用いて(図4B)、インビボで処置されたブタから得られた、ブタ心臓切片のコンピューターにより作成した写真である。この心臓を、虚血性損傷の危険性がある部位(area)(図4Bの、主に中央の壁における矢印内の部位)および梗塞性部位(図4B白色部位)の決定を可能にする、二重染色技術(double−staining technique)(実施例3)を用いて染色した。図4Bにおいて見られるように、スクランブルψεRACKペプチドで処置されたコントロール心臓は、危険性部位内に、大きな梗塞性部位を有する(矢印で示される境界線)。対照的に、ψεRACKペプチドを受け入れたブタ(図4A)は、有意に減少した梗塞性部位を有する。表面積、領域(region)の重量、ならびに、危険性領域および梗塞性領域の全組織重量の測定は、コントロール心臓が危険性部位中に平均36.5±0.3%の梗塞を有し、それに対し、ψεRACKペプチドで処置された心臓が危険性部位中に平均14.9±.6%の梗塞を有することを示した(p<0.005)。

0067

図4Cは、心臓組織のグラムで測定された、危険性部位における割合として梗塞性部位を示す棒グラフである。見られるように、梗塞の割合は、ψRACKで処置された動物に対して2分の1以上減少した。従って、虚血現象の前か、または虚血現象の間の、インビボでのψεRACKペプチドの送達は、梗塞の割合を、少なくとも2分の1減少させるために有効である。

0068

液サンプルおよび肺、肝臓、脳、腸、腎臓などの組織サンプルを、動物から収集し、そして病理学研究室で分析した。全てのサンプルは正常であり、そして、炎症または組織異常性は認められなかった。

0069

別の研究において、ブタ(n=5)の左心室造影(LVG)を、6Fr.のピッグテール(pig−tail)カテーテルを用いて、3つの時点で行った:(1)バルーンカテーテルによる、左前下行動脈の閉塞前(閉塞前);(2)5μM/10mLのψεRACKを用いた再灌流の直後(ψεRACK後);および(3)5日後の屠殺前(5日後)。2つの視点(右斜め前および左斜め前)からLVGを記録した。最大収縮の間、左心室に存在する全最大量に対する駆出率(EF)(拍動において駆出される血液の割合)を、ソフトウェア(Plus Plus(Sanders Data Systems))によって分析し、そして2つの視点の平均値を評価した。左心室の容積に基づいて駆出率を計算した。結果を図5に示す。駆出率は、心臓がどの程度よく機能しているかの尺度であり、より高い駆出率は、よりよく機能する心臓を示す。短期間における50%未満の駆出率は、心不全の状態への進行を示唆し得る。図5に見られるように、ψεRACKで処置された動物(▲)は、閉塞後、スクランブルペプチドで処置されたコントロール動物(〇)と比較して、より高い駆出率を有し、このペプチドが、細胞および組織への、虚血に起因する損傷を減少または防止することを示唆した。これはまた、虚血および処置の5日後のデータ点(ψεRACKで処置された動物は、虚血前に測定された駆出率と同等であり、そして未処置の動物よりも約10%高い、駆出率を有した)からも明白である。従って、虚血後の、インビボでのψεRACKペプチドの送達は、未処置の細胞または組織の駆出率より少なくとも10%大きい駆出率によって示されるように、細胞損傷および組織損傷を減少させるために有効である。

0070

(III.ψεRACKペプチド)
本明細書中で用いられる場合、「ψεRACKペプチド」とは、配列番号2によって表されるペプチド、ならびに、このペプチドの誘導体およびフラグメントをいう。例示的な誘導体は配列番号6〜18において与えられ、そしてこれらとして以下の配列が挙げられる:HEADIGYD(配列番号6);HDAPIGYE(配列番号7);HDAPVGYE(配列番号8);HDAPLGYE(配列番号9);HDAPIGDY(配列番号10);HDAPIGEY(配列番号11);ADAPIGYD(配列番号12);HDGPIGYD(配列番号13);HDAAIGYD(配列番号14)、およびこれらの改変体の組み合わせ。

