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技術 低粘化サイリウム及びその製造方法

出願人 三菱ケミカル株式会社
発明者 秋山卓理中島永二池田牧子
出願日 2011年3月15日 (9年7ヶ月経過) 出願番号 2011-057120
公開日 2012年10月11日 (8年0ヶ月経過) 公開番号 2012-191875
状態 未査定
技術分野 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理
主要キーワード 極細繊維糸 多孔質充填剤 B型粘度計 落体式 設備負担 単繊維糸 排除機構 中和反応液
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2012年10月11日)のものです。
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図面 (3)

課題

サイリウムが本来有する生理活性、特にヒアルロニダーゼ阻害活性を保持している低粘化サイリウム、及びヒアルロニダーゼ阻害活性を保持したままサイリウムを低粘化する方法を提供すること。

解決手段

セルロシミクロビウム(Cellulosimicrobium)属細菌由来培養物をサイリウムと接触させることを含む、低粘化サイリウムの製造方法。

概要

背景

サイリウムは、オオバコ一種であるPlantago ovata Forskal等の種子外皮から得られるアラビノキシラン主体とした多糖類である。サイリウムは、β−1,4及びβ−1,3結合のキシランを主鎖とし、側鎖の構成糖はβ−D−キシロース、α−D−アラビノース、α−L−ラムノース、α−D−ガラクツロン酸からなり、ゲル形成による吸水作用、膨潤作用等の物理化学的性質を有する。また、便通改善作用コレステロール吸収抑制作用、血糖値上昇抑制作用ヒアルロニダーゼ活性阻害による抗炎症作用等の生理活性を有することが報告されている(特許文献1)。

サイリウムは、水に溶解すると粘凋性の高いゲルを形成して水飴状となってしまうため、そのままでは液体飲料用途に用いることは困難である。そこで、サイリウムを低粘化する種々の方法が検討されている。

サイリウムの低粘化方法としては、酸やアルカリ、加熱により低粘化する方法のほか、酵素を用いる方法もいくつか提案されている。例えば、特許文献2では、ペクチナーゼヘミセルラーゼを使用し低粘化する方法が記載されている。特許文献3では、キシラナーゼ等により低粘化することが記載されている。また、特許文献4では、プロテアーゼを用いたサイリウムの低粘化方法が記載されている。

概要

サイリウムが本来有する生理活性、特にヒアルロニダーゼ阻害活性を保持している低粘化サイリウム、及びヒアルロニダーゼ阻害活性を保持したままサイリウムを低粘化する方法を提供すること。セルロシミクロビウム(Cellulosimicrobium)属細菌由来培養物をサイリウムと接触させることを含む、低粘化サイリウムの製造方法。なし

目的

本発明の主な目的は、サイリウムが本来有する生理活性、特にヒアルロニダーゼ阻害活性を保持している低粘化サイリウム、及びヒアルロニダーゼ阻害活性を保持したままサイリウムを低粘化する方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

セルロシミクロビウム(Cellulosimicrobium)属細菌由来培養物サイリウムと接触させることを含む、低粘化サイリウムの製造方法。

請求項2

セルロシミクロビウム(Cellulosimicrobium)属細菌が、セルロシミクロビウムsp.SY502株(Cellulosimicrobiumsp.SY502)(NITEP−1054)である、請求項1記載の方法。

請求項3

サイズ排除クロマトグラムにおいて2つの分子量ピークを有し、高分子量側ピークピークトップ分子量100万以上、低分子側のピークのピークトップ分子量が10万以下である、低粘化サイリウム。

請求項4

セルロシミクロビウムsp.SY502株(Cellulosimicrobiumsp.SY502)(NITEP−1054)。

技術分野

0001

本発明は、低粘化サイリウム及びその製造方法に関する。

背景技術

0002

サイリウムは、オオバコ一種であるPlantago ovata Forskal等の種子外皮から得られるアラビノキシラン主体とした多糖類である。サイリウムは、β−1,4及びβ−1,3結合のキシランを主鎖とし、側鎖の構成糖はβ−D−キシロース、α−D−アラビノース、α−L−ラムノース、α−D−ガラクツロン酸からなり、ゲル形成による吸水作用、膨潤作用等の物理化学的性質を有する。また、便通改善作用コレステロール吸収抑制作用、血糖値上昇抑制作用ヒアルロニダーゼ活性阻害による抗炎症作用等の生理活性を有することが報告されている(特許文献1)。

0003

サイリウムは、水に溶解すると粘凋性の高いゲルを形成して水飴状となってしまうため、そのままでは液体飲料用途に用いることは困難である。そこで、サイリウムを低粘化する種々の方法が検討されている。

