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技術 血中尿酸値低減作用を有する乳酸菌

出願人 株式会社明治
発明者 坪井洋金子紀子佐藤秋菜土屋義信
出願日 2012年11月29日 (6年6ヶ月経過) 出願番号 2012-260477
公開日 2013年3月14日 (6年3ヶ月経過) 公開番号 2013-048636
状態 特許登録済
技術分野 微生物、その培養処理 食品の着色及び栄養改善 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 通常流 酸素吸着剤 開発室 プリン骨格 介護用食品 無機栄養素 分散比 ピーク面積値
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2013年3月14日)のものです。
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図面 (5)

課題

飲食品医薬品用途に適し、血中尿酸値の上昇を抑制可能な乳酸菌を提供する。

解決手段

プリン体存在下で各種乳酸菌を培養し、該プリン体の消費量および該プリン体分解物生産量を測定し、プリン体分解能の顕著な複数の乳酸菌を選抜した。上記選抜によってプリン体分解能が高いと判断された乳酸菌を、プリン体含有飼料飼育したラット経口投与し、当該マウス一般状態および血清尿酸値を測定し、乳酸菌投与による血清尿酸値への影響を検討した。その結果、血清尿酸値の上昇を有意に抑える乳酸菌:Lactobacillus gasseri OLL2959および Lactobacillus oris OLL2779を見出した。

概要

背景

高尿酸血症は、環境要因生活習慣)や遺伝的要因により、尿酸排泄低下や尿酸産生過剰がおこり、血中の尿酸が過剰になった状態である。高尿酸血症は自覚症状がない場合もあるが、痛風腎機能障害尿路結石動脈硬化症といった深刻な合併症を引き起こす。高尿酸血症の代表的合併症である痛風は、激痛を伴う急性関節炎主症状として現れる。過去には、痛風は「帝王の病気」と呼ばれており、肉やアルコールなどを頻繁に多く摂取する層の「ぜいたく病」であったが、近年では、食生活の変化によって年々増加傾向にある。現在の日本における痛風の患者数は30〜40万人、高尿酸血症の患者数は推定600万人といわれており、高尿酸血症の予防および治療への関心が高まっている。

高尿酸血症の予防および治療は、食事療法運動療法医薬品およびこれらの組み合わせで血中の尿酸値コントロールすることによって行われる。特に、摂取カロリー制限は高尿酸血症の予防および治療方法として最も選択される方法の一つであるが、厳しいカロリー制限を継続することは必ずしも容易ではない。このような状況を改善する方法として、プリン体を分解する乳酸菌酵母などの微生物を経口的に(例えば医薬品、飲食品として)摂取させて、腸管内で食事から摂取されたプリン体を分解し、その体内への吸収を減少させ、血清尿酸値を低減させる方法が提案されている(特許文献1、非特許文献1)。乳酸菌は古くから食品や医薬品として利用されており、人体への安全性も高いため、乳酸菌摂取は副作用の懸念の低い、高尿酸血症を予防・治療するための有効な方法となり得る。また、上述の通り、高尿酸血症の予防および治療法第一選択は食事療法であり、尿酸値のコントロールを可能とする乳酸菌を食品として摂取できれば、極めて現実的かつ有力な新規な高尿酸血症の予防および/または治療法となり得る。しかしながら、上記文献で報告された、プリン体分解能を有する乳酸菌:Lactobacillus fermentum、Lactobacillus pentosusはガス生産能を有しており、飲食品や医薬品への応用という観点からは必ずしも適当な菌種とはいえない。

概要

飲食品や医薬品用途に適し、血中尿酸値の上昇を抑制可能な乳酸菌を提供する。プリン体存在下で各種乳酸菌を培養し、該プリン体の消費量および該プリン体分解物生産量を測定し、プリン体分解能の顕著な複数の乳酸菌を選抜した。上記選抜によってプリン体分解能が高いと判断された乳酸菌を、プリン体含有飼料飼育したラット経口投与し、当該マウス一般状態および血清尿酸値を測定し、乳酸菌投与による血清尿酸値への影響を検討した。その結果、血清尿酸値の上昇を有意に抑える乳酸菌:Lactobacillus gasseri OLL2959および Lactobacillus oris OLL2779を見出した。 なし

目的

本発明は上記状況を鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、飲食品や医薬品用途に適した、高尿酸血症の予防および/または治療の可能な乳酸菌を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

