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課題

インビトロにおいて、水溶液中の糖質濃度監視する。特に、経脈管的に埋め込まれ、糖質、すなわちグルコースまたはフルクトースの濃度を監視をするための装置を提供する。

解決手段

被分析物透過成分と、被分析物透過成分と結合し、第1波長で光を吸収し、第2波長で光を放出するように設定されているフルオロフォアと、被分析物透過成分と結合し、フルオロフォアにより放出された光を被分析物濃度相関した量まで変更するように設定されているクエンチャーとを含み、クエンチャーはボロン酸置換ビオロゲンを含み、装置は、光源と、検出器とを、含むことを特徴とする。

概要

背景

[発明の分野]
本発明の実施例は、水性、または有機媒体中のポリヒドロキシ置換有機分子の濃度を測定する、改善された光学的方法、および/またはセンサーに関連する。一応用において方法およびセンサーは、インビトロにおいて水溶液中の糖質、すなわち、グルコースまたはフルクトースなどの濃度を監視する。特に前記方法およびセンサーは、経脈管的に埋め込まれ、血中のグルコースまたはフルクトースなどの糖質の監視に採用されている。

[関連技術の説明]
体液中のポリヒドロキシ化合物(例:グルコース)濃度の測定のため、蛍光技術を用いる努力が長年続けられてきた。「グルコース」という用語が以下に使用されているが、水溶液中のほとんどのポリヒドロキシル含有有機化合物(糖質、1,2−ジオール、1,3−ジオール等)の濃度が決定されることが理解されること。懸命な努力に関わらず、インビトロにおける監視のための実用的システムが開発、商業化されていなかった。ボロン酸基が付着される色素を使用した蛍光によりグルコースを検出する試みが幾度もなされてきた。ボロン酸は糖質を可逆的に結合すると知られている。ボロン酸機能化色素が糖質に結合する場合、色素の性質が影響を受ける。これらの変化が従来糖質の濃度測定に使用されてきた。

グルコースセンサーへのこのアプローチの一用途は、グルコースに結合し、グルコース濃度によりシグナルを発生する、ボロン酸官能化色素の使用を開示するRusselの米国特許第5,137,833により報告されている(RusselおよびZeppによる米国特許第5,512,246も参照)。James他による米国特許第5,503,770では、同じ原理を使用しているが、単鎖体部分に蛍光色素アミンクエンチング機能、およびボロン酸を結合し、そこからの蛍光発光はグルコース結合の範囲により変化する。Van Antwerp他による、米国特許第6,002,954および第6,011,984は、前記に引用した参照の特徴とを組み合わせ、また組み込み可能にすることを目的とした装置の製造を教示した。A. E .Colvin, Jr.は米国特許第6,304,766で、特に人体中現場検出用光学ベース検知装置を開示している。

目的とする特許は以下を含むがこれらに限られない:

関連する、目的の米国特許は以下を含むが、これらに限られない:

関連する記事、および出版物は以下を含む:

ポリビオロゲンに関する一般的参照は以下を含む

一般的性質の参照は以下を含む:

量子ドットの技術に関する参照は以下を含む;

本願に参照されるすべての特許、記事、参照、基準等は、本書にその全体を参照して援用するものである。

これらすべての従来センサーは、生理的環境下での操作性、操作の安定性、設計の簡素化、信頼性、埋め込み性、および感度などの、一以上の面を欠いている。本発明はこれらの欠点を克服するものである。

概要

インビトロにおいて、水溶液中の糖質濃度を監視する。特に、経脈管的に埋め込まれ、糖質、すなわちグルコースまたはフルクトースの濃度を監視をするための装置を提供する。被分析物透過成分と、被分析物透過成分と結合し、第1波長で光を吸収し、第2波長で光を放出するように設定されているフルオロフォアと、被分析物透過成分と結合し、フルオロフォアにより放出された光を被分析物濃度相関した量まで変更するように設定されているクエンチャーとを含み、クエンチャーはボロン酸置換ビオロゲンを含み、装置は、光源と、検出器とを、含むことを特徴とする。なし

目的

Van Antwerp他による、米国特許第6,002,954および第6,011,984は、前記に引用した参照の特徴とを組み合わせ、また組み込み可能にすることを目的とした

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

光学的に被分析物濃度を決定するための装置であって、被分析物透過成分と、前記被分析物透過成分と結合し、第1波長で光を吸収し、第2波長で光を放出するように設定されているフルオロフォアと、前記被分析物透過成分と結合し、前記フルオロフォアにより放出された光を前記被分析物濃度と相関した量まで変更するように設定されているクエンチャーとを含み、前記クエンチャーは、ボロン酸置換ビオロゲンと、光源と、検出器とを、含むことを特徴とする装置。

請求項2

前記被分析物透過成分は、ポリマーマトリックスを含むことを特徴とする請求項1に記載の装置。

請求項3

前記ポリマーマトリックスは、ヒドロゲルであることを特徴とする請求項2に記載の装置。

請求項4

前記ヒドロゲルは、親水性単量体重合、あるいは、架橋結合された親水性ポリマーによって形成されていることを特徴とする請求項3に記載の装置。

請求項5

請求項6

前記ポリマーマトリックスは、水に不溶性であることを特徴とする請求項2に記載の装置。

請求項7

前記水に不溶であるポリマーマトリックスは、HPTS(Lys−MA)3、HPTS−MA、HPTS−CO2−MA、APTS−BuMAおよびAPTS−DegMAからなる群より選択される単量体から形成されることをと特徴とする請求項6に記載の装置。

請求項8

前記水に不溶であるポリマーマトリックスは、共重合体HEMA、ポリエチレングリコールジメタクリレートまたは、N,N‘−ジメチルアクリルアミド、およびメチレンビスアクリルアミドを含むことを特徴とする請求項7に記載の装置。

請求項9

前記被分析物透過成分は、前記フルオロフォアおよびクエンチャーをとじこめる膜を含むことを特徴とする請求項1に記載の装置。

請求項10

前記フルオロフォアは、置換ピレンを含むことを特徴とする請求項1に記載の装置。

請求項11

前記置換ピレンは、ピラニンスルホン酸塩誘導体を含むことを特徴とする請求項10に記載の装置。

請求項12

前記ピラニンスルホン酸塩誘導体は、下記の構造式から選択されることを特徴とする請求項11に記載の装置。(ここで、R1、R2およびR3は、それぞれ‐NHR4であり、R4は、‐CH2‐CH2(−O−CH2−CH2)n−X1、X1は、−OH、OCH3−CO2H、CONH2、−SO3Hまたは‐NH2であり、そして、nは、約70〜10,000である。)

請求項13

前記ボロン酸置換ビオロゲンは、さらに、芳香族ボロン酸部分を含むことを特徴とする請求項1に記載の装置。

請求項14

前記クエンチャーは、下記の群から選択される前駆体からつくられていることを特徴とする請求項13に記載の装置。(ここで、Xは、臭化物または塩化物である。)

請求項15

前記ビオロゲンは、下記の群から選択される前駆体からつくられたことを特徴とする請求項1に記載の装置。

請求項16

前記クエンチャーは、前記被分析物量と結合するように構成されていることを特徴とする請求項1に記載の装置。

請求項17

前記クエンチャーは、前記フルオロフォアによって、発光される光を減少させるように構成されていることを特徴とする請求項16に記載の装置。

請求項18

前記クエンチャーは、さらに、前記フルオロフォアによって発光される光を、結合した被分析物の量と逆相関した量になるまで減少させるように構成されていることを特徴とする請求項16に記載の装置。

請求項19

前記被分析物は、ポリドキシル置換の有機分子を含むことを特徴とする請求項1に記載の装置。

請求項20

前記被分析物は、グルコースであることを特徴とする請求項19に記載の装置。

請求項21

前記光源は、青色発光ダイオードLED)であることを特徴とする請求項1に記載の装置。

請求項22

生理液中で、被分析物濃度を光学的に決定するための装置であって、被分析物透過成分と、前記被分析物透過成分と結合し、第1波長で光を吸収し、第2波長で光を発光するように構成され、置換ピレンを含むフルオロフォアと、前記被分析物透過成分と結合し、前記フルオロフォアによる光の発光を被分析物に相関した量まで変更するように構成されたクエンチャーと、光源と、検出器と、を含むことを特徴とした装置。

請求項23

第1波長で光を吸収し、第2波長で光を放出するように構成されたフルオロフォアと、前記フルオロフォアによって発光される光を、前記被分析物濃度と相関する量まで変更するクエンチャーであって、ボロン酸置換のビオロゲンを含むクエンチャーと、を含むことを特徴とする被分析物センサー

請求項24

前記フルオロフォアは、置換ピレンを含むことを特徴とする請求項23に記載の被分析物センサー。

請求項25

前記置換ピレンは、下記構造から選択されることを特徴とする請求項24に記載の被分析物センサー。(ここで、R1、R2およびR3は、それぞれ‐NHR4であり、R4は、‐CH2‐CH2(−O−CH2−CH2)n−X1、X1は、−OH、OCH3−CO2H、CONH2、−SO3Hまたは‐NH2であり、そして、nは、約70〜10,000である。)

請求項26

第1励起波長で光を吸収し、第2発光波長で発光するように設定されたピレン誘導体を含むフルオロフォア色素と、被分析物に結合するように設定されたクエンチャーと、を含み、前記クエンチャーは、前記フルオロフォア色素に結合可能であり、そして、前記クエンチャーは、前記フルオロフォア色素により発光される光を被分析物の結合と関連して調整するように設定されていることを特徴とする被分析物センサー。

請求項27

試料中の被分析物の濃度を光学的に決定する方法であって、請求項23から26のいずかに記載の被分析物センサーと接触させる工程と、前記センサーに光を照射する工程と、発光した光を検出する工程と、前記被分析物の濃度を決定する工程と、を含むことを特徴とする方法。

請求項28

前記被分析物の濃度は、継続した一定期間にわたって決定されることを特徴とする請求項27に記載の方法。

請求項29

前記試料が、流体であることを特徴とする請求項28に記載の方法。

請求項30

前記試料が、生理液であることを特徴とする請求項29に記載の方法。

請求項31

前記試料が、生きている哺乳動物の生理液であること特徴とする請求項30に記載の方法。

請求項32

前記光は、第1励起波長で照射されることを特徴とする請求項27に記載の方法。

請求項33

前記光は、発光ダイオード(LED)により照射されることを特徴とする請求項32に記載の方法。

請求項34

前記光は、第2発光波長で検出されることを特徴とする請求項27に記載の方法。

請求項35

前記光は、実質的に連続して照射されることを特徴とする請求項27に記載の方法。

請求項36

前記光は、周期的に照射されることを特徴とする請求項27に記載の方法。

請求項37

前記被分析物は、ポリヒドロキシル置換された有機分子を含むことを特徴とする請求項27に記載の方法。

請求項38

前記ポリヒドロキシル置換された有機分子は、グルコースであることを特徴とする請求項37に記載の方法。

請求項39

前記接触させる工程は、さらに、前記被分析物センサーを皮下に埋め込むことを含むことを特徴とする請求項27に記載の方法。

請求項40

前記接触させる工程は、さらに、前記被分析物センサーを血管中注入することを含むことを特徴とする請求項27に記載の方法。

請求項41

前記血管は、動脈であることを特徴とする請求項40に記載の方法。

請求項42

前記血管は、静脈であることを特徴とする請求項40に記載の方法。

請求項43

前記被分析物センサーは、人間に埋め込まれることを特徴とする請求項39から42のいずれか1項に記載の方法。

請求項44

前記被分析物センサーは、さらに、生体適合性のある被覆物をふくむことを特徴とする請求項27に記載の方法。

請求項45

ジピリジルアリールボロン酸を含むアルキル化剤と反応させ、N,N’‐ビス‐ベンジルボロン酸ビオロゲンを製造する工程と、ビオロゲンによって、消光されることが可能なフルオロフォアと、N,N’‐ビス‐ベンジルボロン酸ビオロゲンとを結合する工程と、を含むことを特徴とする被分析物センサーの形成方法

請求項46

前記アルキル化剤は、ハロメチルフェニルボロン酸であり、ハロブロモまたはクロロであることを特徴とする請求項45に記載の形成方法。

請求項47

下記化学式から選択させる組成物。mおよびnは、それぞれ、1−6で定義され、遊離酸、またはそれらの共役塩であることを特徴とする組成物。

請求項48

下記から選択されることを特徴とする請求項47に記載の組成物。mおよびnは、それぞれ、1であり、遊離酸、またはそれらの共役塩であることを特徴とする組成物。

請求項49

前記被分析物透過成分は、量子ドット部分を含むことを特徴とする請求項1に記載の装置。

請求項50

前記被分析物透過成分は、HEMA,PEGMA,メタクリル酸、ヒドロキシエチルアクリレート、N−ビニルピロリドン、アクリルアミド、N,N’−ジメチルアクリルアミド,メタアクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド、エチレンジメタクリレート、PEGDMA、メチレンビスアクリルアミド、トリメチルロールプロパントリアクリレートを含む架橋結合を有するソディウムスルホプロピルメタアクリレートからなる群より独立して選択されるポリマーまたはこれらの組合せであることを特徴とする請求項1に記載の装置。

請求項51

前記ビオロゲンは、2以上のボロン酸部分を含むことを特徴とする請求項27に記載の装置。

請求項52

前記フルオロフォアは、少なくとも1以上の負電荷を有する請求項1に記載の装置。

請求項53

下記に示される組成物。

技術分野

0001

[関連出願]
本願は、2000年12月5日に出願された前米国出願第09/731,323号であり、2003年9月30日に交付された現米国特許第6,627,177号明細書の一部継続出願である、2003年6月5日に出願された、米国出願第10/456,895の明細書の一部である、2005年12月7日出願された、米国出願第11/296,898明細書の一部継続出願であり、これらすべては、本明細書に参照することにより、組み込まれる。

0002

政府支援に関する声明
本発明は、政府の支援を受けていない。

背景技術

0004

[発明の分野]
本発明の実施例は、水性、または有機媒体中のポリヒドロキシ置換有機分子の濃度を測定する、改善された光学的方法、および/またはセンサーに関連する。一応用において方法およびセンサーは、インビトロにおいて水溶液中の糖質、すなわち、グルコースまたはフルクトースなどの濃度を監視する。特に前記方法およびセンサーは、経脈管的に埋め込まれ、血中のグルコースまたはフルクトースなどの糖質の監視に採用されている。

0005

[関連技術の説明]
体液中のポリヒドロキシ化合物(例:グルコース)濃度の測定のため、蛍光技術を用いる努力が長年続けられてきた。「グルコース」という用語が以下に使用されているが、水溶液中のほとんどのポリヒドロキシル含有有機化合物(糖質、1,2−ジオール、1,3−ジオール等)の濃度が決定されることが理解されること。懸命な努力に関わらず、インビトロにおける監視のための実用的システムが開発、商業化されていなかった。ボロン酸基が付着される色素を使用した蛍光によりグルコースを検出する試みが幾度もなされてきた。ボロン酸は糖質を可逆的に結合すると知られている。ボロン酸機能化色素が糖質に結合する場合、色素の性質が影響を受ける。これらの変化が従来糖質の濃度測定に使用されてきた。

