図面 (/)

技術 ホタル由来ルシフェラーゼ

出願人 オリンパス株式会社
発明者 小江克典秋吉竜太郎鈴木浩文
出願日 2012年9月28日 (8年1ヶ月経過) 出願番号 2012-218029
公開日 2013年5月9日 (7年6ヶ月経過) 公開番号 2013-081459
状態 特許登録済
技術分野 酵素・酵素の調製 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード 組み合わせ条件 発光観察 自家発光 振動時間 大腸菌溶液 発光像 振動速度 CBR
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2013年5月9日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (12)

課題

解決手段

実施形態に係るルシフェラーゼは、シブイヒゲタル(Stenocladius flavipennis)に由来し、特定のアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼおよびその変異体、並びにキベリヒゲボタル(Stenocladius yoshikawai)に由来し、特定のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。

概要

背景

細胞内のシグナル伝達および遺伝子発現といった細胞の機能を調べるためには、蛍光色素および蛍光タンパク質といった蛍光プローブ並びにルシフェリンルシフェラーゼ反応を利用する化学発光プローブが用いられている。特に遺伝子の発現調節の解析には、励起光による細胞のダメージが生じず且つ自家発光の問題が生じない、定量性に優れた発光計測が用いられる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞を観察する場合、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光強度を測定することで、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さ(具体的には発現量)を調べることができる。具体的には、最初に細胞を溶解して細胞溶解液を作製し、その後この細胞溶解液にルシフェリンおよびアデノシン三リン酸ATP)等を添加し、光電子増倍管を用いたルミノメーターで発光強度を定量し、その結果に基づいて発現量を特定する。この方法では、発光強度の測定は細胞を溶解した後に行われる。このため、ある時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、測定に使用した全細胞の平均値として得られる。ルシフェラーゼ遺伝子等の発光遺伝子レポーター遺伝子として導入する方法として、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクチン法またはエレクトロポレーション法等を使用でき、各方法は目的および細胞の種類の違いに応じて使い分けられている。細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の上流または下流に目的のDNA断片繋ぎ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定することで、当該DNA断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることが可能となる。また、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子と目的の遺伝子とを共発現させることで、当該遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることが可能となる。

発光遺伝子発現量の時間変化を調べるには、生きた細胞からの発光強度を経時的に測定する必要がある。このような測定は、ルミノメーターを備えたインキュベーターにて細胞を培養し、細胞集団全体からの発光強度を一定時間ごとに測定することで行われる。細胞集団全体における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることにより、一定の周期性をもった発現リズム等を分析することができる。

近年、生物学および医学の研究において、生命現象分子レベルで動的に捉える必要性が高まってきている。蛍光観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子機能を動的に捉えるために、タイムラプスまたは動画撮像が行われている。従来技術では、蛍光試料を用いた経時的観察(例えば、蛍光分子を付したタンパク質分子動画観察)が行われている。

一方、経時的観察のために化学発光試料を用いる場合、化学発光試料の発光強度は極めて小さいため、イメージインテンシファイアを装着したCCDカメラを用いて観察する必要がある。また最近では、化学発光試料を観察するための光学系を有した顕微鏡も開発されている(特許文献1および2)。

一方、様々な生物種由来の各種ルシフェラーゼが知られているが、野生型が赤色を呈するルシフェラーゼは殆ど存在しない。しかし、赤色の発光は光学的に重要であり、他の発光色と組み合わせたり、赤色でしか得られない光透過性を利用したりするというメリットが考えられる。特に血液や水の吸収を受けにくい「生体の窓」と呼ばれる600nm以上900nm以下の領域で発光するプローブは、効果的にin vivoでの観察を可能にする。これまで、様々な生物種のルシフェラーゼにおいて、発光基質改変補因子の添加、ペプチド塩基配列等の改変など、試行錯誤しながら赤色の変異体を得る試みがあったものの、赤色の変異体は発光輝度が格段に低かった。また、既存の赤色発光酵素CBRは、発光基質(D-Luciferin)に対する反応効率が低く、経済的ではないため、発光基質の供給が困難な環境(in vivo等)で使用する場合には不便であった。

概要

ルシフェリンを発光させる新規ルシフェラーゼを提供する。実施形態に係るルシフェラーゼは、シブイヒゲタル(Stenocladius flavipennis)に由来し、特定のアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼおよびその変異体、並びにキベリヒゲボタル(Stenocladius yoshikawai)に由来し、特定のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。

目的

本発明の目的は、ルシフェリンを発光させる新規ルシフェラーゼを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

ブイヒゲタル(Stenocladius flavipennis)またはキベリヒゲボタル(Stenocladius yoshikawai)に由来するルシフェラーゼ

請求項2

シブイロヒゲボタル(Stenocladius flavipennis)に由来し、以下の(a)、(b)および(c)からなる群より選択されることを特徴とする請求項1に記載のルシフェラーゼ:(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ、(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、ルシフェリン発光させる活性を有する変異型ルシフェラーゼ、および(c)配列番号32または34に示される変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、ルシフェリンを発光させる活性を有する変異型ルシフェラーゼ。

請求項3

キベリヒゲボタル(Stenocladius yoshikawai)に由来し、配列番号37に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項1に記載のルシフェラーゼ。

請求項4

前記ルシフェラーゼが、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較してより高い強度でルシフェリンを発光させる活性を有する変異型ルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。

請求項5

前記ルシフェラーゼが、前記野生型ルシフェラーゼに対して、1.8倍以上の強度で前記ルシフェリンを発光させる活性を有することを特徴とする請求項4に記載の変異型ルシフェラーゼ。

請求項6

前記ルシフェラーゼが、配列番号1に記載されるアミノ酸配列の2番目プロリンアラニンへの置換、並びに配列番号1に記載されるアミノ酸配列の293番目のセリンフェニルアラニンへの置換または配列番号1に記載されるアミノ酸配列の363番目のグルタミン酸リジンへの置換により、配列番号1に示されるアミノ酸配列から誘導された変異型ルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。

請求項7

前記ルシフェラーゼが、配列番号32または34に記載のアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。

請求項8

前記ルシフェラーゼが、配列番号32に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、より高い強度でルシフェリンを発光させる活性を有する変異型ルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。

請求項9

前記ルシフェラーゼが、配列番号34に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、より高い強度で、より長波長にルシフェリンを発光させる活性を有する変異型ルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。

請求項10

前記ルシフェラーゼが、配列番号1に示されるアミノ酸配列において、F282Y、S293F、N387S、C400Y、I432V、V451I、A486D、S517CおよびK520Rから選択される1以上のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列からなり、赤色発光誘起する変異型ルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。

請求項11

前記ルシフェラーゼが、610±10nmの最大発光波長を有する発光を誘起することを特徴とする請求項10に記載のルシフェラーゼ。

請求項12

前記ルシフェラーゼが、610nm以上の最大発光波長を有する発光を誘起し、ヒカリコメツキ由来赤色ルシフェラーゼと比較して高い強度でルシフェリンを発光させる活性を有し、かつヒカリコメツキ由来の赤色ルシフェラーゼと比較してD−ルシフェリンに対するKm値が低いことを特徴とする請求項10に記載のルシフェラーゼ。

請求項13

前記ルシフェラーゼが、配列番号39、配列番号41または配列番号43に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項11または12に記載のルシフェラーゼ。

請求項14

請求項1から13の何れか1項に記載のルシフェラーゼをコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸

請求項15

配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号33または配列番号35に示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項14に記載の核酸。

請求項16

配列番号36または38に示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項14に記載の核酸。

請求項17

配列番号40、配列番号42または配列番号44に示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項14に記載の核酸。

技術分野

0001

本発明はホタル由来ルシフェラーゼに関する。

背景技術

0002

細胞内のシグナル伝達および遺伝子発現といった細胞の機能を調べるためには、蛍光色素および蛍光タンパク質といった蛍光プローブ並びにルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する化学発光プローブが用いられている。特に遺伝子の発現調節の解析には、励起光による細胞のダメージが生じず且つ自家発光の問題が生じない、定量性に優れた発光計測が用いられる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞を観察する場合、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光強度を測定することで、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さ(具体的には発現量)を調べることができる。具体的には、最初に細胞を溶解して細胞溶解液を作製し、その後この細胞溶解液にルシフェリンおよびアデノシン三リン酸ATP)等を添加し、光電子増倍管を用いたルミノメーターで発光強度を定量し、その結果に基づいて発現量を特定する。この方法では、発光強度の測定は細胞を溶解した後に行われる。このため、ある時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、測定に使用した全細胞の平均値として得られる。ルシフェラーゼ遺伝子等の発光遺伝子レポーター遺伝子として導入する方法として、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクチン法またはエレクトロポレーション法等を使用でき、各方法は目的および細胞の種類の違いに応じて使い分けられている。細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の上流または下流に目的のDNA断片繋ぎ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定することで、当該DNA断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることが可能となる。また、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子と目的の遺伝子とを共発現させることで、当該遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることが可能となる。

0003

発光遺伝子発現量の時間変化を調べるには、生きた細胞からの発光強度を経時的に測定する必要がある。このような測定は、ルミノメーターを備えたインキュベーターにて細胞を培養し、細胞集団全体からの発光強度を一定時間ごとに測定することで行われる。細胞集団全体における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることにより、一定の周期性をもった発現リズム等を分析することができる。

0004

近年、生物学および医学の研究において、生命現象分子レベルで動的に捉える必要性が高まってきている。蛍光観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子機能を動的に捉えるために、タイムラプスまたは動画撮像が行われている。従来技術では、蛍光試料を用いた経時的観察(例えば、蛍光分子を付したタンパク質分子動画観察)が行われている。

0005

一方、経時的観察のために化学発光試料を用いる場合、化学発光試料の発光強度は極めて小さいため、イメージインテンシファイアを装着したCCDカメラを用いて観察する必要がある。また最近では、化学発光試料を観察するための光学系を有した顕微鏡も開発されている(特許文献1および2)。

0006

一方、様々な生物種由来の各種ルシフェラーゼが知られているが、野生型が赤色を呈するルシフェラーゼは殆ど存在しない。しかし、赤色の発光は光学的に重要であり、他の発光色と組み合わせたり、赤色でしか得られない光透過性を利用したりするというメリットが考えられる。特に血液や水の吸収を受けにくい「生体の窓」と呼ばれる600nm以上900nm以下の領域で発光するプローブは、効果的にin vivoでの観察を可能にする。これまで、様々な生物種のルシフェラーゼにおいて、発光基質改変補因子の添加、ペプチド塩基配列等の改変など、試行錯誤しながら赤色の変異体を得る試みがあったものの、赤色の変異体は発光輝度が格段に低かった。また、既存の赤色発光酵素CBRは、発光基質(D-Luciferin)に対する反応効率が低く、経済的ではないため、発光基質の供給が困難な環境(in vivo等)で使用する場合には不便であった。

先行技術

0007

特開2006−301599号公報
国際公開第06/088109号

発明が解決しようとする課題

0008

本発明の目的は、ルシフェリンを発光させる新規ルシフェラーゼを提供することにある。

0009

一般に、発光強度が小さい化学発光試料を顕微鏡により撮像する場合、鮮明な画像を撮影するために必要な露出時間は長くなる。このような化学発光試料は、使用できる研究用途が制限される。例えば、発光強度の小ささのために30分間の露出時間が必要となる場合、30分間隔での経時的撮影は可能であっても、より短い間隔での撮影、さらにはリアルタイムでの撮影は不可能である。また、画像の取得に当って、発光する細胞に焦点を合わせるために複数枚の画像を取得し比較する必要があるが、発光強度の小ささのために長い露出時間を必要とする場合、1枚の画像を取得するだけでも手間と時間を要することになる。

