図面 (/)

技術 改善されたアラビノース資化能を有するザイモモナス(ZYMOMONAS)

出願人 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
発明者 ジエンジュン・ヤン
出願日 2010年6月10日 (9年3ヶ月経過) 出願番号 2012-516137
公開日 2012年12月6日 (6年9ヶ月経過) 公開番号 2012-530490
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理
主要キーワード 単一原料 腐食性溶液 シリコーン基剤 リグノセルロース性 切り詰める 有酸素性 拡散輸送 識別因子
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2012年12月6日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題・解決手段

改善されたアラビノース資化能がある株を提供することが見出されたアラビノースプロトン共輸送体発現するように、アラビノース資化ザイモモナス(Zymomonas)のいくつかの株を遺伝子操作した。これらの株は、唯一炭素源としてまたは糖混合物中の1つの糖としてのどちらかでアラビノースを含有する培地中において、改善されたエタノール生産を有する。

概要

背景

微生物によるエタノール生産化石燃料代替エネルギー源を提供し、したがって現在の重要な研究分野である。キシロースおよびアラビノースは、発酵で使用される生体触媒のための豊富入手できる低コスト炭素基質源を提供し得る、加水分解リグノセルロース系材料中の主要な五炭糖であることから、エタノールならびにその他の有用な生成物を生産する微生物は、炭素源としてキシロースおよびアラビノースを使用できることが望ましい。

キシロースおよびアラビノースの資化のために、天然ではこれらの糖を資化しないザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)およびその他の細菌エタノロジェンを遺伝子操作してもよい。キシロース資化を提供するために、以下のタンパク質をコードする遺伝子が発現されるように株を遺伝子操作した。1)キシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ;2)キシルロースをリン酸化してキシルロース−5−リン酸を形成するキシルキナーゼ;3)トランスケトラーゼ;および4)トランスアルドラーゼ(特許文献1、2;非特許文献1)。アラビノース資化を提供するために、以下のタンパク質をコードする追加的遺伝子が導入された。1)L−アラビノースをL−リブロースに変換するL−アラビノースイソメラーゼ、2)L−リブロースをL−リブロース−5−リン酸に変換するL−リブロキナーゼ、および3)L−リブロース−5−リン酸をD−キシルロースに変換するL−リブロース−5−リン酸−4−エピメラーゼ(特許文献3)。

概要

改善されたアラビノース資化能がある株を提供することが見出されたアラビノース−プロトン共輸送体を発現するように、アラビノース資化ザイモモナス(Zymomonas)のいくつかの株を遺伝子操作した。これらの株は、唯一の炭素源としてまたは糖混合物中の1つの糖としてのどちらかでアラビノースを含有する培地中において、改善されたエタノール生産を有する。

目的

本発明は、
a)適切な条件下でアラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)株を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
2件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

アラビノースプロトン共輸送体をコードする少なくとも1つの異種遺伝子を含んでなる、アラビノースを資化してエタノールを生成する、ザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)属の組み換え微生物

請求項2

前記アラビノース−プロトン共輸送体が、araE遺伝子のコード領域によってコードされる、請求項1に記載の組み換え微生物。

請求項3

アラビノース資化能が、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも1つの異種遺伝子を欠く親微生物と比較して、少なくとも約10%改善される、請求項1に記載の組み換え微生物。

請求項4

株がキシロースをさらに資化してエタノールを生成する、請求項1に記載の組み換え微生物。

請求項5

a)適切な条件下でアラビノースを資化してエタノールを生成する、組み換えザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)株を提供するステップと;b)アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも1つの異種遺伝子を(a)の株に導入するステップとを含んでなる、アラビノース資化能が増大したザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)属の組み換え微生物を作り出す方法。

請求項6

ステップ(b)の前または後のどちらかで、またはステップ(b)の前または後の双方で、唯一炭素源としてアラビノースを含有する培地中での連続成長によって前記株を適応させ、それによって適応株が産生されるステップをさらに含んでなり、前記株が、適応されていない前記株と比較して、さらに改善されたアラビノース資化能を有する、請求項5に記載の方法。

請求項7

前記適応株が、アラビノース、キシロース、およびグルコースを含んでなる混合糖培地中におけるエタノール生産のために、キシロースおよびグルコースをさらに資化する、請求項6に記載の方法。

請求項8

a)アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも1つの異種遺伝子を含んでなる、アラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)株を提供するステップと;b)(a)の株をアラビノースを含んでなる培地中で培養し、それによってアラビノースがエタノールに変換されるステップとを含んでなるエタノールを製造する方法。

請求項9

前記アラビノース−プロトン共輸送体がaraE遺伝子のコード領域によってコードされる、請求項9に記載の方法。

請求項10

アラビノース資化が、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする異種遺伝子を欠く親微生物と比較して、少なくとも約10%改善される、請求項8に記載の方法。

請求項11

(a)の株がキシロースおよびグルコースをさらに資化して、エタノールを生成できる、請求項8に記載の方法。

請求項12

(a)の株が、唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地中の連続成長によって適応され、それによってアラビノース適応株が産生され、前記アラビノース適応株が、適応されていない(a)の株と比較して、増大するエタノール生産を有する、請求項8に記載の方法。

請求項13

アラビノースからエタノールへの変換が、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも1つの異種遺伝子を欠く組み換え親株によるアラビノースからエタノールの変換と比較して増大する、請求項8に記載の方法。

請求項14

アラビノースからエタノールへの変換が、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも1つの異種遺伝子を欠く組み換え親株と比較して少なくとも約10%増大する、請求項13に記載の方法。

請求項15

前記培地が、アラビノースを含んでなる糖混合物、または唯一の糖としてのアラビノースのどちらかを含んでなる、請求項8に記載の方法。

請求項16

(a)アラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)株からなる群から選択されるアラビノース資化微生物を提供するステップと;(b)アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも1つの異種遺伝子を前記微生物ゲノムに導入し、前記共輸送体が前記微生物によって発現されるステップと;(c)(b)の微生物をアラビノースを含んでなる培地に接触させ、前記微生物が前記アラビノース−プロトン共輸送体を欠く前記微生物と比較して増大する速度で前記アラビノースを代謝するステップとを含んでなる、アラビノース資化微生物によるアラビノース資化を改善する方法。

技術分野

0001

米国政府権利についての記述
本発明は、エネルギー省によって与えられた契約番号第DE−FC36−07GO17056の下に、米国政府の支援によってなされたものである。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する。

0002

本発明は、微生物学および発酵の分野に関する。さらに具体的には、アラビノース資化の改善をもたらすザイモモナス(Zymomonas)株の遺伝子操作、および同株を使用してエタノールを製造する方法について記載される。

背景技術

0003

微生物によるエタノールの生産化石燃料代替エネルギー源を提供し、したがって現在の重要な研究分野である。キシロースおよびアラビノースは、発酵で使用される生体触媒のための豊富入手できる低コスト炭素基質源を提供し得る、加水分解リグノセルロース系材料中の主要な五炭糖であることから、エタノールならびにその他の有用な生成物を生産する微生物は、炭素源としてキシロースおよびアラビノースを使用できることが望ましい。

0004

キシロースおよびアラビノースの資化のために、天然ではこれらの糖を資化しないザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)およびその他の細菌エタノロジェンを遺伝子操作してもよい。キシロース資化を提供するために、以下のタンパク質をコードする遺伝子が発現されるように株を遺伝子操作した。1)キシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ;2)キシルロースをリン酸化してキシルロース−5−リン酸を形成するキシルキナーゼ;3)トランスケトラーゼ;および4)トランスアルドラーゼ(特許文献1、2;非特許文献1)。アラビノース資化を提供するために、以下のタンパク質をコードする追加的遺伝子が導入された。1)L−アラビノースをL−リブロースに変換するL−アラビノースイソメラーゼ、2)L−リブロースをL−リブロース−5−リン酸に変換するL−リブロキナーゼ、および3)L−リブロース−5−リン酸をD−キシルロースに変換するL−リブロース−5−リン酸−4−エピメラーゼ(特許文献3)。

0005

米国特許第5514583号明細書
米国特許第6566107号明細書
米国特許第5843760号明細書

先行技術

0006

Zhangら(1995年)Science 267:240〜243

発明が解決しようとする課題

0007

いくつかのZ.モビリス(Z.mobilis)株がアラビノース資化のために遺伝子操作されているが、これらの遺伝子操作株によって資化される発酵培地中には、典型的に低率のアラビノースのみが存在する。発酵がアラビノースを含有する培地中で起きる場合、ザイモモナス(Zymomonas)およびその他の細菌エタノロジェン中におけるア
ラビノース資化を改善して、エタノール生産を増強する必要性が残る。

課題を解決するための手段

0008

本発明は、アラビノース−プロトン共輸送体発現のための遺伝子が導入されることで遺伝子操作されて、アラビノースを使用する改善された能力を有するザイモモナス(Zymomonas)およびザイモバクター(Zymobacter)株、およびこれらの株を使用したエタノール生産に関する。これらの株をアラビノース含有培地中で培養すると、改善されたエタノール生産を有する。

0009

したがって本発明は、アラビノースを資化してエタノールを生成する、ザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)属の組み換え微生物を提供し、上記微生物はアラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも1つの異種遺伝子を含んでなる。

0010

これに加えて本発明は、
a)適切な条件下でアラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)株を提供するステップと;
b)異種性アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも1つの遺伝子を(a)の株に導入するステップ
を含んでなる、アラビノース資化能が増大したザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)属の組み換え微生物を作成する方法を提供する。

0011

別の実施態様では本発明は、
a)アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも1つの異種遺伝子を含んでなる、アラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)株を提供するステップと;
b)(a)の株をアラビノースを含んでなる培地中で培養し、それによってアラビノースが上記株によってエタノールに変換されるステップ
を含んでなる、エタノールを製造する方法を提供する。

0012

別の実施態様では本発明は、
(a)アラビノースを資化してエタノールを生成する組み換えザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)株からなる群から選択される、アラビノース資化微生物を提供するステップと;
(b)アラビノース−プロトン共輸送体をコードする少なくとも1つの異種遺伝子を上記微生物のゲノム内に導入し、上記共輸送体が上記微生物によって発現されるステップと;(c)(b)の微生物をアラビノースを含んでなる培地に接触させ、アラビノース−プロトン共輸送体を欠く上記微生物と比較して、上記微生物が増大した速度で上記アラビノースを代謝するステップ
を含んでなる、アラビノース資化微生物によるアラビノース資化を改善する方法を提供する。

0013

本発明は、本明細書の一部を構成する、以下の詳細な説明、図面、および添付の配列説明からより完全に理解され得る。

図面の簡単な説明

0014

キシロースおよびアラビノース資化のために遺伝子操作されたザイモモナス(Zymomonas)中のエタノール発酵経路ダイアグラムを示し、glfはグルコース促進性拡散輸送体を意味する。
pARA205のプラスミドマップの図面である。
pARA354のプラスミドマップの図面である。
96時間経過中のMRM3A5中のZW705の成長および代謝産物プロフィールグラフを示す。
96時間経過中のZW705−ara354の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のZW705−ara354A7の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A2.5X2.5G5中のZW705の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A2.5X2.5G5中のZW705−ara354の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A2.5X2.5G5中のZW705−ara354A7の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
pARA112のプラスミドマップの図面である。
pARA113のプラスミドマップの図面である。
96時間経過中のMRM3A5中のZW705−ara354A7の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A5中のZW705−ara354A7−ara112−2の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A5中のZW705−ara354A7−ara112−3の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A2.5X2.5G5中のZW705−ara354A7の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A2.5X2.5G5中のZW705−ara354A7−ara112−2の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A2.5X2.5G5中のZW705−ara354A7−ara112−3の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A5中のZW705−ara354の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A5中のZW705−ara354−ara112−1の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A5中のZW705−ara354−ara112−2の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A2.5X2.5G5中のZW705−ara354の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A2.5X2.5G5中のZW705−ara354−ara112−1の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A2.5X2.5G5中のZW705−ara354−ara112−2の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A5中のZW801−ara354の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A5中のZW801−ara354−ara112−5の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A5中のZW801−ara354−ara112−6の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A2.5X2.5G5中のZW801−ara354の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A2.5X2.5G5中のZW801−ara354−ara112−5の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。
96時間経過中のMRM3A2.5X2.5G5中のZW801−ara354−ara112−6(C)の成長および代謝産物プロフィールのグラフを示す。

0015

配列説明
以下の配列は、37C.F.R.1.821〜1.825(「ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件配列規則」)を満たし、世界知的所有権機関(WIPO)標準ST.25(1998)およびEPOおよびPCTの配列表要件(規則5.2および49.5(aの2)、および実施細則第208号および附属書C)に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、37C.F.R.§1.822で述べられる規則に従う。

0016

0017

列番号21および22は、それぞれ大腸菌(E.coli)araA遺伝子のアミノ酸配列およびコード領域である。

0018

配列番号23および24は、それぞれ大腸菌(E.coli)araB遺伝子のアミノ酸配列およびコード領域である。

0019

配列番号25および26は、それぞれ大腸菌(E.coli)araD遺伝子のアミノ酸配列およびコード領域である。

0020

配列番号27は、araB−araADNA断片PCR産物のヌクレオチド配列である。

0021

配列番号28および29は、araB−araADNA断片のPCR増幅プライマーのヌクレオチド配列である。

0022

配列番号30は、RBSおよび3’UTRを含む、araDDNA断片PCR産物のヌクレオチド配列である。

0023

配列番号31および32は、RBSおよび3’UTRを含む、araDDNA断片のPCR増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。

