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技術 トランスチレチンの発現を阻害するための組成物および方法

出願人 アルナイラムファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド
発明者 ダイナ・ウェン-イー・サーグレゴリー・ヒンクルレネ・アルバレズスチュアート・ミルスタインチェン・キンミン
出願日 2009年10月20日 (11年1ヶ月経過) 出願番号 2011-533279
公開日 2012年3月15日 (8年8ヶ月経過) 公開番号 2012-506254
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 医薬品製剤 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 微生物、その培養処理 化合物または医薬の治療活性 ナノ構造物 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬
主要キーワード 事前増幅 最小オフ 最大低下率 使用量レベル 終端領域 総画像 内部区画 親油性材料
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2012年3月15日)のものです。
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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、トランスチレチンTTR)遺伝子を標的とする二本鎖リボ核酸dsRNA)、およびTTRの発現阻害するために該dsRNAを使用する方法に関する。

概要

背景

トランスチレチンTTR)は、分泌された甲状腺ホルモン結合タンパク質である。TTRは、血漿および脳脊髄液中のレチノール結合タンパク質(RBP)/ビタミンA、および血清チロキシン(T4)に結合し、輸送する。

通常配列のTTRおよび変異配列TTRは共に、アミロイドーシスを引き起こす。通常配列のTTRは、高齢者における心アミロイドーシスを引き起こし、これは老年性全身アミロイドーシス(SSA)(老年性心アミロイドーシス(SCA)とも呼ばれる)と称される。SSAは、しばしば、多くの他の器官において、微細沈着物を伴う。TTRの変異は、TTRのアミロイド形成過程加速し、臨床的意義のあるTTRアミロイドーシス(ATTR(アミロイドーシス−トランスチレチン型)とも呼ばれる)の発症に対する最も重要な危険因子である。85個以上のアミロイド生成性TTR変異体が、全身家族性アミロイドーシスを引き起こすことが知られる。肝臓は、TTRの発現の主要部位である。発現の他の重要な部位には、脈絡叢網膜、および膵臓が含まれる。

TTRアミロイドーシスは、種々の形態で現れる。末梢神経系が、さらに著しく影響を受ける場合、該疾患は、家族性アミロイド神経障害FAP)と称される。心臓が主に関与するが、神経系は関与しない場合、該疾患は、家族性アミロイド心筋症(FAC)と称される。TTRアミロイドーシスの第3の主要型は、髄膜CNS(中神経系)アミロイドーシスと称される。

二本鎖RNA分子dsRNA)が、RNA干渉(RNAi)として知られる、高度に保存された調節機序遺伝子発現遮断することが示されている。国際公開WO第99/32619号(Fireら)は、線虫における遺伝子の発現を阻害するための、少なくとも25ヌクレオチド長のdsRNAの使用を開示している。また、dsRNAは、植物(例えば、国際公開WO第99/53050号、Waterhouseら、および国際公開WO第99/61631号、Heifetzらを参照)、ショウジョウバエ(例えば、Yang,D.,et al.,Curr.Biol.(2000)10:1191−1200を参照)、ならびに哺乳動物(国際公開WO第00/44895号、Limmer、および独国特許DE第101 00 586.5号、Kreutzerらを参照)を含む、他の生物において標的RNAを分解することが示されている。

米国特許第20070207974号は、機能性および過機能性siRNAを開示する。米国特許第20090082300号は、TTRを対象とするアンチセンス分子を開示する。米国特許第7,250,496号は、TTRを対象とするミクロRNAを開示する。

概要

本発明は、トランスチレチン(TTR)遺伝子を標的とする二本鎖リボ核酸(dsRNA)、およびTTRの発現を阻害するために該dsRNAを使用する方法に関する。

目的

本発明は、上記の発明の概要に記載のdsRNAのうちのいずれかを含有する細胞を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
4件
牽制数
10件

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請求項1

トランスチレチンTTR)の発現阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNA)であって、前記dsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、トランスチレチン(TTR)をコードするmRNAの一部に相補的である領域を含み、前記相補性の領域は、30ヌクレオチド長未満であり、前記アンチセンス鎖は、配列番号170、配列番号450、配列番号730、または配列番号1010の15個以上の連続するヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸(dsRNA)。

請求項2

前記センス鎖は、配列番号169、配列番号449、配列番号729、または配列番号1009の15個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項1に記載のdsRNA。

請求項3

前記センス鎖は、配列番号449からなり、前記アンチセンス鎖は、配列番号450からなる、請求項1に記載のdsRNA。

請求項4

前記センス鎖は、配列番号729からなり、前記アンチセンス鎖は、配列番号730からなる、請求項1に記載のdsRNA。

請求項5

前記センス鎖は、配列番号1009からなり、前記アンチセンス鎖は、配列番号1010からなる、請求項1に記載のdsRNA。

請求項6

前記dsRNAは、表3A、3B、4、6A、6B、7、および16から選択されるセンス鎖と、表3A、3B、4、6A、6B、7、および16から選択されるアンチセンス鎖と、を含む、請求項1に記載のdsRNA。

請求項7

前記相補性の領域は、19ヌクレオチド長である、請求項1または2または6に記載のdsRNA。

請求項8

前記相補性の領域は、配列番号169からなる、請求項1または2または6に記載のdsRNA。

請求項9

前記dsRNAのそれぞれの鎖は、19、20、21、22、23、または24ヌクレオチド長である、請求項1または2または6に記載のdsRNA。

請求項10

それぞれの鎖は、21ヌクレオチド長である、請求項1または2または6に記載のdsRNA。

請求項11

前記dsRNAは、配列番号1331の637位のアデニンヌクレオチドと配列番号1331の638位のグアニンヌクレオチドとの間で、TTRのmRNAを切断しない、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項12

前記dsRNAは、配列番号1331の636位のグアニンヌクレオチドと配列番号1331の637位のアデニンヌクレオチドとの間で、TTRのmRNAを切断する、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項13

前記dsRNAは、配列番号1331の628位のグアニンヌクレオチドと配列番号1331の646位のウラシルヌクレオチドとの間で、TTRのmRNAにアニール化される、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項14

前記dsRNAは、少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項15

前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、2’−O−メチル修飾ヌクレオチド、5’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体基またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合される終端ヌクレオチドの群から選択される、請求項14に記載のdsRNA。

請求項16

前記修飾ヌクレオチドは、2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾ヌクレオチド、2’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’−アミノ−修飾ヌクレオチド、2’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基の群から選択される、請求項14に記載のdsRNA。

請求項17

少なくとも1個の2’−O−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項14に記載のdsRNA。

請求項18

前記dsRNAは、リガンドに共役される、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項19

前記dsRNAは、脂質製剤に製剤化される、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項20

前記dsRNAは、LNP製剤、LNP01製剤、XTC−SNALP製剤、またはSNALP製剤に製剤化される、請求項19に記載のdsRNA。

請求項21

前記dsRNAは、2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソラン(XTC)を、57.1/7.1/34.4/1.4の比のXTC/DPPC/コレステロール/PEG−cDMAと、約7:1の比の脂質:siRNAで使用することで、XTC−SNALP製剤に製剤化される、請求項19に記載のdsRNA。

請求項22

前記センス鎖は、配列番号1009からなり、前記アンチセンス鎖は、配列番号1010からなり、前記dsRNAは、2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソラン(XTC)を、57.1/7.1/34.4/1.4の比のXTC/DPPC/コレステロール/PEG−cDMAと、約7:1の比の脂質:siRNAで使用することで、XTC−SNALP製剤に製剤化される、請求項19に記載のdsRNA。

請求項23

前記dsRNAは、50/10/38.5/1.5モル%の比のXTC/DSPC/Chol/PEG2000−C14および約11:1の比の脂質:siRNAを使用することで、LNP09製剤に製剤化される、請求項19に記載のdsRNA。

請求項24

前記dsRNAは、50/10/38.5/1.5モル%の比のMC3/DSPC/Chol/PEG2000−C14および約11:1の比の脂質:siRNAを使用することで、LNP11製剤に製剤化される、請求項19に記載のdsRNA。

請求項25

前記dsRNAは、LNP09製剤またはLNP11製剤に製剤化され、PBS対照群と比較して、0.3mg/kgの用量で、TTRのmRNAレベルを約85〜90%低下させる、請求項19に記載のdsRNA。

請求項26

前記dsRNAは、LNP09製剤またはLNP11製剤に製剤化され、PBS対照群と比較して、0.1mg/kgの用量で、TTRのmRNAレベルを約50%低下させる、請求項19に記載のdsRNA。

請求項27

前記dsRNAは、LNP09製剤またはLNP11製剤に製剤化され、ウエスタンブロットによって測定して、PBS対照群と比較して、用量依存的な様式で、TTRのタンパク質レベルを低下させる、請求項19に記載のdsRNA。

請求項28

前記dsRNAは、DlinDMAを、57.1/7.1/34.4/1.4の比のDLinDMA/DPPC/コレステロール/PEG2000−cDMAと、約7:1の比の脂質:siRNAで使用することで、SNALP製剤に製剤化される、請求項19に記載のdsRNA。

請求項29

細胞への前記dsRNAの投与は、リアルタイムPCRアッセイによって測定して、TTRのmRNA発現の約95%の阻害をもたらし、前記細胞は、HepG2細胞またはHep3B細胞であり、前記dsRNAの濃度は、10nMである、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項30

細胞への前記dsRNAの投与は、分岐DNAアッセイによって測定して、TTRのmRNA発現の約74%の阻害をもたらし、前記細胞は、HepG2細胞またはHep3B細胞であり、前記dsRNAの濃度は、10nMである、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項31

前記dsRNAは、HepG2細胞内で、10pM未満のIC50を有し、前記dsRNAの濃度は、10nMである、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項32

前記dsRNAは、約1mg/kgのED50を有する、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項33

前記dsRNAの投与は、カニクイザル肝臓中でTTRのmRNAを約80%低下させ、前記dsRNAの濃度は、3mg/kgである、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項34

前記dsRNAの投与は、IFN−αおよびTNF−αELISAアッセイによって測定して、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)内の免疫刺激活性をもたらさない、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項35

前記dsRNAの投与は、肝臓TTRのmRNAレベルを約97%、または血清TTRのタンパク質レベルを約90%低下させ、前記dsRNAの濃度は、6mg/kgである、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項36

前記dsRNAの投与は、肝臓TTRのmRNAレベルおよび/または血清TTRのタンパク質レベルを最長22日間低下させ、前記dsRNAの濃度は、6mg/kgまたは3mg/kgである、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項37

前記dsRNAは、それを必要とする対象に、1mg/kgまたは3mg/kgで投与する時に、血清TTRのタンパク質レベルを、処置後14日目まで抑制する、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項38

前記dsRNAは、リアルタイムPCRによって測定して、0.1nMの濃度で、Hep3B細胞中のTTRの発現を98.9%低下させる、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項39

前記dsRNAは、リアルタイムPCRによって測定して、10nMの濃度で、Hep3B細胞中のTTRの発現を99.4%低下させる、請求項1、2、3、4、5、または6に記載のdsRNA。

請求項40

トランスチレチン(TTR)の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、前記dsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、トランスチレチン(TTR)をコードするmRNAの一部に相補的である領域を含み、前記相補性の領域は、30ヌクレオチド長未満であり、前記dsRNAは、表3A、3B、4、6A、6B、7、および16から選択されるセンス鎖と、表3A、3B、4、6A、6B、7、および16から選択されるアンチセンス鎖と、を含む、二本鎖リボ核酸(dsRNA)。

請求項41

トランスチレチン(TTR)の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)であって、前記dsRNAは、配列番号1331のヌクレオチド618〜648のうちの15〜30ヌクレオチドに相補的な領域を含む、アンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号1331の628位でグアニンと塩基対形成する、二本鎖リボ核酸(dsRNA)。

請求項42

請求項1〜41に記載のdsRNAを含有する、細胞。

請求項43

請求項1〜41に記載のdsRNAの少なくとも1本の鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター

請求項44

請求項43のベクターを含む、細胞。

請求項45

請求項1〜41に記載のdsRNAおよび薬剤として許容される担体を含む、TTR遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物

請求項46

dsRNAおよびSNALP製剤を含むTTR遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、前記dsRNAは、30ヌクレオチド長未満のアンチセンス鎖を含み、配列番号170、配列番号450、配列番号730、または配列番号1010の15個以上の連続するヌクレオチドを含み、前記SNALP製剤は、57.1/7.1/34.4/1.4の比で、それぞれ、DlinDMA、DPPC、コレステロール、およびPEG2000−cDMAを含む、医薬組成物。

請求項47

細胞内のTTRの発現を阻害する方法であって、(a)請求項1〜41に記載のdsRNAと前記細胞を接触させることと、(b)TTR遺伝子のmRNA転写物の分解を得るために十分な時間、ステップ(a)において産生された前記細胞を維持し、それによって、前記細胞内の前記TTR遺伝子の発現を阻害することと、を含む、方法。

請求項48

TTRの発現によって媒介された障害治療する方法であって、かかる治療を必要とするヒトに、請求項1〜41に記載の治療上有効な量のdsRNAを投与することを含む、方法。

請求項49

前記dsRNAは、約0.01、0.1、0.5、1.0、2.5、または5.0mg/kgで、前記ヒトに投与される、請求項48に記載の方法。

請求項50

前記dsRNAは、約1.0mg/kgで、前記ヒトに投与される、請求項48〜49に記載の方法。

請求項51

前記ヒトは、トランスチレチンアミロイドーシス罹患する、請求項48〜50に記載の方法。

請求項52

前記ヒトは、肝臓疾患に罹患する、請求項48〜51に記載の方法。

請求項53

前記ヒトは、肝臓移植をさらに提供される、請求項48〜52に記載の方法。

請求項54

前記dsRNAの投与は、ヒト肝臓中でTTRのmRNAを約80%低下させ、前記dsRNAの濃度は、3mg/kgである、請求項48〜53に記載の方法。

請求項55

前記dsRNAの投与は、IFN−αおよびTNF−αELISAアッセイによって測定して、前記ヒトにおいて、免疫刺激活性をもたらさない、請求項48〜54に記載の方法。

請求項56

前記dsRNAの投与は、肝臓TTRのmRNAレベルを約97%、または血清TTRのタンパク質レベルを約90%低下させ、前記dsRNAの濃度は、6mg/kgである、請求項48〜55に記載の方法。

請求項57

前記dsRNAの投与は、肝臓TTRのmRNAレベルおよび/または血清TTRのタンパク質レベルを最長22日間低下させ、前記dsRNAの濃度は、6mg/kgまたは3mg/kgである、請求項48〜56に記載の方法。