プリン体分解能を有し、ガス産生能を有しない、Lactobacillus属乳酸菌

請求項2

Lactobacillus gasseriである、請求項1記載の乳酸菌

請求項3

プリン体分解能を有する、Lactobacillus oris乳酸菌。

請求項4

Lactobacillus gasseri OLL2959 (受託番号:NITEP-224)であるLactobacillus属乳酸菌。

請求項5

Lactobacillus oris OLL2779 (受託番号:NITEP-223)であるLactobacillus属乳酸菌。

請求項6

請求項1から5のいずれか1項に記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を含む、血中尿酸値上昇抑制用の飲食品

請求項7

請求項1から5のいずれか1項に記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を含む、高尿酸血症の予防および/または治療用医薬品。

請求項8

請求項1から5のいずれか1項に記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を投与することを特徴とする、食品から摂取するプリン体量を抑制する方法。

請求項9

請求項1から5のいずれか1項に記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を投与することを特徴とする、血中尿酸値上昇を抑制する方法。

技術分野

0001

本発明は、血中尿酸値低減作用を有する乳酸菌およびその利用方法に関し、また、乳酸菌を含む高尿酸血症の予防および/または治療用食品または医薬品に関する。

背景技術

0002

高尿酸血症は、環境要因生活習慣)や遺伝的要因により、尿酸排泄低下や尿酸産生過剰がおこり、血中の尿酸が過剰になった状態である。高尿酸血症は自覚症状がない場合もあるが、痛風腎機能障害尿路結石動脈硬化症といった深刻な合併症を引き起こす。高尿酸血症の代表的合併症である痛風は、激痛を伴う急性関節炎主症状として現れる。過去には、痛風は「帝王の病気」と呼ばれており、肉やアルコールなどを頻繁に多く摂取する層の「ぜいたく病」であったが、近年では、食生活の変化によって年々増加傾向にある。現在の日本における痛風の患者数は30〜40万人、高尿酸血症の患者数は推定600万人といわれており、高尿酸血症の予防および治療への関心が高まっている。

0003

高尿酸血症の予防および治療は、食事療法運動療法、医薬品およびこれらの組み合わせで血中の尿酸値コントロールすることによって行われる。特に、摂取カロリー制限は高尿酸血症の予防および治療方法として最も選択される方法の一つであるが、厳しいカロリー制限を継続することは必ずしも容易ではない。このような状況を改善する方法として、プリン体を分解する乳酸菌、酵母などの微生物を経口的に(例えば医薬品、飲食品として)摂取させて、腸管内で食事から摂取されたプリン体を分解し、その体内への吸収を減少させ、血清尿酸値を低減させる方法が提案されている(特許文献1、非特許文献1)。乳酸菌は古くから食品や医薬品として利用されており、人体への安全性も高いため、乳酸菌摂取は副作用の懸念の低い、高尿酸血症を予防・治療するための有効な方法となり得る。また、上述の通り、高尿酸血症の予防および治療法第一選択は食事療法であり、尿酸値のコントロールを可能とする乳酸菌を食品として摂取できれば、極めて現実的かつ有力な新規な高尿酸血症の予防および/または治療法となり得る。しかしながら、上記文献で報告された、プリン体分解能を有する乳酸菌:Lactobacillus fermentum、Lactobacillus pentosusはガス生産能を有しており、飲食品や医薬品への応用という観点からは必ずしも適当な菌種とはいえない。

0004

WO2004/112809

先行技術

0005

日本農芸化学ホームページ日本農芸化学会年次大会講演発表データベース(http://isbba.bioweb.ne.jp/jsbba_db/index.html) 「日本農芸化学会 2004.03.30 一般講演、池永武、久米村恵 他:食事性高尿酸血症モデルラットの血中尿酸値に及ぼす乳酸菌の影響」

発明が解決しようとする課題

0006

本発明は上記状況を鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、飲食品や医薬品用途に適した、高尿酸血症の予防および/または治療の可能な乳酸菌を提供することであり、また同時に、上記乳酸菌を用いた高尿酸血症の予防および/または治療用組成物を提供することである。