0024

配列番号33は、Z.モビリス(Z.mobilis)のPgapプロモーターのヌクレオチド配列である。

0025

配列番号34および35は、PgapプロモーターDNA断片のPCR増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。

0026

配列番号36は、PgapプロモーターDNA断片PCR産物のヌクレオチド配列である。

0027

配列番号37および38は、スペクチノマイシン耐性カセットのPCR増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。

0028

配列番号39および40は、付加NcoI部位を除去するPgap変異誘発のためのプライマーのヌクレオチド配列である。

0029

配列番号41は、pARA205プラスミドのヌクレオチド配列である。

0030

配列番号42および43は、LDH−LDNA断片のPCR増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。

0031

配列番号44は、LDH−LDNA断片PCR産物のヌクレオチド配列である。

0032

配列番号45および46は、LDH−RDNA断片のPCR増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。

0033

配列番号47は、LDH−RDNA断片PCR産物のヌクレオチド配列である。

0034

配列番号48は、LoxPw−aadA−LoxPwDNA断片PCR産物のヌクレオチド配列である。

0035

配列番号49は、pARA354プラスミドのヌクレオチド配列である。

0036

配列番号50および51は、Pgap−araBAD−aadAの5’組み込みをチェックするためのPCR増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。

0037

配列番号52および53は、Pgap−araBAD−aadAの3’組み込みをチェックするためのPCR増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。

0038

配列番号54および55は、araEコード領域DNA断片のPCR増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。

0039

配列番号56は、araEDNA断片PCR産物のヌクレオチド配列である。

0040

配列番号57および58は、araFGHDNA断片のPCR増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。

0041

配列番号59は、araFGHDNA断片PCR産物のヌクレオチド配列である。

0042

配列番号60および61は、アクチノプラネス・ミズーリエンシス(Actinoplanes missouriensis)PgiDNA断片のPCR増幅のためのプライ
マーのヌクレオチド配列である。

0043

配列番号62は、PCRテンプレートとして使用されるプラスミド中のアクチノプラネス・ミズーリエンシス(Actinoplanes missouriensis)GIプロモーターのヌクレオチド配列である。

0044

配列番号63は、アクチノプラネス・ミズーリエンシス(Actinoplanes missouriensis)PgiDNA断片PCR産物のヌクレオチド配列である。

0045

配列番号64は、クロラムフェニコール耐性マーカーのヌクレオチド配列である。

0046

配列番号65は、pARA112プラスミドのヌクレオチド配列である。

0047

配列番号66は、pARA113プラスミドのヌクレオチド配列である。

0048

本発明は、アラビノース−プロトン共輸送体を発現するようにさらに遺伝子操作されてアラビノース資化能が改善された組み換えザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)株と、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする遺伝子を導入することにより株を遺伝子操作する方法とについて記載する。別の態様では、本発明はアラビノース資化を改善する方法、および上記株を使用してアラビノースを含んでなる培地中でエタノールを生産する方法について記載する。アラビノース−プロトン共輸送体を発現するアラビノース資化株はアラビノース資化能が改善され、アラビノースを含んでなる培地中でのエタノール生産に有用である。

0049

アラビノース資化能が改善された本株によって生成されるエタノールは、化石燃料の代替エネルギー源として使用してもよい。

0050

明細書および特許請求の範囲の解釈のために、以下の略語および定義を使用する。

0051

本明細書での用法では、「comprises」、「comprising」、「includes」、「including」、「has」、「having」、「contains」または「containing」という用語、またはあらゆるその他のバリエーションは、非排他的包含を範囲に含むことが意図される。例えば要素の一覧を構成する組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明示的に列挙されないその他の要素、またはこのような組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置に固有のその他の要素を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「または」は包含的「または」を指し、排他的「または」を指さない。例えば条件AまたはBは、以下のいずれか1つによって満たされる。Aが真であり(または存在する)Bはである(または存在しない)、Aが偽であり(または存在しない)Bは真である(または存在する)、AおよびBの双方が真である(または存在する)。

0052

また本発明の要素または構成要素に先行する不定詞「a」および「an」は、要素または構成要素の事例(すなわち発生)の数に関して非制限的であることが意図される。したがって「a」または「an」は、1つまたは少なくとも1つを含むものと解釈されるべきであり、要素または構成要素の単数語形は、数が明らかに単数形を意味する場合を除き複数形もまた含む。

0053

「遺伝子」は特定タンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード配列に先行する制御配列(5’非コード配列)と、コード配列に続く制御配列(3’非コード配列)を含
んでもよい。「天然遺伝子」または「野性型遺伝子」は、それ自身の制御配列と共に自然界に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然界に一緒には見られない制御配列およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源由来する制御配列およびコード配列を含んでなってもよく、または同一起源に由来するが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列する制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中のその天然の位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子は、常態では宿主生物中に見られず、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含んでなり得る。

0054

「araE」という用語は、Kmが1.25×10-4Mである低親和性大容量アラビノース輸送体である細菌アラビノース−プロトン共輸送体タンパク質をコードする、遺伝子または遺伝子コンストラクトを指す。アラビノース−プロトン共輸送体タンパク質をコードする遺伝子は非常に多様な細菌から単離されてもよく、エシェリキア(Escherichia)、クレブシエラ(Klebsiella)、サルモネラ(Salmonella)、および赤痢菌(Shigella)などの腸内細菌からのものが本発明で特に有用である。

0055

「アラビノース資化」という用語は、微生物の文脈で使用される場合、その微生物が生成物、特にエタノールの生産のためにアラビノースを資化する能力を指す。

0056

適応株」という用語は、生成物の生産のために炭素源を使用する能力を改善するために、特定の炭素源上での成長について選択された微生物を指す。例えば「アラビノース適応株」は、高濃度のアラビノース上での成長について選択された微生物株である。

0057

「遺伝子コンストラクト」という用語は、1つ以上の特定タンパク質の発現をコードする核酸断片を指す。遺伝子コンストラクト中では、遺伝子は天然、キメラ、または外来性であってもよい。典型的に遺伝子コンストラクトは、「コード配列」を含んでなる。「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列を指す。

0058

「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能性RNAの発現を制御できるDNA配列を指す。 一般にコード配列は、プロモーター配列に対して3’側に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成DNAセグメントを含んでなってさえよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型中において、または異なる発達段階において、または異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を誘導してもよいことは、当業者によって理解される。ほとんどの場合にほとんどの細胞型中で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。

0059

「発現」という用語は、本明細書での用法では、遺伝子から誘導されるセンスmRNA)またはアンチセンスRNA転写と安定した蓄積を指す。発現はまた、mRNAのポリペプチドへの翻訳も指す。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑止できるアンチセンスRNA転写物の生成を指す。「過剰発現」は、通常のまたは非形質転換された生物中での生産レベルを越える、遺伝子導入生物中における遺伝子産物の生成を指す。「同時抑制」は、同一のまたは実質的に同様の外来性または内在性性遺伝子の発現を抑止できる、センスRNA転写物または断片の生成を指す(米国特許第5,231,020号明細書)。

0060

形質転換」という用語は、本明細書での用法では、遺伝的に安定した遺伝形質をもた
らす宿主生物中への核酸断片の転移を指す。転移核酸は、宿主細胞中に保持されるプラスミドの形態であってもよく、またはいくつかの転移核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組み換え」または「形質転換」生物と称される。

0061

「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書での用法では、細胞の中央代謝の一部でなく、通常、環状二本鎖DNA分子の形態である遺伝子を保有することが多い染色体外の要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する直鎖または環状の一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAの自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が結合されまたは組み換えられて独自構造体になり、それは選択された遺伝子産物のために、適切な3’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびDNA配列を細胞内に導入できる。

0062

「作動的に連結する」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような単一核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を与えられる場合、それはコード配列と作動的に連結する(すなわちコード配列はプロモーターの転写制御下にある)。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列と作動的に連結し得る。

0063

「選択可能なマーカー」という用語は、マーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質に対する耐性に基づいて選択できる、通常、抗生物質または耐薬品性遺伝子である識別因子を意味し、効果を使用して関心のある核酸の遺伝形質を追跡し、および/または関心のある核酸を受け継いだ細胞または生物を同定する。

0064

本明細書での用法では「コドン縮重」という用語は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなく、ヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする遺伝コード中の性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように、遺伝子をデザインすることが望ましい。

0065

コドン最適化された」という用語は、様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子コード領域について言及される場合、DNAによってコードされるポリペプチドを変化させることのない、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映する遺伝子または核酸分子コード領域中のコドンの改変を指す。

0066

「炭素源」という用語は、微生物がエタノールなどの生成物を生産する発酵過程において使用し得る、オリゴ糖類および単糖類などの糖(「発酵性糖」)を指す。微生物は生成物の産生のために単一炭素源を使用する能力を有してもよく、したがって同炭素源は本明細書で「唯一の」炭素源と称される。

0067

リグノセルロース誘導体」という用語は、リグニンおよびセルロースの双方を含んでなる組成物を指す。リグノセルロース系材料はまた、ヘミセルロースを含んでなってもよい。

0068

セルロース誘導体」という用語は、セルロースと、ヘミセルロースをはじめとする追加的構成要素とを含んでなる組成物を指す。

0069

糖化」という用語は、多糖類からの発酵性糖または炭素源の生成を指す。

0070

「前処理生物由来資源」という用語は、糖化に先だって前処理された生物由来資源を意味する。

0071

「生物由来資源」は、あらゆるセルロースまたはリグノセルロース系材料を指し、セルロースを含んでなる材料、および任意にヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および/または単糖類をさらに含んでなる材料を含む。生物由来資源はまた、タンパク質および/または脂質などの追加的構成要素を含んでなってもよい。生物由来資源は単一原料に由来してもよく、または生物由来資源は1つを超える原料に由来する混合物を含んでなり得る。生物由来資源は、単一原料に由来してもよく、または生物由来資源は1つ以上の原料に由来する混合物からなり得て、例えば生物由来資源は、トウモロコシ穂軸トウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなり得る。生物由来資源としては、バイオエネルギー作物農業残渣、都市固形廃棄物、工業固形廃棄物、製紙業からの汚泥、庭ごみ、木材および森林廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。生物由来資源の例としては、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、草、小麦、小麦藁、大麦藁、干し草稲藁スイッチグラス、古紙、サトウキビバガスソルガムバガスまたは茎葉ダイズ茎葉、穀物製粉から得られる成分、木材、枝、根、葉、木くずおがくず、灌木および低木野菜果物、花、および動物堆肥が挙げられるが、これに限定されるものではない。

0072

「生物由来資源加水分解産物」は、生物由来資源の糖化から得られる生成物を指す。生物由来資源はまた、糖化に先だって前処理または前加工されてもよい。

0073

「異種性」という用語は、関心のある位置に天然では見られないことを意味する。例えば異種遺伝子は、宿主生物中には天然では見られず、遺伝子移入によって宿主生物内に導入された遺伝子を指す。例えばキメラ遺伝子中に存在する異種性核酸分子は、天然では互いに付随しないコード領域およびプロモーターセグメントを有する核酸分子など、天然ではキメラ遺伝子のその他のセグメントに付随して見られない核酸分子である。

0074

本明細書での用法では、「単離核酸分子」は、任意に合成、非自然的または改変ヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNAのポリマーである。DNAポリマーの形態の単離核酸分子は、cDNA、ゲノムDNAまたは合成DNAの1つ以上のセグメントを含んでなってもよい。

0075

核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、一本鎖形態の核酸断片が他の核酸断片とアニールし得る場合に、cDNA、ゲノムDNA、またはRNA分子などの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、(その内容全体を参照によって本明細書に援用する)Sambrook,J.,Fritsch,E.F.およびManiatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1989年)、特にその中の第11章および表11.1で例証されている。温度およびイオン強度条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、(遠縁の生物からの相同的配列などの)中程度に類似した断片から、(近縁関係にある生物からの機能性酵素を複製する遺伝子などの)類似性の高い断片までをスクリーンするために調節し得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の1つの組は、6×SSC、0.5%SDSで室温で15分間に始まり、次に2×SSC、0.5%SDSで45℃で30分間の繰り返し、次に0.2×SSC、0.5%SDSで50℃で30分間の2回の繰り返しの一連の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のより好ましい組はより高い
温度を使用し、その中で洗浄は、0.2×SSC、0.5%SDS中での最後の2回の30分間の洗浄温度が60℃に増大されること以外は上と同一である。高度にストリンジェントな条件の別の好ましい組は、0.1×SSC、0.1%SDS中で65℃で2回の最終洗浄を使用する。追加的なストリンジェントな条件の組は、例えば0.1×SSC、0.1%SDS、65℃でのハイブリダイゼーション、および2×SSC、0.1%SDSでの洗浄後、0.1×SSC、0.1%SDSを含む。