請求項58

前記dsRNAは、50/10/38.5/1.5モル%の比のXTC/DSPC/Chol/PEG2000−C14および約11:1の比の脂質:siRNAを使用することで、LNP09製剤に製剤化される、請求項48〜57に記載の方法。

請求項59

前記dsRNAは、50/10/38.5/1.5モル%の比のMC3/DSPC/Chol/PEG2000−C14および約11:1の比の脂質:siRNAを使用することで、LNP11製剤に製剤化される、請求項48〜58に記載の方法。

請求項60

前記dsRNAは、LNP09製剤またはLNP11製剤に製剤化され、PBS対照群と比較して、0.3mg/kgの用量で、TTRのmRNAレベルを約85〜90%低下させる、請求項48〜59に記載の方法。

請求項61

前記dsRNAは、LNP09製剤またはLNP11製剤に製剤化され、PBS対照群と比較して、0.1mg/kgの用量で、TTRのmRNAレベルを約50%低下させる、請求項48〜60に記載の方法。

請求項62

前記dsRNAは、LNP09製剤またはLNP11製剤に製剤化され、ウエスタンブロットによって測定して、PBC対照基と比較して、用量依存的な様式で、TTRのタンパク質レベルを低下させる、請求項48〜61に記載の方法。

請求項63

前記dsRNAは、1mg/kgまたは3mg/kgでヒトに投与する時に、血清TTRのタンパク質レベルを、処置後14日目まで抑制する、請求項48〜62に記載の方法。

請求項64

前記dsRNA製剤は、DlinDMAを、57.1/7.1/34.4/1.4の比のDLinDMA/DPPC/コレステロール/PEG2000−cDMAと、約7:1の比の脂質:siRNAで使用することで、SNALP製剤に製剤化される、請求項48〜63に記載の方法。

請求項65

TTRの発現によって媒介される障害を治療するためのdsRNAの使用であって、かかる治療を必要とするヒトに、請求項1〜41に記載の治療上有効な量の前記dsRNAを投与することを含む、使用。

請求項66

前記dsRNAは、約0.01、0.1、0.5、1.0、2.5、または5.0mg/kgで、前記ヒトに投与される、請求項65に記載の使用。

請求項67

前記dsRNAは、約1.0mg/kgで、前記ヒトに投与される、請求項65〜66に記載の使用。

請求項68

前記ヒトは、トランスチレチンアミロイドーシスに罹患する、請求項65〜67に記載の使用。

請求項69

前記ヒトは、肝臓疾患に罹患する、請求項65〜68に記載の使用。

請求項70

前記ヒトは、肝臓移植をさらに提供される、請求項65〜69に記載の使用。

請求項71

細胞内のTTRの発現を阻害するためのdsRNAの使用であって、(a)請求項1〜41に記載のdsRNAと前記細胞を接触させることと、(b)TTR遺伝子のmRNA転写物の分解を得るために十分な時間、ステップ(a)において産生された前記細胞を維持し、それによって、前記細胞内の前記TTR遺伝子の発現を阻害することと、を含む、使用。

技術分野

0001

本発明は、トランスチレチンTTR)遺伝子を標的とする二本鎖リボ核酸dsRNA)、およびTTRの発現阻害するためのdsRNAを使用する方法に関する。

0002

関連出願の相互参照
本願は、2008年10月20日出願の米国仮出願第61/106,956号、および2008年11月18日出願の米国仮出願第61/115,738号、および2009年3月2日出願の米国仮出願第61/156,670号、および2009年6月9日出願の米国仮出願第61/185,545号、および2009年9月15日出願の米国仮出願第61/242,783号、および2009年9月22日出願の米国仮出願第61/244,794号の利益を主張し、それらの全ては、全ての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0003

配列表への言及
本願は、2009年__________に作成された、________バイトの大きさで、___________.txtと名づけられたテキストファイルとして、電子的に提出された配列表を含む。該配列表は、参照により組み込まれる。

背景技術

0004

トランスチレチン(TTR)は、分泌された甲状腺ホルモン結合タンパク質である。TTRは、血漿および脳脊髄液中のレチノール結合タンパク質(RBP)/ビタミンA、および血清チロキシン(T4)に結合し、輸送する。

0005

通常配列のTTRおよび変異配列TTRは共に、アミロイドーシスを引き起こす。通常配列のTTRは、高齢者における心アミロイドーシスを引き起こし、これは老年性全身アミロイドーシス(SSA)(老年性心アミロイドーシス(SCA)とも呼ばれる)と称される。SSAは、しばしば、多くの他の器官において、微細沈着物を伴う。TTRの変異は、TTRのアミロイド形成過程加速し、臨床的意義のあるTTRアミロイドーシス(ATTR(アミロイドーシス−トランスチレチン型)とも呼ばれる)の発症に対する最も重要な危険因子である。85個以上のアミロイド生成性TTR変異体が、全身家族性アミロイドーシスを引き起こすことが知られる。肝臓は、TTRの発現の主要部位である。発現の他の重要な部位には、脈絡叢網膜、および膵臓が含まれる。

0006

TTRアミロイドーシスは、種々の形態で現れる。末梢神経系が、さらに著しく影響を受ける場合、該疾患は、家族性アミロイド神経障害FAP)と称される。心臓が主に関与するが、神経系は関与しない場合、該疾患は、家族性アミロイド心筋症(FAC)と称される。TTRアミロイドーシスの第3の主要型は、髄膜CNS(中神経系)アミロイドーシスと称される。

0007

二本鎖RNA分子(dsRNA)が、RNA干渉(RNAi)として知られる、高度に保存された調節機序遺伝子発現遮断することが示されている。国際公開WO第99/32619号(Fireら)は、線虫における遺伝子の発現を阻害するための、少なくとも25ヌクレオチド長のdsRNAの使用を開示している。また、dsRNAは、植物(例えば、国際公開WO第99/53050号、Waterhouseら、および国際公開WO第99/61631号、Heifetzらを参照)、ショウジョウバエ(例えば、Yang,D.,et al.,Curr.Biol.(2000)10:1191−1200を参照)、ならびに哺乳動物(国際公開WO第00/44895号、Limmer、および独国特許DE第101 00 586.5号、Kreutzerらを参照)を含む、他の生物において標的RNAを分解することが示されている。

0008

米国特許第20070207974号は、機能性および過機能性siRNAを開示する。米国特許第20090082300号は、TTRを対象とするアンチセンス分子を開示する。米国特許第7,250,496号は、TTRを対象とするミクロRNAを開示する。

0009

一実施形態において、本発明は、トランスチレチン(TTR)の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)を提供し、前記dsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、トランスチレチン(TTR)をコードするmRNAの一部に相補的である領域を含み、該相補性の領域は、30ヌクレオチド長未満であり、該アンチセンス鎖は、配列番号170、配列番号450、配列番号730、または配列番号1010の15個以上の連続するヌクレオチドを含む。関連実施形態において、該センス鎖は、配列番号169、配列番号449、配列番号729、または配列番号1009の15個以上の連続するヌクレオチドを含む。なお別の関連実施形態において、該センス鎖は、配列番号449からなり、該アンチセンス鎖は、配列番号450からなる。なお別の関連実施形態において、該センス鎖は、配列番号729からなり、該アンチセンス鎖は、配列番号730からなる。さらに別の関連実施形態において、該センス鎖は、配列番号1009からなり、該アンチセンス鎖は、配列番号1010からなる。なお別の関連実施形態において、該dsRNAは、表3A、3B、4、6A、6B、7、および16から選択されるセンス鎖と、表3A、3B、4、6A、6B、7、および16から選択されるアンチセンス鎖と、を含む。

0010

ある実施形態において、該dsRNAの該アンチセンス鎖とトランスチレチンをコードする該mRNAとの間の該相補性の領域は、19ヌクレオチド長である。別の実施形態において、該相補性の領域は、配列番号169からなる。他の実施形態において、該dsRNAのそれぞれの鎖は、19、20、21、22、23、または24ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態において、それぞれの鎖は、21ヌクレオチド長である。

0011

ある実施形態において、トランスチレチンの発現を阻害するための該dsRNAは、配列番号1331の637位のアデニンヌクレオチドと配列番号1331の638位のグアニンヌクレオチドとの間で、TTRのmRNAを切断しない。他の実施形態において、該dsRNAは、配列番号1331の636位のグアニンヌクレオチドと配列番号1331の637位のアデニンヌクレオチドとの間で、TTRのmRNAを切断する。ある実施形態において、該dsRNAは、配列番号1331の628位のグアニンヌクレオチドと配列番号1331の646位のウラシルヌクレオチドとの間で、TTRのmRNAにアニール化する。

0012

さらに他の関連実施形態において、本発明は、トランスチレチンの発現を阻害するための上記のdsRNAを提供し、該dsRNAは、1個以上の修飾ヌクレオチドを含む。関連実施形態において、少なくとも1個の修飾ヌクレオチド(またはヌクレオチド)は、2’−O−メチル修飾ヌクレオチド、5’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体基またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合される終端ヌクレオチドからなる群から選択される。別の関連実施形態において、該修飾ヌクレオチドは、2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾ヌクレオチド、2’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’−アミノ−修飾ヌクレオチド、2’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基の群から選択される。ある実施形態において、該dsRNAは、少なくとも1個の2’−O−メチル修飾ヌクレオチドを含む。

0013

他の実施形態において、トランスチレチンの発現を阻害するための上記のdsRNAは、リガンドに共役されるか、または脂質製剤に製剤化される。ある実施形態において、該脂質製剤は、LNP製剤、LNP01製剤、XTC−SNALP製剤、またはSNALP製剤に製剤化される。関連実施形態において、該XTC−SNALP製剤は、以下のとおりである:2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソラン(XTC)を、57.1/7.1/34.4/1.4の比のXTC/DPPC/コレステロール/PEG−cDMAと、約7:1の比の脂質:siRNAで使用する。さらに他の関連実施形態において、該dsRNAの該センス鎖は、配列番号1009からなり、該アンチセンス鎖は、配列番号1010からなり、該dsRNAは、以下のようにXTC−SNALP製剤に製剤化される:2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソラン(XTC)を、57.1/7.1/34.4/1.4の比のXTC/DPPC/コレステロール/PEG−cDMA、および約7:1の比の脂質:siRNAで使用する。代替として、上記のもの等のdsRNAは、以下のようにLNP09製剤に製剤化され得る:50/10/38.5/1.5モル%の比で、XTC/DSPC/Chol/PEG2000−C14および約11:1の比の脂質:siRNAを使用する。別の変形において、該dsRNAは、以下のようにLNP11製剤に製剤化される:50/10/38.5/1.5モル%の比で、MC3/DSPC/Chol/PEG2000−C14および約11:1の比の脂質:siRNA比を使用する。さらに別の実施形態において、該dsRNAは、LNP09製剤またはLNP11製剤に製剤化され、PBS対照群と比較して、0.3mg/kgの用量で、TTRのmRNAレベルを約85〜90%低下させる。なお別の実施形態において、該dsRNAは、LNP09製剤またはLNP11製剤に製剤化され、PBS対照群と比較して、0.1mg/kgの用量で、TTRのmRNAレベルを約50%低下させる。なお別の実施形態において、該dsRNAは、LNP09製剤またはLNP11製剤に製剤化され、ウエスタンブロットによって測定して、PBS対照群と比較して、用量依存的な様式で、TTRのタンパク質レベルを低下させる。なお別の実施形態において、該dsRNAは、以下のようにSNALP製剤に製剤化される:DlinDMAを、57.1/7.1/34.4/1.4の比のDLinDMA/DPPC/コレステロール/PEG2000−cDMAと、約7:1の比の脂質:siRNAで使用する。

0014

ある実施形態において、本発明は、トランスチレチンの発現を阻害するための、上記のもの等のdsRNAを提供し、細胞への該dsRNAの投与は、リアルタイムPCRアッセイによって測定して、TTRのmRNA発現の約95%の阻害をもたらし、該細胞は、HepG2細胞またはHep3B細胞であり、該dsRNAの濃度は、10nMである。関連実施形態において、細胞への該dsRNAの投与は、分岐DNAアッセイによって測定して、TTRのmRNA発現の約74%の阻害をもたらし、該細胞は、HepG2細胞またはHep3B細胞であり、該dsRNAの濃度は、10nMである。他の関連実施形態において、該dsRNAは、HepG2細胞内で、10pM未満のIC50を有し、該dsRNAの濃度は、10nMである。さらに他の関連実施形態において、該dsRNAは、約1mg/kgのED50を有する。さらに他の関連実施形態において、該dsRNAの投与は、カニクイザルの肝臓中のTTRのmRNAを約80%低下させ、該dsRNAの濃度は、3mg/kgである。さらに他の関連実施形態において、該dsRNAの投与は、IFN−αおよびTNF−αELISAアッセイによって測定して、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)内の免疫刺激活性をもたらさない。さらに他の関連実施形態において、該dsRNAの投与は、肝臓TTRのmRNAレベルを約97%、または血清TTRのタンパク質レベルを約90%低下させ、該dsRNAの濃度は、6mg/kgである。さらに他の関連実施形態において、該dsRNAの投与は、肝臓TTRのmRNAレベルおよび/または血清TTRのタンパク質レベルを最長22日間低下させ、該dsRNAの濃度は、6mg/kgまたは3mg/kgである。さらに他の関連実施形態において、該dsRNAは、それを必要とする対象に、1mg/kgまたは3mg/kgで投与する時に、血清TTRのタンパク質レベルを、処置後14日目まで抑制する。さらに他の関連実施形態において、該dsRNAは、リアルタイムPCRによって測定して、0.1nMの濃度で、Hep3B細胞内のTTRの発現を98.9%低下させる。さらに他の関連実施形態において、該dsRNAは、リアルタイムPCRによって測定して、10nMの濃度で、Hep3B細胞内のTTRの発現を99.4%低下させる。

0015

他の実施形態において、本発明は、トランスチレチン(TTR)の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)を提供し、前記dsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、トランスチレチン(TTR)をコードするmRNAの一部に相補的である領域を含み、前記相補性の領域は、30ヌクレオチド長未満であり、該dsRNAは、表3A、3B、4、6A、6B、7、および16から選択されるセンス鎖と、表3A、3B、4、6A、6B、7、および16から選択されるアンチセンス鎖と、を含む。

0016

別の実施形態において、本発明は、トランスチレチン(TTR)の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)を提供し、前記dsRNAは、配列番号1331のヌクレオチド618〜648のうちの15〜30ヌクレオチドに相補的な領域を含む、アンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号1331の628位でグアニンと塩基対形成する。

0017

ある実施形態において、本発明は、上記の発明の概要に記載のdsRNAのうちのいずれかを含有する細胞を提供する。ある他の実施形態において、本発明は、上記の発明の概要に記載のdsRNAのうちのいずれかの少なくとも1本の鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。ある実施形態において、該ベクターは、細胞内にある。