課題を解決するための手段

0007

上記課題を解決すべく、本発明者らは鋭意努力を重ねた。まず、イノシンおよびグアノシン存在下で各種乳酸菌を培養し、上記ヌクレオシド消費量および分解物ヒポキサンチングアニン)の生産量を測定し、ヌクレオシド分解能の顕著な複数の乳酸菌を選抜した。上記選抜によってヌクレオシド分解能が高いと判断された乳酸菌を、プリン体含有飼料飼育したラット経口投与し、当該マウス一般状態および血清尿酸値を測定し、乳酸菌の投与による血清尿酸値への影響を観察した。その結果、血清尿酸値の上昇を有意に抑える乳酸菌:Lactobacillus oris OLL2779およびLactobacillus gasseri OLL2959を見出した。さらに本発明者らは、上記乳酸菌を用いてヨーグルトを調製し、上記乳酸菌がヨーグルトを含む食品の加工用として適していることを確認した。本発明の乳酸菌は、血清尿酸値の上昇を抑制するため、高尿酸値血症や痛風の予防および/または治療用の医薬品として有効に利用できる。また、本発明の乳酸菌は、その血清尿酸値の上昇抑制効果が経口投与による実験で確認されており、さらに実際の食品加工に適していることも確認されているため、食品として利用できる点で有用性が著しく高い。すなわち、本発明は高尿酸血症の予防および/または治療の可能な乳酸菌およびその利用に関し、具体的には、以下の発明を提供するものである。
(1)プリン体分解能を有し、ガス産生能を有しない、Lactobacillus属乳酸菌
(2)Lactobacillus gasseriである、上記(1)記載の乳酸菌、
(3)Lactobacillus gasseri OLL2959 (受託番号:NITEP-224)であるLactobacillus 属乳酸菌、
(4)プリン体分解能を有する、Lactobacillus oris乳酸菌、
(5)Lactobacillus oris OLL2779 (受託番号:NITE P-223)であるLactobacillus 属乳酸菌、
(6)上記(1)から(5)のいずれか1項に記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を含む、血中尿酸値上昇抑制用の飲食品、
(7)上記(1)から(5)のいずれか1項に記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を含む、高尿酸血症の予防および/または治療用の医薬品、
(8)上記(1)から(5)のいずれか1項に記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を投与することを特徴とする、食品から摂取するプリン体量を抑制する方法、
(9)上記(1)から(5)のいずれか1項に記載の乳酸菌、該乳酸菌含有物および/またはその処理物を投与することを特徴とする、血中尿酸値上昇を抑制する方法。

発明の効果

0008

本発明によって、血中尿酸値を低減可能な乳酸菌が提供された。本発明の乳酸菌を経口摂取することにより、血中尿酸値を低減することができるため、本発明の乳酸菌は痛風や高尿酸血症の予防および/または治療用の食品または医薬品として利用できる。特に、本発明の乳酸菌は、食品製造上、ガス産生による問題がないことが確認されている点で、実用化に適しているといえる。さらに、本発明の乳酸菌を利用すれば、プリン体量を低減させた加工食品の製造も可能になると考えられる。このように、本発明の乳酸菌は、食品および医薬品産業上、極めて有用性が高いといえる。

図面の簡単な説明

0009

プリン体(イノシン)存在下で各種乳酸菌を培養したときの、各乳酸菌のプリン体分解能を示す図である。プリン体分解率が高いと認められた菌株星印)を、モデル動物実験対象とした。
プリン体(グアノシン)存在下で各種乳酸菌を培養したときの、各乳酸菌のプリン体分解能を示す図である。プリン体分解率が高いと認められた菌株(星印)を、モデル動物実験対象とした。
L. fermentumおよびL. brevis乳酸菌のプリン体分解能を、(ヒポキサンチン量+グアニン量)/5-ブロモウラシル量で評価した図である。
プリン体分解能の高い乳酸菌(L. fermentum、L. brevis)を食事性高尿酸血症モデル動物に経口投与し、血清尿酸値を測定した結果を示す図である。
プリン体分解能の高い乳酸菌(L. oris、L. gasseri)を食事性高尿酸血症モデル動物に経口投与し、血清尿酸値を測定した結果を示す図である。L. orisOLL2779株投与群(第7群)は投与開始後2日目および5日目において、L. gaserri OLL2959株(第9群)は投与開始後5日目において、血清尿酸値上昇の有意な抑制が観察された(図中の#)。

0010

本発明は、プリン体分解能を有し、ガス産生能を有しない、Lactobacillus属乳酸菌に関するものである。本発明は、プリン体分解能を有し、ガス産生能を有しないLactobacillus 属乳酸菌(以下において、「本発明のLactobacillus 属乳酸菌」とも称する)が本発明者らによって初めて見出されたことに基づくものである。