0076

ハイブリダイゼーションは2つの核酸が相補的配列を含有することを要するが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で、塩基間のミスマッチもあり得る。核酸をハイブリダイズさせる適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で良く知られている変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸ハイブリッドTm値はより大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性(より高いTmに対応する)は、以下の順に低下する:RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。長さが100を超えるヌクレオチドのハイブリッドでは、Tmを計算する式が導かれている(Sambrookら、前出参照、9.50〜9.51)。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する(Sambrookら、前出参照、11.7〜11.8)。一実施態様ではハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約10ヌクレオチドである。好ましくはハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは、少なくとも約15ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約20ヌクレオチドであり、最も好ましくは長さは少なくとも約30ヌクレオチドである。さらに当業者は、プローブ長などの要素に準じて、温度および洗浄溶液塩濃度を必要に応じて調節してもよいことを認識するであろう。

0077

アミノ酸またはヌクレオチド配列の「相当な部分」は、当業者による配列の手動評価、またはコンピュータ自動化配列比較BLAST(Altschul,S.F.ら,J.Mol.Biol.,215:403〜410(1993年))などのアルゴリズムを使用した同定のどちらかによって、ポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分である、ポリペプチドまたは遺伝子ヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。一般に、既知のタンパク質または遺伝子と相同的なポリペプチドまたは核酸配列を推定的に同定するには、10以上の隣接するアミノ酸配列または13以上のヌクレオチドが必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、遺伝子同定の配列依存法(例えばサザンハイブリダイゼーション)および単離(例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション)において、20〜30の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用してもよい。さらにプライマーを含んでなる特定核酸断片を得るためのPCRにおける増幅プライマーとして、12〜15塩基のより短いオリゴヌクレオチドを使用してもよい。したがってヌクレオチド配列の「相当な部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定しおよび/または単離するのに十分な配列を含んでなる。本明細書は、特定の真菌タンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告される配列の便益を有して、当業者に知られている目的のために、今や開示される配列の全てまたは相当な部分を使用してもよい。したがって本発明は、添付の配列一覧に報告される完全な配列、ならびに上で定義されるこれらの配列の相当な部分を含んでなる。

0078

相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を記載するのに使用される。例えばDNAに関して、アデノシンチミンに相補的であり、シトシングアニンに相補的である。

0079

「相同性」および「相同的」という用語は、本明細書で同義的に使用される。これらは
、その中で1つ以上のヌクレオチド塩基の変更が、核酸断片が遺伝子発現仲介し、または特定の表現型を生成する能力に影響を及ぼさない、核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の無修飾断片と比較して、得られる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、1つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾も指す。したがって当業者は理解するであろうように、本発明は、特定の具体的配列以上のものを包含すると理解される。

0080

さらに当業者は、本発明に包含される相同的な核酸配列はまた、中程度にストリンジェントな条件(例えば0.5×SSC、0.1%SDS、60℃)下で、本明細書で例証される配列とハイブリダイズする、または本明細書で開示される核酸配列のいずれかと機能的に同等である本明細書で開示されるヌクレオチド配列のあらゆる部分とハイブリダイズする、それらの能力によって定義されることを認識する。

0081

「%同一性」という用語は、当該技術分野で知られているように、配列を比較して判定される、2つ以上のポリペプチド配列または2つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野で「同一性」はまた、場合によっては、このような配列ストリング間のマッチにより判定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、以下に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算され得る。1.)Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.編)Oxford University:NY(1988年);2.)Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.編)Academic:NY(1993年);3.)Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編)Humania:NJ(1994年);4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.編)Academic(1987年);および5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.およびDevereux,J.編)Stockton:NY(1991年)。

0082

同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良のマッチを与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラム中で体系化される。配列アラインメントおよび%同一性の計算は、LASERGENEバイオインフォマテクス演算スイート(DNASTAR Inc.,Madison,WI)のMegAlign(登録商標プログラムを使用して実施してもよい。配列の多重アラインメントは、Clustal Vとラベルされるアラインメント法に相当し、LASERGENEバイオインフォマティクス演算スイート(DNASTAR Inc.)のMegAlign(登録商標)プログラムにある、「アラインメントのClustal V法」(HigginsおよびSharp,CABIOS.5:151〜153(1989年);Higgins,D.G.ら,Comput.Appl.Biosci.,8:189〜191(1992年)によって記載される)をはじめとする、アルゴリズムのいくつかのバラエティーを包含する「アラインメントのClustal法」を使用して実施される。多重アラインメントでは、デフォルト値は、GAPPENALTY=10およびGAPLEGTH PENALTY=10に相当する。Clustal法を使用したタンパク質配列ペアワイズアラインメントおよび%同一性計算のデフォルトパラメーターは、KTUPLE=1、GAPPENALTY=3、WINDOW=5、およびDIAGONALS SAVED=5である。核酸では、これらのパラメーターは、KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WINDOW=4、およびDIAGONALS SAVED=4である。Clustal Vプログラムを使用した配列のアラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を見ることで「%同一性」得ることができる。さらにClustal Wとラベルされるアラインメント法に相当して、LASERGENEバイオインフォマティクス演算スイート(DNASTAR Inc.)のMegAlign(登録商標)v6.1プログラムにある、「アラインメントのClustal W法」(HigginsおよびSharp,CABIOS.5:151〜153(1989年);Higgins,D.G.ら、Comput.Appl.Biosci.8:189〜191(1992年)によって記載される)を利用できる。多重アラインメントのデフォルトパラメーター(GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=0.2、Delay Divergen Seqs(%)=30、DNA Transition Weight=0.5、Protein Weight Matrix=Gonnet Series、DNA Weight Matrix=IUB)。Clustal Wプログラムを使用した配列のアラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を見ることで、「%同一性」を得ることができる。

0083

その他の種からのポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることは、当業者によって良く理解され、このようなポリペプチドは同一のまたは類似した機能または活性を有する。%同一性の有用な例としては、以下が挙げられるがこれに限定されるものではない。24%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%;または25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%などの24%から100%までのあらゆる整数百分率が、本発明について記述する上で有用かもしれない。適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも50のアミノ酸、好ましくは少なくとも100のアミノ酸、より好ましくは少なくとも150のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも200のアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも250のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。

0084

配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、1.)Genetics Computer Group(GCG)(Madison,WI)からのGCGプログラム一式(Wisconsin Package Version 9.0)、2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschulら,J.Mol.Biol.215:403〜410(1990年))、および3.)DNASTAR,Inc.(Madison,WI)からのDNASTAR、4.)Gene Codes Corporation(Ann Arbor,MI)からのSequencher、および5.)スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れFASTAプログラム(W.R.Pearson、Comput.MethodsGenome Res.[Proc.Int.Symp.](1994年),1992年会議,111〜20,編集者:Suhai,Sandor,Plenum,New York,NY)が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書の文脈で分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、特に断りのない限り、分析結果は言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに元からロードされる、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。

0085

本明細書で使用される標準リコンビナントDNAおよび分子クローニング技術については当該技術分野で良く知られており、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,およびManiatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1989年)(下文において「Maniatis」);Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.およびEnquist,L.W.,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,New York(1984年);およびAusubel,F.M.ら,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley−Interscienceによる出版(1987年)に記載されている。

0086

本発明は、アラビノース含有培地中で発酵させると改善されたアラビノース資化能を有する、アラビノース資化ザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)の遺伝子操作株と、同株を使用してエタノールを生産する方法とに関する。典型的に生物由来資源の前処理および糖化によって生成される生物由来資源加水分解産物を含む培地中における、生体触媒の発酵によるエタノール生産の改善にとって難しい課題は、アラビノースの効率的な資化を得ることである。アラビノースは、加水分解リグノセルロース系材料中の主要な五炭糖の1つであり、その他はキシロースである。出願人らは、発酵がアラビノースを含有する培地中である場合、アラビノース−プロトン共輸送体の発現が、アラビノース資化株によるアラビノース資化における効率増大と、ひいてはより高いエタノール収率をもたらすことを発見した。

0087

アラビノース資化宿主株
アラビノースを炭素源として資化できるザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)のあらゆる株を本発明の株を調製するための宿主として使用してもよい。 アラビノースのエタノールへの発酵のために遺伝子操作されているZ.モビリス(Z.mobilis)などのザイモモナス(Zymomonas)の株が、特に有用である。ザイモモナス(Zymomonas)は、以下をコードする遺伝子を導入することにより、アラビノース資化能のために遺伝子操作された。1)L−アラビノースをL−リブロースに変換するL−アラビノースイソメラーゼ、2)L−リブロースをL−リブロース−5−リン酸に変換するL−リブロキナーゼ、および3)L−リブロース−5−リン酸をD−キシルロースに変換するL−リブロース−5−リン酸−4−エピメラーゼ(米国特許第5843760号明細書;および本明細書の実施例1および2に記載される;図1のダイアグラム参照)。これらの酵素をコードするDNA配列は、アラビノースを代謝できるいずれの微生物から得てもよい。コード領域の起源としては、クレブシエラ(Klebsiella)、エシェリキア(Escherichia)、リゾビウム(Rhizobium)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、およびサルモネラ(Salmonella)が挙げられる。特に有用なのは、L−アラビノースイソメラーゼのためのaraAのコード領域(コード領域配列番号21;タンパク質配列番号22)、L−リブロキナーゼのためのaraBのコード領域(コード領域配列番号23;タンパク質配列番号24)、およびL−リブロース−5−リン酸−4−エピメラーゼのためのaraDのコード領域(コード領域配列番号25;タンパク質配列番号26)の大腸菌(E.coli)のコード領域である。これらのタンパク質およびそれらのコード領域は、当業者によって、バイオインフォマティクスまたはaraEについて下述する実験法を使用して、上に列挙したものなどのその他のアラビノース資化微生物中で容易に同定されてもよい。

0088

さらにアラビノースからエタノールへの生合成経路中で、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ活性が使用される(図1参照)。トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼは、キシルロース−5−リン酸を中間体に変換するペントースリン酸経路の2つの酵素であり、中間体は五炭糖代謝を解糖作用エントナードゥドロフ経路に連結して、アラビノースまたはキシロースのエタノールへの代謝を可能にする。これらは内在性活性であってもよく、または内在性活性がこれらの酵素の導入された活性を補足してもよい。

0089

典型的にアラビノース資化ザイモモナス(Zymomonas)は、キシロース資化のためにもまた遺伝子操作される。参照によって本明細書に援用する米国特許第5514583号明細書に記載されるように、典型的にキシロース代謝関与する4つの酵素の発現のために、4つの遺伝子がZ.モビリス(Z.mobilis)に導入される(図1)。これらとしては、上述のようなトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ、ならびにキシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ、およびキシルロースをリン酸化してキシルロース−5−リン酸を形成するキシルロキナーゼをコードする遺伝子が挙げられる(図1参照)。これらの酵素をコードするDNA配列は、腸内細菌、およびいくつかの酵母および真菌などのキシロースを代謝できる多数の微生物のいずれかから得られてもよい。コード領域の起源としては、キサントモナス属(Xanthomonas)、クレブシエラ(Klebsiella)、エシェリキア(Escherichia)、ロドバクター(Rhodobacter)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、アセトバクター(Acetobacter)、グルコノバクター(Gluconobacter)、リゾビウム(Rhizobium)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、サルモネラ(Salmonella)、シュードモナス属菌(Pseudomonads)、およびザイモモナス(Zymomonas)が挙げられる。特に有用なのは、大腸菌(E.coli)のコード領域である。

0090

発現では、アラビノース資化タンパク質およびキシロース資化タンパク質をコードするDNA配列が、Z.モビリス(Z.mobilis)細胞中で発現されるプロモーターおよび転写ターミネーターと作動的に連結する。使用してもよいプロモーターの例としては、Z.モビリス(Z.mobilis)グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素コーディング遺伝子のプロモーター(GAPプロモーター;Pgap)、Z.モビリス(Z.mobilis)エノラーゼコーディング遺伝子のプロモーター(ENOプロモーター;Peno)、およびアクチノプラネス・ミズーリエンシス(Actinoplanes missouriensis)キシロースイソメラーゼコーディング遺伝子のプロモーター(GIプロモーター、Pgi)が挙げられる。コード領域は、典型的にキメラ遺伝子としてプロモーターから個別に発現されてもよく、または2つ以上のコード領域が、同一プロモーターから発現するオペロン中で結合してもよい。得られたキメラ遺伝子および/またはオペロンは、さらなる操作のために、典型的にベクターに構築されまたは導入される。

0091

ベクターについては当該技術分野で良く知られている。ザイモモナス(Zymomonas)中における発現のために特に有用なのは、米国特許第5,514,583号明細書に記載されるpZB188などの大腸菌(E.coli)およびザイモモナス(Zymomonas)の双方の中で複製し得るベクターである。ベクターは、細胞内の自律複製のためのプラスミドと、細胞ゲノムに組み込まれるコンストラクトを保有するためのプラスミドを含んでもよい。DNA組み込みのためのプラスミドは、トランスポゾン標的細胞ゲノムと相同的な核酸配列領域、部位特異的組み込み配列、または組み込みを支援するその他の配列を含んでもよい。相同的組換えにおいては、本明細書の実施例2に記載されるように、標的ゲノム部位への選択可能なマーカーおよびキメラ遺伝子の挿入をもたらす、スペクチノマイシン耐性遺伝子またはその他の選択可能なマーカーと、所望のキメラ遺伝
子とに境を接して、標的組み込み部位に隣接するDNA配列を配置させる。さらに選択可能なマーカーは、対応する部位特異的リコンビナーゼの発現後に耐性遺伝子をゲノムから切除してもよいように、部位特異的組み換え部位と境を接してもよい。

