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課題

コレラ毒素サブユニットまたは易熱性大腸菌毒素Aサブユニットなどの細菌毒素Aサブユニットに融合した大腸菌からの構造的に安定した付着因子を含むキメラ分子から構成される免疫原性組成物、及び前記Aサブユニットと同じまたは異なる種の毒素Bサブユニット非共有結合的会合した付着因子−毒素キメラを提供する。

解決手段

免疫応答惹起するための付着因子/毒素融合組成物を利用する。

概要

背景

下痢原性大腸菌の幾つかの病原型のうちの1つである毒素原性大腸菌(ETEC)は、軽度からコレラ瀉下にわたる分泌型下痢を引き起こす。ETECは、多くの発展途上国に住む人およびそこを訪ねる旅行者に重要な医療上の懸念を提起する。物資が乏しい国の幼児において、およびこれらの地域を旅する者においても、ETECは下痢の主原因である(非特許文献1、非特許文献2)。乳児および幼児に、この生物が年間2億1千万件の下痢および38万の死を引き起こすと推定される(非特許文献3)。

ETECは、小腸上皮細胞への付着ならびに易熱性LTI)および/または熱安定性(ST)腸毒素発現によって疾病を生じさせる(非特許文献4)。一般に、ETECは、定着因子(CF)として知られている糸状細菌表面構造によって宿主細胞に付着する。20より多くの異なるCFが記載されており、それらのうちの少数は、疑う余地なく病理発生の原因とみなされている(非特許文献5)。

記載する第一ヒト特異的ETEC CFである定着因子抗原I(CFA/I)には、病原的役割についての確固たる証拠が存在する。CFA/Iは、遺伝子的および生化学的特徴共有する8のETEC線毛から構成される1つのファミリー原型である(非特許文献6、非特許文献7、非特許文献8、非特許文献9)。このファミリーは、大腸菌表面抗原1(CS1)、CS2、CS4、CS14、CS17、CS19および推定定着因子O71(PCFO71)を含む。この線毛ファミリーの8すべてのメンバーをコードする遺伝子クラスターの完全DNA配列は、出版物掲載されている(非特許文献10)、(非特許文献11、非特許文献12、非特許文献13)。(順番に)ペリプラズムシャペロン、線毛大サブユニット外膜usherタンパク質および線毛小サブユニットをコードする、CFA/Iおよび関連線毛の4遺伝子生体組み立てオペロンが、同様に構成される。CFA/Iの組み立ては、I型線毛形成の古典的シャペロン−usher経路およびIV型線毛などの他の糸状構造のものとは異なる、代替シャペロン経路によって行われる(非特許文献14、非特許文献15)。線毛大サブユニットの一次配列に基づき、CFA/Iおよび関連線毛は、クラス5線毛分類された(非特許文献16)。

CS1の研究は、クラス5線毛の組成および機能的特徴に関する詳細をもたらした(非特許文献17)。CS1線毛柄(fimbrial stalk)は、反復CooA大サブユニットから構成される。そのCooD小サブユニットは、伝えられるところによると、線毛先端(その線毛量の極めて小さな割合を構成する)に位置し、線毛形成の開始に必要とされる(非特許文献18)。従って、大サブユニットが結合を媒介することを示唆する先行の証拠(非特許文献19)とは対照的に、最近の発見は、小サブユニットを線毛媒介付着の責任を負うものとして関係付け、CS1およびCFA/I線毛インビトロ付着に必要な特定のアミノ酸残基を同定した(非特許文献20)。大サブユニットは、小サブユニットとそれぞれの線毛の血清学的相違の原因となる(非特許文献21)。

クラス5大および小サブユニットの比較進化分析は、大サブユニットと比較して大きな構造的保存が小サブユニットの間に存在することを明示している。これは、異種、サブクラス関連線毛を発現するETECのマンノース耐性血球凝集反応MRHA)を阻害する、抗大サブユニットおよび線毛抗体ではなく、抗小サブユニットの能力と一致する(非特許文献22)。

1およびP型線毛を含む尿路病原性大腸菌株に関する以前の研究努力が、これらの細菌株上の線毛組み立てメカニズム解明するためにモデルとして利用された。これらの研究は、尿路病原性大腸菌における組み立てが、シャペロン−usher経路によって行われることを示した(非特許文献23、非特許文献24、非特許文献25)。この研究の成果は、ドナー鎖の相補性原理、線毛サブユニットが、重要な欠失β鎖相互作用サブユニット間シャッフリングにより隣接サブユニット非共有結合的にからみ合うプロセス、の開発であった(非特許文献26、非特許文献27;非特許文献28)。証拠は、この同じメカニズムを、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)血球凝集性線毛(非特許文献29)およびペスト菌莢膜タンパク質、非線毛タンパク質重合体(非特許文献30)のフォールディングおよび4次構造完全性に関係付けた。これらの両方の構造は、古典的シャペロン−usher経路によって組み立てられる、クラスIの1およびP型線毛の遠縁ある。

尿路病原性大腸菌における努力にもかかわらず、ETECにおける付着部分の同定および線毛組み立てメカニズムは不明であった。これらの異なる経路の線毛組み立ておよび構造成分が配列類似性を共有しないことは、それらが、収束進化の道を通って生じたことを示唆している。それにもかかわらず、CFA/I構造サブユニットのコンピュータ分析は、ドナー鎖の相補性がシャペロン−サブユニットおよびサブユニット−サブユニット相互作用も支配し得る可能性を示唆している。

8つのETECクラス5線毛は、メンバー数3(CFA/I、CS4およびCS14)、4(CS1、PCFO71、CS17およびCS19)および1(CS2)の3つのサブクラス(それぞれ、サブクラス5a、5bおよび5cと呼ばれる)にクラスタリングされた(非特許文献31)。以前の報告は、CFA/I、CS2、CS4、CS14およびCS19を有するETECが、クラスター化Caco−2細胞への付着をはっきりと示すことを明示した(非特許文献32、非特許文献33)。しかし、CFA/IおよびCS1のどの成分サブユニットが付着を媒介するかに関して相反するデータが発表された(非特許文献34、非特許文献35)。

どの線毛成分が付着媒介に責任を負うかというこの疑問には、無損傷CFA/I線毛、CfaB(大サブユニット)への、ならびに2つの異なるインビトロ付着モデルにおけるCfaE(小サブユニット)の非オーバーラッピングアミノ末端(残基23〜211)およびカルボキシ末端(残基212〜360)半分への抗体の付着阻害活性を評価することによるアプローチがとられた(非特許文献36)。CFA/I付着に最も重要なドメインは、付着因子CfaEのアミノ末端半分に存するが実証された。

上で簡単に説明した研究は、CFA/Iの小サブユニット、ならびに他のクラス5線毛の同種サブユニット受容体結合部分であるという証拠を提供している(非特許文献37、非特許文献38)。これらの観察とも一致して、小サブユニットの低レベルの配列多様性が線毛サブクラス5aおよび5b内で観察された(非特許文献39)ため、進化の関係は、これら2つのサブクラスのそれぞれを代表する小サブユニットのアミノ末端半分に対する抗体の交差反応相関した(非特許文献40)。

類似しているがクラス5線毛とは異なる大腸菌表面抗原(CS3)は、ETEC定着因子抗原II(CFA/II)複合体の共通付着微細線維の代表である。これらの抗原を発現するETECは、世界の多くの地域において流行している。CS3は、2つのサブユニット、CstHおよびCstGから構成される。さらに、CstGではなく、抗血清抗原CstHは、血球凝集反応阻害を示した。これは、CstHがCS3付着因子であることを示唆している。

CS3微細線維の組み立ては、PapDスーパーファミリーへのCS3ペリプラズムシャペロンの遺伝子的関連性に基づき、古典的シャペロン−usher(CU)経路のメンバーとして分類された(非特許文献41)。興味深いことに、それは、細長い微細線維状またはafimbrial付着オルガネラの組み立てを媒介するFGL(F1−G1 long)サブファミリー(シャペロンの固有構造的特徴を指す)に分類される(非特許文献42)。CstHのN末端アミノ酸スパンとペスト菌F1莢膜サブユニットのアラインメントは、(成熟CstHポリペプチドを参照して)アミノ酸16による交互疎水性残基の共通モチーフを示す。F1莢膜サブユニット(Caf1)のこのスパンは、莢膜組み立ておよびサブユニット連結中にCaf1Mシャペロンと相互作用し、F1タンパク質サブユニットに隣接することにより、ドナー鎖として機能する(非特許文献43)。従って、CstHも同様に機能し得ると、当然、推論される。

