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技術 タンパク質キナーゼ阻害剤としての化合物および組成物

出願人 アイアールエム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー
発明者 ピエール-イヴ・ミシェリーペイ・ウェイトーマス・エイチ・マーシルジェウェンシュオ・ルチェン・ベイ宇野哲郎ジン・ユンホジアン・タオ
出願日 2012年7月6日 (8年4ヶ月経過) 出願番号 2012-152703
公開日 2012年11月22日 (8年0ヶ月経過) 公開番号 2012-229240
状態 特許登録済
技術分野 ピリジン系化合物 窒素含有縮合複素環(3) 化合物または医薬の治療活性 複数複素環系化合物 プリン,テリジン系化合物 その他のN系縮合複素環1 その他のN系縮合複素環2 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 1,3-ジアジン系化合物
主要キーワード フィルム状物質 ピンヘッド 炭酸水素アルカリ金属塩 アウトサイド 水酸化アルカリ金属塩 ARPA アニオン交換反応 長鎖飽和脂肪酸
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重要な関連分野

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課題

未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)活性接着斑キナーゼ(FAK)、ゼータ鎖関連タンパク質キナーゼ70(ZAP-70)、インシュリン様増殖因子(IGF-1R)またはその組み合わせの阻害応答する状態を処置し、寛解させ、または予防するため、新規化合物およびその医薬組成物、および該化合物の使用方法の提供。

解決手段

新規の式(I):のピリミジンおよびピリジン誘導体

概要

背景

背景技術
未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)は、受容体チロシンキナーゼインシュリン受容体スーパーファミリーメンバーであり、造血器腫瘍および非造血器腫瘍における発癌に関係している。神経芽細胞腫および神経膠芽腫において全長ALK受容体タンパク質の異常発現報告されており、未分化大細胞リンパ腫においてALK融合タンパク質が生じる。ALK融合タンパク質の研究はまた、ALK陽性悪性腫瘍を有する患者のための新規治療的処置の可能性を上昇させる(Pulford et al., Cell. Mol. Life Sci. 61:2939-2953 (2004))。

接着斑キナーゼ(FAK)は、インテグリン介在アウトサイドインシグナルカスケード(integrin-mediated outside-in signal cascade)において、重要な酵素である(D. Schlaepfer et al., Prog Biophys Mol Biol 1999, 71, 43578)。シグナル伝達カスケードトリガーは、Y397の自己リン酸化である。リン酸化されたY397は、SrcファミリーチロシンキナーゼのためのSH2ドッキング部位である;結合されたc-Srcキナーゼは、FAK中の他のチロシン残基をリン酸化する。これらのうち、リン酸化されたY925は、Grb2小アダプタータンパク質のSH2部位のための結合部位となる。Grb2のFAKへの直接結合は、下流の標的、例えばRas-ERK2/MAPキナーゼ・カスケードの活性化のための重要な段階の一つである。

ゼータ鎖関連タンパク質キナーゼ70 (ZAP-70)は、タンパク質チロシンキナーゼファミリーのメンバーであり、慢性リンパ球性白血病(CLL)において、予後に重要である可能性がある。ZAP-70は、T細胞およびNK細胞シグナル伝達において重要であることが知られているが、正常な末梢B細胞には存在せず、予後不良な未変異のCLLの多数において発現され、変異されたIgVH遺伝子を有するほとんどの症例では存在しない。ZAP-70はまた、他のB細胞腫瘍少数で発現される(Orchard et al., Leuk. Lymphoma 46:1689-98 (2005))。

インシュリン様増殖因子(IGF-1)シグナルは、IGF-1受容体(IGF-1R)が支配的な要素である癌に大きく関係している。IGR-1Rは、腫瘍形質転換および悪性細胞生存に重要であるが、正常な細胞増殖にも一部だが関係している。IGF-1Rの標的は、癌治療のための見込みのある選択肢であることを示唆している (Larsson et al., Br. J. Cancer 92:2097-2101 (2005))。

概要

未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)活性、接着斑キナーゼ(FAK)、ゼータ鎖関連タンパク質キナーゼ70(ZAP-70)、インシュリン様増殖因子(IGF-1R)またはその組み合わせの阻害応答する状態を処置し、寛解させ、または予防するため、新規化合物およびその医薬組成物、および該化合物の使用方法の提供。新規の式(I):のピリミジンおよびピリジン誘導体。なし

目的

本発明は、式(1)、(2)、(3A)、(3B)、(4A)、(4B)または(5)を有する化合物、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

式(1)で示される化合物:[式中、Wは、であり;A1およびA4は、独立してCであり;A2およびA3はそれぞれCであり;R1およびR2は、一体となって、所望により置換されている5〜6員のアリール、または、1〜3個の窒素原子を含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環を形成し;R3は、(CR2)0−2SO2R12、(CR2)0−2SO2NRR12、(CR2)0−2C(O)O0−1R12、(CR2)0−2CONRR12、CO2NH2またはシアノであり;R4、R7およびR10は、独立してHであり;R、R5およびR5'は、独立して、HまたはC1−6アルキルであり;R6は、ハロまたはO(C1−6アルキル)であり;R8およびR9は、独立して、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル、ハロまたはXであるか、あるいは、R8およびR9の一方がHであり;ただし、R8およびR9の一方がXであり;Xは、(CR2)qY、シアノ、C(O)O0−1R12、CONR(R12)、CONR(CR2)pNR(R12)、CONR(CR2)pOR12、CONR(CR2)pSR12、CONR(CR2)pS(O)1−2R12、または(CR2)1−6NR(CR2)pOR12であり;Yは、所望により置換されている3〜12員の炭素環式環、5〜12員のアリール、または、N、Oおよび/またはSを含み、かつ(CR2)qYにおけるqが0であるときヘテロアリールまたはヘテロ環式環の炭素原子を介してA2またはA3またはこれらの両方に結合している5〜12員のヘテロアリールまたはヘテロ環式環であり;R12は、所望により置換されている3〜7員の飽和または部分的に不飽和の炭素環式環、または、N、Oおよび/またはSを含む5〜7員のヘテロ環式環;アリールまたはヘテロアリールであるか;あるいは、R12は、H、C1−6アルキルであり;nは0であり;そしてpおよびqは、独立して、0〜4である。]、またはその薬学的に許容される塩。

請求項2

R3が、SO2R12、SO2NH2、SO2NRR12、CO2NH2、CONRR12、C(O)O0−1R12、またはシアノであり;およびR12が、C1−6アルキル、所望により置換されているC3−7シクロアルキル、C3−7シクロアルケニルピロリジニルピペラジニルピペリジニル、またはモルホリニルである、請求項1に記載された化合物またはその薬学的に許容される塩。

請求項3

当該化合物が次に示す化合物からなる群から選択される、請求項1に記載された化合物:またはその薬学的に許容される塩。

請求項4

当該化合物が次に示す化合物からなる群から選択される、請求項1に記載された化合物:またはその薬学的に許容される塩。

請求項5

当該化合物が次に示す化合物からなる群から選択される、請求項1に記載された化合物:またはその薬学的に許容される塩。

請求項6

N6−(4−(1−エチルピペリジン−4−イル)−2−イソプロポキシ−5−メチルフェニル)−N4−(2−(イソプロピルスルホニルフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4,6−ジアミンである、請求項1に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

請求項7

N6−(2−イソプロポキシ−5−メチル−4−(1−メチルピペリジン−4−イル)フェニル)−N4−(2−(イソプロピルスルホニル)フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4,6−ジアミンである、請求項1に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

請求項8

請求項1〜7の何れか1項に記載された化合物またはその薬学的に許容される塩、および化学療法薬を含む、組合せ。

技術分野

0001

関連出願の相互引用
本出願は、米国仮特許出願第60/869,299号(2006年12月8日出願)(言及することによって、その全体が本明細書に組み込まれる)の利益を主張している。

0002

技術分野
本発明は、タンパク質キナーゼ阻害剤、より特定的には新規ピリミジンおよびピリジン誘導体およびその医薬組成物、および医薬としてのその使用に関する。

背景技術

0003

背景技術
未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)は、受容体チロシンキナーゼインシュリン受容体スーパーファミリーメンバーであり、造血器腫瘍および非造血器腫瘍における発癌に関係している。神経芽細胞腫および神経膠芽腫において全長ALK受容体タンパク質の異常発現報告されており、未分化大細胞リンパ腫においてALK融合タンパク質が生じる。ALK融合タンパク質の研究はまた、ALK陽性悪性腫瘍を有する患者のための新規の治療的処置の可能性を上昇させる(Pulford et al., Cell. Mol. Life Sci. 61:2939-2953 (2004))。

0004

接着斑キナーゼ(FAK)は、インテグリン介在アウトサイドインシグナルカスケード(integrin-mediated outside-in signal cascade)において、重要な酵素である(D. Schlaepfer et al., Prog Biophys Mol Biol 1999, 71, 43578)。シグナル伝達カスケードトリガーは、Y397の自己リン酸化である。リン酸化されたY397は、SrcファミリーチロシンキナーゼのためのSH2ドッキング部位である;結合されたc-Srcキナーゼは、FAK中の他のチロシン残基をリン酸化する。これらのうち、リン酸化されたY925は、Grb2小アダプタータンパク質のSH2部位のための結合部位となる。Grb2のFAKへの直接結合は、下流の標的、例えばRas-ERK2/MAPキナーゼ・カスケードの活性化のための重要な段階の一つである。

0005

ゼータ鎖関連タンパク質キナーゼ70 (ZAP-70)は、タンパク質チロシンキナーゼファミリーのメンバーであり、慢性リンパ球性白血病(CLL)において、予後に重要である可能性がある。ZAP-70は、T細胞およびNK細胞シグナル伝達において重要であることが知られているが、正常な末梢B細胞には存在せず、予後不良な未変異のCLLの多数において発現され、変異されたIgVH遺伝子を有するほとんどの症例では存在しない。ZAP-70はまた、他のB細胞腫瘍少数で発現される(Orchard et al., Leuk. Lymphoma 46:1689-98 (2005))。

0006

インシュリン様増殖因子(IGF-1)シグナルは、IGF-1受容体(IGF-1R)が支配的な要素である癌に大きく関係している。IGR-1Rは、腫瘍形質転換および悪性細胞生存に重要であるが、正常な細胞増殖にも一部だが関係している。IGF-1Rの標的は、癌治療のための見込みのある選択肢であることを示唆している (Larsson et al., Br. J. Cancer 92:2097-2101 (2005))。

先行技術

0007

Pulford et al., Cell. Mol. Life Sci. 61:2939-2953 (2004)
D. Schlaepfer et al., Prog Biophys Mol Biol 1999, 71, 43578
Orchard et al., Leuk. Lymphoma 46:1689-98 (2005)
Larsson et al., Br. J. Cancer 92:2097-2101 (2005)

発明が解決しようとする課題

0008

明らかになったALK、FAK、ZAP-70およびIGF-1Rの疾患に関連する役割のために、ALK、FAK、ZAP-70および/またはIGF-1Rの阻害応答する疾患を処置するおよび予防するのに有用である化合物について、継続的な要請がある。

課題を解決するための手段

0009

本発明の開示
本発明は、新規のピリミジンおよびピリジン誘導体、その医薬組成物、および医薬としてのその使用に関する。

0010

一つの態様において、本発明は、式(1):



[式中、
Wは、



であり;
A1およびA4は、独立して、CまたはNであり;
A2およびA3はそれぞれCであるか、あるいは、R6およびR7が環を形成するときA2およびA3の一方がNであり;
BおよびCは、独立して、所望により置換されている5〜7員の炭素環式環アリール、N、OもしくはSを含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環であり;
Z1、Z2およびZ3は、独立して、NR11、C=O、CR−OR、(CR2)1−2または=C−R12であり;
R1およびR2は、独立して、ハロ、OR12、NR(R12)、SR12、または所望により置換されているC1−6アルキル、C2−6アルケニルまたはC2−6アルキニルであるか、あるいは、R1およびR2の一方がHであり;
R3は、(CR2)0−2SO2R12、(CR2)0−2SO2NRR12、(CR2)0−2CO1−2R12、(CR2)0−2CONRR12またはシアノであり;
R4、R6、R7およびR10は、独立して、所望により置換されているC1−6アルキル、C2−6アルケニルまたはC2−6アルキニル;OR12、NR(R12)、ハロ、ニトロ、SO2R12、(CR2)pR13またはXであるか、あるいは、R4、R7およびR10は、独立してHであり;
R、R5およびR5'は、独立して、HまたはC1−6アルキルであり;
R8およびR9は、独立して、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル、ハロまたはXであるか、あるいは、R1およびR2が環を形成するときR8およびR9の一方がHであり;ただし、R8およびR9の一方がXであり;
あるいは、炭素原子に結合しているとき、R1およびR2、またはR6およびR7、R7およびR8、またはR9およびR10は、所望により置換されている5〜7員の単環式または縮合炭素環式環、アリール、または、N、Oおよび/またはSを含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環を形成してもよく、あるいは、Nに結合しているとき、R7、R8、R9およびR10は、存在せず;
R11は、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、(CR2)pCO1−2R、(CR2)pOR、(CR2)pR13、(CR2)pNRR12、(CR2)pCONRR12または(CR2)pSO1−2R12であり;
R12およびR13は、独立して、所望により置換されている3〜7員の飽和または部分的に不飽和の炭素環式環、または、N、Oおよび/またはSを含む5〜7員のヘテロ環式環;アリールまたはヘテロアリールであるか;あるいは、R12は、H、C1−6アルキルであり;
Xは、(CR2)qY、シアノ、CO1−2R12、CONR(R12)、CONR(CR2)pNR(R12)、CONR(CR2)pOR12、CONR(CR2)pSR12、CONR(CR2)pS(O)1−2R12、または(CR2)1−6NR(CR2)pOR12であり;
Yは、所望により置換されている3〜12員の炭素環式環、5〜12員のアリール、または、N、Oおよび/またはSを含み、かつ(CR2)qYにおけるqが0であるときヘテロアリールまたはヘテロ環式環の炭素原子を介してA2またはA3またはこれらの両方に結合している5〜12員のヘテロアリールまたはヘテロ環式環であり;
n、pおよびqは、独立して、0〜4である。]
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。

0011

上記の式(1)において、R1は、ハロまたはC1−6アルキルであってもよく;R2は、HまたはNH2であるか;またはR1およびR2は、一体となって、所望により置換されている5〜6員のアリール、または、1〜3個の窒素原子を含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環を形成する。別の例において、式(1)におけるR3は、SO2R12、SO2NH2、SO2NRR12、CO2NH2、CONRR12、CO1−2R12、またはシアノであってもよく;R12は、C1−6アルキル、所望により置換されているC3−7シクロアルキル、C3−7シクロアルケニルピロリジニルピペラジニルピペリジニルモルホリニルまたはアゼチジニルである。さらに別の例において、式(1)におけるR5、R5'、R7およびR10は独立してHであり、nは0である。別の例において、式(1)におけるR6は、ハロまたはOR12であってもよく、R12はC1−6アルキルである。

0012

一つの態様において、本発明は、式(2):



[式中、
R1は、ハロまたはC1−6アルキルであり、
R2は、Hであるか、あるいは
R1およびR2は、一体となって、1個または2個の窒素原子を含む、所望により置換されている5〜6員のヘテロアリールまたはヘテロ環式環を形成し;
R6は、イソプロポキシまたはメトキシであり;
R8およびR9の一方が(CR2)qYであり、他方がC1−6アルキル、シアノ、CO1−2R12、CONR(R12)またはCONR(CR2)pNR(R12)であり;
Yは、所望により置換されているC3−7シクロアルキル、C3−7シクロアルケニル、またはフェニルであるか、あるいは、Yは、ピリジルピラゾリルイソオキサゾリルイミダゾリルチアゾリルベンゾイミダゾリル、ピロリジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、アゼチジニル、ヘプタメチレンイミン、またはオクタメチレンイミンであり、これらはそれぞれ、(CR2)qYにおけるqが0であるとき1個の炭素原子を介して該フェニル環に結合しており;
nは、0〜1であり;
qは、0〜4である。]
を有する化合物を提供する。

0013

上記の式(2)において、R8およびR9の一方が(CR2)qYであってもよく、他方がC1−6アルキルであり;nおよびqは独立して0である。幾つかの例において、Yは、ピロリジニル、ピペリジニル、アゼチジニルである。別の例において、R1はハロまたはC1−6アルキルであり;R2はHである。

0014

別の態様において、本発明は、式(3A)または(3B):



[式中、
BおよびCは、一体となって、



を形成し;
Z1、Z2およびZ3は、一体となって、



またはその互変異性体を形成し;
R1は、ハロまたはC1−6アルキルであり、
R2はHであるか、あるいは、
R1およびR2は、一体となって、所望により置換されている5〜7員の炭素環式環、アリール、または、N、Oおよび/またはSを含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環を形成し;
R6は、イソプロポキシまたはメトキシである。]
を有する化合物を提供する。