0092

特定の用途があるキシロース資化株としては、CP4(pZB5)(米国特許第5514583号明細書)、ATCC31821/pZB5(米国特許第6566107号明細書)、8b(米国特許第20030162271号明細書;Mohagheghiら,(2004年)Biotechnol.Lett.25;321〜325)、および誘導体ZW800およびZW801−4があるZW658(同一譲受人同時係属米国特許公開第20080286870号明細書;寄託TTCC番号PTA−7858)が挙げられる。また参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の同時係属米国特許出願第12/641642号明細書に記載されるZW705を使用してもよい。使用してもよいアラビノース資化株は、参照によって本明細書に援用する米国特許第5843760号明細書で開示され、ならびに本明細書の実施例1および2に記載される。

0093

アラビノース資化能の適応
上述のようにキシロースおよびアラビノースの資化のために遺伝子操作されたZ.モビリス(Z.mobilis)株は、出願人らによって、試験成長条件において、アラビノースが唯一の炭素源(50g/L)である場合は培地中のアラビノースの約33%を資化し、25g/Lアラビノース、25g/Lキシロース、および50g/Lグルコースの混合糖を含む培地中ではアラビノースの約68%を資化することが分かった。改善されたアラビノース資化能を有する株を得る試みにおいて、出願人らは、本明細書の実施例2に記載されるように、唯一の炭素源として50g/Lアラビノースがある培地中での連続成長によって、キシロースおよびアラビノース資化株からの細胞を適応させた。この方法を使用することで、アラビノースが唯一の炭素源である培地中においてアラビノース資化能にかなりの改善を有する単離株が得られ、それはアラビノース適応株である。例えば1つの株は、50g/Lのアラビノースが唯一の炭素源である培地中のアラビノースの約83%を使用する。25g/Lアラビノース、25g/Lキシロース、および50g/Lグルコースを含有する混合糖培地中では改善はより少なく、約74%のアラビノースが使用された。また混合糖培地中では、アラビノースの資化は、グルコースおよびキシロースの資化と比較して遅延された。

0094

改善されたアラビノース資化能を有する株を得るために、上述のようにアラビノース資化遺伝子の発現について遺伝子操作株を約20g/L〜100g/L以上の濃度でアラビノースを唯一の炭素源として含有する培地中での連続成長によって適応させてもよい。適応はより低いアラビノース濃度中であってもよいが、初期成長は約20g/L以上の濃度中である。連続成長は、典型的に少なくとも約25の倍加である。適応は、下述される異種性アラビノース−プロトン共輸送体をアラビノース資化株に導入するステップの前または後であってもよい。これに加えて細胞は、異種性アラビノース−プロトン共輸送体の導入前および後の双方において適応されてもよい。

0095

改善されたアラビノース資化能を遺伝子操作するための発見
出願人らは、大腸菌(E.coli)中に存在する2つの異なるアラビノース輸送系の発現のために、ザイモモナス(Zymomonas)のキシロースおよびアラビノース資化株を遺伝子操作した。2つの輸送系は、1)araFGHによってコードされる3つのタンパク質(araFによってコードされる33kDのペリラスムアラビノース結合タンパク質、araGによってコードされる55kDの膜結合ATPアーゼ、およびaraHによってコードされる34kDの膜結合タンパク質)から構成されるABC輸送体;および2)1つのタンパク質(araEによってコードされる52kDのアラビノース−プロトン共輸送体)から構成されるアラビノース−プロトン共輸送体である。ABC輸送体
はKmが3×10−6Mの高親和性低容量アラビノース輸送体である一方、アラビノース−プロトン共輸送体はKmが1.25×10-4Mの低親和性高容量アラビノース輸送体である。出願人らは、アラビノースのみの培地中では、ABC輸送体の発現が、実際にはアラビノース資化能の低下をもたらすことを見いだした。アラビノース−プロトン共輸送体の発現は、アラビノースのみの培地と、混合糖の培地の双方でアラビノース資化能を増大させた。したがって出願人らは、ザイモモナス(Zymomonas)中で、大腸菌(E.coli)ABC輸送体がアラビノース資化能を改善しない一方、アラビノース−プロトン共輸送体はアラビノース資化能を改善することを発見した。アラビノース−プロトン共輸送体の発現によって、アラビノースのみの培地と、混合糖の培地の双方で、アラビノース資化能は大きく増大した。

0096

アラビノース−プロトン共輸送体の発現は、全ての試験された株でアラビノース資化能を増大させた。これらには、適応なしのアラビノースおよびキシロース資化Z.モビリス(Z.mobilis)株、ストレス条件でキシロース資化について適応させたアラビノースおよびキシロース資化Z.モビリス(Z.mobilis)株(参照によって本明細書に援用する同一譲受人同時係属米国特許出願第12/641642号明細書で開示される)、および上述され実施例2に記載されるように、ストレス条件でキシロース資化とアラビノース資化についても適応されたアラビノースおよびキシロース資化Z.モビリス(Z.mobilis)株が含まれる。アラビノース適応のない株では、アラビノース資化能は、アラビノースのみの培地ならびに混合糖培地中で少なくとも約28%増大した。またアラビノース適応株では、アラビノース資化能は、混合糖培地中で少なくとも約28%増大した。アラビノースのみの培地では、アラビノース−プロトン共輸送体の発現なしのアラビノース適応親株中のアラビノース資化能のレベルは既に約80%であり、したがってアラビノース資化能の増大は20%を越えることはできず約18%であった。

0097

したがってアラビノース資化株とも称される、アラビノースを資化できるあらゆるザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)株を使用して、本株を作り出してもよい。特に有用なのは、キシロースおよびグルコースをさらに資化する株である。これらの株中では、アラビノース−プロトン共輸送体を発現することによって、アラビノース資化能は少なくとも約10%改善される。アラビノース資化能は、少なくとも約10%、12%、16%、18%、20%、24%、28%以上改善されてもよい。%改善は、培地タイプおよびアラビノース−プロトン共輸送体の発現を遺伝子操作するのに使用される親微生物をはじめとする使用される成長条件、ならびに特定の得られた改変株に応じて変動してもよい。変動を引き起こす要因としては、形質転換体の間で異なるかもしれない、導入されたアラビノース−プロトン共輸送体の発現レベル、および得られる輸送体の活性レベルが挙げられる。

0098

アラビノース−プロトン共輸送体の発現
本遺伝子操作ザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)細胞中では、あらゆる細菌アラビノース−プロトン共輸送体が発現されてアラビノース資化能の増大を提供してもよい。ザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)中での発現のための細菌アラビノース−プロトン共輸送体タンパク質およびそれらのコード配列は、ザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)中に天然では見られないので、それらは異種性である。発現されてもよいアラビノース−プロトン共輸送体タンパク質およびコード配列の例としては、大腸菌(E.coli)(コード領域配列番号1;タンパク質配列番号2)、フレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)(コード領域配列番号3;タンパク質配列番号4)、ボイド赤痢菌(Shigella boydii)(コード領域配列番号5;タンパク質配列番号6)、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)(コード領域配列番号7;タンパク質配列番号8)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)(コード領域配列番号9;タンパク質配列番号10)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)(コード領域配列番号11;タンパク質配列番号12)、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)(コード領域配列番号13;タンパク質配列番号14)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)(コード領域配列番号15;タンパク質配列番号16)、エンテロバクターカンセロゲヌス(Enterobacter cancerogenus)(コード領域配列番号17;タンパク質配列番号18)およびバチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)(コード領域配列番号19;タンパク質配列番号20)のaraE遺伝子によってコードされるものが挙げられる。

0099

上に列挙して表1に示した配列番号で例証されるように、アラビノース−プロトン共輸送体コード領域およびコードされるタンパク質の配列は良く知られているので、追加的な適切なアラビノース−プロトン共輸送体は、バイオインフォマティクスアプローチを用いた配列類似性に基づいて、当業者によって容易に同定されてもよい。典型的に、本株中で使用してもよい追加的なアラビノース−プロトン共輸送体、およびそれらのコード配列を同定するのには、本明細書で提供されるものなどの既知のアラビノース−プロトン共輸送体アミノ酸配列を用いた、公的に利用可能なデータベースのBLAST(上述)検索が使用される。これらのタンパク質は、アラビノース−プロトン共輸送体活性を有する一方で、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、または20のアラビノース−プロトン共輸送体のいずれかと、少なくとも約80〜85%、85%〜90%、90%〜95%または95%〜99%の配列同一性を有してもよい。アイデンティティは、GAPPENALTY=10、GAPLENGTH PENALTY=0.1、およびGonnet 250シリーズタンパク質重量マトリックスのデフォルトパラメーターを使用した、アラインメントのClustal W法に基づく。

0100

タンパク質またはコード領域配列およびバイオインフォマティクス法を使用して追加的アラビノース−プロトン共輸送体を同定するのに加えて、本明細書に記載されるまたは当該技術分野で列挙される配列を使用して、自然界のその他の相同体実験的に同定してもよい。例えば本明細書に記載されるアラビノース−プロトン共輸送体をコードする核酸断片のそれぞれを使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の単離については、当該技術分野で良く知られている。配列依存プロトコルの例としては以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。1.)核酸ハイブリダイゼーション法;2.)核酸増幅技術の様々な使用[例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、Mullisらに付与された米国特許第4,683,202号明細書;リガーゼ連鎖反応(LCR)、Tabor,S.ら,Proc.Acad.Sci.USA 82:1074(1985年);または鎖置換増幅(SDA)、Walkerら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:392(1992年)]によって例証される、DNAおよびRNA増幅法、;および3.)相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法

0101

例えば本明細書に記載されるアラビノース−プロトン共輸送体コード配列と類似したタンパク質またはポリペプチドのコード領域は、当業者に良く知られている方法を使用して、あらゆる所望の生物からのライブラリーをスクリーンするためのDNAハイブリダイゼーションプローブとして本核酸断片の全部または一部を使用して、直接単離できる。開示される核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当該技術分野で知られている方法(Maniatis、前出)によってデザインし合成し得る。さらに配列全体を直接使用して、当業者に知られている方法(例えばランダムプライマーDNA標識ニックトランスレーションまたは末端標識技術)によってDNAプローブを合成し、または利用できる生体外転写系を使用してRNAプローブを合成し得る。さらに特定のプライマーをデザインして使用し、本配列の一部(またはその全長)を増幅し得る。得られる増幅産物増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、プローブとして使用し、適切なストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションによって完全長DNA断片を単離し得る。

0102

典型的にPCRタイプ増幅技術では、プライマーは異なる配列を有して互いに相補的でない。所望の試験条件に応じて、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製の双方を提供するようにデザインされるべきである。PCRプライマーデザイン方法は一般的であり、当該技術分野で良く知られている(TheinおよびWallace“The use of oligonucleotides as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders”,in Human Genetic Diseases:A Practical Approach,K.E.Davis編,(1986年)33〜50頁,IRL:Herndon,VA;およびRychlik,W.,In Methodsin Molecular Biology,White,B.A.編,(1993年)第15巻,31〜39頁,PCR Protocols:Current Methods and Applications.Humania:Totowa,NJ)。

0103

一般に、記載される配列の2つの短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコル中で使用して、DNAまたはRNAからの相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローンされた核酸断片のライブラリー上で実施してもよく、その中では1つのプライマーの配列が、記載される核酸断片から誘導され、その他のプライマーの配列は、mRNA前駆体をコードする微生物の遺伝子の3’末端に対するポリアデニル酸トラクトの存在を活用する。

0104

代案としては、第2のプライマー配列は、クローニングベクターから誘導される配列に基づいてもよい。例えば当業者は、RACEプロトコル(Frohmanら、PNAS USA 85:8998(1988年))に従って、PCRを使用して、転写物および3’または5’末端の単一点間の領域のコピーを増幅することによってcDNAを作成し得る。本配列から、3’および5’方向に配向したプライマーをデザインし得る。市販される3’RACEまたは5’RACEシステム(例えばBRL,Gaithersburg,MD)を使用して、特定の3’または5’cDNA断片を単離し得る(Oharaら,PNAS USA 86:5673(1989年);Lohら,Science 243:217(1989年))。

0105

代案としては、記載されるアラビノース−プロトン共輸送体コード配列を相同体を同定するためのハイブリダイゼーション試薬として用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基礎的構成要素としては、プローブ、関心のある遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が挙げられる。プローブは、典型的に、検出される核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出される核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は、5個の塩基から数万個の塩基まで変動し得て、実施される特定の試験に左右される。典型的に、約15塩基から約30塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが検出される核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列間の相補性は、必ずしも完璧である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間では起きず、その結果、ハイブリダイズした領域内の特定の塩基画分は、適切な相補的塩基と対をなさない。

0106

ハイブリダイゼーションの方法については、詳細に定義されている。典型的にプローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくては
ならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩の存在下でプローブとサンプルを接触させるステップを伴う。プローブとサンプル核酸は、プローブとサンプル核酸の間のあらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるのに十分な時間接触させなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションが起きるのに必要な時間を左右する。プローブまたは標的濃度が高いほど、より短いハイブリダイゼーションインキュベーションが必要である。任意にカオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性阻害することで核酸を安定化する。さらにカオトロピック剤は、室温における短いオリゴヌクレオチドプローブの高感度でストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする(Van NessおよびChen,Nucl.AcidsRes.19:5143〜5151(1991年))。適切なカオトロピック剤としては、特に塩化グアニジニウムグアニジウムチオシアネートチオシアン酸ナトリウムテトラクロロ酢酸リチウム過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウムヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的に、カオトロピック剤は約3Mの最終濃度で存在する。所望ならば、ホルムアミドを典型的に30〜50%(v/v)で、ハイブリダイゼーション混合物に添加してもよい。