コレラ毒素(CT)および大腸菌腸毒素(LTIおよびLTII)は、易熱性腸毒素ファミリーのメンバーである(非特許文献44、非特許文献45、非特許文献46)。それらは、小腸の腸細胞に対して作用し、分泌性下痢を引き起こす。それぞれの毒素は、単一のAポリペプチドおよび5つの同一のBポリペプチド(すべて、非共有結合性相互作用によって付いている)から構成される。CTおよびLTIの公知変異体は、血清群Iに属し、LTIIの変異体は、血清群IIに属する。

CT、LTIおよびLTIIbの構造は、血清群Iの毒素のBポリペプチドと血清群IIの毒素のBポリペプチドとでアミノ酸配列が異なるにもかかわらず、すべてが、密接に関連したフォールディングパターンを有することを示す(非特許文献47)。5つの同一のBポリペプチドが、1つのドーナツ形分子を形成する。Aポリペプチドは、Bサブユニットの上面のすぐ隣に位置するA1ドメインと、B五量体の中央の孔を通るA2ドメインとを有する。A1およびA2は、短い表面露出ループによって連結されている。そのループ内のタンパク質溶解性分解は、ジスルフィド結合によって連結されたフラグメントA1およびA2を伴う、ニックを有するホロトキシンを生じさせる。そのB五量体の下面の5つの同一の結合部位は、ターゲット細胞上の特定の受容体と相互作用する。腸毒素間の受容体結合特異性は大いに異なる。CTおよびLTIは、ガングリオシドGM1にしっかりと結合する。CTではなくLTIは、アシアロガングリオシドGM1および一定の糖タンパク質に結合し、ならびにLTIIaおよびLTIIbは、ガングリオシドGD1bおよびGD1aに、それぞれ、最もよく結合する。

ETECが定着した時の上皮細胞などの細胞に対する腸毒素の活性は、事象の複雑な連鎖によって媒介される(非特許文献48、非特許文献49、非特許文献50、非特許文献51)。定着すると、ETEC熱安定性(ST)および/または易熱性(LTI)腸毒素は、上皮細胞に対して作用する。LTIに加えて、ETEC熱安定性腸毒素(ST)は、腸膜に結合したグアニル酸シクラーゼを活性化する腸ペプチドグアニリン非免疫原性ペプチド類似体である(非特許文献52)。

幼児の血清免疫学的研究によって、血清抗CFA/IIgG抗体ベルとCFA/I−ETECでの疾病のリスクの間の逆相間が証明された(非特許文献53)。しかし、研究は、抗LTI抗体が防御的であることを実証することができなかった。CTのBサブユニット(CT−B)の投与が、抗原的に類似たLIT腸毒素を発現する、ETECに起因する下痢に対しての有意な防御をもたらすとう証拠が存在する(非特許文献54、非特許文献55)。さらに、動物攻撃試験は、抗線毛抗体と抗LTI抗体が相乗的に作用して、ETEC攻撃から防御することを示唆した(非特許文献56)。

非毒性形態のLTIまたはCTを伴うCFA/Iおよび他の大腸菌表面抗原に対する有望な免疫応答のため、これらの抗原がETECに対する粘膜ワクチン製剤の中心になった(非特許文献57)。CT−Bと共同投与される経口、死菌全細胞ETECワクチンが広範に試験された(非特許文献58、非特許文献59)。このワクチンが安全であることはわかったが、乳児には効かなかった(非特許文献60)。さらに、弱毒生ETEC生ワクチンは、弱毒化免疫原性との適正なバランスを達成できないことに、一部起因して、有効でないことが判明した(非特許文献61、非特許文献62、非特許文献63、非特許文献64)。従って、より有効に抗付着性免疫を誘導する線毛成分の同定の重要性は、ますます深刻になってきている。ETECにおいて、この部分は、CfaEなどの線毛小サブユニットであることが明らかになった。従って、本発明の態様は、CTまたはLTなどの細菌トキソイドの成分とのコンジュゲーションでの構造安定性ETEC線毛付着因子または付着ドメイン構築、および下痢原性ETECに対する免疫を誘導するためのそれらの使用である。

概要

コレラ毒素Aサブユニットまたは易熱性大腸菌毒素Aサブユニットなどの細菌毒素Aサブユニットに融合した大腸菌からの構造的に安定した付着因子を含むキメラ分子から構成される免疫原性組成物、及び前記Aサブユニットと同じまたは異なる種の毒素Bサブユニットと非共有結合的に会合した付着因子−毒素キメラを提供する。免疫応答を惹起するための付着因子/毒素融合組成物を利用する。

目的

本発明は、細菌付着因子に特異的に結合して、その細菌付着因子の活性を阻害することによって下痢原性細菌の定着を崩壊させる、ならびに易熱性腸毒素の活性を阻害することによっても、および細菌定着を防止し、その結果、インビボで、易熱性腸毒素と熱安定性腸毒素の両方の生産を減少させるといった二次的効果としても、易熱性腸毒素の下痢への寄与を減少させる組成物、および免疫の誘導(主として、免疫グロブリンによって媒介される)のための前記組成物の使用法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

毒素サブユニットポリペプチドに、直接、またはリンカーおよびドナー鎖ポリペプチド配列によって、動作可能に接続された大腸菌線毛付着因子ポリペプチドを含有する精製された融合タンパク質を含む免疫原性組成物

技術分野

0001

本発明の主題は、細菌線毛成分および免疫原性細菌毒素から構成されるタンパクキメラ分子を使用して毒素原性大腸菌(Escherichia coli)に対する免疫応答誘導する方法に関する。本発明の組成物は、付着因子トキソイドキメラを生じさせるように下痢原性細菌毒素に分子融合した大腸菌付着因子を意図する。

背景技術

0002

下痢原性大腸菌の幾つかの病原型のうちの1つである毒素原性大腸菌(ETEC)は、軽度からコレラ瀉下にわたる分泌型下痢を引き起こす。ETECは、多くの発展途上国に住む人およびそこを訪ねる旅行者に重要な医療上の懸念を提起する。物資が乏しい国の幼児において、およびこれらの地域を旅する者においても、ETECは下痢の主原因である(非特許文献1、非特許文献2)。乳児および幼児に、この生物が年間2億1千万件の下痢および38万の死を引き起こすと推定される(非特許文献3)。

0003

ETECは、小腸上皮細胞への付着ならびに易熱性LTI)および/または熱安定性(ST)腸毒素発現によって疾病を生じさせる(非特許文献4)。一般に、ETECは、定着因子(CF)として知られている糸状細菌表面構造によって宿主細胞に付着する。20より多くの異なるCFが記載されており、それらのうちの少数は、疑う余地なく病理発生の原因とみなされている(非特許文献5)。

0004

記載する第一ヒト特異的ETEC CFである定着因子抗原I(CFA/I)には、病原的役割についての確固たる証拠が存在する。CFA/Iは、遺伝子的および生化学的特徴共有する8のETEC線毛から構成される1つのファミリー原型である(非特許文献6、非特許文献7、非特許文献8、非特許文献9)。このファミリーは、大腸菌表面抗原1(CS1)、CS2、CS4、CS14、CS17、CS19および推定定着因子O71(PCFO71)を含む。この線毛ファミリーの8すべてのメンバーをコードする遺伝子クラスターの完全DNA配列は、出版物掲載されている(非特許文献10)、(非特許文献11、非特許文献12、非特許文献13)。(順番に)ペリプラズムシャペロン、線毛大サブユニット外膜usherタンパク質および線毛小サブユニットをコードする、CFA/Iおよび関連線毛の4遺伝子生体組み立てオペロンが、同様に構成される。CFA/Iの組み立ては、I型線毛形成の古典的シャペロン−usher経路およびIV型線毛などの他の糸状構造のものとは異なる、代替シャペロン経路によって行われる(非特許文献14、非特許文献15)。線毛大サブユニットの一次配列に基づき、CFA/Iおよび関連線毛は、クラス5線毛分類された(非特許文献16)。

