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技術 抗αVβ6抗体およびその使用

出願人 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド
発明者 シェリアビオレットルイーズエー.コープマンケニスジェイ.サイモンポールエイチ.ウェインレブハーマンファンフリッジメンジョゼサルダニャアレクセイエー.ルゴフスコイ
出願日 2012年6月18日 (7年10ヶ月経過) 出願番号 2012-137005
公開日 2012年9月27日 (7年7ヶ月経過) 公開番号 2012-183077
状態 特許登録済
技術分野 微生物による化合物の製造 化合物または医薬の治療活性 微生物、その培養処理 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 放射線診断機器 生物学的材料の調査,分析 ペプチド又は蛋白質 酵素、微生物を含む測定、試験 突然変異または遺伝子工学 磁気共鳴イメージング装置
主要キーワード 接地帯 進行線 存在域 構造転換 部分陰 噴霧チップ 距離標 取り扱い手順
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (20)

課題

非ヒト起源可変領域及びヒト起源免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むv6インテグリンを認識するヒト化抗体を提供すること。

解決手段

本発明は又、これらの抗体を調製するプロセス、これらの抗体を含む薬学的組成物、及びヒト化抗v6抗体を投与することにより種々の疾患を処置する方法にも関する。本発明は又、腫瘍細胞及び組織の表面におけるインテグリンαvβ6の差次的発現の特定、腫瘍細胞の転移の可能性を測定することにおけるこの差次的発現の使用、並びにインテグリンαvβ6に結合するリガンド、特に抗体を使用して、腫瘍転移診断及び処置/予防する、及び残存する転移腫瘍細胞を排除する方法にも関する。

概要

背景

(関連技術)
インテグリンは、細胞外マトリックスタンパク質を結合し、細胞−細胞及び細胞−細胞外マトリックス相互作用(一般的には細胞接着事象と呼ばれる)を媒介する細胞表面糖タンパク質受容体である(Ruoslahti, E., J. Clin. Invest. 87:1−5 (1991); Hynes, R.O., Cell 69:11−25 (1992))。これらの受容体は、互いに組み合わさると、異なる細胞特異性及び接着特異性を有する種々のヘテロ2量体タンパク質が生じる、非共有結合により会合したアルファ(α)及びベータ(β)鎖からなる(Albeda, S.M., Lab. Invest. 68:4−14 (1993))。最近の試験では、細胞接着、遊走浸潤分化、増殖、アポトーシス及び遺伝子発現を含めた細胞プロセスの調節において特定のインテグリンが関与していることが示唆されている(Albeda, S.M., Lab. Invest. 68:4−14 (1993); Juliano, R., Cancer Met. Rev. 13:25−30 (1994); Ruoslahti, E. and Reed, J.C., Cell 77:477−478 (1994);及びRuoslahti, E. and Giancotti, F.G., Cancer Cells 1:119−126 (1989);
Plow, Haas, et al., 2000;van der Flier and Sonnenberg 2001)。

αvβ6受容体は、細胞表面へテロ2量体タンパク質として発現されるインテグリンファミリーの1つのメンバーである(Busk, M., et al., J. Biol. Chem. 267(9):5790−5796 (1992))。αvサブユニットは、種々のβサブユニット(βl、β3、β5、β6及びβ8)とヘテロ2量体を形成できるのに対して、β6サブユニットは、αvサブユニットとヘテロ2量体として発現されるのみである。αvβ6インテグリンは、フィブロネクチン結合、潜時関連ペプチドLAP)結合、及びテナシンC結合細胞表面受容体であることが知られており、これらのRGDトリペプチド結合部位を介して細胞外マトリックスと相互作用する(Busk,
M., et al., J. Biol. Chem. 267:5790−5796 (1992); Weinacker, A., et al., J. Biol. Chem. 269:6940−6948 (1994); Prieto, AX., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10154−10158 (1993))。αvβ6インテグリンは10年以上前に最初に特定され、配列決定されたが、特に疾患におけるαvβ6の生物学的重要性は依然として調査中である。αvβ6の発現は上皮細胞に制限されており、これらの細胞においてαvβ6は、健常組織において比較的低レベルで発現され、発達傷害及び創傷治癒時には有意にアップレギュレートされる(Breuss, J.M., et al., J. Histochem. Cytochem. 41:1521−1527 (1993); Breuss, J.M., et al., J. Cell Sci. 108:2241−2251 (1995); Koivisto, L., et al., Cell Adhes. Communic. 7:245−257 (1999); Zambruno, G., et al., J. Cell Biol. 129(3):853−865 (1995); Hakkinen, L., et al., J. Histochem. Cytochem. 48(6):985−998 (2000))。最近増えつつある報告では、αvβ6が、例えば、結腸癌腫(Niu, J., et al., Int. J. Cancer 92:40−48 (2001); Bates, R.C., et al., J. Clin. Invest. 115:339−347 (2005))、卵巣癌(Ahmed, N., et al., J. Cell Biochem. 84:675−686 (2002); Ahmed, N., et al., J. Histochem. Cytochem. 50:1371−1379 (2002); Ahmed, N., et al., Carcinogen. 23:237−244 (2002))、扁平上皮細胞癌腫(Koivisto, L., et al., Exp. Cell Res. 255:10−17 (2000); Xue, H., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 288:610−618 (2001); Thomas, G.J., et al., J. Invest.
Dermatol. 117:67−73 (2001); Thomas, GJ., et al., Int. J. Cancer 92:641−650 (2001); Ramos, D.M., et al., Matrix Biol. 21:297−307 (2002); (Agrez, M., et al., Br.
J. Cancer 81:90−97 (1999); Hamidi, S., et al., Br. J. Cancer 82(8):1433−1440 (2000); Kawashima, A., et al., Pathol. Res. Pract. 99(2):57−64 (2003))及び乳癌(Arihiro, K., et al., Breast Cancer 7:19−26 (2000))を含めた上皮起源の癌においてアップレギュレートされることが示されている。又、αvサブユニットは、腫瘍転移に関与する場合があり、このサブユニットを阻害することで転移が予防される場合があることも報告されている(例えば、Imhof, B.A., et al., “Attempts to Understand Metastasis Formation I,” U. Gunthert and W. B
irchmeier, eds., Berlin: Springer−Verlag, pp. 195−203 (1996)を参照)。