0071

1つの好ましい実施形態において、配列番号2中の配列「DAPIG」(配列番号18)は、いかなる残基においても、2つ以下の改変しか有さない。配列「DAPIG」の外側の残基のうちの1つ、2つ、または3つ全ては改変され得る。例えば、AEAPVGEY(配列番号15)は、「DAPIG」(配列番号18)配列の外側の全3残基および「DAPIG」配列内の2つの残基が改変された、配列番号2の誘導体である。他の例として、HEAPIGDN(配列番号16)およびHDGDIGYD(配列番号17)が挙げられる。

0072

配列番号2および上記の改変体のフラグメントが適切であり得ることもまた、理解される。配列番号2の例示的なフラグメントはDAPIG(配列番号18)である。

0073

これらの例示的なペプチドは全て、(i)化学的に合成され得るか、または(ii)例えば、前記のペプチドをコードするポリヌクレオチドフラグメントを含む発現ベクターを用いて、宿主細胞において組換え産生され得る(ここで、ポリヌクレオチドフラグメントは、宿主細胞におけるフラグメントからmRNA発現し得るプロモーターに、作動可能に連結される)。

0074

投与されるペプチドの用量は、処置される組織および患者の状態に依存して変動する。投薬量は、動物研究および人体研究に基づいて、当業者によって容易に決定される。代表的には、0.05〜5μMの間、より好ましくは、0.1〜2μMの間、もっとも好ましくは、約0.1〜1μMのペプチドが投与される。しかし、これらの範囲の上限および下限は単なる例示である。

0075

このペプチドは、主な医療従事者によって決定されるような、任意の適切な経路によって投与され得る。例えば、静脈内、非経口、皮下、吸入、鼻腔内、舌下、粘膜、および経皮などによる投与が企図される。当然、投与の経路は、当業者に理解されるように、投与の用量およびタイミングに影響する。

0076

このペプチドは、融合タンパク質または輸送タンパク質結合体の形態で投与され得る。代表的に、融合タンパク質を形成するために、このペプチドは、Cys−Cys結合以外の結合によって、別のペプチドと結合される。1つのペプチドのC末端から他のペプチドのN末端へのアミド結合は、融合タンパク質における結合の例である。δPKCアゴニスト/アンタゴニストペプチドが結合された第2のペプチドは、治療目的または輸送目的のために選択される、実質的に任意のペプチドであり得る。例えば、ψεRACKペプチドを、サイトカインまたは生物学的応答を誘発する他のペプチドに連結することは、おそらく望ましい。

0077

このペプチドが結合体の一部である場合、このペプチドは、代表的に、Cys−Cys結合によって、キャリアペプチド(例えば、Tat由来輸送ポリペプチド(Vivesら、1997)、ポリアルギニン(Mitchellら、2000;Rolhbardら、2000)、またはAntennapediaペプチド)に結合される。米国特許第5,804,604号を参照のこと。別の一般的な実施形態において、このペプチドは、キャリアまたはカプセル材料(例えば、リポソーム媒介送達におけるリポソーム)を用いて、細胞、組織、または器官全体に導入され得る。

0078

ψεRACKならびに同様の活性を有する任意の化合物が、本明細書中に記載される処置方法において用いられ得ることもまた、理解される。他の化合物(例えば、ペプチド模倣物、化学物質、または他のペプチド)は、例えば、米国特許第6,165,977号において開示されるスクリーニング方法によって同定され得、そして、この14欄45行〜15欄54行の部分は、本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、虚血から細胞または組織を保護するために有効な化合物を同定するための例として、δPKCは、δPKCを含む溶液マルチウェルプレートに導入し、そしてδPKCをプラスチックに結合することを可能にすることによって、マルチウェルプレートのウェル内に固定される。このウェルは、δPKCの結合を増強する基質、および/または非特異的結合のレベルを減少させる基質で、予め被膜され得る。