0005

CS1の研究は、クラス5線毛の組成および機能的特徴に関する詳細をもたらした(非特許文献17)。CS1線毛柄(fimbrial stalk)は、反復CooA大サブユニットから構成される。そのCooD小サブユニットは、伝えられるところによると、線毛先端(その線毛量の極めて小さな割合を構成する)に位置し、線毛形成の開始に必要とされる(非特許文献18)。従って、大サブユニットが結合を媒介することを示唆する先行の証拠(非特許文献19)とは対照的に、最近の発見は、小サブユニットを線毛媒介付着の責任を負うものとして関係付け、CS1およびCFA/I線毛インビトロ付着に必要な特定のアミノ酸残基を同定した(非特許文献20)。大サブユニットは、小サブユニットとそれぞれの線毛の血清学的相違の原因となる(非特許文献21)。

0006

クラス5大および小サブユニットの比較進化分析は、大サブユニットと比較して大きな構造的保存が小サブユニットの間に存在することを明示している。これは、異種、サブクラス関連線毛を発現するETECのマンノース耐性血球凝集反応MRHA)を阻害する、抗大サブユニットおよび線毛抗体ではなく、抗小サブユニットの能力と一致する(非特許文献22)。

0007

1およびP型線毛を含む尿路病原性大腸菌株に関する以前の研究努力が、これらの細菌株上の線毛組み立てメカニズム解明するためにモデルとして利用された。これらの研究は、尿路病原性大腸菌における組み立てが、シャペロン−usher経路によって行われることを示した(非特許文献23、非特許文献24、非特許文献25)。この研究の成果は、ドナー鎖の相補性原理、線毛サブユニットが、重要な欠失β鎖相互作用サブユニット間シャッフリングにより隣接サブユニット非共有結合的にからみ合うプロセス、の開発であった(非特許文献26、非特許文献27;非特許文献28)。証拠は、この同じメカニズムを、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)血球凝集性線毛(非特許文献29)およびペスト菌莢膜タンパク質、非線毛タンパク質重合体(非特許文献30)のフォールディングおよび4次構造完全性に関係付けた。これらの両方の構造は、古典的シャペロン−usher経路によって組み立てられる、クラスIの1およびP型線毛の遠縁ある。

0008

尿路病原性大腸菌における努力にもかかわらず、ETECにおける付着部分の同定および線毛組み立てメカニズムは不明であった。これらの異なる経路の線毛組み立ておよび構造成分が配列類似性を共有しないことは、それらが、収束進化の道を通って生じたことを示唆している。それにもかかわらず、CFA/I構造サブユニットのコンピュータ分析は、ドナー鎖の相補性がシャペロン−サブユニットおよびサブユニット−サブユニット相互作用も支配し得る可能性を示唆している。

0009

8つのETECクラス5線毛は、メンバー数3(CFA/I、CS4およびCS14)、4(CS1、PCFO71、CS17およびCS19)および1(CS2)の3つのサブクラス(それぞれ、サブクラス5a、5bおよび5cと呼ばれる)にクラスタリングされた(非特許文献31)。以前の報告は、CFA/I、CS2、CS4、CS14およびCS19を有するETECが、クラスター化Caco−2細胞への付着をはっきりと示すことを明示した(非特許文献32、非特許文献33)。しかし、CFA/IおよびCS1のどの成分サブユニットが付着を媒介するかに関して相反するデータが発表された(非特許文献34、非特許文献35)。

0010

どの線毛成分が付着媒介に責任を負うかというこの疑問には、無損傷CFA/I線毛、CfaB(大サブユニット)への、ならびに2つの異なるインビトロ付着モデルにおけるCfaE(小サブユニット)の非オーバーラッピングアミノ末端(残基23〜211)およびカルボキシ末端(残基212〜360)半分への抗体の付着阻害活性を評価することによるアプローチがとられた(非特許文献36)。CFA/I付着に最も重要なドメインは、付着因子CfaEのアミノ末端半分に存するが実証された。

0011

上で簡単に説明した研究は、CFA/Iの小サブユニット、ならびに他のクラス5線毛の同種サブユニット受容体結合部分であるという証拠を提供している(非特許文献37、非特許文献38)。これらの観察とも一致して、小サブユニットの低レベルの配列多様性が線毛サブクラス5aおよび5b内で観察された(非特許文献39)ため、進化の関係は、これら2つのサブクラスのそれぞれを代表する小サブユニットのアミノ末端半分に対する抗体の交差反応相関した(非特許文献40)。

0012

類似しているがクラス5線毛とは異なる大腸菌表面抗原(CS3)は、ETEC定着因子抗原II(CFA/II)複合体の共通付着微細線維の代表である。これらの抗原を発現するETECは、世界の多くの地域において流行している。CS3は、2つのサブユニット、CstHおよびCstGから構成される。さらに、CstGではなく、抗血清抗原CstHは、血球凝集反応阻害を示した。これは、CstHがCS3付着因子であることを示唆している。

0013

CS3微細線維の組み立ては、PapDスーパーファミリーへのCS3ペリプラズムシャペロンの遺伝子的関連性に基づき、古典的シャペロン−usher(CU)経路のメンバーとして分類された(非特許文献41)。興味深いことに、それは、細長い微細線維状またはafimbrial付着オルガネラの組み立てを媒介するFGL(F1−G1 long)サブファミリー(シャペロンの固有構造的特徴を指す)に分類される(非特許文献42)。CstHのN末端アミノ酸スパンとペスト菌F1莢膜サブユニットのアラインメントは、(成熟CstHポリペプチドを参照して)アミノ酸16による交互疎水性残基の共通モチーフを示す。F1莢膜サブユニット(Caf1)のこのスパンは、莢膜組み立ておよびサブユニット連結中にCaf1Mシャペロンと相互作用し、F1タンパク質サブユニットに隣接することにより、ドナー鎖として機能する(非特許文献43)。従って、CstHも同様に機能し得ると、当然、推論される。

0014

コレラ毒素(CT)および大腸菌腸毒素(LTIおよびLTII)は、易熱性腸毒素ファミリーのメンバーである(非特許文献44、非特許文献45、非特許文献46)。それらは、小腸の腸細胞に対して作用し、分泌性下痢を引き起こす。それぞれの毒素は、単一のAポリペプチドおよび5つの同一のBポリペプチド(すべて、非共有結合性相互作用によって付いている)から構成される。CTおよびLTIの公知変異体は、血清群Iに属し、LTIIの変異体は、血清群IIに属する。

0015

CT、LTIおよびLTIIbの構造は、血清群Iの毒素のBポリペプチドと血清群IIの毒素のBポリペプチドとでアミノ酸配列が異なるにもかかわらず、すべてが、密接に関連したフォールディングパターンを有することを示す(非特許文献47)。5つの同一のBポリペプチドが、1つのドーナツ形分子を形成する。Aポリペプチドは、Bサブユニットの上面のすぐ隣に位置するA1ドメインと、B五量体の中央の孔を通るA2ドメインとを有する。A1およびA2は、短い表面露出ループによって連結されている。そのループ内のタンパク質溶解性分解は、ジスルフィド結合によって連結されたフラグメントA1およびA2を伴う、ニックを有するホロトキシンを生じさせる。そのB五量体の下面の5つの同一の結合部位は、ターゲット細胞上の特定の受容体と相互作用する。腸毒素間の受容体結合特異性は大いに異なる。CTおよびLTIは、ガングリオシドGM1にしっかりと結合する。CTではなくLTIは、アシアロガングリオシドGM1および一定の糖タンパク質に結合し、ならびにLTIIaおよびLTIIbは、ガングリオシドGD1bおよびGD1aに、それぞれ、最もよく結合する。

0016

ETECが定着した時の上皮細胞などの細胞に対する腸毒素の活性は、事象の複雑な連鎖によって媒介される(非特許文献48、非特許文献49、非特許文献50、非特許文献51)。定着すると、ETEC熱安定性(ST)および/または易熱性(LTI)腸毒素は、上皮細胞に対して作用する。LTIに加えて、ETEC熱安定性腸毒素(ST)は、腸膜に結合したグアニル酸シクラーゼを活性化する腸ペプチドグアニリン非免疫原性ペプチド類似体である(非特許文献52)。