0107

様々なハイブリダイゼーション溶液を用い得る。典型的に、これらは約20〜60容積%、好ましくは30容積%の極性有機溶媒を含んでなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約30〜50%v/vのホルムアミド、約0.15〜1Mの塩化ナトリウム、約0.05〜0.1Mの緩衝液(例えばクエン酸ナトリウム、Tris−HCl、PIPESまたはHEESpH範囲約6〜9))、約0.05〜0.2%の洗剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム)、または0.5〜20mMのEDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(約300〜500kdal)、ポリビニルピロリドン(約250〜500kdal)、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約0.1〜5mg/mLの未標識キャリア核酸断片化核DNA(例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子DNA、または酵母RNA)、および任意に約0.5〜2%wt/volのグリシンも含まれる。多様な極性水溶剤または膨潤剤(例えばポリエチレングリコール)、アニオン性ポリマー(例えばポリアクリレートまたはポリアクリル酸メチル)、およびアニオン性糖重合体(例えば硫酸デキストラン)をはじめとする体積排除剤などのその他の添加剤もまた含めてもよい。

0108

核酸ハイブリダイゼーションは、多様なアッセイ形態に適合できる。最も適した1つが、サンドイッチアッセイ形態である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下におけるハイブリダイゼーションに特に適合する。サンドイッチタイプアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部に相補的な核酸プローブ吸着され、またはそれと共有結合的に共役して、それを固定化する。

0109

アラビノース−プロトン共輸送体の発現は、アラビノース−プロトン共輸送体をコードする配列を用いて形質転換することで達成される。当該技術分野で知られているように、遺伝コードの縮重の理由から、アミノ酸配列をコードするDNA配列中に多様性があってもよい。当業者に良く知られているように、コード配列は、標的ザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)宿主細胞中における最大の発現のためにコドン最適化されてもよい。典型的に、所望のコード領域と作動的に連結してザイモモナス(Zymomonas)細胞中で活性のプロモーター、ならびに転写ターミネーターを含むキメラ遺伝子が、発現のために使用される。アラビノース資化のためのタンパク質発現のために、上で述べた例などのザイモモナス(Zymomonas)細胞中で活性のあらゆるプロモーターを使用してもよい。上述したようにコード領域が異なる生物からのものであるため、プロモーターおよびアラビノース−共輸送体コード領域を用いて構築されたキメラ遺伝子は、ザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)中での発現について異種遺伝子である。発現および/また
は組み込みのためのベクターは、アラビノース資化のためのタンパク質発現について上述した通りである。

0110

改善されたエタノール生産
本株は、唯一の炭水化物源としてアラビノースがある培地中で、およびアラビノースを含む混合糖がある培地中で、改善されたアラビノース資化能を有する。本株はまた、改善されたエタノール生産も有する。アラビノース−プロトン共輸送体発現遺伝子の導入に先だつ親株と比較して、アラビノース−プロトン共輸送体を発現する株のエタノール生産は増大する。エタノール生産の増大は、発酵で使用される培地および成長条件、ならびに生体触媒として使用されるアラビノース−プロトン共輸送体発現株次第で変動してもよい。典型的にエタノール生産は少なくとも約10%増大してもよく、約10%、12%、16%,18%、20%、24%、28%以上増大してもよい。

0111

改善されたアラビノース資化株の発酵
株に天然の生成物、または株が産生するよう遺伝子操作された生成物を生産する発酵において、L−アラビノースイソメラーゼ、L−リブロキナーゼ、L−リブロース−5−リン酸−4−エピメラーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼの発現のために、アラビノース−プロトン共輸送体および遺伝子またはオペロンを発現する遺伝子操作されたアラビノース資化株を使用してもよい。例えばザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)およびザイモバクター・パルメ(Zymobacter
palmae)は、天然のエタノロジェンである。キシロースもまた資化する、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの発現のためにさらに遺伝子操作された株が好ましい。例として、キシロースおよびアラビノースを資化する本発明のZ.モビリス(Z.mobilis)株によるエタノールの生産について記載する。Z.モビリス(Z.mobilis)は、天然でグルコースもまた資化する。

0112

エタノール生産のために、アラビノース−プロトン共輸送体を発現する組み換えキシロースおよびアラビノース資化Z.モビリス(Z.mobilis)をアラビノース含有培地と接触させる。典型的に培地は、アラビノース、キシロース、およびグルコースを含む混合糖を含有する。培地は、加工セルロース性またはリグノセルロース性バイオマスに由来する糖を含む、生物由来資源加水分解産物を含有してもよい。

0113

同一譲受人同時係属米国特許公開第20080081358−A1号明細書で開示されるように、成長が阻害される程に混合糖の濃度が高い場合、培地はソルビトールマンニトール、またはその混合物を含む。ガラクチトールまたはリビトールをソルビトールまたはマンニトールで置換してもよく、またはそれと組み合わせてもよい。Z.モビリス(Z.mobilis)は、発酵が起きてエタノールが生産される培地中で培養する。発酵は、空気、酸素、またはその他の気体補給なしに(嫌気性、微有酸素性、または微好気性発酵などの条件を含んでもよい)、少なくとも約24時間実施され、30以上時間実施されてもよい。最大のエタノール生産に達するタイミングは、発酵条件次第で変動する。典型的に、培地中に阻害物質が存在するとより長い発酵時間が必要である。発酵は、約30℃〜約37℃の温度および約4.5〜約7.5のpHで実施されてもよい。

0114

本Z.モビリス(Z.mobilis)は、実験室規模発酵槽内で、および商業的な量のエタノールが生産される大規模発酵において、アラビノースを含む混合糖を含有する培地中で培養してもよい。エタノールの商業生産が所望される場合、多様な培養法を応用してもよい。例えば本Z.モビリス(Z.mobilis)株からの大量生産は、バッチおよび連続培養法の双方によって生成されてもよい。古典的バッチ培養法閉鎖系であり、培地組成物培養開始時に設定され、培養過程中に人為的変更を受けない。したがって培養過程の開始時に所望の生物を培地に接種して、システムに何も添加することなく成長または代謝活性を生じさせる。しかし典型的に、「バッチ」培養は炭素源の添加に関してのバッチであり、pHおよび酸素濃度などの要素を制御する試みがなされることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物由来資源組成物は、培養が終結する時点まで常に変化する。バッチ培養中では、細胞は、静止遅滞期から高成長対数期を経て、最後に成長率が減少しまたは停止する定常期に至る。処置されない場合、定常期の細胞はやがて死滅する。対数期の細胞は、いくつかのシステムにおいて、最終産物または中間体の生成の大半の責を負うことが多い。その他のシステムでは、静止期または対数後期生産があり得る。

0115

標準バッチシステムの変法が、流加システムである。流加培養過程もまた、本Z.モビリス(Z.mobilis)株の成長に適し、培養過程の進行に伴って基質が徐々に添加されることを除いては、典型的なバッチシステムを含んでなる。流加システムは、異化代謝産物抑制が細胞代謝を阻害する傾向がある場合、そして培地中に限定的量の基質を有することが望ましい場合に有用である。流加システム中の実際の基質濃度の測定は困難であり、したがってpHやCO2などの廃ガス分圧などの測定可能な要素の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加培養法は一般的で、当該技術分野で良く知られており、参照によって本明細書に援用するBiotechnology:A Textbook of
Industrial Microbiology,Crueger,Crueger,およびBrock,第2版(1989年)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA、またはDeshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36,227,(1992年)に例が見られる。

0116

エタノールの商業生産はまた、連続培養を用いて達成されてもよい。連続培養は、規定培地バイオリアクターに連続的に添加され、同時に加工のために等量の慣熟培地が取り出される開放系である。連続の培養は、一般に、細胞が主として対数成長期にある一定の高液相密度に細胞を保つ。代案としては、固定化細胞を用いて連続培養を実施してもよく、そこでは炭素および栄養素が連続的に添加され、価値ある生成物、副産物または老廃物細胞集団から連続的に除去される。細胞固定化は、当業者に知られている天然および/または合成材料から構成される、多様な固体担体を使用して実施してもよい。

0117

連続または半連続培養は、細胞成長または最終産物濃度に影響を及ぼす、1つの要素またはあらゆる数の要素の調節を可能にする。例えば1つの方法は、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質定率に保ち、その他の全パラメーターを加減する。別のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響を及ぼすいくつかの要素を連続的に変更し得る。連続系恒常的成長条件を保つことを目指し、したがって培地の除去による細胞損失は、培養中の細胞成長率に対して平衡状態になくてはならない。連続培養過程のために栄養素および増殖因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の技術分野で良く知られており、多様な方法がBrock、前出で詳述されている。

0118

エタノール生産に特に適するのは、次のような発酵計画である。本発明の所望のZ.モビリス(Z.mobilis)株を軌道振盪機内で約150rpmで振盪しながら約30℃〜約37℃の半天然培地中で振盪フラスコ内で培養し、次に同様の培地を含有する10Lの種発酵槽に移す。OD600が3〜6になるまで種培養物を種発酵槽内で嫌気的に培養してから、発酵パラメーターをエタノール生産のために最適化した生産発酵槽に移す。種タンクから生産タンクに移される典型的な接種体積は、約2%から約20%v/vの範囲に及ぶ。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム(1.0〜10.0g/L)、硫酸アンモニウム(0〜2.0g/L)、硫酸マグネシウム(0〜5.0g/L)、酵母抽出物またはダイズベース製品などの複合窒素源(0〜10gL)などの最少培地構成要素を含有する。最終濃度約5mMのソルビトールまたはマンニトールが培地中に存在する。最初の炭素源バッチ(50〜200g/l)の枯渇に際し、炭素源を提供するアラビノースと、グルコース(またはスクロース)などの少なくとも1つの追加的糖とを含む混合糖が発酵容器に継続的に添加されて、エタノール速度と力価を最大化する。炭素源供給速度は動的に調節されて、酢酸などの毒性副産物の蓄積をもたらし得る過剰なグルコースを培養が蓄積しないようにする。資化される基質から生成するエタノールの収率を最大化するために、最初にバッチ供給され、または発酵過程中に供給される一定量のリン酸塩によって、バイオマス成長を制限する。発酵は、腐食性溶液水酸化アンモニウム水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムなど)および硫酸またはリン酸のどちらかを使用して、pH5.0〜6.0に調節される。発酵槽の温度は30℃〜35℃に調節される。気泡を最小限にするために、消泡剤シリコーン基剤有機基剤などのあらゆる種類)を必要に応じて容器に添加する。株中にそれに対する抗生物質耐性マーカーがある場合、カナマイシンなどの抗生物質を任意に使用して汚染を最小限にしてもよい。

0119

さらに発酵は、SSF(同時糖化発酵)法を使用した糖化と同時に起きてもよい。この方法では、生物由来資源が生産生体触媒によって代謝されるにつれて、糖が生物由来資源から生成する。

0120

上述のあらゆる条件の組、さらに当該技術分野で良く知られているこれらの条件のバリエーションは、アラビノース−プロトン共輸送体の異種性コード領域を導入することによりアラビノース−プロトン共輸送体を発現するように遺伝子操作された、アラビノース資化組み換えザイモモナス(Zymomonas)またはザイモバクター(Zymobacter)株によるエタノール生産のための適切な条件である。

0121

本発明を以下の実施例でさらに定義する。実施例は、本発明の好ましい実施態様を示唆しながら、例証としてのみ提供されることを理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。

0122

一般方法
実施例で使用する標準組み換えDNAおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.およびManiatis,T.,「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第2版」、Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1989年)(下文において「Maniatis」);およびSilhavy,T.J.,Bennan,M.L.およびEnquist,L.W.,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1984年);およびAusubel,F.M.ら,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley−Interscienceによる出版,Hoboken,NJ(1987年)に記載されている。

0123

略語の意味は次の通り。「kb」はキロベースを意味し、「bp」は塩基対を意味し、「nt」はヌクレオチドを意味し、「hr」は時間を意味し、「min」は分を意味し、「sec」は秒を意味し、「d」は日を意味し、「L」はリットルを意味し、「ml」はミリリットルを意味し、「μL」はマイクロリットルを意味し、「μg」はマイクログラムを意味し、「ng」はナノグラムを意味し、「mM」はミリモル濃度を意味し、「μM」はマイクロモル濃度を意味し、「nm」はナノメートルを意味し、「μmol」はマイクロモルを意味し、「pmol」はピコモルを意味し、「Cm」はクロラムフェニコールを意味し、「Cmr」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Cms」はクロラムフェニコール感応性を意味し、「Spr」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Sps」はスペクチノマイシン感応性を意味し、「UTR」は非翻訳領域を意味し、「RBS」はリボソーム結合部位を意味する。

0124

プライマーは、特に断りのない限りSigma(St.Luis,MO)によって合成された。

0125

実施例1
ザイモモナス(Zymomonas)中のアラビノース資化タンパク質のためのオペロンの構築および発現
アラビノース資化のためにザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)を遺伝子操作するために、大腸菌(E.coli)araA、araB、およびaraCコード領域をZ.モビリス(Z.mobilis)プロモーターと共にオペロン中で構築し、Z.モビリス(Z.mobilis)細胞中のプラスミド上で発現させた。AraB、araA、およびaraDは、それぞれタンパク質L−リブロースキナーゼ、L−アラビノースイソメラーゼ、およびL−リブロース−5−リン酸−4−エピメラーゼをコードし、それはトランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ活性と併せて、アラビノース同化作用経路を提供する(図1参照)。