0079

次いで、このプレートは、ブロッキング溶液(例えば、ウシ血清アルブミンを含む)を用いてインキュベートされ、次いで、数回洗浄される。レポーター標識された(例えば、蛍光標識化によって放射標識化された)ペプチドψεRACK(配列番号2)および試験ウェルにおいて、コントロールウェルと対照的に、試験化合物を含む溶液が添加される。異なるウェルは、異なる試験化合物か、または異なる濃度の同一の試験化合物を含み得る。各濃度での各々の試験化合物は代表的に、2連で試験され、そして各々のアッセイは代表的に、ネガティブ(試験化合物を有さないウェル)コントロールならびにポジティブ(「試験化合物」が非標識化ペプチドであるウェル)コントロールとともに行われる。次いで、遊離ペプチドが洗い流され、そしてこのウェルにおける結合の程度が評価される。

0080

試験化合物は、ペプチドの結合が減少する場合(すなわち、結合の程度に対する効果が閾値レベルよりも上である場合)、活性な試験化合物として同定される。より具体的には、結合の減少が、コントロールサンプル実験サンプルとの間で数倍異なる場合、この化合物は、結合活性を有すると考えられ得る。代表的に、試験サンプルとコントロールサンプルとの間で、閾値の2倍または4倍の、結合の差異が求められる。

0081

このようなアッセイにおいて有用な検出法として、抗体ベースの方法、ペプチドに導入されるレポーター部分(例えば、蛍光ラベル)の直接検出などが挙げられる。

0082

他のペプチド、高分子、低分子、化学的混合物および/または生物的混合物真菌抽出物細菌抽出物あるいは藻類抽出物を含む、種々の試験化合物がスクリーニングされ得る。これらの化合物は、生物学的または合成的に生じ得る。

0083

(IV.投与の有用性および経路)
本発明は、例えば、生存する心臓麻痺患者の処置、ならびに、病院への入院後の心臓疾患によってただちに死亡する人物の処置における用途を有する。εPKC選択的ペプチドアゴニスト(ψεRACK)の送達は、これらの患者の管理において、急性的にも慢性的にも役立つ。

0084

急性的には、切迫した梗塞を伴って病院に運ばれる患者において、医療は、伝統的に、血栓溶解またはカテーテル血管形成のどちらかによって、冠状動脈閉塞の原因を除去することに向けられている。しかし、損傷した部位の再灌流は、心筋細胞損傷の主要な機構の1つであり得る。心臓保護を誘導するために、血栓溶解または血管形成の直前またはそれらと同時に、カテーテルによって閉塞部位に送達されるか、または静脈内に注射される、ψεRACKペプチドPKCアゴニストの投与が、本発明によって企図される。

0085

慢性的には、狭心症の患者において、現在の医療アプローチは、狭心症のプレコンディショニングの保護効果の置換せずに、狭心症の症状を停止することである。AεPKC選択的アゴニスト(例えば、ψεRACK)は、狭心症患者において、狭心症によって誘導されるプレコンディショニング効果を置換し、そして、より深刻な虚血の将来の発症の際に、より高速な心筋サルベージを提供する。

0086

本発明のさらなる用途は、虚血のタイミングが医師によって制御される、臨床的状況である。このような場合、プレコンディショニング応答薬理的な増強は、処置を受ける患者にとって有意な利点を提供し得る。具体的には、毎年、アメリカ合衆国においてだけでも、600,000人の成人および12,000の子供が心肺バイパスを利用する開胸手術を受けており、その間、心臓は、数分〜1時間をはるかに超える範囲に及ぶ期間の、制御された虚血に供される。心臓保護の進歩にも関わらず、手術直後の期間の間の心筋不全は依然として、これらの患者の罹病率および死亡率の主因である。虚血傷害の正確なタイミングは、患者に先んじて知られ、虚血の前のψεRACKの投与を可能にする。ψεRACKの投与は、手術前の数時間、または数日間、プレコンディショニング応答を誘導することによって、心筋損傷を減少させる。