0004

サイリウムの低粘化方法としては、酸やアルカリ、加熱により低粘化する方法のほか、酵素を用いる方法もいくつか提案されている。例えば、特許文献2では、ペクチナーゼヘミセルラーゼを使用し低粘化する方法が記載されている。特許文献3では、キシラナーゼ等により低粘化することが記載されている。また、特許文献4では、プロテアーゼを用いたサイリウムの低粘化方法が記載されている。

先行技術

0005

特開2002−145756号公報
特開平11−75776号公報
WO99/63053号パンフレット
特開2002−320464号公報

発明が解決しようとする課題

0006

しかしながら、サイリウムが本来有する生理活性、特にヒアルロニダーゼ阻害活性を保持したまま低粘化することは容易ではない。

0007

酸やアルカリ、加熱による低粘化方法では、サイリウムが低pHや高pH、高温にさらされることになり、低粘化とともに生理活性も損なわれてしまう可能性が高い。また、工業的生産の観点からも、低pHや高pH、高温といった厳しい反応条件に耐えうる製造設備が必要となり、コストアップ要因となる。

0008

一方、酵素による低粘化方法は、常温、常圧に近い温和な反応条件で処理するため、設備負担も少なく、生理活性を保持したままサイリウムを低粘化できる可能性がある。

0009

しかしながら、例えば、特許文献2や特許文献3記載のペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ等による低粘化方法では、生理活性として主に便通改善効果に着目しており、その他の多様な生理活性、特にヒアルロニダーゼ阻害活性が保持されているかどうかは不明である。また、特許文献4記載のプロテアーゼを用いたサイリウムの低粘化方法でも、その生理活性への影響については開示されていない。

0010

従って、本発明の主な目的は、サイリウムが本来有する生理活性、特にヒアルロニダーゼ阻害活性を保持している低粘化サイリウム、及びヒアルロニダーゼ阻害活性を保持したままサイリウムを低粘化する方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

0011

本発明者は、従来技術の問題点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、特定の微生物由来培養物をサイリウムに接触させることにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

0012

すなわち、本発明は、セルロシミクロビウム属細菌由来の培養物をサイリウムと接触させることを含む、低粘化サイリウムの製造方法に関する。

発明の効果

0013

セルロシミクロビウム属細菌、特に、セルロシミクロビウムsp.SY502株由来の培養物をサイリウムと接触させることにより、生理活性、特に、ヒアルロニダーゼ阻害活性を保持している低粘化サイリウムを製造することができる。

0014

本発明によって得られる低粘化サイリウムは、水等の溶媒に溶解した際の溶液の粘度が低いため、液体飲料として容易に摂取することができ、サイリウムが有する生理活性を保持した機能性食品素材として、広く利用することができる。

図面の簡単な説明

0015

図1は、SY502株培養液上清処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
図2は、蒸留水処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
図3は、塩酸処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを示す図である。

0016

本発明では、セルロシミクロビウム属細菌由来の培養物をサイリウムと接触させることによって、サイリウムを低粘化させる。

0017

(1)セルロシミクロビウム属細菌由来の培養物
(1−1)セルロシミクロビウム属細菌
本発明において、サイリウムの低粘化に用いられる細菌は、セルロシミクロビウム(Cellulosimicrobium)属に属する細菌である。セルロシミクロビウム属は、2001年にSchumannらによって提唱された新属である(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,2001,50,993−996)。

0018

本発明において用いられる細菌は、セルロシミクロビウム属に分類される細菌であればいかなる細菌でもよいが、特に好適なものとして、セルロシミクロビウムsp.SY502株(Cellulosimicrobium sp.SY502)が挙げられる。セルロシミクロビウム sp. SY502株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター寄託番号NITEP−1054として寄託されている。

0019

(1−2)細菌の培養
培養条件としては、セルロシミクロビウム属に属する細菌が好適に生育する条件であれば特段限定されるものではない。

0020

培養温度は、例えば、20℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃、さらに好ましくは30℃〜37℃で行うことができ、また、必要に応じて、培養中に温度を変更してもよい。

0021

培養時間も特には限定されず、例えば、5〜100時間、好ましくは10〜90時間、さらに好ましくは20〜80時間程度行えばよい。

0022

培養前又は培養中の培地のpHは、セルロシミクロビウム属に属する細菌の生育に適した値であればよく、例えば5〜9、好ましくは6〜8のpHで培養することができ、必要に応じてpHの調整を行いながら培養することができる。pH調整剤としては無機又は有機酸アルカリ溶液等を用いることができる。

0023

培養方法としては、固体培養液体培養静置培養振盪培養通気攪拌培養等が挙げられる。これらの中でも液体培養法によって培養するのが好ましく、特に振盪培養又は通気攪拌培養による培養が好ましい。