0010

したがって、本発明の一つの目的は、高い強度でルシフェリンを発光させる新規ルシフェラーゼを提供することにある。

課題を解決するための手段

0011

本発明の一態様に係るルシフェラーゼは、シブイヒゲタル(Stenocladius flavipennis)に由来し、配列番号1、32または34に示されるアミノ酸配列を有する野生型および変異型ルシフェラーゼ、並びにキベリヒゲボタル(Stenocladius yoshikawai)に由来し、配列番号37に示されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。本発明の好ましい態様に係るルシフェラーゼは、既存のPhotinus pyralis由来のルシフェラーゼと比較して、より高い強度でルシフェリンを発光させる。

発明の効果

0012

本発明によれば、新規ルシフェラーゼが提供され、ルシフェラーゼを利用した発光観察利用可能である。本発明の好ましい態様によれば、高い発光強度でルシフェラーゼを発光させるルシフェラーゼが提供されるため、発光像を撮像するために必要な露出時間を短縮することができ、且つ従来よりも時間分解能が高い経時的観察が可能となる。

図面の簡単な説明

0013

野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られた、各pHにおける発光スペクトルを示す図である。
各ルシフェラーゼのKm値プロットした図である。
野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られた発光強度と変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られた発光強度とを比較した図である。
野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られた発光スペクトルを示す図である。
変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ(変異体1)を用いた場合に得られた発光スペクトルを示す図である。
変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ(変異体2)を用いた場合に得られた発光スペクトルを示す図である。
プロメガ社のコメツキムシ由来のルシフェラーゼ(CBR)を用いた場合に得られた発光スペクトルを示す図である。
D−ルシフェリンを基質として用いた場合に各種ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光強度を比較した図である。
D−ルシフェリンを基質として用いた場合に赤色変異体ルシフェラーゼ(改良型赤色変異体A)により誘起された発光の発光スペクトルを示す図である。
D−ルシフェリンを基質として用いた場合に赤色変異体ルシフェラーゼ(改良型赤色変異体B)により誘起された発光の発光スペクトルを示す図である。
D−ルシフェリンを基質として用いた場合に赤色変異体ルシフェラーゼ(改良型赤色変異体C)により誘起された発光の発光スペクトルを示す図である。

0014

本発明の実施形態は、シブイロヒゲボタル(Stenocladius flavipennis)に由来するルシフェラーゼに関する。

0015

「ルシフェラーゼ」とは、一般に、発光が生じる化学反応触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ATPの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光する。現在、ルシフェラーゼは、ホタルに由来するものおよびバクテリアに由来するものが取得されている。実施形態に係るルシフェラーゼも、上述の通り定義されるルシフェラーゼと同義であるが、後述するホタルから初めて取得された新規のルシフェラーゼである。実施形態に関してルシフェリンとは、好ましくはホタルルシフェラーゼの基質となるホタルルシフェリンを意味する。より好ましくは、ホタルルシフェリンとはD−ルシフェリンである。

0016

実施形態に係るルシフェラーゼは、シブイロヒゲボタル(Stenocladius flavipennis)に由来する。シブイロヒゲボタルとは節足動物門昆虫綱コウチュウホタル科ヒゲボタル属に属すホタルである。なお、ここにいう「シブイロヒゲボタルに由来するルシフェラーゼ」とは、シブイロヒゲボタルが有する野生型のルシフェラーゼに加えて、野生型のルシフェラーゼから誘導されたその変異型ルシフェラーゼをも含むことを意味する。

0017

実施形態に係るルシフェラーゼは、ルシフェリンを発光させる活性を有する。好ましい実施形態に係るルシフェラーゼによれば、既知のルシフェラーゼと比較して格段に高い発光強度が得られる。従って、かかる好ましい実施形態に係るルシフェラーゼは、タンパク質のイメージングのためのレポーターとして利用する場合に特に有利な効果を奏する。すなわち、かかる好ましい実施形態に係るルシフェラーゼは、少量でも高い発光強度を提供できるため、発現量が低いタンパク質の良好な検出を可能とする。また、かかる好ましい実施形態に係るルシフェラーゼは、得られる発光強度が高いことにより検出に必要な露出時間を短縮できる。このため、かかる好ましい実施形態に係るルシフェラーゼを経時的観察のためのレポーターとして利用すれば、撮影間隔を短くすることが可能となり、よりリアルタイムに近い観察が可能となる。すなわち、時間分解能が高い経時的観察が可能となる。

0018

実施形態に係るルシフェラーゼの一例は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼである。当該ルシフェラーゼは、シブイロヒゲボタルから得られた野生型のルシフェラーゼである。この明細書および特許請求の範囲では、当該ルシフェラーゼを、野生型ルシフェラーゼ、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼまたは野生型シブイロヒゲボタル由来ルシフェラーゼ等と称する。

0019

図1に、実施形態に係る野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られたルシフェリンの発光スペクトルを示す。この図に示されるとおり、実施形態に係る野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼは、pH8.0において、最大発光波長が559nm付近にある発光を生じさせる。また、最大発光波長は、pH6.0では約605nm、pH6.5では約583nm、pH7.0では約564nm、pH7.5では約565nmであり、pHが下がるほど最大波長は長くなる傾向がみられる。ここで「最大発光波長」とは、ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光を測定することによって得られるスペクトルにおいて、発光強度が最大となる波長を意味する。

0020

実施形態に係るルシフェラーゼは、シブイロヒゲボタルから取得された野生型のルシフェラーゼだけでなく、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の一部に変異が生じた変異型のルシフェラーゼを含む。ここでは、このようなルシフェラーゼを、変異型ルシフェラーゼ、変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼまたは変異型シブイロヒゲボタル由来ルシフェラーゼ等と称する。

0021

そのような変異は、ルシフェラーゼの酵素活性を向上させる変異であってよい。すなわち、そのような変異は、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼよりも高い発光強度をもたらす変異であってよい。例えば、実施形態に係る変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼを用いた場合に達成される発光強度は、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼを用いた場合に達成される発光強度の2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、4倍以上または5倍以上であり得る。

0022

変異の別の例は、発光スペクトルの最大発光波長がシフトする変異である。このような変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼを発光反応の酵素として用いた場合、野生型を用いた場合と比較して、最大発光波長がシフトした発光スペクトルが得られる。pH8.0の環境下において野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼを用いた場合、最大発光波長が559nm付近となる発光が生じるが、このような変異によって、最大発光波長が長波長側または短波長側にシフトする。この変異型ルシフェラーゼを野生型ルシフェラーゼまたはその他の変異型ルシフェラーゼとともに細胞内に発現させた場合、これらのルシフェラーゼを、最大発光波長の差異に基づいて区別することができる。したがって、マーカーとしてこれらのルシフェラーゼを利用する研究において、最大発光波長がシフトした変異型ルシフェラーゼを使用することで、マーカーの選択肢を増やすことができる。また、長い波長を有する光は、生体内での透過性がより優れている。そのため、この変異型ルシフェラーゼを用いることにより、組織および個体を測定の対象とする場合のように、ルシフェリンから光の検出手段までの間に遮蔽物が多く介在する場合であっても、発光強度の低下を抑えて発光を検出することができる。

0023

図3には、HeLa細胞中での野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼとその変異型ルシフェラーゼ、およびP.ピラリスルシフェラーゼによるルシフェリンの発光強度を比較したグラフが示されている。この図から、特定の測定条件下において、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼは、P.ピラリスルシフェラーゼの1.65倍の発光強度を、また変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ(変異体1)は、P.ピラリスのルシフェラーゼの3.00倍の発光強度を、また変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ(変異体2)は、P.ピラリスのルシフェラーゼの1.35倍の発光強度を達成できることがわかる。また、変異体2は、pH8.0の環境下において、その変異により、最大発光波長を559nm(野生型、図1のpH8の場合)から620nmにシフトさせることができる(図6参照)。また、変異体2は、コメツキムシ由来の赤色発光のルシフェラーゼCBRの5倍以上の発光強度を達成できる。このように、特定の実施形態に係るルシフェラーゼを用いた場合は、従来のホタルルシフェラーゼを用いた場合と比較して、より高い発光強度または異なる最大発光波長を達成できる。

0024

発光強度の向上をもたらす変異の例は、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列(配列番号1)における363番目グルタミン酸(E)をリジン(K)に置換する変異(E363K)である。最大発光波長の変化をもたらす変異の例は、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列(配列番号1)における293番目のセリン(S)をフェニルアラニン(F)に置換する変異(S293F)である。これら計2種の変異は、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列(配列番号1)に対して、全て同時に、または何れか一方のみ導入することができる。

0025

あるいは、上記2種の変異は、配列番号1とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質に対しても導入することができる。例えば、そのようなタンパク質のアミノ酸配列と配列番号1との対応関係を考慮して変異を導入することができる。たとえば、そのようなタンパク質にE363K変異を導入したい場合、配列番号1と導入の対象とするタンパク質の配列とを比較して、配列番号1に示されるアミノ酸配列の363番目のEに対応するアミノ酸残基を決定し、当該アミノ酸をKに置換することでE363K変異を導入することができる。ここにおいて「対応するアミノ酸残基」は、例えば相同性検索といった公知の技術を利用して決定することができる。

0026

実施形態に係る変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼの一例は、配列番号32に記載のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。ここでは、この変異型ルシフェラーゼを変異体1と称する。変異体1は、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ(配列番号1)に対して、P2A(Kozak配列の付与による変異)およびE363Kの変異を導入して得られた変異型ルシフェラーゼである。変異体1を用いた場合に達成され得る発光強度は、例えば特定の測定条件下において、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ(配列番号1)を用いた場合に達成され得る発光強度の1.8倍以上である(図3参照)。

0027

また、実施形態は、変異体1に対して更なる変異を導入した変異型ルシフェラーゼも含む。例えば、変異体1に対して、さらなる発光強度の向上を目的として、さらなる変異を導入した変異型ルシフェラーゼを含む。あるいは、変異体1に対して、発光強度の向上とは別の目的、例えば、可溶性の向上、分解に対する耐性の向上等を目的として、さらなる変異を導入した変異型ルシフェラーゼを含む。具体的には、実施形態は、変異体1のアミノ酸配列(配列番号32)との間で一定の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、より高い強度でルシフェリンを発光させる変異型ルシフェラーゼを含む。ここにおいて、アミノ酸配列における一定の相同性とは、例えば、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上または99%以上の相同性である。また、好ましくは、変異体1に対して更なる変異が導入された変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号32に示されるアミノ酸配列の1から20のアミノ酸が変異したものであり、より好ましくは1から15のアミノ酸が変異したものであり、より好ましくは1から10のアミノ酸が変異したものであり、より好ましくは1から5のアミノ酸が変異したものであり、より好ましくは1から4のアミノ酸が変異したものであり、より好ましくは1から3のアミノ酸が変異したものであり、より好ましくは1または2のアミノ酸が変異したものである。好ましくは、変異体1に対して更なる変異が導入された変異型ルシフェラーゼでは、P2AおよびE363Kの変異が維持されている。すなわち、変異体1に対して更なる変異が導入された変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列において、2番目のアミノ酸(またはそれに対応するアミノ酸)がアラニンであり、363番目のアミノ酸(またはそれに対応するアミノ酸)がリジンである。ここにおいて「対応するアミノ酸」は、例えば相同性検索といった公知の技術を利用して決定することができる。