αvβ6インテグリンは、腫瘍細胞の生物学において複数の調節機能を有する場合がある。最近の研究では、β6サブユニットの細胞外及び原形質ドメインが種々の細胞活性を媒介することが示されている。これらの細胞外及び膜貫通ドメインは、TGF−βの活性化及び接着を媒介することが示されている(Sheppard, D., Cancer
and Metastasis Rev. 24:395−402 (2005); Munger, J.S., et al., Cell 96:319−328 (1999))。β6サブユニットの原形質ドメインは、αvβ6調節細胞の増殖、MMPの生成、遊走及び生存促進の媒介において重要となる固有の11アミノ酸配列を含有する(Li, X., et al., J. Biol. Chem. 278(43):41646−41653 (2003); Thomas, G.J., et al.,
J. Invest. Derm. 117(1):61−73 (2001); Thomas, G.J., et al., Br. J. Cancer 87(8):859−867 (2002); Janes, S.M. and Watt, F.M., J. Cell Biol 166(3):419−431 (2004))。β6サブユニットは、既にクローニング、発現及び精製されており(開示内容が全体が参考として本明細書で援用される、Sheppard等の特許文献1)、αvβ6インテグリンに選択的に結合する機能阻害抗体が報告されている(開示内容が全体が参考として本明細書で援用される、Weinreb, et al., J. Biol. Chem. 279:17875−17877 (2004))。αvβ6の拮抗物質(特定のモノクローナル抗体を含む)も又、急性傷害及び線維症の特定の型を処置する可能性が示唆されている(開示内容が全体が参考として本明細書で援用される、特許文献2及び特許文献3を参照)。

αvβ6は、フィブロネクチン、テネイシン、潜時関連ペプチド−1及び−3(LAP1及びLAP3)、即ちアルギニングリシンアスパルテート(RGD)モチーフとの直接の相互作用を介したTGF−β1潜伏性前駆体型N末端278アミノ酸を含めた、幾つかのリガンドに結合することができる(Busk, M., et al., J. Biol. Chem. 267(9):5790−5796 (1992); Yokosaki, Y., et al., J. Biol. Chem. 271(39):24144−24150 (1996); Huang, X.Z., et al., J. Cell Sci. 111:2189−2195 (1998); Munger, J.S., et al., Cell 96:319−328 (1999))。TGF−βサイトカインは、成熟活性C末端TGF−βサイトカインに非共有結合により会合したN末端LAPを有する潜伏性複合体として合成される。この潜伏性TGF−β複合体は、その同属体受容体に結合することができず、従って活性型に変換されるまでは生物学的活性を有さない(Barcellos−Hoff, M.H., J. Mamm. Gland Biol. 1(4):353−363 (1996);
Gleizes, P.E., et al., Stem Cells 15(3):190−197 (1997); Munger, J.S., et al., Kid. Int. 51:1376−1382 (1997); Khalil, N., Microbes Infect. 1(15):1255−1263 (1999))。LAP1又はLAP2へのαvβ6の結合によって、TGF−β1及びTGF−β3の潜伏性前駆体型の活性化がもたらし(Munger, J.S., et al.,
Cell 96:319−328 (1999))、これは、TGF−βによるその受容体への結合を可能にする潜伏性複合体の構造変化によるものであることが提案されている。即ち、αvβ6のアップレギュレートされた発現によってTGF−βの局所的な活性化がもたらされ、ひいては下流の事象が連鎖的に活性化される可能性がある。

TGF−β1サイトカインは、細胞の増殖、分化及び免疫応答を調節する多面発現性の成長因子である(Wahl, S.M., J. Exp. Med. 180:1587−1590 (1994); Massague, J., Annu. Rev. Biochem. 67:753−791 (1998); Chen, W. and
Wahl, S.M., TGF−β: Receptors, Signaling
Pathways and Autoimmunity, Basel:Karger, pp. 62−91 (2002); Thomas, D.A. and Massague, J., Cancer Cell 8:369−380 (2005))。癌においてTGF−β1が果たす役割は2つの側面がある。TGF−βは腫瘍抑制物質及び生育抑制活性と認識されているが、多くの腫瘍がTGF−β1の生育抑制活性に対して耐性を発生させている(Yingling, J.M., et al., Nature Rev. Drug Discov. 3(12):1011−1022 (2004); Akhurst, R.J., et al., TrendsCell Biol. 11(11):S44−S51 (2001); Balmain, A.
and Akhurst, R.J., Nature 428(6980):271−272 (2004))。樹立された腫瘍において、TGF−β1の発現及び活性は、腫瘍の生存、進行及び転移の促進において関与している(Akhurst, R.J.,
et al., Trends Cell Biol. 11(11):S44−S51 (2001); Muraoka, R.S., et al., J. Clin. Invest. 109(12):155l (2002); Yang, Y.A., et al., J. Clin. Invest. 109(12):1607−1615 (2002))。これは、免疫監視機構血管形成及び腫瘍間質圧力の増大に対するTGF−βの作用を含めた、局所的な腫瘍−支質環境におけるオートクリン及びパラクリンの両作用により媒介されていると仮定されている。現在、幾つかの研究で、TGF−β1を抑制する抗腫瘍及び抗転移作用が示されている(Akhurst, R.J., J. Clin. Invest. 109(12):1533−1536 (2002); Muraoka, R.S., et al., J. Clin. Invest. 109(12):l55l (2002); Yingling, J.M., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 3(12):1011−1022 (2004); Yang, Y.A., et al., J.
Clin. Invest. 109(12):l607−1615 (2002);
Halder, S.K., et al., Neoplasia 7(5):509−521 (2005); Iyer, S., et al., Cancer Biol. Ther. 4(3):26l−266 (2005))。