0126

1.大腸菌(E.coli)araBADコード配列およびZ.モビリス(Z.mobilis)Pgapプロモーターをクローニングする
大腸菌(E.coli)のaraB、araA、およびaraDコード領域(それぞれ配列番号23、21、および25)は、araBADオペロン中に存在する。それぞれ順方向および逆方向プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーara1(配列番号28)およびara2(配列番号29)を使用して、araB−araADNA断片(araBA;配列番号27)を調製した。プライマーara1は、araBコード領域の開始コドンATGの前にヌクレオチドCCを付加してNcoI部位を作り出す。プライマーara2は、araAコード領域の停止コドンの後にXbaI部位を付加する。araD DNA断片(配列番号30)は、それぞれ順方向および逆方向プライマーであるオリゴヌクレオチドプライマーara3(配列番号31)およびプライマーara4(配列番号32)を使用して調製された。プライマーara3は、araDコード領域に対して5’である、リボソーム結合部位(RBS)配列の5’末端にXba部位を付加する。プライマーara4は、araDコード領域に対して3’である、3’非翻訳領域(UTR)の後にHindIII部位を付加する。WizardゲノムDNA精製キット(Promega,Madison,WI)を使用して、50μLのAccuPrime Pfx SuperMix(Invitrogene,Carlsbad,CA)、1μLの10μM順方向および逆方向プライマー、およびMG1655(ATCC番号700926;K12株)から調製された2μL(約50〜100ng)の大腸菌(E.coli)ゲノムDNAを含む、標準PCR反応において各プライマー対を使用した。プライマーara1およびara2を使用した反応を95℃で5分間実施し、35サイクルの95℃で30秒間/56℃で30秒間/68℃で3.5分間がそれに続き、68℃で7分間で終了した。それは5’NcoI部位およびa3’XbaI部位がある3226bpのaraB−araA断片をもたらした(配列番号27)。68℃での延長時間が1.5分間に短縮されたこと以外は同様のプログラムを使用して、プライマーara3およびara4を使用した別の反応を実施した。それは5’XbaI部位および3’HindIII部位がある889bpのaraD断片(araD3’UTRを含む)を生じた(配列番号30)。

0127

araBADオペロンのための天然大腸菌(E.coli)プロモーターは誘導性プロ
モーターであり、それはZ.モビリス(Z.mobilis)中での所望の発現に適さない。Z.モビリス(Z.mobilis)中での発現のための強力な構成的プロモーターであることから、Z.モビリス(Z.mobilis)GAP(グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素)プロモーター(Pgap;配列番号33)を使用した。オリゴヌクレオチドプライマーara10およびara11を使用して、Z.モビリス(Z.mobilis)Pgapを含有するDNA断片を調製した。プライマーara10(配列番号34)は、プロモーターDNA断片の5’末端にSacIおよびApeI部位を付加する順方向プライマーである。プライマーara11(配列番号35)は、プロモーターの最後の2つのヌクレオチドをACからCCに変化させる逆方向プライマーであり、したがってそれはプロモーターDNA断片の3’末端にNcoI部位を付加する。DNAテンプレートとしてPgapを含有するプラスミドを使用し、これらの2つのプライマーを上述したような標準PCR反応で使用して、5’SacIおよびSpeI部位および3’NcoI部位がある323bpのPgapプロモーターDNA断片(配列番号36)を作成した。

0128

これらの各PCR産物を製造業者使用説明書に従って、TOPO Blunt Zeroベクター(Invitrogen,Calsbad,CA)にクローンした。得られたプラスミドpTP−araB−araA、pTP−araD、およびpTP−Pgapを大腸菌(E.coli)DH5a細胞(Invitrogen)中で増殖させ、Qiagen DNA Miniprepキットを使用してそれぞれを調製した。それらの配列をDNA配列決定によって確認した。

0129

2.シャトルベクター内でPgap−araBADオペロンをアセンブルする
ベクターpZB188(Zhangら(1995年)Science 267:240〜243;米国特許第5514583号明細書)をベースとし、ベクターがザイモモナス(Zymomonas)細胞中で複製できるようにする複製領域を含有する、2,582bpのZ.モビリス(Z.mobilis)ゲノムDNA断片を含む、pZB188aadaと称されるザイモモナス(Zymomonas)−大腸菌(E.coli)シャトルベクター内で、Pgap−araBADオペロンをアセンブルした。pZB188aada中では、テトラサイクリン耐性カセット(Tcr−カセット)pZB188が、スペクチノマイシン耐性カセット(Specr−カセット)で置換された。プラスミドpHP15578(Cahoonら,(2003年)Nature Biotechnology 21:1082〜1087)をテンプレートとして、プライマー1(配列番号32fromCL4236)および2(配列番号33fromCL4236)を使用したPCRによって、Specr−カセットを作成した。プラスミドpHP15578は、3’(9)−O−ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするTranposon Tn7 aadA遺伝子(GenBank登録番号X03043)の公開された配列をベースとする、Specr−カセットおよびそのプロモーターのための完全なヌクレオチド配列を含有する。
プライマー1(配列番号37):



プライマー2(配列番号38):

0130

プライマー1(順方向プライマー)の下線付き塩基は、Specr−カセットのプロモーターのすぐ上流で(GenBank登録番号X03043のnts4〜22に)ハイブリダイズする一方、小文字はプライマーの5’末端に付加されたClaI部位に相当する。プライマー2(逆方向プライマー)の下線付き塩基は、Specr−カセットの停止コドンの約130塩基下流で(GenBank登録番号X03043のnts1002〜1020に)ハイブリダイズする一方、小文字はプライマーの5’末端に付加されたAflIII部位に相当する。PCRにより生じた1048bpのSpecr−カセットをClaIとAflIIIで二重消化し、得られたDNA断片をQIAquick PCR精製キット(Qiagen、カタログ番号28104)と供給業者推奨プロトコルを使用して精製した。((damメチル化に感応性の)ClaIで切断するため、非メチル化プラスミドDNAを得るために大腸菌(E.coli)SSC110(dcm−、dam−)から単離された)プラスミドpZB188をClaIとBssHIIで二重消化してTcr−カセットを除去し、得られた大きなベクター断片をアガロースゲル電気泳動法によって精製した。次にこのDNA断片と精製PCR産物を共に連結させ、Stratageneから入手した化学的コンピテント細胞(カタログ番号200239)を使用して、形質転換反応混合物を大腸菌(E.coli)JM110中に導入した。BssHIIおよびAflIIIは適合性の「付着末端」を発生させるが、それらが共に連結すると、どちらの部位も破壊されることに留意されたい。スペクチノマイシン(100μg/ml)を含有するLB培地上に形質転換体を播種して、37℃で培養した。正確なサイズの挿入断片があるプラスミドを含有する、スペクチノマイシン耐性形質転換体をNotIを用いた制限酵素消化分析によって同定し、pZB188/aadaと命名した。

0131

pTP−PgapSpeI−NcoI Pgap断片、pTP−araB−araA NcoI−XbaI araB−araA断片、およびpTP−araD XbaI−NotI araD断片を全てNotI−SpeI pZB188/aadaベクターにクローンして、Pgap−araBADオペロンを含有するpZB188aadaベースのシャトルベクターを形成した。pARA201と称される得られたプラスミドを大腸菌(E.coli)DH5a中で増殖させ、Qiagen DNA Miniprepキットを使用して調製した。Pgapの3’末端のヌクレオチドをCCから元のACヌクレオチドに戻すことによって、pARA205(図2;配列番号41)をpARA201から調製した。これはQickChange XL部位特異的変異誘発キット(Stratagene,La Jolla,CA)を使用して実施した。この変異誘発では、順方向プライマーara31(配列番号30)および逆方向プライマーara32(配列番号40)を使用して、製造業者の使用説明書に従って改変を行った。pARA205を大腸菌(E.coli)DH5a中で増殖させ、Qiagen DNA Miniprepキットを使用して調製した。

0132

3.araBADをZ.モビリス(Z.mobilis)中で発現する
Pgap−araBADがZ.モビリス(Z.mobilis)中で機能するオペロンであることを確認するために、pARA205を発現のためにZ.モビリス(Z.mobilis)株ZW801−4に導入した。ZW801−4は、Z.モビリス(Z.mobilis)のキシロース資化株である。ZW658、ZW800、およびZW801−4株の構築および特性解析は、参照によって本明細書に援用する同一譲受人同時係属米国特許出願公開第20080286870−A1号明細書に記載される。逐次遺伝子転位事象を通じて、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼをコードする4つのキシロース資化遺伝子を含有する2つのオペロン、PgapxylABおよびPgaptaltktをZW1(ATCC#31821)ゲノムに組み込み、続いてキシロースを含有する選択培地上で適応させることで、ZW658(ATCC#PTA−7858)を構築した。ZW800はZW658の誘導体であり、それはグルコース−果糖オキシド還元酵素(GFOR)酵素をコードする配列中にスペクチノマイシン耐性カセットの二重交叉挿入を有して、この活性をノックアウトする。ZW801−4はZW800の誘導体であり、その中ではスペクチノマイシン耐性カセットが部位特異的遺伝子組み換えによって欠失しており、タンパク質を時期尚早切り詰めるインフレームの停止コドンが残されている。

0133

ZW801−4のコンピテント細胞は、種細胞をMRM3G5(1%酵母抽出物、15mMKH2PO4、4mMMgSO4、および50g/Lグルコース)中において150rpmで振盪しながら、30℃でOD600値が5近くになるまで一晩培養することによって調製した。細胞を収集し、新鮮な培地にOD600値0.05に再懸濁した。それらを同一条件下で、対数初期または中期(OD600が0.5に近い)までさらに培養した。細胞を収集して、氷冷水で2回、次に氷冷10%グリセロールで1回洗浄した。得られたコンピテント細胞を収集し、氷冷10%グリセロールにOD600値100近くに再懸濁した。Z.モビリス(Z.mobilis)の形質転換には非メチル化DNAを要するので、pARA205プラスミドを大腸菌(E.coli)SCS110コンピテント細胞(Stratagene)に形質転換した。形質転換細胞の1つのコロニーを10mLのLB−Amp100(100mg/Lアンピシリンを含有するLBブロス)中で37℃で一晩培養した。Qiagen DNA Miniprepキットを使用して、10mLの培養物からDNAを調製した。

0134

1MM電気穿孔キュベット(VWR,West Chester,PA)内で、およそ500ngの非メチル化pARA205プラスミドDNAを50μLのZW801−4コンピテント細胞と混合した。BT720 Transporater Plus(BTX−Genetronics,San Diego,CA)を使用して、プラスミドDNAを2.0KVで細胞中に電気穿孔した。形質転換細胞を1mLのMMG5培地(50g/Lのグルコース、10g/Lの酵母抽出物、5g/Lのトリプトン、2.5g/Lの(NH4)2SO4、0.2g/LのK2HPO4、および1mMのMgSO4)中において30℃で4時間回復させ、AnaeroPack付き嫌気性ジャー(Mitsubishi Gas Chemical,New York,NY)内で、MMG5−Spec250プレート(250mg/Lスペクチノマイシンおよび15g/L寒天添加MMG5)上で30℃で2日間培養した。個々のコロニーをMMA5−Spec250(MMG5−Spec250と同一であるがグルコースが50g/Lアラビノースによって置換されている)プレート上、および新しいMMG5−Spec250プレート上に二連画線塗抹した。上述したのと同一条件下で画線培養は良好に成長したが、MMA5−Spec250プレート上の成長にはより長時間かかった。これはPgap−araBADオペロンが発現したことを示唆した。

0135

MMG5−Spec250プレート上に成長した形質転換細胞の2本の画線培養(ZW801−ara205−4およびZW801−ara205−5)を72時間成長アッセイのために選択した。アッセイでは、各画線培養からの細胞を2mLのMRM3G5−Spec250(250mg/Lスペクチノマイシン添加MRM3G5)中において150rpmで振盪しながら、30℃で一晩培養した。細胞を収集してMRM3A5(MRM3G5と同一であるがグルコースがアラビノースによって置換されている)で洗浄し、MRM3A5−Spec250(250mg/Lスペクチノマイシンを含有するMRM3A5)に再懸濁して、0.1の開始OD600を得た。4mLの懸濁液を14mLの蓋付きFalcon管に入れて、150rpmで振盪しながら30℃で72時間培養した。培養の終わりにOD600を測定した。次に1mLの培養物を10,000×gで遠心分離して、細胞を除去した。0.22μmのCostar Spin−X遠心管フィルター(Corning Inc,Corning,NY)を通して上清濾過し、Agilent 1100HPLCシステム(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)で、55℃で0.6mL/分の速度で0.01NのH2SO4を用いてBioRad Aminex HPX−A7Hイオン排除カラム(BioRad,Hercules,CA)を通過させて分析し、エタノールおよび糖濃度を判定した。並行して、対照としてZW801−4を(抗生物質なしで)培養し分析した。表2に示す結果は、araBADの発現がZ.モビリス(Z.mobilis)ZW801−4を成長できるようにし、唯一の炭素源としてアラビノースを使用してエタノールを生成できるようにしたことを実証する。