0028

実施形態に係る変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼの別の例は、配列番号34に記載のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。ここでは、この変異型ルシフェラーゼを変異体2と称する。変異体2は、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ(配列番号1)に対して、P2A(Kozak配列の付与による変異)およびS293Fの変異を導入して得られた変異型ルシフェラーゼである。変異体2による発光強度は、例えば特定の測定条件下において、P.ピラリスのルシフェラーゼを用いた場合に達成され得る発光強度の1.35倍であり、その最大発光波長を559nm(野生型、図1のpH8の場合)から620nmにシフトさせることができる(図3および6参照)。また、変異体2は、コメツキムシ由来の赤色発光のルシフェラーゼCBRの5倍以上の発光強度を達成できる。

0029

変異体2のように赤色の発光を生じる変異体を「赤色変異体」と称する。本明細書において、赤色の発光は、たとえば、発光スペクトルの最大発光波長が600〜780nmの光をいう。
また、実施形態は、変異体2などの赤色変異体に対して更なる変異を導入した改良型赤色変異体も含む。例えば、変異体2などの赤色変異体に対して、さらなる発光強度の向上を目的として、さらなる変異を導入した改良型赤色変異体を含む。あるいは、別の実施形態は、変異体2などの赤色変異体に対して、発光強度の向上とは別の目的、例えば、可溶性の向上、分解に対する耐性の向上等を目的として、さらなる変異を導入した改良型赤色変異体を含む。具体的には、実施形態は、変異体2のアミノ酸配列(配列番号34)との間で一定の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、より高い強度でルシフェリンを発光させる改良型赤色変異体を含む。

0030

ここにおいて、アミノ酸配列における一定の相同性とは、例えば、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上または99%以上の相同性である。また、好ましくは、変異体2に対して更なる変異が導入された改良型赤色変異体のアミノ酸配列は、配列番号34に示されるアミノ酸配列の1から20のアミノ酸が変異したものであり、より好ましくは1から15のアミノ酸が変異したものであり、より好ましくは1から10のアミノ酸が変異したものであり、より好ましくは1から5のアミノ酸が変異したものであり、より好ましくは1から4のアミノ酸が変異したものであり、より好ましくは1から3のアミノ酸が変異したものであり、より好ましくは1または2のアミノ酸が変異したものである。好ましくは、変異体2に対して更なる変異が導入された改良型赤色変異体では、P2AおよびS293Fの変異が維持されている。すなわち、変異体2に対して更なる変異が導入された改良型赤色変異体のアミノ酸配列において、2番目のアミノ酸(またはそれに対応するアミノ酸)がアラニンであり、293番目のアミノ酸(またはそれに対応するアミノ酸)がフェニルアラニンである。ここにおいて「対応するアミノ酸」は、例えば相同性検索といった公知の技術を利用して決定することができる。

0031

かかる改良型赤色変異体は、たとえば、配列番号1に示されるアミノ酸配列からなる野生型ルシフェラーゼにおいて、下記9種類の変異から選ばれる少なくとも一つの変異を含むアミノ酸配列から構成される:
(1)配列番号1のアミノ酸配列の282番目のフェニルアラニンをチロシンに置換する変異(F282Y);
(2)配列番号1のアミノ酸配列の293番目のセリンをフェニルアラニンに置換する変異(S293F);
(3)配列番号1のアミノ酸配列の387番目のアスパラギンをセリンに置換する変異(N387S);
(4)配列番号1のアミノ酸配列の400番目のシステインをチロシンに置換する変異(C400Y);
(5)配列番号1のアミノ酸配列の432番目のイソロイシンバリンに置換する変異(I432V);
(6)配列番号1のアミノ酸配列の451番目のバリンをイソロイシンに置換する変異(V451I);
(7)配列番号1のアミノ酸配列の486番目のアラニンをアスパラギン酸に置換する変異(A486D);
(8)配列番号1のアミノ酸配列の517番目のセリンをシステインに置換する変異(S517C);および
(9)配列番号1のアミノ酸配列の520番目のリジンをアルギニンに置換する変異(K520R)。

0032

より具体的には、かかる改良型赤色変異体は、配列番号34に示されるアミノ酸配列からなる赤色変異体(変異体2)に、更なる変異を導入したものであり得る。すなわち、かかる改良型赤色変異体は、配列番号34に示されるアミノ酸配列からなる赤色変異体が既に有する変異S293Fに加えて、F282Y、N387S、C400Y、I432V、V451I、A486D、S517CおよびK520Rから選ばれる少なくとも一つの変異を含むアミノ酸配列から構成され得る。

0033

かかる改良型赤色変異体の例として、下記の3つのタイプが挙げられる(後述の実施例5を参照):
(1)配列番号1のアミノ酸配列に、S293F、N387S、C400Y、I432V、V451I、A486D、S517CおよびK520Rの8つの変異を有する変異体(配列番号39);
(2)配列番号1のアミノ酸配列に、F282Y、S293F、N387S、C400Y、A486D、S517CおよびK520Rの7つの変異を有する変異体(配列番号41);および
(3)配列番号1のアミノ酸配列に、S293F、N387S、C400Y、A486D、S517CおよびK520Rの6つの変異を有する変異体(配列番号43)。

0034

たとえば、改良型赤色変異体は、D−ルシフェリンを基質として用いた場合に、610nm付近の最大発光波長、好ましくは610±10nmの最大発光波長、より好ましくは610〜620nmの最大発光波長を有する光を生じさせることができる。たとえば、改良型赤色変異体は、D−ルシフェリンを基質として用いた場合に、610nm以上(たとえば610〜620nm)の最大発光波長を有する発光を誘起し、既存のヒカリコメツキ由来赤色ルシフェラーゼと比較して高い強度でルシフェリンを発光させる活性を有し、かつ既存のヒカリコメツキ由来の赤色ルシフェラーゼと比較してD−ルシフェリンに対する低いKm値を有することができる。

0035

上記3タイプの改良型赤色変異体は、赤色発光を示すため、小動物のin vivoイメージングなど生体組織に適用した際に生体組織での透過率が高いという利点を有するとともに(図9〜11参照)、既存の赤色発光のルシフェラーゼCBRに比べて格段に高い発光強度を示すという利点も有する(図8参照)。

0036

実施形態に係る変異型ルシフェラーゼのその他の例は、実験的な操作性を向上させる変異が導入された変異型ルシフェラーゼである。たとえば、野生型ルシフェラーゼが哺乳細胞内において低い可溶性を示す場合、実施形態に係る変異型ルシフェラーゼは、その可溶性を高める変異が導入されたルシフェラーゼである。

0037

変異型ルシフェラーゼとは、実施形態に係るルシフェラーゼの特徴、すなわちルシフェラーゼ活性が得られる限りにおいて(好ましくは従来のルシフェラーゼと比較して高い発光強度が得られる限りにおいて)、ルシフェラーゼのアミノ酸配列に任意の変異、例えば、アミノ酸の置換、欠失および/または付加等が生じたルシフェラーゼであってよい。この変異とは、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の1以上のアミノ酸の変異または1から数個のアミノ酸の変異であり、好ましくは、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の1から20のアミノ酸の変異、より好ましくは1から15のアミノ酸の変異、より好ましくは1から10のアミノ酸の変異、より好ましくは1から5のアミノ酸の変異、より好ましくは1から4のアミノ酸の変異、より好ましくは1から3のアミノ酸の変異、より好ましくは1または2のアミノ酸の変異である。好ましくは、当該変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列との間で75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上または99%以上の相同性を有する。

0038

アミノ酸の変異の導入は、公知の手法に従って、たとえば、InversePCR法や下記文献に基づく部位特異的変異導入法により行うことができる:
Asako Sawano and Atsushi Miyawaki, Nucleic AcidsResearch,2000, Vol.28, No.16。

0039

本発明の他の実施形態は、上記実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸に関する。すなわち、当該核酸は、シブイロヒゲボタルに由来するルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸である。実施形態において、核酸とは、例えばDNAまたはRNAを指す。また、実施形態において、ルシフェラーゼの「遺伝子」とは、主として、mRNAに転写される領域、すなわち構造遺伝子を意味する。

0040

実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の一例は、配列番号2に示される塩基配列を含む核酸である。この配列を有する遺伝子は、シブイロヒゲボタルからクローニングされており、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼをコードする。

0041

実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の別の例は、配列番号33または35に示される塩基配列を含む核酸である。配列番号33の配列を有する遺伝子は変異体1をコードする。配列番号35の配列を有する遺伝子は変異体2をコードする。配列番号33および35は、それぞれ、シブイロヒゲボタルからクローニングされた野生型の塩基配列に対して変異を導入することで得られる配列である。

0042

実施形態に係る核酸は、野生型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸であっても、そこにおいて変異が生じた変異型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸であってもよい。ここにおいて、変異型ルシフェラーゼ遺伝子とは、コードされたルシフェラーゼが、実施形態に係るルシフェラーゼの特徴、すなわちルシフェラーゼ活性が得られる限りにおいて(好ましくは従来のルシフェラーゼと比較して高い発光強度が得られる限りにおいて)、塩基配列中の特定の塩基、たとえば数個の塩基の置換、欠失および/または付加等を受けた遺伝子であってよい。また、塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異が含まれる。すなわち、実施形態に係る核酸には、野生型ルシフェラーゼをコードする変異型ルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸が含まれる。

0043

そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の一例は、遺伝子中に存在する特定の制限酵素認識配列を無効にする変異である。この変異によって、遺伝子を含む核酸は当該制限酵素によって切断されなくなるものの、当該遺伝子は変異前と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードできる。このような変異は、制限酵素の認識配列を構成するコドンを、異なる塩基配列の同義コドンに変換することで達成できる。このような変異は、遺伝子組み換えに使用する制限酵素の認識配列が当該遺伝子中に存在する場合に有用である。この場合、予め遺伝子中の認識配列を無効にしておくことで、制限酵素で処理した場合に遺伝子を含む核酸が断片化することを防ぐことができ、結果として組み換えが容易になる。特定の制限酵素の認識配列を無効にした例は、配列番号3に示される塩基配列である。当該塩基配列は、シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列(配列番号2)からBamHIおよびEcoRIの認識配列を無効にしたものである。

0044

そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の別の例は、遺伝子のコドンを特定の生物種における発現に最適化させる変異である。ここにいう「最適化」とは、核酸に含まれる遺伝子のコドンを、特定の生物種においてコドン出現頻度が高いコドンに代えることを意味する。最適化を行った場合、特定の生物種における遺伝子の発現は、最適化をしない場合に比べて高まる。実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子はホタルから取得されたものであるため、当該遺伝子を導入しようとする生物種が分類学的にホタルから遠い程、最適化の効果はより高いと考えられる。実施形態において特定の生物種とは、例えば細菌細胞酵母細胞および哺乳細胞である。更に哺乳細胞は、例えばマウスの細胞、サルの細胞およびヒトの細胞である。

0045

実施形態に係るコドンが最適化されたルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の一例は、配列番号4に示される塩基配列を含む核酸である。当該核酸は、シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列(配列番号2)からBamHIおよびEcoRIの認識配列が無効にされており、且つ哺乳細胞における発現にコドンが最適化されている。

0046

実施形態に係る核酸は、Kozak配列が付与されたルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸を含む。Kozak配列とは、開始コドンとその前後の複数の塩基配列から成る配列であり、Kozak配列が存在することで、その遺伝子の発現量が増大することがわかっている。Kozak配列は、生物種または生物群ごとに共通配列が見出されている。実施形態に係るKozak配列を含む核酸は、それを導入する生物種に対応したKozak配列を有する。例えば哺乳細胞に導入される場合、核酸は、Kozak配列としてgccrccatgg(配列番号5)(rはグアニンまたはアデニンを意味する)の配列を含む。Kozak配列を付与するルシフェラーゼ遺伝子は、野生型遺伝子であってもよいが、上述のようなコドンの最適化を行った変異型遺伝子であってもよい。