0006

グルコースセンサーへのこのアプローチの一用途は、グルコースに結合し、グルコース濃度によりシグナルを発生する、ボロン酸官能化色素の使用を開示するRusselの米国特許第5,137,833により報告されている(RusselおよびZeppによる米国特許第5,512,246も参照)。James他による米国特許第5,503,770では、同じ原理を使用しているが、単鎖体部分に蛍光色素アミンクエンチング機能、およびボロン酸を結合し、そこからの蛍光発光はグルコース結合の範囲により変化する。Van Antwerp他による、米国特許第6,002,954および第6,011,984は、前記に引用した参照の特徴とを組み合わせ、また組み込み可能にすることを目的とした装置の製造を教示した。A. E .Colvin, Jr.は米国特許第6,304,766で、特に人体中現場検出用光学ベース検知装置を開示している。

0007

目的とする特許は以下を含むがこれらに限られない:

0008

関連する、目的の米国特許は以下を含むが、これらに限られない:

0009

関連する記事、および出版物は以下を含む:

0010

ポリビオロゲンに関する一般的参照は以下を含む

0011

一般的性質の参照は以下を含む:

0012

量子ドットの技術に関する参照は以下を含む;

0013

本願に参照されるすべての特許、記事、参照、基準等は、本書にその全体を参照して援用するものである。

0014

これらすべての従来センサーは、生理的環境下での操作性、操作の安定性、設計の簡素化、信頼性、埋め込み性、および感度などの、一以上の面を欠いている。本発明はこれらの欠点を克服するものである。

課題を解決するための手段

0015

好適な実施例において、本発明は、水性媒体中ポリヒドロキシル化合物、特に生理的媒体中のグルコースまたはフルクトースなどの糖質の濃度を決定する、特にインビボにおける決定するための光学的方法および光学的装置に関連する。これらの化合物被分析物は、光源検出器、およびフルオロフォアD(蛍光色素等)、クエンチャー、および任意のポリマーマトリクスMを含む、活性成分からなる、蛍光検知装置を備えた系中にある。適切な波長の光により励起された場合、フルオロフォアは光を放出する(蛍光)。光の強度はクエンチングの範囲に依存する。フルオロフォア、およびクエンチャーQは、独立した構成要素でもよく、検出および定量化する目的の化合物を透過、または接触するポリマーマトリクスに随意に固定、または、共有結合される。別の実施例において、フルオロフォアDおよびクエンチャーQは、互いに共有結合されていてもよい。

0016

一態様において、本発明は、生理的pHにおける、またはそれに近い水性媒体中のグルコースなどの、ポリヒドロキシル化合物の存在に反応する、蛍光クエンチング化合物群を含む。言い換えれば、クエンチング効率は、媒体中のこれらの化合物の濃度によって制御される。クエンチャーは、少なくとも一つのボロン酸基と置換されたビオロゲンからなり、前記付加体ポリマーと固定される、あるいは共有結合している。クエンチャー、色素、およびポリマーも互いに共有結合されていても良い。

0017

別の態様において、本発明は、ビオロゲン/ボロン酸付加体による、クエンチングに影響されやすいポリマー蛍光色素の一群である。有用な色素には、ピラニン誘導体(例、ヒドロキシピレントリスルホンアミド(「HTPS」)誘導体等)およびアミノピレントリスルホン酸誘導体(「APTS」)(図1A、1B、1C、および17参照)。

0018

一実施例において、色素は、ポリマーに結合した、ヒドロキシピレントリスルホンアミド部分である。スルホン酸基スルホンアミド基に変換することは、ピラニンのpKaを生理的pHにおける測定により好適になりうる範囲に変化させる。この変換はまた、色素の吸光度をより長い波長に変化させることにより、埋め込みセンサーの光源として好適な光源の一つである、青色LEDの光によって、より効果的に励起することができる。これらの誘導体は、通常塩化トリスルホニル中間物を、1)ポリアミン、2)、付加体が後に重合される、アミン官能エチレン含有不飽和単量体、3)または、アミン官能ポリマーと反応させることにより、生成される。一実施例において、色素はピレン環遊離残留スルホン酸群のない完全に置換された誘導体である。

0019

別の態様において、本発明は、色素およびクエンチャー部分を構成する、複合水相溶性ポリマーマトリクス、好ましくはヒドロゲルである。前記マトリクスは、膨潤性共重合体であり、好ましくは、色素とクエンチャー部分が、結合基Lにより共有結合している、架橋結合である。一実施例において、前記マトリクスは、色素が一方のネットワークに、クエンチャーがもう一方のネットワークに組み込まれている、相互貫入重合体ネットワーク(IPN:Interpenetrating Polymer Network)である。別の実施例において、前記マトリクスは半IPNであり、色素成分は、クエンチャー単量体、および好適な親水性共単量体からなる、架橋結合ネットワークに閉じ込められている、高分子量水溶性または水分散性ポリマーである。あるいは、前記クエンチャーは水相溶性または水分散性成分、およびネットワーク内の色素中にあってもよい。さらに、色素とクエンチャーの両方が水溶性または水分散性ポリマーに個別にくわえられてもよく、ここで色素とクエンチャーのいずれも不活性ポリマーマトリクスに閉じ込められている。あるいは、前記成分は、前記成分を不透過であるが、被分析物を透過する、膜によって被分析物溶液から分離される。あるいは、前記マトリクスは、色素とクエンチャーの結合に有利に働くため、また他のポリヒドロキシ化合物に対し、グルコースなどの特定の糖質への選択性を高めるため、分子インプリントされている。色素とクエンチャーの相互作用を高める好適な一実施例においては、色素部分を、カルボン酸塩スルホン酸塩ホスホン酸塩、およびリン酸塩などの、負に帯電した基で官能化することである。

0020

好適な一実施例において、本発明は光学的センサーの手段でインビボにおいてグルコース濃度の測定をする装置に関連する。好ましくは、前記装置は、可視光源、好ましくは青色LED光源光検知器光ファイバー組立などの光導管光学導波管)、およびビオロゲン、ビオロゲン/ボロン酸クエンチャー、およびグルコース透過性ポリマーによるクエンチングに影響を受けやすいフルオロフォアからなる水に不溶性のポリマーマトリクスからなり、前記マトリクスは前記導管、および被分析物を含む媒体に接触している。

0021

一実施例において、光学的に被分析物濃度を決定するため、装置が開示されている。前記装置は、被分析物透過成分と、 前記被分析物透過成分と結合し、第1波長で光を吸収し、第2波長で光を放出するように設定されているフルオロフォアと、前記被分析物透過成分と結合し、前記フルオロフォアにより放出された光を前記被分析物濃度と相関した量まで変更するように設定されているクエンチャーとを含み、前記クエンチャーは、ボロン酸置換ビオロゲンと、光源と、検出器とを、含む。

0022

前記分析物透過成分は、ポリマーマトリクスが含まれてもよい。好適な変形例においては、ポリマーマトリクスは、ヒドロゲルである。前記ヒドロゲルは、親水性単量体の重合、あるいは親水性ポリマーの架橋結合によって形成されても良い。好ましくは、前記親水性単量体は、2−ヒドロキシエチルメタアクリレートポリエチレングリコールメタクリレートメタクリル酸ヒドロキシエチルアクリレート、N−ビニルピロリドンアクリルアミド、N,N‘−ジメチルアクリルアミドメタアクリルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロライドジアリルジメチルアンモニウムクロライド、およびエチレンジメタクリレート、PEGDMA、メチレンビス−アクリルアミドおよびトリメチロールプロパントリアクリレートから選択される架橋剤が随意に結合されている、ソジウムスルホプロピルメタクリレートからなる群より選択される1種またはこれらの組合せから形成されても良い。

0023

一実施例において、前記ポリマーマトリクスは、水に不溶性である。前記水に不溶であるポリマーマトリクスは、HPTS(Lys−MA)3、HPTS−MA、HPTS−CO2−MA、APTS−BuMAおよびAPTS−DegMAからなる群より選択される単量体から形成される。

0024

一実施例において、前記水に不溶であるポリマーマトリックスは、共重合体HEMA、ポリエチレングリコールジメタクリレートまたは、N,N‘−ジメチルアクリルアミド、およびメチレンビスアクリルアミドを含む。

0025

別の変形例において、前記被分析物透過成分は、前記フルオロフォアおよびクエンチャーを閉じ込める膜を含む。

0026

好適な実施例において、フルオロフォアは、置換ピレンからなる。置換ピレンは、ピレンスルホン酸塩誘導体からなってもよい。前記ピレンスルホン酸誘導体は、下記の構造式から選択されてもよい:



ここで、R1、R2およびR3は、それぞれ‐NHR4であり、R4は、‐CH2‐CH2(−O−CH2−CH2)n−X1、
X1は、−OH、OCH3−CO2H、CONH2、−SO3Hまたは‐NH2であり、そして、nは、約70〜10,000である。

0027

前記装置の好適な一実施例において、ボロン酸置換ビオロゲンは、さらに芳香族ボロン酸部分をさらに含む。

0028

ボロン酸クエンチャーは、下記の群から選択される前駆体からつくられても良い:

0029

前記ビオロゲンは、下記の群から選択される前駆体からつくられても良い:

0030

好適な実施例において、前記クエンチャーは、前記被分析物量と結合するように構成される。一変形例においては、前記クエンチャーは、前記フルオロフォアによって、発光される光を減少させるように構成されている。別の変形例においては、前記クエンチャーは、さらに前記フルオロフォアによって発光される光を、結合した被分析物の量と逆相関した量になるまで減少させるように構成されてもよい。

0031

開示装置の好適な実施例において、被分析物は、ポリヒドロキシル置換の有機分子を含む。より好ましくは、前記分析物はグルコースである。

0032

開示装置の別の好適な実施例において、光源は青色発光ダイオード(LED)である。

0033

別の好適な実施例によると、装置は、生理液中の被分析物濃度を光学的に決定するため開示されている。前記装置は、被分析物透過成分と、 前記被分析物透過成分と結合し、第1波長で光を吸収し、第2波長で光を発光するように構成され、置換ピレンを含むフルオロフォアと、前記被分析物透過成分と結合し、前記フルオロフォアによる光の発光を被分析物に関連した量まで修正するように構成されたクエンチャーと、光源と、検出器と、を含む。

0034

別の好適な実施例によると、被分析物センサーが開示されている。前記被分析物センサーは、第1波長で光を吸収し、第2波長で光を放出するように構成されたフルオロフォアと、前記フルオロフォアによって発光される光を、前記被分析物濃度と関連する量まで変更するクエンチャーであって、ボロン酸置換のビオロゲンを含むクエンチャーと、を含む。

0035

別の好適な実施例によると、開示された被分析物センサーは、第1励起波長で光を吸収し、第2発光波長で発光するように設定されたピレン誘導体を含むフルオロフォア色素と、被分析物に結合するよう構成されたクエンチャーと、を含み、前記クエンチャーは、前記フルオロフォア色素に結合可能であり、そして、前記クエンチャーは、前記フルオロフォア色素により発光される光を被分析物の結合と関連して調整するように設定されている。

0036

また、サンプル中における、被分析物の濃度を光学的に決定する方法が開示されている。前記方法は、上記の被分析物センサーを飼料と接触させる工程、前記センサーに光を照射する工程、発光した光を検出する工程と、前記被分析物の濃度を決定する工程を含む。

0037

被分析物の濃度は、継続した一定期間にわたって決定されてもよい。

0038

前記サンプルは流体であり、好ましくは生理液である。さらに好ましくは、前記サンプルは生きている哺乳動物の生理液である。

0039

開示された方法の一変形例において、前記光は、第一励起波長で照射される。好ましくは、前記光は発光ダイオード(LED)によって照射される。別の変形例では、前記光は、第二発光波長で検出される。開示された方法の変形例において、前記光は、実質的に連続して照射されてもよく、また、周期的に照射されてもよい。

0040

好適な実施例において、前記方法は、ポリヒドロキシル置換された有機被分析物の濃度を光学的に決定するため採用されている。さらに好ましくは、被分析物はグルコースである。

0041

一実施例において、前記接触させる工程は、さらに被分析物センサーを皮下に埋め込むことを含んでも良い。また、前記接触させる工程は、さらに被分析物センサーを血管中注入することを含んでも良い。前記血管は、動脈あるいは、静脈でも良い。好ましくは、前記被分析物センサーは、人間に埋め込まれる。

0042

一実施例において、前記被分析物センサーは、さらに生体適合性のある被覆物も含む。

0043

本発明の好適な一実施例に従い、被分析物センサーの作成方法が開示されている。前記方法は、ジピリジルアリールボロン酸を含むアルキル化剤と反応させ、N,N’‐ビス‐ベンジルボロン酸ビオロゲンを製造する工程と、ビオロゲンによって、消光されることが可能なフルオロフォアと、N,N’‐ビス‐ベンジルボロン酸ビオロゲンとを結合可能にする工程と、を含む。

0044

前記アルキル化剤は、好ましくはハロメチルフェニルボロン酸であり、ハロクロロ、もしくはブロモである。

0045

本発明の別の好適な実施例において、組成物が開示されている。前記組成物は、以下の化学式から選択することが出来る:



m=0−6;n=0−10;色素は、遊離酸、またはそれらの共役塩を含むことを特徴とする組成物。上述の組成物の具体例は以下の式を含む。

0046

開示された装置の一変形例においては、前記被分析物透過成分は、量子ドット部分を含んでも良い。

0047

更なる装置の変形例において、前記被分析物透過成分は、HEMA,PEGMA,メタクリル酸、ヒドロキシエチルアクリレート、N−ビニルピロリドン、アクリルアミド、N,N’−ジメチルアクリルアミド,メタアクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド、エチレンジメタクリレート、PEGDMA、メチレンビスアクリルアミド、トリメチルロールプロパントリアクリレートを含む架橋結合を有するソディウムスルホプロピルメタアクリレートからなる群より独立して選択されるポリマーまたはこれらの組合せでもよい。

0048

本発明の別の好適な実施例において、前記ビオロゲンは2つ以上のボロン酸部分を含んでもよい。

0049

別の好適な実施例において、前記フルオロフォアは少なくとも1以上の負電荷を含んでもよい。

0050

別の実施例において、本発明は、被分析物を決定するため、共に作用する上記に一覧された成分を含む装置である。

0051

本発明において、フルオロフォアが付着される、用語「ポリマー」には、ボロン酸化合物と反応する、または化合するポリヒドロキシポリマーを除外する。有用なポリマーは、アニオン性陽イオン性、または非イオン性であり、また加水分解に安定で、インビボ液と相溶性である。