0024

培地としては、例えば、酵母エキストリプトンポリペプトンコーンスティープリカー大豆若しくは小麦ふすま浸出液等の1種以上の窒素源に、塩化ナトリウム塩化カリウムリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム硫酸マグネシウム塩化マグネシウム硝酸ナトリウム塩化第二鉄硫酸第二鉄若しくは硫酸マンガン等の無機塩類の1種以上を添加し、さらに、糖質原料ビタミン抗生物質誘導剤等を添加したものが用いられる。

0025

また、サイリウム低粘化酵素活性誘導するために、培地にサイリウムを添加することが好ましい。添加するサイリウムの濃度は特段限定されず、例えば、0.001〜10質量%、好ましくは0.01〜5質量%とすることができる。

0026

(1−3)培養物
本発明において、培養物とは、培養液、培養液上清、菌体、菌体懸濁液、菌体破砕液粗酵素液及びこれらの処理物など、セルロシミクロビウム属に属する細菌を培養することによって得られるもの及びそれらに起因するものいずれをも含む。本発明において特に好ましく用いられる培養物は、培養液及び培養液上清である。

0027

「培養液」とは、細菌を、生育に好適な成分を含有する培地中に接種し、適当な培養条件下で増殖させた後に得られる溶液である。「培養液上清」とは、培養後に遠心分離やろ過などの手段によって、培養液から菌体を除去して得られる画分である。「菌体」とは、細菌そのものを意味し、完全に乾燥されたもののみならず、少量の水、緩衝液、培養液、その他液体を含有しているものも含む。「菌体懸濁液」とは、菌体を水や緩衝液、その他液体に懸濁したもの溶液を言う。「菌体破砕液」とは、細菌の菌体を、超音波処理高圧処理磨砕処理、衝撃破砕処理、酵素処理凍結融解処理低張液処理等によって、破砕して得られる菌体破砕物を含有する溶液を言う。「粗酵素液」とは、遠心分離やろ過などの手段によって、菌体破砕液から不溶物を除去して得られる画分を言う。「処理物」とは、上記の培養液、培養液上清、菌体、菌体懸濁液、菌体破砕液、粗酵素液に対して、物理的・化学的処理を施したものを言う。例えば、菌体を担体固定化して得られる固定化菌体や、培養液上清や粗酵素液から硫安沈殿や各種クロマトグラフィーなどの操作によって得られる画分なども含まれる。

0028

(2)サイリウム
サイリウムは、オオバコの一種Plantago ovataの種子から得られる天然多糖である。一般には、サイリウムハスクサイリウムシードガムとして市販されている。

0029

本発明においては、いかなる粒度グレードのものを用いることができるが、ごみ等共雑物の少ないものが好ましい。本発明では、公知の方法(例えば、特開平01−197501号公報に記載の方法)により製造することもできるし、市販されているものを使用することもできる。市販されているサイリウムとしては、例えば、ソアリュームPG200、ソアリュームPG020MR(共にMRCポリサッカライド社製)などがある。

0030

(3)サイリウムの低粘化
本発明において、培養物をサイリウムと接触させるとは、サイリウム溶液とセルロシミクロビウム属細菌由来の培養物を混合し、一定時間反応させることをいう。本発明では、サイリウムを含むサイリウム溶液に微生物の培養物を添加しても良く、逆に微生物の培養物にサイリウム又はサイリウム溶液を添加しても良い。ここでは、代表して前者の方法について述べる。

0031

サイリウム溶液中のサイリウム濃度はサイリウムが低粘化されれば限定されず、例えば、0.001〜10質量%、好ましくは0.01〜5質量%、さらに好ましくは0.1〜1質量%とすることができる。

0032

サイリウム溶液の溶媒としては水が例示できるが、低粘化が妨げられない限り、エタノール等の有機溶媒を加えたり、緩衝作用を有する無機・有機塩類等を添加したりすることも可能である。

0033

用いられる緩衝液は特段限定されるものではなく、例えば、緩衝液成分濃度5〜500mM、好ましくは5〜150mM程度、pHとしては5〜9程度のものが挙げられる。緩衝作用を有する無機・有機塩類等としては、例えば、トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)、リン酸ナトリウム又はカリウム塩クエン酸塩酢酸塩等を用いることができる。

0034

反応条件は、サイリウムの低粘化を達成できる条件であれば如何なる条件でもよい。反応温度は、10〜60℃、好ましくは20〜50℃、より好ましくは30〜40℃とすることができる。pHは、4〜10、好ましくは5〜9、より好ましくは6〜8とすればよい。

0035

必要に応じて、反応液撹拌することができる。反応を効率的に進行させることができるからである。回転速度は、例えば、5〜500rpm(回転/分)、好ましくは10〜200rpm、より好ましくは20〜100rpmとすることができる。