0011

Lactobacillus 属は、乳酸菌の代表的な属の一つで、80種以上の種を含む。Lactobacillus属に含まれる種の例として、Lactobacillus delbrueckii subsp. burgalicus、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis、Lactobacillus paracasei subsp. paracasei、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus helveticus subsp. jugurti、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus oris、Lactobacillus casei subsp. rhamnosus、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus brevisを挙げることができる。本発明のLactobacillus属乳酸菌はプリン体分解能を有し、ガス産生能を有しない、Lactobacillus 属乳酸菌である限りいずれの種であってもよいが、好ましくは、Lactobacillus gasseriである。

0012

プリン体は、核酸を構成する成分であり、プリンde novo合成、サルベージ回路食餌中核タンパク質等によって生体に供給され、不要なプリン体は肝臓において代謝されて排出される。尿酸は、ヒト、高等霊長類鳥類爬虫類等におけるプリン体の最終代謝産物である。

0013

本明細書においてプリン体とは、プリン骨格を有する化合物である。プリン体の代表例として、プリンヌクレオチドアデニル酸デオキシアデニル酸グアニル酸デオキシグアニル酸)、プリンヌクレオシドアデノシンデオキシアデノシン、グアノシン、デオキシグアノシン)、プリン塩基アデニン、グアニン)、プリン塩基を含むオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを挙げることができる。プリン塩基は、核酸を構成する他、ATPGTPcAMPcGMP補酵素AFADNAD等の多様な生体成分を構成する。本明細書においては、プリン骨格を有する限り、このような生体成分も全てプリン体に含まれる。

0014

生体内におけるプリン体は、尿酸に代謝される。プリン体が尿酸まで至る代謝経路は広く知られている。AMPは5´‐ヌクレオチダーゼによってアデノシンとなり、アデノシンはイノシンを経てヒポキサンチンとなる。GMPは、5´‐ヌクレオチダーゼによってグアノシンとなった後、グアニンとなる。ヒポキサンチンはキサンチンオキシダーゼによって、またグアニンはグアニンデアミナーゼによって、いずれもキサンチンに代謝され、さらにキサンチンはキサンチンオキシダーゼによって尿酸となる。

0015

本発明においてプリン体分解能とは、少なくとも一つのプリン体を分解する能力をいい、分解産物がプリン骨格を有するかどうかは問わない。すなわち、あるプリン体を分解してプリン骨格を有さない化合物にする能力も、あるプリン体を分解して別のプリン体(プリン骨格を有する化合物)にする能力も、本発明におけるプリン体分解能に含まれる。

0016

本発明のLactobacillus属乳酸菌は、公知方法によって分離することができる。例えば、ヒト等の哺乳類糞便から菌を培養し、培養した菌の形状、生理学的特徴等からLactobacillus属を分離し、プリン体分解能およびガス生産能の有無を検出し、プリン体分解能を有し、かつガス生産能を有しないLactobacillus属を選別することで単離可能である。プリン体分解能の検出およびガス生産能の検出は公知方法によって可能であり、一例を示せば、本実施例の方法により可能である。

0017

本発明のLactobacillus属乳酸菌を培養するには、一般的に乳酸桿菌の培養に適した培地であれば良く、グルコースラクトースガラクトースフルクトーストレハローススクロースマンノースセロビオース等の炭素源肉エキスペプトンイーストエキストラクトカゼインホエータンパク質等の窒素源硫酸マグネシウム硫酸鉄硫酸マンガン等の無機栄養素を含む培地を用いることができる。好適な例の一つとして、LactobacilliMRS Broth (Difco)を挙げることができる。培養条件は、腸内乳酸菌が生育し得る条件であれば、特に制限はないが、好ましい条件としては、例えば、 pH5.0−pH8.0、温度20℃−45℃であり、より好ましい条件としては、嫌気性、pH5.0−pH7.0、温度30℃−40℃である。

0018

本発明者らは、後述するとおり、本発明のLactobacillus属乳酸菌をモデル動物に経口投与し、該乳酸菌に血中尿酸値の上昇を抑制する効果があることを確認した。したがって、本発明のLactobacillus属乳酸菌は、血中尿酸値の上昇抑制のために、または高尿酸血症の予防および/または治療のために利用することができる。さらに本発明のLactobacillus属乳酸菌のプリン体分解能を利用して、プリン体量が低減化された食品を製造することも可能と考えられる。