0052

一態様において、本発明は、水性溶液中のグルコースなどのポリヒドロキシ化合物の存在に反応する、蛍光クエンチング化合物の一群であり、言い換えればクエンチング効率は前記媒体中の化合物の濃度によって制御される。前記クエンチャーがフルオロフォアと化合されると、血液などの生理液中のグルコースの濃度測定に有用である。フルオロフォアは、蛍光有機色素、蛍光有機金属化合物または金属キレート、蛍光共役ポリマー蛍光量ドット、またはナノ粒子、またはその組み合わせでもよい。前記クエンチャーは、2以上のボロン酸基で置換したビオロゲンからなる。一実施例において、クエンチャーは、窒素オルトベンジルボロン酸基で置換した、3,3‘−ジピリジル由来のビオロゲンからなり、前記付加体は、随意で1以上の付加的な陽性基を含み、前記付加体は好ましくは、ポリマーに共有結合する。グルコース認識する受容体は、芳香族ボロン酸である。本発明のボロン酸は、ビオロゲンに結合し、ボロン酸を形成するため、6.8から7.8のpH範囲において、体温で、血液中、または他の体液中のグルコースと可逆的に反応する。反応の範囲は、媒体中のグルコース濃度に相関し、濃度範囲が約50から400mg/dl以上である。好ましくは、2以上のボロン酸基が、ビオロゲン分子に付着し、グルコースへの共同的結合のため、間隔をあける。フルオロフォアとクエンチャーは、平衡が10分未満で成立するよう、ヒドロゲルに組み込まれる、または、グルコースを適切に透過させる膜に閉じ込められる。ビオロゲンボロン酸部分は、ポリマー骨格、またはポリマー鎖ペンダント基の単位でも良い。あるいは、自己組織化単分子層または、多分子層として表面に付着してもよい。他の態様では、本発明はポリマーマトリクスであり、好ましくは、フルオロフォアおよびクエンチャー部位からなるヒドロゲルである。前記マトリクスは、水溶性または膨潤性共重合体であり、好ましくは、フルオロフォアとクエンチャーが共有結合している、架橋結合であり、より好ましくは、前記マトリクスは、フルオロフォアが一方のネットワークに、クエンチャーがもう一方のネットワークに組み込まれている、相互貫入重合体ネットワーク(IPN:Interpenetrating Polymer Network)である。あるいは、前記マトリクスは、フルオロフォアとクエンチャーの結合に有利に働くため、また他のポリヒドロキシ化合物に対するグルコースの選択性を高めるため、分子インプリントされている。前記マトリクス作成に有用な単量体には、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、アクリルアミド、およびN,N−ジメチルアクリルアミドなどが含まれる。ビオロゲンと検知ポリマーの一般的な合成と、グルコース検知の実証が本書に示されている。

0053

別の態様では、本発明はインビボにおいて血液中のグルコース濃度を測定する装置であり、前記装置は、LED光源光検出器、光ファイバーなどの光導管、およびビオロゲン、オルトベンジルボロン酸置換ビオロゲンクエンチャー、およびグルコース透過性ポリマーによるクエンチングに反応する、フルオロフォアよりなるポリマーマトリクスからなり、前記マトリクスは前記導管および、被分析物を含む媒体と接触している。通常前記センサーは、血管に挿入される、カテーテルに含まれる。

0054

前記方法の別の態様において、色素Dは離散分子D1,または以下の構造を持つピラニン誘導体のポリマーD2から選択される:



ここで、R1,R2,およびR3はそれぞれ−NH−CH2−CH2(−O−CH2−CH2)n−X1である。



ここで、X1は,−CH2 −CH3,−Co2H −CONH2, −SO3H または−NH2から選択され、またnは、約70から10,000の間であり、好ましくは100から1,000の間である。

0055

前記方法の別の態様において、色素D1またはD2は、以下の構造を持つピラニン誘導体から作成される:



あるいは、以下の群からなる色素単量体から作成される:



ここで、R4=−Hであり、また
R5は、−R6−NH−(C=O)−(C=CH2)−R7, −R6−O−(C=O)−(C=CH2)−R7,
−CH2−C6H4−CH=CH2、または−CH2−CH=CH2
R6は、炭素2から6の低級アルキレンであり、またR7=−H,またはCH3
ここでZは以下から選択される加水分解により取り除かれる保護基であり、
−(C=O)−R8−Y
ここで、R8は、炭素原子1から4の低級アルキレンであり、また、
Yは、−H, −OH, −CO2H, SO3H, −(C=O)−NH−R9, あるいはCO2−R9
ここで、R9は、炭素原子1から4の低級アルキレンである。

0056

好ましくは、離散化合物、またはペンダント基である、色素部位D1は、以下から選択されるピラニン誘導体から作成される:



ここで、R18は、—HまたはL−Aであり、Lは連結基であり、Aは、−COOHおよびSO3Hから選択される、また、
R19は、−Hあるいは、色素が、少なくともR18またはR19のいずれかが重合可能基で、各スルホンアミド基が、一つの−Hで置換されるD2であるという条件で、上記R5から選択される。

0057

別の態様において、Q1は分子量(MW)が、少なくとも一つのボロン酸を持つ水溶性、または分散性の被分析物のMWのすくなくとも二倍である遊離化合物であり、前記化合物は、半透過性膜により、本体から分離される。好ましくは、遊離化合物としてのQ1は、二つのボロン酸置換基を含む。

0058

別の態様において、前記クエンチャーQ1は、下記から選択される:



上記構造において、オルト誘導体が含まれないという条件で、また:



ここで、ボロン酸基は、オルト−、メタ−、および、パラ−部位にある。

0059

色素Dにおいて、色素D1およびD2がジアゾ連鎖—N=N−を含まない条件で、D1およびD2が定義されることに注意すること。

0060

クエンチャーQ、Q1、およびQ2において、クエンチャーQ1およびQ2がジアゾ連鎖−N=N−を含まない条件で決定されることに注意すること。

0061

本書に記述されたインビボの適用において、ポリマー存在下での4.4‘−ジピリドリルのN−ベンジル−2−ボロン酸付加体であるビオロゲンは除外される。

0062

好適な実施例において、少なくとも1以上の負の電荷を持つフルオロフォアが、存在しても良い。

発明を実施するための最良の形態

0063

[定義]
本文中に使用されている:

0064

「ビス−ビオロゲン」は、二つのビオロゲンが互いに連結する化合物を示す。

0065

「ボロン酸」は、−B(OH)2の構造を示す。当業者は、本発明のクエンチャーの合成における、様々な段階で、ボロン酸がボロン酸エステルとして存在する可能性を認識する。ボロン酸にはそのようなエステルを含むことが意図されている。

0066

検知器」は、光ダイオードなどの光度を測定する装置を示す。

0067

「フルオロフォア」は、特定の波長の光で照射されるとより長い波長で発光する、すなわち蛍光を発する物質を示す。フルオロフォアには、有機色素、有機金属化合物、金属キレート、蛍光共役ポリマー、量子ドット、またはナノ粒子、または上述組み合わせを含む。フルオロフォアは、離散部分またはポリマーに付着する置換基でもよい。「蛍光色素」または「色素」は、離散化合物、または第二の遊離化合物に、あるいは前記反応性中間物または重合可能な化合物から生成されたポリマーペンダント基または単位鎖である、重合可能な化合物D1またはD2に、可逆性な反応性中間物、から選択され、ポリマーは、水溶性、または水拡散性、あるいは水に不溶なポリマーであり、また前記ポリマーは随意で架橋結合される。

0068

「蛍光共役ポリマー」は、構造全体がフルオロフォアとして作用するポリマーを示す。その一般的な例は、ポリフェニレンビニレンであり、すなわち共役炭素炭素二重結合が存在し、ポリマーが蛍光特性を持つに十分な共役である。

0069

「HEMA」は、2−ヒドロキシエチルメタクリレートを示す。

0070

「光源」または「励起光源」は、好ましくは選ばれた波長で光を照射する装置を示す。前記「光源」は、そのすべてが商用で入手可能な、キセノンランプ中圧水銀ランプ、発光ダイオード(LED)などの電磁放射を放出するいずれの装置を包含してもよい。

0071

「連結基」とは、検知部分をポリマーまたはマトリクスに共有結合させる、二価部分であり、L、L1,または、L2を示す。L、L1,または、L2の例としては、直接結合、あるいは、スルホンアミド(−So2NH−)、アミド−(C=0)N−、エステル‐(C=O)−O−、エーテル‐O−、硫化物‐S−、スルホン(−SO2−)、フェニレンーC6H4−、ウレタンーNH(CO=O)=O−、尿素ーNH(C=O)NH−、チオ尿素−NH(C=S)−NH−、アミド‐(C=O)NH−、アミン‐NR‐(ここで、Rは、1から6炭素原子を持つアルキルとして定義される)等から選択される二価の連結基により、終端または中断される、1から8炭素原子を持つ低級アルキレンから、それぞれ独立して選択されるものを含む。

0072

「ポリビオロゲン」は、一般的に、ビス−ビオロゲンを含む、連結した2以上のビオロゲン単位を含む化合物を示し、還元電位で測定された結合した化合物の電子親和力が、単一ビオロゲンより高まるに十分なほどビオロゲン環が近接している。

0073

「ポリビオロゲンボロン酸」は、少なくとも2のボロン酸基と置換されたポリビオロゲンを示す。

0074

「クエンチャー」(「Q」)フルオロフォアに結合される場合、フルオロフォアの放出を低減させる化合物を示す。一実施例においては、クエンチャーとフルオロフォアが相互作用に十分な近接する場合、フルオロフォアは結合されるとみなされてよく、相互作用は結果として、還元蛍光となる。好適な実施例においては、Qはさらに、被分析物、好ましくはグルコースを結合し、被分析物結合は、Qのクエンチング活動を調節する。クエンチャーQは、遊離化合物、離散化合物、または第二の遊離化合物に、あるいは前記反応性中間物または重合可能な化合物から生成されたポリマーペンダント基または単位鎖である、重合可能な化合物D1またはD2に、可逆性な反応性中間物、から選択され、ポリマーは、水溶性、または水拡散性ポリマーであり、また前記ポリマーは随意で架橋結合される。

0075

「量子ドットは、(「qd」)は、電子と材料の孔が空間の超微小な領域に(通常1−25nm)に閉じ込められるとき、材料構造は、サイズ量子化の構造に入り、システムの電子エネルギーレベルは、準連続よりも、離散的になり、材料の光学的、電子的特性が、サイズに強く依存する。そのような構造はその形状と、量子閉じ込めの次元により、、量子ドット、またはナノクリスタル量子ロッド、または量子井戸と呼ばれる。それには、直径数ナノメートルで、水分散性にするために通常表面を官能基で処理された、半導体クリスタルを含む。

0076

「インビボ」は、生きている哺乳類、好ましくは人体中における解析を示す。インビボ測定は、例えば、人体中に見られる、温度、圧力、媒体、分析物濃度およびpHの生理的状況下において実施される。

0077

「IPN」または、「相互貫入重合体ネットワーク」は、並置において合成された2以上のネットワークポリマーの組み合わせを示す(L.H. Sperling, Interpenetrating Polymer Networks, ACS Advances in Chemistry Series 239, 1994, from August 25−30, 1991 New York ACS Meeting参照)。

0078

ピリジニウム」は、構造に言及する(単位からなる、すなわちピリジン環が窒素で置換されており、随意で環のほかの位置で炭素と置換されている、連結基またはペンダント基)。カーボンの置換基には、ビニル基を含み、窒素の置換基には、ベンジルボロン酸のメチレン基を含む。

0079

「半IPN」または「半相互貫入重合体ネットワーク」は、一方の成分が水溶性で、他方のポリマーがネットワークであるポリマーの組み合わせを示す(上記Sperling参照)。

0080

オニウム」は、ビオロゲンが窒素の場合、ヘテロ原子形式正電荷のある、芳香族複素環イオン化合物を示す。

0081

「PEG」あるいは、ポリエチレングリコールは、オキシエチレン(−OCH2−CH2−)反復単位を含む、ポリマーまたは鎖セグメントを示す。

0082

「PEGDMA」は、2つのメタクリレート基で終端された、ポリエチレングリコールを示す。

0083

「PEGDMA」は、1つのメタクリレート基で終端された、ポリエチレングリコールを示す。

0084

「生理的pH」は、健康的な生存中の人間の血液中に通常存在する、7.3−7.5のpH範囲を示す。重病患者においては、約6.8から7.8の生理pHがしばし見られる。

0085

可視光範囲」は、約400から800nmの間のスペクトルの光を示す。

0086

ビオロゲンは、一般的に2−2‘−、3,3’−または4,4‘−N,N’ビス−(ベンジル)ビピリジウムジハロゲン(すなわち、ジクロライドブロマイドクロライド)等の、共役N置換複素環芳香族ビスオニウム塩を含む、窒素の基本的構造を持つ化合物を示す。

0087

数々の重要な発展に関する本発明の好適な実施例に数々の重要な発展が包含される。これらには、水性または有機液中、またはその組み合わせ、あるいは生理液中の糖質、1,2ジオール、または1,3、ジオールレベルを決定する方法、およびインビボ装置が含まれるが、これに限定されない。フルオロフォア色素群、ボロン酸置換クエンチャー群、およびの相互作用する、水相溶性、水溶性、有機溶剤相溶性および有機溶剤溶性の組み合わせの有機ポリマーが使用されている。これらの態様に関しては、下記に詳細に述べられている。先ず成分について述べられ、方法と装置を生成するその組み合わせの記述が続く。

0088

[クエンチャー]
本発明において、グルコース認識をもたらす部分は、芳香族ボロン酸である。さらに具体的には、本発明のボロン酸は、共役窒素含有複素環芳香族ビスオニウム構造、例えばビオロゲンに(図3Aから3Iの例を参照)共有結合しており、ボロン酸は、pH約6.8から7.8で、水性媒体中のグルコースと可逆的に反応しボロン酸エステルを生成する。特定のpHにおける反応の範囲はグルコース濃度と、ボロン酸の酸性度(pKaによって測定される)に関連する。

0089

本発明のビスオニウム塩は、共役複素環芳香族ジニトロゲン化合物から作成される。共役複素環芳香族ジニトロゲン化合物は、ジピリジル、ジピリジルエチレン、ジピリジルフェニレンフェナントロリンジアザフルオレンから、選択され、窒素原子は異なる芳香環にあり、オニウム塩を生成することが出来る。両方の窒素を置換することの出来る、共役複素環芳香族二窒素化合物のすべての異性体は、本発明において有用であることが理解されること。4,4’−ジピリジル、および4,7−フェナントロリン由来のビスオニウム塩が含まれる。ビオロゲンボロン酸付加体は、離散化合物、あるいは水相溶性ペンダント基、または分子量10,000を上回る水溶性、または水分散性ポリマーの鎖の単位系であり、あるいは、不溶性ポリマーマトリクスに結合している。一以上のボロン酸基がビオロゲン部分に付着している。

0090

ポリマークエンチャー前駆体においては、中心に位置した複素環式芳香族基中の2つの異なる窒素に付着するボロン酸部分には、複数選択肢がある
これらは:
a)第一の芳香族部分の重合可能な基は、一方の窒素に付着し、少なくとも一つの−B(OH)2期を含む第二の芳香族基は、第二の窒素に付着する。
b)一つ以上のボロン酸は、一つの窒素および一つのボロン酸に付着した、第一の芳香族部分に付着し、重合可能な基は、第二の芳香族基が第二の窒素に付着した、第二の芳香族基に付着する。
c)一つのボロン酸基と、一つの重合可能な基が、第一の芳香族基が一つの窒素に付着した第一の芳香族部分と付着し、またボロン酸基と重合可能な基が、第二の窒素と付着している第二の芳香族部分に付着する。
d)一つのボロン酸が各窒素に付着し、重合可能あるいは連結基が複素芳香族環に付着している。好適な実施例においては、2ボロン酸部分、および1重合可能な基あるいは、連結基がある。

ボロン酸基がひとつの代表ビオロゲンには、次のものを含む:
1. 構造のボロン酸置換ビオロゲン



ここで、n=1−3、好ましくは、nは1、また、Lは連結基、すなわちここで定義されるL1またはL2、また、Mはここに定義されるポリマーマトリクスである。また
ここで、Y2は、フェニルボロン酸(m−およびP−異性体)またはナフチルボロン酸、好ましくはフェニルボロン酸である。また、
2. ビオロゲンの複素環の置換基として