腫瘍における、特に腫瘍−支質の界面におけるαvβ6の発現の増大は、TGF−β1の局所的活性化に固有な機序、並びに腫瘍の生存、浸潤及び転移を促進する能力を反映する場合がある。ヒト転移における高レベルの発現は、転移の樹立におけるαvβ6の潜在的な役割を示しており、これはαvβ6が、上皮から間葉への転移、in vitroにおける腫瘍細胞の浸潤、及び転移と相関する発現をマウスモデルにおいて媒介することができるという以前の報告と合致している(Bates, R.C., et al., J. Clin. Invest. 115(2):339−347 (2005); Thomas, G.J., et al., Br. J. Cancer 87(8):859−867 (2002); Morgan, M.R., et al., J. Biol. Chem. 279(25):26533−26539 (2004))。

以前に本発明者等は、αvβ6のヒト及びマウスの両型に結合し、αvβ6のそのリガンドへの結合及びTGF−β1のαvβ6媒介活性化を阻害する、強力且つ選択的な抗αvβ6モノクローナル抗体(mAb)の生成について報告している(Weinreb, P.H., et al., J. Biol. Chem. 279(17):17875−17887 (2004))。全体が参考として本明細書で援用される特許文献4にも記載の通り、αvβ6に対する高親和性抗体は、このような抗体の相補性決定領域(CDR)における重要アミノ酸残基の同定及び分析を含め、発見及び特徴付けされている。特にこれらの高親和性抗体は、(a)αvβ6に特異的に結合し;(b)αvβ6のそのリガンド、例えばIC50値が10D5の値よりも低いLAP、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びテナシンとの結合を抑制し(特許文献3);(c)TGF−βの活性化を阻害し;(d)αvβ6への結合特異性をもたらすCDR中の特定のアミノ酸配列を含有し;(e)β6サブユニットに特異的に結合し;及び/又は(f)免疫染色操作法、例えばパラフィン包組織の免疫染色でαvβ6認識する。

特許文献4には又、αvβ6に結合する抗体を生物物理学的に異なるクラス及びサブクラス分類できるという発見についても記載している。抗体の1つのクラスは、リガンド(例えばLAP)のαvβ6への結合を阻害する能力を示す(ブロッカー)。このクラスの抗体は、更にカチオン依存性ブロッカー及びカチオン非依存性ブロッカーのサブクラスに分割することができる。カチオン依存性ブロッカーの一部は、アルギニン−グリシン−アスパルテート(RGD)ペプチド配列を含有するのに対し、カチオン非依存性ブロッカーは、RGD配列を含有しない。別のクラスの抗体は、αvβ6に結合する能力を示すが、αvβ6のリガンドへの結合は阻害しない(非ブロッカー)。

更に、特許文献4は、相補性決定領域(CDR)1、2及び3が、αvβ6への結合特異性をもたらす特定のアミノ酸配列からなる重軽鎖を含む抗体も開示している。第WO03/100033号は又、αvβ6に特異的に結合するが潜時関連ペプチド(LAP)へのαvβ6の結合を抑制しない抗体、並びに同じエピトープに結合する抗体も提示している。

特許文献4は更に、ハイブリドーマ細胞6.1A8、6.2B10、6.3G9、6.8G6、6.2Bl、6.2Al、6.2E5、7.1G10、7.7G5及び7.1C5、コード配列を含む単離された核酸、及び抗αvβ6抗体のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドも開示している。特に特許文献4は、ハイブリドーマ6.1A8、6.3G9、6.8G6、6.2Bl、6.2B10、6.2Al、6.2E5、7.1G10、7.7G5又は7.1C5により生成される抗体として重軽鎖ポリペプチド配列を含む抗αvβ6抗体を開示している。ハイブリドーマの数種は、ブダペスト条約に基づきAmerican Type Culture Collection(“ATCC”;P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA)に寄託されている。特にハイブリドーマクローン6.3G9及び6.8G6は、2001年8月16日に寄託され、それぞれ受入番号ATCCPTA−3649及びPTA−3645を有する。ハイブリドーマ6.3G9及び6.8G6により生成されるマウス抗体は、ヒト化抗体として開発する可能性に関して、本出願において更に検討する。

マウスモノクローナル抗体3G9は、ヒト可溶性αvβ6で免疫化されたβ6インテグリン−/−マウス(Huang, et al., J. Cell Biol. 133:921−928 (1996))から単離されたマウスIgGκ抗体である。3G9抗体は、傷害、線維症及び癌の間にアップレギュレートされたレベルで発現されるαvβ6インテグリンエピトープを特異的に認識する(例えば、Thomas, et al., J. Invest. Dermatology 117:67−73 (2001); Brunton, et al., Neoplasia 3:215−226 (2001); Agrez, et al., Int. J. Cancer 81:90−97 (1999); Breuss, J. Cell Science
108:2241−2251 (1995)を参照)。これはその他のαvインテグリンには結合せず、ヒト及びマウスの両分子に対して交差反応性を有する。マウスモノクローナル抗体3G9は、精製されたヒト可溶性αvβ6への、又はβ6発現細胞へのリガンドの結合を阻害することから判断される通り、αvβ6のLAPへの結合を阻害し、これによりTGF−β受容体活性化の線維症促進活性を抑制することが報告されている(特許文献4を参照)。又、既知のαvβ6抗体の1つである10D5よりもIC50値が低いTGF−βのαvβ6媒介活性化を抑制することも示されている(Huang, et al., J CeIl Sci. 111:2189 −2195 (1998))。

マウスモノクローナル抗体8G6は、特許文献4に記載の通り、αvβ6インテグリンエピトープも認識するマウスIgG1κ抗体である。マウスモノクローナル抗体8G6は、10D5よりもIC50値が低いTGF−βのαvβ6媒介活性化を抑制する能力を示す、αvβ6のカチオン依存性高親和性ブロッカーである(特許文献4を参照)。

3G9及び8G6の両マウス抗体は、特許文献4に記載の通り、腎臓及び肺の線維症を予防するのに有効であった。更に、マウス抗体3G9は、ヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を効果的に抑制することができ、癌の病理におけるαvβ6の潜在的な役割、及びαvβ6に指向された抗体を使用するこのような阻害の有効性が示唆されている。