0015

上記の(3A)または(3B)において、R11は、それぞれ、(CR2)pCO1−2R、(CR2)pOR、(CR2)pR13、(CR2)pNRR12または(CR2)pCONRR12であってもよく;
RおよびR12は、独立して、HまたはC1−6アルキルであり;
R13は、所望により置換されているピペリジニル、アゼチジル、テトラヒドロピラニルシクロヘキシル、モルホリニル、ピロリジニル、ヘプタメチレンイミン、オクタメチレンイミン、二環式アミンまたはジアミン誘導体キヌクリジン−3−イル、8−メチル−8−アザビシクロ[3.2.1]オクタ−6−イル、または9−メチル−9−アザ−ビシクロ[4.2.1]ノナン−7−イルである。

0016

さらに別の態様において、本発明は、式(4A)または式(4B):



[式中、
R1は、ハロまたはC1−6アルキルであり、
R2はHであるか、あるいは
R1およびR2は、一体となって、所望により置換されている5〜7員の炭素環式環、アリール、または、N、Oおよび/またはSを含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環を形成し;
R6は、イソプロポキシまたはメトキシであり;
B2およびB3は、独立して、所望により置換されている5〜6員のアリールまたはN、OもしくはSを含むヘテロアリールである。]
を有する化合物を提供する。

0017

別の態様において、本発明は、式(5):



[式中、
Wは、



であり;
A1およびA4は、独立して、CまたはNであり;
A2およびA3はそれぞれCであるか、あるいは、R6およびR7が環を形成するときA2およびA3の一方がNであり;
BおよびCは、独立して、所望により置換されている5〜7員の炭素環式環、アリール、N、OもしくはSを含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環であり;
Z1、Z2およびZ3は、独立して、NR11、C=O、CR−OR、(CR2)1−2または=C−R12であり;
R1およびR2は、独立して、ハロ、OR12、NR(R12)、SR12、または所望により置換されているC1−6アルキル、C2−6アルケニルまたはC2−6アルキニルであるか、あるいは、R1およびR2の一方がHであり;
R3は、(CR2)0−2SO2R12、(CR2)0−2SO2NRR12、(CR2)0−2CO1−2R12、(CR2)0−2CONRR12またはシアノであり;
R4、R6、R7およびR10は、1個の炭素原子に結合しているとき、独立して、H、所望により置換されているC1−6アルキル、C2−6アルケニルまたはC2−6アルキニル;OR12、NR(R12)、ハロ、ニトロ、SO2R12、(CR2)pR13またはXであり;ただし、R6およびR7は同時にHではなく;
R、R5およびR5'は、独立して、HまたはC1−6アルキルであり;
R8およびR9は、独立して、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル、ハロまたはXであるか、あるいは、R8およびR9の一方がHであり;ただしR8およびR9の一方がXであり;
あるいは、R1およびR2、または、R6およびR7、R7およびR8、または、R9およびR10が、1個の炭素原子に結合しているとき、所望により置換されている5〜7員の単環式または縮合炭素環式環、アリール、または、N、Oおよび/またはSを含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環を形成してもよく、あるいは、Nに結合しているとき、R7、R8、R9およびR10は、存在せず;
R11は、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、(CR2)pCO1−2R、(CR2)pOR、(CR2)pR13、(CR2)pNRR12、(CR2)pCONRR12または(CR2)pSO1−2R12であり;
R12およびR13は、独立して、所望により置換されている3〜7員の飽和または部分的に不飽和の炭素環式環、または、N、Oおよび/またはSを含む5〜7員のヘテロ環式環;アリールまたはヘテロアリールであるか;あるいは、R12は、H、C1−6アルキルであり;
Xは、(CR2)qY、シアノ、CO1−2R12、CONR(R12)、CONR(CR2)pNR(R12)、CONR(CR2)pOR12、CONR(CR2)pSR12、CONR(CR2)pS(O)1−2R12、または(CR2)1−6NR(CR2)pOR12であり;
Yは、所望により置換されている3〜12員の炭素環式環、5〜12員のアリール,または、N、Oおよび/またはSを含み、かつ(CR2)qYにおいてqが0であるときヘテロアリールまたはヘテロ環式環の炭素原子を介してA2またはA3またはこれらの両方に結合している5〜12員のヘテロアリールまたはヘテロ環式環であり;
n、pおよびqは、独立して、0〜4である。]
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。

0018

さらに別の態様において、本発明は、式(1)、(2)、(3A)、(3B)、(4A)、(4B)または(5)を有する化合物、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

0019

さらに別の態様において、本発明は、ALK、FAK、ZAP-70および/またはIGF-1Rを調節する方法であって、それが必要な系または対象に、治療有効量の式(1)、(2)、(3A)、(3B)、(4A)、(4B)または(5)を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、あるいはその医薬組成物を投与し、それによって当該ALK、FAK、ZAP-70および/またはIGF-1Rを調節する方法を提供する。本発明はまた、ALK、FAK、ZAP-70および/またはIGF-1Rの阻害に応答する状態を処置し、寛解させ、または予防する方法であって、該処置が必要な系または対象に、有効量の式(1)、(2)、(3A)、(3B)、(4A)、(4B)または(5)を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、あるいは所望により第2治療薬と組み合わせたその医薬組成物を投与し、それによって該状態を処置することを含む方法を提供する。あるいは、本発明は、ALK、FAK、ZAP-70および/またはIGF-1Rが介在する状態を処置する医薬の製造における、式(1)、(2)、(3A)、(3B)、(4A)、(4B)または(5)を有する化合物の使用を提供する。特定の態様において、本発明の化合物は、単独で、または、ALKが介在する状態を処置する第2治療薬と組み合わせて用いられ得る。ここで、該状態は、自己免疫疾患移植疾患、感染性疾患または細胞増殖障害である。

0020

さらに、本発明は、細胞増殖障害を処置する方法であって、該処置が必要な系または対象に、式(1)、(2)、(3A)、(3B)、(4A)、(4B)または(5)を有する化合物またはその薬学的に許容される塩、あるいは所望により第2治療薬と組み合わせた医薬組成物を投与し、それによって該状態を処置する方法を提供する。あるいは、本発明は、細胞増殖障害を処置する医薬の製造における、式(1)、(2)、(3A)、(3B)、(4A)、(4B)または(5)を有する化合物の使用を提供する。特定の例において、本発明の化合物は、単独で、または細胞増殖障害を処置する化学療法薬と組み合わせて用いられ得る。該障害は、リンパ腫、骨肉腫黒色腫、または、乳癌腎臓癌前立腺癌結腸直腸癌甲状腺癌卵巣癌膵臓癌、神経の癌、肺癌子宮癌または消化器の腫瘍を含み、これらに限定されない。

0021

上記の本発明の化合物を使用する方法において、式(1)、(2)、(3A)、(3B)、(4A)、(4B)または(5)を有する化合物は、細胞または組織を含む系に、または哺乳動物の対象に、例えばヒトまたは動物に投与され得る。

0022

定義
“アルキル”は、1個の基および他の基(例えばハロ置換アルキルおよびアルコキシ)の構成要素として記載し、また、直鎖であっても分枝であってもよい。本明細書で用いられる、所望により置換されているアルキル、アルケニルまたはアルキニルは、所望によりハロゲン化されていてもよく(例えばCF3)、または、1個以上の置換された炭素を有していてもよく、または、ヘテロ原子、例えばNR、OまたはSと置き換えられた炭素を有していてもよい(例えば−OCH2CH2O−、アルキルチオールチオアルコキシアルキルアミン類など)。

0023

“アリール”は、炭素原子を含む単環式または縮合二環式芳香環を言う。“アリーレン”は、アリール基から誘導される二価の基を意味する。例えば、アリール基は、フェニル、インデニル、インダニル、ナフチル、または、1,2,3,4−テトラヒドロナフタニルであってもよく、所望によりオルト位メタ位またはパラ位で置換されていてもよい。

0024

本明細書で用いられる“ヘテロアリール”は、1個以上の環員がヘテロ原子であるときの、上記アリールと定義される。ヘテロアリール類の例は、ピリジル、ピラジニルインドリルインダゾリルキノキサリニルキノリニルベンゾフラニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、ベンゾ[1,3]ジオキソール、イミダゾリル、ベンゾ−イミダゾリル、ピリミジニル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、ベンゾトリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、チエニルピロリル、イソキノリニルプリニル、チアゾリル、テトラジニル、ベンゾチアゾリルオキサジアゾリル、ベンゾオキサジアゾリルなどを含み、これらに限定されない。

0025

本明細書で用いられる“炭素環式環”は、所望により、例えば=Oで置換されていてもよい、炭素原子を含む飽和または部分的に不飽和の、単環式、縮合二環式または架橋多環式環を言う。炭素環式環の例は、シクロプロピルシクロブチルシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロプロピレンシクロヘキサノンなどを含み、これらに限定されない。

0026

本明細書で用いられる“ヘテロ環式環”は、1個以上の環炭素がヘテロ原子であるときの、上記炭素環式環と定義される。例えば、ヘテロ環式環は、N、O、S、−N=、−S−、−S(O)−、−S(O)2−、または−NR−(ここで、Rは、水素、C1−4アルキルまたは保護基であり得る。)を含み得る。ヘテロ環式環の例は、モルホリノ、ピロリジニル、ピロリジニル−2−オン、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリジニルオン(piperidinylone)、1,4−ジオキサ−8−アザ−スピロ[4.5]デカ−8−イル、1,2,3,4−テトラヒドロキノリニルなどを含み、これらに限定されない。本明細書で用いられるヘテロ環式環は、二環式アミン類および二環式ジアミン類を含んでいてもよい。

0027

本明細書で用いられる用語“共投与”または“組み合わせ投与”などは、1人の患者への複数の選択された治療薬の投与を含むことを意味し、また、これらの薬物が、必ずしも同じ投与経路によって、または同時に投与されない処置レジメを含むことを意図している。

0028

本明細書で用いる用語“薬学的組み合わせ”は、複数活性成分の混合または組み合わせから得られる製品を言い、また、複数活性成分の固定化された組み合わせおよび固定化されていない組み合わせの双方を含む。用語“固定化された組み合わせ”は、複数活性成分、例えば式(1)の化合物および併用薬が、両方とも、一人の患者に、1つのものまたは投与形で、同時に投与されることを意味する。用語“固定化されていない組み合わせ”は、複数活性成分、例えば式(1)の化合物および併用薬が、別個のものとして、一人の患者に、同時に、一緒に(concurrently)または特定の時間制限なしで連続して、両方とも投与されることを意味する。ここで、このような投与は、患者の身体中で、複数活性成分の治療有効量を提供する。後者はまた、例えば3種以上の活性成分の投与である、カクテル療法に適用される。

0029

用語“治療有効量”は、細胞、組織、臓器、系、動物またはヒトにおいて生物学的または医学的応答をもたらす、研究者獣医医師または他の臨床医によって求められる対象化合物の量を意味する。

0030

対象化合物についての用語“投与”または“投与する”は、本発明の化合物およびそのプロドラッグを、処置が必要な対象に提供することを意味する。

0031

本発明の実施態様
本発明は、新規のピリミジンおよびピリジン誘導体、およびその医薬組成物、および該化合物の使用方法を提供する。

0032

一つの態様において、本発明は、式(1):



[式中、
Wは、



であり;
A1およびA4は、独立して、CまたはNであり;
A2およびA3はそれぞれCであるか、あるいは、R6およびR7が環を形成するときA2およびA3の一方がNであり;
BおよびCは、独立して、所望により置換されている5〜7員の炭素環式環、アリール、N、OもしくはSを含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環であり;
Z1、Z2およびZ3は、独立して、NR11、C=O、CR−OR、(CR2)1−2または=C−R12であり;
R1およびR2は、独立して、ハロ、OR12、NR(R12)、SR12、または所望により置換されているC1−6アルキル、C2−6アルケニルまたはC2−6アルキニルであるか、あるいは、R1およびR2の一方がHであり;
R3は、(CR2)0−2SO2R12、(CR2)0−2SO2NRR12、(CR2)0−2CO1−2R12、(CR2)0−2CONRR12またはシアノであり;
R4、R6、R7およびR10は、独立して、所望により置換されているC1−6アルキル、C2−6アルケニルまたはC2−6アルキニル;OR12、NR(R12)、ハロ、ニトロ、SO2R12、(CR2)pR13またはXであるか、あるいは、R4、R7およびR10は、独立してHであり;
R、R5およびR5'は、独立して、HまたはC1−6アルキルであり;
R8およびR9は、独立して、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル、ハロまたはXであるか、あるいは、R1およびR2が環を形成するときR8およびR9の一方がHであり;ただし、R8およびR9の一方がXであり;
あるいは、炭素原子に結合しているとき、R1およびR2、またはR6およびR7、R7およびR8、またはR9およびR10は、所望により置換されている5〜7員の単環式または縮合炭素環式環、アリール、または、N、Oおよび/またはSを含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環を形成してもよく、あるいは、Nに結合しているとき、R7、R8、R9およびR10は、存在せず;
R11は、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、(CR2)pCO1−2R、(CR2)pOR、(CR2)pR13、(CR2)pNRR12、(CR2)pCONRR12または(CR2)pSO1−2R12であり;
R12およびR13は、独立して、所望により置換されている3〜7員の飽和または部分的に不飽和の炭素環式環、または、N、Oおよび/またはSを含む5〜7員のヘテロ環式環;アリールまたはヘテロアリールであるか;あるいは、R12は、H、C1−6アルキルであり;
Xは、(CR2)qY、シアノ、CO1−2R12、CONR(R12)、CONR(CR2)pNR(R12)、CONR(CR2)pOR12、CONR(CR2)pSR12、CONR(CR2)pS(O)1−2R12、または(CR2)1−6NR(CR2)pOR12であり;
Yは、所望により置換されている3〜12員の炭素環式環、5〜12員のアリール、または、N、Oおよび/またはSを含み、かつ(CR2)qYにおけるqが0であるときヘテロアリールまたはヘテロ環式環の炭素原子を介してA2またはA3またはこれらの両方に結合している5〜12員のヘテロアリールまたはヘテロ環式環であり;
n、pおよびqは、独立して、0〜4である。]
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。

0033

一つの態様において、本発明は、式(2):



[式中、
R1は、ハロまたはC1−6アルキルであり、
R2は、Hであるか、あるいは
R1およびR2は、一体となって、1個または2個の窒素原子を含む、所望により置換されている5〜6員のヘテロアリールまたはヘテロ環式環を形成し;
R6は、イソプロポキシまたはメトキシであり;
R8およびR9の一方が(CR2)qYであり、他方がC1−6アルキル、シアノ、CO1−2R12、CONR(R12)またはCONR(CR2)pNR(R12)であり;
Yは、所望により置換されているC3−7シクロアルキル、C3−7シクロアルケニル、またはフェニルであるか、あるいは、Yは、ピリジル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピロリジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、アゼチジニル、ヘプタメチレンイミン、またはオクタメチレンイミンであり、これらはそれぞれ、(CR2)qYにおけるqが0であるとき1個の炭素原子を介して該フェニル環に結合しており;
nは、0〜1であり;
qは、0〜4である。]
を有する化合物を提供する。

0034

別の態様において、本発明は、式(3A)または(3B):



[式中、
BおよびCは、一体となって、



を形成し;
Z1、Z2およびZ3は、一体となって、



またはその互変異性体を形成し;
R1は、ハロまたはC1−6アルキルであり、
R2はHであるか、あるいは、
R1およびR2は、一体となって、所望により置換されている5〜7員の炭素環式環、アリール、または、N、Oおよび/またはSを含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環を形成し;
R6は、イソプロポキシまたはメトキシである。]
を有する化合物を提供する。

0035

さらに別の態様において、本発明は、式(4A)または式(4B):



[式中、
R1は、ハロまたはC1−6アルキルであり、
R2はHであるか、あるいは
R1およびR2は、一体となって、所望により置換されている5〜7員の炭素環式環、アリール、または、N、Oおよび/またはSを含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環を形成し;
R6は、イソプロポキシまたはメトキシであり;
B2およびB3は、独立して、所望により置換されている5〜6員のアリールまたはN、OもしくはSを含むヘテロアリールである。]
を有する化合物を提供する。

0036

別の態様において、本発明は、式(5):