0091

ビオロゲンは、上記の組み合わせを含むことが意図される。ビオロゲン/ボロン酸が抽出される前駆体は、一端をボロン酸官能基で、またもう一端をビニル基などの重合可能な基で非対称的に置換されたビオロゲンである(図3Aから3I参照)。ビオロゲン/ボロン酸部分(すなわちクエンチャー)は、ペンダント基、水溶性あるいは水分散性ポリマーの単位鎖、または、架橋構造親水性ポリマー、または平衡が確立するよう、グルコースを十分透過するヒドロゲルにおけるユニットである。好適な実施例において、ビオロゲンが2つ以上のボロン部分からなる場合、より強度なシグナルが見られる。

0092

別の実施例においては、クエンチャーQ1またはQ2は、o−, m− またはp−ボロン酸からなる一群から選択されるクエンチャー前駆体から生成される:



ここで、Vは、ジピリジル、ジピリジルエチレン、ジピリジルフェニレン、フェナントロリン、またはジアザフルオレンから選択される、共役複素環式芳香族基を含む二窒素であり、2つの窒素原子が、それぞれ異なる芳香族環にあり、窒素は、オニウム塩の精製が可能なすべての位置にあり、またZ1またはZ2は、窒素上の独立した置換基であり、重合可能なエチレン含有不飽和基または、随意でボロン酸置換キシリレン連結基のいずれかである。

0093

重合可能な基は、以下から選択されるが、これらに限られない:
(i)−R10−CO2−C(R11)==CH2, −R10−NH−(C=O)−C(R2)=CH2 または−CH2−C6H4−CH=CH2
ここでR10は、2から6炭素原子の下級アルキレンまたはヒドロキシアルキレンであり、また
R11=−Hまたは−CH3である。
(ii)前記結合基は、以下から選択されるがこれらに限られない:
−R12−Z3
ここで、R12は、結合基で、好ましくは、−CH2C6H4−CH2または、2から6炭素原子のアルキレンであり、また
Z3は、共反応物質と、共有結合を形成が可能な、反応性官能基である。このような基には、−OH、−SH、−CO2,H、または−NH2を含むが、これらに限定されない。

0094

Q1は、離散化合物、あるいは、水溶性または水分散性ポリマーのペンダント基、または単位鎖(直鎖、または分岐鎖)である。Q2は、水不溶性ポリマーマトリクスM1−L2−Q2のペンダント基あるいは、単位鎖である。好ましくは、マトリクスは、架橋構造ヒドロゲルである。

0095

別の態様では、Q1またはQ2は、以下から選択される前駆体から生成される:



ここで、V1は、Vと同一で、またZ4およびZ5は、Z1およびZ2など、さらにクエンチャー前駆体でメチレン基に結合する、N,N−ジメチルアンモニウムおよびピリジウムを含む、第四級窒素基に共有結合する重合可能な基、または結合基である。

0096

よって、Z4またはZ5は、2,3または4−(CH2=CH)−ピリジニウム、2,3または4−(CH2=C(CH3)−(C=O)NH−(CH2)w−ピリジニウム、−N−(CH3)2−(CH2)w−O(C=O)C(CH3)=CH2)、−O−(CH2)w−O−(C=O)−C(CH3)=CH2、−O−(CH2)w−O−(C=O)CH=CH2、および‐O−(CH2)w−NH−(C=O)C(CH3)=CH2を含み、Wは2から6の整数、あるいは、Z4とZ5は、ヘテロ原子、好ましくは、−O−を通してビオロゲン前駆体でメチレン基に結合するZ1およびZ2である。重合可能な基、または結合基のその後の反応は、クエンチャー前駆体が水溶性または水分散性ポリマーへ、または、前記ポリマーのペンダント基、単位鎖、または終端基としての、ポリマーマトリクスMへ結合する結果となる。

0097

好適なクエンチャーQ2は、窒素においてベンジルボロン酸基と、またジピリドリル間のほかの位置で重合可能な基、または結合基と置換した、3.3‘−ジピリドリルから抽出されたビオロゲンからなる前駆体から生成される。代表ビオロゲンには以下を含む:



ここで、L4は、ここに定義されるL、L1またはL2から独立して選択され、Z6は、ここに定義されるZ1、Z2、Z3、Z4またはZ5から独立して選択され、R’は−B(OH)2、またR”は、ここに定義される、重合可能な、または結合基である。

0098

新規クエンチャー前駆体の他の例には、以下を含む:

0099

R1は、ベンジル環のオルト−、メタ−、またはパラ部位におけるボロン酸である。R2は、ヒドロゲン、あるいは随意で、ここで定義される重合可能な基または結合基、またはボロン酸の酸性度を調整するために特に使用される置換基である。

0100

ボロン酸置換のポリビオロゲンは、好適なクエンチャーの別の類である。ビオロゲンという用語には、連結基により共有結合した2以上のビオロゲンからなる離散化合物、鎖におけるビオロゲン反復単位からなるポリマー、鎖に釣り下がるビオロゲン基を備えるポリマー、好ましくはビオロゲン終端基を含む、ビオロゲン単位をからなるデンドリマー、好ましくはビオロゲン終端基を含むビオロゲン単位からなるオリゴマー、およびこれらの組み合わせを含む。モノビオロゲン基がその中で微量成分であるポリマーは含まれない。好適なクエンチャーは、少なくとも2のボロン酸と置換され、また水溶性、または分散性ポリマー、またはポリビオロゲンボロン酸からなるヒドロゲルである。あるいは、ポリビオロゲンボロン酸は、不活性基質に直接結合されている。 クエンチャー前駆体は、さらに重合可能な基または結合基と置換される、低分子量ポリビオロゲンボロン酸を含む、ポリビオロゲンボロン酸からなる。

0101

具体的な一実施例においては、ポリビオロゲンボロン酸前駆体は、2ビオロゲン単位を共有結合させることにより生成されたビスビオロゲン誘導体であり、前記付加体は、ボロン酸、および重合可能な基または結合基とさらに置換されている。好ましくは、前駆体は、連結基に直接結合しているそのような重合可能な基、または結合基の一つのみと置換される。連結基は、各ビオロゲン単位の複素芳香族環における1つの窒素へ、各ビオロゲン単位の環における炭素に結合する、あるいは、一方のビオロゲンにおける環炭素へ一つの結合をし、窒素へもう一方の結合をする。2以上のボロン酸基がクエンチャー前駆体に結合している。好ましくは、連結基はボロン酸基のグルコースへの協同的結合を高めるため選択される。

0102

2つのビオロゲン単位を連結する部分は、連結基Lであり、連結基Lは、ボロン酸基、重合可能な基、あるいは、結合基、あるいは、その組み合わせによって随意にさらに置換される、という条件で、以前に定義されている。一部の例では、連結基は、ビオロゲンはペンダント基または鎖の単位であるポリマー鎖のセグメントでもよい。

0103

フロロフォア色素]
本発明の実施例において有用な色素(図1A、1Bおよび1C参照)は、約400nm以上(好ましくは430nm)の波長の光で、ストークスの変化が波長の励起および放出が分離するに十分な大きさ、少なくとも10nm、また好ましくは約30nm以上で励起される。これらの色素は、ビオロゲンなどの電子受容体分子によるクエンチングに感受性があり、光漂白体制があり、光酸化、加水分解、および生分解に安定である。本発明において有用な色素は、約50以上、好ましくは100以上のメチルビオロゲン試験される場合、見かけスターンウォメルクエンチング定数をもつ。スターンウォリメル試験の一般的記述は、下記の手順Aに見られる。好適な色素には、ヒドロキピレントリスルホン酸およびアミノピレントリスルホン酸のポリマー誘導体である。一部の例では、色素はスルホンアミド官能基を通してポリマーに結合する。ポリマー色素は、水溶性、不溶性だが、膨潤性、水分散性であり、また架橋結合されていてもよい。ポリマーとしての好適な色素は、例えば、8−ヒドロキシピレン−1,3,6−N,N’,N”,−トリス(メトキシポリエトキシエチル(n〜125)スルホンアミド)(アセトキシピレントリスルホニルクロライドアミノエチルPEGモノメチルエーテルで反応させ生成した)水溶性PEG付加体である。結果として生じる色素ポリマーは、少なくとも約10,000の分子量を持ち、ヒドロゲルまたはネットワークポリマーマトリクスに閉じ込められる場合、マトリクスから周辺水性媒体拡散できない。

0104

拡散化合物としての代表色素は、8−アセトキシピレン−1,3,6−トリスルフォニルクロライド(HPTS−CL)をアミノブチル酸などの、アミノ酸で反応させることにより形成したトリス付加体である。ポリマーと結合し、1以上のアニオン基をもつ、ヒドロキシピレントリスルホンアミド色素が好ましく、それらには、HEMA、PEGMAなどと、8−ヒドロキシピレン−1−N(メタクリルアミドプロピルスルホンアミド)−N‘,N“−3,6−ビス(カルボキシプロピルスルホンアミド)HPTS−CO2−MAとの共重合体である。

0105

他の例には、HEMA、PEGMA、または他の親水性驚嘆量対と、8−アセトオキシピレン−1,3,6−N,N‘,N“−トリス(メタクリルアミドプロピルスルフォンアミド)の共重合体である。色素におけるフェノール置換基は、重合中、重合の完了後に加水分解によって取り除くことが出来る、保護基によって保護されている。アセトキシ、トリフロロアセトキシなどの例に好適なそのような保護基が技術的に良く知られている。他の好適な色素には、ペンダント基、またはポリマー鎖の単位としてのポリマーに色素が結合している、アミノピレントリスルホン酸[APTS]のポリマー誘導体が含まれる。色素は、スルホンアミド連結を通して、また好ましくは、アミン連結基を通して、ポリマーに結合している。重合可能ないくつかのAPTS誘導体には、以下を含む:

0106

検出が行われるには、検出部分(被分析物、色素、クエンチャー)が、相互作用を可能にするよう、例えば、分子レベルで混合し、検出される種と平衡が確立するよう、物理的に近接することが好ましい。いずれの理論または、構造に拘束されない中で、色素とクエンチャーのイオン相互作用は、基底状態色素/ビオロゲン複合体へ導き、色素から放出された蛍光の光度が減衰されたようである。クエンチャーへのグルコースの結合は、複合体を弱くする負に帯電したボロネートエステルを生成し、グルコース結合の範囲により、光度を上昇させる。シグナルに影響する被分析物結合からの立体相互作用により、複合種の分子配座における変化もまた起こりえる。さらに、ボロネートエステルは、ビオロゲンと相互作用する場合があり、それよりクエンチング有効性を変化させる。この相互作用の特定な性質はまだ確立されていないが、ボロネートの形成がビオロゲンの還元電荷を変化させることがある。還元電荷は、ビオロゲンの電荷受容能力指標である。大幅に強化されたポリビオロゲン/ボロニック付加体のクエンチング効率、およびグルコース結合から得られた増大した変化は、酸化還元機構が関わっている可能性を示す。色素とクエンチャーのレドクッス結合の後、色素を非励起状態に保つ支援をする、ビオロゲン部分の電子交換が続く。ボロン酸エステル形成は、この工程に干渉する。

0107

[量子ドット(qd)実施例]
蛍光量子ドット半導体ナノ粒子は、生分子標識組織像、およびイオン検出などの適用において、従来有機フルオロフォアの代替として使用の増加が見られてきた。蛍光量子ドット(qd)への関心は、広い吸収性、狭い発光、強い光度、および有機色素に対する良好な光安定性から由来している。しかし驚くべきことに、多くの多様な蛍光ベースのグルコース検出系の一式にも関わらず、本質的に蛍光なqdを使用したグルコース検出方法が報告されていなかった。本文に記載されているグルコース検出への二成分アプローチは、検出適用の特定な要求事項によりクエンチャー/受容体およびフルオロフォア成分の選択にかなりの柔軟性を可能にする。例えば、特定のクエンチャー/受容体がその単糖結合の選択性が理由で選ばれている可能性があると同時に、フルオロフォア成分は、いずれの範囲の希望する励起、または発光波長を提供するために選択されている。qdの利点のいくつかは、水性溶液中のグルコース濃度の変化を検出する、二成分系において実現されている。

0108

蛍光qdは、希望する表面の化学的性質をもたらすため、ZnSなどの絶縁ジェル材料被覆され、さらに処理された、CdTeおよびSdSeなどの無機半導体コア材料で、構成されている。水溶性コアシェルqdの生成には、ホスホン酸塩、カルボキシル、またはアミン基での表面機能化がしばし用いられる。特定の表面の化学的性質が、たんぱく質などの関心ある分子へqbの結合、また、溶解度、凝集挙動、およびクエンチング工程への感応性の決定を可能にする。メチルビオロゲン(MV2+)を使用したqd蛍光のクエンチングをいくつかのグループが、観察した。工程は、励起状態の電子がqdからビオロゲンに異動し、結果としてビオロゲンからMV●+へ還元されることから起こると考えられている。過去の研究は、ビオロゲンが、フルオロフォアとの複合形成を通し、多くの有機色素の蛍光の静的クエンチングにおいて、非常に効率的であることを示している。カルボキシ、およびアミンなどの極性表面基を持つ、コアシェル量子ドットの蛍光は同様に、ボロン酸置換ビオロゲンクエンチャーとの複合形成を通し、同様にクエンチされている。

0109

商業的に入手可能なコアシェルCdSe量子ドットの2組が表面機能化を除き、同じように生成された:一方は、表面がカルボキシ基で、もう一方はアミン基で生成された。両方の組は、604nmで集中した、比較的狭い蛍光発光であった。これらqdは、実に有機色素と同様にこの系において機能した、つまり、ビオロゲンクエンチャーを追加すると蛍光の減少が見られた。消光されたqd溶液にグルコースを追加すると、強固な蛍光回復が見られた(図18)。

0110

ボロン酸置換ビオロゲンo−BBV2+による、両方の量子ドット組の蛍光クエンチングに対する感受性は、ph7.4の水溶液中で決定された(図20)。カルボキシルおよびアミンの両方で置換されたqdの蛍光は、カルボキシ置換ドットが、アミン置換ドットに比べ、より強い感受性で、o−BBV2+によるクエンチングに感受性があった。両方のqdの組の蛍光は、またボロン酸置換ビオロゲンより低い度合いではあるが、単純非置換ベンジルビオロゲン(BV2+)によって、同様にクエンチされている。顕著に、表面基イオン化の度合いが決定されていない一方で、アミンドットは中性になりそうなであるのに対し、カルボキシル置換ドットは、主にpH7.4において、アニオン型において存在することが期待される。カルボキシ置換qdの増幅された感受性は、qdの陽イオンビオロゲンクエンチャーと、陰イオン表面基の間の静電気引力による場合がある。

0111

過去の研究は、生理グルコース範囲全体の強く線形シグナル応答に対し、クエンチャーとフルオロフォアの適切な割合の選択が重要であることを示した。数々の異なるクエンチャー対量子ドット比率実験を行う場合、一般的に、グルコースの追加に対応し、より高い比率のときは、より大きな線形の蛍光シグナルであるという、従来有機色素と同じ反応が見られた(図3)。