0019

本発明の「プリン体分解能を有し、ガス産生能を有しない、Lactobacillus属乳酸菌」の具体例として、受託番号:NITEP-224で特定されるLactobacillus gasseri OLL2959を挙げることができる。本発明者らは、多数の乳酸菌についてプリン体分解能およびガス生産能の有無を検討し、Lactobacillus gasseri OLL2959と名付けたLactobacillus属乳酸菌が、プリン体分解能を有し、ガス産生能を有しないことを具体的に見出した。さらにin vivo実験によって、Lactobacillus gasseri OLL2959が血中の尿酸値上昇を有意に抑制することを突き止めた。本発明者らは、上記菌株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
(イ)寄託機関:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
所在地:日本国千葉県木更津市かずさ足2−5−8郵便番号292-0818)
(ロ)寄託日:2006年3月31日
(ハ)受託番号:
Lactobacillus gasseri OLL 2959株(受託番号NITE P-224)

0020

また、本発明は、プリン体分解能を有する、Lactobacillus oris乳酸菌に関するものである。本発明は、プリン体分解能を有し、Lactobacillus oris 乳酸菌(以下において、「本発明のLactobacillus oris乳酸菌」とも称する)が本発明者らによって初めて見出されたことに基づくものである。

0021

本発明のLactobacillus oris乳酸菌は、本発明のLactobacillus属乳酸菌の分離・培養について上記の通り説明した方法と同様の方法によって、分離・培養できる。また、本発明のLactobacillus oris乳酸菌も、血中尿酸値の上昇抑制のために、または高尿酸血症の予防および/または治療のために利用することができる。

0022

本発明の「プリン体分解能を有する、Lactobacillus oris乳酸菌」の具体例として、受託番号:NITEP-223で特定されるLactobacillus oris OLL2779を挙げることができる。本発明者らは、多数の乳酸菌の中から、プリン体分解能を有する乳酸菌として、Lactobacillus oris OLL2779を見出し、さらに、in vivo実験によって、Lactobacillus oris OLL2779が血中の尿酸値上昇を有意に抑制することを突き止めた。本発明者らは、上記菌株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
(イ)寄託機関:独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
(所在地:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8郵便番号292-0818)
(ロ)寄託日:2006年3月31日
(ハ)受託番号:
Lactobacillus oris OLL 2779株 (受託番号NITE P-223)

0023

本発明のLactobacillus属乳酸菌および本発明のLactobacillus oris乳酸菌は、血中尿酸値上昇抑制用の飲食品または医薬品、高尿酸値血症の予防および/または治療用の医薬品または飲食品の製造に用いることができる。

0024

本発明のLactobacillus属乳酸菌および本発明のLactobacillus oris乳酸菌を用いて作る飲食品は、カテゴリーや種類に制限はなく、機能性食品特定保健用食品、健康食品、介護用食品でも良く、また、菓子乳酸菌飲料チーズやヨーグルト等の乳製品調味料等であっても良い。飲食品の形状についても制限はなく、固形、液状、流動食状、ゼリー状タブレット状顆粒状、カプセル状など、通常流通し得るあらゆる飲食品形状をとることができる。上記飲食品の製造は、当業者の常法によって行うことができる。上記飲食品の製造においては、乳酸菌生育を妨げない限り、糖質タンパク質、脂質、食物繊維ビタミン類、生体必須微量金属(硫酸マンガン、硫酸亜鉛塩化マグネシウム炭酸カリウム、等)、香料やその他の配合物を添加することもできる。

0025

本発明のLactobacillus属乳酸菌および本発明のLactobacillus oris乳酸菌、これらの該乳酸菌含有物および/またはその処理物(例えば、培養物濃縮物ペースト化物噴霧乾燥物凍結乾燥物真空乾燥物、ドラム乾燥物、液状物希釈物破砕物)は、上記の通り乳製品・発酵乳を含む一般飲食品に加工できる他、ヨーグルトやチーズ等の乳製品・発酵乳の製造用スターターとして利用することも可能である。スターターとする場合は、本発明のLactobacillus属乳酸菌および本発明のLactobacillus oris乳酸菌の生息・増殖に支障がない限り、また、乳製品製造に支障がない限り、他の微生物が混合されていても良い。例えば、ヨーグルト用乳酸菌として主要な菌種であるLactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus、Streptococcus thermophilus、Lactobacillus acidophilus等と混合しても良く、その他、一般にヨーグルト用やチーズ用として用いられる菌種と混合してスターターとすることができる。上記スターターによる乳製品、発酵乳の製造は、常法に従って行うことができる。例えば、加温・混合・均質化殺菌処理後に冷却した乳または乳製品に、上記スターターを混合し、発酵・冷却することにより、プレーンヨーグルトを製造することができる。