0087

同様の利点は、アメリカ合衆国において毎年約2500件が存在する、心臓移植の分野において理解され得る。延長される移植片虚血は、このような心臓移植に対する、長距離ドナー器官の獲得を制限する要素の1つである。器官獲得時のψεRACKペプチドの投与は、器官収集と器官移植との間の時間を延長し得、そして、手術後の心筋不全の危険性を減少させ得る。

0088

もちろん、ψεRACKペプチドが、心臓虚血に加えて、種々の虚血状態および低酸素状態の処置において用いられ得ることが理解される。例えば、ψεRACKは、虚血現象または低酸素現象の前に、間に、または後に、多種多様な細胞および組織に投与され得る。例として、腎臓、血管内皮、肝臓、眼、ならびに、発作に起因して脳および他の中枢神経系組織への組織損傷が生じ得る、中枢神経系が挙げられるが、これらに限定する意図はない。

0089

本明細書中に記載される研究によって示されるように、このペプチドは、虚血現象あるいは低酸素現象の前に、間に、または後に投与され得る。虚血傷害の前に送達される場合、このペプチドは、細胞損傷の程度を有効に減少させる。好ましくは、このペプチドは、虚血前に組織を越えるか、または通じて、約1〜180分間灌流され、より好ましくは、約1〜120分間灌流され、もっとも好ましくは、約1〜60分灌流される。1つの実施形態において、約3時間以内の間、より好ましくは、約120分以内の間、そしてもっとも好ましくは、約60分以内の間灌流される(ペプチド灌流の休止と、虚血現象または低酸素現象との間、隔てられる)。このペプチドは、1分間、2分間、5分間、10分間、20分間、30分間、またはより長い、虚血傷害に続く期間の間に送達され得る。

0090

このポリペプチドが虚血現象に続いて送達される場合、好ましい実施形態において、約2時間以内、より好ましくは、1時間以内、そしてさらに好ましくは、30分以内の期間が、虚血現象とこのペプチドの投与の開始との間、隔てられる。このペプチドは、1分間、2分間、5分間、10分間、20分間、30分間、またはより長い、虚血傷害に続く期間の間に送達され得る。

0091

このペプチドはまた、虚血現象の間に投与され得る。具体的には、制御された虚血の時間の間(例えば、手術の間)、医療従事者は、虚血現象の開始の寸前またはそれと同時に、ψεRACKの投与を開始し得る。

0092

(IV.実施例)
以下の実施例は、本明細書中に記載される本発明をさらに説明し、そして本発明の範囲を限定することを決して意図しない。

0093

(方法)
(1.ペプチド調製)
Stanford Protein and Nucleic Acid Facilityで、ψεRACK(HDAPIGYD、配列番号2)を合成および精製した(>95%)。同様に、スクランブルψεRACKペプチド(PDYHDAGI、配列番号4)を調製した。いくつかの研究において、このペプチドを、キャリアペプチドを用いて、Drosophilaアンテナペディアホメオドメイン由来ペプチド(C−RQKIWFQNRRMKWKK、配列番号3;Theodore,L.ら、1995;Jhonson,J.A.ら、1996a)との、N末端Cys−Cys結合を介するか、または、Tatタンパク質由来ペプチド(C−YGRKKRRQRRR、配列番号6)との、N末端Cys−Cys結合を介する架橋によって、改変した。

0094

(実施例1)
(虚血前のψεRACKのエキソビボ投与
マウスまたはラットを、i.p.アバーティン(avertin)で麻酔し、それらの心臓を迅速に取り出し、そしてこれらの心臓に、当該分野において記載されるように(Colbertら、1997)、再灌流のために、大動脈を介して挿管した。取り出してから90秒以内にこれらの心臓を灌流するように注意した。左心室圧および実時間導関数(dP/dt)を、心室尖端に配置されたカテーテルを介してモニターした。血流力学的パラメーターを、手順全体を通して、20分ごとに記録した。酸素添加Krebs−Henseleit溶液(NaCl 120;KCl 5.8;NaHCO3 25;NaH2O4 1.2;MgSO4 1.2;CaCl2 1.0;および、ブドウ糖10(単位はnmol/L)で構成され、pH7.4、37℃)を用いて、この心臓を灌流した。

