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技術 CD40およびパターン認識受容体アダプターを誘発することによる免疫応答を生成するための方法および組成物

出願人 ベイラーカレッジオブメディスン
発明者 スペンサー,デイビッドプライヤダーシニ,ナラヤナン
出願日 2009年9月21日 (11年2ヶ月経過) 出願番号 2011-528050
公開日 2012年2月2日 (8年9ヶ月経過) 公開番号 2012-503019
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 動物,微生物物質含有医薬
主要キーワード 二次誘導 単一エレメント 停滞状態 電源投入スイッチ 単一通過 注文生産 冷凍保存前 青方偏移
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (20)

課題・解決手段

誘発性パターン認識受容体アダプターまたはアダプター断片およびCD40の活性を誘発することによって抗原提示細胞を活性化し、免疫応答誘導するための方法が提供される。誘発性CD40ペプチドおよび誘発性パターン認識受容体アダプターまたはアダプター断片を含むキメラタンパク質をコードする配列を含む核酸組成物もまた提供される。例示的な一実施形態において、上記方法は、抗原提示細胞に、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸形質導入するステップを含み、前記キメラタンパク質は、(i)膜ターゲティング領域、(ii)リガンド結合領域、(iii)細胞質CD40ポリペプチド領域、ならびに(iv)TIRドメイン欠く切断型MyD88ペプチドおよびTRIFペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む。

概要

背景

背景
抗原を処理し、かつ提示するそれらの特有の方法ならびに副刺分子およびサイトカイン分子の高レベル発現に対する潜在能力により、樹状細胞(DC)は、ナイーブ細胞刺激し、かつ活性化するための、有効な抗原提示細胞APC)となる(Banchereau J、Paczesny S、Blanco Pら Dendritic cells: controllers of the immune system and a new promise for immunotherapy. Ann N Y Acad Sci. 2003年;987巻:180〜187頁)。この特性は、有望な結果を伴う、多くの臨床試験における予防接種のための細胞のプラットフォームとしてのそれらの広範囲の使用に至った(O’NeillDW、Adams S、Bhardwaj N. Manipulating dendritic cell biology for the active immunotherapy of cancer. Blood. 2004年;104巻:2235〜2246頁;Rosenberg SA. A new era for cancer immunotherapy based on the genes that encode cancer antigens. Immunity. 1999年;10巻:281〜287頁)。しかしながら、癌患者におけるDCワクチン臨床的効性は、最適以下の活性化、流入領域リンパ節への限られた遊走、およびリンパ節環境における最適なT細胞活性化のための不十分な寿命を含む、おそらく多くの重大な欠失により、不満足なものであった。

DCベース癌ワクチンの最適化におけるパラメーターは、CD4+、CD8+T細胞、および調節性T(Treg)細胞などのような免疫エフェクター細胞とのDCの相互作用である。これらの相互作用では、DCの成熟状態は、結果として生じるエフェクター機能を決定する重要な因子である(Steinman RM、Hawiger D、Nussenzweig MC. Tolerogenic dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2003年;21巻:685〜711頁)。Treg増殖を最小限にしながら、CD4+およびCD8+T細胞刺激を最大限にするために、DCは、完全に成熟し、高レベルの副刺激分子(CD40、CD80、およびCD86のような)ならびにIL−12p70およびIL−6のような炎症誘発性サイトカインを発現する必要がある。等しく重要なことに、DCは、T細胞相互作用を開始するために予防接種の部位から流入領域リンパ節まで効率的に遊走することができなければならない(Vieweg J、Jackson A. Modulation of antitumor responses by dendritic cells. Springer Semin Immunopathol. 2005年;26巻:329〜341頁)。

単球由来未成熟DCのex vivo成熟については、大多数のDCベースの治験は、TNF−アルファ、IL−1ベータ、IL−6、およびPGE2からなる、標準の成熟サイトカインカクテル(MC)を使用してきた。標準の成熟カクテルにおけるプロスタグランジンE2(PGE2)の主要な機能は、CCケモカイン受容体7(CCR7)を、そのリガンド、CCケモカインリガンド19(CCL19)およびCCL21に対して感作し、それにより流入領域リンパ節へのDCの遊走性能を増強することである(Scandella E、Men Y、Gillessen S、Forster R、Groettrup M. Prostaglandin E2 is a key factor for CCR7 surface expression and migration of monocyte−derived dendritic cells. Blood. 2002年;100巻:1354〜1361頁;Luft T、Jefford M、Luetjens Pら Functionally distinct dendritic cell (DC) populations induced by physiologic stimuli: prostaglandin E(2) regulates the migratory capacity of specific DC subsets. Blood. 2002年;100巻:1362〜1372頁)。しかしながら、PGE2はまた、T細胞増殖の抑制(Goodwin JS、Bankhurst AD、Messner RP. Suppression of human T−cell mitogenesis by prostaglandin. Existence of a prostaglandin−producing suppressor cell. J Exp Med. 1977年;146巻:1719〜1734頁;Goodwin JS. Immunomodulation by eicosanoidsand anti−inflammatory drugs. Curr Opin Immunol. 1989年;2巻:264〜268頁)、炎症誘発性サイトカイン産生(例えばIL−12p70およびTNF−アルファ)の阻害(Kalinski P、VieiraPL、Schuitemaker JH、de Jong EC、Kapsenberg ML. Prostaglandin E(2) is a selective inducer of interleukin−12 p40 (IL−12p40) production and an inhibitor of bioactive IL−12p70 heterodimer. Blood. 2001年;97巻:3466〜3469頁;van der Pouw Kraan TC、Boeije LC、Smeenk RJ、Wijdenes J、Aarden LA. Prostaglandin−E2 is a potent inhibitor of human interleukin 12 production. J Exp Med. 1995年;181巻:775〜779頁))の阻害、ならびに主要組織適合複合体MHC)II表面発現ダウンレギュレーション(Snyder DS、Beller DI、UnanueER. Prostaglandins modulate macrophage Ia expression. Nature. 1982年;299巻:163〜165頁)を含む、免疫応答の刺激に対する、潜在的に有害な多数の特性を有することが報告されてきた。そのため、遊走を促進しながら、PGE2を回避することができる成熟プロトコールは、おそらく、DCベースのワクチンの治療上の有効性を改善するであろう。

CD40シグナル経路の標的一時的制御に基づくDC活性化系は、リンパ組織内のDCの刺激誘発性(pro−stimulatory)状態を拡張するために開発されてきた。DCの機能性は、CD40シグナル伝達の大きさおよび期間の両方を増加させることによって改善された(非特許文献1)。これを達成するために、CD40受容体は、CD40の細胞質ドメインが膜ターゲティング配列と共に合成リガンド結合ドメインに融合されるように再設計された。二量体化化学的誘発物質CID)と呼ばれる脂質透過性二量体化薬物AP20187(AP)の投与(非特許文献2)は、マウスDCにおけるCD40依存的シグナル伝達カスケードのin vivo誘発に至った。この誘発戦略は、他の活性化様式を用いて達成されるもの以上に、in vivoにおける、明示される抗原および腫瘍の両方に対する免疫原性を著しく増強した(非特許文献1)。マウスにおけるこのキメラリガンド誘発性CD40(iCD40と命名される)の強い効力は、この方法が、ヒトDCワクチンの効力を同様に増強するかもしれないことを示唆した。

Toll様受容体TLR)シグナル伝達がその例であるパターン認識受容体(PRR)シグナル伝達もまた、DCの成熟および活性化の誘発における重大な役割を果たし、ヒトDCは、多数の別のTLRを発現する(非特許文献3)。11種の哺乳動物TLRは、様々な病原体由来巨大分子応答し、適応免疫の開始と共に自然免疫応答の活性化に寄与する。リポ多糖LPS)および臨床的に関係のある誘導体モノホスホリルリピドA(MPL)は、細胞表面TLR−4複合体に結合し(非特許文献3)、マイトジェン活性化プロテインキナーゼMAPK)p38およびc−Junキナーゼ(JNK)と共にNF−カッパBおよびIRF3などのような転写因子の誘発に結果的になる様々なシグナル経路に至る(非特許文献4;非特許文献5)。このプロセスの間に、DCは、成熟し、IL−6、IL−12、およびI型インターフェロンのような炎症誘発性サイトカインを部分的にアップレギュレートする(非特許文献6)。LPS誘発成熟は、DCがin vitroおよびin vivoにおいて抗原特異的T細胞応答を刺激する能力を増強することが示されてきた(非特許文献7)。CD40ペプチドをコードする核酸を細胞に形質導入するステップを含む、抗原提示細胞を活性化するための方法は、特許文献1において記載されており、誘発性CD40ペプチドおよびパターン認識受容体または経路における他の下流タンパク質を含むキメラタンパク質をコードする核酸を細胞にトランスフェクトするステップを含む、抗原提示細胞を活性化するための方法は、本明細書において参照によってこれによって組み込まれる、特許文献2として公開されている、2007年10月19日に提出された国際特許出願第PCT/US2007/081963号において記載されている。

概要

誘発性パターン認識受容体アダプターまたはアダプター断片およびCD40の活性を誘発することによって抗原提示細胞を活性化し、免疫応答を誘導するための方法が提供される。誘発性CD40ペプチドおよび誘発性パターン認識受容体アダプターまたはアダプター断片を含むキメラタンパク質をコードする配列を含む核酸組成物もまた提供される。例示的な一実施形態において、上記方法は、抗原提示細胞に、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を形質導入するステップを含み、前記キメラタンパク質は、(i)膜ターゲティング領域、(ii)リガンド結合領域、(iii)細胞質CD40ポリペプチド領域、ならびに(iv)TIRドメイン欠く切断型MyD88ペプチドおよびTRIFペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む。

目的

標準の成熟カクテルにおけるプロスタグランジンE2(PGE2)の主要な機能は、CCケモカイン受容体7(CCR7)を、そのリガンド、CCケモカインリガンド19(CCL19)およびCCL21に対して感作し、それにより流入領域リンパ節へのDCの遊走性能を増強することである

効果

実績

技術文献被引用数
3件
牽制数
2件

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請求項1

抗原提示細胞活性化するための方法であって、前記方法は:抗原提示細胞に、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸トランスフェクトまたは形質導入するステップであって、前記キメラタンパク質は、(i)膜ターゲティング領域、(ii)リガンド結合領域、(iii)細胞質CD40ポリペプチド領域、ならびに(iv)MyD88ペプチド、TIRドメイン欠く切断型MyD88ペプチド、NOD2ペプチド、RIG−1ペプチド、およびTRIFペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む、ステップと前記抗原提示細胞を、前記リガンド結合領域に結合する非タンパク質多量体リガンドと接触させるステップとを含み、それにより前記抗原提示細胞が活性化される、方法。

請求項2

抗原提示細胞を活性化するための方法であって、前記方法は:抗原提示細胞に、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸をトランスフェクトまたは形質導入するステップであって、前記キメラタンパク質は、(i)膜ターゲティング領域、(ii)リガンド結合領域、および(iii)TIRドメインを欠く切断型MyD88ペプチドを含む、ステップと前記抗原提示細胞を、前記リガンド結合領域に結合する非タンパク質多量体リガンドと接触させるステップとを含み、それにより前記抗原提示細胞が活性化される、方法。

請求項3

前記キメラタンパク質は、細胞質CD40ポリペプチド領域をさらに含む、請求項2に記載の方法。

請求項4

前記ペプチドは、配列番号6、配列番号10、配列番号12、配列番号14、および配列番号16からなる群より選択されるペプチド配列を有するか、または前記ペプチドは、配列番号9、配列番号11、配列番号13、および配列番号15からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項1に記載の方法。

請求項5

前記切断型MyD88は、配列番号6のペプチド配列を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

前記切断型MyD88ペプチドは、配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

前記膜ターゲティング領域は、ミリストイル化ターゲティング領域、パルミトイル化ターゲティング領域、プレニル化領域、および受容体膜貫通領域からなる群より選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

前記膜ターゲティング領域は、ミリストイル化ターゲティング領域である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

前記CD40細胞質ポリペプチド領域は、配列番号2の細胞質領域のペプチド配列を有する、請求項1または3から8のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

前記CD40細胞質ポリペプチド領域は、配列番号1における細胞質ポリペプチド領域をコードするポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項1または3から9のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

前記リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域、サイクロフィリン受容体リガンド結合領域、ステロイド受容体リガンド結合領域、サイクロフィリン受容体リガンド結合領域、およびテトラサイクリン受容体リガンド結合領域からなる群より選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。

請求項12

前記リガンド結合領域はFv’Fvls配列を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

前記リガンド結合領域はさらなるFv’配列をさらに含む、請求項12に記載の方法。

請求項14

前記リガンドは小分子である、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。

請求項15

前記リガンドは二量体である、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。

請求項16

前記リガンドは二量体FK506または二量体FK506アナログである、請求項15に記載の方法。

請求項17

前記リガンドはAP1903またはAP20187である、請求項16に記載の方法。

請求項18

前記核酸はウイルスベクター内に含有される、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。

請求項19

前記ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである、請求項18に記載の方法。

請求項20

前記核酸はプラスミドベクター内に含有される、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。

請求項21

前記抗原提示細胞を、exvivoにおいて前記ベクターと接触させる、請求項18から19のいずれか一項に記載の方法。

請求項22

前記抗原提示細胞を、抗原と接触させる、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。

請求項23

前記抗原提示細胞を、exvivoにおいて前記抗原と接触させる、請求項22に記載の方法。

請求項24

前記抗原提示細胞は、exvivoにおいて前記ベクターでトランスフェクトまたは形質導入され、そして被験体投与される、請求項21から23のいずれか一項に記載の方法。

請求項25

前記ベクターは、前記被験体に皮内投与または皮下投与によって投与される、請求項24に記載の方法。

請求項26

前記抗原提示細胞が、invivoにおいて前記核酸で形質導入またはトランスフェクトされる、請求項18から20のいずれか一項に記載の方法。

請求項27

前記抗原に対して免疫応答が生成される、請求項24から26のいずれか一項に記載の方法。

請求項28

前記免疫応答は細胞傷害性Tリンパ球(CTL)免疫応答である、請求項27に記載の方法。

請求項29

前記免疫応答は腫瘍抗原に対して生成される、請求項27または28に記載の方法。

請求項30

前記抗原提示細胞は樹状細胞である、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。

請求項31

前記抗原提示細胞はヒト樹状細胞である、請求項30に記載の方法。

請求項32

前記核酸は、前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。

請求項33

前記抗原提示細胞は、アジュバントを追加せずに活性化される、請求項1から32のいずれか一項に記載の方法。

請求項34

キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む組成物であって、前記キメラタンパク質は、(i)膜ターゲティング領域、(ii)リガンド結合領域、(iii)細胞質CD40ポリペプチド領域、ならびに(iv)MyD88ペプチド、TIRドメインを欠く切断型MyD88ペプチド、NOD2ペプチド、RIG−1ペプチド、およびTRIFペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む、組成物。

請求項35

キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む組成物であって、前記キメラタンパク質は、(i)膜ターゲティング領域、(ii)リガンド結合領域、および(iii)TIRドメインを欠く切断型MyD88ペプチドを含む、組成物。

請求項36

前記キメラタンパク質は細胞質CD40ポリペプチド領域をさらに含む、請求項35に記載の組成物。

請求項37

前記ペプチドは、配列番号6、配列番号10、配列番号12、配列番号14、および配列番号16からなる群より選択されるペプチド配列を有するか、または前記ペプチドは、配列番号9、配列番号11、配列番号13、および配列番号15からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項34に記載の組成物。

請求項38

前記切断型MyD88は配列番号6のペプチド配列を有する、請求項34から37のいずれか一項に記載の組成物。

請求項39

前記切断型MyD88ペプチドは、配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項34から38のいずれか一項に記載の組成物。

請求項40

前記膜ターゲティング領域は、ミリストイル化ターゲティング領域、パルミトイル化ターゲティング領域、プレニル化領域、および受容体膜貫通領域からなる群より選択される、請求項34から39のいずれか一項に記載の組成物。