0026

本発明のLactobacillus属乳酸菌および本発明のLactobacillus oris乳酸菌は、生理学的に許容される担体賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができるが、好ましい投与方法は、経口投与である。経口投与製剤としては、周知の各種剤型とすることができ、例えば、顆粒剤散剤錠剤丸剤カプセル剤液剤シロップ剤乳剤懸濁剤トローチ剤等の剤型とすることができる。また、当業者に周知の方法で腸溶性製剤とすることにより、胃酸の効果を受けることなく、本発明のLactobacillus属乳酸菌をより効率的に腸まで運ぶことも可能である。

0027

本発明のLactobacillus属乳酸菌および本発明のLactobacillus oris乳酸菌を用いて製造された医薬品および飲食品は、飲食品中の同菌の作用によって、血中尿酸値上昇抑制効果や高尿酸値血症の予防および/または治療効果を発揮するものと期待できる。

0028

以下、本発明を実施例に基づき、より具体的に説明する。もっとも本発明は、下記実施例に限定されるものではない。尚、実施例中、菌株名にJCMと記載された菌株は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室から入手した基準株、菌株名にATCCと記載された菌株は、American Type Culture Collectionから入手した基準株、菌株名にMEPと記載された菌株は明治乳業株式会社保有菌株である。

0029

〔実施例1〕乳酸菌の尿酸低減作用に関するin vitroの実験方法
各種乳酸菌について、プリン体分解能の有無を以下の方法によって検討した。
各種の乳酸菌(菌体)をDifco LactobacilliMRS Broth(BD製)培地を用いて、酸素吸着剤「アネロパック」(三菱ガス(株)製)と共に密閉容器に入れ、温度37℃にて一晩嫌気培養した。培養後の菌体懸濁液を回転数3000rpm、温度4℃にて10分間遠心分離して菌体を沈殿回収(集菌)した。
この菌体から1×109 CFU/mLの菌体懸濁液を0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液で調製した。
各種の菌体懸濁液を調製した後に、イノシンとグアノシンをそれぞれが1.25mMになるように各種の菌体懸濁液に加えた。これらの菌体懸濁液を37℃の恒温漕へ入れ、水平回転数140rpmにて30分間あるいは2時間振とう培養した。
振とう培養後の菌体懸濁液(反応液)について、ヌクレオシドの消費量と、ヌクレオシドの分解物である塩基(ヒポキサンチンとグアニン)の生成量を、5-ブロモウラシルを内部標準としてHPLCにて測定した。移動相Aの780μLに、反応液200μL、内部標準として5-ブロモウラシル(1.6 mg/mL) 20μLを加えて混合した。この混合液フィルター孔径0.45μm)で濾過した後に、透過液50μLをHPLCに注入した。HPLCの具体的な操作条件は以下の通りである。

0030

HPLC: Waters alliance 2690
カラムCAPCELLPAK C18 SG120、粒子径5μm、カラムサイズ 4.6×250 mm(資生堂)
移動相: A : 25mM KH2PO4(0.1%メタノール
B : 25mM KH2PO4(0.1% メタノール)/メタノール(75:25)
グラジエントA/B (min) : 100/0(0)− 100/0(10)−
20/80(20)− 20/80(25)− 100/0(26)− 100/0(40)
検出器フォトダイオードアレイ(Waters 996)検出波長254nm
流速: 1 mL/min
カラム温度常温
結果を図1〜3に示す。各化合物の定量は、HPLCチャートピーク面積値に基づき行った。更に図1及び図2の分解率は下式に従い算出した。
分解率=100-(イノシンあるいはグアノシン量/ブランクにおけるイノシンあるいはグアノシン量)×100
また、図3算出方法は以下の通りである。
(ヒポキサンチン量+グアニン量)/5-ブロモウラシル量
図1〜3の結果から、ヌクレオシド分解能の顕著であると判断される乳酸菌を選抜した。