0017

幼児の血清免疫学的研究によって、血清抗CFA/IIgG抗体ベルとCFA/I−ETECでの疾病のリスクの間の逆相間が証明された(非特許文献53)。しかし、研究は、抗LTI抗体が防御的であることを実証することができなかった。CTのBサブユニット(CT−B)の投与が、抗原的に類似たLIT腸毒素を発現する、ETECに起因する下痢に対しての有意な防御をもたらすとう証拠が存在する(非特許文献54、非特許文献55)。さらに、動物攻撃試験は、抗線毛抗体と抗LTI抗体が相乗的に作用して、ETEC攻撃から防御することを示唆した(非特許文献56)。

0018

非毒性形態のLTIまたはCTを伴うCFA/Iおよび他の大腸菌表面抗原に対する有望な免疫応答のため、これらの抗原がETECに対する粘膜ワクチン製剤の中心になった(非特許文献57)。CT−Bと共同投与される経口、死菌全細胞ETECワクチンが広範に試験された(非特許文献58、非特許文献59)。このワクチンが安全であることはわかったが、乳児には効かなかった(非特許文献60)。さらに、弱毒生ETEC生ワクチンは、弱毒化と免疫原性との適正なバランスを達成できないことに、一部起因して、有効でないことが判明した(非特許文献61、非特許文献62、非特許文献63、非特許文献64)。従って、より有効に抗付着性免疫を誘導する線毛成分の同定の重要性は、ますます深刻になってきている。ETECにおいて、この部分は、CfaEなどの線毛小サブユニットであることが明らかになった。従って、本発明の態様は、CTまたはLTなどの細菌トキソイドの成分とのコンジュゲーションでの構造安定性ETEC線毛付着因子または付着ドメイン構築、および下痢原性ETECに対する免疫を誘導するためのそれらの使用である。

先行技術

0019

Black,R.E.1990.Epidemiology of travelers’diarrhea and relative 98,5importance Attny Docket 44 Express Mail No.EQ438665791 US 560 of various pathogens.Rev Infect Dis 12(Suppl 1):S73−S79.
Huilan,S.,L.G.Zhen,M.M.Mathan,M.M.Mathew,J.Olarte,R.Espejo,U.Khin Maung,M.A.Ghafoor,M.A.Khan,Z.Sami,and et al.1991.Etiology of acute diarrhoea among children in developingcountries:a multicentre study in five countries.Bull World Health Organ 69:549−55.
Qadri,F.,A.M.Svennerholm,A.S.Faruque,and R.B.Sack.1005.Enterotoxigenic Escherichia coli in developing countries:Epidemiology,microbiology,clinical features,treatment,and prevention.Clin.Microbiol.Rev 18:465−483.
Nataro,J.P.,and J.B.Kaper.1998.Diarrheagenic Escherichia coli.Clin Microbiol Rev 11:142−201.
Gaastra,W.,and A.M.Svennerholm.1996.Colonization factors of human 590 enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC).TrendsMicrobiol 4:444−452.
Evans,D.G.,R.P.Silver,D.J.Evans,Jr.,D.G.Chase,and S.L.Gorbach.1975.Plasmid−controlled colonization factor associated with virulence in Esherichia co//enterotoxigenic for humans.Infect Immun 12:656−667.
Gaastra,W.,and A.M.Svennerholm.1996.Colonization factors of human 590 enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC).Trends Microbiol 4:444−452.
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発明が解決しようとする課題

0020

毒素原性大腸菌(ETEC)は、大腸菌の幾つかの重要な病原型うちの1つであり、下痢原性大腸菌株の最も重要な病原型の1つである。前記生物は、軽度からコレラ様瀉下にわたる分泌型下痢を引き起こす。現在、ETECに対して効くワクチンは存在しない。従って、これらの生物に対する新規ワクチン製剤は、特に、下痢疾患が最も流行しており、医療基幹施設が乏しい発展途上国には、重要である。

課題を解決するための手段

0021

本発明の目的は、ワクチン製剤において使用するための構造的に安定でプロテアーゼ耐性の付着因子ポリペプチド−毒素融合構築物を含む組成物である。考えられる融合構築物は、任意の細菌毒素Aサブユニットを含む。加えて、考えられる変型は、同じまたは異なる毒素の毒素Bサブユニットと非共有結合的に会合している、融合生成物に含まれている、Aサブユニットを含む。本組成物は、大腸菌に対する免疫応答の誘導に有用である。毒素の例としては、コレラ毒素および毒素原性大腸菌易熱性腸毒素が挙げられる。

0022

本発明のさらなる目的は、毒素Bサブユニットと非共有結合的に会合しているまたはしていない、構造的に安定でプロテアーゼ耐性の付着因子ポリペプチド−細菌毒素Aサブユニット融合構築物であり、この場合、毒素AおよびBサブユニットは、コレラ毒素または大腸菌易熱性毒素由来する。

0023

本発明の、さらなる目的は、キメラ分子またはキメラ分子の混合物の投与により、大腸菌線毛または大腸菌(クラス5大腸菌および大腸菌CS3微細線維を含む)に対する免疫応答を誘導する方法であり、前記キメラ分子は、それぞれ、免疫修飾効果およびアジュバント効果を示す細菌トキソイドの成分(例えば、コレラまたはETEC易熱性毒素からのもの)に遺伝子的に融合した安定化ETEC付着因子ポリペプチドから構成される。

0024

追加の目的は、宿主へのETEC線毛または微細線維の付着を阻害することによる大腸菌の定着の予防である。

0025

さらなる追加の目的は、キメラ分子またはキメラ分子の混合物の投与により、腸毒素に対する抗体免疫応答を誘導する方法であり、前記キメラ分子は、それぞれ、細菌トキソイドの成分(例えば、コレラまたはETEC易熱性毒素からのもの)に遺伝子的に融合した安定化ETEC付着因子ポリペプチドから構成される。
本発明のこれらおよび他の目的は、免疫を誘導するためのワクチン成分として大腸菌付着因子ポリペプチドを利用することによって達成される。

図面の簡単な説明

0026

付着因子−エンテロトキソイドキメラをコードするプラスミドインサートマップを示す図である。上から順番に、それぞれ、プラスミドインサートBおよびCの構築においてdscCfaE遺伝子を増幅したT7系クローン、dscCfaE−CTA2/CTB5キメラ発現のためのpBAD系クローン、dscCfaE−CTA2/LTB5キメラ発現のためのpBAD系クローン、CfaE付着因子ドメイン(CfaEad)が付着因子成分を構成するキメラタンパク質の発現のための計画インサート、CfaE付着因子ドメイン(CfaEad)が付着因子成分を構成するキメラタンパク質の発現のための計画インサートを示す。
キメラ発現プラスミドのマップを示す図である。プラスミドp0809C3を構築し、dscCfaE−CTA2/CTB5キメラの生産に使用した。
キメラ発現プラスミドのマップを示す図である。p1121C1を構築し、dscCfaE−CTA2/LTB5キメラの生産に使用した。それぞれが、p15A複製起点と、クロラムフェニコール耐性マーカー(cat)と、付着因子−CTA2融合体およびB−エンテロトキソイドをコードするタンデム遺伝子の上流アラビノース誘導性プロモータ(pBAD)とを特徴とする。
CFA/I ETEC誘導MRHAの阻害を示す図である。
CfaE−CTA2/CTBキメラでの免疫処置後のCfaEへのマウス血清IgG応答を示す図である。
CfaE−CTA2/CTBキメラでの鼻腔内免疫処置後のCfaEへのマウス血清IgG応答を示す図である。
CafE、CafEとCTBの混合物またはCfaE−CTA2/CTBでの鼻腔内免疫処置後のCfaEへのマウス血清IgA応答を示す図である。
Talonクロマトグラフィー、その後のゲル濾過による、CfaE−CTA/CTBキメラの2段階精製を示す図である。
固定化GM1へのキメラの結合を示す図である。

0027

付着因子−毒素キメラの設計および構築
本発明は、構造的に安定な、従って免疫活性の付着因子ポリペプチドの投与により抗付着性免疫応答を誘導するための方法および生物学的組成物に関する。本発明の組成物において考えられる付着因子としては、クラス5線毛からのもの、およびCS3からのもの(すなわち、CstH)が挙げられるが、これらに限定されない。付着因子(毒素原性大腸菌線毛および微細線維の遠位分子成分)は、宿主細胞への細菌付着のための有望なエフェクターである(文献65)。従って、付着因子は、細菌の定着および病原性にとって重要である。

0028

[文献65]Anantha,Ravi P.,A.L.McVeigh,L.H.Lee,M.K.Agnew,FJ.Cassels,D.A.Scott,T S.Whittam,and S.J.Savarino.2004.Evolutionary and functional Relationships of colonization factor antigen I andotherClass 5 adhesive fimbriae of enterotoxigenic Escherichia coli.Infand lmm.72:7190−7201.