0018

他の実施形態において、本発明は、上記の発明の概要に記載のdsRNAのうちのいずれか、および薬剤として許容される担体を含むTTR遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。関連実施形態において、本発明は、dsRNAおよびSNALP製剤を含むTTR遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供し、該dsRNAは、30ヌクレオチド長未満のアンチセンス鎖を含み、配列番号170、配列番号450、配列番号730、または配列番号1010の15個以上の連続するヌクレオチドを含み、該SNALP製剤は、57.1/7.1/34.4/1.4の比で、それぞれ、DlinDMA、DPPC、コレステロール、およびPEG2000−cDMAを含む。

0019

なお別の実施形態において、本発明は、細胞内のTTRの発現を阻害する方法を提供し、該方法は、(a)上記の発明の概要に記載のdsRNAのいずれかと該細胞を接触させることと、(b)TTR遺伝子のmRNA転写物の分解を得るために十分な時間、ステップ(a)において産生された該細胞を維持し、それによって、該細胞内の該TTR遺伝子の発現を阻害することと、を含む。

0020

なお別の実施形態において、本発明は、TTRの発現によって媒介された障害治療する方法であって、かかる治療を必要とするヒトに治療上有効な量の、上記の発明の概要に記載されるdsRNAのいずれかを投与することを含む、方法を提供する。関連実施形態において、該dsRNAは、約0.01、0.1、0.5、1.0、2.5、または5.0mg/kgで、該ヒトに投与される。なお別の関連実施形態において、該dsRNAは、約1.0mg/kgで、該ヒトに投与される。なお別の関連実施形態において、処置される該ヒトは、トランスチレチンアミロイドーシス、および/または肝臓疾患罹患する。関連実施形態において、該ヒトは、肝臓移植をさらに提供される。なお別の実施形態において、該dsRNAの投与は、ヒト肝臓中のTTRのmRNAを約80%低下させ、該dsRNAの濃度は、3mg/kgである。なお別の関連実施形態において、該dsRNAの投与は、IFN−αおよびTNF−αELISAアッセイによって測定して、該ヒトにおいて、免疫刺激活性をもたらさない。なお別の関連実施形態において、該dsRNAの投与は、肝臓TTRのmRNAレベルを約97%、または血清TTRのタンパク質レベルを約90%低下させ、該dsRNAの濃度は、6mg/kgである。なお別の関連実施形態において、該dsRNAの投与は、肝臓TTRのmRNAレベルおよび/または血清TTRのタンパク質レベルを、最長22日間低下させ、該dsRNAの濃度は、6mg/kgまたは3mg/kgである。なお別の関連実施形態において、該dsRNAは、以下のようにLNP09製剤に製剤化される:50/10/38.5/1.5モル%の比で、XTC/DSPC/Chol/PEG2000−C14および約11:1の比の脂質:siRNAを使用する。なお別の関連実施形態において、該dsRNAは、以下のようにLNP11製剤に製剤化される:50/10/38.5/1.5モル%の比で、MC3/DSPC/Chol/PEG2000−C14および約11:1の比の脂質:siRNAを使用する。さらに別の関連実施形態において、該dsRNAは、LNP09製剤またはLNP11製剤に製剤化され、PBS対照群と比較して、0.3mg/kgの用量で、TTRのmRNAレベルを約85〜90%低下させる。なお別の関連実施形態において、該dsRNAは、LNP09製剤またはLNP11製剤に製剤化され、PBS対照群と比較して、0.1mg/kgの用量で、TTRのmRNAレベルを約50%低下させる。さらに別の関連実施形態において、該dsRNAは、LNP09製剤またはLNP11製剤に製剤化され、ウエスタンブロットによって測定して、PBS対照群と比較して、用量依存的な様式で、TTRのタンパク質レベルを低下させる。さらに別の関連実施形態において、該dsRNAの投与は、ヒトに、1mg/kgまたは3mg/kgで投与する時に、血清TTRのタンパク質レベルを、処置後14日目まで抑制する。さらに別の関連実施形態において、該dsRNAは、以下のようにSNALP製剤に製剤化される:DlinDMAを、57.1/7.1/34.4/1.4の比のDLinDMA/DPPC/コレステロール/PEG2000−cDMAで、および約7:1の比の脂質:siRNA比で使用する。

0021

別の実施形態において、本発明は、TTRの発現によって媒介された障害を治療するためのdsRNAの使用であって、かかる治療を必要とするヒトに、治療上有効な量の、上記の発明の概要に記載されるdsRNAのいずれかを投与することを含む、使用を提供する。関連実施形態において、該dsRNAは、約0.01、0.1、0.5、1.0、2.5、または5.0mg/kgで、該ヒトに投与される。特定の関連実施形態において、該dsRNAは、約1.0mg/kgで、該ヒトに投与される。別の関連実施形態において、該ヒトは、トランスチレチンアミロイドーシス、および/または肝臓疾患に罹患する。本発明によって提供される使用のなお別の実施形態において、該処置されたヒトは、肝臓移植をさらに提供される。

0022

なお別の実施形態において、本発明は、細胞内のTTRの発現を阻害するための方法において、dsRNAの使用を提供し、該方法は、(a)上記の発明の概要に記載のdsRNAと該細胞を接触させることと、(b)TTR遺伝子のmRNA転写物の分解を得るために十分な時間、ステップ(a)において産生された該細胞を維持し、それによって、該細胞内の該TTR遺伝子の発現を阻害することと、が含まれる。

0023

本発明の1つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に説明される。本発明の他の特長、目的、利点は、説明および図面から、および特許請求の範囲から明らかとなる。

図面の簡単な説明

0024

TTRのsiRNAでの形質移入後、培養したヒトPBMCにおける、TNFαおよびIFNαレベルのグラフである。
図2Aおよび2BはHepG2細胞内のAD−18324およびAD−18328のそれぞれにおける用量反応曲線である。
HepG2細胞内のAD−18246における用量反応曲線である。
LNP01に製剤化されたTTR−dsRNA(AD−18324、AD−18328、およびAD−18246)の静脈内ボーラス投与による、遺伝子導入H129−mTTR−KO/iNOS−KO/hTTRマウスにおける、肝臓mRNAおよび血漿タンパク質レベルのそれぞれの阻害を示す。
LNP01に製剤化されたTTR−dsRNA(AD−18324、AD−18328、およびAD−18246)の静脈内ボーラス投与による、遺伝子導入H129−mTTR−KO/iNOS−KO/hTTRマウスにおける、肝臓mRNAおよび血漿タンパク質レベルのそれぞれの阻害を示す。
SNALPに製剤化されたTTR−dsRNA(AD−18324およびAD−18328)の15分間の静脈内注入後の非ヒト霊長類の肝臓中のTTRのmRNAレベルの測定の概要を示すグラフである。
SNALP−18328の静脈内ボーラス投与による遺伝子導入マウスにおける、ヒトV30M TTR肝臓mRNAおよび血清タンパク質レベルのそれぞれの阻害を示す。群平均が決定され、PBS対照群に対して正規化され、次いで、プロットされた。エラーバー標準偏差を示す。PBSと比較した、群平均の低下の割合(%)が、SNALP−1955およびSNALP−18328群に対して示される。(***p<0.001、一元配置ANOVAおよびDunnの事後検定
SNALP−18328の静脈内ボーラス投与による遺伝子導入マウスにおける、ヒトV30M TTR肝臓mRNAおよび血清タンパク質レベルのそれぞれの阻害を示す。群平均が決定され、PBS対照群に対して正規化され、次いで、プロットされた。エラーバーは標準偏差を示す。PBSと比較した、群平均の低下の割合(%)が、SNALP−1955およびSNALP−18328群に対して示される。(***p<0.001、一元配置ANOVAおよびDunnの事後検定)
SNALP−18328の単回静脈内ボーラス投与から22日にわたる、遺伝子導入マウスにおける、ヒトV30M TTR肝臓mRNAおよび血清タンパク質レベルのそれぞれの低下の持続性を示す。群平均を決定した。TTR/GAPDHのmRNAレベルは、0日目のレベルに正規化され、プロットされた。各時点におけるSNALP−1955と比較して、正規化されたTTRのmRNAレベルの割合の低下が、算出され、SNALP−18328群に対して示される。(***p<0.001、一元配置ANOVAおよびDunnの事後検定)
SNALP−18328の単回静脈内ボーラス投与から22日にわたる、遺伝子導入マウスにおける、ヒトV30M TTR肝臓mRNAおよび血清タンパク質レベルのそれぞれの低下の持続性を示す。群平均を決定した。TTR/GAPDHのmRNAレベルは、0日目のレベルに正規化され、プロットされた。各時点におけるSNALP−1955と比較して、正規化されたTTRのmRNAレベルの割合の低下が、算出され、SNALP−18328群に対して示される。(***p<0.001、一元配置ANOVAおよびDunnの事後検定)
SNALP−18328の15分間の単回静脈内注入から14日にわたる、非ヒト霊長類における、TTRの血清タンパク質レベルの時間経過を示す。
SNALP−18328の静脈内ボーラス投与後の、ヒトV30M TTR/HSF−1ノックアウトマウスの種々の組織中のTTR−免疫反応性の低下を示す。E:食道;S:;I1:腸/十二指腸;I4:腸/結腸;N:神経;D:後根神経節
XTC−SNALP−18328の15分間の単回静脈内注入後の、非ヒト霊長類の肝臓中のTTRのmRNAレベルの測定値を示す。
LNP09−18328またはLNP11−18328の15分間の静脈内注入後の、非ヒト霊長類の肝臓中のTTRのmRNAおよび血清タンパク質レベルのそれぞれの測定値を示す。
LNP09−18328またはLNP11−18328の15分間の静脈内注入後の、非ヒト霊長類の肝臓中のTTRのmRNAおよび血清タンパク質レベルのそれぞれの測定値を示す。
PBS対照群と比較した時の、0.3mg/kgのLNP09−18328の15分間の静脈内注入から28日間にわたる、TTRの血清タンパク質レベルの時間経過を示す。
ヒトTTRのmRNAの配列(参照配列NM_000371.3、配列番号1331)を示す。
ヒトおよびラットTTRのmRNAのそれぞれの配列である。図13Aは、ヒトTTRのmRNAの配列(参照配列NM_000371.2、配列番号1329)である。図13Bは、ラットTTRのmRNAの配列(参照配列NM_012681.1、配列番号1330)である。
NM_000371.3、NM_000371.2、およびAD−18328のヌクレオチドアライメントを示す。
家族性アミロイド神経障害、家族性アミロイド心筋症、およびCNSアミロイドーシスと関連するTTRにおける、症状および変異を図示する。
異なるTTRの注入継続時間での、SNALP−18534を用いた肝臓における、mRNAレベルの低下を示す。動物群(n=4/群)は、15分間、または1、2、または3時間の注入を介して1mg/kgのSNALP−18534を投与した。48時間後、ラットは、安楽死させ、肝臓が採集された。TTRおよびGAPDHのmRNAレベルが、Quantigene bDNAアッセイを使用して、肝臓溶解物から測定された。TTRのmRNAレベルとGAPDHのmRNAレベルとの比が、各動物について算出された。群平均が決定され、PBS対照群に正規化され、次いで、プロットされた。エラーバーは標準偏差を示す。(***p<0.001、PBSと比較した、一元配置ANOVAおよびBonferroniの事後検定)
LNP07−18534またはLNP08−18534の15分にわたる静脈内注入後の、ラットの肝臓中のTTRのmRNAレベルの測定値を示す。
LNP09−18534またはLNP11−18534の15分にわたる静脈内注入後の、Sprague−Dawleyラットの肝臓中の内因性TTRのmRNAレベルのインビボ阻害を示す。動物群(n=4/群)は、15分間の注入を介して、0.01、0.03、0.1、または0.3mg/kgのLNP09−18534、LNP−11−18534、またはPBSを静脈内に投与した。48時間後、動物は、安楽死させ、肝臓を採集した。TTRおよびGAPDHのmRNAレベルを、Quantigene bDNAアッセイを使用して、肝臓生検の溶解物から測定した。TTRのmRNAレベルとGAPDHのmRNAレベルとの比が、各動物について算出された。群平均が決定され、PBS対照群に対して正規化され、次いで、プロットされた。エラーバーは標準偏差を示す。

0025

本発明は、dsRNA、およびdsRNAがTTR遺伝子を標的とする、細胞または哺乳動物における、TTR遺伝子の発現を阻害するためのdsRNAを使用する方法を提供する。本発明はまた、TTR遺伝子の発現によって引き起こされる、哺乳動物における、TTRアミロイドーシス等の病態および疾患を治療するための、組成物および方法も提供する。dsRNAは、RNA干渉(RNAi)として知られる過程を通じてmRNAの配列に特異的な分解を導く。

0026

本明細書で取り上げられる組成物のdsRNAは、30ヌクレオチド長未満、一般に、19〜24ヌクレオチド長である、領域を有するRNA鎖(アンチセンス鎖)を含み、TTR遺伝子のmRNA転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。これらのdsRNAの使用は、哺乳動物における、TTRの発現に関連する病理学に関係している遺伝子のmRNAの標的化分解を可能にする。特に、TTRのdsRNAの非常に低い投薬量は、特異的かつ効率的にRNAiを媒介することができ、TTR遺伝子の発現の著しい阻害をもたらす。細胞に基づくアッセイを用いて、本発明者は、TTRを標的とするdsRNAが、RNAiを特異的かつ効率的に媒介することができ、TTR遺伝子の発現の著しい阻害をもたらす事を実証した。したがって、これらのdsRNAを含む方法および組成物は、肝臓疾患またはTTRアミロイドーシス、例えば、FAPの治療において等、TTRを下方調節することによって媒介され得る病理過程を治療するのに有用である。

0027

TTRのdsRNAを含有する方法および組成物は、TTRアミロイドーシス等のTTRの発現によって媒介される病理過程を治療するのに有用である。1つの実施形態において、TTRの発現によって媒介される障害を治療する方法には、TTRを標的とした、治療上有効な量のdsRNAを、かかる処置を必要とするヒトに投与することが含まれる。1つの実施形態において、dsRNAは、約0.01、0.1、0.5、1.0、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25mg/kgで、ヒトに投与される。

0028

以下の詳細な説明は、TTR遺伝子の発現を阻害するための、dsRNAを含有する組成物の作製方法および使用方法、ならびにこの遺伝子の発現によって引き起こされる疾患および障害を治療するための、組成物および方法を開示する。本発明で取り上げられる医薬組成物は、薬剤として許容される担体と共に、30ヌクレオチド長未満、一般に19〜24ヌクレオチド長であり、TTR遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である、相補性の領域を含むアンチセンス鎖を有するdsRNAを含む。また、本発明で取り上げられる医薬組成物は、30ヌクレオチド長未満、一般に19〜24ヌクレオチド長であり、TTR遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である、相補性の領域を有するアンチセンス鎖を有するdsRNAも含む。