0112

qdの両方の組の、50、200、500、および1000対1のクエンチャー:qd比率でのグルコース反応を調べた。アミンおよびカルボキシル置換qdの両方で、1000:1のクエンチャー対量子ドット比を使用して、最適な結果が得られた。著しく、量子ドットの使用が、大きなシグナル応答と、相当な、100nMグルコースの追加の後、非クエンチ量子ドット蛍光の回復を可能にした(図21)。

0113

成分検出系におけるヒドロゲル中の糖質の検出に、量子ドットを使用した結果が実施例60に示されている。

0114

インビボでの適用において、センサーは流動する生理液、例えば、一つ以上のポリヒドロキシル有機化合物を含む血管内において使用されること、または、前記化合物を含む筋肉などの組織に埋め込まれることが好ましい。したがって、センサー集合より、いずれの検出部分が漏れないことが望ましい。よって、インビボでの使用においては、検出成分は、有機ポリマー検出集合体の一部である。水溶性色素およびクエンチャーは、被分析物の透過を許すが、検出部分の透過をブロックする半透過性膜によって、閉じ込めることが出来る。これは、被分析物分子より実質的に大きい(分析物の少なくとも二倍の分子量、または1000より大きい、好ましくは、5000より大きい分子量)、検出部分溶性分子を使用することで実現でき、また二つの間で特定の分子量を削除する、透析、または限外ろ過膜などの、選択半透過性膜を使用することによって、検出部分は量的に維持できる。

0115

好ましくは、検出部分は、グルコースに自由に透過可能な、不溶ポリマーマトリクスに固定化される、図8参照。ポリマーマトリクスは、有機、無機、またはその組み合わせのポリマーからなってもよい。マトリクスは、生体適合性材料から構成されても良い。あるいは、マトリクスは、目的の被分析物に透過性のある、第二生体適合性ポリマーにより被覆されても良い。

0116

ポリマーマトリクスの一つの機能は、フルオロフォアとクエンチャー部分をまとめ、固定し、これらの部分の間を結合可能にすることであり、同時に、被分析物との接触と、被分析物のボロン酸への結合を許す。この効果を達成するには、マトリクスは、媒体において不溶であること、またマトリクスと被分析物溶液とを結合する高表面積を確立することにより、それと近接結合することが好ましい。例えば、超薄膜、または細孔サポートマトリクスが使用されても良い。また、マトリクスは被分析物溶液において膨潤性であり、例えば、ヒドロゲルマトリクスが、水溶液系に使用される。ある場合においては、検出ポリマーは、光導管の表面などの表面に結合している、または細孔膜含浸している。すべての場合において、マトリクスは被分析物の結合部位への運搬に干渉しないことが望ましく、よって、二つの相間において平衡が確立される。超薄膜、細孔ポリマー、細孔ソルゲル、およびヒドロゲルを生成する技術は、当技術分野において確立している。有用なマトリクスのすべてが、透過性の分析物として定義されている。

0117

ヒドロゲルポリマーが本発明の実施例に好ましい。本書に使用されている用語ヒドロゲルは、実質的に膨潤するが、水に溶けないポリマーを言及する。そのようなポリマーは、線形、分岐、またはネットワークポリマー、または水溶性または浸出性分画を含まないという、規定の高分子電解質複合体であっても良い。一般的に、ヒドロゲルネットワークは、架橋結合工程により生成され、この工程は水性ポリマーで行われることにより、膨潤するか、水性媒体に溶解しない。また、水溶性ポリマーは、水膨潤性ネットワークポリマーを得るため、親水性および架橋構造単量体の混合を重合化することにより生成される。そのようなポリマーは、付加、または縮合重合、または組み合わせ工程によって形成される。これらの場合において、検出部分はネットワーク形成単量体との組み合わせによる、単量体誘導体を使用した重合によりポリマーに含まれる。または、感応性部分重合後反応を使用して既に生成されているマトリクスに結合される。前記検出部分はポリマー鎖または前記鎖に付着するペンダント基の単位である。

0118

本発明に有用なヒドロゲルは、色素とクエンチャーの両方が共有結合する、単ネットワークなどの、モノリシックポリマー、または相互貫入ネットワーク多成分ヒドロゲルでもよい。多成分ヒドロゲルには、ヒドロゲルマトリクスおよび交互マイクロレイヤー集合中の、第二のポリマーの分散を含む、水膨潤性合成物を得るために、相互貫入ネットワーク、ポリ電解質複合体、他の様々な二つ以上のポリマーのブレンドを含む。

0119

モノリシックポリマーヒドロゲルは、通常、HEMA、PEGMA、メタクリル酸、ヒドロキシエチルアクリレート、N−ビニルピロリドン、アクリルアミド、N,N’−ジメチルアクリルアミドなどのが含まれるが、これに限られない、親水性単量体の混合による、フリーラジカル重合により形成され、イオン単量体には、メタクリルイルアミノプロピルトリメチルクロライド、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド、ソジウムスルホプロピルメタクリレート等を含み、架橋剤には、エチレンジメタクリレート、PEGDMA、N,N’−メチレン−ビス−アクリルアミドトリメチルオルプロパントリアクリレートなどが含まれる。単量体の比率は、当技術分野において、よく確立された、透過性、膨潤指数、およびゲル強度を含む、ネットワーク特性を最適化するよう選択される。一実施例において、色素部分は、8−アセトキシピレン−1,3,6−N,N‘,N”−トリス(メタクリルアミドプロピルスルフォンアミド)などの、色素分子のエチレン含有不飽和誘導体に由来し、クエンチャー部分は、4−N−ベンジル−3−ボロン酸)−4‘−N’−(ベンジル−4エテニル)−ジピリジニウムジハロゲン(m−SBBV)などのエチレン含有不飽和ビオロゲンに由来しており、また、マトリクスは、HEMAおよびPEGDMAから生成される。色素濃度は、発光強度を最適化するため選択される。クエンチャー対色素の比率は、望ましい測定可能なシグナルを生成するために十分な消光を提供するよう調整される。

0120

また、モノリシックヒドロゲルは、縮合重合によって形成することが出来る。例えば、アセトキシピレントリスルフォニルクロライドは、未反応ジアミンに溶解した、トリス−(アミノPEG)付加体を得るために、PEGジアミンの余剰と反応する。余剰のトリメソイルクロライドおよび酸受容体は、ビオロゲンの酸クロライド機能性生テルを得るため、4−N−(ベンジル−3−ボロン酸)−4‘−N’−(2ヒドロキシエチル)ビピリジニウムジハロゲンに反応する。二つの反応性混合物は、互いに接触され、例えば、一つの混合物で成膜し、もう一つに浸漬することにより、ヒドロゲルを形成するため反応することを許される。

0121

本方法の条件下でボロネートエステルを形成するため、ボロン酸と反応することの出来るポリマーは、マトリクスポリマーとして好まれない。セルロース誘導体ポリマー多糖ポリビニルアルコール、およびその共重合体が含まれるが、これらに限定されない、そのようなポリマーは、1,2−またア1,3−ジヒドロキシ置換基を持つ。

0122

一つの成分に色素が含まれ、他方にクエンチャーが含まれる、多成分ヒドロゲルが、本発明のセンサーを作成するために好まれる。また、これらの系は、成分間の相互作用を高めるため、また他のポリヒドロキシ被分析物より、グルコースの選択性を提供するため、随意で、分子インプリントされる。好ましくは、多成分系は、相互貫入重合体ネットワーク(IPN)または、半相互貫入重合体ネットワーク(半IPN)である。

0123

IPNポリマーは、通常逐次重合によって生成される。先ず、クエンチャーを含むネットワークが形成される。そして、ネットワークは、色素単量体を含む単量体の混合物で膨潤され、IPNヒドロゲルを得るため第二の重合が行われる。

0124

半IPNヒドロゲルは、色素部分を含む可溶性ポリマーを、クエンチャー単量体を含む、単量体混合物に溶解し、重合することにより形成される。あるいは、可溶性クエンチャーポリマーを色素単量体に含む、単量体混合物に溶解し、混合物を重合する。いずれの場合においても、可溶性成分の分子量は、ネットワークの外に拡散できないよう、すなわち、物理的にマトリクスに結合、または閉じ込められないよう、十分高く(約10,000以上)なくてはならない。

0125

図4Aにおいて、ポリマー鎖41、42、および44の一群は、クエンチャー、例えばクエンチャーQ2を含む。第二のポリマー鎖45、46、および47の群は、色素、例えばほぼ同時または、逐次形成された色素D2を含む。ポリマーの架橋点は、48と、49として指定されている。図4Bにお低は、ポリマー鎖51、52、53、および54は、クエンチャー、例えばクエンチャーQ2を含む。色素D1は、第二ポリマー56のペンダント基にある。架橋点57が指定されている。

0126

[分子インプリント]
随意で、本発明のポリマーは、分子インプリントされる。一実施例において、有機塩は、単量体クエンチャーカチオン、および単量体色素アニオンにより形成される。そして有機塩は、モノリシックヒドロゲルマトリクスを形成するため、少なくともイオン対が部分的に結合され続けるような、条件下において、共重合される。あるいは、クエンチャー単量体は、第一のポリマーを形成するため重合され、次にアニオン色素対イオンのある高分子電解質を得るため、イオン交換される。後者は次に、イオン結合を通し、クエンチャーと結合される、相互貫入色素ポリマーを形成するため、好適な単量体と共重合される。 この組み合わせが、IPNポリマーまたは半IPMポリマーのいずれかである。別の実施例において、本発明のポリマーは、最初に、重合可能ビオロゲンボロン酸のある、グルコースのビスボロネートエステルを形成することにより、フルクトースなどの、他のポリヒドロキシ化合物に対する、グルコースの選択性を高めるため、分子インプリントされる。そしてこのエステルは、グルコースインプリントポリマーを得るため、共重合され、加水分解される。このポリマーは、次に、色素ポリマーのあるIPMを形成するために使用される。

0127

別の態様において、m−SBBVは、例えば水/ジオキサンなどの水性有機溶剤に約2:1の分子比で、グルコースと混合される。この生成ビスボロネートエステルは、真空化において、溶液を留去することにより再生される。生成物は、次に、例14に記述される手順に従い、第一のヒドロゲルを得るため、HEMAおよびPEGDMAと共重合される。そしてグルコースは、希釈塩酸中で調整することにより、ヒドロゲルから漉し出される。脱イオン水で調整した後、ヒドロゲルは例28の色素単量体と接触し、アニオン色素とカチオンクエンチャーポリマーの間に、複合体を形成する。そして、更なるHEMAとPEGDMAでの第二段階重合が、分子インプリントIPNヒドロゲルを形成するために実行される。

0128

多成分ヒドロゲルの個別成分は、同じまたは異なる重合スキームにより作られる。例えば、IPNポリマーにおいては、第一のネットワークは、フリーラジカル重合により形成され、第二のネットワークは、縮合重合により形成される。同様にして、半IPNポリマーにおいては、溶解性成分は縮合重合により形成され、ネットワークは、フリーラジカル重合によって形成される。例えばポリ4,4‘−N,N’−ビス(1,3−キシレン−5−ボロン酸)ビピリジニウムジハロンなどの、クエンチャーポリマーは、4,4’−ジピドリルを3,5−ビス−ブロモメチルフェニルボロン酸と凝縮することにより形成される。クエンチャーポリマーは、上述の8−アセトキシピレン−1,3,6−N,N’、N”−トリス(メタクリルアミドプロピルスルフォンアミド)を含む反応混合物に溶解され、溶液は半IPNヒドロゲルを得るために重合される。

0129

上述のクエンチャーポリマーは、ポリビオロゲンボロン酸の一例である。

0130

具体的な実施例においては、8−ヒドロキシピレン−1,3,6、N,N’,N”−トリス−(メトキシポリエトキシエチル(n〜125)スルホンアミド)を得るため、アセトキシピレントリスルフォニルクロライドをアミノエチルPEGモノエチルエーテルで凝縮することにより、高分子量水溶性色素が生成される。PEG色素ポリマーは、半IPNヒドロゲルを得るため、HEMA、PEGDMA、4−N−(ベンジル−3−ボロン酸)−4‘−N’−(ベンジル−4−エテニル)ジピリジニウムジハロン(m−SBBV)、水性アルコールフリーラジカル開始剤からなる混合物に溶解され、重合される。希釈塩基で加水分解し、脱イオン水でろ過した後、ヒドロゲルは、体液に露出され、また体液と平衡になるよう、分岐光ファイバー光導管に装着される。光導管は適切なフィルターと共に青色発光ダイオード(LED)光源と、電子コントローラーと関係する測定機器共に、シリコン光検出器に接続される。センサーは、体の望む場所へ挿入される、カテーテルの先端に設置される。センサーは、約475nmの光、および520nmで監視される蛍光度の光に励起される。体液中のグルコースのレベルが発光の強度から決定される。

0131

[単成分ビオロゲンセンサー]
本発明の別の実施例は、フルオロフォアに共有結合する、ボロン酸置換ビオロゲンである。遊離化合物としての単成分ビオロゲンセンサーの例は、実施例39として示されている。好ましくは、付加体は重合可能化合物、またはポリマーの一単位である。そのような付加体の一つは、先ず、ベンジル−3−ボロン酸基を一つの窒素と、またアミノエチル基ともう一方を付着させることにより、4,4‘−ジピドリルから非対称ビオロゲンを形成することにより生成される。ビオロゲンは、プリポリマー混合物を得るため、順次に、先ず8−アセトキシピレン−1,3,6−トリスルフォニルクロライドを1:1のモル比で、次に余剰PEGジアミンの反応によって凝縮される。すべての酸受容体は、副生成物酸を除去するために、両方の工程に含まれる。プレポリマー混合物は、ヒドロゲルを得るため、ポリイソシアネートと反応させることによって架橋結合される。生成物は、保護基を取り除くため、塩基で処理される。不完全反応性生物、および未反応開始物は、更なる使用の前に、脱イオン水で完全抽出することにより、ヒドロゲルからろ過することが出来る。生成物は、本書に記述されるとおり、検出成分として使用される場合、グルコースに反応する。

0132

あるいは、前記付加体は、エチレン含有不飽和単量体、例えばジメチルビス‐ブロモメチルベンゼンボロネートで、半ビオロゲン付加体を形成するために余剰4,4−ジピリドリルと反応される。余剰ジピリドリルを取り除いた後、付加体はさらにブロモエチレンアミドヒドロクロライドの余剰と反応され、ビス‐ビオロゲン付加体を生成する。この付加体は、酸受容体の存在下で、1:1のモル比で、8−アセトキシピレントリスルフォニルクロライドと反応し、その後、余剰アミノプロピルメタクリルアミドと反応することにより、ピラニン色素に結合される。最後に、いずれの残留アミノ基はメタクリルクロライドと反応される。精製後、色素/ビオロゲン単量体は、ヒドロゲルを得るため、HEMAとPEGDMAと共重合化される。

0133

このビオロゲンの一群の利点の一つは、色素とクエンチャーが、共有結合により、近接していることで(すなわち、結合可能な構造に固定されて)、感度の上昇につながることがある。欠点は、これらの付加体を作ることは、困難な合成の課題で、組成の変更の実施が難しいことである。生成物の特性化と精製は同様に困難である。よって、色素とクエンチャーが独立した構成要素である、実施例が好ましい。本書に記載された成分の組み合わせは、生理液中のポリヒドロキシ置換有機分子の決定のための装置を生成する。