0029

多数の病原性細菌種、例えばLTまたはCTからのポリペプチド配列は、効力ある免疫修飾因子であることが明らかになった。さらに、CT B−サブユニット(CTB)は、ETECに起因するジフテリアに対する有意な防御をもたらす(文献66、文献67)。従って、細菌毒素と付着要素併用投与は、他のETEC部分を含有する製剤より下痢原性細菌に対して大きな防御免疫をもたらすことができる。本発明は、細菌付着因子に特異的に結合して、その細菌付着因子の活性を阻害することによって下痢原性細菌の定着を崩壊させる、ならびに易熱性腸毒素の活性を阻害することによっても、および細菌定着を防止し、その結果、インビボで、易熱性腸毒素と熱安定性腸毒素の両方の生産を減少させるといった二次的効果としても、易熱性腸毒素の下痢への寄与を減少させる組成物、および免疫の誘導(主として、免疫グロブリンによって媒介される)のための前記組成物の使用法を提供する。

0030

[文献66]Clemens,J.D.,D.A.Sack,J.R.Harris,J.Charkraborty,P.K.Neogy,B.Stanton,N.Huda,M.U.Khan,B.A.Kay,M.R.Khan,M.Anasaruzzaman,M.Yunus,M.R.Rao,A.M.Svennerholm,and J.Holmgren.1988.Cross−protection by B subunit whole cell cholera vaccine against diarrhea associated with heat−labile toxin producing」enterotoxigenic Escherichia coli: results of a large−scale field trial.J.Infect.Dis.158:372−377.
[文献67]Peltola,H., A.Siitonen,H.Kyronseppa,I.Simula,L.Mattila,P.Oksanen,MJ.Kataja,and M.Cadoz.1991.Prevention of traveller’S diarrhoea by oral B−subunit/whole−cel I cholera vaccine.Lancet 338:1285−1289.

0031

付着因子ポリペプチドの構造安定性およびことによるとプロテアーゼ耐性は、最大免疫原性の確保に有用である。付着因子単量体の構造完全性は、隣接するサブユニットによって提供される供与β鎖によって付与される。クラス5線毛の場合、例えば、CFA/I付着因子、CfaE、の構造安定性は、CfaBからのドナーβ鎖によってもたらされる。CS3の場合、安定性は、隣接する単量体からのペプチドドナー鎖によってもたらされることもある。これに関しては、CstHドナー鎖が、隣接するCstH付着因子単量体に安定性をもたらす。

0032

本発明の1つの態様は、細菌毒素サブユニット(例えば、LTまたはCTからのもの)と近位にある構造安定性が付与された付着因子ポリペプチドを有するキメラ分子である。改善されたワクチン効能随伴する、付着因子ポリペプチド免疫原の構造安定性を確保するために、本発明の1つの態様は、毒素タンパク質またはポリペプチドに動作可能に融合している隣接した付着因子ポリペプチド配列にドナーβ鎖を動作可能に提供するように設計されたポリペプチド構築物である。前記構築物の付着因子成分は、そのC末端先端でリンカーポリペプチドに連結されている付着因子ポリペプチドから成り、そのリンカーポリペプチドは、そのC末端でドナー鎖ポリペプチドにも連結されている。ドナー鎖は、CfaBなどの線毛構造大サブユニットのすべてまたは一部を含む多数の源によって提供され得る。それにまた、前記付着因子成分は、細菌毒素Aサブユニット由来のポリペプチドに遺伝子的に融合している。本発明のキメラは、毒素Aサブユニット成分を含有する発現されたキメラが、その後、毒素Bサブユニットとともに組み立てられてキメラ腸毒素様分子を形成するように、毒素Bサブユニットと共に発現させることもできる。

0033

本発明の組成物は、任意の付着因子ポリペプチド、例えばCfaE、CsfD、CsuD、CooD、CosD、CsdD、CsbD、CotDおよびCstHから構成される組成物を考えている。前記付着因子は、その付着因子のC末端でリンカーポリペプチドによってドナー鎖に融合している。前記ドナー鎖は、線毛大サブユニット、例えばCfaB、CsfA、CsuA1、CsuA2、CooA、CosA、CsbA、CsdA、CotAおよびCstH、をはじめとする任意の数の源に由来し得る。そうした構造安定化付着因子を本明細書では接頭語「dsc」と付けて記載する。本発明の組成物は、図1に図示するように構造安定化付着因子が細菌毒素Aサブユニットとも融合していることを、さらに考えている。本発明の組成物のさらなる延長は、本発明の組成物の安定な付着因子成分として天然付着因子構造のN末端ドメインのみの使用を考えている。そうした構造的に安定な付着因子ドメインを本明細書では接尾語「ad」を付け、接頭語「dsc」を付けずに記載する。

0034

構造安定化付着因子の例としては、dscCfaE(配列番号6)、dscCsbD(配列番号12)、dscCotD(配列番号15)が挙げられるが、これらに限定されず、これらは、それぞれ、CfaB、CotBおよびCotDからのドナー鎖を含有する。加えて、CstHのN末端領域(配列番号28)にリーダー配列(配列番号27)を融合させ、これを、リンカー(配列番号1)により、CstHからのドナー鎖(配列番号29)に融合させることによってCstHなどの非クラス5線毛付着因子を使用することができる。安定な、dscCstH、配列を配列番号30に示す。

0035

それにまた、構造的に安定な付着因子は、完全長またはトランケートされたA2細菌毒素Aサブユニットに融合している。本発明の組成物は、任意の数の細菌毒素Aサブユニットを使用できることを考えている。Aサブユニットの例としては、LTA2(配列番号18)およびCTA2(配列番号19)が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、本発明の組成物は、付着因子−毒素AサブユニットおよびBサブユニットが自発的に分子相互作用し、毒素様分子へと組み立てられることができるように、図2に図示するように単一オペロン下で、または単一のプラスミド上もしくは別々だが適合性のプラスミド上で別々のプロモータから発現された遺伝子として、安定化付着因子−毒素Aサブユニットキメラと毒素Bサブユニットを協調的におよび随伴的に発現できる能力を考えている。前記AおよびBサブユニットは、同じ細菌種から形成される場合もあり、または異なる細菌種から形成される場合もある。毒素Bサブユニットの例としては、CTB(配列番号21)およびLTB(配列番号23)が挙げられるが、これらに限定されない。前記Bサブユニットは、CTBおよびLTBのためのそれぞれ配列番号20および配列番号22の場合のように、改善された発現のためにLTIIbリーダー配列(配列番号24)を含有することがある。さらに、CTA2またはLTA2のいずれかのN末端五(5)アミノ酸を配列番号25および26のアミノ酸配列の代わりに用いることができる。表1は、それらの配列の要約である。

0036

0037

実施例1:dscCfaE−CTおよびLTキメラの構築
本発明をさらに十分に例証するために、CfaE、CFA/Iの小サブユニット、を含有する抗ETEC組成物の例を説明する。図1(A)を参照して、CfaEのコーディング配列の3’末端ヘアピンリンカーを遺伝子的に連結させることにより、構造的に安定なCfaEを構築した。リンカーのアミノ酸配列は、配列番号1、2および3によって記載する。その後、CfaBからのアミノ酸ドナー鎖(配列番号4に記載する)をそのリンカーの3’末端で連結させ、最後に、ヘキサヒスチジンタグをそのCfaBドナー鎖の3’末端で連結させた。その後、その構築物をpET24プラスミドに挿入し、大腸菌において発現させた。得られたポリペプチド(dscCfaEと呼ぶ)をニッケルまたはコバルト親和性およびカチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。その組換えポリペプチドは、可溶性であり、安定していた。ゲル濾過に基づき、そのdscCfaEポリペプチドは単量体として存在し、CDスペクトル分析により、主としてβ鎖分子の存在と一致する結果を得た。