[式中、
Wは、



であり;
A1およびA4は、独立して、CまたはNであり;
A2およびA3はそれぞれCであるか、あるいは、R6およびR7が環を形成するときA2およびA3の一方がNであり;
BおよびCは、独立して、所望により置換されている5〜7員の炭素環式環、アリール、N、OもしくはSを含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環であり;
Z1、Z2およびZ3は、独立して、NR11、C=O、CR−OR、(CR2)1−2または=C−R12であり;
R1およびR2は、独立して、ハロ、OR12、NR(R12)、SR12、または所望により置換されているC1−6アルキル、C2−6アルケニルまたはC2−6アルキニルであるか、あるいは、R1およびR2の一方がHであり;
R3は、(CR2)0−2SO2R12、(CR2)0−2SO2NRR12、(CR2)0−2CO1−2R12、(CR2)0−2CONRR12またはシアノであり;
R4、R6、R7およびR10は、1個の炭素原子に結合しているとき、独立して、H、所望により置換されているC1−6アルキル、C2−6アルケニルまたはC2−6アルキニル;OR12、NR(R12)、ハロ、ニトロ、SO2R12、(CR2)pR13またはXであり;ただし、R6およびR7は同時にHではなく;
R、R5およびR5'は、独立して、HまたはC1−6アルキルであり;
R8およびR9は、独立して、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル、ハロまたはXであるか、あるいは、R8およびR9の一方がHであり;ただしR8およびR9の一方がXであり;
あるいは、R1およびR2、または、R6およびR7、R7およびR8、または、R9およびR10が、1個の炭素原子に結合しているとき、所望により置換されている5〜7員の単環式または縮合炭素環式環、アリール、または、N、Oおよび/またはSを含むヘテロアリールまたはヘテロ環式環を形成してもよく、あるいは、Nに結合しているとき、R7、R8、R9およびR10は、存在せず;
R11は、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、(CR2)pCO1−2R、(CR2)pOR、(CR2)pR13、(CR2)pNRR12、(CR2)pCONRR12または(CR2)pSO1−2R12であり;
R12およびR13は、独立して、所望により置換されている3〜7員の飽和または部分的に不飽和の炭素環式環、または、N、Oおよび/またはSを含む5〜7員のヘテロ環式環;アリールまたはヘテロアリールであるか;あるいは、R12は、H、C1−6アルキルであり;
Xは、(CR2)qY、シアノ、CO1−2R12、CONR(R12)、CONR(CR2)pNR(R12)、CONR(CR2)pOR12、CONR(CR2)pSR12、CONR(CR2)pS(O)1−2R12、または(CR2)1−6NR(CR2)pOR12であり;
Yは、所望により置換されている3〜12員の炭素環式環、5〜12員のアリール、または、N、Oおよび/またはSを含み、かつ(CR2)qYにおいてqが0であるときヘテロアリールまたはヘテロ環式環の炭素原子を介してA2またはA3またはこれらの両方に結合している5〜12員のヘテロアリールまたはヘテロ環式環であり;
n、pおよびqは、独立して、0〜4である。]
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。

0037

上記のそれぞれの式において、YまたはR13は、独立して、ヘテロ環式環であってもよく、該環は、二環式アミンであっても二環式ジアミンであってもよい。二環式アミンおよび二環式ジアミンの例は、所望により置換されているヘキサンメチレンイミン;ヘプタメチレンイミン;キヌクリジン;3−アザビシクロ(3,3,0)オクタン;3,8−ジアザビシクロ[3,2,1]オクタン;オクタヒドロ−1H−ピリド[3,4−C]アゼピン;オクタヒドロピロリジン;6−アザビシクロ[3,2,1]オクタン;3−アザビシクロ[3,2,1]オクタン;2,5−ジアザビシクロ[2,2,1]ヘプタン;1−アザビシクロ[2,2,1]ヘプタン;2−アザビシクロ[2,2,1]ヘプタン;1,4−ジアザビシクロ[4,4,0]デカン;1,4−ジアザビシクロ[4,3,0]ノナン;1−アザビシクロ[3,2,1]オクタン;3−アザビシクロ[3,3,0]オクタン;8−アザビシクロ[3,2,1]オクタン;3,9−ジアザビシクロ[4,2,1]ノナン;オクタヒドロピロロ[3,4−C]ピロール;オクタヒドロピロロ[3,4−B]ピロール;ヘキサヒドロピロロ[3,2−B]ピロール;ヘキサヒドロピロロ[3,2−C]ピロール;1,4−ジアザシクロオクタン;1,5−ジアザシクロオクタン;3,7−ジアザビシクロ[4,2,0]オクタン;3,7−ジアザビシクロ[3,3,1]ノナン;オクタヒドロピロロ[3,4−C]ピリジン;オクタヒドロピロロ[3,4−B]ピリジン;オクタヒドロシクロペンタ[C]ピロリジン;ヘキサヒドロシクロペンタ[C]ピロリジン;8−アザビシクロ[3,2,1]オクタン;デカヒドロキノリンデカヒドロイソキノリン;デカヒドロピリド[3,4−B]アゼピン;デカヒドロピリド[4,3−B]アゼピン;9−アザビシクロ[3,3,1]ノナン;ビスジン;3−アザビシクロ[3,1,0]ヘキサン;8−アザビシクロ[3,2,1]オクタン;2−アザビシクロ[3.3.1]ノナン;テトラヒドロキノリンテトラヒドロイソキノリン;2,5−ジアザビシクロ[2,2,2]オクタン;デカヒドロ−2,7−ナフチリジン;1,4−ジアゼパン;アゾナン;オクタヒドロ−1H−インドール;オクタヒドロ−1H−イソインドール;2−アザビシクロ[3,3,0]オクタン;6−アザビシクロ[3,2,1]オクタン;7−アザ−ビシクロ[2.2.1]ヘプタン;デカヒドロピラジノ[1,2−a]アゼピン;3,8−ジアザ−ビシクロ[3,2,1]オクタン;3−アザビシクロ[3,2,1]オクタン;3−アザ−トリシクロ[4,2,1,0(2,5)]ノナン;2,6−ジアザスピロ[3,5]ノナン;6−アザビシクロ[2,1,0]ヘキサンなどを含み、これらに限定されない。

0038

上記のそれぞれの式において、不斉炭素原子は何れも、(R)−、(S)−または(R,S)−配置で存在し得る。従って、本化合物は、異性体の混合物として、または純粋な異性体、例えば純粋なエナンチオマーまたはジアステレオマーとして存在し得る。さらに、本発明は、本発明の化合物の可能性のある互変異性体を含む。

0039

上記のそれぞれの式において、所望により置換された部分はそれぞれ、C1−6アルキル、C2−6アルケニルまたはC3−6アルキニルで置換されていてもよく、これらはそれぞれ、所望によりハロゲン化されていてもよく、あるいは、所望によりN、S、O、またはそれらの組み合わせで置き換えられた(例えば、ヒドロキシルC1−C8アルキル、C1−C8アルコキシC1−C8アルキル);あるいは、先に記載したハロ、アミノアミジノ、C1−6アルコキシ;ヒドロキシル、メチレンジオキシカルボキシ;C1−8アルキルカルボニル、C1−8アルコキシカルボニルカルバモイル、C1−8アルキルカルバモイルスルファモイル、シアノ、オキソ、ニトロ、または所望により置換されている炭素環式環、ヘテロ環式環、アリールもしくはヘテロアリールで置換された炭素を有していてもよい。

0040

薬理および有用性
本発明の化合物およびその薬学的に許容される塩は、細胞なしのキナーゼアッセイおよび細胞アッセイにおいてin vitroで試験したとき、有益な薬理学的性質を示し、従って、それらは医薬として有用である。

0041

一つの態様において、式(1)、(2)、(3A)、(3B)、(4A)、(4B)または(5)の化合物は、未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)およびNPM-ALK融合タンパク質のチロシンキナーゼ活性を阻害し得る。このタンパク質チロシンキナーゼは、ヌクレオフォスミン(NPM)およびALKの遺伝子融合由来し、ALKリガンドに独立のタンパク質チロシンキナーゼ活性をもたらす。NPM-ALKは、例えば未分化大細胞リンパ腫(ALCL)および非ホジキンリンパ腫(NHL)、特にALK+NHLまたはアルコマ(Alkomas)、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍(IMT)および神経芽細胞腫において、血液疾患および腫瘍性疾患を引き起こす造血細胞および他のヒトの細胞におけるシグナル伝達に重要な役割を果たす(Duyster et al. 2001 Oncogene 20, 5623-5637)。NPM-ALKに加えて、他の融合遺伝子が、ヒトの血液疾患および腫瘍性疾患で確認されている;例えばTPM3-ALK(非筋細胞トロポミオシンとALKとの融合)。

0042

ALKチロシンキナーゼ活性の阻害は、既知の方法、例えばJ. Wood et al. Cancer Res. 60, 2178-2189 (2000)に記載されたVEGF-Rキナーゼアッセイと同様の方法で、ALKの組み換えキナーゼドメインを用いて証明され得る。一般的に、GST-ALKタンパク質チロシンキナーゼを用いたin vitro酵素アッセイは、96ウェルプレート中で、20mM Tris HCl(pH=7.5)、3mM MgCl2、10mM MnCl2、1mM DTT、0.1μCi/アッセイ(=30μl)[γ−33P]−ATP、2μM ATP、3μg/mLポリ(Glu, Tyr 4:1) ポリ−EY(Sigma P-0275)、1%DMSO、25ng ALK酵素におけるフィルター結合アッセイとして行われる。アッセイを環境温度で10分間インキュベートする。50μlの125mMEDTAを添加することによって反応を終了させ、先にメタノールで湿らせたMAIP Multiscreen plate (Millipore, Bedford, MA, USA)に、該反応混合物を移し、H2Oで5分間再水和する。洗浄後(0.5% H3PO4)、プレートを液体シンチレーション計数機計数する。%阻害の線形回帰分析によって、IC50値を計算する。

0043

式(1)、(2)、(3A)、(3B)、(4A)、(4B)または(5)の化合物は、マウスのBaF3細胞を過剰発現するヒトのNPM-ALK (DSMZ Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH, Germany)の増殖を強く阻害し得る。NPM-ALKの発現は、BaF3細胞株を、NPM-ALKをコードする発現ベクターpClneo(商標)(Promega Corp., Madison WI, USA)でトランスフェクトし、続いて、G418耐性細胞を選択することによって達成され得る。トランスフェクトされていないBaF3細胞は、細胞生存について、IL-3に依存する。対照的に、NPM-ALK発現BaF3細胞(以後、BaF3-NPM-ALKと呼ぶ)は、NPM-ALKキナーゼによって増殖シグナルを得るため、IL-3非存在下でも増殖し得る。従って、NPM-ALKキナーゼの推定阻害剤は、増殖シグナルを止め、抗増殖活性をもたらし得る。しかしながら、NPM-ALKキナーゼの推定阻害剤の抗増殖活性は、NPM-ALKに独立なメカニズムを介して増殖シグナルを与えるIL-3の添加によって克服され得る。FLT3キナーゼを用いた類似の細胞系もまた記載されている(E Weisberg et al. Cancer Cell;1, 433-443 (2002)を参照のこと)。

0044

本発明の化合物の阻害活性は以下の通り決定され得る。一般的に、BaF3-NPM-ALK細胞(15,000/マイクロタイタープレート・ウェル)を、96ウェル・マイクロタイタープレートに移す。ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した試験化合物を、DMSO最終濃度が1%(v/v)を越えないように、一連の濃度(希釈シリーズ)で加える。添加後、該プレートを、試験化合物を含まないコントロール培地が2細胞分裂周期を経る間である2日間インキュベートする。BaF3-NPM-ALK細胞の増殖は、YOPRO (商標)色素の方法[T Idziorek et al. J. Immunol. Methods;185: 249-258 (1995)]によって測定される:20mMクエン酸ナトリウム(pH 4.0)、26.8mM塩化ナトリウム、0.4% NP40、20mMEDTAおよび20mMを含む、25μlの溶解緩衝液を、それぞれのウェルに加える。細胞の溶解を室温で60分以内で完了させ、DNAに結合したYOPRO (商標)の総量を、Cytofluor II 96-well reader (PerSeptive Biosystems)を用いて、以下の設定で測定することによって決定する:励起(nm) 485/20および放出(nm) 530/25。

0045

IC50値は、式:
IC50=[(ABS試験化合物-ABS開始時)/(ABSコントロール-ABS開始時)]×100 (ABS=吸収)
を用いて、コンピューターを使ったシステムによって決定され得る。

0046

これらの実験において、IC50値は、阻害剤なしのコントロールを用いて得られる値の50%未満である細胞数となる、対象の試験化合物の濃度として示される。遊離形または薬学的に許容される塩形の本発明の化合物は、例えば、本明細書で記載されたin vitro試験によって示された通り、有益な薬理学的性質を示し得る。一般的に、本発明の化合物は、1nMから10μMのIC50値を有する。幾つかの例において、本発明の化合物は、0.01μMから5μMのIC50値を有する。別の例において、本発明の化合物は、0.01μMから1μMの、より特定的には、1nMから1μMのIC50値を有する。また、別の例において、本発明の化合物は、1nM未満の、または10μMより大きいIC50値を有する。本発明の化合物は、ALKに対して、10μMで、50%より大きい%阻害を示し、別の態様において、約70%より大きい%阻害を示し得る。

0047

本発明の化合物の抗増殖作用はまた、ヒトKARPAS-299リンパ腫細胞株(DSMZ Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH, Braunschweig, Germany)(WG Dirks et al. Int. J. Cancer 100, 49-56 (2002)に記載されている)において、BaF3-NPM-ALK細胞株について上で記載した方法と同じ方法を用いて証明され得る。幾つかの態様において、本発明の化合物は、約0.01から1μMの範囲のIC50を有する阻害活性を示し得る。ALKの自己リン酸化に対する本発明の化合物の作用は、ヒトKARPAS-299リンパ腫細胞株において、WG Dirks et al. Int. J. Cancer 100, 49-56 (2002)に記載されたイムノブロットによって証明され得る。

0048

別の態様において、本発明の化合物は、接着斑キナーゼ(FAK)を阻害し得る。また、本発明の化合物は、例えば特定の腫瘍の処置において、FAKと関連するシグナルカスケードの機能不全によって引き起こされる障害を処置するための医薬として有用であり得る。内因性FAKシグナル伝達の阻害は、運動性の低下をもたらし、細胞死を誘発する場合もある。他方、外因性発現によるFAKシグナル伝達の増加は、細胞運動性を増加させる。さらに、FAKは、浸潤性および転移性上皮癌間葉系癌、甲状腺癌および前立腺癌において、過剰発現される。結果として、FAKの阻害剤は、抗腫瘍増殖および転移のための薬物となるようである。本発明の化合物は、従って、腫瘍性疾患、特に乳癌、腸(結腸および直腸)の癌、胃癌、卵巣癌、前立腺癌、非小細胞肺癌小細胞肺癌肝臓癌、黒色腫、膀胱癌および頭頚部癌罹患している脊椎動物、より特定的には哺乳動物を、予防および/または処置するのに有用であり得る。

0049

FAK阻害と免疫系の間の関係は、例えばG.A. van Seventer et al., Eur. J. Immunol. 2001, 31, 1417-1427に記載されている。従って、本発明の化合物は、例えば、免疫系障害、Tリンパ球Bリンパ球肥満細胞および/または好酸球が介在する疾患または障害、例えば急性または慢性の臓器または組織の同種または異種移植片拒絶反応アテローム性動脈硬化症血管障害による血管閉塞、例えば血管形成再狭窄高血圧心不全慢性閉塞性肺疾患CNS疾患、例えばアルツハイマー病、または筋萎縮性側索硬化症;癌;感染性疾患、例えばAIDS;敗血症ショックまたは成人呼吸窮迫症候群虚血再灌流傷害、例えば心筋梗塞、卒中、腸虚血、腎不全またはまたは出血性ショック、または外傷性ショックに罹患している脊椎動物、より特定的には哺乳動物を、予防および/または処置するのに有用である。

0050

さらに別の態様において、本発明の化合物は、ゼータ鎖関連タンパク質キナーゼ70 (ZAP-70)を阻害し得る。本発明の薬物のZAP-70タンパク質チロシンキナーゼ相互作用は、例えば、水性溶液中、ヒトZAP-70タンパク質チロシンキナーゼによるLAT-11(T細胞活性化のためのリンカー)のリン酸化を妨げる能力によって証明され得る。従って、本発明の化合物は、ZAP-70阻害が役割を果たす障害または疾患を予防または処置するのに有用であり得る。

0051

本発明の化合物はまた、インシュリン様増殖因子受容体1(IGF-1R)を阻害し得る。また、本発明の化合物は、IGF-1R介在疾患の処置に有用であり得る。IGF-1R介在疾患の例は、増殖性疾患、例えば腫瘍、例えば乳癌、腎臓癌、前立腺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、卵巣癌、膵臓癌、神経の癌、肺癌、子宮癌および消化器の腫瘍、ならびに骨肉腫および黒色腫を含み、これらに限定されない。本発明の化合物のIGF-1Rチロシンキナーゼ活性の阻害剤としての効果は、細胞捕獲ELISAを用いて証明され得る。このアッセイにおいて、IGF-1Rの(IGF-1)誘発自己リン酸化に対する本発明の化合物の活性を測定する。