請求項41

前記膜ターゲティング領域はミリストイル化ターゲティング領域である、請求項34から40のいずれか一項に記載の組成物。

請求項42

前記CD40細胞質ポリペプチド領域は、配列番号2の細胞質領域のペプチド配列を有する、請求項34または36から41のいずれか一項に記載の組成物。

請求項43

前記CD40細胞質ポリペプチド領域は、配列番号1における細胞質ポリペプチド領域をコードするポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項34または36から41のいずれか一項に記載の組成物。

請求項44

前記リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域、サイクロフィリン受容体リガンド結合領域、ステロイド受容体リガンド結合領域、サイクロフィリン受容体リガンド結合領域、およびテトラサイクリン受容体リガンド結合領域からなる群より選択される、請求項34から43のいずれか一項に記載の組成物。

請求項45

前記リガンド結合領域はFv’Fvls配列を含む、請求項34から44のいずれか一項に記載の組成物。

請求項46

前記リガンド結合領域はさらなるFv’配列をさらに含む、請求項45に記載の組成物。

請求項47

前記核酸はウイルスベクター内に含有される、請求項34から46のいずれか一項に記載の組成物。

請求項48

前記ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである、請求項47に記載の組成物。

請求項49

前記核酸はプラスミドベクター内に含有される、請求項34から48のいずれか一項に記載の組成物。

請求項50

前記核酸は、前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む、請求項34から49のいずれか一項に記載の組成物。

請求項51

請求項34から50のいずれか一項に記載の核酸が形質導入された細胞を含む組成物。

請求項52

前記細胞は抗原提示細胞である、請求項51に記載の組成物。

請求項53

前記細胞は樹状細胞である、請求項51に記載の組成物。

請求項54

前記細胞はヒト樹状細胞である、請求項53に記載の組成物。

請求項55

免疫応答を増強することによって被験体の状態を治療するための方法であって、請求項34から54のいずれか一項に記載の組成物を前記被験体に投与するステップを含む方法。

請求項56

前記状態は過剰増殖疾患である、請求項55に記載の方法。

請求項57

前記状態は感染症である、請求項55に記載の方法。

技術分野

0001

関連する特許出願
優先権を、2009年5月27日に出願され、表題「Methodsand Compositions for Generating an Immune Response by Inducing CD40 and Pattern Recognition Receptor Adapters」の米国仮出願第61/181,572号、2009年2月18日に出願され、表題「Methods and Compositions for Generating an Immune Response by Inducing CD40 and Pattern Recognition Receptor Adapters」の米国仮出願第61/153,562号、および2008年9月22日に出願され、表題「Methods and Compositions for Generating an Immune Response by Inducing CD40 and Pattern Recognition Receptor Adapters」の米国仮出願第61/099,163号(これらは、全てそれらの全体が参考として本明細書に引用され、そして援用される)に対して主張する。

0002

発明の分野
本発明は、一般的に免疫学の分野、そして特に、抗原提示細胞活性化する、および免疫応答を誘発するための方法および組成物に関する。

0003

連邦政府によって後援された研究についての声明
本発明は、NIH助成金第R01−CA120411号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有し得る。

背景技術

0004

背景
抗原を処理し、かつ提示するそれらの特有の方法ならびに副刺分子およびサイトカイン分子の高レベル発現に対する潜在能力により、樹状細胞(DC)は、ナイーブ細胞刺激し、かつ活性化するための、有効な抗原提示細胞(APC)となる(Banchereau J、Paczesny S、Blanco Pら Dendritic cells: controllers of the immune system and a new promise for immunotherapy. Ann N Y Acad Sci. 2003年;987巻:180〜187頁)。この特性は、有望な結果を伴う、多くの臨床試験における予防接種のための細胞のプラットフォームとしてのそれらの広範囲の使用に至った(O’NeillDW、Adams S、Bhardwaj N. Manipulating dendritic cell biology for the active immunotherapy of cancer. Blood. 2004年;104巻:2235〜2246頁;Rosenberg SA. A new era for cancer immunotherapy based on the genes that encode cancer antigens. Immunity. 1999年;10巻:281〜287頁)。しかしながら、癌患者におけるDCワクチン臨床的効性は、最適以下の活性化、流入領域リンパ節への限られた遊走、およびリンパ節環境における最適なT細胞活性化のための不十分な寿命を含む、おそらく多くの重大な欠失により、不満足なものであった。

0005

DCベース癌ワクチンの最適化におけるパラメーターは、CD4+、CD8+T細胞、および調節性T(Treg)細胞などのような免疫エフェクター細胞とのDCの相互作用である。これらの相互作用では、DCの成熟状態は、結果として生じるエフェクター機能を決定する重要な因子である(Steinman RM、Hawiger D、Nussenzweig MC. Tolerogenic dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2003年;21巻:685〜711頁)。Treg増殖を最小限にしながら、CD4+およびCD8+T細胞刺激を最大限にするために、DCは、完全に成熟し、高レベルの副刺激分子(CD40、CD80、およびCD86のような)ならびにIL−12p70およびIL−6のような炎症誘発性サイトカインを発現する必要がある。等しく重要なことに、DCは、T細胞相互作用を開始するために予防接種の部位から流入領域リンパ節まで効率的に遊走することができなければならない(Vieweg J、Jackson A. Modulation of antitumor responses by dendritic cells. Springer Semin Immunopathol. 2005年;26巻:329〜341頁)。

0006

単球由来未成熟DCのex vivo成熟については、大多数のDCベースの治験は、TNF−アルファ、IL−1ベータ、IL−6、およびPGE2からなる、標準の成熟サイトカインカクテル(MC)を使用してきた。標準の成熟カクテルにおけるプロスタグランジンE2(PGE2)の主要な機能は、CCケモカイン受容体7(CCR7)を、そのリガンド、CCケモカインリガンド19(CCL19)およびCCL21に対して感作し、それにより流入領域リンパ節へのDCの遊走性能を増強することである(Scandella E、Men Y、Gillessen S、Forster R、Groettrup M. Prostaglandin E2 is a key factor for CCR7 surface expression and migration of monocyte−derived dendritic cells. Blood. 2002年;100巻:1354〜1361頁;Luft T、Jefford M、Luetjens Pら Functionally distinct dendritic cell (DC) populations induced by physiologic stimuli: prostaglandin E(2) regulates the migratory capacity of specific DC subsets. Blood. 2002年;100巻:1362〜1372頁)。しかしながら、PGE2はまた、T細胞増殖の抑制(Goodwin JS、Bankhurst AD、Messner RP. Suppression of human T−cell mitogenesis by prostaglandin. Existence of a prostaglandin−producing suppressor cell. J Exp Med. 1977年;146巻:1719〜1734頁;Goodwin JS. Immunomodulation by eicosanoidsand anti−inflammatory drugs. Curr Opin Immunol. 1989年;2巻:264〜268頁)、炎症誘発性サイトカイン産生(例えばIL−12p70およびTNF−アルファ)の阻害(Kalinski P、VieiraPL、Schuitemaker JH、de Jong EC、Kapsenberg ML. Prostaglandin E(2) is a selective inducer of interleukin−12 p40 (IL−12p40) production and an inhibitor of bioactive IL−12p70 heterodimer. Blood. 2001年;97巻:3466〜3469頁;van der Pouw Kraan TC、Boeije LC、Smeenk RJ、Wijdenes J、Aarden LA. Prostaglandin−E2 is a potent inhibitor of human interleukin 12 production. J Exp Med. 1995年;181巻:775〜779頁))の阻害、ならびに主要組織適合複合体MHC)II表面発現ダウンレギュレーション(Snyder DS、Beller DI、UnanueER. Prostaglandins modulate macrophage Ia expression. Nature. 1982年;299巻:163〜165頁)を含む、免疫応答の刺激に対する、潜在的に有害な多数の特性を有することが報告されてきた。そのため、遊走を促進しながら、PGE2を回避することができる成熟プロトコールは、おそらく、DCベースのワクチンの治療上の有効性を改善するであろう。

0007

CD40シグナル経路の標的一時的制御に基づくDC活性化系は、リンパ組織内のDCの刺激誘発性(pro−stimulatory)状態を拡張するために開発されてきた。DCの機能性は、CD40シグナル伝達の大きさおよび期間の両方を増加させることによって改善された(非特許文献1)。これを達成するために、CD40受容体は、CD40の細胞質ドメインが膜ターゲティング配列と共に合成リガンド結合ドメインに融合されるように再設計された。二量体化化学的誘発物質CID)と呼ばれる脂質透過性二量体化薬物AP20187(AP)の投与(非特許文献2)は、マウスDCにおけるCD40依存的シグナル伝達カスケードのin vivo誘発に至った。この誘発戦略は、他の活性化様式を用いて達成されるもの以上に、in vivoにおける、明示される抗原および腫瘍の両方に対する免疫原性を著しく増強した(非特許文献1)。マウスにおけるこのキメラリガンド誘発性CD40(iCD40と命名される)の強い効力は、この方法が、ヒトDCワクチンの効力を同様に増強するかもしれないことを示唆した。

0008

Toll様受容体TLR)シグナル伝達がその例であるパターン認識受容体(PRR)シグナル伝達もまた、DCの成熟および活性化の誘発における重大な役割を果たし、ヒトDCは、多数の別のTLRを発現する(非特許文献3)。11種の哺乳動物TLRは、様々な病原体由来巨大分子応答し、適応免疫の開始と共に自然免疫応答の活性化に寄与する。リポ多糖LPS)および臨床的に関係のある誘導体モノホスホリルリピドA(MPL)は、細胞表面TLR−4複合体に結合し(非特許文献3)、マイトジェン活性化プロテインキナーゼMAPK)p38およびc−Junキナーゼ(JNK)と共にNF−カッパBおよびIRF3などのような転写因子の誘発に結果的になる様々なシグナル経路に至る(非特許文献4;非特許文献5)。このプロセスの間に、DCは、成熟し、IL−6、IL−12、およびI型インターフェロンのような炎症誘発性サイトカインを部分的にアップレギュレートする(非特許文献6)。LPS誘発成熟は、DCがin vitroおよびin vivoにおいて抗原特異的T細胞応答を刺激する能力を増強することが示されてきた(非特許文献7)。CD40ペプチドをコードする核酸を細胞に形質導入するステップを含む、抗原提示細胞を活性化するための方法は、特許文献1において記載されており、誘発性CD40ペプチドおよびパターン認識受容体または経路における他の下流タンパク質を含むキメラタンパク質をコードする核酸を細胞にトランスフェクトするステップを含む、抗原提示細胞を活性化するための方法は、本明細書において参照によってこれによって組み込まれる、特許文献2として公開されている、2007年10月19日に提出された国際特許出願第PCT/US2007/081963号において記載されている。

0009

米国特許第7,404,950号明細書
国際公開第2008/049113号

先行技術

0010

Hanks BA、Jiang J、Singh RAら Re−engineered CD40 receptor enables potent pharmacological activation of dendritic−cell cancer vaccines in vivo. Nat Med. 2005年;11巻:130〜137頁
SpencerDM、Wandless TJ、Schreiber SL、Crabtree GR. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 1993年;262巻:1019〜1024頁
Kadowaki N、Ho S、Antonenko Sら Subsets of human dendritic cell precursors express different toll−like receptors and respond to different microbial antigens. J Exp Med. 2001年;194巻:863〜869頁
Ardeshna KM、Pizzey AR、Devereux S、Khwaja A. The PI3 kinase, p38SAPkinase, and NF−kappaB signal transduction pathways are involved in the survival and maturation of lipopolysaccharide−stimulated human monocyte−derived dendritic cells. Blood. 2000年;96巻:1039〜1046頁
Ismaili J、Rennesson J、Aksoy Eら Monophosphoryl lipid A activates both human dendritic cells and T cells. J Immunol. 2002年;168巻:926〜932頁
Rescigno M、Martino M、Sutherland CL、GoldMR、Ricciardi−Castagnoli P. Dendritic cell survival and maturation are regulated by different signaling pathways. J Exp Med. 1998年;188巻:2175〜2180頁
Lapointe R、Toso JF、Butts C、YoungHA、Hwu P. Human dendritic cells require multiple activation signals for the efficient generation of tumor antigen−specific T lymphocytes. Eur J Immunol. 2000年;30巻:3291〜3298頁

課題を解決するための手段

0011

誘発性CD40(iCD40)系は、ヒト樹状細胞(DC)に適用されており、iCD40シグナル伝達をパターン認識受容体(PRR)アダプター連結と組み合わせることにより、ヒトDCの持続性で強い活性化が引き起こされることが実証されてきた。これらの特徴は、例えば、進行ホルモン不応性前立腺癌のような癌を治療するための癌免疫療法基礎を形成する。したがって、誘発CD40および誘発性PRRアダプターの組合せは、抗原提示細胞を相乗的に活性化し、抗原に対する免疫応答を誘発することが発見された。誘発性PRRアダプターは、例えば、MyD88およびTRIFを含み、例えばNOD様受容体、例えばNOD1またはNOD2およびRIG様ヘリカーゼ、例えばRIG−IまたはMda−5などのような誘発性パターン認識受容体もまた、誘発性CD40と組み合わせて使用されてもよい。抗原提示細胞を活性化するための方法であって、抗原提示細胞に、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を形質導入するステップであって、前記キメラタンパク質は、(i)膜ターゲティング領域、(ii)リガンド結合領域、(iii)細胞質CD40ポリペプチド領域、ならびに(iv)TIRドメイン欠く切断型MyD88ペプチドおよびTRIFペプチドからなる群より選択されるペプチドを含むステップならびに前記抗原提示細胞を、前記リガンド結合領域に結合する非タンパク質多量体リガンドと接触させるステップを含み、それにより前記抗原提示細胞は活性化される方法が本明細書において提供される。

0012

したがって、本明細書において、抗原提示細胞を活性化するための方法であって、抗原提示細胞に、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸をトランスフェクトまたは形質導入するステップであって、前記キメラタンパク質は、膜ターゲティング領域、リガンド結合領域、細胞質CD40ポリペプチド領域、ならびにMyD88ペプチド、TIRドメインを欠く切断型MyD88ペプチド、NOD2ペプチド、RIG−1ペプチド、およびTRIFペプチドからなる群より選択されるペプチドを含むステップならびに前記抗原提示細胞を、前記リガンド結合領域に結合する非タンパク質多量体リガンドと接触させるステップを含み、それにより前記抗原提示細胞は活性化される方法が提供される。方法および組成物の細胞質CD40ポリペプチド領域は、例えば、配列番号2の細胞質領域ペプチド配列を有していてもよく、例えば、配列番号1における細胞質ポリペプチド領域をコードするポリヌクレオチド配列によってコードされてもよい。

0013

抗原提示細胞を活性化するための方法であって、抗原提示細胞に、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸をトランスフェクトまたは形質導入するステップであって、前記キメラタンパク質は、膜ターゲティング領域、リガンド結合領域、およびTIRドメインを欠く切断型MyD88ペプチドを含むステップならびに前記抗原提示細胞を、前記リガンド結合領域に結合する非タンパク質多量体リガンドと接触させるステップを含み、それにより前記抗原提示細胞は活性化される方法もまた提供される。キメラタンパク質は、CD40ポリペプチド領域をさらに含んでいてもよい。

0014

キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む組成物であって、前記キメラタンパク質は、膜ターゲティング領域、リガンド結合領域、細胞質CD40ポリペプチド領域、ならびにMyD88ペプチド、TIRドメインを欠く切断型MyD88ペプチド、NOD2ペプチド、RIG−1ペプチド、およびTRIFペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む組成物がさらに提供される。