0038

図1を参照して、コレラ毒素AサブユニットのA2フラグメントをdscCfaEのカルボキシル末端(C末端)に遺伝子的に融合させた。しかし、CTAのA2フラグメントの代わりに、他の毒素のAサブユニットからのA2フラグメント、例えばLT−Iを使用できることに留意しなければならない。単量体dscCfaEの精製を助長するために、ヒスチジン(His−6)テールをdscCfaEのC末端に付加させた(図1A参照)。しかし、天然配列を最小限にしか修飾しないキメラの精製を助長するために、他の構築物では、LTの毒素配列内の選択された部位でHisを置換した。しかし、CTの五量体Bサブユニットは、自発的にニッケルまたはコバルトに結合するため、CTB五量体単独、またはキメラ付着因子−CTA2融合ポリペプチドとCTB五量体の両方を含有する抗原構築物、いずれかを、付着因子−CTA2融合ポリペプチドおよびCTBポリペプチドのいずれにもHis−6タグを付加させる必要なく、ニッケルまたはコバルト親和性クロマトグラフィーによって直接精製することができる。それ故、dscCfaEにおけるHis−6タグについてのコーディング領域は、図1Bに示す構築物には含まれなかった。五量体CTBとは異なり、LT−Iの五量体Bサブユニットは、ニッケルまたはびコバルトを含有する樹脂のいずれにも自発的に結合しない。しかし、成熟LT−1Bポリペプチドの配列へのR13HおよびN94H置換の導入により、五量体LT−1B(またはキメラ付着因子−CTA2融合ポリペプチドとLT−IB五量体の両方を含有する、対応する抗原構築物)(読者図1Cに注目)をニッケルまたはコバルト含有樹脂に結合させ、ニッケルまたはコバルト親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。

0039

さらに、付着因子ドメインは、2つのドメイン内ジスルフィド架橋によって安定化されているので、CfaE残基199から204の後の停止コドンの配置により、当初の2ドメイン2ドメイン付着因子の線毛形成性ドメインが無い安定な1ドメイン付着因子を結果的に生産することとなる。停止コドンがこの場所に導入された付着因子単量体は、接尾語「ad」を有する。例えば、CfaEad(配列番号7)、CsbDad(配列番号13)およびCotDad(配列番号16)。従って、対応する安定な1ドメイン付着因子についてのコーディング配列を、安定な2ドメインdsc−付着因子変異体についてのコーディング配列の代わりに使用して、付着因子−ad−CTA2融合ポリペプチドが、上で説明したdsc−付着因子−CTA2融合ポリペプチドに置き換わっている抗原構築体を生産することができる(図1Dおよび1E参照)。

0040

図1を参照して、付着因子−CTA2融合タンパク質および細菌毒素Bサブユニットについてのコーディング領域が、両方とも、発現プラスミドにおけるオペロンの中に存在するときには、付着因子−毒素Aサブユニットキメラと毒素Bサブユニットが付随して生産される。これにより、発現されたAおよびB毒素サブユニットポリペプチドの両方を大腸菌宿主細胞のペリプラズムに分泌させ、そのペリプラズムにおいて自発的に組み立てさせて所望のキメラ腸毒素様抗原を形成することができる。前記AおよびBサブユニットは、同じ細菌種からのものである場合もあり、または異なる細菌種からのものである場合もある。さらなる例証として、図2Aおよび2Bは、CTおよびLT−1からの五量体Bサブユニットをそれぞれ含有するキメラ構築物をコードするプラスミドのマップを示す。

0041

図1は、コレラ毒素または大腸菌LTのいずれかのBサブユニットと協調的に発現されるdscCfaE−CTA2融合体を示す。LTIIBシグナル配列の付加は、組換え生成物の有望な発現を増進する。組換えLTIIbが、組換えCTまたはCTBに対してほぼ100倍のレベルで生産されるからである。CT様キメラの構築を助長するために、付着因子遺伝子配列を有するフレームのすぐ下流またはそのフレーム内にCTA2についてのコーディング領域を追加することにより発現ベクターを修飾して、対象となるタンパク質が、ペリプラズムに分泌されるばかりでなく、そのC末端にCTのA2ポリペプチドも含有するようにした。

0042

dscCfaEのコーディング配列を、コレラ毒素Bサブユニット遺伝子から上流の、N末端LTIIb−Bシグナル配列およびC末端A2融合体を有するA1置換抗原の発現のための2つのベクターに、インフレームクローニングした。それらのpLDR5およびpARLDR19ベクターは、修飾コレラ毒素オペロンを、それぞれ、lacプロモータまたはアラビノース誘導性pBADプロモータ(p0809C3)の制御下に置く。これらのクローンを発現に適する大腸菌株形質転換させた。両方の構築物は、誘導条件下、豊富培地中で増殖させたとき、そのペリプラズムにおいてキメラを生産した。

0043

誘導後、細胞をポリミキシンBで処理して、ペリプラズム内容物を放出させ、可溶性画分金属親和性クロマトグラフィーによって精製した(文献68)。遊離CTB五量体を、ゲル濾過によって、dscCfaE−CTA2/CTBキメラから分離した。CTA、CTBおよびCfaEに特異的な抗体を使用する、SDS−PAGEおよびウエスタンブロット法によるキメラの分析は、抗CTB反応性バンド、および抗CTA抗血清と抗CfaE抗血清の両方と反応したdscCfaE−CTA2融合タンパク質バンドを示した。図8を参照して、GM1被覆プレートでの96ウエルELISAフォーマットおよび一次抗CfaE抗体での検出を用いて、本発明者らは、dscCfaE−CTA2/CTBキメラが実際にGM1に結合することを実証した。

0044

[文献68]Dertzbaugh,M.T.,and L.M.Cox.1998.The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.Protein Eng.11:577−581.

0045

発現生成物のさらなる機能強化として、CTA2のN末端は残基194において生じるので、CTA2におけるシステイン−199残基のみをセリンに変えて、抗原−CTA2融合タンパク質の抗原ドメイン内のシステイン−199と他のシステインとの一切の異所ジスルフィド結合形成を防止した。加えて、lacプロモータの代わりにアラビノース誘導性pBADプロモータの制御下、キメラの生産増進のために、pARLDR19などの他のベクターを作製した(文献69、文献70)。

0046

[文献69]Tinker,J.K.,J.L.Erbe,and R.K.Holmes.2005.Characterization of fluorescent chimeras of cholera toxin and Escherichia coli heat−labile enterotoxins produced by USE of the twin arginine translocation system.Infect.Immun.73:3627−3635.
[文献70]Li,X.,J.L.Erbe,CV.Lockatell,D.E.Johnson,M.G.Jobling,R.K.Holmes,and H.L.Mobley.2004.Use of translational fusion of the MrpH fimrial adhesin−binding domain with the cholera toxin A2 domain,coexpressed with the cholera toxin B subunit,as an intranasal vaccine to prevent experimental urinary tract infection by Proteus mirabilis.Infect.Immun.72:7306−7310.

0047

実施例2:キメラ構築物の機能分析
構築物を機能的に試験した。図1Aまたは図1Bにおける構築物を3μmラテックスビーズ吸着させ、ヒトまたはウシ赤血球に添加し、結果としてMRHAを誘導した。この観察は、CfaEがETECにおける付着因子である明瞭な証拠をもたらす。

0048

2.3Å分解能でのdscCfaEの結晶構造解析は、ループによりその中間点付近で連結された2つの細長いドメインを明らかにした。βシート構造からのN末端およびC末端ドメインとCfaBからのドナーβ鎖の両方が、C末端ドメインの疎水性の溝を塞ぎ、その結果、その分子を安定させる。付着因子ドメインは、2つのドメイン内ジスルフィド架橋によって安定化されている。CfaE残基199の後の停止コドンの配置(図1C参照)により、安定なCfaE付着因子ドメイン(CfaE−adと呼ぶ)が生じるであろう。

0049

dscCfaEの抗原性および免疫原性を動物モデルにおいて試験した。最初に、2匹のウサギに、1用量当たり250μgの4用量(0、28、56および84日)投薬計画で、フロイントアジュバントでの非経口的免疫処置を施した。最後の追加抗原刺激の28日後に採取した血清は、CfaE酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)によって測定して、それぞれのウサギにおいて高い抗CfaE力価を示した。さらに、血球凝集反応阻害(HAI)アッセイにおいて、これらの抗血清は、CFA/IならびにCS4およびCS14線毛を発現するETECのMRHAを阻害した。