従って、ヒトにおいてより抗原性が低く、αvβ6経路に関与する疾患の処置において有用な場合があるαvβ6抗体を開発することが必要とされている。組換えDNA法の出現により、抗体遺伝子構造的に操作し、ハイブリドーマ技術では得られない特性を有する修飾された抗体分子を生成することが可能となった。治療現場において、本方法の1つの目的は、ヒトにおけるげっ歯類モノクローナル抗体の免疫原性を、それらの一次アミノ酸構造を修飾することによって低減することであった。免疫応答の誘導により、治療用抗体の排除の増進とそれに伴う薬効損失から、極端な場合は致命的なアナフィラキシーにまで至る、一連患者における有害作用を引き起こす可能性があることから、治療用抗体の免疫原性を低下させることが望まれている。

外来性モノクローナル抗体の免疫原性を低減する1つの方策は、モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖定常ドメインヒト起源の類似ドメインで置き換えて、外来性抗体の可変領域ドメインに影響が及ばないようにすることであった。重軽鎖の可変領域ドメインは、抗体と抗原の間の相互作用を担っている。ヒト定常ドメインに連結したマウス可変ドメインを有するキメラ抗体分子は、通常キメラ由来元のマウス抗体と同じ親和性定数を有する抗原に結合する。このようなキメラ抗体は、その完全なマウス対応型よりもヒトにおける免疫原性が低い。それにもかかわらず、マウス可変ドメイン全体を維持する抗体は、患者のかなりの割合において免疫応答を誘発する傾向がある。

ヒトが全マウス可変ドメインに対して免疫応答を示すことは予測されたことであり、従って、より多いヒト特性を有する可変ドメインを得る取組みが、このような標準的なキメラ抗体の臨床試験結果が報告されるよりも前から開始されていた。「ヒト化」と呼ばれることが多い方法の1つの区分は、マウスとヒトの両特性を有する抗体可変ドメイン組換え構築することにより、マウスモノクローナル抗体の可変ドメインをよりヒト型に変換することを目的としている。ヒト化の方策は、抗体構造データの幾つかの合意された理解に基づいている。第1に、可変ドメインは、種内で保存されているが、進化的に遠い種同士(例えばマウスとヒト)の間では異なるペプチド配列の隣接地帯を含有する。第2に、その他の隣接地帯は、種内で保存されていないが、同じ個体内の抗体生成細胞の間でさえも異なる。第3に、抗体と抗原の接触は、主に可変ドメインの非保存領域を介して起こる。第4に、抗体可変ドメインの分子アーキテクチャーは、種の間で十分に類似することから、種間で対応するアミノ酸残基の位置が、実験データを使用せずに位置のみに基づいて特定される場合がある。

ヒト化の方策は、マウス配列に特徴的なアミノ酸残基をヒト抗体の対応する位置に存在する残基で置き換えることで、結果として得られる抗体のヒトにおける免疫原性を低下させることができるという前提に基づいている。しかしながら、種間の配列の置き換えると、通常は抗体によるその抗原への結合を低下させることになる。そのため、ヒト化の技術は、免疫原性を低下させるための元のマウス配列の置き換えと、ヒト化分子が抗原結合の治療有用性を維持する必要性とのバランスを取ることにある。このバランスは2つの手法を使用して取られている。

特許文献5に例示されている1つの手法では、特徴的な点として、ヒト型である残基が、(i)抗原との相互作用において有意な化学的役割を果たさず、(ii)側鎖が溶媒内に突出して配置されていることが判明している又は予測されているマウス可変ドメイン残基で置き換えられている。即ち、抗原結合部位から遠い外部残基をヒト化されるのに対して、内部残基、抗原結合残基、並びに可変ドメイン間の界面を形成する残基は、マウス型のままである。この手法の1つの欠点は、残基が抗原結合において有意な化学的役割を果たさず、特定の3次元抗体構造において溶媒内に配置されるかどうかを判定するために、かなり広範な実験データが必要となる点である。

特許文献6に例示されている別のより一般的な手法では、保存されていると考えられるマウス可変ドメインペプチド配列の隣接地帯が、ヒト抗体の対応する地帯置換される。このより一般的な手法では、抗原結合に関与する非保存の領域を除いて、全ての可変ドメイン残基がヒト化される。置き換えに適切な隣接地帯を決定するに当たり、特許文献6では、Wu and Kabat, J Exp Med. 132(2):211−250 (1970)にて以前に開発されている抗体可変ドメイン配列の分類を利用している。

Wu及びKabatは、抗体ペプチド配列のアライメント開拓しており、この点における両者の寄与は数倍にも及んでいる。第一に、Kabat及びWuは、可変ドメイン間の配列類似性の研究を通して、全脊椎動物種の全抗体にわたってある程度は相同である対応する残基を同定した。これらは、同様の三次元構造を採用し、同様の機能的役割を果たし、近隣残基と同様に相互作用し、同様の化学的環境に存在することから、同定が可能であった。第2に、Kabat及びWuは、相同の免疫グロブリン残基が同じ位置番号割り付けられているペプチド配列番号付け系を考案した。当業者であれば、配列そのものを超えた何れかの実験データに依存することなく、通常Kabat番号付けと呼ばれるものを何れかの可変ドメイン配列に明白に割り付けることができる。第3に、Kabat番号を有する配列位置のそれぞれについて、Kabat及びWuは可変性を計算した。この可変性とは、可変ドメイン配列がアラインされる場合における多少の可能なアミノ酸の発見を意味する。Kabat及びWuは、4つの低可変性の隣接領域内に埋め込んだ3つの高可変性の隣接領域を同定した。その他の研究者等は、概ねこれらの領域(超可変領域)における可変性を以前に報告しており、高可変性領域が、抗原結合に使用されるアミノ酸残基を表すと提唱している。Kabat及びWuは、これらの可変地帯を構成する残基を以前に区分けしており、これらを、抗体と抗原の間の化学的相補性を指す「相補性決定領域」(CDR)と呼んだ。抗原認識ではなく可変ドメインの3次元折り畳みにおける役割は、残余の低可変領域に起因するとされており、これは現在では「フレームワーク領域」と呼ばれている。第4に、Kabat及びWuは、抗体ペプチド及び核酸配列の公的データベース確立しており、これは現在でも継続して維持され、当業者に周知である。