0015

抗原提示細胞は、活性化抗原提示細胞と関連する1つまたは複数の活性が、当業者によって観察および/または測定される可能性がある場合、「活性化されている」。例えば、抗原提示細胞は、本明細書において提示される発現ベクターとの接触後に、活性化と関連する活性が、発現ベクターと接触させていない、またはネガティブ対照ベクターと接触させた抗原提示細胞と比較して、発現ベクター接触細胞において測定され得る場合、活性化されている。一実施例では、増加した活性は、非接触細胞またはネガティブ対照と接触させた細胞の2、3、4、5、6、7、8、9、または10倍以上のレベルであってもよい。例えば、以下の活性のうちの1つは、発現ベクターと接触させた抗原提示細胞において増強されてもよい:抗原提示細胞上の副刺激分子発現、抗原提示細胞におけるNF−カッパBの核転座、例えばtoll様受容体発現もしくはCCR7発現などのようなDC成熟マーカー発現、例えば腫瘍細胞に対して向けられる特異的な溶解活性などのような特異的な細胞傷害性Tリンパ球応答、またはサイトカイン(例えばIL−2)もしくはケモカイン発現。抗原提示細胞の活性化をアッセイするための方法は、本明細書において、例えば実施例11〜17において提示される。

0016

免疫応答を「増強する」、抗原提示細胞を活性化する組成物の量は、組成物を追加せずに測定される同じ免疫応答と比較して、組成物の追加により、多少なりとも大きい、または強化された、または並外れた免疫応答が観察される量を指す。例えば、細胞傷害性T細胞の溶解活性は、例えば、組成物を伴うおよびそれを伴わない51Cr放出アッセイを使用して測定することができる。組成物を伴わないCTL溶解活性と比較して、CTL溶解活性が増強される、物質の量は、抗原に対する動物の免疫応答を増強するのに十分な量であると表現される。例えば、免疫応答は、少なくとも約2の因子によってまたは例えば約3以上の因子によって増強されてもよい。分泌されるサイトカインの量もまた、変化してもよい。

0017

増強される免疫応答は、能動免疫応答または受動免疫応答であってもよい。その代わりに、応答は、抗原提示細胞が被験体(例えば患者)から得られ、次いで、本明細書において提示される発現ベクターまたは構築物を含む組成物を形質導入されるまたはトランスフェクトされる、適応免疫療法アプローチの一部であってもよい。抗原提示細胞は、例えば被験体の血液または被験体の骨髄から得られてもよい。次いで、抗原提示細胞は、同じもしくは異なる動物または同じもしくは異なる被験体(例えば同じもしくは異なるドナー)に投与されてもよい。ある実施形態では、被験体(例えば患者)は、例えば前立腺癌などのような癌を有するもしくはそれを有する疑いがあるまたは感染症を有するもしくはそれを有する疑いがある。他の実施形態では、免疫応答を増強するための方法は、公知の癌療法または感染症を治療するための任意の公知の療法と共に実施される。

0018

提供される方法のステップは、当業者に公知で、当業者によって選択される任意の適した方法を使用して実行されてもよく、これらの方法は、限定を伴うことなく、本明細書において提示される抗原提示細胞に核酸を形質導入する、形質転換する、または他の場合には提供するための方法を含む。いくつかの実施形態では、切断型MyD88ペプチドは、配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされる(DNAリンカーを有するまたは有していない)。他の実施形態では、ペプチドは、TRIFペプチドである。多くの場合、ペプチドは、配列番号9のヌクレオチド配列によってコードされる(DNAリンカーを有するまたは有していない)。いくつかの実施形態では、CD40細胞質ポリペプチド領域は、配列番号1におけるポリヌクレオチド配列によってコードされる。方法または組成物のいくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号6、配列番号10、配列番号12、配列番号14、および配列番号16からなる群より選択されるペプチド配列を有するまたはペプチドは、配列番号9、配列番号11、配列番号13、および配列番号15からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされる。ある実施形態では、切断型MyD88は、配列番号6のペプチド配列を有し、例えば、配列番号5のヌクレオチド(nucldotide)配列によってコードされてもよい。多くの場合、核酸は、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。一般に、用語「作動可能に連結される」は、プロモーター配列が第2の配列に機能的に連結されることを示すことを意味し、プロモーター配列は、第2の配列に対応するDNAの転写を開始し、媒介する。

0019

当業者らは、限定を伴うことなく、本明細書において議論されるプロモーター配列を含む適切なプロモーター配列を選択してもよい。

0020

当業者らは、限定を伴うことなく、ミリストイル化ターゲティング領域、パルミトイル化ターゲティング領域、プレニル化領域、または受容体膜貫通領域を含む、任意の適切な公知の膜ターゲティング領域を選択してもよい。多くの場合、膜ターゲティング領域は、ミリストイル化ターゲティング領域である。

0021

ある実施形態では、リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域、サイクロフィリン受容体リガンド結合領域、ステロイド受容体リガンド結合領域、サイクロフィリン受容体リガンド結合領域、およびテトラサイクリン受容体リガンド結合領域からなる群より選択される。多くの場合、リガンド結合領域は、Fv’Fvls配列を含む。時に、Fv’Fvls配列は、さらなるFv’配列をさらに含む。

0022

いくつかの実施形態では、リガンドは、小分子である。当業者らは、選択されるリガンド結合領域に対する適切なリガンドを選択してもよい。多くの場合、リガンドは、二量体であり、時に、リガンドは、二量体FK506または二量体FK506アナログである。ある実施形態では、リガンドは、AP1903である。ある実施形態では、リガンドは、AP20187である。

0023

いくつかの実施形態では、核酸は、ウイルスベクター内に含有される。当業者らは、適切なウイルスベクターを選択してもよい。ある実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ウイルスベクターとex vivoにおいて接触させ、いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ウイルスベクターとin vivoにおいて接触させることが理解される。

0024

いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞、例えば哺乳動物樹状細胞である。多くの場合、抗原提示細胞は、ヒト樹状細胞である。

0025

ある実施形態では、抗原提示細胞はまた、抗原と接触させる。多くの場合、抗原提示細胞は、抗原とex vivoにおいて接触させる。時に、抗原提示細胞は、抗原とin vivoにおいて接触させる。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、被験体中にあり、免疫応答は、抗原に対して生成される。時に、免疫応答は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)免疫応答である。時に、免疫応答は、腫瘍抗原に対して生成される。ある実施形態では、抗原提示細胞は、アジュバントを追加せずに活性化される。

0026

いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ex vivoにおいて核酸が形質導入され、皮内投与によって被験体に投与される。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ex vivoにおいて核酸が形質導入され、皮下投与によって被験体に投与される。時に、抗原提示細胞は、ex vivoにおいて核酸が形質導入される。時に、抗原提示細胞は、in vivoにおいて核酸が形質導入される。

0027

抗原に対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)免疫応答を誘発するための方法であって、抗原を用いて感作されたヒト抗原提示細胞を、(a)本来のCD40に結合し、その多量体を形成する2つ以上の領域を有する多量体分子および(b)誘発性PRRアダプター、例えばMyD88、切断型MyD88、またはTRIFと接触させるステップを含み、それによりCTL免疫応答は、抗原に対して誘発される方法もまた提供される。MyD88によって、骨髄分化一次応答遺伝子88、例えば、これに限定されないが、ncbi遺伝子ID4615として引用されるヒトバージョンが意味される。TRIFによって、TIRドメイン含有アダプター誘発インターフェロン−ベータが意味される。「切断型」によって、タンパク質が完全長でなく、例えば、ドメインを欠いていてもよいことが意味される。例えば、切断型MyD88は、完全長でなく、例えば、TIRドメインが欠けていてもよい。切断型MyD88の例は、本明細書においてMyD88Lとして示され、また配列番号5(核酸配列)および6(ペプチド配列)としても提示される。配列番号5は、サブクローニングの間に追加されたリンカーを含む。当業者らは、「切断型MyD88」をコードする核酸配列によって、切断型MyD88ペプチドをコードする核酸配列が意味され、用語はまた、リンカーによってコードされる任意のアミノ酸を含む、クローニング人工産物として追加される、任意のアミノ酸をコードする部分を含む核酸配列を指してもよいことを認識する。そのような方法では、多量体分子は、CD40の細胞外ドメイン中のエピトープに結合する抗体とすることができる(例えばヒト化抗CD40抗体;Taiら、Cancer Research 64巻、2846〜2852頁(2004年))、CD40リガンドとすることができる(例えば米国特許第6,497,876号(Maraskovskyら))、または他の副刺激分子(例えばB7/CD28)であってもよい。本明細書においてアッセイされるように、機能に影響を与えない、配列における保存的変異は、本発明の請求項の範囲内にあることが当業者らによって理解される。

0028

本明細書において、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含む組成物であって、前記キメラタンパク質は、(i)膜ターゲティング領域、(ii)リガンド結合領域、(iii)細胞質CD40ポリペプチド領域、ならびに(iv)TIRドメインを欠く切断型MyD88ペプチドおよびTRIFペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む組成物もまた提供される。いくつかの実施形態では、切断型MyD88ペプチドは、配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施形態では、ペプチドは、TRIFペプチドである。多くの場合、ペプチドは、配列番号9のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、CD40細胞質ポリペプチド領域は、配列番号1におけるポリヌクレオチド配列によってコードされる。多くの場合、核酸は、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。当業者らは、限定を伴うことなく、本明細書において議論されるプロモーター配列を含む適切なプロモーター配列を選択してもよい。

0029

当業者らは、限定を伴うことなく、ミリストイル化ターゲティング領域、パルミトイル化ターゲティング領域、プレニル化領域、または受容体膜貫通領域を含む、任意の適切な公知の膜ターゲティング領域を選択してもよい。多くの場合、膜ターゲティング領域は、ミリストイル化ターゲティング領域である。

0030

ある実施形態では、リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域、サイクロフィリン受容体リガンド結合領域、ステロイド受容体リガンド結合領域、サイクロフィリン受容体リガンド結合領域、およびテトラサイクリン受容体リガンド結合領域からなる群より選択される。多くの場合、リガンド結合領域は、Fv’Fvls配列を含む。時に、Fv’Fvls配列は、さらなるFv’配列をさらに含む。

0031

いくつかの実施形態では、核酸は、ウイルスベクター内に含有される。当業者らは、適切なウイルスベクターを選択してもよい。ある実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ウイルスベクターとex vivoにおいて接触させ、いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ウイルスベクターとin vivoにおいて接触させることが理解される。

0032

いくつかの実施形態では、抗原提示細胞を活性化するための方法であって、抗原提示細胞に、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を形質導入するステップであって、前記キメラタンパク質は、(i)膜ターゲティング領域、(ii)リガンド結合領域、ならびに(iii)MyD88ペプチドまたはTIRドメインを欠く切断型MyD88ペプチドを含むステップならびに前記抗原提示細胞を、前記リガンド結合領域に結合する非タンパク質多量体リガンドと接触させるステップを含み、それにより前記抗原提示細胞は活性化される方法が提供される。多くの場合、MyD88ペプチドは、切断型であり、限定を伴うことなく、配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされる切断型MyD88ペプチドを含む。提供される方法のステップは、当業者に公知で、当業者によって選択される任意の適した方法を使用して実行されてもよく、これらの方法は、限定を伴うことなく、本明細書において提示される抗原提示細胞に核酸を形質導入する、形質転換する、または他の場合には提供するための方法を含む。多くの場合、核酸は、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。当業者らは、限定を伴うことなく、本明細書において議論されるプロモーター配列を含む適切なプロモーター配列を選択してもよい。

0033

当業者らは、限定を伴うことなく、ミリストイル化ターゲティング領域、パルミトイル化ターゲティング領域、プレニル化領域、または受容体膜貫通領域を含む、任意の適切な公知の膜ターゲティング領域を選択してもよい。多くの場合、膜ターゲティング領域は、ミリストイル化ターゲティング領域である。

0034

ある実施形態では、リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域、サイクロフィリン受容体リガンド結合領域、ステロイド受容体リガンド結合領域、サイクロフィリン受容体リガンド結合領域、およびテトラサイクリン受容体リガンド結合領域からなる群より選択される。多くの場合、リガンド結合領域は、Fv’Fvls配列を含む。時に、Fv’Fvls配列は、さらなるFv’配列をさらに含む。

0035

いくつかの実施形態では、リガンドは、小分子である。当業者らは、選択されるリガンド結合領域に対する適切なリガンドを選択してもよい。多くの場合、リガンドは、二量体であり、時に、リガンドは、二量体FK506または二量体FK506アナログである。ある実施形態では、リガンドは、AP1903である。ある実施形態では、リガンドは、AP20187である。

0036

いくつかの実施形態では、核酸は、ウイルスベクター内に含有される。当業者らは、適切なウイルスベクターを選択してもよい。ある実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ウイルスベクターとex vivoにおいて接触させ、いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ウイルスベクターとin vivoにおいて接触させることが理解される。

0037

いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞、例えば哺乳動物樹状細胞である。多くの場合、抗原提示細胞は、ヒト樹状細胞である。

0038

ある実施形態では、抗原提示細胞はまた、抗原と接触させる。多くの場合、抗原提示細胞は、抗原とex vivoにおいて接触させる。時に、抗原提示細胞は、抗原とin vivoにおいて接触させる。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、被験体中にあり、免疫応答は、抗原に対して生成される。時に、免疫応答は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)免疫応答である。時に、免疫応答は、腫瘍抗原に対して生成される。ある実施形態では、抗原提示細胞は、アジュバントを追加せずに活性化される。

0039

いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ex vivoにおいて核酸が形質導入され、皮内投与によって被験体に投与される。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ex vivoにおいて核酸が形質導入され、皮下投与によって被験体に投与される。時に、抗原提示細胞は、ex vivoにおいて核酸が形質導入される。時に、抗原提示細胞は、in vivoにおいて核酸が形質導入される。

0040

例えば、本発明の方法において使用されてもよい組成物もまた、本明細書において提供される。したがって、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含む組成物であって、前記キメラタンパク質は、(i)膜ターゲティング領域、(ii)リガンド結合領域、(iii)細胞質CD40ポリペプチド領域、ならびに(iv)MyD88ペプチドまたはTIRドメインを欠く切断型MyD88ペプチドを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、MyD88ペプチドは、切断型である。時に、切断型MyD88ペプチドは、配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされる。多くの場合、核酸は、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。当業者らは、限定を伴うことなく、本明細書において議論されるプロモーター配列を含む適切なプロモーター配列を選択してもよい。

0041

当業者らは、限定を伴うことなく、ミリストイル化ターゲティング領域、パルミトイル化ターゲティング領域、プレニル化領域、または受容体膜貫通領域を含む、任意の適切な公知の膜ターゲティング領域を選択してもよい。多くの場合、膜ターゲティング領域は、ミリストイル化ターゲティング領域である。

0042

ある実施形態では、リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域、サイクロフィリン受容体リガンド結合領域、ステロイド受容体リガンド結合領域、サイクロフィリン受容体リガンド結合領域、およびテトラサイクリン受容体リガンド結合領域からなる群より選択される。多くの場合、リガンド結合領域は、Fv’Fvls配列を含む。時に、Fv’Fvls配列は、さらなるFv’配列をさらに含む。

0043

いくつかの実施形態では、核酸は、ウイルスベクター内に含有される。当業者らは、適切なウイルスベクターを選択してもよい。ある実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ウイルスベクターとex vivoにおいて接触させ、いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ウイルスベクターとin vivoにおいて接触させることが理解される。

0044

本明細書において提示される実施形態のいずれかの核酸組成物を形質導入された細胞を含む組成物もまた、提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、抗原提示細胞である。多くの場合、細胞は、限定を伴うことなく、哺乳動物細胞、例えば、限定を伴うことなく、ヒト樹状細胞を含む樹状細胞である。

0045

免疫応答を活性化することによる、状態の療法のための医薬の製造におけるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む組成物であって、前記キメラタンパク質は、(i)膜ターゲティング領域、(ii)リガンド結合領域、(iii)細胞質CD40ポリペプチド領域、ならびに(iv)MyD88ペプチド、TIRドメインを欠く切断型MyD88ペプチド、NOD2ペプチド、RIG−1ペプチド、およびTRIFペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む組成物の使用もまた、本明細書において提供される。他の実施形態では、免疫応答を活性化することによる、状態の療法のための医薬の製造における、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を形質導入されたまたはトランスフェクトされた細胞を含む組成物の使用であって、キメラタンパク質は、(i)膜ターゲティング領域、(ii)リガンド結合領域、(iii)細胞質CD40ポリペプチド領域、ならびに(iv)MyD88ペプチド、TIRドメインを欠く切断型MyD88ペプチド、NOD2ペプチド、RIG−1ペプチド、およびTRIFペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む、使用。組成物は、例えば、抗原提示細胞をトランスフェクトまたは形質導入するために使用されてもよい。ペプチドは、例えば、切断型MyD88ペプチドであってもよい。状態は、例えば、過剰増殖疾患または例えば感染症であってもよい。