0050

マウス実験を行って、CFA/I線毛との比較でdscCfaEの相対粘膜免疫原性を判定した。マウス6匹の群に、25μgの試験抗原を単独で、または1.5μgの遺伝子的に解毒したLTR192粘膜アジュバントとの併用投与で、鼻腔内(IN)投与した。別のコホートのマウスには、250μgの用量で、10μgのLTIR 192Gと共にまたは伴わずに、経口胃管により免疫処置を施した。すべての動物に2週間間隔での3用量スケジュールを施した。固体化抗原が、免疫処置に使用した抗原と同種であったとき、ELISAによって強い力価が観察された。HAIアッセイによる抗付着因子抗体レベルの直接的(head−to−head)比較では、dscCfaEで免疫された群は、対応するCFA/Iで免疫された群より有意に高いHAI抗体力価を示した。考え合わせると、これらの動物研究は、CfaEが、非経口または粘膜(IN)免疫処置で血清抗体応答を誘導できることを示唆している。さらに、この抗原は、機能的抗付着因子抗体を惹起する点でCFA/Iより優れている。

0051

他のマウス免疫処置研究は、キメラの抗原性、特に、抗付着因子抗体応答を誘導するその能力、を評価するために、およびIN免疫処置でのdscCfaE−CTA2/CTBキメラの免疫修飾特性を評価するために行った。この免疫処置研究では、3群のマウス(1群当たりn=3)に、該当抗原の約50μgの初回抗原刺激用量および25μgの追加抗原刺激用量での、第0および28日におけるdscCfaE−CTA2/CTBキメラ、またはdscCfaE単独もしくはCTB単独の2用量投薬計画で、腹腔内的(IP)免疫処置を施した。免疫処置前、追加抗原刺激用量の12日後(第40日)に血清を採取し、標準濃度のCFA/I−ETEC(H10407株)と抗血清の滅菌希釈物とをインキュベートし、その後、ヒト赤血球に添加し、HAI活性を判定することによって、MRHAのインビトロ阻害について試験した。いずれの免疫処置前の血清も、試験した最低希釈(1:20)でHAI活性を示さず、CTBで免疫処置したマウスからの免疫処置後の血清も示さなかった。対照的に、dscCfaEで免疫処置した群およびdscCfaE−CTA2/CTBで免疫処置した群、両方からの血清は、図3に図示するように、同様の希釈でMRHAを阻害した。これらは、両方の群において第40日にELISAによって測定して、高い血清抗CfaEIgG力価に相当した。CfaE群の幾何平均力価は、423,000であり、dscCfaE−CTA2/CTB群の幾何平均力価は、233,000であった。従って、dscCfa−CTA2/CTBキメラは、機能的抗体応答の誘導のためにその付着因子を有効に提示する。

0052

図4を参照して、5群のマウス(1群当たりn=10)に、第0、14および28日に次の抗原でIN免疫処置を施した:(1)dscCfaE−CTA2B(8μgのCfaEおよび11μgのCTBを与えるように計算した20μgの総重量);(2)混合したdscCfaE(8μg)+CTB(13μg);(3)dscCfaE単独(25μg);(4)CTB単独(13μg);およびPBS陰性対照。CfaEおよびCTBに対する血清IgG抗体力価を第0、14、28および42日にELISAによって判定した。CfaEキメラのIN投与後に、マウス血清血球凝集反応阻害を試験した。図3の場合と同様、図4に図示するように、HAI力価は、第42日において、他の群のそれぞれより有意に高かった。加えて、図5を参照して、任意の形態でCTBを受けたすべての群が、予想通り、第42日において高い血清抗CTB力価を示した。dscCfaE−CTA2/CTBキメラ群は、第14、28および42日において、CfaE+CTB混合物またはdscCfaE群より有意に高い血清IgG抗CfaE応答を示した。

0053

IgGに加えて、IgA力価も、dscCfaE−CTA2/CTB5の投与後に試験した。抗CfaE力価を第0および42日にELISAによって測定した。それを図6に図示する。ベースライン(第0日)でのIgA力価は、図5におけるすべての群について検出限界より下であった。結果は、図6に図示するように、キメラ群が他の群より有意に高いIgA力価を生じることを示している。

0054

実施例3:ワクチン製剤における本発明のキメラの可能な使用
易熱性腸毒素の活性の防止も防御に寄与しうるが、付着因子が下痢原性大腸菌に対する免疫の誘導に最も重要な成分である可能性は高い。線毛付着因子は本質的には不安定であり、隣接するサブユニットへのそれらの非共有結合的連結が無ければ分解されるため、本発明は、構造安定性を付与することにより付着因子の免疫原性の素質を有意に改善する。加えて、構造安定性付着因子の免疫原的有効度は、効力ある免疫原性とアジュバント活性の両方を有する腸毒素成分をキメラとして付着因子構築物に備えさせることにより、有意に改善される可能性が高い。
本発明の構築物は、下痢原性大腸菌に対する免疫応答および/または抗毒素免疫を誘導するためのワクチン成分として有用であると予想される。免疫の誘導方法は、次の段階を含む:

0055

a.毒素Aサブユニットに由来する無損傷またはトランケートされたA2ポリペプチドに融合した構造的に安定な2ドメインまたは1ドメイン付着因子融合成分を含有するキメラポリペプチドを含む免疫原の投与による初回抗原刺激。前記免疫原は、その無損傷またはトランケートされたA2ポリペプチドと毒素Bサブユニットポリペプチドとの非共有結合性相互作用によって腸毒素様キメラに組み立てられたキメラポリペプチドも含むことができる。前記毒素AおよびBサブユニットは、いずれの細菌毒素(例えば、ビブリオコレラ(Vibrio cholerae)または大腸菌易熱性腸毒素)に由来してもよい。免疫原の単位用量の範囲は、50μgから1mgであり、それを、経皮的に(transcutaneously)、例えばドライパッチにより、皮膚を通して(transdermally)、筋肉内に、ミルクもしくは他の溶液で経口的に、経皮的にまたは経鼻的に、投与することができる。

0056

b.初回抗原刺激用量後、2から4の追加抗原刺激用量も、同様の経路により、50μgから1mgの免疫原の単位用量で投与する。

0057

代替ワクチンアプローチは、弱毒化生菌ベクターに挿入されたキメラポリペプチドを発現することができるDNA構築物の投与である。可能性のあるベクターの例としては、ビブリオコレラをはじめとするブリ菌属のメンバー;大腸菌;カンピロバクター(Camplyobacter)属のメンバー;サルモネラ菌(Salmonella)属のメンバー;および赤痢菌(Shigella)属のメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。

0058

実施例4:DscCfaE−CTA2/CTBキメラのスケールアップ
妥当な量の付着因子/毒素キメラを生産するために、生産および精製計画の開発を開示する。好ましい生産および精製手順の一例を提示するが、安定な免疫原性付着因子/毒素キメラ生成物を最終的に生じさせることができる他の方法を利用してもよい。

0059

この実施例では、LonおよびOmpTプロテアーゼが欠失した大腸菌株BL21を形質転換するために、アラビノース誘導性ベクター(p0809C3)を選択し、使用した。30gの細胞ペースト出発し、マイクロフルイダイゼーションを用いて細胞を破壊した。可溶性画分をTalon樹脂クロマトグラフィーおよびFPLCによるゲル濾過の二段階プロセスに付した。Talon樹脂の負荷および洗浄後、50mMのイミダゾールでキメラ画分を溶離した。図7を参照して、ピークの下の溶離画分をプールし、濃縮し、ゲル濾過に付した。ゲル濾過溶離は、類似した高さのキメラ(初期ピーク)とCTB五量体(後期ピーク)に対応する2つのピークを有する、2こぶピークパターンを示した。プールしたキメラ画分を、抗CTB、抗CTAおよび抗CfaE抗血清を用いてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)およびウエスタンブロット法によって分析した。

0060

生成物の機能的完全性を確認するために、図8に図示するように、生成物をガングリオシドGM−1に結合するその能力について試験した。マイクロタイタープレートウエル内に固定したGM1を使用して、ELISAアッセイを行った。このアッセイでは、dscCfaE−CTA2/CTBをGM1固定化プレート暴露し、結合したキメラを抗CfaE抗血清によって視覚化した。対照実験において、結合したCfaE抗原について抗CfaE抗血清でプローブする前に、GTBまたはdscCfaEをマイクロタイタープレート内に固定されたGM1と相互作用させたとき、抗CfaEの反応性は観察されなかった。図8では、GM1が入っているウエルに添加した0.25から2μg/mLのキメラ濃度範囲にわたって用量応答を観察した。この手順に使用したキメラの収量は、およそ0.05mg/(出発細胞ペーストのg)であった。