0134

[グルコースの解析のバッチ光学法]
測定は従来発光分光計によって実施される。本発明の色素とクエンチャーを含む溶液は、pH=7.4に緩衝され、生成され、クベットに搭載される。使用される色素に好適な波長の光でサンプルは励起され、蛍光強度が測定される。定量の未知のグルコースが含まれる溶液が、前記溶液に追加され、測定が繰り返される。グルコース溶液標準系を測定し、濃度の関数として、強度が変化するごとに結果をプロットすることにより、個別に決定された校正曲線に参照することによって、強度の変化がグルコース濃度の計算に使用される。この方法においては、検出成分は試験のときにだけ安定する必要があり、グルコースと反応は可逆的ある必要がない。

0135

プロセスストリーム解析の光学的方法]
蛍光分光計のために、貫流セルが作製される。一方の面が励起光に、他方がプロセスストリームにさらされるように、検出ポリマーがセルに取り付けられる。グルコースの無いプロセスストリームをセルを通して通過し、蛍光の安定状態を測定することによって、ベースラインを確立する。そしてプロセスストリームは、セルを通して通過され、時間の関数として蛍光強度が監視される。グルコース濃度は、上述のとおり構成曲線を参照することにより決定される。この方法においては、センサーは動作の間にわたり安定していなければならず、またグルコースとの反応も可逆的でなくてはならない。検出部分は、固定されなければならず、プロセスストリームに浸出してはならない。

0136

装置設定
図8は、一回、または継続的な糖質、すなわちグルコースの監視に使用される装置の概略図である。色素を含み、クエンチされた、検出ポリマー81は、オプショナルサポート82に付着されてもよい。いくつかの実施例においては、随意半透過性ポリマー膜83が存在する。他の適用においては、最適生体適合被膜83Bに集合体を被覆することが有用な場合がある。光源84は、光学フィルター88から、光ファイバー86を通し検知ポリマー81に接続されている。検出器87は、光フィルターをから、検出ポリマー81に接続する光ファイバー89に接続されている。光源84および検出器87双方とも、電子制御器90に接続されている。光ファイバーは、とりわけ光源によって随意である。よって、系は、生理液中のグルコース含有量に基づき、検知ポリマーの変化を検出できる。装置は、図9および10に示されるとおり、プロセスストリームにおいて、およびインビボ埋め込み及び監視に有用である。図9は、光学機器を示す。図10は、プローブの断面図である。図9では、光源11(可視)が光ファイバー12によって活性セル13に接続されている。半透過性膜14は、被分析物がセル13から自由に出入りすることを可能にする。光ファイバー15は、変化した光をフィルター16と、分析を行うための被分析物スペクトルを生成するため、随意の光電子増倍管17に運搬する。

0137

図9、および10に示すように、セル13は、解析の条件化で、セル13にポリマー21、色素22、およびクエンチャー23の混合物が維持されるように、選択的透過性膜を含む。光は、光ファイバー12を通して進入する。セルの14Aの活性部分の中で、選択的にセルに侵入した、ポリマー21、色素22およびクエンチャー33、接触被分析物24が、スペクトルに量的で、再現可能な変化をもたらす。 この変更された光シグナルは、解析のため、光電子増倍管17まで光ファイバー15を進行する。当業者は、本発明の検知部分が当該技術分野で公知の、他の埋め込み可能蛍光検知装置においてしようできることを認識するであろう。クエンチャー、フルオロフォアの成分、および被分析物透過成分(マトリクスとしても知られる)は、本文および、請求項に記載されている。これらすべては、本明細書に参照することにより、組み込まれる。
[実験項]

0138

特に言及がない限り、市販されている試薬および溶媒を使用した(年1回公表されているChem Sources USAを参照のこと)。

0139

以下実施例について説明するが、これらは具体例として記載されているだけであって、本発明がこれらいずれかの手段、方法に限定されるわけではない。

0140

[手順A]
蛍光色素を用いたメチルビオロゲンの見かけのスターンウォリメル(Stern−Volmer)クエンチング定数の蛍光分光分析

0141

見かけのスターンウォリメル(Stern−Volmer)クエンチング定数は、クエンチ濃度(M)に対する相対的蛍光強度(Fo/F)のスターンウォリメルプロットのスロープに由来している(J.R. Lakowicz, (1999) Principles of Fluorescence Spectroscopy Second Edition, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, pp. 237−289を参照のこと)。当業者は通常、目的とする特定の溶媒中で、蛍光色素/クエンチペアー(quenched pair)のために本分析を実行することができる。この一般的なスターンウォリメル分析は、0.1イオン強度pH7.4リン酸緩衝液中で、スターンウォリメルクエンチング定数を決定するために使用される。

0142

濃度クエンチング効果を避けるため、色素の濃度は一般的に、励起λmax<0.5吸収単位で、色素の光学密度になるように調整される。一度所望の色素濃度が決定されると、ストック色素溶液は、最終計測において濃度が所望の濃度の5倍より大きくなるように調製される。例えば、励起λmax<0.5吸収単位の光学密度を与える所望の最終濃度が1×10−5Mである色素は通常、濃度が5×10−5Mである原液を必要とする。

0143

上述のように一旦決定されると、適切な濃度を有する10mLの色素原液は、色素の適切な質量を測ること、および10mLの容量分析フラスコ中に固体を配置することによって作られる。そして、そのフラスコは、0.1イオン強度pH7.4リン酸緩衝液を用いて、10mLマークのところまで満たされる。

0144

メチルビオロゲンの原液(25 mL, 0.0025 M)は、10mLの容量分析フラスコ中で、pH7.4リン酸緩衝液(0.1イオン強度)を用いて調製される。メチルビオロゲンを含む7つの異なる溶液は、下記の表1で示されるようにpH7.4リン酸緩衝液中で調製される。

0145

各サンプルは、対応色素に対する適切な励起波長および適切な放出波長の範囲でセットされた発光分光計で順番に分析された。機器セッティングスリット幅スキャンスピード、光学フィルター、励起波長、放出波長範囲)は、一連サンプル分析を通して一定に保たれた。放出蛍光強度は、台形規則近似法(trapezoidal rule approximation method)によって放出波長範囲を超える蛍光強度の積分として決定された。積算値はY軸上にプロットされ、クエンチ濃度はX軸上にプロットされ、その結果生じたラインのスロープは、スターンウォリメルクエンチング定数として、直線回帰によって計算された。当業者は、スターンウォリメルクプロットは直線関係を生じることはないというクエンチングメカニズムに基づいていることを理解するだろう。しかしながら、当業者によって知られ、理解されている適切な数学的関係の使用を通じて、見かけのスターンウォリメルククエンチング定数は、計算され、そして比較として使用される。

0146

[調製A]
ジメチル−(4−ブロモメチル)ベンゼンボロナートの合成

0147

炉で乾燥した100mLの丸底フラスコアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、(4−ブロモメチル)ベンゼンボロン酸(12.49mmols, 2.684 g)を仕込んだ。そのフラスコをセプタム密閉し、ペンタン(55mL)を仕込んだ。そして、懸濁液を室温にて撹拌し、新たに蒸留したCH3OH(3.16g,4mL、97mmols)を加え、溶液はすぐに浄化された。20分間の撹拌後、溶液はMgSO4を用いて乾燥され、さらにCaCl2で乾燥された(余分なCH3OHを取り除くため)。ガラスフリット漏斗(glass−fritted funnel)(中型)を通して、アルゴン下、浮遊物カニューレを挿入し、ペンタンを真空内で除去した。残った黄色状油を、さらに減圧下(0.1torr、1時間)で乾燥した。収率:1.6g,6.59mmols(56%)。1H−NMR(CD3OD,ppm):4.5 (s,2H),7.4(d,2H),7.55(d,2H).11B−NMR(CH3OH, ppm):29(s)。類似の手順が、対応する2−および3−異性体を調製するために使用された。生成物は、実施例1−3、5および6のボロン酸ビオロゲン化合物を作るために使用された。

0148

[調製B]
8−アセトキシピレン−1,3,6−トリスルホニルクロライドの合成

0149

トリナトリウム−8−アセトキシピレン−1,3,6−トリスルホナート(アセトキシ−HPTS、11.33 g、20 mmol)を30mLのチオニルクロライドに懸濁し、5滴のジメチルホルムアミドを加えた。懸濁液が色溶液になるまで3時間懸濁液を還流した。そして、その反応溶液アルゴン雰囲気下25℃まで冷却した。チオニルクロライドを真空下(2 Torr)蒸留し、黄色状残渣を得た。黄色状残渣を、ジクロロメタン(60mL)とともに、3つに分かれた遠心分離管に移した。そして、懸濁液を遠心分離し、浮遊物溶液を乾燥丸底フラスコに移した。遠心分離管に残った残渣を、10mLのジクロロメタンで追加的に4回洗浄した。浮遊物溶液を混ぜ、アルゴン雰囲気下一晩放置すると、沈殿物が観察された。大量の黄色状固体沈殿物の原因であるペンタン(250mL)に、ジクロロメタンを加えた。浮遊物を両頭針で取り除き、黄色状固体を高真空(0.2 Torr)で乾燥した。収率: 8.62 g, 15.5 mmol (78 %)。



この生成物は、実施例7,9,13,14および15で使用された。

0150

[調製C]
4−(4−ピリジル)−N−(ベンジル−4−エテニル)ピリジニウムクロライドの合成

0151

炉で乾燥した100mLの丸底フラスコをアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、4,4’−ジピリジル(12.50 g, 80 mmols)を仕込んだ。フラスコをセプタムで密閉し、CH3OH(20mL)を仕込んだ。4−(クロロメチルスチレン(2.82 mL, 20 mmols)をシリンジを用いて滴下して加えながら、均一溶液を室温にて撹拌した。室温にて48時間撹拌した後、溶媒を真空下にて除去した。無水テトラヒドロフラン(50 mL)をカニューレ経由で反応フラスコに加え、撹拌するのを止め、固体が安定することを可能とし、できる限りカニューレで溶媒を除去し、混合物は3日間硬くなった。各混合時間を24時間まで減らして、この工程を2回以上繰り返した。3番目粉砕後、混合物を窒素下にてろ過し、カニューレ経由で無水ジエチルエーテル(200mL)で洗浄した。そして、1時間減圧下にて固形物ドライ窒素を通し、最後に真空下(0.1 Torr, 1時間)に置くことによって固形物を乾燥した。収率:5.56 g, 18 mmols (90%)。



この化合物は、実施例5および6にて使用された。

0152

[調製D]
N−ベンジル−4−エテニル−4,7−フェナントロリニウムクライド(4,7−フェンSV)の合成

0153

炎で乾燥した、100mL枝付丸底フラスコに磁気撹拌子を取り付け、アルゴン下にて冷却し、4,7−フェナントロリン(2.14 g, 1 1.86 mmols)を仕込んだ。そのフラスコにアルゴン(g)ラインに取り付けられた還流コンデンサーを取り付け、フラスコの枝から(クロロメチル)スチレン(0.905 g, 0.836 mL, 5.93 mmols)および無水CH3CN (20 mL)を仕込んだ。反応溶液を17時間アルゴン(g)下にて還流のため加熱した後、室温まで冷却し、ジエチルエーテル(30 mL)を用いて固形物を沈殿させた。縣濁液を安定させた後、カニューレを通して浮遊物を除去した。残った残渣を溶媒(15mL)を用いてカニューレを通して遠心分離管へ移し、アセトン(20mL)を用いて粉砕し、遠心分離した(この工程は4回繰り返された)。茶色がかったピンク色の固体をジエチルエーテル(3×20mL)を用いて粉砕し、減圧下にて乾燥した。収率0.376 g, 1.13 mmols (19%)。

0154

この化合物は、実施例25で使用された。

0155

[実施例1]
4,4’−N,N’−ビス(ベンジル−3−ボロン酸)ジピリジニウムジブマイドの合成

0156

炉で乾燥した50mLの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、4,4’−ビピリジル(0.469g,3mmols)を仕込んだ。遠心分離管をセプタムで密閉し、CH3OH(7mL)を仕込んだ。そして、新たに調製したジメチル−(3−ブロモメチル)ベンゼンボロナート(1.82g,7.5mmols)をシリンジを用いて仕込んだ均一溶液に加えながら、室温で撹拌した。15時間溶液を撹拌した後、反応容器を遠心分離し(3200RPMで4分間)、CH3OHをカニューレを用いて別のフラスコに移した。残った黄色状の固体を、アセトン:水(24:1,V/V,25mL)を用いて粉砕し、ボルテックスミキサーで強く撹拌し、遠心分離した。カニューレを用いてアセトン溶液を取り除き、粉砕工程を2回以上繰り返した。そして、その固体を前記と同じ工程でジエチルエーテルを用いて粉砕した。遠心分離管中で薄黄色の固体を高圧下(0.6torr,2時間)で乾燥した。収率:0.956g、1.63mmols(54%)。MP:分解>230℃。

0157

この化合物を、下記の実施例16〜18および図6で使用した。

0158

[実施例2]
4,4’−N,N’−ビス(ベンジル−4−ボロン酸)ジピリジニウムジブロマイドの合成

0159

炉で乾燥した50mLの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、4,4’−ジピリジル(0.234 g, 1.5 mmols)を仕込んだ。遠心分離管をセプタムで密閉し、無水CH3OH(7mL)を仕込んだ。そして、新たに調製したジメチル−(4−ブロモメチル)ベンゼンボロナート(l .09 g, 4.5 mmols)をシリンジを用いて仕込んだ均一溶液に加えながら、室温で撹拌した。15時間溶液を撹拌した後、反応容器を遠心分離し(3200RPMで4分間)、CH3OHをカニューレを用いて別のフラスコに移した。残った黄色状の固体を、アセトン:水(24:1,V/V,25mL)を用いて粉砕し、ボルテックスミキサーで強く撹拌し、遠心分離した。カニューレを用いてアセトン溶液を取り除き、粉砕工程を2回以上繰り返した。そして、その固体を前記と同じ工程でジエチルエーテルを用いて粉砕した。遠心分離管中で薄黄色の固体を減圧下(0.6torr,2時間)で乾燥した。収率:0.723 g, 1.63 mmols (82%)。MP:230℃より大きい分解。



実施例17および18、図6を参照。

0160

[実施例3]
4,4’−N,N’−ビス(ベンジル−2−ボロン酸)ジピリジニウムジブロマイドの合成

0161

(a) 炉で乾燥した50mLの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、4,4’−ビピリジル(1.5 mmol, 0.234 g)を仕込んだ。遠心分離管をセプタムで密閉し、CH3OH(7mL)を仕込んだ。均一溶液を混合しながら、室温で撹拌した。新たに調製したジメチル−(2−ブロモメチル)ベンゼンボロナート(4.5 mmols, 1.2 mL, 1.09 g)をシリンジを用いて反応管に加え、生じた茶色/オレンジ色の溶液を15時間室温(周囲の)で撹拌した。そして、反応容器を遠心分離し(3200RPMで4分間)、CH3OHをカニューレを用いて別のフラスコに移した。残った黄色状の固体を、ジエチルエーテル(25mL)を用いて粉砕し、ボルテックスミキサーで強く撹拌し、遠心分離した。カニューレを用いてエーテル溶液を取り除き、粉砕工程を3回以上繰り返した。遠心分離管中で薄黄色の固体を減圧下(0.6torr,2時間)で乾燥した。収率は70%であった。