0046

本明細書において提示される免疫応答を誘発するための方法において、抗原提示細胞は、キメラタンパク質をコードする核酸をex vivoにおいてまたはin vivoにおいて形質導入することができる。抗原提示細胞は、抗原提示細胞を多量体リガンドと接触させるのと同時に、抗原に対して感作されてもよいまたは抗原提示細胞は、抗原提示細胞を多量体化リガンドと接触させる前に、抗原に対してあらかじめ感作することができる。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、ex vivoにおいて抗原と接触させる。ある実施形態では、抗原提示細胞は、ex vivoにおいて核酸が形質導入され、皮内投与によって被験体に投与される。時に、抗原提示細胞は、ex vivoにおいて核酸が形質導入され、皮下投与によって被験体に投与される。抗原は、腫瘍抗原であってもよく、CTL免疫応答は、流入領域リンパ節への抗原提示細胞の遊走によって誘発することができる。

0047

本明細書における方法では、ペプチドの誘発性CD40部分は、誘発性PRRアダプタータンパク質部分の上流または下流に位置してもよい。また、誘発性CD40部分および誘発性PRRアダプタータンパク質部分は、シスで同じベクター上でまたはトランス別個のベクター上で細胞の中にトランスフェクトされてもよいまたは形質導入されてもよい。

0048

リンパ節への抗原提示細胞の遊走を評価するための方法であって、(a)検出可能なタンパク質を産生する抗原提示細胞を被験体に注射するステップおよび(b)動物のリンパ節における検出可能なタンパク質の量を決定するステップを含み、それによりリンパ節への抗原提示細胞の遊走は、リンパ節における検出可能なタンパク質の量から評価される方法もまた本明細書において提供される。そのような方法では、動物は、ラットまたはマウス(例えば照射マウス)などのようなげっ歯動物とすることができる。いくつかの実施形態では、検出可能なタンパク質は、コメツキムシ(chick)(例えばPyrophorus plagiophalamus)赤方偏移ルシフェラーゼタンパク質などのようなルシフェラーゼタンパク質である。ある実施形態では、抗原提示細胞は、検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を用いて形質導入されている。ある実施形態では、リンパ節は、膝窩リンパ節または鼠径リンパ節である。抗原提示細胞は、ヒト樹状細胞などのような樹状細胞とすることができる。ある実施形態では、リンパ節は、検出可能なタンパク質の量が決定される前に動物から摘出され、時に、D−ルシフェリンは、摘出されたリンパ節に投与される。検出可能なタンパク質の量は、定質的なものであってもよい(例えば異なる試料にわたって比較される相対量)または定量的なものとすることができる(例えば濃度)。検出可能なタンパク質の量は、タンパク質を直接、検出することによって決定されてもよい。例えば、タンパク質は、蛍光であってもよい(例えば緑色蛍光タンパク質または赤方偏移もしくは青方偏移バージョン)または蛍光標識(例えば、蛍光体に連結された抗体)に結合することができる。その代わりに、検出可能なタンパク質の量は、タンパク質によって検出可能な産物に変換される基質を動物に投与し、検出可能な産物を検出することによって、間接的に決定することができる。例えば、ルシフェラーゼタンパク質の量は、D−ルシフェリンを動物に投与し、抗原提示細胞において産生されるルシフェラーゼによって生成されるD−ルシフェリン産物を検出することによって決定することができる。

0049

ある実施形態では、以下で記載される領域などのような他のタイプの膜貫通標的領域から膜ターゲティング領域を選択することができるが、膜ターゲティング領域は、ミリストイル化ターゲティング領域である。いくつかの実施形態では、リガンドは、小分子であり、時に、分子は、二量体である。二量体分子の例は、二量体FK506および二量体FK506アナログである。ある実施形態では、リガンドは、AP1903またはAP20187である。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、例えば、2つまたは3つのリガンド結合領域などのような、1つまたは複数のリガンド結合領域を含む。リガンド結合領域は、多くの場合、直列型である。

0050

ある実施形態における核酸は、例えばアデノウイルスベクターなどのようなウイルスベクター内に含有される。いくつかの実施形態における抗原提示細胞は、時にex vivoにおいて抗原と接触させる。ある実施形態では、抗原提示細胞は、被験体中にあり、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)免疫応答などのような免疫応答は、抗原に対して生成される。ある実施形態では、免疫応答は、腫瘍抗原(例えばPSMA)に対して生成される。いくつかの実施形態では、核酸は、ex vivoにおいて調製され、例えば、皮内投与または皮下投与によって被験体に投与される。時に、抗原提示細胞は、ex vivoにおいてまたはin vivoにおいて核酸を形質導入またはトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。その代わりに、核酸は、キメラタンパク質のタンパク質コード領域を含有する、ex vivo転写RNAを含む。

図面の簡単な説明

0051

図1は、iCD40およびヒトDCにおける発現の概略図である。Aは、ヒトCD40細胞質ドメインが、ミリストイル化ターゲティングドメイン(M)および2つのタンデムドメイン(Fv)の下流にサブクローニングできることを示す図である(Clackson T、Yang W、RozamusLWら、Redesigning an FKBP−ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998年;95巻:10437〜10442頁)。本明細書において誘導性CD40(iCD40)と称される、M−Fv−Fv−CD40キメラタンパク質の発現は、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの調節下であり得る。Bは、ウェスタンブロットにより評価した、CD40の内因性型(eCD40)および組換え誘導型(iCD40)の発現を示す図である。レーン1:野生型DC(内因性CD40対照)、レーン2:1マイクログラム/mlのLPSを用いて刺激したDC、レーン3および4:それぞれ、10,000VP/細胞(MOI約160)のAd5/f35−iCD40(iCD40−DC)を形質導入し、AP20187二量体化薬物を用いたDCおよびAP20187二量体化薬物を用いなかったDC、レーン5:LPSおよびAP20187を用いて刺激したiCD40−DC、レーン6:CD40L(CD40リガンド、TNFファミリーメンバーのタンパク質)およびLPSを用いて刺激したDC、レーン7:Ad5/f35−GFP(GFP−DC)をMOI160で形質導入し、AP20187およびLPSを用いて刺激したDC、レーン8:AP20187を用いて刺激したGFP−DC、レーン9:Ad5/f35−iCD40を形質導入した293T細胞(CD40の誘導型に対する陽性対照)。アルファチューブリン発現レベル内部対照とした。
図2は、iCD40の概略図である。脂質透過性二量体化薬物であるAP20187/AP19031の投与は、AP20187結合性ドメインおよびミリストイル化ターゲティング配列を含有するように改変された、CD40の細胞質ドメインのオリゴマー化をもたらす。
図3は、CID誘導性TLRの概略図である。
図4は、CID誘導性複合Toll様受容体(icTLR)の概略図である。
図5は、CD誘導性複合TLR(icTLR)/CD40の概略図である。
図6は、Toll様受容体(TLR)、それらのアダプター、それらに結合しているタンパク質キナーゼおよび下流のシグナル伝達効果の間の主な関係を示す図である。Nature 430巻、257〜263頁(2004年7月8日)。
図7は、293細胞中のiNod2およびiCD40の図である。293細胞に、(6ウェルプレートの)100万細胞/ウェルの割合で、3マイクログラムのキメラiNod−2のための発現プラスミド、および1マイクログラムのNFカッパB依存性SEAPレポータープラスミド(図においてRとして示した)を、一過性に共トランスフェクトした。iCD40は、陽性対照として使用した。
図8は、RAW264.7細胞中のiRIG−1およびiMyD88の図である。RAW264.7細胞に、3マイクログラムのiRIG−1のための発現プラスミドおよび1マイクログラムのIFNガンマ依存性SEAPレポータープラスミド;ならびに3マイクログラムのiMyD88および1マイクログラムのNF−カッパB依存性SEAPレポータープラスミドを一緒に、一過性に共トランスフェクトした。
図9は、パターン認識受容体の概略図である。
図10Aは、例であるiPRRプラスミドの概略図である。
図10Bは、例であるiPRRプラスミドの概略図である。
図10Cは、例であるiPRRプラスミドの概略図である。
図11は、iRIG、iNOD2およびiCD40をトランスフェクトした293細胞におけるNFカッパB SEAPレポーター誘導グラフである。
図12は、iRIG−IおよびiCD40をトランスフェクトした293細胞におけるNFカッパB SEAPレポーターの誘導のグラフである。
図13は、iRIG、iCD40およびiRIG+CD40をトランスフェクトした293細胞におけるNFカッパB SEAPレポーターの誘導のグラフである。
図14は、iRIG−IおよびiCD40をトランスフェクトしたJurkat Tag細胞におけるNFカッパB SEAPレポーターの誘導のグラフである。
図15Aおよび15Bは、それぞれ、pSH1−Sn−RIGI−Fv’−Fvls−EおよびpSH1−Sn−Fv’−Fvls−RIGI−Eに関するプラスミドマップの図である。「Sn」という用語は、クローニング目的で付加したNcoI部位を有する「S」を表す。「S」という用語は、非標的という用語を表す。
図16は、誘導性CD40およびMyD88受容体ならびにNFカッパB活性の誘導の概略図である。
図17は、誘導性キメラCD40/MyD88レポーターおよびNFカッパB活性の誘導の概略図である。
図18は、誘導性MyD88およびキメラMyD88−CD40受容体による、293細胞におけるNFカッパBの活性化のグラフである。CD40Tは、「ターボ」CD40を示し、受容体は、FKBP12v36ドメイン(Fv’)の3コピーを含む。
図19は、基質と共に3時間インキュベーション後の誘導性切断型MyD88(MyD88L)およびキメラ誘導性MyD88/CD40によるNFカッパB活性のグラフである。
図20は、基質と共に22時間インキュベーション後の誘導性切断型MyD88(MyD88L)およびキメラ誘導性MyD88/CD40によるNFカッパB活性のグラフである。このアッセイにおいて、いくつかのアッセイ飽和が存在する。
図21は、293T細胞のアデノウイルスMyD88L形質導入後のHAタンパク質のウェスタンブロットの図である。
図22は、293T細胞のアデノウイルスMyD88L−CD40形質導入後のHAタンパク質のウェスタンブロットの図である。
表示の誘導性CD40およびMyD88構築体による、DC由来骨髄のアデノウイルス感染後のELISAアッセイのグラフである。
図24は、図23におけるELISAアッセイと同様のELISAアッセイの結果のグラフである。
図25は、より多量のアデノウイルスを用いた感染後の、図23および24におけるELISAアッセイと同様のELISAアッセイの結果のグラフである。
図26は、iRIG−1およびiCD40をトランスフェクトした細胞における、NFカッパB SEAPレポーターアッセイの結果のグラフである。
図27は、iRIG−1およびiTRIFをトランスフェクトした細胞における、IFNベータSEAPレポーターアッセイの結果のグラフである。
図28は、トランスフェクトした細胞におけるNFカッパBおよびIFNベータレポーターのiTRIF活性化を比較するグラフである。
図29は、トランスフェクトした細胞におけるNFカッパBレポーターのiNOD2活性化のグラフである。
図30は、pShuttleX−iMyD88の構築物マップである。
図31は、pShuttleX−CD4−TLR4L3−Eの構築物マップである。
図32は、pShuttleX−iMyD88E−CD40の構築物マップである。
図33は、誘導性MyD88.CD40複合構築物を発現する、様々な感染の多重度のアデノウイルスを形質導入したヒト単球由来樹状細胞(moDC)におけるIL−12p70発現の用量依存性誘導の結果を表す棒グラフである。
図34は、さまざまな誘導性構築物を発現するアデノウイルスを形質導入したヒト単球由来樹状細胞(moDC)における、IL−12p70発現の薬物依存性誘導の結果を表す棒グラフである。
図35は、ワクチン接種前に形質導入した樹状細胞におけるIL−12p70レベルを表す棒グラフである。
図36(a)は、形質導入した樹状細胞をワクチン接種したマウスにおけるEG.7−OVA腫瘍成長阻害のグラフである。図36(b)は、代表的なワクチン接種されたマウスの写真である。図36(c)は、エラーバーを含む36(a)のグラフである。
図36(a)は、形質導入した樹状細胞をワクチン接種したマウスにおけるEG.7−OVA腫瘍成長阻害のグラフである。図36(b)は、代表的なワクチン接種されたマウスの写真である。図36(c)は、エラーバーを含む36(a)のグラフである。
図36(a)は、形質導入した樹状細胞をワクチン接種したマウスにおけるEG.7−OVA腫瘍成長阻害のグラフである。図36(b)は、代表的なワクチン接種されたマウスの写真である。図36(c)は、エラーバーを含む36(a)のグラフである。
図37(a)は、形質導入した樹状細胞により誘導されたAg特異的CD8+T細胞の頻度の増強を示す散布図であり、37(b)は、棒グラフである。
図38は、形質導入した樹状細胞により誘導されたAg特異的IFNガンマ+CD8+T細胞およびCD4+TH1細胞の頻度の増強を示す棒グラフである。
図39は、in vivoの細胞傷害性リンパ球アッセイの概略および結果の図である。
図40は、樹状細胞により誘導された、in vivoのCTL活性の増強によるデータを要約する棒グラフである。
図41は、形質導入した樹状細胞により誘導されたマウスにおけるCTLアッセイの代表的結果の図である。
図42は、形質導入した樹状細胞を接種したマウスにおけるIL−4産生TH2細胞に関する内部細胞染色の結果である。
図43は、Ad5−iCD40.MyD88を形質導入した細胞を用いて処理したマウスにおける腫瘍成長阻害アッセイの結果である。
Ad5−iCD40.MyD88を形質導入した細胞を用いて処理したマウスにおける腫瘍特異的T細胞アッセイの図である
図45は、エフェクターとして処理マウス由来脾細胞を使用する、ナチュラルキラー細胞アッセイの結果である。
図46は、エフェクターとして処理マウス由来脾細胞を使用する、細胞傷害性リンパ球アッセイの結果である。
図47は、表示のベクターを形質導入した樹状細胞と共培養したT細胞を使用する、IFNガンマELISPotアッセイの結果である。
図48は、表示のベクターを用いて形質転換した樹状細胞を使用し、アジュバントとしてLPSを用いた、または用いない、CCR7上方制御アッセイの結果である。
図49は、図48に提示されたCCR7上方制御アッセイの結果を提示し、多数の動物由来のデータが1つのグラフに含まれる。

0052

本明細書において使用されるように、単語「1つの(a)」または「1つの(an)」の使用は、特許請求の範囲および/または明細書において用語「含む(comprising)」と共に使用される場合、「1つの(one)」を意味してもよいが、それはまた、「1つまたは複数の」、「少なくとも1つの」、および「1つのまたは1つを超える」の意味と一致している。さらに、用語「有する」、「含む(including)」、「含有する」、および「含む(comprising)」は、交換可能であり、当業者は、これらの用語が制約がない用語であることを認識している。

0053

本明細書において使用される用語「同種異系」は、抗原性が別のHLA座またはMHC座を指す。したがって、同じ種から移された細胞または組織は、抗原性が別となり得る。同系マウスは、1つまたは複数の座で異なり得(コンジェニック)、同種異系マウスは、同じバックグラウンドを有し得る。