Kabatの分類の使用において特許文献6に開示されるヒト化の方法は、1つの抗体由来のCDR、及び種、起源、特異性、サブクラス又はその他の特徴が異なる別の抗体由来のフレームワーク領域を含むキメラ抗体をもたらす。しかしながら、何れの特定の配列又は特性も、フレームワーク領域に起因するとはされておらず、実際に特許文献6では、何れのセットのフレームワークも何れのセットのCDRと組み合わせることができると教示している。以来、フレームワーク配列は、良好な抗原結合を維持するのに必要な抗体の可変領域の三次元構造を与える上で重要であると認識されている。その後のこの分野の進歩は、対応するマウス抗体のアビディティ相対比較した場合の一部のヒト化抗体を使用した場合に観察される抗原に対するアビディティの喪失を取り扱う特許文献6の適用範囲内における改良となっている。

特許文献7は、抗体をヒト化するための特許文献6の1つの改良を開示しており、立体的又はその他の化学的な不適合成のためにマウス抗体内に存在する結合可能な構造へのCDRの折り畳みを妨害するヒト化フレームワークにおける構造モチーフにおける問題点がアビディティ喪失の原因であるとする前提に基づいている。この問題を論じるために、特許文献7は、ヒト化するマウス抗体のフレームワーク配列に対して直鎖ペプチド配列において緊密に相同であるヒトフレームワーク配列を使用することを教示している。従って、特許文献7の方法は、種間のフレームワーク配列を比較することに焦点を置いている。一般的には、全ての使用可能なヒト可変ドメイン配列を特定のマウス配列と比較し、対応するフレームワーク残基の間の同一性パーセントを計算する。ヒト可変ドメインは、ヒト化プロジェクトのためのフレームワーク配列が提供されるように、最高パーセントを有するものが選択される。特許文献7は又、結合可能な構造においてCDRを支持するのに重要なマウスフレームワーク由来の特定のアミノ酸残基を、ヒト化フレームワーク内で保持することが重要であるとも教示している。

その他の手法では、Riechmann, et al., Nature 332(6162):323−327 (1988)に記載の通り、低アビディティのヒト化コンストラクトが得られた後に、単一残基をマウス配列に先祖返りさせ、抗原結合を試験することにより、特定のフレームワークアミノ酸残基の重要性が実験的に測定されている。フレームワーク配列におけるアミノ酸の重要性を同定する別の例の手法は、特許文献8及び特許文献9に開示されている。これらの参考文献は、ヒト化抗体においてはアビディティを維持するために対応するマウスアミノ酸との置換を必要とする場合があるフレームワーク内の特定のKabat残基位置を開示している。従って、一部がヒト型であり一部がマウス型である結果として構築されたフレームワークは、依然としてヒト免疫原性又は低下した抗原結合を示すことが多く、このため、治療的使用に好適なフレームワークを得るには、フレームワークの構築において数多くの反復が必要となる。
従って、ヒトにおいてより抗原性が低いαvβ6抗体を開発することが当該技術分野で必要とされている。本発明は、αvβ6に対する特異的な反応性を有するヒト化抗体の生成を提供する。本発明は又、このようなヒト化抗体を作成する方法であって、好適なヒトフレームワーク配列を確実に同定するヒト化抗体を提供することで、非ヒトCDR領域サポートし、更にヒトにおいて高い抗原結合性と低い免疫原性を維持するヒト化抗体を提供することにより行われる方法も提供する。本発明は又、種々の疾患及び障害の処置、診断及び/又は予防における、このようなαvβ6に対する反応性を有するヒト化抗体の使用も提供する。

概要

非ヒト起源の可変領域及びヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むv6インテグリンを認識するヒト化抗体を提供すること。本発明は又、これらの抗体を調製するプロセス、これらの抗体を含む薬学的組成物、及びヒト化抗v6抗体を投与することにより種々の疾患を処置する方法にも関する。本発明は又、腫瘍細胞及び組織の表面におけるインテグリンαvβ6の差次的発現の特定、腫瘍細胞の転移の可能性を測定することにおけるこの差次的発現の使用、並びにインテグリンαvβ6に結合するリガンド、特に抗体を使用して、腫瘍転移を診断及び処置/予防する、及び残存する転移腫瘍細胞を排除する方法にも関する。なし

目的

免疫応答の誘導により、治療用抗体の排除の増進とそれに伴う薬効の損失から、極端な場合は致命的なアナフィラキシーにまで至る、一連の患者における有害作用を引き起こす可能性があることから、治療用抗体の免疫原性を低下させることが望まれている

効果

実績

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請求項1

明細書に記載の発明。

技術分野

0001

(発明の分野)
本発明は、細胞生物学免疫学及び腫瘍学の分野に属する。特に、本発明は、非ヒト起源可変領域及びヒト起源免疫グロブリンの少なくとも一部分を含むv6インテグリンを認識するヒト化抗体に関する。本発明は又、これらの抗体を調製するプロセス、これらの抗体を含む薬学的組成物、及びヒト化抗v6抗体を投与することにより種々の疾患を処置する方法にも関する。本発明は又、腫瘍細胞及び組織の表面におけるインテグリンαvβ6の差次的発現の特定、腫瘍細胞の転移の可能性を測定することにおけるこの差次的発現の使用、並びにインテグリンαvβ6に結合するリガンド、特に抗体を使用して、腫瘍転移診断及び処置/予防する、及び残存する転移腫瘍細胞を排除する方法にも関する。