0029

dsRNAのセンス鎖は、配列番号169、配列番号449、配列番号729、または配列番号1009の15、16、17、18、19、20、21個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。dsRNAのアンチセンス鎖は、配列番号170、配列番号450、配列番号730、または配列番号1010の15、16、17、18、19、20、21個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。1つの実施形態において、dsRNAのセンス鎖は、配列番号449またはそのフラグメントからなり得、該アンチセンス鎖は、配列番号450またはそのフラグメントからなり得る。1つの実施形態において、dsRNAのセンス鎖は、配列番号729またはそのフラグメントからなり得、該アンチセンス鎖は、配列番号730またはそのフラグメントからなり得る。1つの実施形態において、dsRNAのセンス鎖は、配列番号1009またはそのフラグメントからなり得、該アンチセンス鎖は、配列番号1010またはそのフラグメントからなり得る。

0030

1つの実施形態において、dsRNAは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含むことができる。1つの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、2’−O−メチル修飾ヌクレオチド、5’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、および/またはコレステリル誘導体基またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合される終端ヌクレオチドを含むことができる。1つの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾ヌクレオチド、2’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’−アミノ−修飾ヌクレオチド、2’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、および/またはヌクレオチドを有する非天然塩基を含むことができる。

0031

1つの実施形態において、dsRNAの該相補性の領域は、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21個、またはそれ以上のヌクレオチド長である。1つの実施形態において、該相補性の領域は、配列番号169の10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含む。

0032

1つの実施形態において、dsRNAのそれぞれの鎖は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個、またはそれ以上のヌクレオチド長である。1つの実施形態において、該dsRNAは、表3A、3B、4、6A、6B、7、および16から選択される、センス鎖、または10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくは21個のそのヌクレオチドフラグメント、ならびに表3A、3B、4、6A、6B、7、および16から選択される、アンチセンス鎖、または10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくは21個のそのヌクレオチドフラグメントを含む。

0033

1つの実施形態において、細胞へのdsRNAの投与は、リアルタイムPCRアッセイによって測定して、TTRのmRNA発現の約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%もしくはそれ以上の阻害をもたらす。1つの実施形態において、細胞へのdsRNAの投与は、リアルタイムPCRアッセイによって測定して、TTRのmRNA発現の約40%〜45%、45%〜50%、50%〜55%、55%〜60%、60%〜65%、65%〜70%、70%〜75%、75%〜80%、80%〜85%、85%〜90%、90%〜95%、もしくはそれ以上の阻害をもたらす。1つの実施形態において、細胞へのdsRNAの投与は、分岐DNAアッセイによって測定して、TTRのmRNA発現の約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、もしくはそれ以上の阻害をもたらす。1つの実施形態において、細胞へのdsRNAの投与は、分岐DNAアッセイによって測定して、TTRのmRNA発現の約40%〜45%、45%〜50%、50%〜55%、55%〜60%、60%〜65%、65%〜70%、70%〜75%、75%〜80%、80%〜85%、85%〜90%、90%〜95%、もしくはそれ以上の阻害をもたらす。

0034

1つの実施形態において、dsRNAは、0.01pM、0.1pM、1pM、5pM、10pM、100pM、または1000pM未満のIC50を有する。1つの実施形態において、dsRNAは、約0.01、0.1、1、5、または10mg/kgのED50を有する。

0035

1つの実施形態において、dsRNAの投与は、カニクイザルにおける、TTRのmRNAを約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、またはそれ以上低下させることができる。1つの実施形態において、dsRNAの投与は、肝臓TTRのmRNAレベルを、約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、もしくはそれ以上、または血清TTRのタンパク質レベルを、約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、もしくはそれ以上低下させる。1つの実施形態において、dsRNAの投与は、肝臓TTRのmRNAレベル、および/または血清TTRのタンパク質レベルを最長1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25日、もしくはそれ以上の日数、低下させる。

0036

1つの実施形態において、dsRNAは、LNP製剤に製剤化され、PBC対照群と比較して、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、もしくは1mg/kgの用量で、TTRのmRNAレベルを、約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、もしくはそれ以上低下させる。1つの実施形態において、dsRNAは、LNP製剤に製剤化され、ウエスタンブロットによって測定して、PBC対照群と比較して、TTRのタンパク質レベルを、約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、もしくはそれ以上低下させる。1つの実施形態において、dsRNAは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25mg/kgで、それを必要とする対象に投与する時、処置してから最長1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25日目まで、血清TTRのタンパク質レベルを抑制する。

0037

したがって、幾つかの態様において、TTRのdsRNAおよび薬剤として許容される担体を含有する医薬組成物、TTR遺伝子の発現を阻害するために組成物を使用する方法、およびTTR遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を治療するために医薬組成物を使用する方法が、本発明で取り上げられる。

0038

I.定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される、特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分の用語の用法と、本項で提供されるその定義との間に明らかな相違がある場合、本項の定義が優先される。

0039

「G」、「C」、「A」、および「U」のそれぞれは、一般に、塩基としてそれぞれグアニン、シトシンアデニン、およびウラシルを含有するヌクレオチドを表す。「T」および「dT」は、本明細書で交換可能に使用され、核酸塩基チミン、例えば、デオキシリボチミン(deoxyribothymine)である、デオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、以下でさらに詳述する修飾ヌクレオチド、または代替の置換部分も指すことができることが理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、かかる置換部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成性を実質的に変化させることなく、他の部分によって置換可能であることを十分認識している。例えば、限定されないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対を形成することができる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドと置換され得る。かかる置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。

0040

本明細書で使用される、「トランスチレチン」(「TTR」)とは、細胞内の遺伝子を指す。TTRはまた、ATTR、HsT2651、PALB、プレアルブミン、TBPA、およびトランスチレチン(プレアルブミン、アミロイドーシスI型)としても知られている。ヒトTTRのmRNA転写物の配列は、NM_000371で見出され得る。マウスTTRのmRNAの配列は、NM_013697.2で見出され得る。ラットTTRのmRNAの配列は、NM_012681.1で見出され得る。

0041

本明細書で使用される、「標的配列」は、一次転写産物のRNAプロセシングの産物であるmRNAを含む、TTR遺伝子の転写の間に形成される、mRNA分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。

0042

本明細書で使用される、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して言及される配列によって説明される、ヌクレオチド鎖を含む、オリゴヌクレオチドを指す。

0043

本明細書で使用される場合、別途記載のない限り、第2のヌクレオチド配列に関連して第1のヌクレオチド配列を説明するために使用される時の「相補的」という用語は、当業者には理解されるように、特定の条件下で、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドハイブリダイズして二本鎖構造を形成する、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの能力を指す。かかる条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ストリンジェントな条件は、400mM NaCl、40mMPIPESpH6.4、1mMEDTA、12〜16時間50℃もしくは70℃、その後の洗浄を含み得る。生物内で遭遇され得る、生理的に適切な条件等の他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に応じて、2つの配列の相補性の試験に最も適切な、一連の条件を決定することができよう。

0044

これには、第1および第2のヌクレオチド配列の全長にわたる、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに対する、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの塩基対形成が含まれる。かかる配列は、本明細書において、互いに対して「完全に相補的」と呼ぶことができる。しかし、本明細書において、第1の配列が第2の配列に対して「実質的に相補的」であると言われる場合、2つの配列は完全に相補的であり得るか、あるいはそれらの最終的な用途に最も適した条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、ハイブリダイズ時に、1個以上であるが、一般に4、3、または2個を超えないミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかし、2つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ時に1つ以上の単鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、かかるオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとは見なされないものとする。例えば、21ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドと、23ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含むdsRNAであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的である21ヌクレオチドの配列を含むdsRNAは、本明細書に記載の目的上、やはり「完全に相補的」であるとして言及され得る。

0045

また、本明細書で使用される、「相補的」な配列は、それらのハイブリダイズ能に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソンクリック塩基対、および/または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含み得るか、または完全にそれらから形成され得る。かかる非ワトソンクリック塩基対には、G−Uゆらぎまたはフーグスティーン型塩基対が含まれるが、これらに限定されない。

0046

本明細書における「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、これらが使用される文脈から理解されるように、dsRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはdsRNAのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基一致に対して使用され得る。

0047

本明細書で使用される、メッセンジャーRNA(mRNA)「の少なくとも一部に実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、5’UTR、オープンリーディングフレーム(ORF)、または3’UTRを含む、対象となるmRTA(例えば、TTRをコードするmRTA)の連続する部分に実質的に相補的である、ポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、TTRをコードするmRTAの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、TTRのmRTAの少なくとも一部に相補的である。

0048

本明細書で使用される、「二本鎖RNA」または「dsRNA」という用語は、逆平行で、上で定義されるように実質的に相補的である、2本の核酸鎖を含む二本鎖構造を有する、リボ核酸分子複合体を指す。一般に、各鎖のヌクレオチドの大半はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に説明されるように、それぞれもしくは両方の鎖は、少なくとも1個の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび/または修飾ヌクレオチドも含み得る。加えて、本明細書で使用される「dsRNA」は、複数のヌクレオチドでの大幅な修飾を含み、本明細書で開示されるか、または当該技術分野において既知であるあらゆる種類の修飾を含む、リボヌクレオチドへの化学修飾を含み得る。siRNA型分子内で使用される、このようないずれの修飾も、本明細書および特許請求の範囲の目的上、「dsRNA」によって包含される。

0049

二本鎖構造を形成する2本の鎖は、より長い1つのRNA分子の異なる部分であってもよく、あるいはそれらは別個のRNA分子であってもよい。2本の鎖がより長い1つの分子の一部であり、したがって二本鎖構造を形成する1本の鎖の3’末端とそれぞれのもう一方の鎖の5’末端との間の中断されていないヌクレオチド鎖によって接続される場合、接続するRNA鎖は、「ヘアピンループ」と称される。2本の鎖が、二本鎖構造を形成する1本の鎖の3’末端とそれぞれのもう一方の鎖の5’末端との間の、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合的に接続される場合、該接続構造は、「リンカー」と称される。該RNA鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、二本鎖内に存在するいずれかのオーバーハングを差し引いた、dsRNAの最も短い鎖内のヌクレオチド数である。二本鎖構造に加えて、dsRNAは、1つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。また、「siRNA」という用語は、上に記載の通り、dsRNAを指すように本明細書に使用される。

0050

本明細書で使用される、「ヌクレオチドオーバーハング」とは、不対ヌクレオチド、またはdsRNAの1本の鎖の3’末端がもう一方の鎖の5’末端を越えて延びるか、またはその逆である時に、dsRNAの二本鎖構造から突出するヌクレオチドを指す。「平滑」または「平滑末端」は、dsRNAのその末端に不対ヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端の」dsRNAは、その長さ全体にわたって二本鎖であるdsRNAであり、すなわち、該分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがない。

0051

「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的である領域を含む、dsRNAの鎖を指す。本明細書で使用される、「相補性の領域」という用語は、配列、例えば本明細書において定義される標的配列に実質的に相補的である、アンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、該ミスマッチは、該末端領域内に最も許容され、存在する場合、一般に、終端領域内、例えば、5’および/または3’終端の6、5、4、3、もしくは2ヌクレオチド内にある。

0052

本明細書で使用される、「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含む、dsRNAの鎖を指す。

0053

本明細書で使用される、「SNALP」という用語は、安定な核酸脂質粒子を指す。SNALPは、dsRNA、またはdsRNAが転写されるプラスミド等の核酸を含む、少量の水性内部をコーティングする、脂質の小胞を表す。SNALPは、例えば、米国特許出願公開第 20060240093号、第20070135372号、および2008年4月15日に出願の第USSN61/045,228号に説明されている。これらの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

0054

dsRNAについて言及する際、「細胞への導入」とは、当業者には理解されるように、細胞への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。dsRNAの吸収または取り込みは、支援を伴わない拡散過程もしくは細胞の能動的過程を通じて、または補助的な薬剤もしくは装置によって発生し得る。この用語の意味は、インビトロでの細胞に限定されず、dsRNAは、生命体の一部である「細胞に導入」することもできる。そのような場合、細胞への導入は、該生物への送達を含む。例えば、インビボ送達については、dsRNAを組織部位に注射するか、または全身投与することができる。細胞へのインビトロでの導入には、電気穿孔法およびリポフェクション法等の当該技術分野において既知の方法が含まれる。さらなるアプローチは、本明細書に説明されているか、または当該技術分野において既知である。

0055

「発現停止させる」、「〜の発現を阻害する」、「〜の発現を下方制御する」、および「〜の発現を抑制する」等の用語は、それらがTTR遺伝子について言及する限り、本明細書において、第1の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるが、そのように処置されていない第2の細胞もしくは細胞群(対照細胞)と比較して、TTR遺伝子が転写され、TTR遺伝子の発現が阻害されるように処置された第1の細胞もしくは細胞群から単離され得る、および/または検出され得る、mRNAの量の低下によって現れる、TTR遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。阻害の程度は、通常、以下で表される。

0056

代替として、阻害の程度は、TTR遺伝子の発現に機能的に結び付けられるパラメータ、例えば細胞によって分泌されるTTR遺伝子によってコードされるタンパク質の量、または特定の表現型、例えばアポトーシス提示する細胞の数の低下に関して出されてもよい。原則的に、TTR遺伝子の発現停止は、構成的に、またはゲノム工学によってのいずれか、ならびに任意の適切なアッセイによって、該標的を発現する任意の細胞において決定することができる。しかし、あるdsRNAが特定の程度、TTR遺伝子の発現を阻害し、したがって本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要とされる場合、以下の実施例で提供されるアッセイが、かかる参照の役割を果たす。

0057

例えば、特定の場合において、TTR遺伝子の発現は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%抑制される。幾つかの実施形態において、TTR遺伝子は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約60%、70%、または80%抑制される。幾つかの実施形態において、TTR遺伝子は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約85%、90%、または95%抑制される。

0058

TTRの発現の文脈において本明細書で使用される、「治療する」、「治療」等の用語は、TTRの発現によって媒介される病理過程の軽減または緩和を指す。本発明の文脈において、本明細書で以下に列挙される他の病態のうちのいずれかに関連する限り(TTRの発現によって媒介される病理過程以外)、「治療する」、「治療」等の用語は、かかる病態に関連する少なくとも1つの症状の軽減もしくは緩和、またはFAP等のTTRアミロイドーシスの進行の遅延等の、かかる病態の進行の遅延もしくは逆行を意味する。TTRアミロイドーシスの症状には、神経障害(例えば、知覚障害、遠位部の感覚鈍麻)、自律性神経障害(例えば、胃潰瘍または起立性低血圧症等の胃腸障害)、運動神経障害発作認知症ミエロパシー多発性神経障害手根管症候群自律神経不全症、心筋症、硝子体混濁腎不全腎症、実質的に減少したmBMI修正ボディーマスインデックス)、脳神経障害、および角膜格子変性が含まれる。