0047

本発明のさらに他の実施形態はこれらの核酸を含むベクターに関する。当該ベクターには、ルシフェラーゼをコードする核酸以外に、プロモーター配列や発現を調節するための配列またはマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。

0048

また、本発明のさらに他の実施形態は発光プローブに関する。当該発光プローブは、野生型のルシフェラーゼを含むものでもよいが、変異型ルシフェラーゼを含むものでもよい。特に、公知の技術によって、発光プローブとしての利用に適した改変を加えたものが好ましい。さらに実施形態は、上記発光プローブを用いた種々の試料(インビボインビトロ)に関する種々の使用(イメージング、測光等)に有効に適用できる。

0049

本発明のさらに他の実施形態は、実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内の機能を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼを細胞内に導入する工程、および前記ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。例えば、DNA中の特定の発現調節領域の下流に実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ルシフェラーゼの発現を、それが誘起するルシフェリンの発光の有無によって検出することで、発現調節領域の機能を調べることが可能である。

0050

本発明のさらに他の実施形態は、上記実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内タンパク質を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼと解析の対象とするタンパク質とから成る融合タンパク質を細胞内に導入する工程;および、前記ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。

0051

当該方法は、解析の対象とするタンパク質の細胞内の局在の観察、および、その局在の時間変化の観察(タイムラプス)を含む。また、当該方法は、タンパク質の局在だけでなく、そのタンパク質が単に発現したか否かの確認をも含む。使用される細胞に特別な限定はなく、細胞のイメージングの分野において通常使用できる細胞であってよい。また、解析の対象とするタンパク質も特別に限定はなく、研究の目的に応じたタンパク質を選択することができる。当該タンパク質は、使用する細胞内に本来存在するタンパクであってよく、または細胞内に本来存在しない異種性のまたは改変したタンパク質であってよい。

0052

融合タンパク質を細胞内に導入する場合、既知の導入方法を使用することができる。1つの方法は、細胞外で精製した融合タンパク質を細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によって融合タンパク質を細胞内に直接注入することができる。または、融合タンパク質を含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによって融合タンパク質を細胞に取り込ませることができる。また別の方法は、まず融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を導入し、その後細胞内で融合タンパク質を発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターから融合タンパク質を発現させることができる。ここにおいて、融合タンパク質の遺伝子は、実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子と解析の対象とするタンパク質の遺伝子とを含む遺伝子であり、ここにおいて、ルシフェラーゼ遺伝子とタンパク質遺伝子とは、それぞれ正常に翻訳されるよう連結されている。

0053

ルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程は、既知の検出方法を使用することができる。例えば、ルシフェラーゼを含む融合タンパク質を発現する細胞に、ルシフェリン、ATPおよびMg2+イオン等を適宜与えてルシフェラーゼにルシフェリンの発光反応を誘起させ、発生した発光をイメージング装置により検出することができる。イメージング装置とは、例えば発光を捉えるためのフィルターを備えた顕微鏡である。顕微鏡を使用することで、細胞内における発光の位置を特定して、この情報をもとにタンパク質の局在を特定することが可能となる。また、イメージング装置として、経時的に撮像できる機能を備えた顕微鏡を使用することができ、この顕微鏡によって経時的観察も可能となる。

0054

[実施例1:シブイロヒゲボタル由来のルシフェラーゼ遺伝子のクローニング]
1.材料
材料として縄県久米島で採集したシブイロヒゲボタル(Stenocladius flavipennis)の幼虫を用いた。

0055

2.トータルRNAの抽出とcDNAの合成
ホタルの幼虫からハサミを用いて発光器切り取った。組織および細胞のホモジナイズ用のビーズを含むチューブであるLysing Matrix Dチューブ(MP−Biomedicals社)に、採取した発光器および1mLのトータルRNA抽出試薬TRIzol Reagent(インビトロジェン社)を入れた。このチューブを組織細胞破砕装置FastPrep 24(MP−Biomedicals社)またはFastPrepFP100A(MP−Biomedicals社)に装着し、振動速度6.5m/sおよび振動時間45秒の条件で、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。完了後、チューブを破砕装置から取り出し、30分間上に置いた。その後、もう一度同じ条件で破砕を実施した。

0056

次に、トータルRNA抽出試薬TRIzol Reagentの説明書に従って、破砕した溶液からトータルRNAの分離精製を行った。得られたmRNA溶液100μlを、エタノール沈殿法によって沈殿濃縮した。次に、完全長cDNA合成試薬GeneRacer(インビトロジェン社)をマニュアルに従って使用して、沈殿濃縮したトータルRNAから完全長cDNAを合成した。得られたcDNA溶液20μlをホタル完全長cDNAライブラリーとして以下の遺伝子実験に用いた。

0057

3.ホタルルシフェラーゼ遺伝子の5’末端側の同定
3−1.Rapid Amplification ofcDNAEnd(RACE)法に用いるプライマーの作製
シブイロヒゲボタルのルシフェラーゼ遺伝子のクローニングをPolymerase chain reaction(PCR)法によって行った。このPCRに使用するプライマーは、既知の近縁生物由来のルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、以下の通り作製した。

0058

ホタルルシフェラーゼにおいてよく保存されているアミノ酸領域を確認するために、既に公開されている10種類のホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列を、配列情報解析ソフトウェアDNASIS Pro(日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社)を用いて比較した。比較に用いた近縁生物は、ラムフィリス・ノクティルカ(Lampyris noctiluca)(登録番号CAA61668)、ルキオラ・クルシアタ(Luciola cruciata)(登録番号P13129)、ルキオラ・ラテラリス(Luciola lateralis)(登録番号Q01158)、ルキオラ・ミングレリカ(Luciola mingrelica)(登録番号Q26304)、ホタリア・パルヴラ(Hotaria parvula)(登録番号AAC37253)、フォティヌス・ピラリス(Photinus pyralis)(登録番号BAF48390)、フォトゥリス・ペンシルヴァニカ(Photuris pennsylvanica)(登録番号Q27757)、ピロエリア・ミヤコ(Pyrocoelia miyako)(登録番号AAC37254)、ピロコエリア・ルファ(Pyrocoelia rufa)(登録番号AAG45439)およびラハゴフタルムス・オーバイ(Rhagophthalmus ohbai)(登録番号BAF34360)である。

0059

その結果、ホタルルシフェラーゼのC末端側440残基付近に位置するL−I−K−Y−K−G−Y−Q−V(配列番号6)のアミノ酸配列がよく保存されていることがわかった。この9つのアミノ酸配列をコードするコドンから塩基配列を予測し、5’末端RACEPCRに用いる12種類のホタルルシフェラーゼ特異的混合プライマーを設計した。このプライマーの名称および配列は以下の通りである(プライマー配列中のY、RおよびNは混合塩基を示す。すなわち、Yは、CまたはTを示し、Rは、AまたはGを示し、Nは、A、G、CまたはTを示す):
flexLuc5−ATA(5’−ACY TGR TAN CCY TTATATTTA AT−3’:配列番号7)、
flexLuc5−ATG(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTG AT−3’:配列番号8)、
flexLuc5−ATT(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TATTTTAT−3’:配列番号9)、
flexLuc5−ACA(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTA AT−3’:配列番号10)、
flexLuc5−ACG(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTG AT−3’:配列番号11)、
flexLuc5−ACT(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTT AT−3’:配列番号12)、
flexLuc5−GTA(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTA AT−3’:配列番号13)、
flexLuc5−GTG(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTG AT−3’:配列番号14)、
flexLuc5−GTT(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTT AT−3’:配列番号15)、
flexLuc5−GCA(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTA AT−3’:配列番号16)、
flexLuc5−GCG(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTG AT−3’:配列番号17)、
flexLuc5−GCT(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTT AT−3’:配列番号18)。これらのプライマーの合成はライフテクノロジージャパン株式会社に委託して行った。

0060

3−2.5’−RACEPCRによる、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の5’末端側のクローニング
上述の通り作製したホタル完全長cDNAライブラリーを鋳型として用い、上述の通り作製した12種類の特異的混合プライマーおよび5’末端特異的プライマーであるGeneRacer5’Primer(5’−CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA−3’:配列番号19)およびGeneRacer5’Nested Primer(5’−GGA CAC TGACATGGA CTG AAG GAG TA−3’:配列番号20)を用いて5’−RACE PCRを行った。GeneRacer5’ PrimerおよびGeneRacer5’ Nested Primerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキット(インビトロジェン社)に含まれているものを使用した。5’−RACE PCRによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnested PCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx−Taq(タカラバイオ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。

0061

度目のPCRとして、上述の通り作製した12種類の特異的混合プライマーのいずれかとGeneRacer5’ Primerとから成る12通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。最終濃度が等倍の10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+plus)、最終濃度が各0.2mMのdNTP Mixture(各2.5mM)、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRa Ex Taq(5U/μl)、最終濃度が1.0μMの12種類プライマーの内1つおよび最終濃度が0.3μMのGeneRacer3’ Primerを含む10μlのPCR反応溶液を作製し、そこへホタル完全長cDNAライブラリー溶液を0.2μl加えた。なお、ホタル完全長cDNAライブラリー溶液の濃度は未定量であった。PCR反応は、最初に94℃2分間の熱変性を行った後、94℃30秒、45℃30秒および72℃90秒を30サイクル繰り返し、最後に72℃5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1%トリ酢酸緩衝液(TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。12の反応溶液の全てにおいてわずかに遺伝子増幅が認められたため、これらのPCR反応溶液を鋳型としてそれぞれnested PCR反応を次の通り実施した。

0062

nestedPCRとして、一度目のPCRで使用した12種類プライマーのうちの4つとGeneRacer3’ Nested Primerとから成る4通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+plus)、最終濃度が各0.2mMのdNTP Mixture(各2.5mM)、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRa Ex Taq(5U/μl)、最終濃度が1.0μMの12種類プライマーの内1つおよび最終濃度が0.3μMのGeneRacer3’ Primerを含む10μlのPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型として1度目のPCR反応溶液を滅菌水で10倍希釈した溶液を1.0μl加えた。PCR反応は、最初に94℃2分間の熱変性を行った後、94℃30秒、45℃30秒および72℃90秒を30サイクル繰り返し、最後に72℃5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約1.4kbp付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせ条件を確認した。

0063

3−3.5’−RACEで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
5’−RACEで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるPCR産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。

0064

約1.4kbp付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでPCR(最終容量20μl)を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片回収した。ゲル抽出はWizardSVGel and PCR Clean−Up System(プロメガ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。TAクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したPCR産物のサブクローニングを実施した。TAクローニングはpGEM−T Easy Vector System(プロメガ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターDNAを大腸菌(TOP10株またはDH5α株)に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーPCRに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーPCRには、M13−F(−29) Primer(5’−CAC GACGTTGTA AAACGA C−3’:配列番号21)とM13 Reverse(5’−GGA TAA CAATTTCAC AGG−3’:配列番号22)とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+plus)、最終濃度が各0.2mMのdNTP Mixture(各2.5mM)、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRa Ex Taq(5U/μl)、最終濃度がそれぞれ0.2μMのプライマー対を含む10μlのPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。PCR反応は、最初に94℃1分間の熱変性を行った後、94℃30秒、50℃30秒および72℃2分を25サイクル繰り返し、最後に72℃2分間の伸長反応を行った。PCR反応後、2μlのPCR反応溶液を、1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。