0162

この化合物は、実施例8の色素の蛍光を消し、グルコースに応答するために検出された。実施例17を参照。

0163

[実施例4]
1, 7−N,N’−ビス(ベンジル−3−ボロン酸)フェナントロリニウムジブロマイドの合成

0164

炉で乾燥した50mLの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、1,7−フェナントロリン(0.288 g, 1.6 mmols)を仕込んだ。遠心分離管をセプタムで密閉し、CH3OH(4mL)を仕込んだ。そして、新たに調製したジメチル−(3−ブロモメチル)ベンゼンボロナート(0.972 g, 4 mmols)をシリンジを用いて加えた。その均一溶液を15時間室温で撹拌し、2時間還流を行った。反応混合物をアルゴン下で室温まで冷却し、真空下でCH3OHを除去した。黄色/オレンジ色の固体を、アセトン:水(40mL, 24:1, V/V)を用いて、さらにジエチルエーテル(2×40mL)を用いて一晩かけて粉砕した。その縣濁液をガラスフリット付漏斗(中型)を通してろ過し、アルゴン下で固体を単離した。収率:0.495g, 0.812 mmols(51%)。MP:>230℃。

0165

この化合物は、実施例8の色素の蛍光を消し、グルコースに応答するために検出された。

0166

[実施例5]
4−N−(ベンジル−4−ボロン酸)−4’−N’−(ベンジル−4−エテニル)ジピリジニウムブロマイドクロライド(P−SBBV)の合成炉で乾燥した50mLの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、4−(4−ピリジル)−N−(ベンジル−4−エテニル)ピリジニウムクロライド (0.463 g, 1.5 mmols)を仕込んだ。遠心分離管をセプタムで密閉し、アセトニトリル(6mL)を仕込んだ。生じたピンク色/オレンジ色の縣濁液に、新たに調製したジメチル−(4−ブロモメチル)ベンゼンボロナート(0.486 g, 2 mmols)をシリンジを用いて加えながら、室温で撹拌した。懸濁液を23時間撹拌した後、反応容器を遠心分離し(3200RPMで4分間)、アセトニトリルをカニューレを用いて別のフラスコに移した。残った黄色状の固体を、アセトン:水(24:1,V/V,25mL)を用いて粉砕し、ボルテックスミキサーで強く撹拌し、遠心分離した。カニューレを用いてアセトン溶液を取り除き、粉砕工程を2回以上繰り返した。そして、その固体を前記と同じ工程でジエチルエーテルを用いて粉砕した。遠心分離管中ではっきりとした黄色の固体を減圧下(0.5torr,1時間)で乾燥した。収率:0.431 g, 0.824 mmols (55%)。MP: > 200℃。

0167

この化合物は、実施例8の色素の蛍光を消し、グルコースに応答するために検出された。

0168

[実施例6]
4−N−(ベンジル−3−ボロン酸)−4’−N’−(ベンジル−4−エテニル)ジピリジニウムブロマイドクロライド(M−SBBV)の合成

0169

炉で乾燥した50mLの遠心分離管をアルゴン下で冷却し、磁気撹拌子を取り付け、4−(4−ピリジル)−N−(ベンジル−4−エテニル)ピリジニウムクロライド(0.463 g, 1.5 mmols)を仕込んだ。遠心分離管をセプタムで密閉し、アセトニトリル(6mL)を仕込んだ。生じたピンク色/オレンジ色の縣濁液に、新たに調製したジメチル−(3−ブロモメチル)ベンゼンボロナート(0.486 g, 2 mmols)をシリンジを用いて加えながら、室温で撹拌した。懸濁液を23時間撹拌した後、反応容器を遠心分離し(3200RPMで4分間)、アセトニトリルをカニューレを用いて別のフラスコに移した。残った黄色状の固体を、アセトン:水(24:1,V/V,25mL)を用いて粉砕し、ボルテックスミキサーで強く撹拌し、一晩放置した。カニューレを用いてアセトン溶液を取り除き、ジエチルエーテル(3×25mL)を用いて固体を粉砕した;粉砕ごとにカニューレを用いて除去を行った。遠心分離管中ではっきりとした黄色の固体を減圧下(0.015torr,3時間)で乾燥した。収率:0.584g, 1.12 mmols (74%)。MP:150℃より大きい分解。

0170

この化合物は、実施例10、11、12および14のポリマーを合成するために使用された。

0171

[実施例7]
8−アセトキシピレン− 1,3,6−N, N’, N” −トリス− (メトキシポリエトキシエチル(N〜125)スルホンアミド) の合成

0172

250mL丸底フラスコに磁気撹拌子を取り付け、170mLの無水テトラヒドロフラン(THF)を仕込んだ。メトキシ−ポリエチレングリコール(PEG)−アミン(5.65 g, 5630 g/mol, 1 mmol)を0.5gの粒状のCaH2と共にフラスコに加えた。その混合物を30℃で24時間撹拌しながら加熱した。ジイソプロピルエチルアミン(0.6 mL, 129.24 MW、 0.742 g/mL, 3.4 mmol)をフラスコに加え、さらに混合物を1時間撹拌した。フラスコを室温まで冷やし、空気に敏感なガラス溶解フィルター器具を通してろ過し、余分なCaH2とCa(OH)2を除去した。磁気撹拌子を有する250mL丸底フラスコにTHF溶液を加え、撹拌しながら30℃まで加熱した。8−アセトキシピレン− 1,3,6−トリスルホニルクロライド(0. 185 g, 624.8 g/mol, 0.3 mmol)を暖めたTHF溶液に加えた。溶液はすぐに深い青色に変化し、15分以上赤ワイン色に一時的に変化した。反応は30℃で24時間撹拌して行われた。溶媒をロータリーエバポレーションによって除去し、残渣を100mLの1 M HClで溶解した。メチレンクロライド(3 x 100 mL)を用いて水溶液を抽出した。メチレンクロライドのフラクションを混ぜ、減圧エバポレーションによって溶媒を除去し、赤色の固体である化合物を得た。収率: 約5.5 g (〜97%)



この化合物は、実施例8、11、16および17で使用された。

0173

[実施例8]
8−ヒドロキシピレン− 1,3,6−N, N’, N” −トリス− (メトキシポリエトキシエチル(N〜125)スルホンアミド)

0174

8−アセトキシピレン− 1,3,6−N, N’, N−トリス− (メトキシポリエトキシエチル(n〜125)スルホンアミド) (5.5 g, 0.32 mmols)を、100mLの1 M NaOHに溶かし、2時間撹拌した。その水溶液をpH7まで中和し、メチレンクロライド(3 x 100 mL)を用いて抽出した。メチレンクロライドのフラクションを混ぜ、ロータリーエバポレーションによって約10mLまで還元した。濃縮されたメチレンクロライド溶液を、Erlenmeyerフラスコ中で強く撹拌されているジエチルエーテル(400mL)中に滴下して加えた。ジエチルエーテルをBuchner漏斗を使用してろ過した。生成物は、オレンジパウダーとして単離された。収率5.425 g, 0.31 mmol (94%)。FTIR (KBペレット, cm−1): 842, 963, 1060, 1110, 1150, 1242, 1281, 1343, 1360, 1468, 2888。この化合物は、Fourier Transform Infrared (FTIR)を用いて三置換スルホンアミド誘導体として同定された。スルホニックアシッドIRストレッチは、1195.7 cm−1で生じる。この化合物のFTIRでは、1195.7 cm−1ストレッチは存在していない。代わりに、スルホンアミドに割り当てられる1110 cm−1ストレッチが観察されている。pH 7.4リン酸緩衝液中に溶かしたとき、この化合物の蛍光は、319M−1の見かけのスターンウォリメルクエンチング定数を有するメチルビオロゲンによってクエンチされている。

0175

これは、実施例1,2および3の生成物によってクエンチされ、実施例11、16、17,18および19で使用された。

0176

[実施例9]
8−アセトキシピレン− 1,3,6−N, N’, N” −トリス− (メタクリルアミドプロピルスルホンアミド) (アセトキシ−HPTS−MA)

0177

100mLの丸底フラスコにアミノプロピル−3−メタクリルアミドHCl塩(2.68 g, 15 mmol)と50mLのアセトニトリルを仕込み、白色懸濁液を得た。そして、白色懸濁液の2層が消えるまで撹拌しながら水を滴下して加えた。炭酸カリウムを加え、懸濁液を15分撹拌した。浮遊物を500mL丸底フラスコに移し、炭酸カリウムを50mLのアセトニトリルで洗浄し、その500mL丸底フラスコ中で混合した。アセトキシ−HPTS−Cl (1.03 g, 1.8 mmol)の黄色溶液、200mLのアセトニトリルおよび20mLのジクロロメタンを、沈殿物形成と共に深い赤色に変化する溶液を生じるアセトニトリル中の遊離アミンを含む500mL丸底フラスコ中にアルゴン下で加えた。その溶液を1時間撹拌し、浮遊物を移し、真空下にて濃縮し、暗い残渣を得た。この残渣を水(1000 mL)と50:50アセトニトリル/酢酸エチル溶液(700 mL)で抽出した。有機抽出液を水(1000 mL)で洗浄した。有機抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥し、ロータリーエバポレーターで濃縮して赤色残渣を得、その残渣をメタノールに溶かした。そのメタノール溶液を濃縮し、生じた赤色残渣を高真空下にて乾燥し、保護されていないHPTS−MAである赤色固体を得た。収率: 420 mg, 0.5 mmol, 28 %。



保護されていないHPTS−MA(100 mg, 0. 1 mmol)を10mLの無水酢酸に懸濁し、触媒量の酢酸ナトリウムを加え、2時間還流した。無水酢酸と酢酸を真空下にて除去し、生じた茶色残渣を20mLのアセトニトリルで抽出した。抽出液を150mLのジエチルエーテルに滴下し、茶色固体の沈殿物を得た。収率: 75 mg, 0.09 mmol (86 %)。

0178

この単量体は、実施例13、14および15で使用された。

0179

[実施例10]
4−N−(ベンジル−3−ボロン酸)−4’−N’−(ベンジル−4−エテニル)ジピリジニウムブロマイドクロライドと水溶性ポリマーの共重合

0180

50mLコーン型丸底フラスコに、2−ヒドロキシエチルメタクリレート(1.5Og, 11.5 mmols)と4−N−(ベンジル−3−ボロン酸)−4’−N−(ベンジル−4−エテニル)ジピリジニウムブロマイドクロライド(0. 1 g, 0. 191 mmols)と、3−((メタクリロイルアミノ)プロピル))トリメチルアンモニウムクロライド (0.50 g, 2.27 mmols)を仕込んだ。フラスコをセプタムで密封した後、溶液をボルテックスミキサーで強く撹拌した。そして、その容器イソプロピルアルコール:水(8 mL, 1:1, V/V)を加え、1時間アルゴンで酸素を除去した。同時に、別の100mL枝付丸底フラスコで、イソプロピルアルコール:水(5 mL)中に2,2’アゾビスイソブチロニトリルAIBN, 100 mg, 0.609 mmols)を調製した。そのフラスコに磁気撹拌子とコンデンサーを取り付け、1時間アルゴンで酸素を除去した。すべてのマノメータ溶液をシリンジで取り除き、その1mLをフラスコの枝からAIBN溶液に加えた。AIBN反応容器を70℃オイルバス中に設置し、残ったマノメータ混合物を6時間以上かけてシリンジポンプで加えた(1.5 mL/1時間)。生じたオレンジ色溶液をアルゴン下で室温まで冷やし、溶媒を真空化で慎重に取り除いた。非晶質固体をCH3OH (20 mL)中に溶かし、カニューレを通して定量的に遠心分離管に移した。ジエチルエーテル(20 mL)の添加と白色沈殿物の形成後、生成物を遠心分離(3200 RPMで4分間)で単離した。それをジエチルエーテル(30 mL)で洗浄し、減圧下(0.5 torr、3時間)で乾燥し、不活性ガスアルゴン下で単離した。収率: 1.345g, (67 Wt %)。ポリマーに取り込まれたビオロゲン部位の量はUV吸収を用いて決定され、それは期待値の99%より大きい値であった。

0181

この生成物は、実施例19で使用された。

0182

[実施例11]
EMI−IPN: HPTS−PEGを使用した4−N−(ベンジル−3−ボロン酸)−4’−N−(ベンジル−4−エテニル)ジピリジニウムブロマイドクロライドの薄膜共重合

0183

10mL容積測定フラスコに、2−ヒドロキシエチルメタクリレート(3.525 g, 27.08 mmols), 4−N−(ベンジル−3−ボロン酸)−4’−N’−(ベンジル−4−エテニル)ジピリジニウムブロマイドクロライド(0.039 g, 0.075 mmols), 3−((メタクリロイルアミノ)プロピル)トリメチルアンモニウムクロライド (0.3 g, 1.36 mmols),ポリエチレングリコールジメタクリレート(1.11 g, 1. 11 mmols), 2,2’−アゾビス(2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパンジヒドロクロライド(0.025 g, 0.077 mmols)および8−ヒドロキシピレン−1,3,6−N, N’, N”−トリス−(メトキシポリエトキシエチル(n〜125)スルホンアミド) (0.013 g, 7.5 x 10−4 mmols)を仕込んだ;それをイソプロピルアルコール:水(1:1, V/V)を用いて10mLの目盛りまで満たした。その溶液をボルテックスミキサーで強く撹拌した後、ピペットで50mLコーン型丸底フラスコに移し、1時間アルゴンで酸素を除去した。単量体溶液をシリンジで取り出し、そのシリンジを重合チャンバーに取り付けた。そして、溶液をアルゴン下セルへ挿入し、セルの空洞全体を満たした。チャンバーテフロン登録商標)(Teflon(登録商標))(栓で密封し、2つのZIPLOC (登録商標)冷凍用バッグで包んだ。全ユニットを40℃のウォーターバス中に沈め、17時間加熱した。共重合チャンバーをバスとバッグから取り除き、続いて薄い緑色の高分子フィルムを提供するために分解した。その高分子フィルムを濾し、pH 7.4リン酸緩衝液中に保存した。この生成物は、実施例12で使用された。

0184

重合チャンバーは、(1)IRセル保持部材:セルおよびLUERLOCポートを含むために形作られた2つのステンレススチールプレート;(2)セル:トッププレートスペーサを通じて開けられた穴を有し、その間にTEFLON(登録商標) 0.02”スペーサを含む2つのガラスプレート;および(3)ガスケット:セル保持部材に対してセルをしっかり閉じるために使用される、正確にカットされたゴム状スペーサ、から成る。

0185

[実施例12]
HPTS−PEGを使用する4−N−(ベンジル−3−ボロン酸)−4’−N’−(ベンジル−4−エテニル)ジピリジニウムブロマイドクロライドのSEMI−IPN共重合の蛍光分光分析