0036

接触させるセルロシミクロビウム属細菌由来の培養物の量は、低粘化が達成できる量であれば限定されず、培養物中に含まれる低粘化活性その他の反応条件を考慮して任意に設定できる。例えば、培養液の上清を直接用いる場合、サイリウム溶液の0.001倍〜10倍の質量、好ましくは0.01倍〜5倍の質量、より好ましくは0.1倍〜2倍の質量とすることができる。

0037

低粘化反応を行った後は、反応を停止するために培養物に含まれる低粘化活性を消失させるための失活処理を行うことができる。失活処理は、低粘化活性を消失することができ、且つ、サイリウムの過剰な低粘化や分解が生じない処理であれば如何なる処理でもよい。例えば、加熱処理などが挙げられる。加熱処理としては、例えば50〜100℃、好ましくは60〜100℃、より好ましくは70〜100℃とすることができる。

0038

また、必要に応じて、低粘化反応により得られた低粘化サイリウムを精製することができる。精製方法としては、所望の低粘化サイリウム溶液を得ることができる方法であれば如何なる方法でもよい。例えば、遠心分離やろ過、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿などの方法が挙げられる。

0039

遠心分離の条件は、不要不純物などが沈殿し、低粘化サイリウム含む上清を回収できる条件であれば如何なる条件でもよいが、例えば、1,000〜50,000×g、好ましくは5,000〜20,000×gとすることができる。

0040

ろ過は、ろ紙ろ布、膜などを用いて行うことができる。ろ紙としては、精製した綿繊維セルロース)を主体としたもの又はガラス繊維ろ紙等が挙げられ、例えば、JIS P3801の規定による定性分析用及び定量分析用等のろ紙を用いることができる。

0041

ろ布としては、ポリプロピレンポリエステルポリアミドナイロン)、塩化ビニリデンビニロン、綿等の材質のろ布を用いることができる。ろ布の糸の形態としては、例えば、スパン糸短繊維糸)、マルチフィラメント糸長繊維糸)、モノフィラメント糸(長単繊維糸)、分割型極細繊維糸等のものを用いることができる。ろ布の組織としては、平織綾織、二重織、フェルト朱子織等のものを用いることができる。

0042

ろ紙又はろ布によってろ過を行う際、ろ過助剤を併用して行うこともできる。ろ過助剤としては、例えば、珪藻土パーライト真珠岩)のほか、活性炭セルロース系ろ過助剤等が挙げられる。

0043

膜としては、精密ろ過MF)膜や限外ろ過(UF)膜を用いることができる。MF膜の材質としては、有機系の高分子膜アルミナなどの無機系のセラミック膜があり、有機高分子膜としてはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスフォンポリフッ化ビニリデンなどが用いられる。MF膜の孔径としては、例えば0.1〜0.5μm程度の孔径のものを用いることができる。UF膜の材質としては、高分子材料を用いる有機膜とセラミック膜などの無機膜があり、高分子膜としては、酢酸セルロース系ポリアクリロニトリル系、ポリスルフォン系などが挙げられる。UF膜は目的に応じた分画分子量の膜を選択して用いることができ、例えば、1,000〜300,000程度のUF膜を使用することができる。

0044

クロマトグラフィーとしては、所望の低粘化サイリウム溶液を得ることができる方法であればよく、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーイオン交換クロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィー疎水性クロマトグラフィー陰イオンクロマトグラフィー等が挙げられる。

0045

アルコール沈殿に用いるアルコールとしては、エタノールやイソプロパノール等を用いることができる。アルコールの濃度は、低粘化サイリウムの沈殿を取得することができる濃度であれば如何なる濃度でもよいが、例えば、50〜99%(V/V)、好ましくは60〜99%、より好ましくは70〜99%の濃度とすればよい。必要に応じて得られたサイリウムの沈殿を同様の濃度のアルコール水溶液リンスすることができる。得られたサイリウムの沈殿は、真空乾燥凍結乾燥などにより乾燥することができる。

0046

(4)低粘化サイリウム
(4−1)低粘化
本発明において、低粘化とは、サイリウム溶液の粘度を低下させることを意味する。粘度の測定方法は特には限定されない。例えば、25℃で水溶液として測定した場合に、低粘化反応を行う前(原料)のサイリウム溶液の粘度と比較して、好ましくは50%以下、より好ましくは20%以下、さらに好ましくは10%以下に粘度を低下させることを意味する。

0047

サイリウム溶液の粘度は、種々の粘度計を用いて測定することができる。粘度計の種類としては、振動式粘度計、回転式粘度計細管式粘度計、落体式粘度計、カップ式粘度計などがある。サイリウム溶液の粘度を適切に測定できる粘度計であれば如何なる粘度計を用いてもよいが、本発明においては、回転式粘度計を好適に用いることができる。回転式粘度計には、共軸二重円筒型、単一円筒型回転式粘度計(B型粘度計)、コーンプレート型(E型粘度計)等があり、本発明においては、B型粘度計を好適に用いることができる。