0054

本明細書において使用される用語「抗原」は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生もしくは特異的な免疫適格細胞の活性化またはその両方を含んでいてもよい。抗原は、生物、タンパク質/抗原のサブユニット死滅または不活性化全細胞または溶解物に由来し得る。例示的な生物は、ヘリコバクターカンピロバクタークロストリジウム、Corynebacterium diphtheriae、Bordetella pertussis、インフルエンザウイルスパラインフルエンザウイルス呼吸器多核体ウイルス、Borrelia burgdorfei、プラスモジウム単純ヘルペスウイルスヒト免疫不全ウイルスパピローマウイルス、Vibrio cholera、E. coli、麻疹ウイルスロタウイルス赤痢菌、Salmonella typhi、Neisseria gonorrheaを含むが、これらに限定されない。そのため、当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が抗原として果たし得ることを理解する。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムDNAに由来し得る。当業者は、病原性ゲノムのヌクレオチド配列もしくは部分的なヌクレオチド配列または免疫応答を誘導するタンパク質についての遺伝子もしくは遺伝子の断片を含有する任意のDNAは、抗原の合成をもたらすことを理解する。さらに、当業者は、本発明が、遺伝子またはゲノムの全核酸配列の使用に限定されないことを理解する。本発明は、1つを超える遺伝子またはゲノムの部分的な核酸配列の使用を含むが、これらに限定されず、これらの核酸配列が、所望の免疫応答を誘導するために様々な組合せで配置されることは容易に固有のものとなる。

0055

用語「抗原提示細胞」は、その細胞表面上に(またはそれに)少なくとも1つの抗原または抗原断片を示す、獲得する、提示することができる様々な細胞のいずれかである。一般に、用語「抗原提示細胞」は、抗原または抗原組成物に対する免疫応答(つまり免疫系のT細胞またはB細胞アーム(arm)由来の)の増強を支援することによって本発明の目標を達成する任意の細胞とすることができる。そのような細胞は、本明細書において開示される、当技術分野における方法を使用して、当業者らによって定義することができる。当業者によって理解され(例えば、参照によって本明細書において組み込まれるKuby、2000年、Immunology、第4増補版、W.H. Freeman and companyを参照されたい)、ある実施形態において本明細書において使用されるように、免疫細胞クラスII主要組織適合分子または複合体と共に抗原を正常にまたは優先的に示す、または提示する細胞は、「抗原提示細胞」である。ある態様では、細胞(例えばAPC細胞)は、所望の抗原を発現する組換え細胞または腫瘍細胞などのような他の細胞と融合されてもよい。2つ以上の細胞の融合物を調製するための方法は、例えば、それぞれが参照によって本明細書において組み込まれるGoding, J.W.、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、65〜66頁、71〜74頁(Academic Press、1986年);Campbell、in: Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、13巻、Burden & Von Knippenberg、Amsterdam、Elseview、75〜83頁、1984年;Kohler & Milstein、Nature、256巻:495〜497頁、1975年;Kohler & Milstein、Eur. J. Immunol.、6巻:511〜519頁、1976年、Gefterら、Somatic Cell Genet.、3巻:231〜236頁、1977年において開示される方法などのように、当技術分野において周知である。いくつかの場合では、抗原提示細胞が抗原を示す、または提示する免疫細胞は、CD4+TH細胞である。APCまたは他の免疫細胞上に発現される、さらなる分子は、免疫応答の増強を支援してもよいまたは改善してもよい。例えばサイトカインおよびアジュバントなどのような分泌分子または可溶性分子もまた、抗原に対する免疫応答を支援してもよいまたは増強してもよい。そのような分子は、当業者に周知であり、様々な例は、本明細書において記載されている。

0056

本明細書において使用される用語「癌」は、独自特性−正常な制御の損失−が、無秩序成長、分化の欠如局所的な組織浸潤、および転移をもたらす、細胞の過剰増殖として定義される。例として、黒色腫非小細胞小細胞肺、肺、肝細胞癌白血病網膜芽細胞腫星状細胞腫膠芽腫歯肉神経芽細胞腫、頭部、頸部乳房膵臓前立腺腎臓、骨、精巣卵巣中皮腫子宮頸部胃腸リンパ腫、脳、結腸肉腫、または膀胱を含むが、これらに限定されない。

0057

本明細書において使用される用語「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、区別なく使用されてもよい。すべてのこれらの用語はまた、任意のおよびすべての続く世代となる、それらの子孫を含む。すべての子孫が、故意または偶然突然変異により同一だとは限らなくてもよいことが理解される。

0058

本明細書において使用されるように、用語「iCD40分子」は、誘発性CD40として定義される。このiCD40は、内因的なCD40シグナル伝達を失わせるメカニズムを回避することができる。用語「iCD40」は、「iCD40核酸」、「iCD40ポリペプチド」、および/またはiCD40発現ベクターを包含する。さらに、本明細書において使用されるiCD40の活性は、CIDによって駆動されることが理解される。

0059

本明細書において使用されるように、用語「cDNA」は、鋳型としてメッセンジャーRNAmRNA)を使用して調製されるDNAを指すことが意図される。ゲノムDNAまたはゲノムの、非処理もしくは部分的に処理されたRNA鋳型から重合されたDNAとは対照的に、cDNAを使用することの利点は、cDNAが対応するタンパク質のコード配列を主として含有するということである。非コード領域が最適な発現に必要とされる場合またはイントロンなどのような非コード領域がアンチセンス戦略において標的とされることになっている場合などのように、完全または部分的なゲノムの配列が好ましい場合がある。

0060

用語「「樹状細胞」(DC)は、in vivoにおいて、in vitroにおいて、ex vivoにおいて、または宿主中にもしくは被験体中に存在し、または造血幹細胞もしくは単球に由来し得る抗原提示細胞である。樹状細胞ならびにそれらの前駆型は、様々なリンパ器官、例えば脾臓、リンパ節ならびに骨髄および末梢血から単離することができる。DCは、樹状細胞本体から多数の方向に拡張する薄いシート(thin sheet)(ラメリポディウム)を有する特徴的な形態を有する。典型的に、樹状細胞は、高レベルのMHCならびに副刺激(例えばB7−1およびB7−2)分子を発現する。樹状細胞は、in vitroにおいてT細胞の抗原特異的な分化を誘発することができ、in vitroおよびin vivoにおいて一次T細胞応答を開始することができる。

0061

本明細書において使用されるように、用語「発現構築物」または「導入遺伝子」は、配列をコードする核酸の一部またはすべてを転写することができ、ベクターの中に挿入することができる、遺伝子産物をコードする核酸を含有する、任意のタイプの遺伝子構築物として定義される。転写物は、タンパク質に翻訳されるが、その必要はない。ある実施形態では、発現は、遺伝子の転写および遺伝子産物へのmRNAの翻訳の両方を含む。他の実施形態では、発現は、対象の遺伝子をコードする核酸の転写のみを含む。用語「治療用構築物」もまた、発現構築物または導入遺伝子を指すために使用されてもよい。当業者は、発現構築物または導入遺伝子が、例えば、癌などのような過剰増殖疾患または障害を治療するための療法として使用されてもよく、したがって、発現構築物または導入遺伝子が、治療用構築物または予防構築物となることを理解する。

0062

本明細書において使用されるように、用語「発現ベクター」は、転写することができる、遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。いくつかの場合では、次いで、RNA分子は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合では、これらの配列は、例えばアンチセンス分子またはリボザイムの産生において翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主生物における、作動可能に連結されるコード配列の転写およびおそらく翻訳に必要な核酸配列を指す、様々な制御配列を含有することができる。転写および翻訳を調節する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を同様に果たし、以下に記載される核酸配列を含有していてもよい。

0063

本明細書において使用されるように、用語「ex vivo」は、体「の外部」を指す。当業者は、ex vivoおよびin vitroを区別なく使用することができることを知っている。

0064

本明細書において使用されるように、本明細書において使用される用語「機能的に等価な」は、例えば、それが、CD40核酸断片変異体、またはアナログを指すように、CD40ポリペプチドまたは腫瘍もしくは過剰増殖疾患を破壊するために免疫応答を刺激するCD40ポリペプチドをコードする核酸を指す。「機能的に等価な」は、例えば、細胞外ドメインを欠くが、抗原提示分子の樹状細胞発現をアップレギュレートすることによって、T細胞媒介腫瘍死滅応答を増幅することができるCD40ポリペプチドを指す。

0065

用語「過剰増殖疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的な過剰増殖疾患は、癌または自己免疫疾患を含むが、これらに限定されない。他の過剰増殖疾患は、血管閉塞再狭窄アテローム性動脈硬化症、または炎症性腸疾患を含んでいてもよい。

0066

本明細書において使用されるように、用語「遺伝子」は、機能的なタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドコード単位として定義される。当業者らによって理解されるように、この機能的な用語は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および突然変異体を発現する、または発現するのに適応したゲノム配列cDNA配列、およびより小さな操作された遺伝子セグメントを含む。

0067

用語「免疫原性組成物」または「免疫原」は、免疫応答を誘発することができる物質を指す。免疫原の例は、例えば、抗原、自己免疫疾患の誘発において役割を果たす自己抗原、および癌細胞上に発現される腫瘍関連抗原を含む。

0068

本明細書において使用される用語「免疫無防備状態の」は、低下したまたは衰弱した免疫系を有する被験体として定義される。免疫無防備状態の状態は、免疫系の欠損もしくは機能不全または感染症および/もしくは疾患に対する感受性を高める他の因子によるものであってもよい。そのような分類は評価のための概念的な基礎を可能にするが、免疫無防備状態の個人は、多くの場合、1つの群または他の群に完全には適合しない。体の防御メカニズムにおける1つを超える欠損が影響を与えられているかもしれない。例えば、HIVによって引き起こされる特異的なTリンパ球欠損を有する個人はまた、抗ウイルス療法のために使用される薬剤によって引き起こされる好中球減少症をも有しているかもしれないまたは皮膚および粘膜完全性欠陥のために免疫無防備状態であるかもしれない。免疫無防備状態の状態は、留置しているセントラルラインまたは静脈薬物乱用による他のタイプの損傷に起因し得る、または二次悪性疾患栄養失調症によってまたは結核もしくは性感染病、例えば梅毒もしくは肝炎などのような他の感染病原体に感染していることによって引き起こされ得る。

0069

本明細書において使用されるように、用語「薬学的にまたは薬理学的に許容される」は、動物またはヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー性の、または他の不都合な反応をもたらさない分子の実体および組成物を指す。

0070

本明細書において使用されるように、「薬学的に許容されるキャリア」は、任意のおよびすべての溶媒分散媒コーティング剤抗菌および抗真菌剤等張および吸収遅延剤、ならびにその他同種のものを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。いかなる従来の媒体または作用物質も、本明細書において提示されるベクターまたは細胞と不適合性である場合以外は、治療用組成物におけるその使用は、企図される。補充性活性成分もまた、組成物の中に組み込むことができる。

0071

本明細書において使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドの多量体である。したがって、本明細書において使用される核酸およびポリヌクレオチドは、交換可能である。当業者は、核酸が、単量体「ヌクレオチド」に加水分解することができるポリヌクレオチドであるという一般知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解することができる。本明細書において使用されるように、ポリヌクレオチドは、限定を伴うことなく、組換え手段、つまり、通常のクローニング技術およびPCR商標)ならびにその他同種のものを使用する、組換えライブラリーまたは細胞ゲノム由来の核酸配列のクローニングを含む、当技術分野において入手可能な任意の手段によってならびに合成手段によって得られるすべての核酸配列を含むが、これらに限定されない。さらに、当業者は、ポリヌクレオチドがポリヌクレオチドの突然変異を含み、当技術分野において周知の方法によるヌクレオチドまたはヌクレオシドの突然変異を含むが、これらに限定されないことを認識している。

0072

本明細書において使用されるように、用語「ポリペプチド」は、明示される配列を通常有する、アミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書において使用されるように、ポリペプチドという用語は、用語「ペプチド」および「タンパク質」と交換可能である。

0073

本明細書において使用されるように、用語「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識されるDNA配列として定義される。

0074

本明細書において使用されるように、用語「免疫応答を調節する」または「免疫応答を調整する」は、免疫応答を修飾するための能力を指す。例えば、組成物は、免疫応答を増強および/または活性化することができる。さらに、組成物はまた、免疫応答を阻害することもできる。調節の形態は、組成物と共に使用されるリガンドによって決定される。例えば、化学物質の二量体アナログは、副刺激ポリペプチドの二量体化をもたらし、DCの活性化に至るが、化学物質の単量体アナログは、副刺激ポリペプチドの二量体化をもたらさず、これは、DCを活性化しないであろう。

0075

用語「トランスフェクション」および「形質導入」は、交換可能であり、外因性DNA配列真核生物宿主細胞の中に導入されるプロセスを指す。トランスフェクション(または形質導入)は、エレクトロポレーションマイクロインジェクション遺伝子銃送達レトロウイルス感染リポフェクションスーパーフェクション(superfection)、およびその他同種のものを含む、多くの手段のいずれか1つによって達成することができる。

0076

本明細書において使用されるように、用語「同系」は、同一であり、もしくは組織移植を可能にするのに十分に密接に関係し、または免疫学的適合性である遺伝子型を有する細胞、組織、または動物を指す。例えば、同じ近交系一卵性双生児または動物。同系および同遺伝子系は、交換可能に使用することができる。

0077

本明細書において使用される用語「被験体」は、生物または動物;例えばヒト、非ヒト霊長動物(例えばサル)、マウス、ブタ雌ウシヤギウサギ、ラット、モルモットハムスターウマ、サル、ヒツジ、または他の非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物;例えば、トリ(例えばニワトリもしくはアヒル)またはなどのような非哺乳動物脊椎動物および非哺乳動物無脊椎動物を含む非哺乳動物を含むが、これらに限定されない。

0078

本明細書において使用されるように、用語「転写制御下」または「作動可能に連結される」は、プロモーターが、RNAポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するために、核酸に関して正確な位置および方向づけにあるように定義される。

0079

本明細書において使用されるように、用語「治療」、「治療する」、「治療される」、または「治療すること」は、予防法および/または療法を指す。例えば、感染症に関して使用される場合、用語は、病原体による感染症に対する被験体の抵抗性を増加させ、または言いかえれば、被験体が病原体に感染し、もしくは感染症に起因する病気徴候を示す見込みを減少させる予防的治療ならびに被験体が感染した後に、感染症と戦う、例えば、感染症を低下させ、もしくは排除し、またはそれがより悪くなるのを予防するための治療を指す。

0080

本明細書において使用されるように、用語「ワクチン」は、動物に投与することができる形態をしている、本明細書において提示される組成物を含有する製剤を指す。典型的に、ワクチンは、組成物が懸濁または溶解される従来の生理食塩水または緩衝水溶液媒体を含む。この形態では、組成物は、状態を予防する、回復させる、または他の場合には治療するために好都合に使用することができる。被験体への導入に際して、ワクチンは、抗体、サイトカインの産生、および/または他の細胞応答を含むが、これらに限定されない免疫応答を誘発することができる。

0081

樹状細胞
自然免疫系は、微生物中に存在する、保存された分子パターンの認識のために生殖細胞系コード受容体のセットを使用する。これらの分子パターンは、リポ多糖、ペプチドグリカンリポタイコ酸ホスファチジルコリンリポタンパク質を含む細菌特異的タンパク質、細菌DNA、ウイルス一本鎖および二本鎖RNA非メチル化CpG−DNA、マンナン、ならびに様々な他の細菌および菌細胞壁成分を含む、微生物のある種の構成物中に生じる。そのような分子パターンはまた、植物アルカロイドなどのような他の分子中にも生じ得る。自然免疫認識のこれらの標的は、それらが感染宿主生物によってではなく微生物によって産生されるので、病原体関連分子パターン(PAMP)と呼ばれる(Janewayら(1989年)Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.、54巻:1〜13頁;Medzhitovら、Nature、388巻:394〜397頁、1997年)。

0082

PAMPを認識する自然免疫系の受容体は、パターン認識受容体(PRR)と呼ばれる(Janewayら、1989年;Medzhitovら、1997年)。これらの受容体は構造が異なり、いくつかの異なるタンパク質ファミリーに属する。これらの受容体のいくつかは、PAMPを直接、認識する(例えばCD14、DEC205、コレクチン)が、他のもの(例えば補体受容体)は、PAMP認識によって生成される産物を認識する。これらの受容体ファミリーメンバーは、一般に、3つのタイプ:1)血漿中で循環する体液性受容体、2)免疫細胞表面上に発現されるエンドサイトーシス受容体、および3)細胞表面上にまたは細胞内で発現することができるシグナル伝達受容体に分類することができる(Medzhitovら、1997年;Fearonら(1996年)Science 272巻:50〜3頁)。