0136

0137

実施例2
Z.モビリス(Z.mobilis)ゲノムへのアラビノース資化オペロンの組み込みおよび得られた株の特性解析
この実施例は、Z.モビリス(Z.mobilis)の2つのキシロース資化株へのPgap−araBADオペロンの安定した組み込みについて記載する。

0138

1.Pgap−araBADオペロンを自殺ベクターに構築する
Pgap−araBADオペロンをZ.モビリス(Z.mobilis)のゲノムに組み込むために、DCO(二重交叉)相同的組換えのための自殺ベクターを調製した。Pgap−araBADに加えて、このベクターは、Pgap−araBADの組み込みを導くDCO相同的組換え断片と、スペクチノマイシン耐性のための選択的マーカーを提供するaadA遺伝子とを含んだ。我々は挿入部位としてldhA遺伝子座を選んだ。Z.モビリス(Z.mobilis)ZW801−4 DNAをテンプレートとして使用し、DCO、LDH−L、およびLDH−Rのための2つのldhADNA断片をPCRによって合成した。反応はAccuPrime Mixを使用して、実施例1に記載される標準PCR手順に従った。LDH−L DNA断片は、順方向プライマーara20(配列番号42)および逆方向プライマーara21(配列番号43)を使用して合成された。得られた生成物は、ldhAコード領域に対して5’の配列、およびldhAコード領域のヌクレオチド1〜493を含む895bpのDNA断片であり、5’SacI部位および3’SpeI部位があった(配列番号44)。LDH−R DNA断片は、順方向プライマーara22(配列番号45)および逆方向プライマーara23(配列番号46)を使用して合成した。得られた生成物は、ldhAコード領域のヌクレオチド494〜996、およびldhAコード領域に対して3’の配列を含む1169bpの断片であり、5’EcoRI部位および3’NotI部位があった(配列番号47)。

0139

pBSベクターはザイモモナス(Zymomonas)中で複製できないことから、pBSSK(+)(Bluescriptプラスミド;Stratagene)を自殺ベクターとして使用した。pARA205のPgap−araBADオペロン、LDH−L断片、およびLDH−R断片をpBSSK(+)中にクローニングすることで、pARA354(配列番号49)を構築した。さらに野性型LoxP部位(LoxPw−aadA−LoxPw断片;配列番号48)によって境界される、(スペクチノマイシン耐性のための)aadAマーカーを含有するDNA断片をpARA354に含めた。pARA354はLDH−LとLDH−R配列との間に位置する、Pgap−araBADオペロンおよびLoxPw−aadA−LoxPwマーカー断片を有する。

0140

図3は10,441bpのpARA354のマップを示す。これはf1(+)orig
inと、大腸菌(E.coli)中のプラスミド増殖のためのアンピシリン耐性遺伝子とを有する。LDH−LおよびLDH−Rは、それぞれldhAコード配列の最初の493塩基対と残りの503塩基対を有したので、交叉型組み換えによって、Z.モビリス(Z.mobilis)のldhAコード配列に、ヌクレオチド#493と#494の間でPgap−araBADおよびaadAを直接挿入するために、pARA354がデザインされた。

0141

2.Pgap−araBAD組み込み株を作成する
Z.モビリス(Z.mobilis)株ZW705はZ.モビリス(Z.mobilis)の遺伝子操作株であり、ストレス条件下で改善されたキシロース資化能があり、参照によって本明細書に援用する同時係属同一譲受人の米国特許出願第12/641642号明細書に記載されるように、連続培養中での適応によってZW801−4から誘導される。ZW801−4キシロース資化ザイモモナス(Zymomonas)細胞を少なくとも約50g/Lのキシロースを含んでなる培地中で連続培養して、エタノールを含んでなる培養物を生成し、次にアンモニアおよび酢酸を添加してストレス培養物を作成した。細胞をストレス培養中でさらに連続培養して、ZW705株をはじめとする改善されたキシロース資化能を有する細胞を単離した。

0142

pARA354をZW705およびZW801−4株の双方に形質転換するために、各株から調製された50μLコンピテント細胞中に、800ngの非メチル化プラスミドDNAを電気穿孔した。DNA脱メチル化、コンピテント細胞調製、および電気穿孔は、実施例1に記載されるように実施した。各株の形質転換細胞のコロニーをAnaeroPack付き嫌気性ジャー内において、MMG5−Spec250プレート上で30℃で2日間培養した。pARA354はZ.モビリス(Z.mobilis)中で複製できないので、スペクチノマイシン耐性は、これらのコロニーが組み込み株であることを示唆した。コロニーを新らしいMMG5−Spec250プレートおよびMMA5−Spec250プレートの上に二連で画線塗抹し、それぞれ2日間および4日間培養した。MMA5−Spec250プレート上のそれらの成長もまた、組み込みを示唆した。組み込みをさらに実証するために、Pgap−araBAD−aadA断片とZ.モビリス(Z.mobilis)ゲノムDNAとの間の接合部をPCRSuper Mix(Invitrogen)、一対のプライマー、および試験する形質転換細胞を含有する標準35サイクルPCR反応によって検査した。1つのPCRサイクルは、95℃で45秒間の変性、58℃で45秒間のアニーリング、および72℃で2分間の延長を含んだ。プライマーara45(配列番号50)およびプライマーara42(配列番号51)は、それぞれ、Z.モビリス(Z.mobilis)ゲノムDNA中のLDH−L配列の上流に位置する順方向プライマー、およびpARA354のaraB遺伝子中に位置する逆方向プライマーであった。このプライマー対は、PCRによって検査された全コロニーから1694bpの断片を増幅した。それぞれZ.モビリス(Z.mobilis)ゲノムDNA中のpARA354のaadA遺伝子中に位置する順方向プライマー、およびLDH−R配列の下流に位置する逆方向プライマーである、プライマーara46(配列番号52)およびプライマーara43(配列番号53)もまた使用された。このプライマー対は、PCRによって調査された全てのコロニーから1521bpの断片を増幅した。したがってPgap−araBAD−aadA断片は、DCOアプローチによってZW801−4およびZW705ゲノムに成功裏に組み込まれた。DCO相同的組換えは標的特異性組み込みであることから、ZW801−4またはZW705の組み込みから生じるあらゆるコロニーは同一の遺伝子型を有する。各組み込みからのコロニーを5mLのMRMG5−Spec250中において、150rpmで振盪しながら30℃で一晩培養した。細胞を遠心分離によって収集し、0.5mLの50%グリセロールに再懸濁して、次に−80℃で保存した。株をZW705−ara354およびZW801−ara354と命名した。

0143

組み込まれたPgap−araBADオペロンの機能をさらに改善するために、ZW705−ara354株を適応させた。この目的で、ZW705−ara354の一晩培養物を遠心分離によって収集し、MRM3A5で洗浄して、0.1のOD600でMRM3A5−Spec250に再懸濁した。この懸濁液4mLを14mLのFalcon蓋付き管に入れて、150rpmの振盪機内でOD600が1を越えるまで30℃で72時間培養した。次に培養物を4mLの新鮮なMRM3A5−Spec250を含有する新しいFalcon管に接種して、2回目の培養のために開始OD600を0.1近くにした。全部で9回の連続培養を完了した。各培養はOD600をおよそ0.1から1以上にし、細胞がはるかにより緩慢に成長したために6日かかった4回目の培養を除いて、3〜4日間を要した。適応株を特性解析するために、9回目の培養を100倍に希釈して、10μLの希釈液をMMA5−Spec250プレート上に塗布し、AnaeroPack付き嫌気性ジャー内で30℃で3日間培養した。個々のコロニー(すなわち適応株)を拾って、150rpmの振盪機上で、3mLのMRM3G5−Spec250中において30℃で一晩培養した。実施例1記載されるように、それらにMRM3A5−Spec250中での72時間成長アッセイを施した。ZW705−ara354株は、アッセイ中で対照として使用した。5つの適応株(ZW705−ara354A4〜A8)の分析データは表3に提示され、全ての適応株がZW705−ara354よりも良い成績を示した。ZW705−ara354A7は、成長、エタノール生産、およびアラビノース資化の観点から最良の株であった。

0144

0145

3.適応ありまたはなしのPgap−araBAD組み込み株の成長および代謝産物プロフィールを特性解析する
唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地中、および混合糖を含有する培地中において、アラビノースを資化して細胞成長とエタノール生産を支える能力について、Pgap−araBAD組み込み株をさらに特性解析した。唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地中においてこれらの株を特性解析するために、最初にZW705−ara354およびZW705−ara354A7細胞を150rpm振盪機内で2mLのMRM3G5−Spec250中において30℃で一晩培養した。細胞を収集してMRM3A5で洗浄し、0.1の開始OD600でMRM3A5−Spec250に再懸濁した。20mLの懸濁液を50mLねじ蓋付きVWR遠心管に入れて150rpmで振盪しながら30℃で96時間にわたって培養した。時間経過中に、OD600をそれぞれ0、24、48、72、および96時間目に測定した。各時点において、1mLの培養物を取り出して10,000×gで遠心分離し、細胞を除去した。0.22μmのCostar Spin−X遠心管フィルターを通して上清を濾過し、Agilent 1100HPLCシステム上において55℃で0.6mL/分間の速度を使用して、0.01N H2SO4を用いて、BioRad Aminex HPX−A7Hイオン排除カラムを通過させて、エタノールおよび糖濃度について分析した。並行してZW705を抗生物質なしの培地中で培養し、対照として分析した。結果を図4に示す。これらの結果は、Pgap−araBADなしではZW705がアラビノースを代謝できず、アラビノースが唯一の炭素源である場合、成長できないことを示唆する(図4A)。Pgap−araBADの組み込み後、ZW705−ara354はアラビノースを資化して、成長およびエタノール生産を支えることができる(図4B)。アラビノース消費の最大速度は0.2g/L/hrであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は32.8%低下して34g/Lになった。適応はZW705−ara354A7中のアラビノース資化能、細胞成長、およびエタノール生産を大幅に改善した。アラビノース消費最大速度は、0.73g/L/hrであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は83.4%低下して8.4g/Lになった。

0146

混合糖を含有する培地中において株を特性解析するために、ZW705、ZW705−ara354、およびZW705−ara354A7を上述のように培養して分析したが、先の実験で使用したMRM3A5培地は、MRM3A2.5X2.5G5培地(25g/Lアラビノース、25g/Lキシロース、および50g/Lグルコース添加MRM3)によって置換された。MRM3A2.5X2.5G5中の迅速な成長のために、10時間目の時点を添加した。分析は、アラビノース培地を使用した実験について上述したのと同様であった。結果を図5に示す。これらの結果は、ZW705がグルコースおよびキシロースを効率的に資化して、強力な細胞成長とエタノール生産を支えるが、アラビノースは代謝できないことを示す(図5A)。Pgap−araBADの組み込み後、ZW705−ara354はアラビノースを資化して、細胞成長およびエタノール生産を増強できた(図5B)。アラビノース消費の最大速度は、0.3g/L/hrであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は67.9%低下して8.8g/Lになった。適応株ZW705−ara354A7中では、アラビノース資化において、ZW705−ara354株よりもいくらかの改善があり、それはより良い成長およびエタノール生産を支えた。アラビノース消費の最大速度は0.36g/L/hrであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は74.1%低下して7.1g/Lになった。

0147

実施例3
大腸菌(E.coli)からの2つのアラビノース輸送系のザイモモナス(Zymomonas)中における発現のためのコンストラクト
大腸菌(E.coli)中に存在してaraEまたはbyaraFGHによってコードされる、2つの各アラビノース輸送系をザイモモナス(Zymomonas)中で発現させて、アラビノース資化を分析した。araEはアラビノース−プロトン共輸送体をコードする一方、araFGHはABC輸送体を形成する3つのタンパク質をコードする。

0148

1.ザイモモナス(Zymomonas)中における発現のためのキメラaraE遺伝子およびaraFGHオペロンの構築
テンプレートとして大腸菌(E.coli)MG1655(aK12株:ATCC#700926)DNAを使用して、実施例1に記載される標準30サイクルPCRによって、大腸菌(E.coli)araEおよびaraFGHコード配列DNA断片を調製した。各サイクルは、94℃で45秒間の変性、60℃で45秒間のアニーリング、および72℃で4分間の鎖延長を含んだ。順方向プライマーara135(配列番号:54)および逆方向プライマーara136(配列番号:55)をPCRで使用して、araEコード配列(1,419bp)およびその3’UTR(121bp)を含む1,550bpのaraE断片を合成し、NcoI部位を5’末端に、EcoRI部位を3’末端に付加する(配列番号:56)。順方向プライマーara137(配列番号:57)および逆方向プライマーara138(配列番号:58)をPCRで使用して、3,744bpのaraFGH断片(配列番号:59)を合成する。この断片は大腸菌(E.coli)araFGHオペロンと同一であるが、プロモーターを欠いている。これは、araFコード配列、araGコード配列、araHコード配列、araH3’UTR、および未変化の遺伝子間領域を含んだ。プライマーは、5’NcoI部位および3’EcoRI部位を付加した。