0048

また、本発明において、サイリウムを低粘化させる能力の強さを低粘化活性と言う。本発明における低粘化活性は、被験試料とサイリウム溶液を混合して反応液とし、所定条件下で所定時間接触(反応)させた後の粘度によって測定及び比較することができるものとする。

0049

(4−2)サイズ排除クロマトグラフィー
本発明の低粘化サイリウムは、サイズ排除クロマトグラムにおいて2つの分子量ピークを有する。そのうちの1つは高分子量側ピークピークトップ分子量100万以上であり、もう1つは低分子側のピークのピークトップ分子量が10万以下である。高分子量側のピークの好ましいピークトップ分子量は100万〜200万程度、より好ましくは120万〜150万程度である。また、低分子量側のピークの好ましいピークトップ分子量は1000〜10万程度、より好ましくは5000〜5万程度である。

0050

本発明において、サイズ排除クロマトグラムとは、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、横軸に保持時間又は溶出容量を、縦軸溶質濃度を反映する光学シグナル吸光度示唆屈折率蛍光等)強度や電気化学的シグナル強度をとったものを言う。サイズ排除クロマトグラフィーとは、多孔質充填剤を詰めたカラム中において、充填剤表面の細孔とポリマー高分子量体)とのサイズ排除機構により物質を分離することができるクロマトグラフィーを言う。

0051

サイズ排除クロマトグラフィーでは、分子サイズの大きい(高分子量の)ポリマーは多孔質充填剤の深部へは到達できないために早く溶出され、分子サイズの小さい(低分子量の)ポリマーは深部へ到達できるために遅く溶出されるため、分子サイズ(分子量)の違いによりポリマーを分離することができる。

0052

種々のサイズ排除クロマトグラフィー用充填剤(カラム)が市販されており、本発明においては、サイリウムの分子量を適切に測定できるカラムであれば如何なるカラムをも用いることができる。例えば、Shodex OHpak SB−806M HQ(昭和電工株式会社)などを好適に用いることができる。

0053

サイズ排除クロマトグラフィーにおいては、分子量既知のポリマー(標準ポリマー)を用い、保持時間又は溶出容量と分子量の較正曲線を予め求めておくことで、被験ポリマーであるサイリウムの分子量を求めることができる。標準ポリマーは、被験ポリマーであるサイリウムの分子量を適切に算出できるポリマーであれば特段限定されず、特にプルラン(例えば、STDP−82、STD P−250、昭和電工株式会社)を好適に用いることができる。

0054

サイズ排除クロマトグラフィーによって、数平均分子量(Mn)、重量平均分子量(Mw)、z平均分子量(Mz)、ピークトップ分子量(Mp)などの平均分子量を求めることができる。本発明における低粘化サイリウムは、ピークトップ分子量によって特定することができる。

0055

ピークトップ分子量は、サイズ排除クロマトグラムにおける分子量ピーク(以下、単にピークとも呼ぶ)の頂点ピークトップ)に相当する分子量として求められる。ピークトップは、サイズ排除クロマトグラム上の「山」の頂点に相当する部分であり、ピーク領域内における出力値の1階微分値が0であり2階微分値がマイナスであるデータ点ということができる。クロマトグラムにおけるピークの検出方法は任意であるが、例えば、クロマトグラムの微分値を求め、該微分値が+、−の所定レベルを超えた時点をピークの始点、終点として、始点と終点の間の部分をピークとする方法が挙げられる。

0056

なお、本発明において低粘化サイリウムを特定するためのピーク及びピークトップ分子量は、本質的にサイリウムに由来するピーク及びそのピークトップ分子量が対象であり、クロマトグラム上に出現するサイリウム以外の不純物等に由来するピーク及びそのピークトップ分子量は対象ではない。ピークがサイリウムに由来するものであるか否かは、被験試料であるサイリウム溶液のクロマトグラムと、サイリウム以外の成分が被験試料と同じ溶液のクロマトグラムとを比較することによって容易に判断することができる。

0057

(4−3)ヒアルロニダーゼ阻害活性
本発明においてヒアルロニダーゼ阻害活性とは、ヒアルロン酸を分解する酵素であるヒアルロニダーゼの活性を阻害する活性を言う。ヒアルロン酸は、β−D−N−アセチルグルコサミンとβ−D−グルクロン酸が交互に結合してできた直鎖状高分子多糖であり、哺乳動物結合組織に多量に分布するほか、ニワトリ鶏冠連鎖球菌夾膜などにも存在する。