0065

増幅が確認できたPCR反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。PCR産物精製キットExoSAP−IT(GEヘルスケアバイオサイエンス)を用いて、PCR反応溶液に含まれる余剰なdNTPおよびプライマーを除去し、PCRダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ)を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。PCR産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に2.5倍量の100%エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、70%エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上清を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にHi−Di Formamide(アプライドバイオシステムズ)を15μl加え、溶解させた。この溶液を94℃2分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをApplied Biosystems 3130xl ジェネティックアナライザ(アプライドバイオシステムズ)を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。得られた塩基配列を、シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ遺伝子の5’末端側非翻訳領域の塩基配列として配列番号23に示す。

0066

シークエンシングによって得られた遺伝子配列を、配列情報解析ソフトウェアDNASIS Proの「シークエンス連結」機能を用いて解析した。この配列をNational Center for Biotechnology Information(NCBI)が提供するblastxサーチを利用して相同性検索を実施し、既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の5’末端側であると決定した。

0067

4.ホタルルシフェラーゼ遺伝子の3’RacePCRおよび完全長cDNAの取得
4−1.3’Race PCRに用いるプライマーの設計
5’Race PCRの実験で得られたホタルルシフェラーゼ遺伝子の5’末端側非翻訳領域の配列を基にして、3’RACEに用いるプライマー(配列番号24)およびNested PCRに用いるプライマー(配列番号25)を作成した。プライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託した。

0068

4−2.ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長cDNA取得のための3’RacePCR
上述の通り作成したホタル完全長cDNAライブラリーを鋳型として用い、目的とするホタルルシフェラーゼの5’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーSteno(kume)-Full-F1(TTTTCGTTCATCCATTCAAGTTAGG):配列番号24)およびGeneRacer3’ Primer(5’−GCTGTC AAC GATACGCTA CGT AAC G−3’:配列番号26)およびGeneRacer3’ Nested Primer(5’−CGC TAC GTA ACGGCATGA CAG TG−3’:配列番号27)を用いて3’−RACE PCRを行った。GeneRacer3’ PrimerおよびGeneRacer3’ Nested Primerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキット(インビトロジェン社)に含まれているものを使用した。3’−RACE PCRによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnested PCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx−Taq(タカラバイオ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。

0069

一度目のPCRとして、5’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーとGeneRacer3’ Primerとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+plus)、最終濃度が各0.2mMのdNTP Mixture(各2.5mM)、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRa Ex Taq(5U/μl)および最終濃度がそれぞれ0.3μMのプライマーを含む20μlのPCR反応溶液を作製し、そこへホタル完全長cDNAライブラリー溶液を0.4μl加えた。なお、ホタル完全長cDNAライブラリー溶液の濃度は未定量であった。PCR反応は、最初に94℃2分間の熱変性を行った後、94℃30秒、50℃30秒および72℃2分を30サイクル繰り返し、最後に72℃5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。わずかに遺伝子増幅が認められたため、このPCR反応溶液を鋳型としてそれぞれnested PCR反応を実施した。

0070

NestedPCRとして、Nested PCR用のプライマーSteno(kume)-Full-F2(TTTTCGTTCATCCATTCAAGTTAGGTCTCG):配列番号25)とGeneRacer3’ Nested Primerとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+plus)、最終濃度が各0.2mMのdNTP Mixture(各2.5mM)、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRa Ex Taq(5U/μl)および最終濃度がそれぞれ0.3μMのプライマーを含む20μlのNestedPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型として1度目のPCR反応溶液を滅菌水で10倍希釈した溶液を1.0μl加えた。PCR反応は、最初に94℃2分間の熱変性を行った後、94℃30秒、50℃30秒および72℃2分を30サイクル繰り返し、最後に72℃5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約2kbp付近に効率よく遺伝子が増幅していることを確認した。

0071

4−3.3’−Raceで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
3’−RACEで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるPCR産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。

0072

約2kbp付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでPCR(最終容量20μl)を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はWizardSVGel and PCR Clean−Up System(プロメガ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。TAクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したPCR産物のサブクローニングを実施した。TAクローニングはpGEM−T Easy Vector System(プロメガ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターDNAを大腸菌(TOP10株またはDH5α株)に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーPCRに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーPCRには、M13−F(−29) Primer(5’−CAC GACGTTGTA AAACGA C−3’:配列番号21)とM13 Reverse(5’−GGA TAA CAATTTCAC AGG−3’:配列番号22)とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+plus)、最終濃度が各0.2mMのdNTP Mixture(各2.5mM)、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRa Ex Taq(5U/μl)、最終濃度がそれぞれ0.2μMのプライマー対を含む10μlのPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。PCR反応は、最初に94℃1分間の熱変性を行った後、94℃30秒、50℃30秒および72℃2分を25サイクル繰り返し、最後に72℃2分間の伸長反応を行った。PCR反応後、2μlのPCR反応溶液を、1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。

0073

増幅が確認できたPCR反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。PCR産物精製キットExoSAP−IT(GEヘルスケアバイオサイエンス)を用いて、PCR反応溶液に含まれる余剰なdNTPおよびプライマーを除去し、PCRダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ)を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスに用いたプライマーはベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。PCR産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に2.5倍量の100%エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、70%エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上清を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にHi−Di Formamide(アプライドバイオシステムズ)を15μl加え、溶解させた。この溶液を94℃2分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ(アプライドバイオシステムズ)を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。得られた塩基配列を、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列として配列番号2に示す。

0074

シークエンシングによって完全長ホタルルシフェラーゼ遺伝子を獲得した。この塩基配列(配列番号2)もしくはアミノ酸へ翻訳した配列(配列番号1)について、NCBIが提供するblastxまたはblastpサーチを利用して相同性検索を実施した。それぞれの検索で既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長cDNA配列であると決定した。

0075

塩基配列(配列番号2)は、以下のとおりである。
ATGCCGTCATCGATGATGAGCAAAAAGGATCTAGAAGATAAAAATGTCGTGCATGGACCCGATCCTTATTACCTAGTCGATGAAGGTAACGCTGGACAACAACTACACAAAACAATTTTGAGATATGCACAACTACCTGATACCATCGCTTTTACGGATGGACATACAAAACGAGATGTGACCTACGCCCACTATTTTGATCTTACTTGTAGATTAGCAGAAAGCTTGAAGAGATATGGGCTTAATCTACAATCCAGAATTGCAGTTTGTAGTGAAAATAATGTTGAATTTTTCATACCTGTAGTTGCATCTCTGTATTTAGGAGTCGGTGTTGCTCCAACGAATGATATTTATAATGAAACTGAATTATTCAACAGTCTAAACATATCGCAACCAACTATTGTTTTTGTTTCAAAAAGAGCACTGCATAAAATTTTGGAAGTAAAAAAGAGGATACCAATTATTAAGACGGTCGTGGTATTAGATACCGAAGAAGACTTTATGGGATACCACTGCCTCCATTCATTTATGAAACATTACCTACCACCAAATTTCGATATAATGTCCTATAAACCTGAGGAGTTTGCAAGGGATGGCCAACTCGCTCTCATAATGAACTCTTCTGGATCAACGGGATTACCAAAAGGCGTAATGTTAGCCCATAGAAGTGTAGTTGTGCGATTTTCGCACTGCAAGGATCCGGTATTTGGCAATCAAATCATCCCAGATACTGCTATATTAACAGTAATACCATTTCATCATGGTTTTGGTATGTTTACAACTTTAGGATACCTAACCTGCGGTTTTCGCATTGTACTATTGAGAAAATTTGATGAACATTACTTTTTGAAATGCTTACAAGACTATAAAATTCAAAGTGCATTACTAGTACCAACCCTATTCTCTTTCTTTGCAAAAAGTACTTTAGTTGACCAATATGATTTATCAAATTTAAAAGAAATAGCATCCGGTGGAGCTCCTCTTGCAAAAGAAGTTGGAGAAGCTGTCGCAAAAAGATTCAAGCTACCAGGAATAAGACAAGGATACGGTTTAACAGAAACCACCTCAGCTGTAATAATTACACCAGAGGGTGAAGATAAACCTGGATCAACTGGGAAAGTTGTTCCGTTCTTTTCAGCTAAAATAGTTGATCTTAATAATGGAAAATCTGTGGGACCACACCAACGCGGTGAATTATGCCTTAAAGGCGATATGATTATGATGGGATATTGCAATAATAAAGCAGCAACAGATGAAATGATTGATAAAGATGGTTGGTTACATTCCGGCGATATTGCTTATTACGATGAAGATGGGCACTTCTTTATTGTAGATCGCTTAAAATCTTTAGTTAAATATAAAGGCTACCAGGTGGCACCTGCTGAATTAGAGGCTGTACTATTACAACATCCATGTATTTTTGACGCCGGTGTTACTGGTGTTCCTGATGACGTTGCTGGAGAGCTTCCAGGAGCTTGCGTCGTACTTGAAAAGGGCAAACATGTAACAGAACAGGAAGTTATGGATTACGTTGCAGGTCAACTTTCATCGTACAAAAAACTCCGAGGCGGAGTACGCTTCATAGATGAAATACCTAAGGGTCTTACTGGGAAAATTGATAGAAAGGCATTGAAAGAAATTCTTAAAAAACCGCAATCCAAAATGTAA

0076

アミノ酸へ翻訳した配列(配列番号1)は、以下のとおりである。
MPSSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRSVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYFLKCLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNNGKSVGPHQRGELCLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLVKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVAGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSSYKKLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM
以下、この新規のルシフェラーゼ遺伝子にコードされるタンパク質を野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼと称する。

0077

[実施例2:野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼの酵素学的パラメータの測定]
1.野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現
野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ遺伝子を大腸菌でタンパク質発現させるため、pRSET−Bベクター(インビトロジェン)に導入した。遺伝子発現ベクター構築標準的な方法に従い以下のように実験を実施した。

0078

1−1.野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ遺伝子の制限酵素認識部位の改変
上述の通り決定した塩基配列によれば、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ遺伝子はBamHIおよびEcoRIの制限酵素認識配列を含む。ルシフェラーゼのアミノ酸配列を維持しつつ、これらの塩基配列におけるこれらの認識配列を除去する遺伝子改変を実施した。この処理は、後述するルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターへの導入を容易にするために行った。遺伝子変異の導入は、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法—簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」(土社、2001年発行、p.17−25)に示される方法に従った。変異導入後の配列は、配列番号3に示される塩基配列である。