0052

本発明の化合物はまた、急性または慢性炎症性疾患または障害、または自己免疫疾患、例えば関節リウマチ骨関節炎全身性エリテマトーデス橋本甲状腺炎多発性硬化症重症筋無力症糖尿病(I型およびII型)およびその合併症呼吸器疾患、例えば喘息、または炎症性肝臓傷害、炎症性糸球体傷害、免疫介在傷害または疾病皮膚症状、炎症性および過剰増殖性皮膚疾患(例えば乾癬アトピー性皮膚炎アレルギー性接触皮膚炎刺激性接触皮膚炎およびさらに湿疹性皮膚炎脂漏性皮膚炎)、炎症性眼疾患、例えばシェーグレン症候群角結膜炎またはブドウ膜炎炎症性腸疾患クローン病、または潰瘍性大腸炎の処置および/または予防に有用であり得る。

0053

前記に従って、本発明は、
(1)医薬として使用するための本発明の化合物;
(2)ALK阻害剤、FAK阻害剤、ZAP-70阻害剤および/またはIGF-1R阻害剤として使用するための、例えば前記の特定の適応の何れかに使用するための本発明の化合物;
(3) 例えば、前記の適応の何れかに使用するための医薬組成物であって、1種以上の薬学的に許容される希釈剤または担体と共に、活性成分として本発明の化合物を含む医薬組成物;
(4) 必要な患者において、前記の特定の適応の何れかを処置する方法であって、有効量の本発明の化合物またはそれと同じものを含む医薬組成物に投与することを含む方法;
(5) ALK、FAK、ZAP-70および/またはIGF-1Rの活性化が役割を果たすかまたは関係している疾患または状態の処置または予防のための医薬を製造するための本発明の化合物の使用;
(6) 上記の(4)において定義した方法であって、治療有効量の本発明の化合物と、1種以上のさらなる薬物を、例えば同時にまたは連続して共投与する(ここで、当該さらなる薬物は、前記の特定の適応の何れかに有用なものである。)ことを含む方法;
(7) 治療有効量の本発明の化合物と、1種以上のさらなる薬物(ここで、当該さらなる薬物は、前記の特定の適応の何れかに有用なものである。)を含む組み合わせ;
(8)未分化リンパ腫キナーゼの阻害に応答する疾患の処置または予防のための医薬の製造における、本発明の化合物の使用;
(9) 処置される疾患が、未分化大細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、神経芽細胞腫および腫瘍性疾患から選択される、(8)に記載された使用;
(10) 該化合物が実施例の何れか1つに記載された化合物またはその薬学的に許容される塩である、(8)または(9)に記載された使用;
(11) 未分化リンパ腫キナーゼの阻害に応答する疾患、特に未分化大細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、神経芽細胞腫および腫瘍性疾患から選択される疾患を処置する方法であって、有効量の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法;
を提供する。

0054

投与と医薬組成物
一般的に、本発明の化合物は、治療有効量で、当技術分野で既知の有用な且つ許容される何れかの方法を介して、単独でまたは1種以上の治療薬と組み合わせての何れかで投与される。治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢および関連の健康状態、用いられる化合物の力価、および当業者に既知の他の因子に依存して、広く変化し得る。例えば、腫瘍性疾患および免疫系障害の処置のために、求められる投与量はまた、投与方法、処置されるべき特定の状態および望ましい効果に依存して変化する。

0055

一般的に、約0.01から約100mg/kg体重、または特に約0.03から2.5mg/kg体重の1日投与量で、全身に与えられるとき、満足のいく結果を示す。より大きな哺乳動物(例えばヒト)で、適応される1日用量は、約0.5mgから約2000mgの、より特定的には約0.5mgから約100mgの範囲であってもよく、便宜的には、例えば1日4回までの分割投与で、または徐放形で投与される。経口投与に適切な単位投与形は、約1から50mgの活性成分を含む。

0056

本発明の化合物は、何れかの慣用経路によって、例えば経腸で、例えば経口で、例えば錠剤またはカプセル剤の形態で;非経腸で、例えば注射可能な溶液または懸濁液の形態で;あるいは、局所で、例えばローションゲル軟膏またはクリームの形態で、または鼻用形態または坐剤の形態で投与され得る。

0057

少なくとも1種の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせた、遊離形または薬学的に許容される塩形の本発明の化合物を含む医薬組成物が、慣用の方法で、混合、造粒コーティング、溶解または凍結乾燥工程によって製造され得る。例えば、少なくとも1種の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせた本発明の化合物を含む医薬組成物は、慣用の方法で、薬学的に許容される担体または希釈剤と混合することによって製造され得る。経口投与のための単位投与形は、例えば約0.1mgから約500mgの活性な物質を含む。

0058

一つの態様において、医薬組成物は、活性成分の溶液であり、懸濁液または分散液を含み、例えば等張性水溶液である。活性成分のみを、または担体(例えばマンニトール)と共に含む、凍結乾燥した組成物の場合は、分散液または懸濁液は、使用前に作られ得る。医薬組成物は、滅菌処理されていてもよく、かつ/またはアジュバント、例えば保存料、安定剤、湿化剤または乳化剤、溶液促進剤、浸透圧調節用塩および/または緩衝剤を含んでいてもよい。適切な保存料は、抗酸化剤(例えばアスコルビン酸)、殺菌剤(例えばソルビン酸または安息香酸)を含み、これらに限定されない。溶液または懸濁液は、さらに、粘度増加剤(カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストランポリビニルピロリドンゼラチンを含み、これらに限定されない)、または、可溶化剤(例えばTween 80(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレート))を含んでいてもよい。

0059

油中懸濁液は、油成分として、植物油、注射目的に慣例の合成もしくは半合成油脂を含んでもよい。その例は、8から22個の炭素原子を、幾つかの具体的態様において12から22個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸を酸成分として含む液体脂肪酸エステルを含む。適切な液体脂肪酸エステル類は、ラウリン酸トリデカン酸、ミリスチン酸ペンタデカン酸、パルミチン酸マルガリン酸ステアリン酸アラキジン酸ベヘン酸、または対応する不飽和酸、例えばオレイン酸エライジン酸エルカ酸ブラシジン酸およびリノール酸を含み、これらに限定されない。望ましいならば、抗酸化剤、例えばビタミンE、3−カロチンまたは3,5−ジ−tert−ブチルヒドロキシトルエンを含んでいてもよい。これらの脂肪酸エステル類アルコール成分は、6個の炭素原子を有し、一価アルコールであっても多価アルコールであってもよく、例えば一価、二価または三価のアルコールである。適切なアルコール成分は、メタノール、エタノールプロパノールブタノールまたはペンタノール、またはそれらの異性体;グリコールおよびグリセロールを含み、これらに限定されない。

0060

他の適切な脂肪酸エステル類は、オレイン酸エチルミリスチン酸イソプロピルパルミチン酸イソプロピル、LABRAFIL(登録商標) M 2375、(ポリオキシエチレングリセロール)、LABRAFIL(登録商標) M 1944 CS (杏仁油加アルコール分解により製造される不飽和ポリグリコール化グリセリド, グリセリドおよびポリエチレングリコールエステルを含む)、LABRASOL(商標) (TCMの加アルコール分解により製造される飽和ポリグリコール化グリセリド, グリセリドおよびポリエチレン グリコール エステルを含む;全てGaKefosse、Franceより購入)、および/またはMIGLYOL(登録商標) 812 (C8−C12長鎖飽和脂肪酸トリグリセリド, Huels AG、Germanyより購入)、および植物油、例えば綿実油アーモンド油、オリーブ油ひまし油ごま油大豆油、または落花生油を含み、これらに限定されない。

0061

経口投与のための医薬組成物は、例えば、活性成分を1種以上の固体担体と合わせ、望ましいならば、得られた混合物を造粒し、該混合物または顆粒をさらなる賦形剤を含めることによって加工し、錠剤または錠剤コアを形成する。

0062

適切な担体は、糖類、(例えば乳糖ショ糖、マンニトールまたはソルビトール)、セルロース調製物、および/またはリン酸カルシウム(例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム)、さらに、結合剤、例えば澱粉(例えばとうもろこし、小麦、米またはじゃがいもの澱粉)、メチルセルロースヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン、および/または、望ましいならば、崩壊剤、例えば上記の澱粉、カルボキシメチル澱粉、架橋ポリビニルピロリドンアルギン酸またはその塩(例えばアルギン酸ナトリウム)を含み、これらに限定されない。さらなる賦形剤は、流動性調整剤および滑沢剤、例えば、珪酸タルク、ステアリン酸またはその塩(例えばステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム)、および/またはポリエチレングリコールまたはその誘導体を含む。

0063

錠剤コアは、とりわけ、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタンを含んでいてもよい濃縮糖溶液の使用によって、あるいは、適切な有機溶媒または溶媒混合物中コーティング溶液の使用によって、あるいは、腸溶性コーティングの製造のための適切なセルロース調製物(例えば、フタル酸アセチルセルロースまたはフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース)の溶液の使用によって、適切な、所望により腸溶性のコーティングと共に提供されてもよい。例えば同定または活性成分の異なる用量を示す目的で、染料または顔料を錠剤または錠剤コーティングに加えてもよい。

0064

経口投与のための医薬組成物はまた、ゼラチンを含む硬カプセル剤、または、ゼラチンおよび可塑剤(例えばグリセロールまたはソルビトール)を含む密封軟カプセル剤を含み得る。硬カプセル剤は、例えば充填剤(例えばとうもろこし澱粉)、結合剤および/または滑剤(例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム)、所望により安定剤と混合した活性成分を顆粒の形態で含んでもよい。軟カプセル剤において、活性成分は、安定剤および界面活性剤(例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル・タイプ)をまた含んでもよい適切な液体賦形剤、例えば油脂、パラフィンオイルまたは液体ポリエチレングリコール、またはエチレンもしくはプロピレングリコールの脂肪酸エステルに、溶解または懸濁してもよい。

0065

直腸投与に適切な医薬組成物は、例えば、活性成分と坐剤の基剤の組み合わせを含む坐剤である。適切な坐剤の基剤は、例えば、天然または合成トリグリセリドパラフィン炭化水素類、ポリエチレングリコールまたは高次アルカノール類である。

0066

非経腸投与に適切な医薬組成物は、粘性増加物質(例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストラン)、望ましいならば安定剤を含む、水に溶解可能な形態(例えば水溶性の塩)の活性成分の水溶液、または水性注射用懸濁液を含み得る。活性成分はまた、所望により賦形剤と共に、凍結乾燥させた形態であってもよく、非経腸投与前に適切な溶媒を添加することによって溶液にすることができる。例えば非経腸投与に用いられる溶液はまた、点滴用溶液として用いられ得る。注射可能な製剤の製造は、通常、滅菌条件下で行われ、例えばアンプルまたはバイアル充填され、容器が密封されている。

0067

本発明の化合物は、唯一の活性成分として、または、腫瘍性疾患に有用な、または免疫調節レジメに有用な別の薬物と共に投与され得る。例えば、本発明の化合物は、上記の種々の疾患に有効な医薬組成物、例えばシクロホスファミド5−フルオロウラシルフルダラビンゲムシタビンシスプラチンカルボプラチンビンクリスチンビンブラスチンエトポシドイリノテカンパクリタキセルドセタキセルリツキサンドキソルビシンゲフィチニブまたはイマチニブ;あるいは、シクロスポリン類ラパマイシン類、アスコマイシン類またはそれらの免疫抑制アナログ、例えばシクロスポリンAシクロスポリンG、FK-506、シロリムスまたはエベロリムスコルチコステロイド、例えばプレドニゾン、シクロホスファミド、アザチオプリンメトトレキサート金塩スルファサラジン抗マラリア剤ブレキナル(brequinar)、レフルノミドミゾリビンミコフェノール酸ミコフェノール酸モフェチル、15−デオキシスパガリン、免疫抑制モノクローナル抗体、例えば白血球受容体に対するモノクローナル抗体、例えばMHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、I CD40、CD45、CD58、CD80、CD86、CD152、CD137、CD154、ICOS、LFA-1、VLA-4またはそれらのリガンド、または他の免疫調節化合物(例えばCTLA41g)と組み合わせて、本発明に従って使用され得る。

0068

本発明はまた、a)本明細書に開示された遊離形または薬学的に許容される塩形の本発明の化合物である第1薬物、および、b)少なくとも1種の併用薬(co-agent)を含む、薬学的組み合わせ、例えばキットを提供する。該キットは、それの投与のための説明書を含み得る。

0069

本発明の化合物の合成方法
式(1)の化合物は、反応スキームIに従って製造され得る。
反応スキームI



ここで、それぞれの置換基は、本発明の概要で定義した通りである。

0070

式(1)の化合物は、式(6)の化合物を、式(7)の化合物と、パラジウム触媒(例えば酢酸パラジウムなど)、リガンド(例えばxantphosなど)および塩基(例えば炭酸セシウムなど)の存在下で、適切な溶媒(例えばTHFなど)中で反応させることによって合成され得る。該反応は、約70℃から約180℃の温度範囲で行い、完了するのに10分から8時間かかり得る。

0071

あるいは、式(1)の化合物は、式(6)の化合物を、式(7)の化合物と、酸(例えばHCl、TsOHなど)の存在下で、適切な溶媒(例えば2−プロパノールなど)中で反応させることによって合成され得る。該反応は、約70℃から約150℃の温度範囲で行い、完了までに12時間未満かかり得る。

0072

本発明の化合物を合成するための追加的工程
塩を含む本発明の化合物はまた、水和物の形態で得られ、あるいは、その結晶は、例えば結晶化に用いた溶媒を含んでもよい(溶媒和物として存在)。塩は、適切な塩基性反応剤、例えば炭酸アルカリ金属塩炭酸水素アルカリ金属塩、または水酸化アルカリ金属塩(例えば炭酸カリウムまたは水酸化ナトリウム)で処理することによって、通常、遊離形に変換され得る。遊離形の新規化合物とその塩の形態の密接な関連性を、新規化合物の精製または単離における中間体として用いられ得る塩を含めて考慮すると、前記および後記の遊離の化合物についての全ての記載は、適切なときは、対応する塩についても記載していると解されるべきである。

0073

塩形成基を有する本発明の化合物の塩は、それ自身既知の方法で製造され得る。式(1)、(2)、(3A)、(3B)、(4A)、(4B)または(5)の化合物の酸付加塩は、従って、酸または適切なアニオン交換反応剤で処理することによって得られる。本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、例えば、無機酸または有機酸との酸付加塩として、塩基性窒素原子を有する式(1)、(2)、(3A)、(3B)、(4A)、(4B)または(5)の化合物から形成され得る。

0074

適切な無機酸は、ハロゲン酸、例えば塩酸硫酸、またはリン酸を含み、これらに限定されない。適切な有機酸は、カルボン酸、リン酸、スルホン酸またはスルファミン酸、例えば酢酸プロピオン酸オクタン酸デカン酸ドデカン酸グリコール酸乳酸フマル酸コハク酸アジピン酸ピメリン酸スベリン酸アゼライン酸リンゴ酸酒石酸クエン酸アミノ酸、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸シクロヘキサンカルボン酸アダマンタンカルボン酸、安息香酸、サリチル酸、4−アミノサルチル酸、フタル酸、フェニル酢酸マンデル酸桂皮酸メタン−もしくはエタン−スルホン酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−1,2−ジスルホン酸ベンゼンスルホン酸、2−ナフタレンスルホン酸、1,5−ナフタレン-ジスルホン酸、2−、3−もしくは4−メチルベンゼンスルホン酸、メチル硫酸エチル硫酸ドデシル硫酸、N−シクロヘキシルスルファミン酸、N−メチル−、N−エチル−もしくはN−プロピル−スルファミン酸、または他の有機プロトン酸、例えばアスコルビン酸を含み、これらに限定されない。

0075

単離または精製の目的のために、薬学的に許容されない塩、例えばピクリン酸塩または過塩素酸塩を使用することも可能である。治療的使用のためには、薬学的に許容される塩または遊離の化合物のみが用いられる(適切な場合は医薬製剤の形態で)。

0076

酸化されていない形態の本発明の化合物は、本発明の化合物のN−オキシドから、還元剤(例えば硫黄二酸化硫黄トリフェニルホスフィン水素化ホウ素リチウム水素化ホウ素ナトリウム三塩化リン三臭化リンなど)で、適切な不活性有機溶媒(例えばアセトニトリル、エタノール、水性ジオキサンなど)中、0から80℃で処理することによって製造され得る。

0077

本発明の化合物のプロドラッグ誘導体は、当業者に既知の方法によって製造され得る(例えば、さらなる詳細については、Saulnier et al., (1994), Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol.4, p1985を参照のこと)。例えば、適切なプロドラッグは、誘導体化されていない本発明の化合物を、適切なカルバミル化剤(例えば1,1−アシルオキシアルキルカルボクロデートパラ−ニトロフェニルカーボネートなど)と反応させることによって製造され得る。

0078

本発明の化合物の保護誘導体は、当業者に既知の手段によって合成され得る。保護基の付加および除去に適応可能な技術の詳細な記載は、T. W. Greene, “Protecting Groups in Organic Chemistry”, 3rd edition, John Wiley and Sons, Inc., 1999で見出され得る。