0083

細胞のPRRは、適応免疫においてプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)として機能する細胞を含む、自然免疫系のエフェクター細胞上に発現される。そのようなエフェクター細胞は、マクロファージ、樹状細胞、Bリンパ球、および表面上皮(surface epithelia)を含むが、これらに限定されない。この発現プロファイルは、PRRが、自然エフェクターメカニズムを直接、誘発することおよびまた、下記に議論される炎症性サイトカインおよびケモカインなどのような内因的なシグナルのセットの発現を誘発することによって、感染病原体の存在に対して宿主生物に警告することをも可能にする。この後者の機能は、侵入物退治するためのエフェクター力の効率的な動員を可能にする。

0084

樹状細胞(DC)の主要な機能は、末梢組織において抗原を獲得し、二次リンパ組織に移動し、免疫系のエフェクターT細胞に抗原を提示することである(Banchereau, J.ら、Annu Rev Immunol、2000年、18巻:767〜811頁;Banchereau, J., & Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392巻、245〜252頁(1998年))。DCが免疫応答においてそれらの重大な役割を実行するので、それらは、それらがそれぞれの環境に対して適切な機能を実行することを可能にする成熟変化を受ける(Termeer, C. C.ら、J Immunol、2000年8月15日 165巻:1863〜70頁)。DCの成熟の間に、抗原取り込み潜在能力は、失われ、主要組織適合複合体(MHC)クラスIおよびクラスII分子表面密度は、10〜100倍増加し、CD40、副刺激分子、および接着分子発現もまた、大幅に増加する(Lanzavecchia, A.およびF. Sallusto、Science、2000年 290巻:92〜96頁)。さらに、他の遺伝子改変は、DCが、流入領域リンパ節の、T細胞に富んだ傍皮質帰り、ナイーブおよび記憶T細胞を誘引し、抗原特異的ナイーブTH0細胞を刺激するT細胞ケモカインを発現することを可能にする(Adema, G. J.ら、Nature、1997年6月12日 387巻:713〜7頁)。このステージの間に、成熟DCは、CD4+ヘルパーT細胞にそれらのMHC II分子を介して抗原を提示して、DC CD40受容体に引き続いて結合するT細胞CD40リガンド(CD40L)のアップレギュレーションを誘発する。このDC:T細胞相互作用は、MHC I分子およびII分子、接着分子、副刺激分子(例えばB7.1、B7.2)、サイトカイン(例えばIL−12)、ならびに抗アポトーシスタンパク質(例えばBcl−2)のさらなるアップレギュレーションを含む、強力なCD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答の開始に重大である、さらなるDC分子の急速な発現を誘発する(Anderson, D. M.ら、Nature、1997年11月13日 390巻:175〜9頁;Ohshima, Y.ら、J Immunol、1997年10月15日 159巻:3838〜48頁;Sallusto, F.ら、Eur J Immunol、1998年9月28日:2760〜9頁;Caux, C. Adv Exp Med Biol. 1997年、417巻:21〜5頁;)。CD8+T細胞は、リンパ節を出て、循環に再び入り、病原体または悪性細胞を破壊するために炎症の本来の部位に帰る。

0085

DCの機能に影響を及ぼす重要な1つのパラメーターは、DCの「電源投入スイッチ(on switch)」として果たすCD40受容体である(Bennett, S. R.ら、Nature、1998年6月4日 393巻:478〜80頁;Clarke, S. R.、J Leukoc Biol、2000年5月 67巻:607〜14頁;Fernandez, N. C.ら、Nat Med、1999年4月5日:405〜11頁;Ridge, J. P.、D. R. F、およびP. Nature、1998年6月4日 393巻:474〜8頁;Schoenberger, S. P.ら、Nature、1998年6月4日 393巻:480〜3頁)。CD40は、TNF受容体スーパーファミリーの48kDa膜貫通メンバーである(McWhirter, S. M.ら、Proc Natl Acad Sci U S A、1999年7月20日 96巻:8408〜13頁)。CD40−CD40L相互作用は、TNF受容体関連因子(TRAF)を含むシグナル伝達カスケードを開始するために必要なCD40三量体形成を誘発する(Ni, C.ら、PNAS、2000年、97巻(19号):10395〜10399頁;Pullen, S.S.ら、J Biol Chem、1999年5月14日 274巻:14246〜54頁)。CD40は、NF−カッパB、AP−1、STAT3、およびp38MAPKを含む、DC中のいくつかの転写因子を活性化するためにこれらのシグナル伝達分子を使用する(McWhirter, S.M.ら、1999年)。

0086

新規なDC活性化系は、DCにおける活性化および/または生存延長/増加をもたらす、DCのプラスミド膜(plasmid membrane)への、シグナル伝達分子または副刺激ポリペプチドの補充に基づいて提供される。副刺激ポリペプチドは、NF−カッパB経路、Akt経路、および/またはp38経路を活性化する任意の分子またはポリペプチドを含む。DC活性化系は、副刺激ポリペプチドが、オリゴマー化をもたらすリガンド(つまり脂質透過性有機二量体化薬物)により活性化および/または調節される、リガンド結合ドメイン(つまり小分子結合ドメイン)に融合される組換えシグナル伝達分子の利用に基づく。副刺激ポリペプチドを架橋する、またはそれのオリゴマー化のために使用されてもよい他の系は、抗体、天然リガンド、および/または人工交差反応リガンドもしくは合成リガンドを含む。さらに、企図される他の二量体化系は、クーママイシンDNAジャイレースB系を含む。

0087

使用することができる副刺激ポリペプチドは、NF−カッパBおよび他の可変性のシグナル伝達カスケード、例えばp38経路および/またはAkt経路を活性化するものを含む。そのような副刺激ポリペプチドは、パターン認識受容体、C−反応性タンパク質受容体(つまりNod1、Nod2、PtX3−R)、TNF受容体(つまりCD40、RANK/TRANCE−R、OX40、4−1BB)、ならびにHSP受容体(Lox−1およびCD−91)を含むが、これらに限定されない。パターン認識受容体は、エンドサイトーシスパターン認識受容体(つまりマンノース受容体、スカベンジャー受容体(つまりMac−1、LRP、ペプチドグリカン、タイコ酸(techoic acid)、毒素、CD11c/CR4));外部シグナルパターン認識受容体(Toll様受容体(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10)、ペプチドグリカン認識タンパク質(PGRPは細菌ペプチドグリカンおよびCD14に結合する);内部シグナルパターン認識受容体(つまりNOD受容体1&2)、RIG1、ならびに図8中に示されるPRRを含むが、これらに限定されない。当業者らはまた、例えばWerts C.ら、Cell Death and Differentiation(2006年)13巻:798〜815頁;Meylan, E.ら、Nature(2006年)442巻:39〜44頁;およびStrober, W.ら、Nature Reviews(2006年)6巻:9〜20頁において議論されるものを含む、本発明の方法および組成物に適した他のパターン認識受容体を知っている。

0088

発現構築物の操作
すべてが作動可能に連結される、副刺激ポリペプチドおよびリガンド結合ドメインをコードする発現構築物もまた提供される。より詳細には、1つを超えるリガンド結合ドメインが、発現構築物中に使用される。さらに、発現構築物は、膜ターゲティング配列を含有する。当業者は、適切な発現構築物が、上記のFKBPリガンド結合エレメントのどちらかの側に副刺激ポリペプチドエレメントを含んでいてもよいことを理解する。発現構築物は、ベクター、例えばウイルスベクターまたはプラスミドの中に挿入されてもよい。

0089

A.副刺激ポリペプチド
副刺激ポリペプチド分子は、抗原提示分子の樹状細胞発現をアップレギュレートすることによってT細胞媒介応答を増幅することができる。企図される副刺激タンパク質は、例えば腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーのメンバー(つまりCD40、RANK/TRANCE−R、OX40、4−1B)、Toll様受容体、C−反応性タンパク質受容体、パターン認識受容体、およびHSP受容体を含むが、これらに限定されない。典型的に、これらの副刺激ポリペプチド由来の細胞質ドメインは、発現ベクター中に使用される。認識配列が細胞質ドメインと関連する転写の開始に関与するその突然変異体を含む、様々な副刺激ポリペプチドの1つからの細胞質ドメインは、公知であり、またはそのような配列に応答性の遺伝子が公知である。

0090

特定の実施形態では、副刺激ポリペプチド分子は、CD40である。CD40分子は、(1)公知のCD40遺伝子の配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、(2)CD40ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。CD40ポリペプチドは、ある実施例では、細胞外ドメインを欠いていてもよい。CD40ポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、配列番号1および他の種由来のCD40アイソフォームを含むが、これらに限定されない。CD40の他の正常なまたは突然変異体の変異体は、本発明の方法および組成物において使用することができることが企図される。したがって、CD40領域は、1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および/または挿入によって本来の配列と異なるアミノ酸配列を有し得る。例えば、1つまたは複数のTNF受容体関連因子(TRAF)結合領域は、排除されてもよいまたは有効に排除されてもよい(例えば、CD40アミノ酸配列は、TRAFタンパク質が結合しないまたはそれが本来のCD40配列に結合するよりも低い親和性で結合するように欠失し、または改変される)。特定の実施形態では、TRAF3結合領域は、それが排除され、または有効に排除されるように欠失し、または改変される(例えば、アミノ酸250〜254は、改変され、または欠失していてもよい;Hauerら、PNAS 102巻(8号):2874〜2879頁(2005年))。

0091

ある実施形態では、本発明の方法は、CD40の誘発性形態(iCD40)をコードする発現構築物を産生するための遺伝物質の操作を含む。そのような方法は、例えば、CD40細胞質ドメインをコードする異種核酸配列を含有する発現構築物の生成およびその発現のための手段を含む。ベクターは、適切なヘルパー細胞中で複製することができ、ウイルス粒子は、そこから産生されてもよく、細胞は、組換えウイルス粒子に感染されてもよい。

0092

したがって、本明細書において提示されるCD40分子は、例えば、細胞外ドメインを欠いていてもよい。特定の実施形態では、細胞外ドメインは、切断型であり、または除去される。細胞外ドメインは、機能的な細胞外ドメインを有していないCD40分子を産生するために標準の突然変異誘発、挿入、欠失、または置換を使用して突然変異させることができることもまた企図される。CD40核酸は、配列番号1の核酸配列を有していてもよい。CD40核酸はまた、配列番号1の配列を有する核酸の相同体および対立遺伝子ならびに先の核酸の機能的に等価な断片、変異体、およびアナログを含む。誘発性CD40ベクターを構築するための方法は、例えば、2008年7月29日に発行された米国特許第7,404,950号において記載されている。

0093

遺伝子療法との関連において、遺伝子は、ベクターのバックボーンを提供する、ウイルスゲノム以外の供給源に由来する異種ポリヌクレオチド配列となるであろう。遺伝子は、細菌、ウイルス、酵母寄生生物、植物、またはさらに動物などのような原核生物または真核生物の供給源に由来する。異種DNAはまた、1つを超える供給源、つまり多重遺伝子構築物または融合タンパク質に由来する。異種DNAはまた、ある供給源に由来する調節配列および異なる供給源由来の遺伝子を含んでいてもよい。

0094

B.リガンド結合領域
発現構築物のリガンド結合(「二量体化」)ドメインは、天然または非天然リガンド、例えば非天然合成リガンドを使用する誘発を可能にするであろう任意の好都合なドメインとすることができる。リガンド結合ドメインは、構築物の性質およびリガンドの選択に依存して、細胞の膜に対して内部または外部であってもよい。上記に示される細胞質領域と結合するリガンド結合タンパク質を含む、受容体を含む、種々様々のリガンド結合タンパク質は、公知である。本明細書において使用されるように、用語「リガンド結合ドメインは、用語「受容体」と交換可能とすることができる。リガンド(例えば小さな有機リガンド)が公知であり、または容易に産生されてもよいリガンド結合タンパク質が特に興味深い。リガンド結合ドメインまたは受容体は、FKBPおよびサイクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体、上記に示される他の受容体、ならびにその他同種のものならびに抗体から得ることができる「非天然」受容体、特に重鎖サブユニットまたは軽鎖サブユニット、その突然変異配列、確率的な手順、コンビナトリアル合成、およびその他同種のものによって得られるランダムアミノ酸配列を含む。例として、例えばKopytek, S.J.ら、Chemistry & Biology 7巻:313〜321頁(2000年)およびGestwicki, J.E.ら、Combinatorial Chem. & High Throughput Screening 10巻:667〜675頁(2007年);Clackson T(2006年)Chem Biol Drug Des 67巻:440〜2頁;Clackson, T.「Controlling Protein−Protein Interactions Using Chemical Inducers and Disrupters of Dimerization」in Chemical Biology: From Small Molecules to Systems Biology and Drug Design(Schreiber, s.ら編、Wiley、2007年))において記載されるものを含む。

0095

大部分については、リガンド結合ドメインまたは受容体ドメインは、天然ドメインまたはその切断型活性部分として、少なくとも約50アミノ酸、約350アミノ酸未満、通常、200アミノ酸未満であろう。結合ドメインは、例えば、小さくてもよい(<25kDa、ウイルスベクターにおいて効率的なトランスフェクションを可能にするために)、単量体(これはアビジンビオチン系を除外する)、非免疫原性であってもよく、二量体化のために構成することができる、合成的に入手可能であり、細胞透過性で、無毒性のリガンドを有するはずである。

0096

受容体ドメインは、発現構築物の設計および適切なリガンドの入手可能性に依存して、細胞内また細胞外のものとすることができる。疎水性リガンドについては、結合ドメインは、膜のどちらの側にもあり得るが、親水性リガンド、特にタンパク質リガンドについては、結合ドメインは、結合に利用可能である形態をしたリガンドを内部移行するための輸送系がない限り、通常、細胞膜に対して外部にあるであろう。細胞内受容体については、構築物は、受容体ドメイン配列の5’または3’にシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインをコードすることができ、または受容体ドメイン配列の5’に脂質結合シグナル配列を有していてもよい。受容体ドメインがシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインの間にある場合、受容体ドメインは、細胞外のものとなるであろう。

0097

受容体をコードする発現構築物の部分は、様々な理由で突然変異誘発にかけることができる。突然変異誘発されたタンパク質は、より高い結合親和性をもたらすことができる、自然発生の受容体および突然変異誘発された受容体のリガンドによる区別を可能にすることができる、受容体−リガンド対を設計するための自由度を提供する、またはその他同種のことをすることができる。受容体における変化は、結合部位にあることが公知のアミノ酸における変化、コンビナトリアル技術を使用するランダム突然変異誘発を含むことができ、結合部位と関連するアミノ酸または立体構造変化と関連する他のアミノ酸についてのコドンは、特定のアミノ酸についてコドン(複数可)を公知の変化を用いてまたはランダムに交換することによって突然変異誘発にかけ、適切な原核生物の宿主において、結果として生じるタンパク質を発現させ、次いで、結合について、結果として生じるタンパク質をスクリーニングすることができる。

0098

抗体および抗体サブユニット、例えば重鎖もしくは軽鎖、特に断片、より詳細には可変領域のすべてもしくは一部、または重鎖および軽鎖の融合物は、高親和性結合を引き起こすために、結合ドメインとして使用することができる。企図される抗体は、免疫応答を引き起こさず、一般に、末梢において(つまりCNS/脳エリアの外部で)発現されないであろう、細胞外ドメインなどのような、異所的に発現されるヒト産物であるものを含む。そのような例は、低親和性神経増殖因子受容体LNGFR)および表面タンパク質(つまり癌胎児性抗原)を含むが、これらに限定されない。

0099

さらに、抗体は、生理学的に許容されるハプテン分子に対して調製することができ、個々の抗体サブユニットは、結合親和性についてスクリーニングすることができる。サブユニットをコードするcDNAは、単離し、リガンドに対して適切な親和性を有する結合タンパク質ドメインを得るために、定常領域、可変領域の部分の欠失、可変領域の突然変異誘発、またはその他同種のものによって修飾することができる。このように、ほぼあらゆる生理学的に許容されるハプテン化合物は、リガンドとしてまたはリガンドに対するエピトープを提供するために用いることができる。抗体単位の代わりに、天然受容体を用いることができ、結合ドメインは、公知であり、結合に有用なリガンドがある。