0059

本明細書で使用される、「治療上有効な量」および「予防上有効な量」というは、TTRの発現によって媒介される病理過程の処置、阻止、もしくは管理、またはTTRの発現によって媒介される病理過程の明らかな症状において、治療的有用性を提供する量を指す。治療上有効である具体的な量は、普通の開業医が容易に決定することができ、例えば、TTRの発現によって媒介される病理過程の種類、患者病歴および年齢、TTRの発現によって媒介される病理過程のステージ、ならびに他のTTRの発現によって媒介される病理過程に抗する薬剤の投与等の、当該技術分野において既知の因子に依存して異なり得る。

0060

本明細書で使用される、「医薬組成物」は、薬理学上有効な量のdsRNAと、薬剤として許容される担体とを含む。本明細書で使用される、「薬理学上有効な量」、「治療上有効な量」、または単に「有効量」は、目的とする薬理学的、治療的、または阻止的結果を産生するのに効果的なRNAの量を指す。例えば、ある臨床的治療が、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータにおいて、少なくとも25%の低下がある時に有効であると見なされる場合、該疾患または障害を治療するための薬物の治療上有効な量は、該パラメータにおける少なくとも25%の低下をもたらすために必要な量である。例えば、TTRを標的とするdsRNAの治療上有効な量は、TTRの血清レベルを少なくとも25%低下させることができる。別の例において、TTRを標的とするdsRNAの治療上有効な量は、肝機能または腎機能を少なくとも25%向上させることができる。

0061

「薬剤として許容される担体」という用語は、治療薬を投与するための担体を指す。かかる担体には、食塩水緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロールエタノール、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。該用語は、明確に、細胞培養基を除く。経口投与される薬物について、薬剤として許容される担体には、不活性希釈剤崩壊剤結合剤滑沢剤甘味剤香味剤着色剤、および防腐剤等の薬剤として許容される賦形剤が含まれるが、これらに限定されない。好適な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよびカルシウムリン酸ナトリウムおよびカルシウム、ならびにラクトースが含まれ、コーンスターチおよびアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤にはデンプンおよびゼラチンを含むことができ、一方滑沢剤が存在する場合は、概してステアリン酸マグネシウムステアリン酸、またはタルクであろう。所望の場合、錠剤モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の材料でコーティングして、消化管内での吸収を遅らせることができる。

0062

本明細書で使用される、「形質転換細胞」は、ベクターが導入されて、そこからdsRNA分子を発現することができる細胞である。

0063

II.二本鎖リボ核酸(dsRNA)
本明細書でより詳細に記載されるように、本発明は、細胞または哺乳動物内、例えば、アミロイドーシスに罹患しているヒトのTTR遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を提供し、該dsRNAは、TTR遺伝子の発現において形成されるmRNAの少なくとも一部に相補的である相補性の領域を有する、アンチセンス鎖を含み、該相補性の領域は、30ヌクレオチド長未満、一般に19〜24ヌクレオチド長であり、該dsRNAは、該TTR遺伝子を発現する細胞と接触すると、例えば、PCRまたは分枝DNA(bDNA)ベースの方法によって、またはウエスタンブロット等によるタンパク質ベースの方法によってアッセイして、該TTR遺伝子の発現を少なくとも30%阻害する。TTR遺伝子の発現は、以下の実施例で説明されるようにアッセイによって測定して、少なくとも30%軽減され得る。例えば、Hep3B細胞等の細胞培養内のTTR遺伝子の発現は、bDNAまたはTaqManアッセイ等によるTTRのmRNAレベルを測定することによって、またはELISAアッセイ等によるタンパク質レベルを測定することによってアッセイされる等により、アッセイされ得る。本発明のdsRNAは、1本以上の単鎖のヌクレオチドのオーバーハングをさらに含み得る。

0064

該dsRNAは、以下でさらに説明されるように、当該技術分野において既知の標準的な方法、例えば、Biosearch,Applied Biosystems,Inc.から市販されるもの等の自動DNA合成装置の使用によって、合成することができる。該dsRNAは、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分相補的である、2本のRNA鎖を含む。該dsRNAの1本の鎖(アンチセンス鎖)は、TTR遺伝子の発現の間に形成されたmRNAの配列から派生した標的配列に実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である、相補性の領域を含み、もう一方の鎖(センス鎖)は、アンチセンス鎖に相補的である領域を含み、その結果、2本の鎖は、好適な条件下で組み合わされると、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。一般に、二本鎖構造は、15〜30、または25〜30、または18〜25、または19〜24、または19〜21、または19、20もしくは21塩基対長である。一実施形態において、二本鎖は19塩基対長である。別の実施形態において、二本鎖は21塩基対長である。2本の異なるsiRNAを組み合わせて使用する場合、二本鎖の長さは同一であってもよく、または異なってもよい。

0065

本発明のdsRNAのそれぞれの鎖は、一般に15〜30、または18〜25、または18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチド長である。他の実施形態において、それぞれの鎖は25〜30ヌクレオチド長である。二本鎖のそれぞれの鎖は、同一長さであってもよく、または異なる長さであってもよい。2本の異なるsiRNAを組み合わせて使用する場合、各siRNAのそれぞれの鎖の長さは、同一であってもよく、または異なってもよい。

0066

本発明のdsRNAは、1個以上のヌクレオチドの1つ以上の単鎖のオーバーハングを含むことができる。一実施形態において、該dsRNAの少なくとも一端は、1〜4、一般には1または2個のヌクレオチドの、単鎖のヌクレオチドオーバーハングを有する。別の実施形態において、該dsRNAのアンチセンス鎖は、センス鎖の3’末端および5’末端のそれぞれに、1〜10個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。さらなる実施形態において、該dsRNAのセンス鎖は、アンチセンス鎖の3’末端および5’末端のそれぞれに、1〜10個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。

0067

少なくとも1つのヌクレオチドオーバーハングを有するdsRNAは、平滑末端の対応物より予想外に優れた阻害特性を有し得る。幾つかの実施形態において、1つのみのヌクレオチドオーバーハングの存在により、その全体的な安定性に影響を及ぼすことなく、dsRNAの干渉活性強化される。1つのみのオーバーハングを有するdsRNAは、インビボ、ならびに種々の細胞、細胞培養基、血液、および血清内で特に安定および効果的であることが判明している。一般に、単鎖のオーバーハングは、アンチセンス鎖の3’終端、または代替として、センス鎖の3’終端に位置する。該dsRNAは、一般にアンチセンス鎖の5’末端に位置する、平滑末端も有し得る。かかるdsRNAは改善された安定性および阻害活性を有し得、したがって、低投薬量、すなわち、1日当たり受容者の体重1kgにつき5mg未満の投与を可能にする。一般に、該dsRNAのアンチセンス鎖は、3’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、5’末端は平滑である。別の実施形態において、オーバーハング内のヌクレオチドのうちの1つ以上が、ヌクレオシドチオリン酸と置換される。

0068

一実施形態において、TTR遺伝子はヒトTTR遺伝子である。特定の実施形態において、該dsRNAのセンス鎖は、表3A、3B、4、6A、6B、または7からのセンス配列のうちの1つであり、該アンチセンス鎖は、表3A、3B、4、6A、6B、または7からのセンス配列のうちの1つである。表3A、3B、4、6A、6B、または7に提供される標的配列のいずれかの箇所を標的とする代替のアンチセンス剤を、標的配列および隣接するTTR配列を使用して、容易に決定することができる。

0069

当業者は、20〜23だが、特に21個の塩基対の二本鎖構造を有するdsRNAが、RNA干渉の誘発に特に効果的であるとして称賛を得ていることをよく認識している(Elbashir et al.,EMBO 2001,20:6877−6888)。しかし、他の者は、より短いもしくはより長いdsRNAが、同様に効果的であり得ることを見出している。上記の実施形態において、表3A、3B、4、6A、6B、または7に提供されるオリゴヌクレオチド配列性質のために、本発明で取り上げられるdsRNAは、本明細書に記載の長さの少なくとも1本の鎖を含むことができる。一端または両端のわずかな数のヌクレオチドを差し引いた、表3A、3B、4、6A、6B、または7の配列のうちの1つを有するより短いdsRNAが、上記のdsRNAと比較して、同様に効果的であり得ることは、妥当予想され得る。したがって、表3、4、6、または7の配列のうちの1つからの、少なくとも15、16、17、18、19、20個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの部分的配列を有するdsRNAは、本明細書で以下に記載されるアッセイにおいて、TTR遺伝子の発現を阻害するそれらの能力が、完全な配列を含むdsRNAと阻害の5、10、15、20、25、もしくは30%以下の異なるdsRNAが、本発明によって企図される。さらに、所望のTTR標的配列内で切断するdsRNAを、対応するTTRアンチセンス配列および相補的なセンス配列を用いて容易に作製することができる。

0070

加えて、表3A、3B、4、6A、6B、または7に提供されるdsRNAは、RNAiに基づく切断の影響を受けやすい、TTR内の部位を特定する。したがって、本発明は、本発明の薬剤のうちの1つによって標的とされる配列内を標的とする、dsRNAをさらに特徴とする。本明細書で使用される、第2のdsRNAは、第2のdsRNAが、第1のdsRNAのアンチセンス鎖に相補的であるmRNA内のいずれかの箇所でメッセージを切断する場合、第1のdsRNAの配列内を標的とすると言われる。かかる第2のdsRNAは、一般に、TTR遺伝子内の選択した配列に隣接する領域から取られたさらなるヌクレオチド配列に連結される、表3A、3B、4、6A、6B、または7に提供される配列のうちの1つからの少なくとも15個の連続するヌクレオチドからなる。

0071

本発明で取り上げられるdsRNAは、標的配列との1つ以上のミスマッチを含有してもよい。一実施形態において、本発明で取り上げられるdsRNAは、3つ以下のミスマッチを含有する。dsRNAのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲が、相補性の領域の中心に位置しないことが好ましい。該dsRNAのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、いずれかの末端から5ヌクレオチド、例えば、相補性の領域の5’もしくは3’末端のいずれかから5、4、3、2、もしくは1ヌクレオチドに制限されることが好ましい。例えば、TTR遺伝子の領域に相補的である23ヌクレオチドのdsRNA鎖について、該dsRNAは、一般には、中央の13個のヌクレオチド内にはいかなるミスマッチも含有しない。本発明内で記載される方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するdsRNAが、TTR遺伝子の発現の阻害に効果的であるかどうかを判定することができる。TTR遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチを有するdsRNAの有効性を考慮することは、特にTTR遺伝子内の特定の相補性の領域が、集団内に多型の配列多様性を有することが既知である場合、重要である。

0072

修飾
また別の実施形態において、該dsRNAは、安定性を亢進させるために化学修飾される。本発明で取り上げられる核酸は、「Current protocols in nucleic acid chemistry」、Beaucage,S.L.et al.(Eds.),John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USAに記載されるもの等の、当該技術分野において十分確立された方法によって、合成および/または修飾することができ、該文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明において有用であるdsRNA化合物の具体例には、修飾された骨格を含むか、または天然のヌクレオシド間結合を含まないdsRNAが含まれる。本明細書で定義されるように、修飾された骨格を有するdsRNAには、該骨格にリン原子を保持するもの、および該骨格にリン原子を有しないものが含まれる。本明細書の目的上、また当該技術分野において時折言及されるように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾されたdsRNAも、オリゴヌクレオシドであると見なすことができる。

0073

修飾されたdsRNA骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホジチオエート、ホスホトリエステルアミノアルキルホスホトリエステル、3’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な3’−5’結合を有するボラノホスフェート、2’−5’結合したこれらの類似体、そしてヌクレオシド単位の隣接する対が3’−5’から5’−3’へ、または2’−5’から5’−2’へ結合する、逆向きの極性を有するものが含まれる。また、種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。

0074

上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第3,687,808号、第4,469,863号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,195号、第5,188,897号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,316号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号、および第5,625,050号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

0075

その中にリン原子を含まない、修飾されたdsRNA骨格は、単鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1個以上の単鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合(ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された)、シロキサン骨格硫化物スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびにN、O、S、およびCH2を混合した構成成分を有する他のもの、を有するものが含まれる。

0076

上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,64,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号、および第5,677,439号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

0077

他の好適なdsRNA模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格が、新規の基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とハイブリダイズするために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているそのようなオリゴマー化合物の1つであるdsRNA模倣体は、ペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物では、dsRNAの糖骨格が、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持され、該骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第5,539,082号、第5,714,331号、および第5,719,262号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsen et al.,Science,1991,254,1497−1500に見出すことができる。

0078

本発明の他の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するdsRNA、およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドであり、特に上述の米国特許第5,489,677号の−−CH2−−NH−−CH2−−、−−CH2−−N(CH3)−−O−−CH2−−[メチレン(メチルイミノ)またはMMI骨格として知られる]、−−CH2−−O−−N(CH3)−−CH2−−、−−CH2−−N(CH3)−−N(CH3)−−CH2−−、および−−N(CH3)−−CH2−−CH2−−[式中、天然のホスホジエステル骨格は、−−O−−P−−O−−CH2−として表される]、および上述の米国特許第5,602,240号のアミド骨格である。

0079

また、修飾されたdsRNAは、1つ以上の置換糖部分も含有することができる。好ましいdsRNAは、2’位に、OH;F;O−、S−、もしくはN−アルキル;O−、S−、もしくはN−アルケニル;O−、S−、もしくはN−アルキニル;またはO−アルキル−O−アルキルのうちの1つを含み、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換のC1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルであり得る。O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2が特に好ましく、式中、nおよびmは1〜約10である。他の好ましいdsRNAは、2’位に、C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルアラルキル、O−アルカリル、もしくはO−アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキルヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基介入物、dsRNAの薬物動態特性を改善するための基、またはdsRNAの薬力学的特性を改善するための基、ならびに類似した特性を有する他の置換基のうちの1つを含む。好ましい修飾には、2’−メトキシエトキシ(2’−O−−CH2CH2OCH3であって、2’−O−(2−メトキシエチル)または2’−MOEとしても知られる)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486−504)すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。好ましいさらなる修飾には、本明細書において以下の実施例に記載される、2’−DMAOEとしても知られる、2’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、O(CH2)2ON(CH3)2基、ならびに、同様に、本明細書において以下の実施例に記載される、2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(当該技術分野で2’−O−ジメチルアミノエトキシエチルもしくは2’−DMAEOEとしても知られる)、すなわち、2’−O−−CH2−−O−−CH2−−N(CH2)2が含まれる。