0079

本発明の化合物は、本化合物のラセミ混合物光学活性分割剤と反応させ、一組のジアステレオアイソマー混合物を形成し、該ジアステレオマーを分離し、光学的に純粋なエナンチオマーを回収することによって、個々の立体異性体として製造され得る。エナンチオマーの分離は、本発明の化合物の共有結合性ジアステレオマー誘導体を用いて、または分離可能複合体(例えば結晶性ジアステレオマー塩)を用いることによって行い得る。ジアステレオマーは、固有性質(例えば融点沸点、溶解度、反応性など)を有し、これらの相違を利用することによって、容易に分離され得る。ジアステレオマーは、分別結晶クロマトグラフィー、または、溶解度の違いに基づく分離/分割法によって分離され得る。次いで、光学的に純粋なエナンチオマーは、分離剤と共に、ラセミ化を起こさない何れかの実用的な手順によって回収される。ラセミ混合物からの化合物の立体異性体の分離に適応可能な技術のより詳細な記載は、Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, “Enantiomers, Racemates and Resolutions”, John Wiley And Sons, Inc., 1981で見出され得る。

0080

要約すると、本発明の化合物は、
(a)反応スキームIの工程;および
(b) 所望により本発明の化合物を薬学的に許容される塩に変換すること;
(c) 所望により本発明の化合物の塩を、塩ではない形態に変換すること;
(d) 所望により酸化されていない形態の本発明の化合物を薬学的に許容されるN−オキシドに変換すること;
(e) 所望により本発明の化合物のN−オキシドを、その酸化されていない形態に変換すること;
(f) 所望により本発明の化合物の個々の異性体を、異性体混合物から分離すること;
(g) 所望により誘導体化されていない本発明の化合物を、薬学的に許容されるプロドラッグ誘導体に変換すること;および
(h) 所望により本発明の化合物のプロドラッグ誘導体を、その誘導体化されていない形態に変換すること;
を含む工程によって合成され得る。

0081

出発物質の製造は、特記されない限り、該化合物が既知であるか、当技術分野で既知の方法と類似の方法によって製造され得るか、または下記の実施例で開示された通りに製造され得る。当業者は、上記の変換が本発明の化合物の製造方法のただの代表例であって、他の周知の方法も同様に用いられ得ることを認識するであろう。本発明は、さらに、下記の本発明の化合物の製造を説明した実施例によって説明され、これらに限定されない。

0082

中間体の製造
中間体1
2−クロロ−N−(2−(イソプロピルスルホニル)フェニル)−5−メチルピリミジン−4−アミン



DMF/DMSO(25/2.5ml)の混合物中の730mgのNaHの懸濁液に、0℃で、DMF/DMSO(10ml, 比=9/1)中の2.53g(12.69mmol)の2−(イソプロピルスルホニル)ベンゼンアミン滴下する。該溶液を0℃で30分間撹拌し、10mlのDMF/DMSO(比=9/1)に希釈した4.11g(25.3mmol, 2当量)の2,4−ジクロロ−5−メチルピリミジンを滴下する。該溶液を室温まで温め、終夜撹拌する。後処理後粗生成物を冷CH3CNから数バッチで直接結晶化し、2−クロロ−N−(2−(イソプロピルスルホニル)フェニル)−5−メチルピリミジン−4−アミンを薄いクリーム色の結晶を得る。
ESMS m/z 326.1 (M + H+).

0083

中間体2
2,5−ジクロロ−N−(2−(イソプロピルスルホニル)フェニル)ピリミジン−4−アミンの合成



2−クロロ−N−(2−(イソプロピルスルホニル)フェニル)−5−メチルピリミジン−4−アミンの合成について記載された手順と同じ手順を用いて、2,5−ジクロロ−N−(2−(イソプロピルスルホニル)フェニル)ピリミジン−4−アミンをクリーム色の固体として単離する。
ESMS m/z 346.0 (M + H+).

0084

中間体3
2−クロロ−4−フルオロ−5−ニトロトルエン



250mlの濃硫酸中の100g(0.7mol)の2−クロロ−4−フルオロトルエンの溶液に、85g(0.875mol)のKNO3を、0℃で少しずつ加える(KNO3の全量の添加は約1時間で終了する)。赤色がかった混合物を、終夜ゆっくりと室温まで昇温し、砕いたクエンチし、EtOAcで抽出する。有機層を合わせ、MgSO4で乾燥し、濃縮する。次いで、粗製の油状物を大きなシリカプラグ(溶出液=97/3ヘキサン/EtOAc)で精製し、2−クロロ−4−フルオロ−5−ニトロトルエンを薄黄色の油状物として得る。これを放置すると固化する。
1H NMR(CDCl3, 400 Mz): 7.97 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 2.43 (s, 3H).

0085

中間体4
2−クロロ−4−イソプロポキシ−5−ニトロトルエン



250mlの2−プロパノール中の、25g(0.131mol)の2−クロロ−4−フルオロ−5−ニトロトルエンの溶液に、208g(0.659mol, 5当量)のCs2CO3を加える。該混合物を60℃で終夜撹拌し、大部分の2−プロパノールを減圧下で蒸発させる。水を加え、該溶液をEtOAcで抽出する。有機層を合わせ、MgSO4で乾燥し、濃縮し、粗生成物をシリカのプラグで濾過し(溶出液=95/5ヘキサン/EtOAc)、2−クロロ−4−イソプロポキシ−5−ニトロトルエンを、薄黄色の綿状固体として得る。

0086

中間体5
2−メチル−4−ニトロ−5−イソプロポキシ−フェニルボロン酸ピナコールエステル



100mlの乾燥ジオキサン中の、5.09gの2−クロロ−4−イソプロポキシ−5−ニトロトルエン(0.02216mol)、6.20g(0.02437mol)のピナコールジボラン、595mg(0.00212mol)のPCy3、1.014g(0.00108mol)のPd2dba3および3.16g(0.0322mol)のKOAcの混合物を、100℃で終夜加熱する。室温まで冷却した後、暗色の溶液をセライトで濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させる。粗製の油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し(溶出液=95/5ヘキサン/EtOAc)、2−メチル−4−ニトロ−5−イソプロポキシ−フェニルボロン酸ピナコールエステルを油状物として得る。これを放置すると固化する。
1H NMR(CDCl3, 400 Mz): 7.51 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 4.70 (m, 1H), 2.48 (s, 3H), 1.36 (d, J = 7.6 Hz, 6H), 1.35 (s, 12H).

0087

中間体6
4−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−3,6−ジヒドロ−2H−ピリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル



THF(100ml)中のN−tert−ブトキシカルボニル−4−ピペリドン(10.17g, 0.05mol)の溶液を、THF(100ml)中のLDA(40mlの1.5Mシクロヘキサン溶液, 0.06mol)の冷却(−78℃)した溶液に、激しく撹拌しながら、N2下で滴下する。該反応混合物を−78℃で30分間放置した後、THF(50ml)中のフェニルトリフルオロスルホンイミド(19.85g, 0.055mol)の溶液を加える。次いで該反応混合物を室温まで温め、3時間撹拌する。該反応物を、0℃で、100mlの飽和水性NH4Clでクエンチし、セライトで濾過する。濾液を100mlのEtOAcに加え、層を分離する。有機層をH2Oで洗浄し、MgSO4で乾燥し、濃縮する。粗生成物をシリカのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し(溶出液としてヘキサン中0〜30% EtOAc, EtOH中2%のKMnO4でTLCを染色してチェック)、4−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−3,6−ジヒドロ−2H−ピリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステルを黄色の油状物として得る。

0088

中間体7
4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロ−フェニル)−3,6−ジヒドロ−2H−ピリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル



110mlのDME/H2O(10:1(v/v))中の、2−メチル−4−ニトロ−5−イソプロポキシ−フェニルボロン酸ピナコールエステル(2.04g, 6.4mmol)、および4−トリフルオロメタンスルホニルオキシ−3,6−ジヒドロ−2H−ピリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル(3.2g, 9.6mmol)の溶液に、Pd(PPh3)4(365mg, 0.32mmol)およびCs2CO3(4.2g, 12.8mmol)を加える。該反応混合物を、N2下、80℃で終夜加熱する。室温に冷却した後、該反応物をセライトで濾過し、濾液を100mlのEtOAcで希釈し、H2Oで、そして塩水で連続して洗浄し、最後に真空で濃縮する。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し(溶出液としてヘキサン中5%〜15% EtOAc)、4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロ−フェニル)−3,6−ジヒドロ−2H−ピリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステルを黄色の油状物として得る。
1H NMR(CD3OD, 400 Mz): 7.59 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 5.67 (ブロードs, 1H), 4.73 (m, 1H), 4.06 (m, 2H), 3.65 (m, 2H), 2.37 (m, 2H), 2.25 (s, 3H), 1.50 (s, 9H), 1.33 (d, J = 6.0 Hz, 6H).

0089

中間体8
2−クロロ−4−イソプロポキシ−5−ニトロ−安息香酸



2−プロパノール(100ml)中の、2−クロロ−4−フルオロ−5−ニトロ−安息香酸(5.0g, 22.8mmol)、および炭酸セシウム(29.7g, 91.1mmol)の混合物を、50℃で終夜加熱する。溶媒を真空で除去し、100mlの水を加える。水性濃塩酸をこの溶液に0℃でpH=2になるまで滴下する。形成した沈殿生成物を濾過によって単離し、水によって洗浄し、真空下で乾燥し、2−クロロ−4−イソプロポキシ−5−ニトロ−安息香酸を得る。

0090

実施例1
6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−2−ピペリジン−4−イル−2,3−ジヒドロ−イソインドール−1−オン(178)

0091

段階1および2: 4−(2−クロロ−4−イソプロポキシ−5−ニトロ−ベンゾイルアミノ)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル



DCM(200ml)およびDMF(1ml)中の、2−クロロ−4−イソプロポキシ−5−ニトロ−安息香酸(中間体8, 10g, 38.5mmol)の溶液に、塩化チオニル(9.17g, 77mmol)を、シリンジを介してゆっくりと加える。該混合物を3時間撹拌し、次いで濃縮乾固する。得られた白色の固体、すなわち塩化2−クロロ−4−イソプロポキシ−5−ニトロ−ベンゾイルを、真空下で乾燥させる。DCM(100ml)中の、4−アミノ−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル(1.44g, 7.2mmol)およびトリエチルアミン(3ml, 21.6mmol)の混合物に、DCM(10ml)に溶解した塩化 2−クロロ−4−イソプロポキシ−5−ニトロ−ベンゾイル(2g, 7.2mmol)を、シリンジを介してゆっくりと加える。該混合物を室温で3時間撹拌し、次いで濃縮する。得られた固体を酢酸エチルに溶解し、水で、そして塩水でそれぞれ洗浄する。溶媒を蒸発させた後、表題化合物を明黄色の固体として得る。これをさらに精製することなく次の段階に直接用いる。

0092

段階3: 4−(4−イソプロポキシ−5−ニトロ−2−ビニル−ベンゾイルアミノ)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル



THF/H2O(100/25ml)中の、前の段階で得られた4−(2−クロロ−4−イソプロポキシ−5−ニトロ−ベンゾイルアミノ)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル(7.2mmol)、ビニルボロン酸ジブチルエステル(1.72g, 9.4mmol)、および炭酸ナトリウム(5.34g, 50.4mmol)の混合物に、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)(442mg, 5%mmol)を加える。該混合物をN2で3分間パージし、90℃で、N2下、終夜、コンデンサーを備えた丸底フラスコ中で加熱する。該混合物を室温まで冷却し、飽和塩アンモニウム水溶液に注ぐ。該混合物を酢酸エチル(3×100ml)で抽出する。有機抽出物を合わせて、塩水で洗浄し、濃縮する。粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによって精製し(ヘキサン中40% 酢酸エチル)、4−(4−イソプロポキシ−5−ニトロ−2−ビニル−ベンゾイルアミノ)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステルを白色の固体として得る。

0093

段階4、5および6: 4−(5−イソプロポキシ−6−ニトロ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル



先の段階で得られた4−(4−イソプロポキシ−5−ニトロ−2−ビニル−ベンゾイルアミノ)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル(1.9g, 4.38mmol)を、DCM(100ml)に溶解し、−78℃に冷却する。溶液の色が青/灰色に変わるまで、O3(g)を該溶液に通気する。次いで、青色が消失するまで、該溶液をN2(g)でパージする。該溶液を室温まで温め、DCM(100ml)中で予め膨潤させたトリフェニルホスフィン樹脂(5g)で処理する。30分後、該混合物を濾過し、濾液を濃縮し、得られた残渣をDCM/TFA(100ml/25ml)に溶解する。この混合物にトリエチルシラン(4.6ml, 17.5mmol)を加える。得られた混合物を室温で終夜撹拌する。該反応混合物を濃縮し、DCMに再度溶解する。該DCM溶液を、1N水性HCl(3×20ml)で洗浄する。合わせた水層を濃い水性NaOHでpH=12まで処理する。水層を酢酸エチル(3×30ml)で抽出する。合わせた有機層を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。有機溶媒の蒸発後、明黄色の固体が得られる。

0094

該固体を、メタノールおよびトリエチルアミンの混合物(100ml, 9:1(v/v))に溶解する。この混合物に、ジ−tert−ブチルジカーボネート(680mg, 3.1mmol)を加える。50℃で30分間撹拌した後、該混合物を濃縮し、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し(溶出液=ヘキサン中40〜50%酢酸エチル)、4−(5−イソプロポキシ−6−ニトロ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステルを白色の固体として得る。
1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 8.19 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 4.74 (q, 1H), 4.45-4.38 (m, 1H), 4.35 (s, 2H), 2.90-2.80 (m, 2H), 1.85-1.81 (m, 2H), 1.66-1.63 (m, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.42 (d, 6H).

0095

段階7、8および9
メタノール中の、先の段階で得られた4−(5−イソプロポキシ−6−ニトロ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル(850mg, 2mmol)の溶液に、Pd/C(10%,炭素上, 100mg)を加える。該混合物を1atmの水素ガス下で水素化する。4時間後、該混合物を濾過し、濃縮する。黄色の固体として得られたアニリンを、さらに精製することなく次の段階に用いる。THF(20ml)中の、先の段階で得られた粗生成物(2mmol)、(2,5−ジクロロ−ピリミジン−4−イル)−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−アミン(中間体2, 770mg, 2.2mmol)、炭酸セシウム(1.3g, 4mmol)およびxantphos(115mg, 0.2mmol)の混合物に、酢酸パラジウム(22mg, 5%mmol)を、マイクロ波チューブ中で加える。該混合物をN2で3分間パージする。密封管を、マイクロ波照射下で、150℃で20分間加熱する。該混合物を冷却し、濾過し、濃縮する。残渣を、シリカゲルのフラッシュカラム・クロマトグラフィーによって精製し(溶出液=ヘキサン中65%酢酸エチル)、黄色の固体を得る。該固体をDCM/TFA(1/1, 10ml)で1時間処理し、続いて真空下で濃縮する。分取RP LC-MSを用いて最終的な精製を行い、6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−2−ピペリジン−4−イル−2,3−ジヒドロ−イソインドール−1−オン(178)を白色の固体として得る。
1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 10.38 (s, 1H), 10.13 (s, 1H), 9.60-9.50 (br, 1H), 9.34-9.21 (br, 1H), 8.46 (d, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.91 (dd, 1H), 7.71 (m, 1H), 7.34 (t, 1H), 7.03 (s, 1H), 4.30 (m, 1H), 4.53 (m, 1H), 4.33 (s, 2H), 3.62 (m, 2H), 3.21-3.09 (m, 3H), 2.31-2.21 (m, 2H), 2.09-2.05 (m, 2H), 1.41 (d, 6H), 2.30 (d, 6H);
ESMS m/z 599.2 (M + H+).

0096

実施例2
6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−2−(1−メチル−ピペリジン−4−イル)−2,3−ジヒドロ−イソインドール−1−オン(181)

0097

段階1: 5−イソプロポキシ−2−(1−メチル−ピペリジン−4−イル)−6−ニトロ−インダン−1−オン



THF(5ml)およびメタノール(5ml)中の、5−イソプロポキシ−6−ニトロ−2−ピペリジン−4−イル−インダン−1−オン(実施例1, 段階5)の溶液に、ホルムアルデヒド(104.2μl, 1.39mmol)および10滴のAcOHを、連続して加える。該反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いでシアノ水素化ホウ素ナトリウム(175.1mg, 2.78mmol)を一度に加え、該反応物をさらに30分間撹拌する。該反応物を、飽和水性NH4Clによってクエンチし、真空で濃縮し、油状残渣を得る。この油状物をEtOAcと塩水の層間に分配し、有機抽出物をNa2SO4で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮する。シリカゲルのクロマトグラフィーにかけ(DCM中5% MeOH)、5−イソプロポキシ−2−(1−メチル−ピペリジン−4−イル)−6−ニトロ−インダン−1−オンを得る。
MS m/z 333.2 (M+1).