背景技術

0002

(関連技術)
インテグリンは、細胞外マトリックスタンパク質を結合し、細胞−細胞及び細胞−細胞外マトリックス相互作用(一般的には細胞接着事象と呼ばれる)を媒介する細胞表面糖タンパク質受容体である(Ruoslahti, E., J. Clin. Invest. 87:1−5 (1991); Hynes, R.O., Cell 69:11−25 (1992))。これらの受容体は、互いに組み合わさると、異なる細胞特異性及び接着特異性を有する種々のヘテロ2量体タンパク質が生じる、非共有結合により会合したアルファ(α)及びベータ(β)鎖からなる(Albeda, S.M., Lab. Invest. 68:4−14 (1993))。最近の試験では、細胞接着、遊走浸潤分化、増殖、アポトーシス及び遺伝子発現を含めた細胞プロセスの調節において特定のインテグリンが関与していることが示唆されている(Albeda, S.M., Lab. Invest. 68:4−14 (1993); Juliano, R., Cancer Met. Rev. 13:25−30 (1994); Ruoslahti, E. and Reed, J.C., Cell 77:477−478 (1994);及びRuoslahti, E. and Giancotti, F.G., Cancer Cells 1:119−126 (1989);
Plow, Haas, et al., 2000;van der Flier and Sonnenberg 2001)。

0003

αvβ6受容体は、細胞表面へテロ2量体タンパク質として発現されるインテグリンファミリーの1つのメンバーである(Busk, M., et al., J. Biol. Chem. 267(9):5790−5796 (1992))。αvサブユニットは、種々のβサブユニット(βl、β3、β5、β6及びβ8)とヘテロ2量体を形成できるのに対して、β6サブユニットは、αvサブユニットとヘテロ2量体として発現されるのみである。αvβ6インテグリンは、フィブロネクチン結合、潜時関連ペプチドLAP)結合、及びテナシンC結合細胞表面受容体であることが知られており、これらのRGDトリペプチド結合部位を介して細胞外マトリックスと相互作用する(Busk,
M., et al., J. Biol. Chem. 267:5790−5796 (1992); Weinacker, A., et al., J. Biol. Chem. 269:6940−6948 (1994); Prieto, AX., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10154−10158 (1993))。αvβ6インテグリンは10年以上前に最初に特定され、配列決定されたが、特に疾患におけるαvβ6の生物学的重要性は依然として調査中である。αvβ6の発現は上皮細胞に制限されており、これらの細胞においてαvβ6は、健常組織において比較的低レベルで発現され、発達傷害及び創傷治癒時には有意にアップレギュレートされる(Breuss, J.M., et al., J. Histochem. Cytochem. 41:1521−1527 (1993); Breuss, J.M., et al., J. Cell Sci. 108:2241−2251 (1995); Koivisto, L., et al., Cell Adhes. Communic. 7:245−257 (1999); Zambruno, G., et al., J. Cell Biol. 129(3):853−865 (1995); Hakkinen, L., et al., J. Histochem. Cytochem. 48(6):985−998 (2000))。最近増えつつある報告では、αvβ6が、例えば、結腸癌腫(Niu, J., et al., Int. J. Cancer 92:40−48 (2001); Bates, R.C., et al., J. Clin. Invest. 115:339−347 (2005))、卵巣癌(Ahmed, N., et al., J. Cell Biochem. 84:675−686 (2002); Ahmed, N., et al., J. Histochem. Cytochem. 50:1371−1379 (2002); Ahmed, N., et al., Carcinogen. 23:237−244 (2002))、扁平上皮細胞癌腫(Koivisto, L., et al., Exp. Cell Res. 255:10−17 (2000); Xue, H., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 288:610−618 (2001); Thomas, G.J., et al., J. Invest.
Dermatol. 117:67−73 (2001); Thomas, GJ., et al., Int. J. Cancer 92:641−650 (2001); Ramos, D.M., et al., Matrix Biol. 21:297−307 (2002); (Agrez, M., et al., Br.
J. Cancer 81:90−97 (1999); Hamidi, S., et al., Br. J. Cancer 82(8):1433−1440 (2000); Kawashima, A., et al., Pathol. Res. Pract. 99(2):57−64 (2003))及び乳癌(Arihiro, K., et al., Breast Cancer 7:19−26 (2000))を含めた上皮起源の癌においてアップレギュレートされることが示されている。又、αvサブユニットは、腫瘍転移に関与する場合があり、このサブユニットを阻害することで転移が予防される場合があることも報告されている(例えば、Imhof, B.A., et al., “Attempts to Understand Metastasis Formation I,” U. Gunthert and W. B
irchmeier, eds., Berlin: Springer−Verlag, pp. 195−203 (1996)を参照)。

0004

αvβ6インテグリンは、腫瘍細胞の生物学において複数の調節機能を有する場合がある。最近の研究では、β6サブユニットの細胞外及び原形質ドメインが種々の細胞活性を媒介することが示されている。これらの細胞外及び膜貫通ドメインは、TGF−βの活性化及び接着を媒介することが示されている(Sheppard, D., Cancer
and Metastasis Rev. 24:395−402 (2005); Munger, J.S., et al., Cell 96:319−328 (1999))。β6サブユニットの原形質ドメインは、αvβ6調節細胞の増殖、MMPの生成、遊走及び生存促進の媒介において重要となる固有の11アミノ酸配列を含有する(Li, X., et al., J. Biol. Chem. 278(43):41646−41653 (2003); Thomas, G.J., et al.,
J. Invest. Derm. 117(1):61−73 (2001); Thomas, G.J., et al., Br. J. Cancer 87(8):859−867 (2002); Janes, S.M. and Watt, F.M., J. Cell Biol 166(3):419−431 (2004))。β6サブユニットは、既にクローニング、発現及び精製されており(開示内容が全体が参考として本明細書で援用される、Sheppard等の特許文献1)、αvβ6インテグリンに選択的に結合する機能阻害抗体が報告されている(開示内容が全体が参考として本明細書で援用される、Weinreb, et al., J. Biol. Chem. 279:17875−17877 (2004))。αvβ6の拮抗物質(特定のモノクローナル抗体を含む)も又、急性傷害及び線維症の特定の型を処置する可能性が示唆されている(開示内容が全体が参考として本明細書で援用される、特許文献2及び特許文献3を参照)。