0080

他の好ましい修飾には、2’−メトキシ(2’−OCH3)、2’−アミノプロポキシ(2’−OCH2CH2CH2NH2)、および2’−フルオロ(2’−F)が含まれる。同様の修飾を、dsRNAの他の位置、特に3’終端ヌクレオチドもしくは2’−5’結合dsRNA内の糖の3’位、および5’終端ヌクレオチドの5’位で作製することもできる。また、dsRNAは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。かかる修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第4,981,957号、第5,118,800号、第5,319,080号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第5,466,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第5,627,053号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第5,670,633号、および第5,700,920号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のうちのあるものは本出願によって共同所有され、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0081

dsRNAは、核酸塩基(当該技術分野ではしばしば単に「塩基」と称される)修飾または置換をも含み得る。本明細書で使用される、「非修飾」もしくは「天然」の核酸塩基には、プリン塩基、アデニン(A)およびグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基、チミン(T)、シトシン(C)、およびウラシル(U)が含まれる。修飾された核酸塩基には、5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシンキサンチンヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2−プロピルおよび他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシン、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニルウラシルおよびシトシン、6−アゾのウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(シュードウシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシルおよび他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニン、ならびに3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニン等の、他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号で開示されるもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858−859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990で開示されるもの、Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613で開示されるもの、およびSanghvi,Y S.,Chapter 15,DsRNAResearch and Applications,pages 289−302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRCPress,1993で開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のうちの特定のものは、本発明で取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために、特に有用である。これらには、2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシル、および5−プロピニルシトシンを含む、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジン、ならびにN−2、N−6、およびO−6置換プリンが含まれる。5−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を0.6〜1.2℃増加させることが示されていて(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,DsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276−278)、例示的な塩基置換であり、2’−O−メトキシエチル糖修飾と組み合わされると、さらに特に好ましい。

0082

上記の修飾された核酸塩基の特定のもの、ならびに他の修飾された核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、上記の米国特許第3,687,808号、ならびに米国特許第4,845,205号、第5,130,30号、第5,134,066号、第5,175,273号、第5,367,066号、第5,432,272号、第5,457,187号、第5,459,255号、第5,484,908号、第5,502,177号、第5,525,711号、第5,552,540号、第5,587,469号、第5,594,121号、第5,596,091号、第5,614,617号、および第5,681,941号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれ、米国特許第5,750,692号も、参照により本明細書に組み込まれる。

0083

共役体
本発明のdsRNAの別の修飾は、該dsRNAの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進させる、1つ以上の部分または共役体の該dsRNAへの化学的結合を伴う。かかる部分には、コレステロール部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,199,86,6553−6556)、コール酸(Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994 4 1053−1060)、チオエーテル、例えば、ヘキシル−S−トリチルチオール(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306−309、Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765−2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20,533−538)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基(Saison−Behmoaras et al.,EMBO J,1991,10,1111−1118、Kabanov et al.,FEBSLett.,1990,259,327−330、Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75,49−54)、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−Hホスホネート(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651−3654、Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777−3783)、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al.,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969−973)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651−3654)、パルミチル部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229−237)、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923−937)等の脂質部分が含まれるが、これらに限定されない。

0084

かかるdsRNA共役体の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第4,828,979号、第4,948,882号、第5,218,105号、第5,525,465号、第5,541,313号、第5,545,730号、第5,552,538号、第5,578,717号、第5,580,731号、第5,591,584号、第5,109,124号、第5,118,802号、第5,138,045号、第5,414,077号、第5,486,603号、第5,512,439号、第5,578,718号、第5,608,046号、第4,587,044号、第4,605,735号、第4,667,025号、第4,762,779号、第4,789,737号、第4,824,941号、第4,835,263号、第4,876,335号、第4,904,582号、第4,958,013号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,245,022号、第5,254,469号、第5,258,506号、第5,262,536号、第5,272,250号、第5,292,873号、第5,317,098号、第5,371,241号、第5,391,723号、第5,416,203号、第5,451,463号、第5,510,475号、第5,512,667号、第5,514,785号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,595,726号、第5,597,696号、第5,599,923号、第5,599,928号、および第5,688,941号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

0085

ある化合物の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際、前述の修飾のうちの1つ以上を単一化合物に、あるいはさらにはdsRNA内の単一ヌクレオシドに組み込むことができる。また、本発明は、キメラ化合物であるdsRNA化合物も含む。本発明の文脈において、「キメラ(chimeric)」dsRNA化合物または「キメラ(chimera)」は、dsRNA化合物であり、特に2つ以上の化学的にはっきりと異なる領域を含有し、それぞれ、少なくとも1つのモノマー単位、すなわち、dsRNA化合物の場合のヌクレオチドからなる、dsRNAである。これらのdsRNAは、典型的には、該dsRNAは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、および/または標的核酸に対する結合親和性の増加を該dsRNAに付与するように、修飾される、少なくとも1つの領域を含有する。dsRNAのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質としての役割を果たすことができる。一例として、RNアーゼHは、RNA:DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。RNアーゼHの活性化は、したがって、RNA標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のdsRNA阻害の効率を大きく亢進させる。それ故、キメラdsRNAが使用される場合、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシdsRNAと比較して、しばしばより短いdsRNAによって匹敵する結果を得ることができる。

0086

RNA標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要であれば、当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技法によって、日常的に検出することができる。dsRNAの標的mRNAにおける切断部位は、一般に、当業者に既知の方法、例えば、Soutschek et al.,Nature;2004,Vol.432,pp.173−178に記載の5’−RACE法(全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる)を用いて決定することができる。1つの実施形態において、Soutschekらによって記載の5’−RACE法を用いて、ALN−18328が、配列番号1331(NM_000371.3)の636位のグアニンヌクレオチドと配列番号1331の637位のアデニンヌクレオチドとの間で、TTRのmRNAを切断することが確認された。1つの実施形態において、ALN−18328が、配列番号1331の637位のアデニンヌクレオチドと配列番号1331の638位のグアニンヌクレオチドとの間で、TTRのmRNAを切断しないことが確認された。

0087

特定の場合において、該dsRNAは、非リガンド基によって修飾されてもよい。多くの非リガンド分子が、dsRNAの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進させるためにdsRNAに共役されており、かかる共役を行うための手順は、科学文献で入手可能である。かかる非リガンド部分には、コレステロール(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6553)、コール酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4:1053)、チオエーテル、例えば、ヘキシル−S−トリチルチオール(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306、Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765)、チオコレステロール(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20:533)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基(Saison−Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10:111、Kabanov et al.,FEBSLett.,1990,259:327、Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75:49)、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホネート(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651、Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18:3777)、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al.,Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651)、パルミチル部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229)、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923)等の脂質部分が含まれている。かかるdsRNA共役体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列記されている。典型的な共役プロトコルは、配列の1つ以上の位置にアミノリンカーを有するdsRNAの合成を伴う。次いで、アミノ基を、適切なカップリングもしくは活性化試薬を使用して、共役される分子と反応させる。共役反応は、依然として固体支持体に結合されたdsRNAを用いて、または溶液相中でのdsRNAの切断後のいずれかに実行することができる。典型的には、HPLCによってdsRNA共役体を精製して、純粋な共役体が得られる。

0088

ベクターによりコードされるdsRNA
別の態様では、TTRのdsRNA分子が、DNAもしくはRNAベクターに挿入された転写単位から発現される(例えばCouture,A,et al.,TIG.(1996),12:5−10、Skillern,Aらの国際PCT公開WO第00/22113号、Conradの国際PCT公開WO第00/22114号、およびConradの米国特許第6,054,299号を参照されたい)。これらの導入遺伝子は、線状構築物環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、宿主ゲノムに統合される導入遺伝子として導入されて、受け継がれ得る。また、導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして受け継がれるのを可能にするように、構築することもできる(Gassmann,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:1292)。

0089

dsRNAの個々の鎖を、2つの個別の発現ベクター上のプロモーターを用いて転写し、標的細胞同時形質移入することができる。あるいは、dsRNAのそれぞれ個々の鎖を、いずれも同一発現プラスミド上に位置するプロモーターを用いて転写してもよい。一実施形態において、dsRNAは、dsRNAがステムアンドループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって接合される逆方向反復として発現される。

0090

組換えdsRNA発現ベクターは、一般に、DNAプラスミドまたはウイルスベクターである。dsRNAを発現するウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス概説として、Muzyczka,et al.,Curr.Topics Micro.Immunol.(1992)158:97−129を参照)、アデノウイルス(例えば、Berkner,et al.,BioTechniques(1998)6:616)、Rosenfeld et al.(1991,Science 252:431−434)、およびRosenfeld et al.(1992)、Cell 68:143−155を参照))、またはアルファウイルス、ならびに当該技術分野において既知の他のものに基づいて構築することができるが、これらに限定されない。種々の遺伝子を、上皮細胞を含む多くの異なる細胞型にインビトロおよび/またはインビボで導入するために、レトロウイルスが使用されている(例えば、Eglitis,et al.,Science(1985)230:1395−1398、Danos and Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)85:6460−6464、Wilson et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3014−3018、Armentano et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:61416145、Huber et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8039−8043、Ferry et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8377−8381、Chowdhury et al.,1991,Science 254:1802−1805、van Beusechem.et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7640−19、Kay et al.,1992,Human Gene Therapy 3:641−647、Dai et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892−10895、Hwu et al.,1993,J.Immunol.150:4104−4115、米国特許第4,868,116号、米国特許第4,980,286号、PCT出願WO第89/07136号、PCT出願WO第89/02468号、PCT出願WO第89/05345号、およびPCT出願WO第92/07573号を参照)。細胞のゲノムに挿入された遺伝子を形質導入して発現することができる組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムを、PA317およびPsi−CRIP等の好適なパッケージング細胞系形質移入することによって、産生することができる(Comette et al.,1991,ヒト Gene Therapy 2:5−10、Cone et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6349)。感受性宿主(例えば、ラット、ハムスターイヌ、およびチンパンジー)内の多岐にわたる細胞および組織を感染させるために、組換えアデノウイルスベクターを使用することができ(Hsu et al.,1992,J.Infectious Disease,166:769)、これは、感染に有糸分裂的に活性な細胞を必要としない利点も有する。

0091

発現されるdsRNA分子のコード配列受け入れることができる任意のウイルスベクターを使用することができ、例としては、アデノウイルス(AV)、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス(例えば、レンチウイルス(LV)、ラブドウイルスマウス白血病ウイルス)、ヘルペスウイルス等に由来するベクターである。ウイルスベクターの指向性は、エンベロープタンパク質もしくは他のウイルスからの他の表面抗原を用いて該ベクターをシュードタイピングすることにより、または異なるウイルスのキャプシドタンパク質適宜置換することによって、修正することができる。

0092

例えば、本発明で取り上げられるレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、狂犬病エボラ、モコラ等からの表面タンパク質でシュードタイピングすることができる。本発明で取り上げられるAAVベクターは、ベクターが異なるキャプシドタンパク質の血清型を発現するように操作することにより、異なる細胞を標的とするようにすることができる。例えば、血清型2のゲノム上に血清型2のキャプシドを発現するAAVベクターは、AAV2/2と称される。AAV2/2ベクター内のこの血清型2のキャプシド遺伝子を、血清型5のキャプシド遺伝子と置換して、AAV2/5ベクターを産生することができる。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するAAVベクターを構築するための技法は、当該技術分野の技能内であり、例えば、Rabinowitz J E et al.(2002),J Virol 76:791−801を参照されたく、その開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

0093

本発明における使用に好適な組換えウイルスベクターの選択、dsRNAの発現のために核酸配列を該ベクターに挿入するための方法、および該ウイルスベクターを対象となる細胞に送達する方法は、当該技術分野の技能内である。例えば、Dornburg R(1995),Gene Therap.2:301−310、Eglitis M A(1988),Biotechniques 6:608−614、Miller A D(1990),Hum Gene Therap.1:5−14、Anderson W F(1998),Nature 392:25−30、およびRubinson D A et al.,Nat.Genet.33:401−406を参照されたく、それらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

0094

ウイルスベクターは、AVおよびAAVに由来し得る。一実施形態において、本発明で取り上げられるdsRNAは、例えば、U6もしくはH1 RNAプロモーター、またはサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターのいずれかを有する組換えAAVベクターから、2つの別個の相補的な単鎖RNA分子として発現される。

0095

本発明のdsRNAを発現するために好適なAVベクター、組換えAVベクターを構築するための方法、該ベクターを標的細胞に送達するための方法は、Xia H et al.(2002),Nat.Biotech.20:1006−1010に記載されている。

0096

本発明で取り上げられるdsRNAを発現するために好適なAAVベクター、組換えAVベクターを構築するための方法、該ベクターを標的細胞に送達するための方法は、Samulski R et al.(1987),J.Virol.61:3096−3101、Fisher K J et al.(1996),J.Virol,70:520−532、Samulski R et al.(1989),J.Virol.63:3822−3826、米国特許第5,252,479号、米国特許第5,139,941号、国際特許出願WO第94/13788号、および国際特許出願WO第93/24641号に記載され、それらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

0097

本発明で取り上げられるDNAプラスミドもしくはウイルスベクターのいずれか内でdsRNAの発現を駆動するプロモーターは、真核生物RNAポリメラーゼI(例えばリボソームRNAプロモーター)、RNAポリメラーゼII(例えばCMV初期プロモーター、もしくはアクチンプロモーター、もしくはU1 snRNAプロモーター)、または一般にRNAポリメラーゼIIIプロモーター(例えばU6 snRNAもしくは7SKRNAプロモーター)、あるいは原核生物プロモーター、例えば、発現プラスミドもT7プロモーターからの転写に必要なT7 RNAポリメラーゼをコードするという条件で、T7プロモーターであり得る。該プロモーターは、膵臓への導入遺伝子の発現を導くこともできる(例えば、the insulin regulatory sequence for pancreas(Bucchini et al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2511−2515)を参照)。

0098

さらに、導入遺伝子の発現は、、例えば、特定の生理的調節因子、例えば、循環ブドウ糖レベル、またはホルモンに感受性である調節配列等の、誘発可能な調節配列および発現系を使用することによって、正確に調節することができる(Docherty et al.,1994,FASEB J.8:20−24)。細胞または哺乳動物内の導入遺伝子の発現を制御するために好適である、かかる誘発可能な発現系には、エクジソンエストロゲンプロゲステロンテトラサイクリン二量化化学誘発物質、およびイソプロピルベータ−D1−チオガラクトピラノシド(EPTG)による調節が含まれる。当業者は、dsRNA導入遺伝子の目的とする用途に基づいて、適切な調節/プロモーター配列を選択することができよう。当業者は、dsRNA導入遺伝子の目的とする用途に基づいて、適切な調節/プロモーター配列を選択することができよう。