0095

10〜20分間の平衡化期間の後、この心臓を、ψεRACKペプチド(配列番号2)またはスクランブルψεRACKペプチド(配列番号4)で20分間処置した。0.5μMの適切なペプチドを含むKrebs−Henseleit溶液を用いて、一定の流動(10mL/分)で灌流を維持した。用いられたランゲンドルフ法は、肺動脈バイパスして、心室から大動脈および冠状動脈への逆行性の流動を用いた。

0096

全体虚血を誘導するために、流動を45分間中断した。虚血現象の後、この心臓を、Krebs−Henseleit溶液を用いて30〜160分間再灌流した。再灌流の間、虚血によって誘導された細胞損傷を、Sigmaキットを用いて、灌流液におけるクレアチンホスホキナーゼ(CPK)の活性(520nmでの吸収)を測定することにより、決定した。結果を、図1A〜1Bに示す。

0097

(実施例2)
(虚血後のψεPKCのエキソビボ投与)
実施例1に記載されるように、ラットの心臓を調製した。30分間の平衡化期間の後、液流を45分間中断することによって全体虚血を誘導した。次いで、この心臓を、0.5μMのψεRACKペプチドを用いて20分間灌流し、それに次いで、このペプチドを用いずに40分間再灌流した。コントロールとして、いくつかの心臓を、虚血の後、未処置のまま放置した。虚血後の60分の期間の間、虚血によって誘導された細胞損傷を、再灌流の間に収集された灌流液におけるクレアチンホスホキナーゼ(CPK)活性(520nmでの吸収)をモニターすることによって決定した。結果を、図3A〜3Bに示す。

0098

(実施例3)
(虚血前のψεPKCのインビボ投与
若い成体雌ブタ(体重35〜40kg)を麻酔し、頚動脈を介して心臓にカテーテルを導入した。従来の処置心臓学的技術を用いて、カテーテルを介して、左前下行動脈(LAD)へとワイヤーを配置した。このワイヤーを伝わせて、閉塞部位へバルーンを送達した。次いで、このバルーンを膨張させ、血流を30分間ブロックした。虚血傷害の最初の10分間に、コントロールであるスクランブルψεRACKペプチド(配列番号4、n=5)または生物学的に活性なψεRACKペプチド(配列番号2、n=5)のどちらかを、このバルーンを介する拡散により、閉塞の下流に直接送達した。約20μgのペプチド(約400ng/kg体重)を投与した。

0099

30分の閉塞後、バルーンを除去し、そしてブタを放置して手術から回復させた。5日後、このブタを安楽死させ、そして心臓を収集した。心臓除去の後、LADを閉塞した。閉塞を固定した状態で、Evans Blue色素(これは、梗塞の危険性がない全ての部位を青く染色するが、血流へのアクセスがない全ての部位を赤く残す)を注入した。次いで、心臓を切片に切り分け、そしてテトラゾリウム赤色色素(これは、全ての生存部位を赤く染色し、そして閉塞された死亡組織を白く染色する)を用いて染色した。各々の心臓は、虚血の危険性がある部位および梗塞部位がマークされた、特有の部位を有する複数の組織切片を有した。これを用いて、各々の切片および心臓全体に対する、危険性がある部位に対する梗塞の割合を決定した。結果を、図4A〜4Cに示す。

0100

本発明は、特定の実施形態に関して記述されているが、種々の変更および改変が、本発明から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に明白である。

実施例

0101

本発明のこれらおよび他の目的ならびに特徴は、本発明の詳細な説明を添付の図面と組み合わせて読むと、より十分に認識される。

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