0005

αvβ6は、フィブロネクチン、テネイシン、潜時関連ペプチド−1及び−3(LAP1及びLAP3)、即ちアルギニングリシンアスパルテート(RGD)モチーフとの直接の相互作用を介したTGF−β1潜伏性前駆体型N末端278アミノ酸を含めた、幾つかのリガンドに結合することができる(Busk, M., et al., J. Biol. Chem. 267(9):5790−5796 (1992); Yokosaki, Y., et al., J. Biol. Chem. 271(39):24144−24150 (1996); Huang, X.Z., et al., J. Cell Sci. 111:2189−2195 (1998); Munger, J.S., et al., Cell 96:319−328 (1999))。TGF−βサイトカインは、成熟活性C末端TGF−βサイトカインに非共有結合により会合したN末端LAPを有する潜伏性複合体として合成される。この潜伏性TGF−β複合体は、その同属体受容体に結合することができず、従って活性型に変換されるまでは生物学的活性を有さない(Barcellos−Hoff, M.H., J. Mamm. Gland Biol. 1(4):353−363 (1996);
Gleizes, P.E., et al., Stem Cells 15(3):190−197 (1997); Munger, J.S., et al., Kid. Int. 51:1376−1382 (1997); Khalil, N., Microbes Infect. 1(15):1255−1263 (1999))。LAP1又はLAP2へのαvβ6の結合によって、TGF−β1及びTGF−β3の潜伏性前駆体型の活性化がもたらし(Munger, J.S., et al.,
Cell 96:319−328 (1999))、これは、TGF−βによるその受容体への結合を可能にする潜伏性複合体の構造変化によるものであることが提案されている。即ち、αvβ6のアップレギュレートされた発現によってTGF−βの局所的な活性化がもたらされ、ひいては下流の事象が連鎖的に活性化される可能性がある。

0006

TGF−β1サイトカインは、細胞の増殖、分化及び免疫応答を調節する多面発現性の成長因子である(Wahl, S.M., J. Exp. Med. 180:1587−1590 (1994); Massague, J., Annu. Rev. Biochem. 67:753−791 (1998); Chen, W. and
Wahl, S.M., TGF−β: Receptors, Signaling
Pathways and Autoimmunity, Basel:Karger, pp. 62−91 (2002); Thomas, D.A. and Massague, J., Cancer Cell 8:369−380 (2005))。癌においてTGF−β1が果たす役割は2つの側面がある。TGF−βは腫瘍抑制物質及び生育抑制活性と認識されているが、多くの腫瘍がTGF−β1の生育抑制活性に対して耐性を発生させている(Yingling, J.M., et al., Nature Rev. Drug Discov. 3(12):1011−1022 (2004); Akhurst, R.J., et al., TrendsCell Biol. 11(11):S44−S51 (2001); Balmain, A.
and Akhurst, R.J., Nature 428(6980):271−272 (2004))。樹立された腫瘍において、TGF−β1の発現及び活性は、腫瘍の生存、進行及び転移の促進において関与している(Akhurst, R.J.,
et al., Trends Cell Biol. 11(11):S44−S51 (2001); Muraoka, R.S., et al., J. Clin. Invest. 109(12):155l (2002); Yang, Y.A., et al., J. Clin. Invest. 109(12):1607−1615 (2002))。これは、免疫監視機構血管形成及び腫瘍間質圧力の増大に対するTGF−βの作用を含めた、局所的な腫瘍−支質環境におけるオートクリン及びパラクリンの両作用により媒介されていると仮定されている。現在、幾つかの研究で、TGF−β1を抑制する抗腫瘍及び抗転移作用が示されている(Akhurst, R.J., J. Clin. Invest. 109(12):1533−1536 (2002); Muraoka, R.S., et al., J. Clin. Invest. 109(12):l55l (2002); Yingling, J.M., et al., Nat. Rev. Drug Discov. 3(12):1011−1022 (2004); Yang, Y.A., et al., J.
Clin. Invest. 109(12):l607−1615 (2002);
Halder, S.K., et al., Neoplasia 7(5):509−521 (2005); Iyer, S., et al., Cancer Biol. Ther. 4(3):26l−266 (2005))。

0007

腫瘍における、特に腫瘍−支質の界面におけるαvβ6の発現の増大は、TGF−β1の局所的活性化に固有な機序、並びに腫瘍の生存、浸潤及び転移を促進する能力を反映する場合がある。ヒト転移における高レベルの発現は、転移の樹立におけるαvβ6の潜在的な役割を示しており、これはαvβ6が、上皮から間葉への転移、in vitroにおける腫瘍細胞の浸潤、及び転移と相関する発現をマウスモデルにおいて媒介することができるという以前の報告と合致している(Bates, R.C., et al., J. Clin. Invest. 115(2):339−347 (2005); Thomas, G.J., et al., Br. J. Cancer 87(8):859−867 (2002); Morgan, M.R., et al., J. Biol. Chem. 279(25):26533−26539 (2004))。

0008

以前に本発明者等は、αvβ6のヒト及びマウスの両型に結合し、αvβ6のそのリガンドへの結合及びTGF−β1のαvβ6媒介活性化を阻害する、強力且つ選択的な抗αvβ6モノクローナル抗体(mAb)の生成について報告している(Weinreb, P.H., et al., J. Biol. Chem. 279(17):17875−17887 (2004))。全体が参考として本明細書で援用される特許文献4にも記載の通り、αvβ6に対する高親和性抗体は、このような抗体の相補性決定領域(CDR)における重要アミノ酸残基の同定及び分析を含め、発見及び特徴付けされている。特にこれらの高親和性抗体は、(a)αvβ6に特異的に結合し;(b)αvβ6のそのリガンド、例えばIC50値が10D5の値よりも低いLAP、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びテナシンとの結合を抑制し(特許文献3);(c)TGF−βの活性化を阻害し;(d)αvβ6への結合特異性をもたらすCDR中の特定のアミノ酸配列を含有し;(e)β6サブユニットに特異的に結合し;及び/又は(f)免疫染色操作法、例えばパラフィン包埋組織の免疫染色でαvβ6認識する。