0099

一般に、dsRNA分子を発現することができる組換えベクターは、以下に記載するように送達され、標的細胞内に生き残る。代替として、dsRNA分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。発現すると、dsRNAは標的RNAに結合し、その機能または発現を調節する。dsRNAを発現するベクターの送達は、静脈内もしくは筋肉内投与等によって全身的、患者から外植された標的細胞に投与後、該患者へ再導入することによって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段等によって、であり得る。

0100

dsRNA発現DNAプラスミドは、典型的には、カチオン性脂質担体(例えばオリゴフェクタミン(Oligofectamine))、または非カチオン性脂質に基づく担体(例えばTransit−TKO(商標))との複合体として、標的細胞に形質移入される。1週間以上の期間にわたって、単一のTTR遺伝子の異なる領域または複数のTTR遺伝子を標的とする、dsRNAによって媒介されるノックダウンのための複数回の脂質の形質移入もまた、本発明によって企図される。ベクターの宿主細胞への導入の成功は、種々の既知の方法を使用して監視することができる。例えば、一過性形質移入は、緑色蛍光タンパク質(GFP)等の蛍光マーカー等のレポーターを用いて示すことができる。エクスビボ細胞の安定な形質移入は、形質移入細胞に、ハイグロマイシンB耐性等の、特定の環境因子(例えば、抗生物質および薬物)に対する耐性を提供するマーカーを使用して、保証することができる。

0101

また、TTRに特異的なdsRNA分子は、ベクターに挿入して、ヒト患者に対する遺伝子療法ベクターとして使用することもできる。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射局所投与(米国特許第5,328,470号を参照)、または定位固定注射(例えば、Chen et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3054−3057を参照)によって、対象に送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬調製物は、許容される希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含んでもよく、または遺伝子送達媒体が中に埋め込まれる徐放性マトリックスを含んでもよい。代替として、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから、完全な遺伝子送達ベクターを無傷で産生することができる場合、医薬調製物は、遺伝子送達系を産生する1つ以上の細胞を含んでもよい。

0102

III.dsRNAを含有する医薬組成物
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるdsRNAと、薬剤として許容される担体とを含有する医薬組成物を提供する。該dsRNAを含有する医薬組成物は、TTRの発現によって媒介される病理過程等の、TTR遺伝子の発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害の治療に有用である。かかる医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、非経口投与を介して、例えば、静脈(IV)送達による全身投与用に製剤化される組成物である。別の例は、例えば、持続ポンプ注入等による脳への注入によって、脳実質への直接送達用に製剤化される組成物である。

0103

本明細書で取り上げられる医薬組成物は、TTR遺伝子の発現を阻害するために十分な投薬量で投与される。

0104

一般に、dsRNAの好適な用量は、1日当たり受容者の体重1キログラムにつき0.01〜200.0ミリグラムの範囲、一般には、1日当たり体重1キログラムにつき1〜50mgの範囲であろう。例えば、該dsRNAは、単回用量当たり0.0059mg/kg、0.01mg/kg、0.0295mg/kg、0.05mg/kg、0.0590mg/kg、0.163mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.543mg/kg、0.5900mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.628mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、または50mg/kgで投与することができる。

0105

一実施形態において、該投薬量は、0.01〜0.2mg/kgである。例えば、該dsRNAは、0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.3mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.10mg/kg、0.11mg/kg、0.12mg/kg、0.13mg/kg、0.14mg/kg、0.15mg/kg、0.16mg/kg、0.17mg/kg、0.18mg/kg、0.19mg/kg、または0.20mg/kgの用量で投与することができる。

0106

一実施形態において、該投薬量は、0.005mg/kg〜1.628mg/kgである。例えば、該dsRNAは、0.0059mg/kg、0.0295mg/kg、0.0590mg/kg、0.163mg/kg、0.543mg/kg、0.5900mg/kg、または1.628mg/kgの用量で投与することができる。

0107

一実施形態において、該投薬量は、0.2mg/kg〜1.5mg/kgである。例えば、該dsRNAは、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、または1.5mg/kgの用量で投与することができる。

0108

該医薬組成物は、1日1回投与することができ、あるいは、該dsRNAは、1日にわたって適切な間隔で、2、3、またはそれ以上の分割用量(sub−dose)として、さらに、持続注入または放出制御製剤による送達を用いて投与されてもよい。その場合、各分割用量に含有されるdsRNAは、1日当たりの総投薬量を達成するように、対応してより小さくなければならない。投薬量単位は、例えば、数日間にわたって該dsRNAの持続放出を提供する、従来の持続放出製剤を使用して、数日間にわたる送達用に配合することができる。持続放出製剤は当該技術分野において周知であり、本発明の薬剤を用いて使用され得る部位等の特定の部位での薬剤の送達に特に有用である。本実施形態では、投薬量単位は、対応する複数の1日量を含む。

0109

TTRレベルに対する単回用量の効果は長く続き、その結果、その後の用量は、3、4、もしくは5日の間隔より多くなく、または1、2、3、もしくは4週間の間隔より多くなく、または5、6、7、8,9、もしくは10週間の間隔より多くない量で投与される。

0110

当業者には、限定されないが、疾患もしくは障害の重症度、以前の処置、総体的な健康、および/または対象の年齢、ならびに存在する他の疾患を含む特定の因子が、対象を効果的に処置するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることが理解されよう。さらに、治療上有効な量の組成物を用いた対象の治療には、単回処置または一連の治療が含まれ得る。本発明により包含される個々のdsRNAに対する効果的な投薬量およびインビボ半減期推定は、従来の方法を使用して、または本明細書のいずれかの箇所で記載される適切な動物モデルを使用したインビボ試験に基づいて、行うことができる。

0111

マウス遺伝学における進歩によって、TTRの発現によって媒介される病理過程等の種々のヒト疾患の研究用に、多くのマウスモデルが生成されている。かかるモデルは、dsRNAのインビボ試験、ならびに治療上有効な用量を決定するために使用される。好適なマウスモデルは、例えば、ヒトTTRを発現するプラスミドを含有するマウスである。別の好適なマウスモデルは、ヒトTTRを発現する導入遺伝子を保有する遺伝子導入マウスである。

0112

細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための一連の投薬量の処方決定に使用することができる。本発明で取り上げられる組成物の投薬量は、一般に、ほとんどまたは全く毒性のないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で異なってもよい。本発明で取り上げられる方法において使用されるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において決定される、IC50(すなわち、症状の半値阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む、化合物、または適切な場合は、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲(例えば、該ポリペプチドの濃度の低下を達成する)を達成するように、処方決定することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。

0113

本発明で取り上げられるdsRNAは、標的遺伝子の発現によって媒介される病理過程の処置に効果的な他の既知の薬剤と組み合わせて投与することができる。いずれの場合においても、投与する医師は、当該技術分野において既知であるか、または本明細書に記載される、標準的な有効性の測定値を使用して得られた結果に基づいて、dsRNA投与の量およびタイミングを調整することができる。

0114

投与
本発明はまた、本発明で取り上げられるdsRNA化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所的または全身的な処置が所望されるか、および処置される範囲に依存して、多くの方法で投与することができる。投与は、局所的、噴霧器によってを含む、例えば、粉末もしくは噴霧剤吸入もしくは吹送による経気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口もしくは非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腔内、もしくは筋肉内注射もしくは注入、または頭蓋内、例えば、実質内くも膜下腔内、もしくは脳室内投与が含まれる。

0115

該dsRNAは、肝臓(例えば、肝臓の肝細胞)等の特定の組織を標的とする様態で送達することができる。

0116

本発明は、脳に直接注射することによって送達することができる医薬組成物が含まれる。該注射は、脳の特定領域(例えば、黒質皮質海馬線条体、もしくは淡蒼球)への定位固定注射によるものであり得、該dsRNAは、中枢神経系への複数領域(例えば、脳、および/または脊髄への複数領域)に送達され得る。該dsRNAは、脳の拡散領域に送達(例えば、脳の皮質への拡散送達)され得る。

0117

一実施形態において、TTRを標的とするdsRNAは、カニューレ、または例えば、脳等の組織(例えば、脳の黒質、皮質、海馬、線条体、もしくは淡蒼球)内に埋め込まれた一端を有する他の送達デバイスを経由して送達され得る。該カニューレは、該dsRNA組成物の貯蔵容器に接続することができる。流入または送達は、ポンプ、例えば、Alzetポンプ等の浸透圧ポンプもしくはミニポンプによって媒介され得る(Durect,Cupertino,CA)。一実施形態において、ポンプおよび貯蔵容器は、組織から離れたエリア、例えば腹部内に埋め込まれ、送達は、ポンプまたは貯蔵所から放出部位誘導する導管によって達成される。該dsRNA組成物の脳への注入は、数時間にわたって、または数日間、例えば、1、2、3、5、もしくは7日間、もしくはそれ以上であり得る。脳への送達用のデバイスは、例えば、米国特許第6,093,180号、および第5,814,014号に記載されている。

0118

局所投与用の医薬組成物および製剤には、経皮パッチ軟膏ローショングリーム、ゲルドロップ剤坐薬スプレー液体、および粉末が含まれ得る。従来の医薬用担体、水性、粉末、もしくは油性基剤増粘剤等が必要であるか、または望ましくあり得る。被覆したコンドーム手袋等も有用であり得る。好適な局所製剤には、本発明で取り上げられるdsRNAが、脂質、リポソーム脂肪酸脂肪酸エステルステロイドキレート剤、および界面活性剤等の局所送達剤と混合されるものが含まれる。好適な脂質およびリポソームには、中性(例えば、ジオレオイルホスファチジルDOPE)エタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン)、陰性(例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG))、ならびにカチオン性(例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル(DOTAP)、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOTMA))が含まれる。本発明で取り上げられるdsRNAは、リポソーム内カプセル化されてもよく、あるいはそれ、特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。代替として、dsRNAは、脂質、特にカチオン性脂質と複合されてもよい。好適な脂肪酸およびエステルには、アラキドン酸オレイン酸エイコサン酸ラウリン酸カプリル酸カプリン酸ミリスチン酸パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリングリセリル1−モノカプリン酸、1−ドデシルアザシクロヘプタン−2−オンアシルカルニチンアシルコリン、またはC1〜10アルキルエステル(例えば、ミリスチン酸イソプロピルIPM))、モノグリセリドジグリセリド、あるいはその薬剤として許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。局所製剤は、米国特許第6,747,014号に詳細に記載され、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。

0119

リポソーム製剤
薬物の製剤化用に研究されて、使用されているマイクロエマルジョンの他に、組織立った多くの界面活性剤の構造がある。これらには、単層ミセル二重層、および小胞が含まれる。リポソーム等の小胞は、薬物送達の観点からの、それらが提示する特異性および作用の持続時間から、大きな関心を集めている。本発明において使用される、「リポソーム」という用語は、球状の1つまたは複数の二重層に配置された両親媒性脂質の小胞を意味する。

0120

リポソームは、親油性材料および水性の内部から形成される膜を有する、単層状または多層状の小胞である。水性部分が、送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができる利点を有する。非カチオン性のリポソームは、細胞壁とさほど効率的に融合することはできないが、マクロファージによってインビボで取り込まれる。

0121

哺乳動物の無傷の皮膚を横断するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下、それぞれ50nm未満の直径を有する、一連の微細孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能で、そのような微細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。

0122

リポソームのさらなる利点には、天然のリン脂質から得られたリポソームは、生体適合性および生分解性であること、リポソームは、広範な水溶性および脂溶性の薬物を組み込むことができること、リポソームは、それらの内部区画でカプセル化された薬物を、代謝および分解から保護できること、が含まれる(Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な事項は、脂質の表面電荷、小胞の大きさ、およびリポソームの水性容積である。

0123

リポソームは、作用部位への活性成分移送および送達に有用である。リポソーム膜は、構造的生体膜と同様であるため、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞との融合が進行するに従って、リポソームの内容物が細胞内へ出て、そこで活性薬剤が作用し得る。

0124

リポソーム製剤は、多くの薬物のための送達様式として、広範な調査焦点となっている。局所投与について、リポソームが他の製剤に勝る幾つかの利点を提示するという証拠が増えつつある。かかる利点には、投与された薬物の高度な体内吸収に関連する副作用の減少、投与された薬物の所望の標的での蓄積の増加、ならびに親水性および疎水性の両方の多岐にわたる薬物を皮膚へ投与する能力が含まれる。

0125

幾つかの報告は、高分子量のDNAを含む薬剤を皮膚へ送達するリポソームの能力について詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン、および高分子量のDNAを含む化合物が、皮膚に投与されている。大半の適用が、表皮上層の標的化をもたらした。

0126

リポソームは、広義の2つのクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電したDNA分子と相互に作用し、安定な複合体を形成する、正に荷電したリポソームである。正に荷電したDNA/リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソーム内に取り入れられる。エンドソーム内の酸性pHにより、リポソームが破裂し、その内容物を細胞の細胞質内に放出する(Wang et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980−985)。

0127

pH感受性であるか、または負に荷電したリポソームは、DNAと複合するのではなく、それを捕捉する。DNAおよび脂質は共に同様に荷電されているため、複合体形成ではなく反発が生じる。それでもなお、DNAの一部は、これらのリポソームの水性内部内に捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAを培養下の細胞単層へ送達するために、pH感受性リポソームが使用されている。外因性遺伝子の発現が、標的細胞中で検出された(Zhou et al.,Journal of Controlled Release,1992,19,269−274)。

0128

リポソーム組成物の1つの主要な種類には、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、またはジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)から形成することができる。アニオン性のリポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方アニオン性の膜融合性リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)から形成される。リポソーム組成物の別の種類は、例えば、大豆ホスファチジルコリン、およびホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン(PC)から形成される。別の種類は、リン脂質、および/またはホスファチジルコリン、および/またはコレステロールの混合物から形成される。

0129

幾つかの研究が、リポソーム製剤の皮膚への局所送達を評価している。インターフェロンを含有するリポソームのモルモット皮膚への適用は、皮膚ヘルペス炎の軽減をもたらし、一方他の手段(例えば、溶液またはエマルジョンとして)を介したインターフェロンの送達は効果がなかった(Weiner et al.,Journal of Drug Targeting,1992,2,405−410)。さらに、さらなる研究は、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの、水性系を使用するインターフェロンの投与に対する有効性を試験し、リポソーム製剤は水溶性投与より優れていると結論付けた(du Plessis et al.,Antiviral Research,1992,18,259−265)。