0098

段階2および3
先に記載した手順(実施例1, 段階7および8)に従って、段階1の生成物を用いて、表題化合物である6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−2−(1−メチル−ピペリジン−4−イル)−2,3−ジヒドロ−イソインドール−1−オン(181)を白色の固体として得る。
1H NMR400MHz (DMSO-d6+微量のD2O) δ 8.46 (d, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.82 (d, 1H), 7.74 (t, 1H), 7.36 (t, 1H), 7.33 (s, 1H), 4.75 (m, 1H), 4.41 (s, 2H), 4,29 (m, 1H), 3.65 (m, 2H), 3.44 (m, 1H), 3.17 (t, 2H), 2.79 (s, 3H), 2.07 (m, 2H), 1.98(d, 2H), 1.28 (d, 6H), 1.14 (d, 6H);
MS m/z 613 (M+1).

0099

実施例3
5−メチル−N2−[4−メチル−5−(1−メチル−1H−ピラゾール−4−イル)−2−(ピペリジン−4−イルオキシ)−フェニル]−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(35)

0100

段階1: 4−(4−クロロ−5−メチル−2−ニトロ−フェノキシ)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル



75mlのTHF中の4−クロロ−5−メチル−2−ニトロ−フェノール(3.752g, 20.0mmol)、4−ヒドロキシ−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル(4.83g, 24mmol)およびトリフェニルホスフィン(6.23g, 24mmol)の混合物に、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(4.73ml, 245mmol)を、数回に分けて22℃で1時間かけて加える。該反応物を、同じ温度で、さらに2時間撹拌する。該反応混合物を真空で濃縮する。残渣を50mlのエーテルに溶かし、22℃で14時間放置する。得られた結晶を濾過によって除去する。濾液を真空で濃縮し、残渣を330gのSiO2カラム(ISCO)で、ヘキサン中20から40%酢酸エチルの濃度勾配を溶出液として用いて精製し、4−(4−クロロ−5−メチル−2−ニトロ−フェノキシ)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステルを暗黄色の粘稠な油状物として得る。
MS (ES+);315.1 (MH+ -C4H8), 393.1 (MNa+).

0101

段階2: 4−[5−メチル−4−(1−メチル−1H−ピラゾール−4−イル)−2−ニトロ−フェノキシ]−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル



4mlの1,4−ジオキサン/H2O(3/1)中の、先の段階で得られた4−(4−クロロ−5−メチル−2−ニトロ−フェノキシ)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル(375.8mg, 1.01mmol)、1−メチル−4−(4,4,5,5−テトラメチル−[1,3,2]ジオキサボロラン−2−イル)−1H−ピラゾール(Boron Molecular, 224.4mg, 1.08mmol)、リン酸三カリウム一水和物(392mg)、Pd2(dba)3(45mg)およびジシクロホスフィノビフェニル(43mg)の混合物を、密封管中、マイクロ波照射下で、150℃で20分間加熱する。該反応混合物をセライトの小さいなプラグで濾過し、Na2SO4で乾燥し、濃縮する。残渣をSiO2カラム(ISCO)を用いて精製し、4−[5−メチル−4−(1−メチル−1H−ピラゾール−4−イル)−2−ニトロ−フェノキシ]−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステルを得る。
MS (ES+);417.3 (MH+), 439.2 (MNa+).

0102

段階3、4および5
実施例1の合成に記載された手順(段階7、8および9)と同じ手順を用いて、分取RP LC-MSを用いて最終的な精製を行い、5−メチル−N2−[4−メチル−5−(1−メチル−1H−ピラゾール−4−イル)−2−(ピペリジン−4−イルオキシ)−フェニル]−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(35)を得る。
MS (ES+): 576.3 (MH+).

0103

実施例4
1−(5−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−4−イソプロポキシ−2−メチル−フェニル)−エタノン(36)

0104

段階1: 2−(4−イソプロポキシ−2−メチル−5−ニトロ−フェニル)−2−メチル−[1,3]ジオキソラン



60mlのベンゼン中の1−(4−イソプロポキシ−2−メチル−5−ニトロ−フェニル)−エタノン(0.788g, 3.32mmol)、エチレングリコール(1.8ml)およびp−トルエンスルホン酸一水和物(6.3mg)の混合物を、Dean-Starkトラップで、18時間還流する。該反応混合物を100mlの酢酸エチルで希釈し、それぞれ100mlの飽和水性NaHCO3で、H2Oで、そして飽和塩水で連続して洗浄する。有機相無水Na2SO4で乾燥し、濾過し、真空で濃縮し、2−(4−イソプロポキシ−2−メチル−5−ニトロ−フェニル)−2−メチル−[1,3]ジオキソランを黄色の結晶として得る。
MS (ES+): 282.2 (MH+).

0105

段階2および3: 5−クロロ−N2−[2−イソプロポキシ−4−メチル−5−(2−メチル−[1,3]ジオキソラン−2−イル)−フェニル]−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン



実施例1の合成に記載された手順(段階7および8)と同じ手順を用いて、出発物質として先の段階で得られた2−(4−イソプロポキシ−2−メチル−5−ニトロ−フェニル)−2−メチル−[1,3]ジオキソランを用いて、シリカゲルのクロマトグラフィーを用いて精製し(ヘキサン中2%から20% EtOAcの濃度勾配)、5−クロロ−N2−[2−イソプロポキシ−4−メチル−5−(2−メチル−[1,3]ジオキソラン−2−イル)−フェニル]−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミンを白色の固体として得る。
MS (ES+): 561.2 (MH+).

0106

段階4
5mlの1,4−ジオキサン中の、先の段階で得られた5−クロロ−N2−[2−イソプロポキシ−4−メチル−5−(2−メチル−[1,3]ジオキソラン−2−イル)−フェニル]−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(84mg, 0.15mmol)の溶液を、1mlの1N水性HClで、22℃で2時間処理する。該反応物を後処理し、1−(5−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−4−イソプロポキシ−2−メチル−フェニル)−エタノン(36)を得る。
MS (ES+): 517.2 (MH+).

0107

実施例5
N2−{2−イソプロポキシ−4−メチル−5−[1−(2−モルホリン−4−イル−エチル)−1H−ピラゾール−4−イル]−フェニル}−5−メチル−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(37)

0108

段階1: 4−ブロモ−5−メチル−2−ニトロ−フェノール



30mlのジクロロメタン中の、4−ブロモ−3−メチル−フェノール(1.122g, 6.00mmol)およびYb(CF3SO3)3(372mg)を、0.38mlの濃HNO3で、22℃で処理する。同じ温度で1時間撹拌した後、さらに0.1mlの濃HNO3を加え、該反応物をさらに1時間撹拌する。該反応混合物をH2Oで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮する。残渣をSiO2カラム(ISCO)を用いて精製し、黄色の結晶として4−ブロモ−5−メチル−2−ニトロ−フェノール、および橙色の結晶として副生成物であるその回転異性体の混合物を得る。

0109

段階2: 1−ブロモ−4−イソプロポキシ−2−メチル−5−ニトロ−ベンゼン



10mlのTHF中の、先の段階で得られた4−ブロモ−5−メチル−2−ニトロ−フェノール(0.66g, 2.84mmol)、2−プロパノール(0.262ml)およびトリフェニルホスフィン(894mg)の混合物に、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(0.671ml)を、22℃で加える。該反応混合物を真空で濃縮する。残渣をSiO2カラム(ISCO)を用いて精製し、1−ブロモ−4−イソプロポキシ−2−メチル−5−ニトロ−ベンゼンを明黄色の固体として得る。

0110

段階3: 5−ブロモ−2−イソプロポキシ−4−メチル−フェニルアミン



20mlのエタノール中の、先の段階で得られた1−ブロモ−4−イソプロポキシ−2−メチル−5−ニトロ−ベンゼン(0.734g, 2.68mmol)および鉄(粉末, 325メッシュ, 1.05g)に、1mlの1N水性HClを氷浴中で冷却しながら加える。添加後、該反応物を2時間還流する。次いで、さらに0.5gの鉄を加え、該反応物をさらに2時間還流する。該反応混合物を冷却し、セライトのパッドで濾過する。濾液を真空で濃縮し、5−ブロモ−2−イソプロポキシ−4−メチル−フェニルアミンを橙色の油状物として得る。該生成物を、さらに精製することなく次の段階に用いる。

0111

段階4: N2−(5−ブロモ−2−イソプロポキシ−4−メチル−フェニル)−5−メチル−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン



先の段階で得られた5−ブロモ−2−イソプロポキシ−4−メチル−フェニルアミン(537mg, 2.20mmol)および2−クロロ−N−(2−(イソプロピルスルホニル)フェニル)−5−メチルピリミジン−4−アミン(中間体1, 652mg, 2.00mmol)を、メタンスルホン酸(0.143ml)の存在下、4mlの2−プロパノール中で、密封管中、マイクロ波照射下で、140℃で30分間縮合させる。後処理後、N2−(5−ブロモ−2−イソプロポキシ−4−メチル−フェニル)−5−メチル−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミンを得る。
MS (ES+): 535.1 (MH+).

0112

段階5
1mlの1,4−ジオキサン/H2O(3/1(v/v))中の、先の段階で得られたN2−(5−ブロモ−2−イソプロポキシ−4−メチル−フェニル)−5−メチル−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(53mg, 0.099mmol)、4−{2−[4−(4,4,5,5−テトラメチル−[1,3,2]ジオキサボロラン−2−イル)−ピラゾール−1−イル]−エチル}−モルホリン(Boron Molecular, 61mg, 0.20mmol)、K3PO4(58mg)、Pd2(dba)3(10mg)、およびトリシクロヘキシルホスフィン(8mg)の混合物を、密封管中、マイクロ波照射下で、150℃で20分間加熱する。該反応混合物を、セライトの小さなプラグで濾過し、濃縮する。分取RP LC-MSを用いて最終的な精製を行い、N2−{2−イソプロポキシ−4−メチル−5−[1−(2−モルホリン−4−イル−エチル)−1H−ピラゾール−4−イル]−フェニル}−5−メチル−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(37)を得る。
MS (ES+): 634.3 (MH+).

0113

実施例6
5−クロロ−N2−(2−イソプロポキシ−5−メチル−4−モルホリン−4−イルメチル−フェニル)−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(60)

0114

段階1および2: 1−クロロ−5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロ−ベンゼン



THF/H2O(20/5ml)中の、1−クロロ−2−メチル−4−ニトロ−5−イソプロポキシ−ベンゼン(中間体4, 870mg, 3.77mmol)、ビニルボロン酸ジブチルエステル(1.24ml, 5.6mmol)、および炭酸ナトリウム(2.8g, 26.4mmol)の混合物に、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)(132mg, 5%mmol)を加える。反応管を密封し、該混合物をN2で3分間パージし、次いで、90℃で、N2下で終夜加熱する。該反応物を室温まで冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液に注ぐ。粗製の反応混合物を、酢酸エチル(3×100ml)で抽出する。有機抽出物を合わせて、塩水で洗浄し、濃縮する。粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによって精製し(ヘキサン中10% 酢酸エチル)、1−メチル−5−ニトロ−4−プロポキシ−2−ビニル−ベンゼンを黄色の固体として得る。先の段階で得られた1−メチル−5−ニトロ−4−プロポキシ−2−ビニル−ベンゼン(360mg, 1.63mmol)を、DCM(20ml)に溶解させ、−78℃に冷却する。溶液の色が青/灰色に変わるまで、該溶液にO3(g)を通気する。次いで、青色が消失するまで該溶液をN2(g)でパージする。該溶液を室温まで温め、DCM(30ml)中で予め膨潤させたトリフェニルホスフィン樹脂(2g)で処理する。30分後、該混合物を濾過し、濾液を濃縮し、2−メチル−4−ニトロ−5−プロポキシ−ベンズアルデヒドを黄色の固体として得る。

0115

段階3および4: 2−イソプロポキシ−5−メチル−4−モルホリン−4−イルメチル−フェニルアミン



MeOH/THF(0.5/0.5ml)中の、先の段階で得られた2−メチル−4−ニトロ−5−プロポキシ−ベンズアルデヒド(34mg, 0.152mmol)の溶液に、酢酸(5滴)を加える。該混合物を室温で1時間撹拌する。次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(20mg, 0.30mmol)を加える。30分間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を添加することによって、該反応物をクエンチする。該反応混合物を酢酸エチル(3×5ml)で抽出する。有機相を合わせて、濃縮し、アミン生成物を黄色の油状物として得る。これをさらに精製することなく次の段階に直接用いる。メタノール(5ml)中の、先の段階で得られた生成物の溶液に、Pd/C(10%/炭素, 2mg)を加える。該混合物を1atmの水素下で水素化する。4時間後、該混合物を濾過し、濃縮する。得られたアニリン生成物(黄色の固体)を、さらに精製することなく次の段階に用いる。

0116

段階5
THF(2ml)中の、先の段階で得られたアニリン生成物(0.152mmol)、(2,5−ジクロロ−ピリミジン−4−イル)−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−アミン(中間体2, 52mg, 0.152mmol)、炭酸セシウム(99mg, 0.30mmol)、およびxantphos(8mg, 0.02mmol)の混合物に、酢酸パラジウム(2mg, 5%mmol)を、マイクロ波チューブ中で加える。該混合物をN2で3分間パージし、次いで、密封管を、マイクロ波照射下、150℃で20分間加熱する。該反応物を濾過し、濃縮し、分取RP LC-MS(マストリガー)によって精製し、表題化合物である5−クロロ−N2−(2−イソプロポキシ−5−メチル−4−モルホリン−4−イルメチル−フェニル)−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(60)を黄色の固体として得る。
1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 10.35 (s, 1H), 8.38 (d, 1H0, 7.93 (d, 1H), 7.59 (m, 2H), 7.41-7.36 (m, 2H), 4.70-4.63 (br, 1H), 4.30-4.18 (br, 2H), 4.15-4.10 (br, 2H), 4.00-3.97 (br, 2H), 3.52-3.46 (br, 2H), 3.20 (m, 1H), 2.95-2.84 (br, 2H), 2.24 (s, 3H), 1.31 (d, 12H);
ESMS m/z 574.2 (M + H+).

0117

実施例7
5−クロロ−N2−(2−イソプロポキシ−5−メチル−4−ピペリジン−4−イル−フェニル)−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(66)

0118

段階1: 4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロ−フェニル)−ピリジン



4−ピリジンボロン酸(147mg, 1.20mmol, 1.1当量)を、ジオキサンおよびH2O(15ml)の2:1(v/v)混合物に溶解し、N2を5分間通気する。トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)(100mg, 0.109mmol, 0.1当量)、2−ジシクロヘキシルホスフィン−2',6'−ジメトキシビフェニル(112mg, 0.272mmol, 0.25当量)、1−クロロ−5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロ−ベンゼン(中間体4, 250mg, 1.09mmol, 1.0当量)、およびK3PO4(462mg, 2.18mmol, 2.0当量)を、N2ブランケット下で加える。反応容器を密封し、マイクロ波照射下、150℃で20分間加熱する。室温まで冷却した後、該反応物を酢酸エチルで希釈し、1N水性NaOH(2×)で洗浄し、次いで有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過する。濃縮後、粗生成物を、シリカゲルのクロマトグラフィーによって精製し(ヘキサンからヘキサン中30%酢酸エチルの濃度勾配)、4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロ−フェニル)−ピリジンを褐色の固体として得る。
ESMS m/z 273.1 (M + H+).

0119

段階2および3: 4−(4−アミノ−5−イソプロポキシ−2−メチル−フェニル)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル



酢酸(30ml)に溶解した先の段階で得られた4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロ−フェニル)−ピリジン(438mg, 1.61mmol)を、TFA(0.24ml, 3.22mmol)およびPtO2(176mg, 40%(w/w))で処理する。該反応混合物を、1atmのH2下で36時間激しく撹拌する。該反応混合物を濾過し、濾液を真空下で濃縮する。得られた残渣を酢酸エチルで希釈し、1N水性NaOH(2×)で洗浄し、有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過する。濃縮後、粗生成物(391mg)を無水CH2Cl2(30ml)に溶解する。TEA(0.44ml, 3.15, 2当量)を加え、続いてBoc2O(344mg, 1.57当量, 1当量)を加える。該反応物を室温で30分間撹拌する。該反応物を真空下で濃縮する。得られた残渣を、シリカゲルのクロマトグラフィーによって精製し(ヘキサンからヘキサン中30% 酢酸エチルの濃度勾配)、4−(4−アミノ−5−イソプロポキシ−2−メチル−フェニル)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステルを粘着性泡沫として得る。
ESMS m/z 293.1 (M-tBu+H)+.