0031

〔実施例2〕乳酸菌の尿酸低減作用に関するin vivoの実験方法
先行文献(非特許文献1)に記載された方法に従い、食事性高尿酸血症モデル動物を作製し、該動物の血清尿酸値に及ぼす微生物(乳酸菌)の影響を検討した。上記方法は具体的には、オキソニン酸カリウムを2.5重量%とRNAを1.0重量%で含む混を調製して、ラットに摂取させ、摂取後からの血中尿酸値を陰性群や対照群と比較する方法である。本方法のモデル動物は、尿酸生成の阻害薬であるアロプリノールを経口投与した際に、該モデル動物の血中尿酸値が有意に抑制されることが明らかとなっている(食品機能研究ニューズ(第14号)、2005年3月9日発行、(株)メルシャクリテック環境検査センター、http://www.m-cleantec.com/gizyutu/news_0503.html)。このことは、高尿酸血症に対する食品の有効性を評価する系として上記方法が有用であることを示している。

0032

〔2−1 材料および実験手順
〔微生物〕
上記in vitro試験でヌクレオシド分解能が高いと判断された、Lactobacillus fermentum MEP181504株(以下において、場合により「Lactobacillus」を「L.」と略す)、L. brevis MEP181507株、L. gaserri JCM8787株、L. gaserri OLL2959株、L. oris OLL2779株の5株を使用した。各種の乳酸菌からin vitro試験と同様にして菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を1×109 CFU/10mL/kgでラットへ経口投与した。

0033

実験動物
ラット(WisterSPF、雄、7週齢)を使用した。飼育(馴化と試験)には、ラット用プラスチックケージを使用し、1ケージ当たり1匹のラットを収容した。明暗サイクル明期を午前7時〜午後7時(12時間)とした。
予備飼育(馴化)と群分け〕
実験動物は搬入した後に1週間の予備飼育(馴化)を行った。馴化中には、餌(飼料)としてAIN-93G(オリエンタル酵母工業(株))、飲水として水道水自由摂取させた。予備飼育したラット(入荷7日後、8週齢、Day0)を午前中に非絶食下で尾静脈より採血した。この血液を室温で30分以上放置した後に、回転数10000 rpmにて10分間遠心分離して血清分取し、血清中の尿酸値をリンタングステン酸法にて測定した。

0034

群分けは各群の血清中の尿酸値が同等になるように行った。試験には、1群当たり5匹のラットを使用し、陰性群(第1、5群)、対照群(第2、6群)、菌体投与群(第3,4,7-9群)の合計9群を設定した。群名、餌、投与物(投与用量)、匹数などを以下に示す。
・陰性群(第1、5群):「AIN-93G」給餌、「生理食塩水」投与(10mL/kg)、5匹
・対照群(第2、6群):「オキソニン酸カリウムを2.5重量%、RNAを1.0重量%で混合したAIN-93G」給餌、「生理食塩水」投与(10mL/kg)、5匹
・菌体投与群(第3、4、7〜9群):いずれの群も、「オキソニン酸カリウムを2.5重量%、RNAを1.0重量%で混合したAIN-93G」給餌、5匹。各群の投与菌体および投与量は、
第3群は、「L. fermentum MEP181504株の懸濁液(1×108 CFU/mL)」投与(10mL/kg)、
第4群は、「L. brevis MEP181507株の懸濁液(1×108 CFU/mL)」投与(10mL/kg)、
第7群は、「L. orisOLL2779株の懸濁液(1×108 CFU/mL)」投与(10mL/kg)、

0035

第8群は、「L. gaserri JCM8787株の懸濁液(1×108 CFU/mL)」投与(10mL/kg)、
第9群は、「L. gaserri OLL2959株の懸濁液(1×108 CFU/mL)」投与(10mL/kg)。