0130

また、非イオン性リポソーム系は、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系における、薬物の皮膚への送達の実用性を決定するために調べられている。Novasome(商標)I(ジラウリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン−10−ステアリルエーテル)およびNovasome(商標)II(ジステアリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン−10−ステアリルエーテル)を含む非イオン性のリポソーム製剤が、シクロスポリンAマウス皮膚真皮に送達するために使用された。結果は、かかる非イオン性のリポソーム系が、皮膚の異なる層へのシクロスポリンAの沈着の促進に効果的であることを示した(Hu et al.S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4,6,466)。

0131

また、リポソームには、「立体的に安定化された」リポソームが含まれ、該用語は、本明細書で使用される場合、1つ以上の特定化された脂質を含むリポソームを指し、リポソームに組み込まれると、かかる特定化された脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命の向上をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、(A)モノシアロガングリオシドGM1等の1つ以上の糖脂質を含むか、または(B)ポリエチレングリコール(PEG)部分等の1つ以上の親水性ポリマー誘導体化されるものである。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはPEG誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増加は、細網内皮系(RES)の細胞内への取り込みの減少に由来すると、当該技術分野では考えられている(Allen et al.,FEBSLetters,1987,223,42、Wu et al.,Cancer Research,1993,53,3765)。

0132

1つ以上の糖脂質を含む種々のリポソームが当該技術分野において既知である。Papahadjopoulosら(Ann.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64)は、モノシアロガングリオシドGM1、ガラクトセレブロシド硫酸、およびホスファチジルイノシトールの、リポソームの血中半減期を改善する能力について報告した。これらの所見は、Gabizonら(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949)によって詳しく説明されている。共にAllenらによる、米国特許第4,837,028号および国際公開WO第88/04924号は、(1)スフィンゴミエリン、および(2)ガングリオシドGM1もしくはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第5,543,152号(Webbら)は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。1,2−sn−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開WO第97/13499号(Limら)に開示されている。

0133

1つ以上の親水性ポリマーによって誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法は、当該技術分野において既知である。Sunamotoら(Bull.Chem.Soc.Jpn.,1980,53,2778)は、PEG部分を含有する非イオン性界面活性剤、2C1215Gを含むリポソームについて記載している。Illumら(FEBSLett.,1984,167,79)は、ポリスチレン粒子ポリマーグリコールによる親水性コーティングが、血中半減期の著しい増加をもたらすことを指摘している。ポリアルキレングリコール(例えば、PEG)のカルボン酸基の結合によって修飾された合成リン脂質が、Sears(米国特許第4,426,330号、および第4,534,899号)によって記載されている。Klibanovら(FEBS Lett.,1990,268,235)は、PEGまたはステアリン酸PEGによって誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン(PE)を含むリポソームが、血中循環半減期の著しい増加を有することを示す実験について記載している。Blumeら(Biochimica et Biophysica Acta,1990,1029,91)は、このような観察を、他のPEG誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)とPEGとの組み合わせから形成されるDSPE−PEGに広げた。外部表面に共有結合されたPEG部分を有するリポソームが、欧州特許EP第0 445 131 B1号および国際公開WO第90/04384号(Fisher)に記載されている。PEGによって誘導体化された1〜20モルパーセントのPEを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法が、Woodleら(米国特許第5,013,556号、および第5,356,633号)、ならびにMartinら((米国特許第5,213,804号および欧州特許EP第0 496 813 B1号)によって記載されている。他の多くの脂質−ポリマー共役体を含むリポソームが、国際公開WO第91/05545号および米国特許第5,225,212号(共にMartinらによる)、ならびに国際公開WO第94/20073号(Zalipskyら)に開示されている。PEG修飾セラミド脂質を含むリポソームが、国際公開WO第96/10391号(Choiら)に記載されている。米国特許第5,540,935号(Miyazakiら)および米国特許第5,556,948号(Tagawaら)は、表面に官能基部分をさらに誘導体化することができるPEG含有リポソームについて記載している。

0134

核酸を含む多くのリポソームが当該技術分野において既知である。Thierryらによる国際公開WO第96/40062号は、高分子量の核酸をリポソーム中にカプセル化するための方法を開示している。Tagawaらによる米国特許第5,264,221号は、タンパク質結合リポソームを開示し、かかるリポソームの内容物にはdsRNAが含まれ得ると主張している。Rahmanらによる米国特許第5,665,710号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する特定の方法について記載している。Loveらによる国際公開WO第97/04787号は、raf遺伝子を標的とするdsRNAを含むリポソームを開示している。

0135

トランスファーソームはさらに別の種類のリポソームであり、薬物送達媒体興味を引く候補者である、高度に変形可能な脂質凝集物である。トランスファーソームは脂質小滴として記載されてもよく、これは、高度に変形可能であるため、この小滴より小さな孔に容易に浸透することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば、自己最適性(皮膚の孔の形状に適合する)、自己修復性であり、しばしば断片化されることなく標的に到達し、しばしば自己負荷性(self−loading)である。トランスファーソームを作製するために、標準的なリポソーム組成物に対して、表面エッジアクチベータ(surface edge−activator)、通常界面活性剤を添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚へ送達するために使用されている。血清アルブミンのトランスファーソームによって媒介される送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同様に効果的であることが示されている。

0136

界面活性剤は、エマルジョン(マイクロエマルジョンを含む)およびリポソーム等の製剤中に幅広い用途を見出す。天然および合成の両方の、多くの異なる種類の界面活性剤の性質を分類および順位付ける最も一般的な方法は、親水性/親油性バランスHLB)の使用によるものである。親水性基(「頭部基」としても知られる)の性質が、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。

0137

界面活性剤分子イオン化されていない場合、これは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品に幅広い用途を見出し、広範なpH値にわたって使用可能である。一般に、それらのHLB値は、その構造に依存して、2〜約18の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステルプロピレングリコールエステルグリセリルエステルポリグリセリルエステル、ソルビタンエステルスクロースエステル、およびエトキシ化エステル等の非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ化物(ethoxylate)、プロポキシ化(propoxylated)アルコール、およびエトキシ化/プロポキシ化ブロックポリマー等の非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤が、非イオン性界面活性剤のクラスのうちで最も一般的な構成物質である。

0138

界面活性剤分子が水中に溶解または分散された時に負の電荷を保有する場合、その界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸等のカルボン酸塩アシルラクチレート(lactylate)、アミノ酸アシルアミドアルキル硫酸塩およびエトキシ化アルキル硫酸塩等の硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネートアシルイセチオネート(isethionate)、アシルタウレート(taurate)、およびスルホコハク酸塩等のスルホネート、ならびにリン酸塩が含まれる。アニオン性界面活性剤のクラスのうちで最も重要な構成物質は、アルキル硫酸塩および石鹸である。

0139

界面活性剤分子が正の荷電を保有する場合、それが水中に溶解または分散されると、その界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第四アンモニウム塩がこのクラスで最も使用される構成物質である。

0140

界面活性剤分子が正または負の電荷のいずれをも保有する能力を有する場合、その界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体置換アルキルアミド、N−アルキルベタイン、およびフォスファチドが含まれる。

0141

薬品、製剤、およびエマルジョン中の界面活性剤の使用が概説されている(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。

0142

核酸脂質粒子
一実施形態において、本発明で取り上げられるTTRのdsRNAは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、SPLP、pSPLP、SNALP、または他の核酸脂質粒子を形成する。本明細書で使用される、「SNALP」という用語は、SPLPを含む安定な核酸脂質粒子を指す。本明細書で使用される、「SPLP」という用語は、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドDNAを含む核酸脂質粒子を指す。SNALPおよびSPLPは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子凝集を阻止する脂質(例えば、PEG脂質共役体)を含有する。SNALPおよびSPLPは、静脈内(i.v.)注射後に長時間の循環寿命を呈し、遠位の部位(例えば、投与部位から物理的に離れた部位)に蓄積するため、全身適用に非常に有用である。SPLPには、「pSPLP」が含まれ、これには、PCT公開WO第00/03683号に記載されるカプセル化された縮合剤と核酸との複合体が含まれる。本発明の粒子は、典型的には約50nm〜約150nm、より典型的には約60nm〜約130nm、より典型的には約70nm〜約110nm、最も典型的には約70〜約90nmの平均直径を有し、実質的に無毒である。さらに、該核酸は、本発明の核酸脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に抵抗性である。核酸脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第5,976,567号、第5,981,501号、第6,534,484号、第6,586,410号、第6,815,432号、およびPCT公開WO第96/40964号に開示されている。

0143

一実施形態において、脂質の薬物に対する比率(質量/質量比率)(例えば、脂質のdsRNAに対する比率)は、約1:1〜約50:1、約1:1〜約25:1、約3:1〜約15:1、約4:1〜約10:1、約5:1〜約9:1、または約6:1〜約9:1の範囲内であろう。

0144

カチオン性脂質は、例えば、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチルクロライドDODAC)、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミドDDAB)、N−(I−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルクロライド(DOTAP)、N−(I−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル)−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロライド(DOTMA)、N,N−ジメチル−2,3−ジオレイルオキシ)プロピルアミン(DODMA)、1,2−ジリノレイルオキシ(DiLinoleyloxy)−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2−ジリノレニルオキシ(Dilinolenyloxy)−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、1,2−ジリノレイルカルバモイルオキシ(Dilinoleylcarbamoyloxy)−3−ジメチルアミノプロパン(DLin−C−DAP)、1,2−ジリノレイオキシ(Dilinoleyoxy)−3−(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン(DLin−DAC)、1,2−ジリノレイオキシ−3−モルホリノプロパン(DLin−MA)、1,2−ジリノレオイル−3−ジメチルアミノプロパン(DLinDAP)、1,2−ジリノレイルチオ(Dilinoleylthio)−3−ジメチルアミノプロパン(DLin−S−DMA)、1−リノレオイル−2−リノレイルオキシ(linoleyloxy)−3−ジメチルアミノプロパン(DLin−2−DMAP)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−トリメチルアミノプロパンクロライド塩(DLin−TMA.Cl)、1,2−ジリノレオイル−3−トリメチルアミノプロパンクロライド塩(DLin−TAP.Cl)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−(N−メチルピペラジノ)プロパン(DLin−MPZ)、または3−(N,N−ジリノレイルアミノ(Dioleylamino)−1,2−プロパンジオール(DLinAP)、3−(N,N−ジオレイルアミノ)−1,2−プロパンジオ(propanedio)(DOAP)、1,2−ジリノレイルオキソ(Dilinoleyloxo)−3−(2−N,N−ジメチルアミノ)エトキシプロパン(DLin−EG−DMA)、1,2−ジリノレニルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、2,2−ジリノレイル(Dilinoleyl)−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−DMA)、またはそれらの類似体、(3aR,5s,6aS)−N,N−ジメチル−2,2−ジ((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエニルテトラヒドロ−3aH−シクロペンタ[d][1,3]ジオキソール−5−アミン(ALN100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート(MC3)、1,1’−(2−(4−(2−((2−(ビス(2−ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)(2−ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)ピペラジン−1−イル)エチルアザネジイル)ジドデカン−2−オール(Tech G1)、あるいはそれらの混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約20モル%〜約50モル%、または約40モル%からなり得る。

0145

別の実施形態では、脂質siRNAナノ粒子を調製するために、化合物、2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソランを使用することができる。2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソランの合成については、2008年10月23日出願の米国仮特許出願第61/107,998号に記載され、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。

0146

一実施形態において、脂質siRNA粒子には、40%の2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソラン、10%のDSPC、40%のコレステロール、10%のPEG−C−DOMG(モルパーセント)が含まれ、粒径63.0±20nmおよび0.027のsiRNA/脂質比である。

0147

非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン 4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート(DOPE−mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン(DSPE)、16−O−モノメチルPE、16−O−ジメチルPE、18−1−トランスPE、1−ステアロイル−2−オレオイル−ホスファジエタノールアミン(SOPE)、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、アニオン性脂質または中性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する総脂質の約5モル%〜約90モル%、約10モル%、または約58モル%であり得る。

0148

粒子の凝集を阻害する共役された脂質は、例えば、制限されないが、PEG−ジアシルグリセロール(DAG)、PEG−ジアルキルオキシプロピル(DAA)、PEG−リン脂質、PEG−セラミド(Cer)、またはそれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール(PEG)−脂質であり得る。PEG−DAA共役体は、例えば、PEG−ジラウリルオキシプロピル(Ci2)、PEG−ジミリスチルオキシプロピル(Ci4)、PEG−ジパルミチルオキシプロピル(Ci6)、またはPEG−ジステアリルオキシプロピル(C]8)であり得る。粒子の凝集を阻止する共役された脂質は、粒子中に存在する総脂質の0モル%〜約20モル%、または約2モル%であり得る。

0149

幾つかの実施形態において、該核酸脂質粒子には、例えば、粒子中に存在する総脂質の約10モル%〜約60モル%、または約48モル%のコレステロールがさらに含まれる。

0150

LNP01
一実施形態において、脂質様(lipidoid)ND98−4HCl(MW1487)(式1)、コレステロール(Sigma−Aldrich)、およびPEG−Ceramide C16(Avanti Polar Lipids)を使用して、脂質siRNAナノ粒子(すなわち、LNP01粒子)を調製することができる。それぞれエタノール中の原液を、ND98、133mg/mL;コレステロール、25mg/mL;PEG−Ceramide C16、100mg/mLのように調製することができる。次いで、ND98、コレステロール、およびPEG−Ceramide C16の原液を、例えば、42:48:10のモル比に混合することができる。混合された脂質溶液は、最終エタノール濃度が約35〜45%、および最終酢酸ナトリウム濃度が約100〜300mMになるように、(例えば、酢酸ナトリウム(pH5)中の)siRNA水溶液と混合することができる。脂質siRNAナノ粒子は、典型的には、混合時に自然発生的に形成される。所望の粒径分布に依存して、得られたナノ粒子混合物は、例えば、Lipex Extruder(Northern Lipids,Inc)等のサーモバレル押出機(thermobarrel extruder)を使用して、ポリカーボネート膜(例えば、100nmカットオフ)を通して押し出すことができる。場合によっては、押出ステップは割愛されてもよい。エタノール除去および同時の緩衝液交換は、例えば、透析または接線流濾過によって達成することができる。緩衝液は、例えば、約pH7、例えば、約pH6.9、約pH7.0、約pH7.1、約pH7.2、約pH7.3、または約pH7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS)と交換することができる。

0151

さらなる例示的な脂質siRNA製剤は、以下の通りである。

0152

LNP09製剤およびXTCを含む製剤は、例えば、2009年9月3日出願の米国仮出願第61/239,686号に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。LNP11製剤およびMC3を含む製剤は、例えば、2009年9月22日出願の米国仮出願第61/244,834号に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

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