0079

変異導入後の配列(配列番号3)は、以下のとおりである。
ATGCCGTCATCGATGATGAGCAAAAAGGATCTAGAAGATAAAAATGTCGTGCATGGACCCGATCCTTATTACCTAGTCGATGAAGGTAACGCTGGACAACAACTACACAAAACAATTTTGAGATATGCACAACTACCTGATACCATCGCTTTTACGGATGGACATACAAAACGAGATGTGACCTACGCCCACTATTTTGATCTTACTTGTAGATTAGCAGAAAGCTTGAAGAGATATGGGCTTAATCTACAATCCAGAATTGCAGTTTGTAGTGAAAATAATGTTGAATTTTTCATACCTGTAGTTGCATCTCTGTATTTAGGAGTCGGTGTTGCTCCAACGAATGATATTTATAATGAAACTGAATTATTCAACAGTCTAAACATATCGCAACCAACTATTGTTTTTGTTTCAAAAAGAGCACTGCATAAAATTTTGGAAGTAAAAAAGAGGATACCAATTATTAAGACGGTCGTGGTATTAGATACCGAAGAAGACTTTATGGGATACCACTGCCTCCATTCATTTATGAAACATTACCTACCACCAAATTTCGATATAATGTCCTATAAACCTGAGGAGTTTGCAAGGGATGGCCAACTCGCTCTCATAATGAACTCTTCTGGATCAACGGGATTACCAAAAGGCGTAATGTTAGCCCATAGAAGTGTAGTTGTGCGATTTTCGCACTGCAAAGATCCGGTATTTGGCAATCAAATCATCCCAGATACTGCTATATTAACAGTAATACCATTTCATCATGGTTTTGGTATGTTTACAACTTTAGGATACCTAACCTGCGGTTTTCGCATTGTACTATTGAGAAAATTTGATGAACATTACTTTTTGAAATGCTTACAAGACTATAAAATTCAAAGTGCATTACTAGTACCAACCCTATTCTCTTTCTTTGCAAAAAGTACTTTAGTTGACCAATATGATTTATCAAATTTAAAAGAAATAGCATCCGGTGGAGCTCCTCTTGCAAAAGAAGTTGGAGAAGCTGTCGCAAAAAGATTCAAGCTACCAGGAATAAGACAAGGATACGGTTTAACAGAAACCACCTCAGCTGTAATAATTACACCAGAGGGTGAAGATAAACCTGGATCAACTGGGAAAGTTGTTCCGTTCTTTTCAGCTAAAATAGTTGATCTTAATAATGGAAAATCTGTGGGACCACACCAACGCGGTGAATTATGCCTTAAAGGCGATATGATTATGATGGGATATTGCAATAATAAAGCAGCAACAGATGAAATGATTGATAAAGATGGTTGGTTACATTCCGGCGATATTGCTTATTACGATGAAGATGGGCACTTCTTTATTGTAGATCGCTTAAAATCTTTAGTTAAATATAAAGGCTACCAGGTGGCACCTGCTGAATTAGAGGCTGTACTATTACAGCATCCATGTATTTTTGACGCCGGTGTTACTGGTGTTCCTGATGACGTTGCTGGAGAGCTTCCAGGAGCTTGCGTCGTACTTGAAAAGGGCAAACATGTAACAGAACAGGAAGTTATGGATTACGTTGCAGGTCAACTTTCATCGTACAAAAAACTCCGAGGCGGAGTACGCTTCATAGATGAAATACCTAAGGGTCTTACTGGGAAAATTGATAGAAAGGCATTGAAAGAAATTCTTAAAAAACCGCAATCCAAAATGTAA

0080

1−2.野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現ベクターへの導入
ルシフェラーゼ遺伝子を、pRSET−Bベクターの制限酵素サイトBamHI−EcoRI間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素BamHI認識配列GGATCCを含むプライマー、並びに終止コドンおよびその後ろに制限酵素EcoRI認識配列GAATTCを含むプライマーを作成した。このプライマー対を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行った。PCRにはポリメラーゼKOD−Plus−(東洋紡績株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。

0081

最終濃度が等倍の10×PCRBuffer、最終濃度が各0.2mMのdNTP Mixture(各2.5mM)、最終濃度が1.0mMのMgSO4、最終濃度が0.02U/μlのTOYOBO KOD−Plus−(1U/μl)、最終濃度がそれぞれ0.3μMのプライマー対を含む20μlのPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型としてBamHIとEcoRI認識配列を持たないルシフェラーゼ遺伝子の溶液を0.4μl加えた。PCR反応は、最初に94℃2分間の熱変性を行った後、94℃30秒、55℃30秒および68℃2分を30サイクル繰り返し、最後に68℃5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。遺伝子増幅が認められたため、このPCR反応溶液を通常のエタノール沈殿法により沈殿濃縮し、制限酵素処理用10×H Bufferを4μl、制限酵素BamHI(東洋紡績株式会社)および制限酵素EcoRI(東洋紡績株式会社)を各2μlならびに滅菌脱イオン水32μlを加えて溶解し、37℃で2時間保温して制限酵素処理した。その後、この反応溶液をエタノール沈殿法により沈殿濃縮した後、滅菌脱イオン水に溶解した。この溶液を、1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行った。紫外線照射下において確認されるDNAバンドを含むゲルを、ナイフを用いて切り出した。この切り出したゲルからWizard(R)SVGel and PCR Clean−Up System(プロメガ)を用いてDNAを抽出した。これらの操作はマニュアルに従って実施した。その後、Ligation Pack(ニッポンジーン)をマニュアルに従って用いて、あらかじめ同様の方法で制限酵素BamHIと制限酵素EcoRIで処理したpRSET−Bベクターに抽出したDNAを導入した。このベクターDNAを大腸菌JM109(DE3)株に形質転換し、コロニーを形成させた。

0082

得られたコロニーを鋳型としてダイレクトコロニーPCRを実施し、pRSET−Bに導入したルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。ダイレクトコロニーPCRは、T7 promoter Primer(5’−TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG−3’:配列番号28)およびT7 Reverse Primer(5’−CTAGTTATTGCT CAGCGG TGG−3’:配列番号29)のプライマー対を用いて行った。最終濃度が等倍の10×Ex Taq Buffer(20mM Mg2+plus)、最終濃度が各0.2mMのdNTP Mixture(各2.5mM)、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRa Ex Taq(5U/μl)および最終濃度がそれぞれ0.2μMのプライマーを含む10μlのPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。PCR反応は、最初に94℃2分間の熱変性を行った後、94℃30秒、50℃30秒および72℃2分を25サイクル繰り返し、最後に72℃5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1%TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。

0083

増幅が確認できたPCR反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。PCR産物精製キットExoSAP−ITを用いて、PCR反応溶液に含まれる余剰なdNTPおよびプライマーを除去し、PCRダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスには、ベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。PCR産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に2.5倍量の100%エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、70%エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にHi−Di Formamide(アプライドバイオシステムズ)を15μl加え、溶解させた。この溶液を94℃2分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをApplied Biosystems 3130xl ジェネティックアナライザを用いて塩基配列を読み取り、配列番号3の塩基配列が、正常に遺伝子発現ベクターpRSET−Bに導入されていることを確認した。

0084

2.発光タンパク質の精製
JM109(DE3)を含む大腸菌溶液50μlにルシフェラーゼ発現ベクター0.5μlを添加し、氷上で10分、その後42℃で1分、最後に氷上で2分インキュベートした。その後、大腸菌溶液50μlをSOC培地200μlに加えた。その大腸菌/SOC培地混合溶液を37℃で20分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル100μlをLB培地プレート(100μg/mlアンピシリンを含む)にストリークし、37℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、500mlスケールのLB培地で培養した。培養は37℃で24時間、18℃で24時間行った。合計48時間の培養の後、遠心分離菌体を回収し、0.1M Tris−HCl溶液(pH8.0)に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離(15000rpm、10分)し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム2mlのカラムにNi−Agar懸濁液500μlと0.1M Tris−HCl2mlを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て4℃の条件で行った。25mMイミダゾール/0.1M Tris−HCl溶液2mlでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに500mMイミダゾール/0.1M Tris−HCl溶液を2ml加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムPD−10(GEヘルスケア)でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをVivaspin6(ザルトリウス)で限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、50%グリセリン溶液とした。保存は−20℃で行った。

0085

3.発光スペクトルの測定
測定のための装置としてLumiFlSpectroCapture(ATTO)を用い、0.1Mクエン酸/0.1M Na2HPO4 buffer(pH6.0−8.0)に1mM D−ルシフェリン、2mMATPおよび4mM MgCl2を含む溶液に、精製酵素を1μg/mlから10μg/mlの間の最終濃度で添加し、酵素添加後15秒経過時点で発光スペクトルを測定した。測定結果図1に示す。

0086

図1より、取得された野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼは、pH8.0の環境において、559nm付近に最大発光波長を示している。また、最大発光波長は、pH7.5において565nm付近、pH7.0において564nm付近、pH6.5において583nm付近およびpH6.0において605nm付近となった。

0087

4.速度論的解析
4−1.D−ルシフェリンおよびATPの濃度の決定
D−ルシフェリン溶液中のD−ルシフェリン濃度およびATP溶液中のATP濃度を以下の通りに決定した。

0088

UV−Visible Spectrometer(Hitachi)を用いて、D−ルシフェリン溶液およびATP溶液の紫外可視吸収スペクトルを測定し、この測定結果と以下のε値とから濃度を算出した。
D−ルシフェリン:λmax 328nm、ε18200、pH5.0
ATP:λmax 259nm、ε15400、pH7.0。

0089

測定はそれぞれ10回ずつ行い、吸光度の平均値を濃度算出に用いた。このように濃度を決定したD−ルシフェリン溶液およびATP溶液を用いて、以下のKm値算出を行った。

0090

4−2.D−ルシフェリンに対するKm値の測定
様々なD−ルシフェリン濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、D−ルシフェリンに対するKm値を決定した。

0091

D−ルシフェリンを0.1M Tris−HCl(pH8.0)に添加して、異なる濃度の12種類のDールシフェリン溶液を作製した。これらの溶液は、D−ルシフェリンの終濃度がそれぞれ0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320、480および640μMとなるようにD−ルシフェリンを含む。これらのD−ルシフェリン溶液を96穴マイクロプレートに50μlずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、4mMATPおよび8mM MgSO4を含む0.1M Tris−HCl(pH8.0)溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに50μl添加すると同時に測定を行った。測定にはLuminescensor(ATTO)を使用した。測定は各ルシフェリン濃度について3回ずつ行った。

0092

得られたフォトンカウント値ピーク強度初速度Vとして、ルシフェリン濃度Sに対してプロットした。このプロットにミカエリスメンテン型のカーブフィッティングを行い、Km値を算出した。カーブフィッティングは非線形最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。

0093

4−3.ATPに対するKm値の測定
様々なATP濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、ATPに対するKm値を決定した。

0094

ATPを0.1M Tris−HCl(pH8.0)に添加して、異なる濃度の12種類のATP溶液を作製した。これらの溶液は、ATPの終濃度がそれぞれ5、10、20、40、80、160、320、480、640、800、1280、1600および1920μMとなるようにATPを含む。これらのATP溶液をそれぞれ96穴マイクロプレートに50μlずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、1mM D−ルシフェリン、8mM MgSO4を含む0.1M Tris−HCl(pH8.0)溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに50μl添加すると同時に測定を行った。測定は各ATP濃度について3回ずつ行った。

0095

得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Vとして、ATP濃度Sに対してプロットした。このプロットにミカエリス・メンテン型のカーブフィッティングを行い、Km値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。

0096

上記のようにして決定されたD−ルシフェリンに対するKm値およびATPに対するKm値を表1に示す。表1には、同様に測定した既知のルシフェラーゼの各Km値も示される。GL3とは既知のホタル由来のルシフェラーゼである。また、ELuc、CBGおよびCBRとは既知のコメツキムシ由来のルシフェラーゼである。これらの既知のルシフェラーゼは市販されるものを使用した。

0097

0098

さらに、これらの結果について、縦軸をATPに対するKm値とし、横軸をD−ルシフェリンに対するKm値としてプロットした図を、図2として示す。

0099

[実施例3:変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼの作製とHeLa細胞内における発光強度および発光スペクトルの比較]
1.変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼの作製
下記のとおり、変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。