0036

〔本飼育(試験)〕
群分けした後の翌日より試験期間とし、「AIN-93G」飼料(陰性群)と「AIN-93G+オキソニン酸カリウム+RNA」飼料(対照群、菌体投与群)をそれぞれ給餌器によりラットに8日間自由摂取させた。本飼料の給餌開始日をDay1とし、以後では日付と共にDayを起算した。「AIN-93G+オキソニン酸カリウム+RNA」飼料は、オキソニン酸カリウム(100g、ALDRICH)を2.5重量%とRNA(500g、MP Biomedicals. Inc.)を1.0重量%で含んでいる。菌体投与群の実験動物には、前記の菌体懸濁液を1×109 CFU/10mL/kgで強制経口投与した。陰性群と対照群には、菌体懸濁液ではなく、生理食塩水を10mL/kgで強制経口投与した。
〔測定と検査等〕
・一般状態の観察と体重の測定
全例(全群)においてDay1からDay8の連日、投与時に一般状態を観察し、Day0、Day1、Day5、Day8の午前9〜10時に定時で体重を測定した。
・ 摂餌量と摂水量の測定
全例(全群)においてDay1(セット値)、Day5(残値、セット値)、Day8(残値)の午前9〜10時に定時で摂餌量と摂水量を測定した。
・採血と生化学的検査
全例(全群)においてDay0(午前中)、Day2(投与1時間後)、Day5(投与1時間後)、Day8(投与前)に尾静脈より採血した。採取した血液は、回転数10000 rpmにて10分間遠心分離して血清を分取し、血清中の尿酸値をリンタングステン酸法にて測定した。前記した通り、Day0では当日に血清中尿酸値を測定し、群分けに使用した。
剖検と生化学的検査
全例(全群)においてDay8に尾静脈より採血した後に、菌体懸濁液を経口投与した。投与1時間後にネンブタール麻酔ペントバルビタール40mg/kg)状態にて、腹大動脈より全採血して致死させた。採取した血液は、回転数3000 rpmにて15分間遠心分離して血清を分取し、血清中のクレアチニン、尿酸、尿素窒素を測定した。
臓器重量の測定
ラットの腎臓摘出し、湿重量を測定した。

0037

統計処理
結果は平均値±標準偏差で示し、対照群と菌体投与各群を比較した。数値化した検査値分散比F検定を行い、等分散の場合にはStudent'st-検定を、不等分散の場合にはAspin-Welch t-検定を行った。統計処理には、エクセル統計 2004 の統計解析を使用し、最低有意水準を両側5%とした。
〔2−2 結果〕
一般状態の結果を表1(L.fermentumとL.brevis)と表2(L orisとL.gasseri)に、血清尿酸値の推移図4および5に示す。
各種乳酸菌投与による血清中の尿酸値の低下について、図5に示すように、L.oris OLL2779投与群およびL.gasseri OLL2959投与群において、有意差が認められた。一般状態は、いずれの群においても、腎機能クレアチニン値、血清中尿素窒素、重量)に問題がなく、体重・摂餌量・摂水量もいずれの群も問題はなかった。また、一般状態の所見については、各種乳酸菌の間で有意差は観察されなかった。L.oris OLL2779およびL.gasseri OLL2959の科学的特徴を表3に示す。

実施例

0038

〔実施例3〕発酵乳の製造
(発酵乳の製造例1)
プレーンヨーグルトをL. gasseri OLL2959 (NITEP-224)、L. bulgaricus JCM1002T、S. thermophilusATCC19258により調製した。まず、脱脂粉乳10%培地を用いて、L. gasseri OLL2959 (NITE P-224)、L. bulgaricus JCM1002T、S. thermophilus ATCC19258のバルクスターターを調製した。次に、ヨーグルトミックス無脂乳固形分(SNF): 9.5%、脂肪分FAT): 3.0%)を95℃、5分間で加熱処理した。この加熱処理後のヨーグルトミックスに、L. bulgaricus JCM1002Tと、S. thermophilus ATCC19258のスターターを各1%、L. gasseri OLL2959 (NITE P-224)のスターターを5%で接種し、43℃、4時間で発酵して、プレーンヨーグルトを得た。このプレーンヨーグルトを冷蔵庫(5℃)で冷却してから、風味と物性を確認した。このとき、風味と物性はいずれも良好であった。
(発酵乳の製造例2)
プレーンヨーグルトをL. oris OLL2779 (NITE P-223)、L. bulgaricus JCM1002T、S. thermophilus ATCC19258により調製した。まず、脱脂粉乳10%培地を用いて、L. oris OLL2779 (NITE P-223)、L. bulgaricus JCM1002T、S. thermophilus ATCC19258のバルクスターターを調製した。次に、ヨーグルトミックス(無脂乳固形分(SNF): 9.5%、脂肪分(FAT): 3.0%)を95℃、5分間で加熱処理した。この加熱処理後のヨーグルトミックスに、L. bulgaricus JCM1002Tと、S. thermophilus ATCC19258のスターターを各1%、L. oris OLL2779 (NITE P-223のスターターを5%で接種し、43℃、4時間で発酵して、プレーンヨーグルトを得た。このプレーンヨーグルトを冷蔵庫(5℃)で冷却してから、風味と物性を確認した。このとき、風味と物性はいずれも良好であり、L. oris OLL2779は食品の製造に好適に使用できることが確認された。

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