0100

C.オリゴマー化
他の結合イベント、例えばアロステリック活性化をシグナルを開始するために用いることができるが、伝達されるシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンド媒介オリゴマー化、つまり、リガンド結合後のオリゴマー化の結果に起因するであろう。キメラタンパク質の構築物は、様々なドメインのオーダーおよび個々のドメインの繰り返しの数に関して変わるであろう。

0101

受容体の多量体を形成するために、キメラ表面膜タンパク質のリガンド結合ドメイン/受容体ドメインに対するリガンドは、それが、少なくとも2つの結合部位を有し、それぞれの結合部位が、リガンド受容体ドメインに結合することができるという意味で、通常、多量体であろう。望ましいように、本発明のリガンドは、二量体またはより高いオーダーの、通常、約四量体を超えないオリゴマーの小さな合成有機分子となり、個々の分子は、典型的に少なくとも約150Daかつ約5kDa未満、通常、約3kDa未満となるであろう。様々な対の合成リガンドおよび受容体を用いることができる。例えば、天然受容体を含む実施形態では、二量体FK506は、FKBP12受容体と共に使用することができ、二量体化シクロスポリンAは、シクロフィリン受容体と共に使用することができ、二量体化エストロゲンは、エストロゲン受容体と共に、二量体化グルココルチコイドは、グルココルチコイド受容体と共に、二量体化テトラサイクリンは、テトラサイクリン受容体と共に、二量体化ビタミンDは、ビタミンD受容体と共に使用することができるなどである。その代わりに、より高いオーダーのリガンド、例えば三量体を使用することができる。非天然受容体、例えば抗体サブユニット、修飾抗体サブユニット、または修飾受容体、およびその他同種のものを含む実施形態については、任意の種々様々の化合物を使用することができる。これらのリガンド単位の重要な特徴は、それぞれの結合部位が高い親和性で受容体に結合することができ、それらが化学的に二量体化することができることである。また、当業者らは、それらが、機能的レベル血清中に溶解することができ、さらに、ほとんどの適用のために形質膜にわたって拡散することができるように、リガンドの疎水性親水性平衡を保つための方法をも知っている。

0102

ある実施形態では、本発明の方法は、条件的に制御されるタンパク質またはポリペプチドを産生するために、化学的に誘発される二量体化(CID)の技術を利用する。この技術が誘発性であることに加えて、それはまた、不安定な二量体化剤の分解または単量体競合的阻害剤の投与により、可逆的となる。

0103

CID系は、リガンド結合ドメインに融合されたシグナル伝達分子を急速に架橋するために合成二価リガンドを使用する。この系は、細胞表面タンパク質(Spencer, D. M.ら、Science、1993年、262巻:1019〜1024頁;Spencer D. M.ら、Curr Biol 1996年、6巻:839〜847頁;Blau, C. A.ら、Proc Natl Acad.Sci. USA 1997年、94巻:3076〜3081頁)もしくは細胞質タンパク質(Luo, Z.ら、Nature 1996年、383巻:181〜185頁;MacCorkle, R. A.ら、Proc Natl Acad Sci USA 1998年、95巻:3655〜3660頁)のオリゴマー化および活性化、転写を調整するための、DNAエレメントへの転写因子の動員(Ho, S. N.ら、Nature 1996年、382巻:822〜826頁;Rivera, V. M.ら、Nat.Med. 1996年、2巻:1028〜1032頁)、またはシグナル伝達を刺激するための、形質膜へのシグナル伝達分子の動員(Spencer D. M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1995年、92巻:9805〜9809頁;Holsinger, L. J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1995年、95巻:9810〜9814頁)を引き起こすために使用されてきた。

0104

CID系は、表面受容体凝集が下流のシグナル伝達カスケードを有効に活性化するという見解に基づく。最も単純な実施形態では、CID系は、脂質透過性免疫抑制薬の二量体アナログ、FK506を使用し、これは、その正常な生物活性を失っているが、FK506結合タンパク質、FKBP12に遺伝子的に融合された分子を架橋するための能力を獲得している。1つまたは複数のFKBPおよびミリストイル化配列を標的受容体細胞質シグナル伝達ドメインに融合することによって、二量体化化合物薬剤依存的にではあるが、リガンドおよび外部ドメイン非依存的にシグナル伝達を刺激することができる。これは、一時的な制御を有する系、単量体薬剤アナログを使用する可逆性、および増強された特異性を提供する。それらの結合ドメイン、FKBP12に対する第3世代AP20187/AP1903 CIDの高い親和性は、内因的なFKBP12を通しての非特異的副作用の誘発を伴うことなく、in vivoにおいて組換え受容体の特異的な活性化を可能にする。さらに、合成リガンドは、プロテアーゼ分解に対して抵抗性であり、ほとんどの、送達されるタンパク質作用物質よりも、in vivoにおいて受容体を活性化することにおいてそれらをより効率的にする。

0105

使用されるリガンドは、2つ以上のリガンド結合ドメインに結合することができる。当業者は、キメラタンパク質が、1つを超えるリガンド結合ドメインを含有する場合、1つを超えるリガンドに結合することができてもよいことを理解する。リガンドは、典型的に、非タンパク質または化学物質である。例示的なリガンドは、二量体FK506(例えばFK1012)を含むが、これらに限定されない。

0106

CD40活性化のメカニズムは、三量体形成に基本的に基づくので、この受容体は、CID系に対して特に適用可能である。CID調節は、1)一時的な制御、2)自己免疫反応の徴候に際しての非活性単量体の追加による可逆性、および3)非特異的副作用に対する限られた潜在能力を有する系を提供する。さらに、誘発性in vivo DC CD40活性化は、CD40シグナル伝達の完全な誘発のために通常、必要とされる第2の「危険」シグナルの必要を回避し、in situにおいてDCの生存を潜在的に促進し、T細胞刺激の増強を可能にするであろう。したがって、iCD40を発現させるためのDCワクチンの操作は、抗原提示分子、接着分子、TH1促進サイトカイン、および生存促進性因子のDC発現をアップレギュレートすることによって、T細胞媒介死滅応答を増幅する。

0107

企図される他の二量体化系は、クーママイシン/DNAジャイレースB系を含む。クーママイシン誘発二量体化は、修飾Rafタンパク質を活性化し、MAPキナーゼカスケードを刺激する。Farrarら、1996年を参照されたい。

0108

D.膜ターゲティング
膜ターゲティング配列は、細胞膜へのキメラタンパク質の輸送をもたらし、同じまたは他の配列が、細胞膜へのキメラタンパク質の結合をコードすることができる。細胞膜と結合する分子は、膜結合を促進する、ある種の領域を含有し、そのような領域は、膜ターゲティング分子を生成するためにキメラタンパク質分子の中に組み込むことができる。例えば、いくつかのタンパク質は、アシル化されるN末端またはC末端の配列を含有し、これらのアシル成分は、膜結合を促進する。そのような配列は、アシルトランスフェラーゼによって認識され、多くの場合、特定の配列モチーフと一致する。ある種のアシル化モチーフは、単一アシル成分(その後、陰イオン脂質頭部の基との結合を改善するためのいくつかの正荷電残基が続くことが多い

0109

)を用いて修飾ことができ、他のものは、多数のアシル成分を用いて修飾することができる。例えば、タンパク質チロシンキナーゼSrcのN末端配列は、単一のミリストイル成分を含むことができる。二重のアシル化領域は、Srcファミリーメンバーのサブセット(例えばYes、Fyn、Lck)およびG−タンパク質アルファサブユニットなどのようなある種のプロテインキナーゼのN末端領域内に位置する。そのような二重のアシル化領域は、多くの場合、そのようなタンパク質の最初の18アミノ酸内に位置し、配列モチーフ、Met−Gly−Cys−Xaa−Cysに一致し、Metは、切断され、Glyは、N−アシル化され、一方のCys残基は、S−アシル化される。Glyは、多くの場合、ミリストイル化され、Cysは、パルミトイル化することができる。G−タンパク質ガンマサブユニットおよび他のタンパク質のC末端由来のC15またはC10イソプレニル成分を用いて修飾することができる配列モチーフCys−Ala−Ala−Xaa(いわゆる「CAAXボックス」)に一致するアシル化領域(例えばワールドワイドウェブアドレスebi.ac.uk/interpro/DisplayIproEntry?ac=IPR001230)もまた、利用することができる。これらおよび他のアシル化モチーフは、当業者に公知であり(例えばGauthier−Campbellら、Molecular Biology of the Cell 15巻:2205〜2217頁(2004年);Glabatiら、Biochem. J. 303巻:697〜700頁(1994年)、およびZlakineら、J. Cell Science 110巻:673〜679頁(1997年))、膜局在化を誘発するためにキメラ分子中に組み込むことができる。ある実施形態では、アシル化モチーフを含有するタンパク質由来の本来の配列は、キメラタンパク質の中に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態では、そのようなタンパク質由来の最初の25N−末端アミノ酸以下のアミノ酸(例えば、任意の突然変異を有する本来の配列の約5〜約20アミノ酸、約10〜約19アミノ酸、または約15〜約19アミノ酸)などのような、Lck、Fyn、もしくはYesまたはG−タンパク質アルファサブユニットのN末端部分は、キメラタンパク質のN末端内に組み込まれてもよい。ある実施形態では、CAAXボックスモチーフ配列を含有するG−タンパク質ガンマサブユニット由来の約25アミノ酸以下のアミノ酸(例えば、任意の突然変異を有する本来の配列の約5〜約20アミノ酸、約10〜約18アミノ酸、または約15〜約18アミノ酸)のC末端配列は、キメラタンパク質のC末端に連結することができる。

0110

いくつかの実施形態では、アシル成分は、+1〜+6の対数p値を有し、時に、+3〜+4.5の対数p値を有する。対数p値は、疎水性の指標であり、多くの場合、オクタノール/水分配研究に由来し、より高い度数での、オクタノールの中へのより高い疎水性分配を有する分子は、より高い対数p値を有すると特徴付けられる。対数p値は、多くの親油性分子について公開されており、対数p値は、公知の分配プロセスを使用して計算することができる(例えばChemical Reviews、71巻、6号、599頁、エントリー4493は、4.2の対数p値を有するラウリン酸を示す)。任意のアシル成分は、上記に記載されるペプチド組成物に連結することができ、公知の方法および以下に記載されるものを使用して、抗菌活性について試験することができる。アシル成分は、時に、例えばC1〜C20アルキル、C2〜C20アルケニル、C2〜C20アルキニル、C3〜C6シクロアルキル(cyclalkyl)C1〜C4ハロアルキル、C4〜C12シクロアルキルアルキル(cyclalkylalkyl)、アリール置換アリール、またはアリール(C1〜C4)アルキルである。任意のアシル含有成分は、時に、脂肪酸であり、脂肪酸成分の例は、プロピル(C3)、ブチル(C4)、ペンチル(C5)、ヘキシル(C6)、ヘプチル(C7)、オクチル(C8)、ノニル(C9)、デシル(C10)、ウンデシル(C11)、ラウリル(C12)、ミリスチル(C14)、パルミチル(C16)、ステアリル(C18)、アラキジル(C20)、ベヘニル(C22)、およびリグセリル成分(C24)であり、それぞれの成分は、0、1、2、3、4、5、6、7、または8つの不飽和(つまり二重結合)を含有することができる。アシル成分は、時に、ホスファチジル脂質(例えばホスファチジルセリンホスファチジルイノシトールホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン)、スフィンゴ脂質(例えばスフィンゴミエリン(shingomyelin)、スフィンゴシンセラミドガングリオシドセレブロシド)、またはその修飾バージョンなどのような脂質分子である。ある実施形態では、1、2、3、4、または5以上のアシル成分は、膜結合領域に連結される。

0111

本明細書におけるキメラタンパク質はまた、単一通過または複数回通過膜貫通配列を含んでいてもよい(例えばキメラタンパク質のN末端またはC末端に)。単一通過膜貫通領域は、ある種のCD分子チロシンキナーゼ受容体セリントレオニンキナーゼ受容体、TGFベータ、BMP、アクチビン、およびホスファターゼにおいて見つけられる。単一通過膜貫通領域は、多くの場合、約20〜約25アミノ酸のシグナルペプチド領域および膜貫通領域を含み、これらの多くは、疎水性アミノ酸であり、αヘリックスを形成する。正荷電アミノ酸の短いトラックは、多くの場合、膜中にタンパク質を固着させるために膜貫通スパンに続く。複数回通過タンパク質は、イオンポンプイオンチャネル、および輸送体を含み、複数回、膜をわたる2つ以上のヘリックスを含む。すべてまたは実質的にすべての複数回通過タンパク質は、時に、キメラタンパク質中に組み込まれる。単一通過および複数回通過膜貫通領域についての配列は、公知であり、当業者によって、キメラタンパク質分子の中への組み込みのために選択することができる。

0112

宿主において機能的であり、キメラタンパク質の他のドメインの1つと結合していてもよいまたは結合していなくてもよい任意の膜ターゲティング配列を、用いることができる。いくつかの実施形態では、そのような配列は、ミリストイル化ターゲティング配列、パルミトイル化ターゲティング配列、プレニル化配列(つまりファルネシル化ゲラニル−ゲラニル化(geranylation)、CAAXボックス)、タンパク質−タンパク質相互作用モチーフ、または受容体由来の膜貫通配列(シグナルペプチドを利用する)を含むが、これらに限定されない。例として、例えばten Klooster JPら、Biology of the Cell(2007年)99巻、1〜12頁、Vincent, S.ら、Nature Biotechnology 21巻:936〜40頁、1098頁(2003年)において記載されるものを含む。

0113

様々な膜でタンパク質保持を増加させることができるさらなるタンパク質ドメインが存在する。例えば、約120アミノ酸プレクストリン相同性(PH)ドメインは、典型的に細胞内シグナル伝達に関与する200以上のヒトタンパク質中に見つけられる。PHドメインは、膜内の様々なホスファチジルイノシトール(PI)脂質に結合することができ(例えばPI(3,4,5)−P3、PI(3,4)−P2、PI(4,5)−P2)、したがって、異なる膜または細胞コンパートメントにタンパク質を動員する際に重要な役割を果たす。多くの場合、PI脂質のリン酸化状態は、PI−3キナーゼまたはPTENによってなどのように、調節され、したがって、PHドメインとの膜の相互作用は、アシル脂質によるものほど安定していない。

0114

E.選択可能マーカー
ある実施形態では、発現構築物は、発現が、発現構築物中にマーカーを含むことによってin vitroまたはin vivoにおいて同定される核酸構築物を含有する。そのようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を与え、発現構築物を含有する細胞の簡単な同定を可能にするであろう。通常、薬剤選択マーカーの包含は、クローニングおよび形質転換体の選択を支援する。例えば、ネオマイシンピューロマイシンハイグロマイシン、DHFR、GPT、zeocin、およびヒスチジノールに対する抵抗性を与える遺伝子は、有用な選択可能マーカーである。その代わりに、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(tk)などのような酵素が用いられる。細胞外非シグナル伝達ドメインまたは様々なタンパク質(例えばCD34、CD19、LNGFR)を含有する免疫性表面マーカーもまた、用いることができ、磁気または蛍光抗体媒介ソーティングのための簡単な方法を可能にする。用いられる選択可能マーカーは、それが、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現させることができる限り、重要であると考えられない。さらなる選択可能マーカーの例は、当業者に周知であり、EGFP、ベータ−gal、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT)などのようなレポーターを含む。

0115

F.制御領域
1.プロモーター
対象のポリヌクレオチド配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、それが標的細胞においてポリヌクレオチドの発現を指示することができる限り、重要であると考えられない。したがって、ヒト細胞が標的とされる場合、ポリヌクレオチド配列コード領域を、ヒト細胞において発現することができるプロモーターに隣接して、プロモーターの制御下に位置づけることが好ましいかもしれない。概して言えば、そのようなプロモーターは、ヒトまたはウイルスプロモーターを含んでいてもよい。