0120

段階4および5
先の段階で得られた4−(4−アミノ−5−イソプロポキシ−2−メチル−フェニル)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル(170mg, 0.488mmol)、(2,5−ジクロロ−ピリミジン−4−イル)−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−アミン(中間体2, 169mg, 0.488mmol, 1当量)、xantphos(28mg, 0.049mmol, 0.1当量)、酢酸パラジウム(5.5mg, 0.024mmol, 0.05当量)、およびCs2CO3(477mg, 1.46mmol, 3当量)を、無水THF(6ml)に溶解する。N2を反応混合物に5分間通気し、次いで反応容器を密封し、マイクロ波照射で、150℃で20分間加熱する。該反応物を濾過し、濾液を真空下で濃縮する。濃縮後、粗生成物をシリカゲルのクロマトグラフィーによって精製し(ヘキサンからヘキサン中30%酢酸エチルの濃度勾配)、4−(4−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−2−メチル−フェニル)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステルを、黄色のフィルム状物質として得る:ESMS m/z 658.3 (M + H+)。この生成物(105mg, 0.160mmol)をCH2Cl2(3ml)に溶解し、TFA(3ml)で処理する。45分後、該反応物を真空下で濃縮する。Et2O中1N HCl(5ml×2)を添加すると、生成物である塩酸塩沈殿が起こる。溶媒を傾斜によって除去する。得られた5−クロロ−N2−(2−イソプロポキシ−5−メチル−4−ピペリジン−4−イル−フェニル)−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(66)を、高真空下で乾燥し、灰白色の粉末を得る。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6+微量のD2O) δ 8.32 (s, 1H), 8.27 (d, 1H), 7.88 (d, 1H), 7.67 (dd, 1H), 7.45 (dd, 1H), 7.42 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 4.56-4.48 (m, 1H), 3.49-3.32 (m, 3H), 3.10-2.91 (m, 3H), 2.09 (s, 3H), 1.89-1.77 (m, 4H), 1.22 (d, 6H), 1.13 (d, 6H);
ESMS m/z 558.1 (M + H+).

0121

実施例8
5−クロロ−N2−[2−イソプロポキシ−5−メチル−4−(1−メチル−ピペリジン−4−イル)−フェニル]−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(67)

0122

段階1:ヨウ化4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロ−フェニル)−1−メチル−ピリジニウム



4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロ−フェニル)−ピリジン(実施例7, 段階1, 217mg, 0.797mmol)を、無水THF(9ml)に溶解する。ヨードメタン(0.10ml, 1.61mmol, 2当量)を加え、該反応物を、40℃で、密封管中、2日間撹拌する。揮発成分を真空下で除去し、ヨウ化 4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロ−フェニル)−1−メチル−ピリジニウムを褐色の固体として得る。
ESMS m/z 287.1 (M+).

0123

段階2および3: 2−イソプロポキシ−5−メチル−4−(1−メチル−ピペリジン−4−イル)−フェニルアミン



先の段階から得られたヨウ化4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロ−フェニル)−1−メチル−ピリジニウム(0.697mmol)をCH3OH(20ml)に溶解し、0℃まで冷却する。NaBH4(264mg, 6.97mmol, 10当量)をゆっくりと加える。この添加が完了した後、冷却浴を除き、該反応物を室温で1時間撹拌する。1N水性HCl(14ml)をゆっくりと添加することによって、反応をクエンチする。CH3OHを真空によって一部除去する。得られた残渣を、EtOAcと1N 水性NaOHの層間に分配する。さらに、水層がpH>12になるまで、50% 水性NaOHを加える。EtOAc層を、1N 水性NaOH(2×)で洗浄し、次いで有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮する。濃縮後、粗生成物(175mg)を酢酸(10ml)に溶解する。TFA(0.15ml, 3当量)およびPtO2(53mg, 30%(w/w))を加え、該反応物を、50psiのH2ガス下、Parr Shaker中で、14時間置く。該反応混合物を濾過し、濾液を真空下で濃縮する。得られた残渣をEtOAcと1N 水性NaOHの層間に分配する。さらに、水層がpH>12になるまで、50% 水性NaOHを加える。EtOAc層を1N 水性NaOH(2×)で洗浄し、次いで有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮し、2−イソプロポキシ−5−メチル−4−(1−メチル−ピペリジン−4−イル)−フェニルアミンを得る。これをさらに精製することなく段階4に用いる。
ESMS m/z 263.2 (M + H+).

0124

段階4
実施例7(段階4)の合成に記載された手順と同じ手順を用いて、分取RP LC-MSを用いて最終精製を行い、5−クロロ−N2−[2−イソプロポキシ−5−メチル−4−(1−メチル−ピペリジン−4−イル)−フェニル]−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(67)を薄黄色の粉末として得る。
(HCl塩,DMSO-d6+微量のD2O) δ 8.28 (s, 1H), 8.19 (d, 1H), 7.86 (d, 1H), 7.66 (dd, 1H), 7.45 (dd, 1H), 7.37 (s, 1H), 6.77 (s, 1H), 4.56-4.49 (m, 1H), 3.51-3.37 (m, 3H), 3.16-3.08 (m, 2H), 2.98-2.88 (m, 1H), 2.77 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 1.90-1.81 (m, 4H), 1.19 (d, 6H), 1.11 (d, 6H);
ESMS m/z 572.2 (M + H+).

0125

実施例9
2−[4−(4−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−2−メチル−フェニル)−ピペリジン−1−イル]−エタノール(72)



5−クロロ−N2−(2−イソプロポキシ−5−メチル−4−ピペリジン−4−イル−フェニル)−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(実施例7, 0.087mmol)を、無水DMF(1ml)に溶解する。TEA(0.04ml, 0.262mmol, 3当量)を添加し、続いて無水DMF(0.7ml)に溶解した2−ブロモ−エタノール(0.019ml, 0.262mmol, 3当量)を添加する。反応容器を密封し、70℃で12時間加熱する。室温まで冷却後、該反応物を酢酸エチルで希釈し、1N水性NaOH(5×)で洗浄し、次いで有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過する。濃縮後、粗生成物を分取RP LC-MSを用いて精製し、2−[4−(4−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−2−メチル−フェニル)−ピペリジン−1−イル]−エタノール(72)を黄色の粉末として得る。
ESMS m/z 602.2 (M + H+).

0126

実施例10
2−[4−(6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−イル]−アセトアミド(149)



DMF(1.5ml)中の、6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−2−ピペリジン−4−イル−2,3−ジヒドロ−イソインドール−1−オン(実施例1, 20mg, 0.033mmol)およびトリエチルアミン(23μl, 0.165mmol)の混合物に、2−ブロモ−アセトアミド(10mg, 0.066mmol)を加える。該混合物を60℃で4時間撹拌する。該反応物を濾過し、濾液をマストリガー分取RP LC-MSによって精製し、表題化合物である2−[4−(6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−イル]−アセトアミド(136)を白色の固体として得る。
1H NMR(400MHz, MeOD-d4) δ 8.41 (d, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.21 (br, 1H), 7.93 (dd, 1H), 7.73 (m, 1H), 7.40 (dd, 1H), 7.30 (s, 1H), 4.52 (s, 2H), 4.45-4.37 (m, 1H), 4.19-4.15 (br, 2H), 3.87-3.78 (br, 2H), 2.37-2.19 (m, 2H), 2.20-2.15 (m, 1H), 1.40 (d, 6H), 1.25 (d, 6H);
ESMS m/z 656.2 (M + H+).

0127

実施例11
4−(6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−カルボン酸ジメチルアミド(155)



DMF(1.5ml)中の6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−2−ピペリジン−4−イル−2,3−ジヒドロ−イソインドール−1−オン(実施例1, 20mg, 0.033mmol)およびトリエチルアミン(23μl, 0.165mmol)の混合物に、塩化ジメチルカルバミル(11mg, 0.1mmol)を加える。該混合物を室温で1時間撹拌する。該反応物を濾過し、濾液をマストリガー分取RP LC-MSによって精製し、表題化合物である4−(6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−カルボン酸 ジメチルアミド(155)を白色の固体として得る。
1H NMR(400MHz, MeOD-d4) δ 8.29 (s, 1H), 8.26 (br, 1H), 7.96 (dd, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.72(dd, 1H), 7.48 (dd, 1H), 7.35 (s, 1H), 4.50 (s, 2H), 4.35-4.29 (m, 1H), 3.83 (d, 2H), 3.38-3.30 (m, 2H), 3.02-2.95 (m, 3H), 2.88 (s, 6H), 1.88-1.84 (m, 3H), 1.36 (d, 6H), 1.25 (d, 6H);
ESMS m/z 670.2 (M + H+).

0128

実施例12
N2−(5−エチニル−2−イソプロポキシ−4−メチル−フェニル)−5−メチル−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(257)

0129

段階1: N2−(2−イソプロポキシ−4−メチル−5−トリメチルシラニルエチニル−フェニル)−5−メチル−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン



1mlの1,4−ジオキサン中の、N2−(5−ブロモ−2−イソプロポキシ−4−メチル−フェニル)−5−メチル−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(実施例5, 段階4, 110mg, 0.21mmol)、エチニル−トリメチルシラン(0.14ml)、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.10ml)、PdCl2(PhCN)2(12mg)、tBu3PHBF4(17mg)およびCuI(4mg)の混合物を、22℃で20時間撹拌し、続いて60℃でさらに2時間加熱する。該反応混合物をセライトの小さいプラグで濾過し、濃縮する。残渣を、4gのSiO2カラム(ISCO)で、ヘキサン中0〜20%酢酸エチルの濃度勾配を溶出液として用いて精製し、N2−(2−イソプロポキシ−4−メチル−5−トリメチルシラニルエチニル−フェニル)−5−メチル−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミンを黄色の粘稠な油状物として得る。

0130

段階2
2.5mlのTHF中の、先の段階で得られたN2−(2−イソプロポキシ−4−メチル−5−トリメチルシラニルエチニル−フェニル)−5−メチル−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(0.102g, 0.18mmol)の溶液を、TBAF(0.5ml, THF中1M)および30μlのAcOHで、22℃で2時間処理する。該反応混合物を濃縮し、残渣を、4gのSiO2カラム(ISCO)を用いて精製し、N2−(5−エチニル−2−イソプロポキシ−4−メチル−フェニル)−5−メチル−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(257)を得る。
MS (ES+): 479.2 (MH+).

0131

実施例13
4−(6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−カルボン酸エチルエステル(175)



DMF(0.5ml)中の、6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−2−ピペリジン−4−イル−2,3−ジヒドロ−イソインドール−1−オン(実施例1, 15mg, 0.025mmol)およびトリエチルアミン(37.5μl, 0.25mmol)の混合物に、クロロ蟻酸エチル(5.4mg, 0.05mmol)を加える。該混合物を室温で1時間撹拌する。粗製の反応混合物を、マストリガー分取RP LC-MSによって精製し、表題化合物である4−(6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−カルボン酸エチルエステル(175)を白色の固体として得る。
1H NMR400MHz (DMSO-d6+微量のD2O) δ 8.55 (d, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.82 (dd,1H), 7.74 (t, 1H), 7.34 (t, 1H), 7.28 (s, 1H), 4.73 (m, 2H), 4.39 (s, 2H), 4.12 (m, 2H), 4.06 (q, 2H), 3.46 (m, 1H), 2.92 (m 2H), 1.76 (m, 2H), 1.68 (m, 2H), 1.29 (d, 6H), 1.20 (t, 3H), 1.17 (d, 6H);
MS m/z 671 (M+1).

0132

実施例14
5−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−6−イソプロポキシ−2−(1−メチル−ピペリジン−4−イル)−イソインドール−1,3−ジオン(176)

0133

段階1: 4−(1−ヒドロキシ−6−イソプロポキシ−5−ニトロ−3−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル



50mlのDCMに溶解した4−(4−イソプロポキシ−5−ニトロ−2−ビニル−ベンゾイルアミノ)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル(実施例1, 段階3, 1.2g, 2.77mmol)を、−78℃まで冷却する。出発物質が消費されるまでオゾンガスをこの溶液に通気し、次いで窒素ガスを該溶液に5分間通気する。該反応混合物を室温まで温める。10mlのDCM中のトリフェニルホスフィン樹脂(2.77g)を加え、得られた混合物を1.5時間撹拌する。樹脂を濾過によって除去し、濾液を濃縮する。シリカゲルのクロマトグラフィーにかけ(DCM中5% MeOH)、4−(1−ヒドロキシ−6−イソプロポキシ−5−ニトロ−3−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステルを得る。
MS m/z 336.2 (M-Boc + H+).

0134

段階2、3および4: 5−イソプロポキシ−2−(1−メチル−ピペリジン−4−イル)−6−ニトロ−インダン−1,3−ジオン



DMF(4ml)中の先の段階で得られた4−(1−ヒドロキシ−6−イソプロポキシ−5−ニトロ−3−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステル(173.9mg, 0.4mmol)の溶液に、重クロム酸ピリジニウム(286.5mg, 0.8mmol)を一度に加える。室温で2時間撹拌した後、該反応混合物を25mlの水に注ぎ、該生成物をEtOAcで抽出する。有機抽出物をNa2SO4で乾燥し、濾過し、真空で濃縮し、粗製の4−(5−イソプロポキシ−6−ニトロ−1,3−ジオキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステルを得る。これを、さらに精製することなく次の段階に直接用いる。

0135

3mlのDCM中の、先の段階で合成された4−(5−イソプロポキシ−6−ニトロ−1,3−ジオキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステルの溶液に、TFA(3ml)を加える。該反応混合物を室温で1時間撹拌する。濃縮後、水(5ml)を粗製の反応混合物に加え、NaHCO3を添加することによって、得られた混合物をpH=8に中和し、該生成物をDCMで抽出する。有機抽出物を、Na2SO4で乾燥し、濾過し、真空で濃縮し、粗製の5−イソプロポキシ−6−ニトロ−2−ピペリジン−4−イル−イソインドール−1,3−ジオンを得る。これを、さらに精製することなく次の段階に直接用いる。

0136

THF(5ml)およびメタノール(5ml)中の、先の段階で得られた5−イソプロポキシ−6−ニトロ−2−ピペリジン−4−イル−イソインドール−1,3−ジオンの溶液に、ホルムアルデヒド(30μl, 0.4mmol)および2滴のAcOHを、連続して加える。反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いでシアノ水素化ホウ素ナトリウム(50.4mg, 0.8mmol)を一度に加え、得られた混合物を、さらに30分間撹拌する。飽和水性NH4Clを添加することによって、反応をクエンチし、続いて真空で濃縮し、油状残渣を得る。この油状物を、EtOAcと塩水の層間に分配する。有機抽出物をNa2SO4で乾燥し、濾過し、濃縮する。シリカゲルのクロマトグラフィーにかけ(DCM中5% MeOH)、5−イソプロポキシ−2−(1−メチル−ピペリジン−4−イル)−6−ニトロ−インダン−1,3−ジオンを得る。
MS m/z 347.2 (M+1).

0137

段階5および6
先に記載された手順(実施例1, 段階7および8)に従って、段階4の手順を用いて、表題化合物である5−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−6−イソプロポキシ−2−(1−メチル−ピペリジン−4−イル)−イソインドール−1,3−ジオン(176)を黄色の固体として得る。
1H NMR400MHz (DMSO-d6+微量のD2O) δ 8.44 (s, 2H), 8.39 (s, 1H), 7.87 (dd, 1H), 7.78 (dt, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.41 (m, 1H), 4.91(m, 2H), 4.25(m, 2H), 3.51 (m, 3H), 3.10(m, 2H), 2.77(s, 3H), 1.80(m, 2H), 1.35(d, 6H), 1.13(d, 6H);
MS m/z 627 (M+1).

0138

実施例15
(2S,4S)−4−(6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピロリジン−2−カルボン酸アミド(177)

0139

段階1: (2S,4S)−4−(6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピロリジン−2−カルボン酸メチルエステル



先に記載された手順(実施例1)に従って、4−アミノ−ピペリジン−1−カルボン酸tert−ブチルエステルの代わりにN−Boc−cis−4−アミノ−L−プロリンメチルエステルを用いて、(2S,4S)−4−(6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピロリジン−2−カルボン酸メチルエステルを合成する。
MS m/z 643.2 (M+1).

0140

段階2
段階1で合成した(2S,4S)−4−(6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピロリジン−2−カルボン酸メチルエステル(20mg, 0.03mmol)を、MeOH中7Nアンモニア溶液(3ml, 21mmol)に溶解する。得られた溶液を、マイクロ波照射を用いて、120℃で1時間加熱する。室温まで冷却した後、該反応混合物を真空で濃縮し、飽和水性NaHCO3でpH=8まで中和し、DCMで抽出する。有機抽出物をNa2SO4で乾燥し、濾過し、真空で濃縮し、(2S,4S)−4−(6−{5−クロロ−4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニルアミノ]−ピリミジン−2−イルアミノ}−5−イソプロポキシ−1−オキソ−1,3−ジヒドロ−イソインドール−2−イル)−ピロリジン−2−カルボン酸アミド(177)を黄色の固体として得る。
1H NMR400MHz (DMSO-d6+微量のD2O) δ 8.47 (d, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.78 (dd, 1H), 7.68 (m, 1H), 7.31(t, 1H), 7.24 (s, 1H), 4.71 (m, 2H), 4.43 (dd, 2H), 3.60 (m, 1H), 3.44 (m, 1H), 3.35 (m,1H), 2.63 (m, 1H), 2.28 (m, 1H), 1.22 (d, 6H), 1.10 (d, 6H);
MS m/z 628 (M+1).