0058

ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を解重合する酵素の総称であり、高等動物精液蛇毒肺炎菌・連鎖球菌中などに存在する。哺乳動物においては、受精の際、卵細胞表面をおおうヒアルロン酸を含む粘性ゲルを取り除いて精子侵入を助けたり、病原菌の侵入を容易にしたりすると考えられている。また、炎症時に活性化され、結合組織のマトッリクス破壊し、炎症系組織への浸潤や血管の透過性亢進I型アレルギーにおける肥満細胞からのヒスタミン遊離過程に介在することが知られている。

0059

ヒアルロニダーゼ阻害活性を有する物質としては、クロモグリク酸ナトリウムトラニラストのような抗アレルギー剤アスピリンインドメタシンのような抗炎症薬等が知られている。

0060

ヒアルロニダーゼ阻害活性は、ヒアルロニダーゼ活性測定系に被験物質共存させた場合に、被験物質を共存させない場合と比較してヒアルロニダーゼ活性がどの程度阻害されるかを調べることによって求めることができる。ヒアルロニダーゼ活性は、例えば、ヒアルロニダーゼによってヒアルロン酸から遊離したN−アセチルグルコサミン量を、Morgan−Elson法(J.Biol.Chem.,1955,217,959−966)によって定量することにより測定できる。

0061

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

0062

[実施例1:セルロシミクロビウム属細菌由来培養物の調製とサイリウム低粘化活性の確認]
セルロシミクロビウムsp.SY502株(Cellulosimicrobium sp.SY502;以下、「SY502株」という。)を次のように培養した。

0063

−80℃で保存していたSY502株のグリセロールストック0.2mLを、500mL容三角フラスコ中に調製した100mLの前培養培地(培地1Lあたり、硝酸ナトリウム1g、リン酸水素二カリウム0.1g、硫酸マグネシウム七水和物0.5g、塩化カリウム0.5g、硫酸第二鉄七水和物0.01g、酵母エキス0.5g、ポリペプトン細粒2g、サイリウム(ソアリューム;MRCポリサッカライド株式会社製)0.5gを含み、水酸化ナトリウム水溶液でpH7に調製した後、オートクレーブ滅菌(121℃、20分間)したもの)に植菌し、温度30℃、回転数200rpmで72時間振とう培養を行った。

0064

得られた前培養液25mLを、3L容ミニジャーファーメンター中に調製した3系列の2.5Lの本培養培地(培地1Lあたり、硝酸ナトリウム1g、リン酸水素二カリウム0.1g、硫酸マグネシウム七水和物0.5g、塩化カリウム0.5g、硫酸第二鉄七水和物0.01g、酵母エキス0.5g、ポリペプトン細粒2g、サイリウム15g、プルロニックL−61(株式会社ADEKA製)0.2gを含み、水酸化ナトリウム水溶液でpH6、7、8にそれぞれ調製した後、オートクレーブ滅菌(121℃、20分間)したもの)に植菌し、温度30℃、回転数200rpm、pH制御値6、7又は8(12.5質量%水酸化ナトリウム水溶液及び12質量%硫酸水溶液で制御)、通気量1.25L/分(26時間後0.6L/分に変更)、圧力は大気圧にて通気撹拌培養を行った。

0065

培養48時間後又は72時間後に、菌濃度を反映するOD660値(波長660nmにおける濁度)を測定した。また、培養液の一部(40mL)を遠心分離(7,500×g、20分間)に供し、得られた上清を「培養液上清」とした。

0066

得られた各培養液上清を用いて、次のように低粘化活性を測定した。サイリウム溶液(サイリウム1.2gを20mM KH2PO4−Na2HPO4緩衝液(pH8)に加え、オートクレーブ(121℃、20分間)により溶解したもの)30mLと、各培養液上清30mL又は対照として蒸留水30mLを混合し、温度37℃、回転数160rpmで24時間(蒸留水の場合は96時間)は反応した後、B型粘度計により粘度を測定した。粘度は、B型粘度計(東京計器株式会社)を用い、温度25℃において測定した。測定したOD660値及び反応液粘度を表1に示す。

0067

本培養時のpHがpH6、7及び8のいずれであってもSY502株は良好に生育した。また、いずれの培養液上清を用いた場合でも、対象である蒸留水を用いた場合と比較して、反応液の粘度は大きく低下した。従って、これらの培養液上清にサイリウム低粘化活性が含まれることが確認された。

0068

[実施例2:SY502株培養液上清による低粘化反応]
実施例1で得られたSY502株培養液上清(本培養時pH7)をサイリウム溶液と接触させて低粘化反応を行った。

0069

サイリウム溶液(サイリウム10gを25mM KH2PO4−Na2HPO4緩衝液(pH7)500mLに加え、オートクレーブ(121℃、20分間)したもの)500mLと、SY502株培養液上清(本培養時pH7)500mLを混合し、温度37℃、pH制御値7(12.5質量%水酸化ナトリウム水溶液及び12質量%硫酸水溶液で制御)、回転数100rpmで2日間反応させ、反応液(=「SY502株培養液上清処理サイリウム」)の粘度を測定した。