0100

哺乳細胞における発現に最適化した遺伝子(配列番号4)に対し、次の2種の変異の何れか一方を導入した。
配列番号4のアミノ酸配列上363番目のグルタミン酸をリジンに置換する変異(E363K)
配列番号4のアミノ酸配列上293番目のセリンをフェニルアラニンに置換する変異(S293F)。

0101

哺乳細胞における発現に最適化した遺伝子(配列番号4)は、以下のとおりである。
ATGCCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGATCCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTGCTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTTTCTGAAGTGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAACGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTGCCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGGTCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGCTGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCAGCTACAAGAAACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCATCGACGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA

0102

それぞれの変異の導入のために、以下のプライマーを用いた。
E363K変異:(GTGATCATCACCCCCnnnGGCGAGGATAAGCCTG:配列番号30)
S293F変異:(GACTACAAGATCCAGnnnGCCCTGCTGGTGCC:配列番号31)

0103

変異の導入は文献の記載に基づいて行った(Asako Sawano and Atsushi Miyawaki, Nucleic AcidsResearch,2000, Vol.28, No.16)。変異導入後にシーケンサーを用いて配列を読み取り、目的とする変異がシブイロヒゲボタルルシフェラーゼ遺伝子に導入されていることを確認した。

0104

作製した変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼを変異体1および変異体2と称する。これらは、それぞれ以下の変異を有する。
変異体1:E363K
変異体2:S293F
変異体1および2は、更に、P2A(Kozak配列の付与による変異)の変異を有する。

0105

変異体1のアミノ酸配列は配列番号32に記載され、変異体1をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号33に記載される。また、変異体2のアミノ酸配列は配列番号34に記載され、変異体2をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号35に記載される。

0106

変異体1のアミノ酸配列(配列番号32)は、以下のとおりである。
MASSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRSVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYFLKCLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPKGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNNGKSVGPHQRGELCLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLVKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVAGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSSYKKLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM

0107

変異体1をコードする遺伝子の塩基配列(配列番号33)は、以下のとおりである。
ATGGCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGATCCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTGCTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTTTCTGAAGTGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCAAAGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAACGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTGCCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGGTCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGCTGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCAGCTACAAGAAACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCATCGACGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA

0108

変異体2のアミノ酸配列(配列番号34)は、以下のとおりである。
MASSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRSVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYFLKCLQDYKIQFALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNNGKSVGPHQRGELCLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLVKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVAGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSSYKKLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM

0109

変異体2をコードする遺伝子の塩基配列(配列番号35)は、以下のとおりである。
ATGGCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGATCCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTGCTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTTTCTGAAGTGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGTTTGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAACGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTGCCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGGTCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGCTGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCAGCTACAAGAAACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCATCGACGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA

0110

2.HeLa細胞内における発光強度および発光スペクトルの比較
次に、野生型、変異体1および2のルシフェラーゼによる細胞内での発光強度を測定し、これらを、フォティヌス・ピラリス(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ(プロメガ社)およびヒカリコメツキムシ(Pyrophorus plagiophthalamus)由来の赤色発光のルシフェラーゼCBR(プロメガ社)と比較した。

0111

野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼの遺伝子を含む核酸、変異体1の遺伝子を含む核酸および変異体2の遺伝子を含む核酸に対してKozak配列を付与した。なお、これら3種の配列(配列番号4、配列番号33、配列番号35)とも哺乳細胞における発現に対してコドン最適化されている。その後、これら配列を、それぞれ、pF9A CMV hRLuc neo Flexi vector(Promega)のマルチクローニングサイトのSgfIおよびPmeIのサイト間に挿入した。pF9Aベクターは内部コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子(hRLuc)をベクター配列に含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度との比として算出することが可能である。

0112

同様の手順に従って、フォティヌス・ピラリス(Photinus pyralis)ルシフェラーゼおよびCBRルシフェラーゼの遺伝子を含む核酸をpF9Aベクターのマルチクローニングサイトに挿入した。

0113

得られた5種のプラスミドを、48穴のプレートに播種したHeLa細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、24時間後PBSで細胞を洗浄した。Dual glow kit(米国Promega社製)の説明書に従って、48穴プレートの各ウェルに2mM D−ルシフェリン/CO2 Independent Medium(Invitrogen)を500μlずつ添加し、25℃、各ウェルあたり1秒間測定の条件でLuminescensor(ATTO)を用いて120分間発光強度を測定した。90分経過時点の発光強度を野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ、変異体1および変異体2の発光強度とした。各ウェル内の培養液を除去した後、PBSで各ウェルを3回洗浄した。次に各ウェルに10μMセレンテラジン/CO2 Independent Mediumを500μlずつ添加し、25℃、各ウェルあたり1秒間測定の条件でLuminescensorを用いて30分間発光強度を測定した。セレンテラジン添加後、10分経過時点の発光強度を内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度とした。野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ、変異体1、変異体2、P.ピラリスルシフェラーゼ(Luc2 ルシフェラーゼ,プロメガ社)およびCBRルシフェラーゼ(プロメガ社)による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度でそれぞれ除算した値を算出し、その値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。その結果を図3に示す。図3において、発光強度は、P.ピラリスルシフェラーゼによる発光強度を1としたときの比で表す。

0114

図3に示されるように、野生型シブイロヒゲボタルよって得られた発光強度は、P.ピラリスルシフェラーゼによる発光強度と比較して1.65倍高かった。変異体1によって得られた発光強度は、P.ピラリスルシフェラーゼによる発光強度と比較して3.00倍高かった。変異の導入によってシブイロヒゲボタルルシフェラーゼの発光強度が増大することが示された。また、変異体2によって得られた発光強度は、P.ピラリスルシフェラーゼによる発光強度の1.35倍であったが、変異体2によって得られた最大発光波長は、その変異により559nm(野生型、図1のpH8の場合)から620nmにシフトした(図6参照)。

0115

また,HeLa細胞で発現させた各種ルシフェラーゼ(野生型、変異体1、変異体2およびCBR)の発光スペクトルを実施例2と同様に測定した。ルシフェリン濃度は20mMで、温度は25℃と37℃の2点で測定した。その結果を図4〜7に示す。図4は、野生型の測定結果、図5は変異体1の測定結果、図6は変異体2の測定結果,図7はCBRの測定結果を示す。

0116

図4および5より、温度が25℃から37℃と上がるに連れて、野生型では最大発光波長が585nmから587nmへと、変異体1では最大発光波長が575nmから590nmへと長波長側にシフトしていることがわかる。これは、図1に示した高pHから低pHへ変化したときのスペクトル変化と同様の結果である。また、変異体2では、温度が25℃から37℃に上昇しても、最大発光波長の明確なシフトはみられなかったため、図6は、37℃で測定した結果のみを示す。図6より、変異体2は、野生型や変異体1とは異なる最大発光波長(620nm)を示し、市販されている赤色発光ルシフェラーゼCBRの波長(620nm)と同程度であることがわかる(図7)。さらに、変異体2の発光強度は、図3からCBRの5倍以上であることもわかる。

0117

[実施例4:西表産キベリヒゲボタル由来のルシフェラーゼ遺伝子のクローニング]
沖縄県西表島にて採集した西表産ヒゲボタルから実施例1と同様の手法を用いて,西表産キベリヒゲボタル(Stenocladius yoshikawai)を由来とするルシフェラーゼ遺伝子のクローニングを実施した。

0118

獲得した塩基配列は、以下のとおりである。
ATGCCGTCATCGATGATGAGCAAAAAGGATCTAGAAGATAAAAATGTCGTGCATGGACCCGATCCTTATTACCTAGTCGATGAAGGTAACGCTGGACAACAACTACACAAAACAATTTTGAGATATGCACAACTACCTGATACCATCGCTTTTACRGATGGACATACAAAACGAGATGTGACCTACGCCCACTATTTTGATCTTACTTGTAGATTAGCAGAAAGCTTGAAGAGATATGGGCTTAATCTACAATCCAGAATTGCAGTTTGTAGTGAAAATAATGTTGAATTTTTCATACCTGTAGTTGCATCTCTGTATTTAGGAGTCGGTGTTGCTCCAACGAATGATATTTATAATGAAACTGAATTATTCAACAGTCTAAACATATCGCAACCAACTATTGTTTTTGTTTCAAAAAGAGCACTGCATAAAATTTTGGAAGTAAAAAAGAGGATACCAATTATTAAGACGGTCGTGGTATTAGATACCGAAGAAGACTTTATGGGATACCACTGCCTCCATTCATTTATGAAACATTACCTACCACCAAAYTTCGATATAATGTCCTATAAACCTGAGGAGTTTGCAAGGGATGGCCAACTCGCTCTCATAATGAACTCTTCTGGATCAACGGGATTACCAAAAGGCGTAATGTTAGCCCATAGAAATGTAGTTGTGCGATTTTCRCACTGCAAGGATCCGGTATTTGGCAATCAAATCATCCCAGATACTGCTATATTAACAGTAATACCATTTCATCATGGTTTTGGTATGTTTACAACTTTAGGATACCTAACCTGCGGTTTCCGTATTGTACTATTGAGAAAATTTGATGAACATTACTTTTTGAAATGCTTACAAGACTATAAAATTCAAAGTGCATTACTCGTACCAACCCTATTCTCTTTCTTTGCAAAAAGTACTTTAGTTGACCAATATGATTTATCAAATTTAAAAGAAATAGCATCCGGTGGAGCTCCTCTTGCAAAAGAAGTTGGAGAAGCTGTCGCAAAAAGATTCAAGCTACCAGGAATAAGACAAGGATACGGTTTAACAGAAACCACTTCAGCTGTAATAATTACACCAGAGGGTGAAGATAAACCTGGATCAACTGGGAAAGTTGTTCCGTTCTTTTCAGCTAAAATAGTTGATCTTAATAATGGAAAATCTGTGGGACCACACCAACGCGGTGAATTATGCCTTAAAGGCGATATGATTATGATGGGRTATTGCAATAATAAAGCAGCAACAGATGAAATGATTGATAAAGATGGTTGGTTACATTCCGGTGATATTGCTTATTACGATGAAGATGGGCACTTCTTTATTGTAGATCGCTTAAAATCTTTGGTTAAATATAAAGGCTACCAGGTGGCACCTGCTGAATTAGAGGCTGTACTATTACAACATCCATGTATTTTTGACGCCGGTGTTACTGGTGTTCCTGATGACGTTGCTGGAGAGCTTCCAGGAGCTTGCGTTGTACTTGAAAAGGGCAAACATGTAACAGAACAGGAAGTTATGGATTACGTTGCAGGTCAACTTTCATCGTACAAAAAACTCCGTGGCGGAGTACGCTTCATAGATGAAATACCTAAGGGTCTTACTGGAAAAATTGATAGAAAGGCATTGAAAGAAATTCTTAAAAAACCGCAATCCAAAATGTAA(配列番号36)

0119

上記塩基配列(配列番号36)によりコードされるアミノ酸配列は、以下のとおりである。
MPSSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRNVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYFLKCLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNNGKSVGPHQRGELCLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLVKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVAGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSSYKKLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM*(配列番号37)

0120

シブイロヒゲボタル由来のルシフェラーゼ(配列番号1)とキベリヒゲボタル由来のルシフェラーゼ(配列番号37)は、配列番号1のアミノ酸配列上223番目のセリンがアスパラギンに置換されている点で異なる。

0121

塩基配列(配列番号36)のコドン最適化遺伝子(哺乳細胞での発現に最適化した遺伝子)の塩基配列は、以下のとおりである。
ATGCCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGAaaCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTGCTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTTTCTGAAGTGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAACGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTGCCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGGTCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGCTGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCAGCTACAAGAAACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCATCGACGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA(配列番号38)