0141

実施例16
5−クロロ−N2−[4−(4−ジメチルアミノ−シクロヘキシル)−2−イソプロポキシ−5−メチル−フェニル]−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(21)

0142

段階1: 1,4−ジオキサスピロ[4.5]デカ−7−エン−8−イルトリフルオロメタンスルホネート



トルエン(4.7ml, 2.34mmol)中の、0.5M KHMDSの溶液を、乾燥THF(18ml)中の、1,4−ジオキサスピロ[4.5]デカン−8−オン(1.80mmol)およびN−フェニルトリフルオロメタンスルホンイミド(2.34mmol)の溶液に、−78℃で、アルゴン下で加える。−78℃で4時間撹拌した後、H2Oで該混合物をクエンチし、ジエチルエーテルで抽出し、MgSO4で乾燥させる。後処置し、シリカのフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン/EtOAc 90:10)にかけた後、1,4−ジオキサスピロ[4.5]デカ−7−エン−8−イル トリフルオロメタンスルホネートを単離する。
1H NMR(CDCl3, 400MHz) δ 5.66 (m, 1H), 3.98 (m. 4H), 2.53 (m, 2H), 2.40 (m, 2H), 1.90 (t, 2H).
MS (ES+): 289.0 (M+1)+.

0143

段階2: 8−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロフェニル)−1,4−ジオキサスピロ[4.5]デカ−7−エン



[Pd(PPh3)4](0.013mmol)およびK3PO4・H2O(0.045mmol)を含むTHF(3ml)中の、1,4−ジオキサスピロ[4.5]デカ−7−エン−8−イルトリフルオロメタンスルホネート(0.03mmol)および2−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロフェニル)−4,4,5,5−テトラメチル−1,3,2−ジオキサボロラン(中間体5, 0.04mmol)の溶液を、撹拌しながら、80℃で、アルゴン下、16時間加熱する。後処理し、シリカのフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン/EtOAc 4:1)にかけた後、8−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロフェニル)−1,4−ジオキサスピロ[4.5]デカ−7−エンが得られる。
1H NMR(CDCl3, 400MHz) δ 7.62 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 5.74 (m, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.04 (m. 4H), 2.47 (m, 4H), 2.27 (s, 3H), 1.89 (t, 2H), 1.29 (d. 6H).
MS (ES+): 334.16 (M+1)+.

0144

段階3: 4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロフェニル)シクロヘキサ−3−エノン



2.5mlのTFAおよびCH2Cl2(1:4(v/v))中の、8−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロフェニル)−1,4−ジオキサスピロ[4.5]デカ−7−エン(0.1mmol)の溶液を、室温で6時間撹拌する。後処理し、シリカのフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン/EtOAc 4:1)にかけた後、4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロフェニル)シクロヘキサ−3−エノンが得られる。
1H NMR(CDCl3, 400MHz) δ 7.63 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 5.73 (m, 1H), 4.62 (m, 1H), 3.07 (m, 2H), 2.68 (m, 4H), 2.27 (s, 3H), 1.37 (d. 6H).
MS (ES+): 290.13 (M+1)+.

0145

段階4: 4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロフェニル)−N,N−ジメチルシクロヘキサ−3−エンアミン



2mlの1,2−ジクロロエタン中の、4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロフェニル)シクロヘキサ−3−エノン(0.1mmol)およびジメチルアミン(0.11mmol)の溶液に、AcOH(0.1mmol)およびNaBH(OAc)3(0.11mmol)を加える。該反応混合物を、室温で10時間撹拌する。後処理し、シリカのフラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2/MeOH 9:1)にかけた後、4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロフェニル)−N,N−ジメチルシクロヘキサ−3−エンアミンが得られる。
MS (ES+): 319.19 (M+1)+.

0146

段階5: 4−(4−(ジメチルアミノ)シクロヘキシル)−2−イソプロポキシ−5−メチルアニリン



10mlのMeOH中の4−(5−イソプロポキシ−2−メチル−4−ニトロフェニル)−N,N−ジメチルシクロヘキサ−3−エンアミン(0.1mmol)の溶液に、Pd/C(5mg)を、アルゴン下で加える。該懸濁液を、1atmのH2下で、6時間撹拌する。濾過後、溶媒を除去し、4−(4−(ジメチルアミノ)シクロヘキシル)−2−イソプロポキシ−5−メチルアニリンが得られる。
MS (ES+): 291.24 (M+1)+.

0147

段階6
先に記載された手順(実施例7, 段階4)に従って、段階5から得られた生成物を用いて、表題化合物である5−クロロ−N2−[4−(4−ジメチルアミノ−シクロヘキシル)−2−イソプロポキシ−5−メチル−フェニル]−N4−[2−(プロパン−2−スルホニル)−フェニル]−ピリミジン−2,4−ジアミン(21)を合成する。
1H NMR(CD3OD, 400MHz) δ 8.36-8.38 (d, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.97-7.99 (m, 1H), 7.69-7.73 (m, 1H), 7.46-7.52 (m, 2H), 6.89-7.02 (d, 1H), 4.60-4.66 (m, 1H), 3.37-3.39 (m, 1H), 3.00 (s, 3H), 2.90 (s, 3H), 2.17-2.22 (m, 4H), 1.64-2.01 (m, 8H), 1.25-1.32 (m, 12H);
MS (ES+): 600.3 (M+1)+.

0148

本発明の化合物の例を以下に示す。表1は式(1A)の化合物の例を示す。
表1

0149

0150

0151

0152

0153

0154

0155

0156

0157

0158

0159

0160

0161

0162

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0190

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0192

0193

0194

0195

0196

0197

0198

0199

0200

0201

0202

0203

表2は、式(1C)の化合物の例を示す。
表2

0204

0205

0206

0207

0208

0209

0210

0211

0212

0213

0214

0215

0216

0217

0218

実施例17
4'−(5−クロロ−4−(2−(イソプロピルスルホニル)フェニルアミノ)ピリジン−2−イルアミノ)−5'−メトキシ−2'−メチルビフェニル−4−カルボン酸メチル(254)



段階1: 4'−アミノ−5'−メトキシ−2'−メチルビフェニル−4−カルボン酸メチル



4'−アミノ−5'−メトキシ−2'−メチルビフェニル−4−カルボン酸メチル;MS m/z 272.1 (M+1)は、先に記載された手順(実施例7, 段階1および2)に従って、適切な反応剤を用いて合成され得る。

0219

段階2: 4'−(4−ブロモ−5−クロロピリジン−2−イルアミノ)−5'−メトキシ−2'−メチルビフェニル−4−カルボン酸メチル



段階1で合成された4'−アミノ−5'−メトキシ−2'−メチルビフェニル−4−カルボン酸メチル(200mg, 0.75mmol)、2,4−ジブロモ−5−クロロピリジン(222mg, 0.82mmol, 1.1当量)、Pd2(dba)3(17mg, 0.02mmol, 0.025当量)、xantphos(22mg, 0.04mmol, 0.05当量)、およびCs2CO3(365mg, 1.1mmol, 1.5当量)を、THF(5ml)に加える。得られた混合物にN2ガスを5分間通気し、次いで150℃で4時間加熱する。室温まで冷却した後、該反応混合物をEtOAcに希釈し、H2Oで洗浄する。EtOAc層をMg2SO4で乾燥し、真空で濃縮する。シリカゲルのクロマトグラフィーにかけ(ヘキサン−EtOAc)、4'−(4−ブロモ−5−クロロピリジン−2−イルアミノ)−5'−メトキシ−2'−メチルビフェニル−4−カルボン酸メチルを得る。
MS m/z 461.0 (M+1).

0220

段階3: 4'−(5−クロロ−4−(2−(イソプロピルスルホニル)フェニルアミノ)ピリジン−2−イルアミノ)−5'−メトキシ−2'−メチルビフェニル−4−カルボン酸メチル(254)
段階2で合成された4'−(4−ブロモ−5−クロロピリジン−2−イルアミノ)−5'−メトキシ−2'−メチルビフェニル−4−カルボン酸メチル(9mg, 0.022mmol)、2−(イソプロピルスルホニル)アニリン(4mg, 0.022mmol, 1当量)、Pd2(dba)3(1.7mg, 0.002mmol, 0.1当量)、2−(ジシクロヘキシルホスフィノ)−2',4',6'−トリ−i−プロピル−1,1'−ビフェニル(1.8mg, 0.004mmol, 0.2当量)、およびナトリウムtert−ブトキシド(2.7mg, 0.028mmol, 1.3当量)を、THF(1ml)に加える。得られた混合物にN2ガスを5分間通気し、次いで150℃で4時間加熱する。室温まで冷却した後、該反応混合物をEtOAcに希釈し、H2Oで洗浄する。EtOAc層をMg2SO4で乾燥し、真空で濃縮する。シリカゲルのクロマトグラフィーにかけ(ヘキサン−EtOAc)、4'−(5−クロロ−4−(2−(イソプロピルスルホニル)フェニルアミノ)ピリジン−2−イルアミノ)−5'−メトキシ−2'−メチルビフェニル−4−カルボン酸メチル(254)を得る。
MS m/z 580.2 (M+1).

0221

本発明の化合物の例を以下に示す。表3は、式(5)の化合物の例を示す。
表3

0222

0223

0224

表4は、未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)活性、接着斑キナーゼ(FAK)、ゼータ鎖関連タンパク質キナーゼ70(ZAP-70)、インシュリン様増殖因子(IGF-1R)の阻害に応答する状態の処置、寛解または予防に有用であり得る他の化合物を示す。
表4

0225

0226

0227

0228

0229

0230

0231

0232

0233

本発明の化合物は、下記のアッセイならびに当技術分野で既知の他のアッセイを用いて、ALKを阻害する能力について評価され得る。

0234

Ba/F3細胞株パネルおよび反応剤
Ba/F3は、マウスのIL-3依存プロBリンパ腫細胞株である。Ba/F3親細胞を用いて、TEL(アミノ酸1−375)のアミノ末端部分またはBCRとの融合によって活性化された個々のチロシンキナーゼで安定に形質転換することによって、増殖および生存をIL-3に独立とした亜系統を作製する。Tel-チロシンキナーゼ(TK)融合物によって形質転換されたBa/F3細胞株を作製するために、Ba/F3親細胞を、それぞれのキナーゼドメインを有するレトロウイルスに感染させ、ピューロマイシン選択およびIL-3離脱を行い、IL-3独立形転換Ba/F3細胞を得る。

0235

形質転換したBa/F3細胞をそれぞれ、10% FBS(Hycloneカタログ番号SV30014.03, Logan,UT)、4.5g/Lブドウ糖(Sigma #G5400, St.Louis, MO)、1.5g/L重炭酸ナトリウム(Biowhittaker #17-613E, Walkersville, MD)、およびPen/Strep (Gibco #10378-016, Carlsbad, CA)を加えたRPMI-1640培地(Gibcoカタログ番号 11875093, Carlsbad, CA)中で培養する。細胞を週に2回分ける。

0236

Ba/F3細胞生存阻害アッセイ
種々のTel-TK形質転換Ba/F3細胞株に対する試験化合物の能力を下記の通り決定する。指数関数的に増殖するBaF3 Tel-TK細胞を、新しい培地で、75,000細胞/mLに希釈し、384ウェル・プレートに、50μl/ウェルで、μFill liquid dispenser (BioTek, Winooski,VT, USA)を用いて、播種する(3750細胞/ウェル)。それぞれの細胞株について2個のプレートで行う。試験化合物およびコントロール化合物をDMSOで連続希釈し、ポリプロピレン384ウェル・プレートに配列する。50nLの化合物を、ピントランスファー装置を用いて、アッセイ・プレートに移し、該プレートを、37℃(5% CO2)で、48時間インキュベートする。25μlのBright-Glo (Promega, Madison, WI, USA)を加え、AnalystGT(Perkin Elmer, Wellesley, MA)を用いて発光を定量する。カスタムカーブフィッティングソフトウェアを用いて、阻害濃度対数関数として、%細胞生存率ロジスティックフィッティングを作成する。IC50は、DMSOコントロールの50%まで細胞生存率が減少するのに必要な化合物の濃度として内挿する。IL-3(最終1ng/ml)の存在下で維持し、培養したBa/F3親細胞を、IL-3(最終1ng/ml)を含む新しい培地で、上記と同じ手順に従って、75,000細胞/mLに希釈する。

0237

Kapas 299細胞アッセイ
ルシフェラーゼ遺伝子をコードするレトロウイルスを感染させることによって、ルシフェラーゼ化Karpas 299 (Karpas299-Luc)を作製し、10% FBS、1% P/S/L-Gluを加えたRPMI-1649培地中で培養する。1日目に、細胞を回収し、150,000細胞/mlの密度で再度懸濁する(細胞数をViCell (BD)を用いて測定する。)。細胞を、希釈懸濁液から384ウェルアッセイプレートに、50μlの容積で、μFill (Bio-TEK)を用いて分配する。連続希釈した化合物(DMSO中)を50nlのピンヘッドを用いてプレートに移す。アッセイプレートを37℃で48時間インキュベートする。4日目に、25μl/ウェルのBright-Glo試薬(Promega)を、μFill (Bio-TEK)を用いて加える。30分以内に、AnalystGTを用いて、発光検出のための初期設定で、ルシフェラーゼのシグナルを測定する。

0238

酵素HTRFアッセイ
ALK酵素およびIGF1RおよびINSRを、Upstateから購入する。下記の試薬を社内で調製する;10×キナーゼ緩衝液(KB)(200mM Tris(pH 7.0)、100mM MgCl2、30mM MnCl2、50nM NaVO4)、10mMATP、100mg/mlBSA、0.5MEDTA、4M KF。Proxiplate-384 (Perkin-Elmer)をセットアップアッセイのために用いる。基質を含む全てのHTRF試薬(ビオチン−ポリ−GT(61GT0BLB)、Mab PT66-K (61T66KLB)、ストレプトアビジン-XLent (611SAXLB))を、CIS-US, Inc.から購入する。

0239

基質/ATPミックスを、ATP(最終濃度3μM)およびビオチン化ポリ−GT(最終濃度10ng/μl)を1×KBに添加することによって調製し、Proxiplate-384に、5μl/ウェルで、μFill (Bio-TEK)を用いて分配する。連続希釈した化合物(DMSO中)を、50nLのピンヘッドを用いてプレートに移す。5μlの調製した酵素ミックス(酵素(最終濃度5ng/μl)をBSAおよびDTTと1×KB中で混合する)を、キナーゼ反応を開始させるために、μFill (Bio-TEK)を用いて加える。アッセイ・プレートを室温で2時間インキュベートする。Mab PT66-Kおよびストレプトアビジン-XLentの双方を、KF(最終濃度125mM)、EDTA(最終濃度50mM)およびBSA(最終濃度100μg/ml)を含む0.5×KB溶液に添加することによって、検出ミックスを調製する。反応の最後に、10μlの検出ミックスを加え、測定前に室温で30分間インキュベートする。HTRFシグナルを、Analyst-GT (molecular dynamic)を用いて検出する。

0240

U2OS細胞におけるRE1-pGL3を用いたIGF1-S3-5またはINSR-S3-5についてのレポーター・アッセイ
10% FBSを含むマッコイ培地中、Seed 10M細胞/T175フラスコで播種し、4日後、培地を吸引して除き、新しい培地を加える。翌日(播種後5日目)、細胞をトリプシン処理し、PBSで1回洗浄し、次いで、P/S/Gと共に4%脱脂血清を含むマッコイ培地中に細胞を再度懸濁する。細胞を計数し、400,000細胞/mlまで希釈する。

0241

95mlの細胞(400000細胞/ml(40M))のために、下記のDNA/Fugene6ミックス:5mlの血清を含まないマッコイ培地;120μgのDNAミックス(20μgのIGF1R-S3-5またはINSR-S3-5+100μgのRE1-pGL3);および240μlのFugene6試薬を調製する。DNA/Fugene6ミックスを15分間インキュベートした後、4%の脱脂した血清中の細胞に添加する。50μl/ウェルを384ウェル・プレートに分配する。22〜24時間後、50nLの連続希釈化合物をピンヘッドを用いて加える。30分後、2μlの4%の脱脂した血清を含むMc-Coyで希釈した26×IGF1(または100×インシュリン)を、μFillを用いて加える。30時間後、25μlの100% bright-gloを添加し、発光を測定するためにAnalyst-GTで測定する。

実施例

0242

本明細書に記載された実施例および態様は、例示の目的のためのみであり、それに照らした種々の修飾または変更は当業者に示唆されており、またこの明細書および請求の範囲の精神および範囲に含まれるべきである。本明細書で引用された全ての文献、特許および特許明細書は、全ての目的について、言及することによって本明細書に組み込まれている。

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