0070

結果を表2に示す。粘度は40mPa・sであり、反応液の粘度が大きく低下していることが確認された。

0071

[比較例1:蒸留水による低粘化反応]
サイリウム溶液(サイリウム1gを蒸留水50mLに加え、オートクレーブ(121℃、20分間)したもの)50mLと、蒸留水50mLを混合し、温度37℃で4日間反応させ、反応液(=「蒸留水処理サイリウム」)の粘度を測定した。

0072

結果を表2に併せて示す。蒸留水処理サイリウムの粘度は5700mPa・sであり、前述したSY502株培養液上清処理サイリウム反応液と比較すると、非常に高い粘度であることが確認された。

0073

[比較例2:塩酸による低粘化反応]
サイリウム溶液(サイリウム1g、を蒸留水100mLに加え、オートクレーブ(121℃、20分間)したもの)100mLに、2N塩酸0.25mLを添加し(添加後pH約2.7)、温度80℃で30分間反応させた後、反応液(=「塩酸処理サイリウム」)の粘度を測定した。

0074

結果を表2に併せて示す。塩酸処理サイリウムの粘度は8mPa・sであり、反応液の粘度が大きく低下していることが確認された。

0075

[比較例3:Novozyme188による低粘化反応]
サイリウム溶液(サイリウム10gを25mM KH2PO4−Na2HPO4緩衝液1000mLに加え、オートクレーブ(121℃、20分間)1000mLに、Novozyme188(ノボザイム社製)溶液5mLを添加し、温度40℃、pH制御値7(12.5質量%水酸化ナトリウム水溶液及び12質量%硫酸水溶液で制御)、回転数100rpmで7日間反応させ、反応液(=「Novozyme188処理サイリウム」)の粘度を測定した。

0076

結果を表2に併せて示す。Novozyme188処理サイリウムの粘度は11mPa・sであり、反応液の粘度が大きく低下していることが確認された。

0077

[実施例3:SY502株培養液上清処理サイリウムの分子量測定
実施例2の反応液を80℃で40分加熱処理を行い、低粘化活性を消失させた。遠心分離(7,500×g、20分間)を行い、得られた上清の一部を用いて、SY502株培養液上清処理サイリウムの分子量をサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。プルラン(STDP−82及びSTD P−250;昭和電工株式会社製)を標準ポリマーに用いて較正曲線を作成した。分析条件を以下に示す。

0078

分析カラム:Shodex OHpak SB−806M HQ 8mm×300mm(昭和電工株式会社)
ガードカラム:Shodex OHpak SB−G 4.6mm×100mm(昭和電工株式会社)
流速:1mL/分
移動相:50mM硫酸ナトリウム水溶液
検出 :示唆屈折率
カラム温度:40℃
サンプル濃度:約0.25mg/mL
注入量 :20μL。

0079

SY502株培養液上清処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを図1に、算出されたピークトップ分子量を表3に示す。

0080

後述する蒸留水処理サイリウム(比較例4;図2)及び塩酸処理(比較例5;図3)のクロマトグラムとは異なり、SY502株培養液上清処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムは、明確に分離された2つの分子量ピークを示した。高分子量側のピークのピークトップ分子量は約140万、低分子側のピークのピークトップ分子量は約7500であった。

0081

[比較例4:蒸留水処理サイリウムの分子量測定]
比較例1で得られた反応液の一部を用いて、蒸留水処理サイリウムの分子量を実施例3と同様の分析条件により測定した。蒸留水処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを図2に、算出されたピークトップ分子量を表3に併せて示す。

0082

実施例3のSY502株培養液上清処理サイリウムのクロマトグラムとは異なり、蒸留水処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムは、近接した2つの分子量ピークを示した。高分子量側のピークのピークトップ分子量は約160万、低分子側のピークのピークトップ分子量は約20万であった。

0083

[比較例5:塩酸処理サイリウムの分子量測定]
比較例2の反応液を水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH6に調整した後、その一部を用いて、塩酸処理サイリウムの分子量を実施例3と同様の分析条件により測定した。塩酸処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを図3に、算出されたピークトップ分子量を表3に併せて示す。

0084

実施例3のSY502株培養液上清処理サイリウムのクロマトグラムとは異なり、また、比較例4の蒸留水処理サイリウムのクロマトグラムと同様に、塩酸処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムも、近接した2つの分子量ピークを示した。高分子量側のピークのピークトップ分子量は約90万、低分子側のピークのピークトップ分子量は約13万であった。