0122

[実施例5:改良型赤色変異体の作製、並びにHeLa細胞内における発光強度および発光スペクトルの比較]
1.改良型赤色変異体の作製
下記のとおり、実施例3で作製された変異体2に更なる変異を導入することにより、改良型赤色変異体を発現する変異型遺伝子を作製した。

0123

(i)改良型赤色変異体A
実施例3で作製された変異体2(配列番号34)をコードする遺伝子(配列番号35)に対し、下記(a)〜(h)の変異を更に導入した:
(a)配列番号34のアミノ酸配列の387番目のアスパラギンをセリンに置換する変異(N387S);
(b)配列番号34のアミノ酸配列の400番目のシステインをチロシンに置換する変異(C400Y);
(c)配列番号34のアミノ酸配列の432番目のイソロイシンをバリンに置換する変異(I432V);
(d)配列番号34のアミノ酸配列の451番目のバリンをイソロイシンに置換する変異(V451I);
(e)配列番号34のアミノ酸配列の486番目のアラニンをアスパラギン酸に置換する変異(A486D);
(f)配列番号34のアミノ酸配列の517番目のセリンをシステインに置換する変異(S517C);および
(g)配列番号34のアミノ酸配列の520番目のリジンをアルギニンに置換する変異(K520R)。

0124

得られた変異型ルシフェラーゼ遺伝子によりコードされる変異型ルシフェラーゼを改良型赤色変異体Aと称する。改良型赤色変異体Aは、S293F、N387S、C400Y、I432V、V451I、A486D、S517CおよびK520Rの8つの変異を有する。この改良型赤色変異体Aをコードする遺伝子は、更にKozak配列の付与による変異(P2A)を有する。

0125

(ii)改良型赤色変異体B
また、実施例3で作製された赤色変異体(配列番号34)をコードする遺伝子(配列番号35)に対し、下記(h)〜(m)の変異を更に導入した:
(h)配列番号34のアミノ酸配列の282番目のフェニルアラニンをチロシンに置換する変異(F282Y);
(i)配列番号34のアミノ酸配列の387番目のアスパラギンをセリンに置換する変異(N387S);
(j)配列番号34のアミノ酸配列の400番目のシステインをチロシンに置換する変異(C400Y);
(k)配列番号34のアミノ酸配列の486番目のアラニンをアスパラギン酸に置換する変異(A486D);
(l)配列番号34のアミノ酸配列の517番目のセリンをシステインに置換する変異(S517C);および
(m)配列番号34のアミノ酸配列の520番目のリジンをアルギニンに置換する変異(K520R)。

0126

得られた変異型ルシフェラーゼ遺伝子によりコードされる変異型ルシフェラーゼを改良型赤色変異体Bと称する。改良型赤色変異体Bは、F282Y、S293F、N387S、C400Y、A486D、S517CおよびK520Rの7つの変異を有する。この赤色変異体をコードする遺伝子は、更にKozak配列の付与による変異(P2A)を有する。

0127

(iii)改良型赤色変異体C
また、実施例3で作製された赤色変異体(配列番号34)をコードする遺伝子(配列番号35)に対し、下記(n)〜(r)の変異を更に導入した:
(n)配列番号34のアミノ酸配列の387番目のアスパラギンをセリンに置換する変異(N387S);
(o)配列番号34のアミノ酸配列の400番目のシステインをチロシンに置換する変異(C400Y);
(p)配列番号34のアミノ酸配列の486番目のアラニンをアスパラギン酸に置換する変異(A486D);
(q)配列番号34のアミノ酸配列の517番目のセリンをシステインに置換する変異(S517C);および
(r)配列番号34のアミノ酸配列の520番目のリジンをアルギニンに置換する変異(K520R)。

0128

得られた変異型ルシフェラーゼ遺伝子によりコードされる変異型ルシフェラーゼを改良型赤色変異体Cと称する。改良型赤色変異体Cは、S293F、N387S、C400Y、A486D、S517CおよびK520Rの6つの変異を有する。この赤色変異体をコードする遺伝子は、更にKozak配列の付与による変異(P2A)を有する。

0129

それぞれの変異の導入は、GeneMorph II Random Mutagenesis kit(商標登録)(アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて、マニュアルにしたがって実施した。
変異導入後、エレクトロポレーション法を用いて大腸菌JM109(DE3)株に形質転換して寒天培地上にコロニーを形成させた。このコロニーに対して最終濃度2mMのD-Luciferinを噴霧後、CCDカメラDP-70(オリンパス)にて発光を撮像した。他のコロニーよりも明るく、赤い発光を呈するコロニーを拾い上げ、シーケンサーを用いて配列を確認した。

0130

改良型赤色変異体A〜Cの変異を下記の表2にまとめて示す。表2は、改良型赤色変異体A〜Cが、シブイロヒゲボタルの野生型ルシフェラーゼに対して、特定の位置に特定のアミノ酸変異を有していることをを示す。

0131

0132

改良型赤色変異体Aのアミノ酸配列は配列番号39に記載され、改良型赤色変異体Aをコードする遺伝子の塩基配列は配列番号40に記載される。

0133

改良型赤色変異体Aのアミノ酸配列(配列番号39)は、以下の通りである。変異アミノ酸に下線を付す。
MASSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRSVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYFLKCLQDYKIQFALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNSGKSVGPHQRGELYLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDVAYYDEDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVDGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSCYKRLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM*

0134

改良型赤色変異体Aをコードする遺伝子の塩基配列(配列番号40)は、以下の通りである。
ATGGCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGATCCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTGCTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTTTCTGAAGTGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGTTTGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAGCGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTACCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACGTTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGACGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCTGCTACAAGAGACTGAGAGGCGGTGTGCGCTTCATCGATGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA

0135

改良型赤色変異体Bのアミノ酸配列は配列番号41に記載され、改良型赤色変異体Bをコードする遺伝子の塩基配列は配列番号42に記載される。

0136

改良型赤色変異体Bのアミノ酸配列(配列番号41)は、以下の通りである。変異アミノ酸に下線を付す。
MASSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRSVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYYLKCLQDYKIQFALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNSGKSVGPHQRGELYLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLVKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVDGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSCYKRLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM*

0137

改良型赤色変異体Bをコードする遺伝子の塩基配列(配列番号42)は、以下の通りである。
ATGGCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGTACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGATCCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGTAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTAACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACTCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTACTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTATCTGAAATGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGTTTGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAGCGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTACCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGGTCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGACGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCTGCTACAAGAGACTGAGAGGCGGTGTGCGCTTCATCGATGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA

0138

改良型赤色変異体Cのアミノ酸配列は配列番号43に記載され、改良型赤色変異体Cをコードする遺伝子の塩基配列は配列番号44に記載される。

0139

改良型赤色変異体Cのアミノ酸配列(配列番号43)は、以下の通りである。変異アミノ酸に下線を付す。
MASSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRSVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYFLKCLQDYKIQFALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNSGKSVGPHQRGELYLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLVKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVDGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSCYKRLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM*

0140

改良型赤色変異体Cをコードする遺伝子の塩基配列(配列番号44)は、以下の通りである。
ATGGCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGATCCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTGCTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTTTCTGAAGTGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGTTTGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAGCGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTACCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGGTCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGACGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCTGCTACAAGAGACTGAGAGGCGGTGTGCGCTTCATCGATGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA

0141

2.HeLa細胞内における発光強度および発光スペクトルの比較
次に、改良型赤色変異体A〜CによるHeLa細胞内での発光強度を測定し、これらを、北米産ホタル(Photinus pyralis)由来のルシフェラーゼLuc2(プロメガ社より入手)およびコメツキムシ由来の赤色発光のルシフェラーゼCBR(プロメガ社のCBRルシフェラーゼ)と比較した。

0142

改良型赤色変異体A〜Cをコードする変異型遺伝子は、変異体2と同様、Kozak配列が付与されている上に、哺乳細胞における発現に対してコドン最適化されている。改良型赤色変異体A〜Cをコードする変異型遺伝子を、それぞれ、pF9A CMV hRLuc neo Flexi vector(Promega)のマルチクローニングサイトのSgfIおよびPmeIのサイト間に挿入した。pF9Aベクターは内部コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子(hRLuc)をベクター配列に含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度との比として算出することが可能である。

0143

同様の手順に従って、北米産ホタル(Photinus pyralis)由来ルシフェラーゼLuc2(プロメガ社より入手)の遺伝子およびCBRルシフェラーゼ(プロメガ株式会社)の遺伝子を、それぞれpF9Aベクターのマルチクローニングサイトに挿入した。

0144

発光強度の比較は、Dual−Glo(登録商標)Luciferase Assay System(米国プロメガ社製、製品番号E2940)を用いて実施した。得られた5種のプラスミドを、48穴のプレートに播種したHeLa細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、24時間後PBSで細胞を洗浄した。48穴プレートの各ウェルに2mM D−ルシフェリン/CO2 Independent Medium(Invitrogen)を200μlずつ添加し、37℃、各ウェルあたり1秒間測定の条件でLuminescensor(ATTO)を用いて90分間発光強度を測定した。90分経過時点の発光強度を5種ルシフェラーゼの発光強度とした。その後、マニュアルに従ってセレンテラジンを添加し、内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度を37℃、各ウェルあたり1秒間測定の条件でLuminescensorを用いて15分間発光強度を測定した。

0145

改良型赤色変異体A〜C、北米産ホタル(Photinus pyralis)由来ルシフェラーゼLuc2およびCBRルシフェラーゼによる発光強度を、ウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度でそれぞれ除算した値を算出し、その値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。その結果を図8に示す。図8において、発光強度は、CBRルシフェラーゼによる発光強度を1としたときの比で表している。

0146

図8に示されるように、改良型赤色変異体A〜Cによって得られた発光強度は、CBRルシフェラーゼによる発光強度に対して、それぞれ約5.72倍、約4.51倍、および約3.98倍であった。また、D−ルシフェリンに対する改良型赤色変異体A〜CのKm値は、それぞれ6.18、2.02および4.20であった。

0147

また、HeLa細胞で発現させた改良型赤色変異体A〜Cの発光スペクトルを実施例2と同様に測定した。ルシフェリン濃度は2mMで、温度は37℃で測定した。その結果を図9〜11に示す。

0148

図9〜11より、改良型赤色変異体A〜Cは、いずれも、野生型とは異なる最大発光波長を示し、改良型赤色変異体Aは約613nm、改良型赤色変異体Bは615nm、改良型赤色変異体Cは613nmの最大発光波長を示した。図9〜11は、最大発光波長における発光強度を1として、それぞれの赤色変異体の発光スペクトルを示す。図9〜11の結果から、改良型赤色変異体A〜Cの最大発光波長は、市販されている赤色発光ルシフェラーゼCBRの最大発光波長(620nm)と同程度であることが示された。

0149

実施例3で作製された変異体2(S293F)は、ヒカリコメツキ由来ルシフェラーゼCBR(プロメガ社)と発光強度を比較すると5.19倍明るかったのに対し、改良型赤色変異体Aは5.72倍明るくなった。

0150

また、下記表3に示されるとおり、改良型赤色変異体A〜CのD−Luciferin(発光基質)に対するKm値は、野生型であるシブイロヒゲボタルよりも、それぞれ2.69倍、8.22倍、3.85倍効率が良く、既存のヒカリコメツキ由来の赤色ルシフェラーゼCBRよりも、それぞれ5.39倍、16.49倍、7.93倍効率が良かった。

実施例

0151

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