実施例

0061

[付記1]
毒素Aサブユニットポリペプチドに、直接、またはリンカーおよびドナー鎖ポリペプチド配列によって、動作可能に接続された大腸菌線毛付着因子ポリペプチドを含有する精製された融合タンパク質を含む免疫原性組成物
[付記2]
前記付着因子ポリペプチドが、前記付着因子のC末端で動作可能に連結されている前記リンカーによって、前記毒素Aサブユニットに連結されており、および前記リンカーが、そのC末端で前記毒素Aサブユニットに動作可能に連結されている前記ドナー鎖にも、そのC末端で動作可能に連結されている、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記3]
前記融合タンパク質が、毒素Bサブユニットに非共有結合的に連結されている、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記4]
前記毒素Aサブユニットが、コレラ毒素A、コレラ毒素A2サブユニット、大腸菌易熱性毒素A、大腸菌易熱性毒素A2から構成される群より選択される、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記5]
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドが、クラス5線毛またはCS3線毛に由来する、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記6]
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドが、定着因子抗原I、CS4、CS14、CS1、PCF071、CS19、CS2およびCS3から構成される群より選択される大腸菌線毛に由来する、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記7]
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドフラグメントが、付着因子ポリペプチドの単量体または重合体である、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記8]
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドフラグメントが、CfaE、CsfD、CsuD、CooD、CosD、CsdD、CsbD、CotDおよびCstHから構成される群より選択される、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記9]
前記リンカーが、配列番号1、配列番号2および配列番号3から構成される群より選択されるアミノ酸配列から構成される、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記10]
前記ドナー鎖が、配列番号5の配列で示されるアミノ酸配列を有する、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記11]
前記ドナー鎖が、CfaB、CsfA、CsuA1、CsuA2、CooA、CosA、CsbA、CsdA、CotAおよびCstHから構成される群より選択される大腸菌線毛大サブユニットまたは付着因子単量体からの8から20アミノ酸配列である、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記12]
前記融合タンパク質が、前記リンカーのC末端および前記毒素のN末端先端に動作可能に連結されたヒスチニンタグを含有する、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記13]
前記構造安定性付着因子構築物が、配列番号6;配列番号7;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号15;配列番号16および配列番号30から構成される群より選択される配列で示される配列のポリペプチドまたはフラグメントである、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記14]
前記毒素Aサブユニットが、配列番号18、配列番号19、配列番号31、配列番号32、配列番号34および配列番号35から構成される群より選択される配列を有するポリペプチドから構成される、付記1に記載の免疫原性組成物。
[付記15]
前記融合タンパク質または前記毒素Bサブユニットが、それらのN末端先端でシグナル配列に動作可能に接続されている、付記3に記載の免疫原性組成物。
[付記16]
前記毒素Bサブユニットが、コレラ毒素Bまたは大腸菌易熱性毒素Bである、付記3に記載の免疫原性組成物。
[付記17]
前記融合タンパク質および前記毒素Bサブユニットが、単一の発現ベクターから発現される、付記3に記載の免疫原性組成物。
[付記18]
前記毒素Bサブユニットが、配列番号20;配列番号21および配列番号33から構成される群より選択される配列で示されるポリペプチド配列から構成される、付記3に記載の免疫原性組成物。
[付記19]
前記毒素AサブユニットのN末端が、配列番号25および配列番号26で示される配列を含有する、付記14に記載の免疫原性組成物。
[付記20]
前記シグナル配列が、配列番号24のLTIIb毒素シグナル配列である、付記15に記載の免疫原性組成物。
[付記21]
a.付記1に記載の組成物の1つ以上の構築物を含む免疫原の初回抗原刺激用量を投与する段階と、
b.免疫応答を惹起する、緩衝水溶液中の前記免疫原の50μgから1mgの単位用量範囲での初回抗原刺激用量の少なくとも1週間後に、第一用量での追加抗原刺激用量を投与する段階と、
を含む、免疫応答を誘導する方法。
[付記22]
前記融合タンパク質が、毒素Bサブユニットに非共有結合的に連結されている、付記21に記載の方法。
[付記23]
前記大腸菌線毛付着因子のポリペプチドが、CfaE、CsfD、CsuD、CooD、CosD、CsdD、CsbD、CotDおよびCstHから構成される群より選択される、付記21に記載の方法。
[付記24]
前記付着因子のポリペプチドが、前記付着因子のC末端で動作可能に連結されている前記リンカーによって、前記毒素Aサブユニットに連結されており、および前記リンカーが、そのC末端で前記毒素Aサブユニットに動作可能に連結されている前記ドナー鎖にも、そのC末端で動作可能に連結されている、付記21に記載の方法。
[付記25]
前記大腸菌付着因子のポリペプチドが、付着因子ポリペプチドの単量体または重合体である、付記21に記載の方法。
[付記26]
前記構造安定性付着因子構築物が、配列番号6;配列番号7;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号15;配列番号16および配列番号30から構成される群より選択される配列で示される配列のポリペプチドまたはフラグメントである、付記21に記載の方法。
[付記27]
前記毒素Aサブユニットが、コレラ毒素A、コレラ毒素A2および大腸菌易熱性毒素A、大腸菌易熱性毒素A2から構成される群より選択される、付記21に記載の方法。
[付記28]
前記毒素Aサブユニットが、配列番号18、配列番号19、配列番号31、配列番号32、配列番号34および配列番号35から構成される群より選択される配列を有するポリペプチドから構成される、付記21に記載の方法。
[付記29]
前記毒素AサブユニットのN末端が、配列番号25および配列番号26で示される配列を含有する、付記28に記載の方法。
[付記30]
前記免疫応答が、ヒト細胞への毒素原性大腸菌線毛付着を阻害する、付記21に記載の方法。
[付記31]
前記免疫応答が、ヒトにおける下痢を軽減または予防する、付記21に記載の方法。
[付記32]
前記組成物が、皮下的に、皮膚を通して、筋肉内に、経口的に、経皮的にまたは経鼻的に投与される、付記21に記載の方法。
[付記33]
前記免疫原が、DNA発現系内にコードされ、弱毒化生菌ベクター内で発現される、付記21に記載の方法。
[付記34]
前記毒素Bサブユニットが、配列番号20;配列番号21および配列番号33から構成される群より選択される配列で示されるポリペプチド配列から構成される、付記22に記載の方法。
[付記35]
前記組成物が、皮下的に、皮膚を通して、筋肉内に、経口的に、経皮的にまたは経鼻的に投与される、付記22に記載の方法。
[付記36]
前記免疫原が、DNA発現系内にコードされ、弱毒化生菌ベクター内で発現される、付記22に記載の方法。
[付記37]
前記免疫応答が、ヒト細胞への毒素原性大腸菌線毛付着を阻害する、付記22に記載の方法。
[付記38]
前記免疫応答が、ヒトにおける下痢を軽減または予防する、付記22に記載の方法。
[付記39]
前記ドナー鎖が、CfaB、CsfA、CsuA1、CsuA2、CooA、CosA、CsbA、CsdA、CotAおよびCstHから構成される群より選択される大腸菌主構造線毛大サブユニットまたは付着因子単量体からの8から20アミノ酸配列である、付記24に記載の方法。
[付記40]
前記経口投与が、溶液、または腸溶性顆粒カプセルによる、付記32に記載の方法。
[付記41]
前記経皮投与が、ドライパッチによる、付記32に記載の方法。
[付記42]
前記細菌ベクターが、大腸菌、赤痢菌属のメンバー、カンピロバクター属のメンバー、サルモネラ菌属のメンバー、およびビブリオ菌属のメンバーから構成される群より選択される、付記33に記載の方法。
[付記43]
前記経口投与が、溶液、または腸溶性顆粒カプセルによる、付記35に記載の方法。
[付記44]
前記細菌ベクターが、大腸菌、赤痢菌属のメンバー、カンピロバクター属のメンバー、サルモネラ菌属のメンバーおよびビブリオ菌属のメンバーから構成される群より選択される、付記36に記載の方法。
[付記45]
前記経皮投与が、ドライパッチによる、付記35に記載の方法。

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