0149

araEおよびaraFGHの発現を導くために、アクチノプラネス・ミズーリエンシス(Actinoplanes missouriensis)GIプロモーター(Pgi)を選択した。これはキシロースイソメラーゼ遺伝子のプロモーターであり、Z.モビリス(Z.mobilis)中で弱い構成的プロモーターとして機能することが実証されている。A.ミズーリエンシス(A. missouriensis)Pgiをクローンするために、1対のオリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。プライマーara12(配列番号:60)はPgiのPCRのための順方向プライマーであり、それはプロモーターの5’末端にSacIおよびSpeI部位を付加した。プライマーara13(配列番号:61)はPgiのPCRのための逆方向プライマーであり、プロモーターの3’末端にNcoI部位を付加した。これらの2つのプライマーを標準PCR反応で使用して、アクチノプラネス・ミズーリエンシス(Actinoplanes missouriensis)GIプロモーター(配列番号62)を含有するプラスミドをテンプレートDNAとして使用した。PCR反応は5’SacIおよびSpeI部位および3’NcoI部位がある201bpのPgiDNA断片(配列番号63)を生じ、それを製造業者の使用説明書に従ってTOPO Blunt Zeroベクター(Invitrogen,Calsbad,CA)にクローンした。得られたプラスミドpTP−Pgiを大腸菌(E.coli)DH5a中で増殖させ、Qiagen DNA Miniprepキットを使用してプラスミドDNAを調製した。

0150

pTP−PgiからのSpeI−NcoI Pgi断片と、NcoI−EcoRIaraEPCR断片とをクロラムフェニコール耐性マーカー(CM−R;配列番号64)と共に、pZB188/aadaベクター中で組み合わせてpARA112(図6;配列番号65)を作り出した。pARA112は、pZB188由来大腸菌(E.coli)/ザイモモナス(Zymomonas)シャトルベクター中にPgi−araEキメラ遺伝子を含有する。pTP−PgiからのSpeI−NcoI Pgi断片と、NcoI−EcoRI araFGHPCR断片とをクロラムフェニコール耐性マーカーと共に、pZB188/aadaベクター中で組み合わせてpARA113(図7;配列番号66)を作り出した。得られたシャトルベクターを大腸菌(E.coli)DH5a中で増殖させて、Qiagen DNA Miniprepキットを使用してプラスミドDNAを調製した。Pgi−araE遺伝子およびPgi−araFGHオペロンは、配列決定によって確認された。

0151

実施例4
ザイモモナス(Zymomonas)ZW705−ara354A7中における大腸菌(E.coli)アラビノース輸送系の発現
構築されたPgi−araE遺伝子およびPgi−araFGHオペロンを発現させることにより、大腸菌(E.coli)の2つのアラビノース輸送系のアラビノース資化ザイモモナス(Zymomonas)細胞に対する影響を試験した。

0152

1.pARA112およびpARA113を用いてZW705−ara354Aを形質転換する
どちらも実施例3で調製されたPgi−araE遺伝子を含有するpARA112およびPgi−araFGHオペロンを含有するpARA113を(実施例1および2で調製された)ZW705−ara354A7の細胞に形質転換した。実施例1に記載されるようにして、ZW705−ara354A7株のコンピテント細胞を調製した。Z.モビリス(Z.mobilis)の形質転換には非メチル化DNAが必要なため、pARA11
2およびpARA113をそれぞれ大腸菌(E.coli)SCS110コンピテント細胞に形質転換し、Qiagen DNA Miniprepキットを使用して、単一コロニーの10mLの培養物から非メチル化プラスミドDNAを調製した。1MM VWR電気穿孔キュベット内で、およそ500ngの各プラスミドDNAを50μLのZW705−ara354A7コンピテント細胞と別々に混合し、BT720 Transporater Plusを使用して2.0KVで細胞内に電気穿孔した。

0153

pARA112またはpARA113形質転換細胞(ZW705−ara354A7−ara112およびZW705−ara354A7−ara113)を1mLのMMG5培地中において30℃で4時間回復させ、次にAnaeroPack付き嫌気性ジャー内で、MMG5−CM120プレート(120mg/Lクロラムフェニコールおよび15g/L寒天添加MMG5)上において30℃で2日間培養した。個々のコロニーを新しいMMG5−CM120プレート上に画線塗抹して、最後のステップと同一条件下で成長させた。画線培養はクロラムフェニコール含有プレート上で良好に成長し、成功裏の形質転換が示唆された。

0154

2.形質転換された株中でPgi−araEおよびPgi−araFGHを発現させる
ZW705−ara354A7−ara112およびZW705−ara354A7−ara113の代表例を示すために、形質転換された株のいくつかの画線培養をMMG5−CM120プレートから選択した。実施例1に記載される72時間成長アッセイによって、Pgi−araEまたはPgi−araFGHの発現を調べた。このアッセイでは、各画線培養からの細胞を150rpmで振盪しながら、2mLのMRM3G5−CM120(120mg/Lクロラムフェニコール添加MRM3G5)中において30℃で一晩培養した。細胞を収集してMRM3A5で洗浄し、MRM3A5−CM120(120mg/Lクロラムフェニコールを含有するMRM3A5)中に0.1の開始OD600に再懸濁した。4mLの懸濁液を150rpmで振盪しながら30℃で72時間培養した。培養終了時に、実施例1に記載されるようにして、Agilent 1100HPLCシステム上で、BioRad Aminex HPX−A7Hイオン排除カラムを使用して、OD600を測定し代謝産物プロフィールを分析した。対照としてZW705−ara354A7株を培養し、CM120をSpec250で置き換えて並行して分析した。各形質転換中の3株の結果を表4に示す。

0155

0156

それらの親株と比較して、全てのZW705−ara354A7−ara112株は、72時間の培養中により多くのアラビノースを資化し、それはより高レベルの成長およびエタノール生産を支えた。実際には、これらのZW705−ara354A7−ara1
12株は、培地中のほぼ全ての利用できるアラビノースを消費した。これはaraEが、遺伝子操作株中でアラビノース資化を促進したことを示唆する。他方araFGHの発現は、悪影響を与えるようである。それは72時間の培養中に、ZW705−ara354A7−ara113株中で、より少ないアラビノース資化、より低レベルの成長、およびより低いエタノール生産をもたらした。

0157

3.ZW705−ara354A7−ara112株の成長および代謝産物プロフィールを特性解析する
ZW705−ara354A7−ara112株はアラビノース代謝の促進を示したので、これらの株をさらに分析した。特性解析は、実施例2.3に記載される手順に従って実施した。araEはシャトルベクターから発現されたので、発現レベルは異なる株間で変動し得る。そのため2つの株(ZW705−ara354A7−ara112−2およびZW705−ara354A7−ara112−3)を並べて調べた。単一糖(アラビノース)培地中において株を特性解析するために、一晩培養したZW705−ara354A7−ara112−2およびZW705−ara354A7−ara112−3培養物を収集してMRM3A5で洗浄し、0.1の開始OD600でMRM3A5−CM120に再懸濁した。20mLの懸濁液を150rpmで振盪しながら30℃で96時間培養した。OD600を0、6、12、24、48、72、および96時間目に測定した。各時点で、Agilent 1100HPLCシステム上のBioRad Aminex HPX−A7Hイオン排除カラムを使用して、代謝産物プロフィールを分析した。並行して、親株ZW705−ara354A7を120mg/Lクロラムフェニコールの代わりに250mg/Lスペクチノマイシン中で培養し、対照として分析した。結果を図8に示す。これらの結果は、Pgi−araEなしでは、ZW705−ara354A7がアラビノースを最大速度0.93g/L/hrで資化することを示唆する。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は80.4%低下して9.81g/Lになった。araEの発現があると、ZW705−ara354A7−ara112−2およびZW705−ara354A7−ara112−3はアラビノースをより効率的に資化し、それはより高レベルの成長とエタノール生産を支えた。アラビノース消費の最大速度は、112−2および112−3株中で、それぞれ1.18g/L/hrおよび1.28g/L/hrに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は、ZW705−ara354A7−ara112−2では98%低下して1.02g/Lになり、ZW705−ara354A7−ara112−3では99.2%低下して0.41g/Lになった。実際にはZW705−ara354A7−ara112−2およびZW705−ara354A7−ara112−3は、それぞれ72時間および48時間の培養後に、全ての利用できるアラビノースをほぼ使い果たした。

0158

混合糖を含有する培地中において株を特性解析するために、ZW705−ara354A7、ZW705−ara354A7−ara112−2およびZW705−ara354A7−ara112−3を培養して上述のように分析したが、MRM3A2.5X2.5G5培地を使用した。結果を図9に示す。これらの結果は、ZW705−ara354A7が、全てのグルコースおよびキシロースを24時間以内に効率的に使い果たし、強力な成長およびエタノール生産を支えたことを示す。そのアラビノース代謝は比較的緩慢で不完全であった。アラビノース消費の最大速度は、0.43g/L/hrであった。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は62.4%低下して9g/Lになった。しかしZW705−ara354A7−ara112−2およびZW705−ara354A7−ara112−3は、アラビノースをはるかにより効率的に資化した。アラビノース消費の最大速度は、それぞれ0.73g/L/hrおよび0.78g/L/hrに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は、ZW705−ara354A7−ara112−2では90.3%低下して2.33g/Lになり、ZW705−ara354A7−ara112−3では90.1%低下して2.38g/Lになった。それは実際には双方の株で、48時間以内にこのレベル近くにまで低下した。したがってaraEの発現は、混合糖培地中のアラビノース資化もまた促進し、それは図9に示すようにエタノール生産に寄与した。発現はグルコース代謝に顕著な影響を及ぼさなかったが、それはキシロース代謝を減速させ、どちらのZW705−ara354A7−ara112株でも培地中の全てのキシロースを消耗するのに48時間かかったが、ZW705−ara354A7株では24時間しかかからなかった。

0159

実施例5
ザイモモナス(Zymomonas)ZW705−ara354およびZW801−ara354中におけるaraE発現
この実施例では、非適応アラビノース資化Z.モビリス(Z.mobilis)ZW705−ara354およびZW801−ara354株中におけるaraE発現の影響を分析する。

0160

1.ZW705−ara354およびZW801−ara354をpARA112によって形質転換する
実施例2に記載されるように、ZW705−ara354およびZW801−ara354は、Pgap−araBADをldhA遺伝子座に導入することによりZW705およびZW801−4から作成された、遺伝子操作Z.モビリス(Z.mobilis)株である。ZW705−ara354は、MRM3A5中で適応されなかったZW705−ara354A7の親株である。双方の株のコンピテント細胞を調製した。先行する実施例に記載されるようにして、pARA112の非メチル化DNAをコンピテント細胞内に電気穿孔した。

0161

pARA112−形質転換ZW705−ara354(ZW705−ara354−ara112)およびZW801−ara354(ZW801−ara354−ara112)を1mLのMMG5培地中において30℃で4時間回復させ、次にAnaeroPack付き嫌気性ジャー内で、MMG5−CM120プレート上において30℃で2日間培養した。個々のコロニーを新しいMMG5−CM120プレート上に画線塗抹し、最終ステップと同一条件下で培養した。画線培養はクロラムフェニコール含有プレート上で良好に成長し、成功裏の形質転換が示唆された。

0162

2.形質転換株中においてPgi−araEを発現する
それぞれZW705−ara354−ara112およびZW801−ara354−ara112の代表例を示すために、形質転換株のいくつかの画線培養をMMG5−CM120プレートから選択した。MRM3A5中の72時間成長アッセイによって、Pgi−araEの発現を調べた。アッセイの詳細は、先行する実施例と同一であった。対照として、増殖培地中の120mg/Lクロラムフェニコールを250mg/Lスペクチノマイシンで置き換えて、ZW705−ara354およびZW801−ara354株を並行して培養し分析した。各形質転換からの3株の結果を表5に示す。それらの親株と比較して、全てのZW705−ara354−ara112およびZW801−ara354−ara112株は、72時間の培養中に顕著により多くのアラビノースを資化し、それはより高レベルの成長とエタノール生産を支えた。したがってaraEは、ZW705−ara354−ara112およびZW801−ara354−ara112株の双方の中で、アラビノース資化もまた促進した。

0163

0164

3.ZW705−ara354−ara112およびZW801−ara354−ara112株の成長および代謝産物プロフィールを特性解析する
ZW705−ara354−ara112およびZW801−ara354−ara112株を96時間経過中のそれらの成長および代謝産物プロフィールについて、さらに特性解析した。特性解析は、実施例4.3に記載されるのと同じ手順に従って実施された。ZW705−ara354−ara112−1およびZW705−ara354−ara112−2を調べてそれらの親株ZW705−ara354と比較する一方、ZW801−ara354−ara112−5およびZW801−ara354−ara112−6を調べてそれらの親株ZW801−ara354と比較した。測定および分析は、0、6、12、24、48、72、および96時間の時点で実施した。

0165

図10は、MRM3A5中で培養したZW705−ara354およびZW705−ara354−ara112株から得られた結果を示す。結果は、Pgi−araEなしでは、ZW705−ara354がアラビノースを最大速度0.25g/L/hrで不完全に資化することを示す。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度は38.19%のみ低下して30.22g/Lになった。araEの発現があると、ZW705−ara354−ara112−1およびZW705−ara354−ara112−2は、アラビノースをより効率的にを資化して、それはより高レベルの成長とエタノール生産を支えた。アラビノース消費の最大速度は、それぞれ0.46g/L/hrおよび0.48g/L/hrに増大した。時間経過の終わりに、培地中のアラビノース濃度はZW705−ara354−ara112−1では65.8%低下して16.73g/Lになり、ZW705−ara354−ara112−2では69.61%低下して14.86g/Lになった。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