0085

[実施例4:SY502株培養液上清処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性測定]
実施例3の遠心上清メンブレンフィルター(ADVANTEC、孔径0.45μm、材質セルロースアセテート)を用いて0.2MPaにて加圧ろ過を行った。得られたろ液限外ろ過膜MILLIPORE、分画分子量1万、材質再生セルロース)を用いて0.15MPaにて加圧ろ過を行い、限外ろ過膜上に濃縮された溶液を回収した。

0086

回収した溶液10mLにイオン交換樹脂(AG501−8X、バイオラッド・ラボラトリーズ株式会社)0.5gを添加し、25℃で一晩振とうし、脱塩を行った。得られた溶液を凍結させた後、凍結乾燥を行った。

0087

得られた乾燥品を用いて、SY502株培養液上清処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性を、以下のようにして測定した。凍結乾燥したSY502株培養液上清処理サイリウムを0.1M酢酸バッファー(pH3.5、以下、酢酸バッファーという)に終濃度0.08〜0.3g/Lとなるよう溶解し、サイリウム溶液とした。

0088

試験管中にサイリウム溶液を0.2mL取り、ヒアルロンニダーゼ溶液(酢酸バッファー中に0.7g/Lの濃度でヒアルロニダーゼ(from bovine testis;タイプIV−S、シグマ社製)を含有)0.1mLを添加して、37℃で20分間インキュベートした。Compound48/80溶液(酢酸バッファー中に0.1g/Lの濃度でCompound48/80(シグマ社製)を含有)0.2mLを添加し、さらに37℃で20分間インキュベートした。

0089

ヒアルロン酸カリウム溶液(ヒアルロン酸カリウム(和光純薬工業(株)製)を酢酸バッファーに溶解し、最終濃度を0.4mg/mLに調製したもの)0.5mLを添加し、37℃で40分間反応させた。0.4M水酸化ナトリウム水溶液を0.2mL添加して反応を停止させた後、氷冷し、ホウ酸溶液ホウ酸4.95gに水50mLを加え、1N水酸化ナトリウム溶液でpH=9.1にし、水を加えて100mLに調製したもの)0.2mLを添加した。沸騰水中で3分間加熱した後、DMAB溶液(10N塩酸12.5mLと酢酸87.5mLの混液にp−ジメチルアミノベンズアルデヒド(和光純薬工業(株)製)を10g溶解し、使用直前に酢酸で10倍に希釈したもの)0.2mLを添加し、37℃で20分間インキュベートした後、波長585nmにおける吸光度(Abs585)を測定した。

0090

被験試料を添加した系におけるAbs585をAbs585(T)、被験試料の変わりに酢酸バッファーを添加した系におけるAbs585値をAbs585(C)とし、次の式によりヒアルロニダーゼ活性阻害率IR(%)を算出した。
IR(%)={Abs585(C)−Abs585(T)/Abs585(C)}×100。

0091

反応系中の被験試料濃度(%)を横軸に、IR(%)を縦軸にとり、IR=50(%)となるような被験試料濃度をIC50(%)とし、ヒアルロニダーゼ阻害活性の指標とした。IC50(%)値を表4に示す。

0092

SY502株培養液上清処理サイリウムのIC50(%)値は0.00582であり、後述する蒸留水処理サイリウム、塩酸処理サイリウム、Novozyme188処理サイリウムと比較して、明らかに高いヒアルロニダーゼ阻害活性を有していることが確認された。

0093

[比較例6:蒸留水処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性測定]
比較例1の反応液を凍結乾燥し、得られた乾燥品を用いて、蒸留水処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性を、実施例4と同様の方法により測定した。IC50(%)値を表4に併せて示す。

0094

蒸留水処理サイリウムのIC50(%)値は0.00920であり、SY502株培養液上清処理サイリウムと比較すると、ヒアルロニダーゼ阻害活性は低いことが確認された。

0095

[比較例7:塩酸処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性測定]
比較例5で得られた中和反応液について、実施例4と同様に分画、精製及び乾燥を行った。得られた乾燥品を用いて、塩酸処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性を、実施例4と同様の方法により測定した。IC50(%)値を表4に併せて示す。

0096

塩酸処理サイリウムのIC50(%)値は0.00982であり、SY502株培養液上清処理サイリウムと比較すると、ヒアルロニダーゼ阻害活性は低いことが確認された。

0097

[比較例8:Novozyme188処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性測定]
比較例3で得られた反応液について、実施例3と同様に、加熱処理及び遠心分離を行った後、実施例4と同様に分画、精製及び乾燥を行った。得られた乾燥品を用いて、Novozyme188処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性を、実施例4と同様の方法により測定した。IC50(%)値を表4に併せて示す。

実施例

0098

Novozyme188処理サイリウムのIC50(%)値は0.00912であり、SY502株培養液上清処理サイリウムと比較すると、ヒアルロニダーゼ阻害活性は低いことが確認された。

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