0116

様々な実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)前初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、β−アクチン、ラットインスリンプロモーター、およびグリセリンアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼは、対象のコード配列の高レベルの発現を得るために使用することができる。対象のコード配列の発現を達成するための、当技術分野において周知の他のウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージプロモーターの使用は、同様に企図される、ただし、発現のレベルが所与の目的に十分であることを条件とする。周知の特性を有するプロモーターを用いることによって、トランスフェクションまたは形質転換後の対象のタンパク質の発現のレベルおよびパターンは、最適化することができる。

0117

特異的な生理的または合成シグナルに応じて調節されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘発性発現を可能にすることができる。例えば、多重シストロン(multicistronic)ベクターが利用される場合の導入遺伝子(複数可)の発現が ベクターが産生される細胞に対して毒性である場合、1つまたは複数の導入遺伝子の発現を妨げ、または低下させることは望ましい。プロデューサー細胞株に対して毒性である導入遺伝子の例は、アポトーシス促進性およびサイトカイン遺伝子である。いくつかの誘発性プロモーター系は、導入遺伝子産物が毒性であるウイルスベクターの産生のために利用可能である(より誘発性のプロモーター中に追加)。

0118

エクジソン系(Invitrogen、Carlsbad、CA)は、1つのそのような系である。この系は、哺乳動物細胞における対象の遺伝子の発現の調節を可能にするように設計される。それは、200倍の誘導性を超えるが、事実上、導入遺伝子の基本レベルの発現を可能にしない、緻密に調節される発現メカニズムから成る。系は、Drosophilaのヘテロ二量体エクジソン受容体に基づき、エクジソンまたはムリステロンAなどのようなアナログが受容体に結合する場合、受容体は、プロモーターを活性化して、下流導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのmRNAの転写が達成される。この系では、ヘテロ二量体受容体の両方の単量体は、1つのベクターから恒常的に発現されるのに対して、対象の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、他のプラスミド上にある。そのため、対象の遺伝子移入ベクターの中へのこのタイプの系の操作は、有用であろう。プロデューサー細胞株における、対象の遺伝子および受容体単量体を含有するプラスミドの同時トランスフェクションは、次いで、潜在的に毒性の導入遺伝子の発現を伴わないで遺伝子移入ベクターの産生を可能にするであろう。適切な時に、導入遺伝子の発現は、エクジソンまたはムリステロン(muristeron)Aを用いて活性化することができる。

0119

有用であろう他の誘発性系は、もともとGossenおよびBujardによって開発されたTet−Off(商標)またはTet−On(商標)系(Clontech、Palo Alto、CA)である(GossenおよびBujard、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻:5547〜5551頁、1992年;Gossenら、Science、268巻:1766〜1769頁、1995年)。この系もまた、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどのようなテトラサイクリン誘導体に応じて高レベルの遺伝子発現が調節されることを可能にする。Tet−On(商標)系では、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの存在下においてオンにされるのに対して、Tet−Off(商標)系において、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの非存在下においてオンにされる。これらの系は、E. coliのテトラサイクリン抵抗性オペロンに由来する2つの調節エレメントに基づく。テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリンオペレーター配列およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質。対象の遺伝子は、その中に存在するテトラサイクリン応答性のエレメントを有するプロモーターの後に、プラスミドの中にクローニングされる。第2のプラスミドは、テトラサイクリン制御トランス活性化因子と呼ばれる調節エレメントを含有し、これは、Tet−Off(商標)系において、単純ヘルペスウイルス由来のVP16ドメインおよび野生型テトラサイクリン(tertracycline)リプレッサーから構成される。したがって、ドキシサイクリンの非存在下において、転写は、恒常的にオンの状態である。Tet−On(商標)系において、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型ではなく、ドキシサイクリンの存在下において、転写を活性化する。遺伝子療法ベクター産生のために、Tet−Off(商標)系は、プロデューサー細胞が、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下において成長し、潜在的に毒性の導入遺伝子の発現を予防することができるが、ベクターが患者に導入された場合、遺伝子発現が恒常的にオンの状態となるように使用されてもよい。

0120

いくつかの環境では、遺伝子療法ベクターにおいて導入遺伝子の発現を調節することは望ましい。例えば、様々な強さの活性を有する異なるウイルスプロモーターは、所望の発現のレベルに依存して利用される。哺乳動物細胞では、CMV前初期プロモーターは、多くの場合、強力な転写活性化をもたらすために使用される。CMVプロモーターは、Donnelly, J.J.ら、1997年 Annu. Rev. Immunol.. 15巻:617〜48頁において考察されている。それほど強力でない、CMVプロモーターの修正バージョンもまた、導入遺伝子の発現のレベルの低下が所望の場合、使用されてきた。造血細胞における導入遺伝子の発現が所望の場合、MLVまたはMMTV由来のLTRなどのようなレトロウイルスプロモーターが、多くの場合、使用される。所望の結果に依存して使用される他のウイルスプロモーターは、SV40、RSVLTR、HIV−1およびHIV−2 LTR、E1A、E2A、またはMLP領域などに由来するアデノウイルスプロモーター、AAV LTR、HSV−TK、ならびにトリ肉腫ウイルスを含む。

0121

同様に、組織特異的プロモーターは、非標的組織に対する潜在的な毒性または望ましくない影響を低下させるために特異的な組織または細胞において転写を達成するために使用される。これらのプロモーターは、CMVプロモーターなどのような、より強力なプロモーターと比較して、発現の低下をもたらしてもよいが、また、より限られた発現および免疫原性をもたらしてもよい(Bojak, A.ら、2002年 Vaccine. 20巻:1975〜79頁;Cazeaux., N.ら、2002年 Vaccine 20巻:3322〜31頁)。例えば、PSA関連プロモーターもしくは前立腺特異的腺性カリクレインまたは筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子などのような組織特異的プロモーターは、適切な場合、使用されてもよい。

0122

ある種の適用では、遺伝子療法ベクターの投与の後の特定の時に転写を活性化することが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカイン調節可能なものなどのようなプロモーターを用いて行われる。使用することができるサイトカインおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターはKおよびTキニノーゲン(Kageyamaら、(1987年)J. Biol. Chem.、262巻、2345〜2351頁)、c−fos、TNF−アルファ、C−反応性タンパク質(Arconeら、(1988年)Nucl. AcidsRes.、16巻(8号)、3195〜3207頁)、ハプトグロビン(Olivieroら、(1987年)EMBO J.、6巻、1905〜1912頁)、血清アミロイドA2、C/EBPアルファ、IL−1、IL−6(PoliおよびCortese、(1989年)Proc. Nat’l Acad. Sci. USA、86巻、8202〜8206頁)、補体C3(Wilsonら、(1990年)Mol. Cell. Biol.、6181〜6191頁)、IL−8およびアルファ−1酸性糖タンパク質(ProwseおよびBaumann、(1988年)Mol Cell Biol、8巻、42〜51頁)、アルファ−1抗トリプシンリポタンパク質リパーゼ(Zechnerら、Mol. Cell. Biol.、2394〜2401頁、1988年)アンギオテンシノゲン(Ronら、(1991年)Mol. Cell. Biol.、2887〜2895頁)、フィブリノーゲン、c−jun(ホルボールエステル、TNF−アルファ、UV照射レチノイン酸、および過酸化水素によって誘発性)、コラゲナーゼ(ホルボールエステルおよびレチノイン酸によって誘発される)、メタロチオネイン重金属およびグルココルチコイド誘発性)、ストロメライシン(ホルボールエステル、インターロイキン−1、およびEGFによって誘発性)、アルファ−2マクログロブリン、ならびにアルファ−1抗キモトリプシンを含む。他のプロモーターは、例えば、SV40、MMTV、ヒト免疫不全ウイルス(MV)、モロニーウイルス、ALV、エプスタインバーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシンヘモグロビン、およびクレアチンを含む。

0123

上記のプロモーターのいずれも、単独でまたは他のものと組み合わせて、所望の作用に依存して有用となり得ることが認識される。プロモーターおよび他の調節エレメントは、それらが所望の細胞または組織において機能的となるように、当業者らによって選択される。さらに、プロモーターのこの列挙は、網羅的なまたは限定するものとして解釈されるべきでなく、当業者らは、本明細書において開示されるプロモーターおよび方法と共に使用される他のプロモーターを知っているであろう。

0124

2.エンハンサー
エンハンサーは、DNAの同じ分子上の離れた位置に配置される、プロモーターからの転写を増加させる遺伝エレメントである。以前の例は、共に、コード配列の側面に位置し、いくつかのイントロン内に生じる、免疫グロブリンおよびT細胞受容体と関連するエンハンサーを含む。CMV、SV40、およびレトロウイルスLTRなどのような多くのウイルスプロモーターは、エンハンサー活性と密接に関連し、多くの場合、単一エレメントのように処理される。エンハンサーは、プロモーターのように非常に組織化されている。すなわち、それらは、多くの個々のエレメントから構成され、これらのそれぞれは、1つまたは複数の転写タンパク質に結合する。エンハンサーおよびプロモーターの基本的な特徴は、使用可能である。エンハンサー領域は、全体として、離れておよび多くの場合、方向づけと無関係に転写を刺激することができなければならず、これは、プロモーター領域またはその成分エレメントに当てはまる必要はない。他方では、プロモーターは、特定の部位でおよび特定の方向づけでRNA合成の開始を指示する1つまたは複数のエレメントを有していなければならないが、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、多くの場合、重複し、近接しており、多くの場合、非常に類似するモジュール構造を有するように思われる。エンハンサーのサブセットは、ゲノムの中に統合された場合、転写活性を増加させることができるだけでなく、(インスレーターエレメントを用いて)隣接配列由来の転写エレメント遮断するのを支援することができる、座制御領域(LCR)である。

0125

任意のプロモーター/エンハンサー組合せ真核生物プロモーターデータベースEPDBにより)は、多くが、特定の組織型または組織のサブセットに発現を限るが、遺伝子の発現を駆動するために使用することができる(例えばKutzler, M.A.およびWeiner, D.B.、2008年 Nature Reviews Genetics 9巻:776〜88頁において考察されている)。例として、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、筋肉クレアチンキナーゼ配列由来のならびにウイルスCMV、RSV、およびEBV由来のエンハンサーを含むが、これらに限定されない。当業者らは、特定の適用に適切なエンハンサーを選択することができるであろう。真核細胞は、送達複合体の一部としてまたはさらなる遺伝子発現構築物として適切な細菌ポリメラーゼが提供される場合、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持することができる。

0126

3.ポリアデニル化シグナル
cDNA挿入物が用いられる場合、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を達成するためのポリアデニル化シグナルを含むことが典型的に望まれるであろう。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の方法の実施の成功にとって重大であると考えられず、ヒトまたはウシ成長ホルモンおよびSV40ポリアデニル化シグナルおよびLTRポリアデニル化シグナルなどのような任意のそのような配列が用いられる。非限定的な1つの例は、pCEP3プラスミド中に存在するSV40ポリアデニル化シグナルである(Invitrogen、Carlsbad、California)。ターミネーターもまた、発現カセットのエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強し、かつカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするように果たし得る。終止またはポリ(A)シグナル配列は、例えば、mRNAの3’末端保存配列(AAUAAA)から約11〜30ヌクレオチド下流に位置づけられてもよい(Montgomery, D.L.ら、1993年 DNA Cell Biol. 12巻:777〜83頁;Kutzler, M.A.およびWeiner, D.B.、2008年 Nature Rev. Gen. 9巻:776〜88頁)。

0127

4.開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特異的な開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳のために必要とされてもよい。これらのシグナルは、ATG開始コドンまたは隣接配列を含む。ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供される必要があってもよい。当業者は、これを容易に決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと共に、インフレームでなければならないことが周知である。外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然または合成のものとすることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントの包含によって増強されてもよい。

0128

ある実施形態では、内部リボソーム進入部位(IRES)エレメントの使用は、多重遺伝子または多シストロン性メッセージを作るために使用される。IRESエレメントは、5’メチル化キャップ依存的翻訳のリボソームスキャニングモデルを回避し、内部部位で翻訳を始めることができる(PelletierおよびSonenberg、Nature、334巻:320〜325頁、1988年)。ピコルナウイルスファミリーの2つのメンバー由来のIRESエレメント(polioおよびencephalomyocarditis)(PelletierおよびSonenberg、1988年)、加えて、哺乳動物メッセージ由来のIRES(MacejakおよびSarnow、Nature、353巻:90〜94頁、1991年)が記載されている。IRESエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。多数のオープンリーディングフレームは、共に転写することができ、それぞれがIRESによって分離され、多シストロン性伝令RNAを作る。IRESエレメントによって、それぞれのオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに到達できる。多数の遺伝子は、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター/エンハンサーを使用して効率的に発現することができる(米国特許第5,925,565号および第5,935,819号を参照されたい。それぞれが、参照によって本明細書において組み込まれる)。

0129

G.配列最適化
タンパク質産生はまた、導入遺伝子中のコドンを最適化することによって増加されてもよい。当業者らに公知の種特異的コドン変化は、タンパク質産生を増加させるために使用されてもよい。また、コドンは、最適化されたRNAを産生するために最適化されてもよく、これは、より効率的な翻訳をもたらしてもよい。RNA中に組み込まれることとなるコドンを最適化することによって、不安定性を引き起こす二次構造をもたらすものなどのようなエレメント、例えばリボソーム結合を阻害し得る二次mRNA構造、またはmRNAの核外輸送を阻害し得る潜在性配列を除去することができる(Kutzler, M.A.およびWeiner, D.B.、2008年 Nature Rev. Gen. 9巻:776〜88頁;Yan., J.ら、2007年 Mol. Ther. 15巻:411〜21頁;Cheung, Y.K.ら、2004年 Vaccine 23巻:629〜38頁;Narum., D.L.ら、2001年 69巻:7250〜55頁;Yadava, A.およびOckenhouse, C.F.、2003年 Infect. Immun. 71巻:4962〜69頁;Smith., J.M.ら、2004年AIDS Res. Hum. Retroviruses 20巻:1335〜47頁;Zhou, W.ら、2002年 Vet. Microbiol. 88巻:127〜51頁;Wu, X.ら、2004年 Biochem. Biophys. Res. Commun. 313巻:89〜96頁;Zhang, W.ら、2006年 Biochem. Biophys. Res. Commun. 349巻:69〜78頁;Deml, L.A.ら、2001年 J. Virol. 75巻:1099〜11001頁;Schneider, R. M.ら、1997年 J. Virol. 71巻:4892〜4903頁;Wang, S.D.ら、2006年 Vaccine 24巻:4531〜40頁;zur Megede, J.ら、2000年 J. Virol. 74巻:2628〜2635頁)。

0130

H.リーダー配列
リーダー配列は、mRNAの安定性を増強し、より効率的な翻訳をもたらすために、当業者らに公知のものとして、追加されてもよい。リーダー配列は、小胞体にmRNAを向けることに通常、関与する。例として、それ自体の切断を遅らせる、HIV−1外被糖タンパク質(Env)のためのシグナル配列およびIgE遺伝子リーダー配列を含む(Kutzler, M.A.およびWeiner, D.B.、2008年 Nature Rev. Gen. 9巻:776〜88頁;Li, V.ら、 2000年 Virology 272巻:417〜28頁;Xu, Z.L.ら 2001年 Gene 272巻:149〜56頁;Malin, A.S.ら、2000年 Microbes Infect. 2巻:1677〜85頁;Kutzler, M.A.ら、2005年 J. Immunol. 175巻:112〜125頁;Yang., J.S.ら、2002年 Emerg. Infect. Dis. 8巻:1379〜84頁;Kumar., S.ら、2006年 DNA Cell Biol. 25巻:383〜92頁;Wang, S.ら、2006年 Vaccine 24巻:4531〜40頁)。IgEリーダーは、小胞体の中への挿入を増強するために使用されてもよい(Tepler, Iら(1989年)J. Biol. Chem. 264巻:5912頁)。

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