0186

両側面に開口部を有する、10mm経路長、5mLガラスクベットに、2つの使い捨てポリエチレンクベットキャップを取り付けた。10/32スタンダード糸の糸、1/8” I.D.ホースエンドアダプターが箇所にねじ込まれるように、キャップを通じた穴を開けた。そして、薄いプラスチックシートを35 x 9 mmの長方形切り、窓6 x 15 mmを中心に切り取った。クベットの箇所中のポリマーを保持するためのプラスチックマスクに圧力をかけるための小さなセプタムから2つの接続部材を構成した。セプタムの高さは9 mmとした。窓を有するフィルムを効果的に形成するそれ上に、直接的にポリマーフィルムをクベットとプラスチックマスクの中心に配置できるように、貫流セルを組み立てた。そして、圧縮接続部材をピンセットを使用し、位置に置いた。1つはセルの底で、1つは頂上部である。クベット内部にあるクベットキャップの外壁を、真空グリースでコートし、セルを閉じるためにクベット内に挿入した。前方表面アダプターを取り付けたPerkin−Elmer LS50B分光光度計中にセルを置いた。ポリマーに接しているその側面が機器(前方表面アダプター中の第一面)の励起ビームに面するようにセルを配置した。1/8” TYGONPTFE管を貫流セルのホースアダプターに接続した。放出検出器がポリマーの表面だけをセンシングできるように前方表面アダプターの配置を最適化した。1分間に30mLの割合でセルを通してpH 7.4リン酸緩衝液中(イオン強度0.1)を循環させるように蠕動{ぜんどう}ポンプを使用した。2秒間の積分時間に対する10秒間ごとの蛍光強度読み取りを実行するためにPerkin−Elmer LS50Bソフトウェアタイムドライブ機能を使用した。励起波長を475 nmにセットし、放出スリット幅を536 nmにセットした。励起および放出スリット幅を2.5 nmにセットした。358(蛍光強度)のベースライン値緩衝液と共に規定した。蠕動{ぜんどう}ポンプを止め、ポンプ溶液をpH 7.4リン酸緩衝液中の1800 mg/dlグルコースに変更した。

0187

蛍光強度は、35%シグナル増加に対応する485 の値まで127 単位増加した(S/N比率= 72)。緩衝液に変更した後、シグナルは期待値であるベースライン値358に近づいた。

0188

[実施例13]
8−ヒドロキシピレン−l,3,6−N, N’, N”−トリス(メタクリルアミドプロピルスルホンアミド) ヒドロゲルポリマー

0189

雌14/20底ガラス結合部(female 14/20 ground glass joint)を用いて改善された16−mm NMRに、イソプロピルアルコール/水(1:1, 1.5 mL)、HEMA (750 mg)、ポリエチレングリコールジメタクリレート(PEGDMA, n〜25) (200mg)、3−(メタクリルアミド)プロピルトリメチルアンモニウムクロライド(TMAC) (50 mg), 8−アセトキシピレン−l,3,6−N, N’, N”−トリス(メタクリルアミドプロピルスルホンアミド) (アセトキシ−HPTS−MA) (1 mg, 1.2 x 10−6 mols)および (2,2’−アゾビス−2(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン)ヒドロクロライド (VA−044フリーラジカル開始剤) (5 mg)の混合物を仕込んだ。すべての固体をボルテックスミキサーで溶解した。雄14/20底ガラス結合部(male 14/20 ground glass joint )TEFLON(登録商標)ストップコックを用いて、NMRチューブ真空アダプターに取り付けた。そして、4冷凍/ポンプ/解凍サイクル(−78℃, 1 torr, 5分間)で混合物の酸素を除去し、窒素下にて解かした。NMRチューブをウォーターバス中で40℃(12時間0.5℃)で加熱した。ガラスNMRチューブは、ポリマープラグ開放するため、慎重に壊された。トリエチルアミン(5滴)を含む脱イオン化水200mLでポリマーを透析し(脱イオン化水およびアミン溶液は、24時間ごと、7日間変えられた)、アセトキシ−HPTS−MAのアセトキシ保護基を除去した。生じたポリマープラグを薄さ約5mmにカットして、蛍光分光法によって分析した。

0190

ゲルの励起および放出スペクトルは実質的にPEG付加物(実施例12)に対して得られたスペクトルと同一である。pH 7.4リン酸緩衝液中に懸濁されたポリマーゲルのサンプルについて、日中実験したときには、蛍光発光を見ることができた。m−SBBV, o−SBBVあるいはp−SBBVが水相に加えられたとき、蛍光発光は著しく消えた。グルコースが溶液に加えられたときには、蛍光発光は回復した。色素濃度0.05〜5 mg/gのポリマー(乾燥重量)を用いて類似のゲルを調製した。すべて黄色−緑色からオレンジ色であり、日光中(自然光)で実験したときには蛍光を観察することができた。

0191

ヒドロゲルを水性o−、m−, あるいはp−BBV(ベンジルボロン酸ビオロゲン)にさらしたときには、蛍光発光はクエンチされた。

0192

[実施例14]
IPN:HPTS−MAポリマーを使用した4−N−(ベンジル−3−ボロン酸)−4’−N’−(ベンジル−4−エテニル)−ジピリジニウムブロマイドクロライドの共重合

0193

マノメータクエンチ溶液:10mL容積測定フラスコに、2−ヒドロキシエチルメタクリレート(27.08 mmols, 3.525 g), 4−N−(ベンジル−3−ボロン酸)−4’−N’(ベンジル−4−エテニル)ジピリジニウムブロマイドクロライド(0.197 mmols, 0.103 g), 3((メタクリロイルアミノ)プロピル)トリメチルアンモニウムクロライド(1.36 mmols, 0.30 g),ポリエチレングリコールジメタクリレート(1. 11 mmols, 1. 11 g)および2,2’−アゾビス(2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン)ジヒドロクロライド(0.077 mmols, 0.025 g)を仕込んだ;そのフラスコをイソプロピルアルコール/水(1 : 1 , V/V)で10mL目盛りのところまで満たした。その溶液が均一になるまで、ボルテックスミキサーで強く撹拌した。

0194

高分子色素粉末:10mL容積測定フラスコに、2−ヒドロキシエチルメタクリレート(27.08 mmols, 3.525 g), 3−((メタクリロイルアミノ)プロピル)トリメチルアンモニウムクロライド(1.36 mmols, 0.3 g),ポリエチレングリコールジメタクリレート(1. 11 mmols, 1. 11 g), 2,2’−アゾビス(2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン)ジヒドロクロライド(0.077 mmols, 0.025 g)および8−アセトキシピレン−1,3,6−N, N’, N”−トリス(メタクリルアミドプロピルスルホンアミド) (7.5 x 10−4mmols, 6.6 x 10−4g) を仕込んだ;そのフラスコをイソプロピルアルコール:水(1 : 1 , V/V)で10mL目盛りのところまで満たした。その溶液をボルテックスミキサーで強く撹拌し、それをピペットで50−mL丸底フラスコに移し、そのフラスコをゴムセプタムで密封した。そこから30分間アルゴンを用いて酸素を取り除いた。シリンジを用いてマノメータ溶液を取り、その針をゴムストッパーを用いてキャップした。そして、それを重合チャンバー備え、アルゴンで満たされたグローブボックスに移した。そのシリンジを重合チャンバーに取り付け、その溶液をアルゴン下でセルに挿入し、空洞全体を満たした。そのチャンバーをTEFLON (登録商標)栓を用いて密封し、ZIPLOC (商標)冷凍用バッグで包んだ。ユニット全体をオーブンに移し、14時間40℃で加熱した。重合チャンバーをオーブンおよびバッグから取り出した後、薄い緑色重合フィルムを提供するために分解した。そのフィルムを6時間蒸留した500mLの水(pH 5)を用いてろ過した;2時間ごとに新しい水と取り替えた。そして、薄いフィルムを減圧下にて乾燥し(40℃、Hg中20、3時間)、−196℃に移し、乳鉢および乳棒を用いて細かい粉末にした。

0195

相互貫入ネットワーク重合体:50mL丸底フラスコに、マノメータクエンチ溶液(5.2 mL)および高分子色素粉末(0.169 g)を仕込んだ。混合液を10分間ボルテックスミキサーで強く撹拌し、色素粒子によって液体が吸収されるようにし、15分間アルゴンで酸素を除去した。不均一溶液をシリンジで取り出し、その針をゴムストッパーを用いてキャップした。そして、それを重合チャンバーを用いてアルゴンで満たされたグローブボックスに移した(実施例11を参照)。そのシリンジを重合チャンバーに取り付け、その溶液をアルゴン下でセルに挿入し、空洞全体を満たした。そのチャンバーをTEFLON(登録商標) 栓を用いて密封し、ZIPLOC (商標)冷凍用バッグで包んだ。ユニット全体をオーブンに移し、14時間40℃で加熱した。重合チャンバーをオーブンおよびバッグから取り出した後、薄いオレンジ色、ゲル合成された重合フィルムを提供するために分解した。そのフィルムを12時間pH 8−NaOH溶液中に置き、ろ過した後、pH 7.4リン酸緩衝液中に保存した。

0196

この生成物を実施例20で使用した。

0197

[実施例15]
2成分系: HPTS−MA を使用した4−N− (ベンジル−3−ボロン酸)−4’−N−(ベンジル−4−エテニル)ジピリジニウムブロマイドクロライド(M−SBBV)の薄膜重合

0198

10mL容積測定フラスコに、2−ヒドロキシエチルメタクリレート(3.525 g, 27.08 mmols), 4−N−(ベンジル−3−ボロン酸)−4’−N’(ベンジル−4−エテニル)ジピリジニウムブロマイドクロライド(0.039 g, 0.075 mmols), 3−((メタクリロイルアミノ)プロピル)トリメチルアンモニウムクロライド(0.3 g, 1.36 mmols),ポリエチレングリコールジメタクリレート(1.11 g, 1.11 mmols), 2,2’−アゾビス(2−(2−イミダゾリン−2−イル)プロパン)ジヒドロクロライド(0.025 g, 0.077 mmols)および8−アセトキシピレン−l,3,6−N, N’, N”−トリス(メタクリルアミドプロピルスルホンアミド) (6.6 x 10−4g , 7.5 x 10−4nmols)を仕込んだ。そのフラスコをイソプロピルアルコール/水(1 : 1 , V/V)で10mL目盛りのところまで満たした。その溶液をボルテックスミキサーで強く撹拌し、それをピペットで50−mLコーン型丸底フラスコに移し、そのフラスコをゴムセプタムで密封した。そこから30分間アルゴンを用いて酸素を取り除いた。シリンジを用いてマノメータ溶液を取り、その針をゴムストッパーを用いてキャップした。そして、それを重合チャンバーを備えたアルゴンで満たされたグローブボックスに移した(実施例11参照)。そのシリンジを重合チャンバーに取り付け、その溶液をアルゴン下でセルに挿入し、空洞全体を満たした。そのチャンバーをTEFLON(登録商標)栓を用いて密封し、ZIPLOC (商標)冷凍用バッグで包んだ。ユニット全体を40℃ウォーターバスに浸し、12時間加熱した。重合チャンバーをバスとバッグから取り除いた後、薄い緑色重合フィルムを提供するために分解した。その重合フィルムを12時間pH 8 NaOH溶液中に置き、ろ過し、pH 7.4リン酸緩衝液中に保存した。この生成物を実施例21で使用した。

0199

[実施例16]
8−ヒドロキシピレン−1,3,6−N, N’, N” −トリス−(メトキシポリエトキシエチル(N−125)スルホンアミド) HPTS−PEGを用いた4,4’−N,N’−ビス(ベンジル−2, 3または 4−ボロン酸)ビピリジニウムジブロマイドの蛍光分光分析

0200

HPTS−PEG (10 mL, 5 x 10−5 M)原液を、pH 7.4リン酸緩衝液(0.1イオン強度)と共に10mL容積測定フラスコ中に準備した。同様に、m−BBV溶液(25 mL, 0.0025 M)を準備した。HPTS−PEGおよびm−BBVを含む7つの異なる溶液を、以下の表2で示されるようにpH 7.4リン酸緩衝液中に準備した。

0201

そして、各サンプルをPerkin−Elmer LS50−B発光分光計で分析した。機器セッティングは:
励起波長−473 nm
放出波長範囲 − 480−630 nm
励起スリット幅− 0 nm (機器依存最小値
放出スリット幅 − 0 nm (機器依存最小値)
光学フィルター− なし
スキャン速度 − 100 nm/秒

0202

機器セッティング(スリット幅,スキャン速度,光学フィルター,励起波長,放出波長範囲)を一連の分析を通じて一定に保った。そして、放出蛍光強度を、480と630 nmの間の蛍光強度曲線の積分(台形公式近似法)によって定量化した。見かけのスターンウォリメルクエンチング定数を、520 M−1とした(図7参照)。

0203

[実施例17]
蛍光分光法によって分析した8−ヒドロキシピレン− 1,3,6−N, N’, N” −トリス−(メトキシポリエトキシエチル(N−125)スルホンアミド) (HPTS−PEG)を用いた4,4’−N,N’−ビス(ベンジル−2, 3または 4−ボロン酸)ビピリジニウムジブロマイドのグルコース検知能力

0204

(a)HPTS−PEG (10 mL, 5 x 10−5 M)原液を、pH 7.4リン酸緩衝液中(0.1イオン強度)と共に10mL容積測定フラスコ中に準備した。同様に、m−BBV溶液(25 mL, 0.0025 M)およびD−グルコース溶液(10 mL. 0.250 M)を準備した。HPTS−PEG、m−BBVおよびD−グルコースを含む7つの異なる溶液を、以下の表3で示されるようにpH 7.4リン酸緩衝液中に準備した。

0205

各サンプルのpHをそれぞれ、pHメーターを使用して決定し、pHが0.02 pHユニット内で一連を通じて一定となるようにした。

0206

そして、各サンプルをPerkin−Elmer LS50−B発光分光計で分析した。機器セッティングは、実施例16と同じにした。

0207

そして、相対的な積算値を、較正曲線を構成するために使用した:F/Fo対グルコース濃度(mg/dL)をプロットした、ここで、Foは、0 mg/dLグルコースを含む表3中の第一サンプルの積分蛍光強度である。

0208

(a) HPTS−PEGを用いたグルコース感度の評価。HPTS−PEG色素の存在下において、ベンジルビオロゲンのグルコース検知能力を4,4’−N,N’−ビス(ベンジル−3−ボロン酸)−ビピリジニウムジブロマイドのそれに対して比較した。HPTS−PEGを用いたベンジルビオロゲンに対する見かけのスターンウォリメルクエンチング定数は、手順Aで述べられているように決定され、それは559M−1であると決定された。HPTS−PEGの存在下において、ベンジルビオロゲンのグルコース感度は、同じ手法で決定された。ベンジルビオロゲン/HPTS−PEG溶液からのシグナルは、グルコース濃度の変化に反応しなかった。4,4’−N,N’−ビス(ベンジル−3−ボロン酸)−ビピリジニウムジブロマイドのグルコース感度は、ベンジルビオロゲンのグルコース感度と共に図5に示されている。

0209

(b) 4,4’−N,N’−ビス(ベンジル−3−ボロン酸)−ジピリジニウムジブロマイドに代えて4,4’−N,N’−ビス(ベンジル−4−ボロン酸)−ビピリジルジブロマイドを使用する以外は、(a)と同様のことを繰り返した。オルト(ortho)およびパラ(para)異性体を同じ方法で分析した。グルコース感度の結果は同等である。結果を図6にプロットした。

0210

[実施例18]
HPTS−PEGを用いたベンジルビオロゲン対4,4’−N,N’−ビス(ベンジル−3−ボロン酸)−ビピリジニウムジブロマイドのグルコース感度の比較

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