0009

特許文献4には又、αvβ6に結合する抗体を生物物理学的に異なるクラス及びサブクラス分類できるという発見についても記載している。抗体の1つのクラスは、リガンド(例えばLAP)のαvβ6への結合を阻害する能力を示す(ブロッカー)。このクラスの抗体は、更にカチオン依存性ブロッカー及びカチオン非依存性ブロッカーのサブクラスに分割することができる。カチオン依存性ブロッカーの一部は、アルギニン−グリシン−アスパルテート(RGD)ペプチド配列を含有するのに対し、カチオン非依存性ブロッカーは、RGD配列を含有しない。別のクラスの抗体は、αvβ6に結合する能力を示すが、αvβ6のリガンドへの結合は阻害しない(非ブロッカー)。

0010

更に、特許文献4は、相補性決定領域(CDR)1、2及び3が、αvβ6への結合特異性をもたらす特定のアミノ酸配列からなる重軽鎖を含む抗体も開示している。第WO03/100033号は又、αvβ6に特異的に結合するが潜時関連ペプチド(LAP)へのαvβ6の結合を抑制しない抗体、並びに同じエピトープに結合する抗体も提示している。

0011

特許文献4は更に、ハイブリドーマ細胞6.1A8、6.2B10、6.3G9、6.8G6、6.2Bl、6.2Al、6.2E5、7.1G10、7.7G5及び7.1C5、コード配列を含む単離された核酸、及び抗αvβ6抗体のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドも開示している。特に特許文献4は、ハイブリドーマ6.1A8、6.3G9、6.8G6、6.2Bl、6.2B10、6.2Al、6.2E5、7.1G10、7.7G5又は7.1C5により生成される抗体として重軽鎖ポリペプチド配列を含む抗αvβ6抗体を開示している。ハイブリドーマの数種は、ブダペスト条約に基づきAmerican Type Culture Collection(“ATCC”;P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA)に寄託されている。特にハイブリドーマクローン6.3G9及び6.8G6は、2001年8月16日に寄託され、それぞれ受入番号ATCCPTA−3649及びPTA−3645を有する。ハイブリドーマ6.3G9及び6.8G6により生成されるマウス抗体は、ヒト化抗体として開発する可能性に関して、本出願において更に検討する。

0012

マウスモノクローナル抗体3G9は、ヒト可溶性αvβ6で免疫化されたβ6インテグリン−/−マウス(Huang, et al., J. Cell Biol. 133:921−928 (1996))から単離されたマウスIgGκ抗体である。3G9抗体は、傷害、線維症及び癌の間にアップレギュレートされたレベルで発現されるαvβ6インテグリンエピトープを特異的に認識する(例えば、Thomas, et al., J. Invest. Dermatology 117:67−73 (2001); Brunton, et al., Neoplasia 3:215−226 (2001); Agrez, et al., Int. J. Cancer 81:90−97 (1999); Breuss, J. Cell Science
108:2241−2251 (1995)を参照)。これはその他のαvインテグリンには結合せず、ヒト及びマウスの両分子に対して交差反応性を有する。マウスモノクローナル抗体3G9は、精製されたヒト可溶性αvβ6への、又はβ6発現細胞へのリガンドの結合を阻害することから判断される通り、αvβ6のLAPへの結合を阻害し、これによりTGF−β受容体活性化の線維症促進活性を抑制することが報告されている(特許文献4を参照)。又、既知のαvβ6抗体の1つである10D5よりもIC50値が低いTGF−βのαvβ6媒介活性化を抑制することも示されている(Huang, et al., J CeIl Sci. 111:2189 −2195 (1998))。

0013

マウスモノクローナル抗体8G6は、特許文献4に記載の通り、αvβ6インテグリンエピトープも認識するマウスIgG1κ抗体である。マウスモノクローナル抗体8G6は、10D5よりもIC50値が低いTGF−βのαvβ6媒介活性化を抑制する能力を示す、αvβ6のカチオン依存性高親和性ブロッカーである(特許文献4を参照)。

0014

3G9及び8G6の両マウス抗体は、特許文献4に記載の通り、腎臓及び肺の線維症を予防するのに有効であった。更に、マウス抗体3G9は、ヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を効果的に抑制することができ、癌の病理におけるαvβ6の潜在的な役割、及びαvβ6に指向された抗体を使用するこのような阻害の有効性が示唆されている。

0015

従って、ヒトにおいてより抗原性が低く、αvβ6経路に関与する疾患の処置において有用な場合があるαvβ6抗体を開発することが必要とされている。組換えDNA法の出現により、抗体遺伝子構造的に操作し、ハイブリドーマ技術では得られない特性を有する修飾された抗体分子を生成することが可能となった。治療現場において、本方法の1つの目的は、ヒトにおけるげっ歯類モノクローナル抗体の免疫原性を、それらの一次アミノ酸構造を修飾することによって低減することであった。免疫応答の誘導により、治療用抗体の排除の増進とそれに伴う薬効損失から、極端な場合は致命的なアナフィラキシーにまで至る、一連患者における有害作用を引き起こす可能性があることから、治療用抗体の免疫原性を低下させることが望まれている。

0016

外来性モノクローナル抗体の免疫原性を低減する1つの方策は、モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖定常ドメインをヒト起源の類似ドメインで置き換えて、外来性抗体の可変領域ドメインに影響が及ばないようにすることであった。重軽鎖の可変領域ドメインは、抗体と抗原の間の相互作用を担っている。ヒト定常ドメインに連結したマウス可変ドメインを有するキメラ抗体分子は、通常キメラ由来元のマウス抗体と同じ親和性定数を有する抗原に結合する。このようなキメラ抗体は、その完全なマウス対応型よりもヒトにおける免疫原性が低い。それにもかかわらず、マウス可変ドメイン全体を維持する抗体は、患者のかなりの割合において免疫応答を誘発する傾向がある。

0017

ヒトが全マウス可変ドメインに対して免疫応答を示すことは予測されたことであり、従って、より多いヒト特性を有する可変ドメインを得る取組みが、このような標準的なキメラ抗体の臨床試験結果が報告されるよりも前から開始されていた。「ヒト化」と呼ばれることが多い方法の1つの区分は、マウスとヒトの両特性を有する抗体可変ドメイン組換え構築することにより、マウスモノクローナル抗体の可変ドメインをよりヒト型に変換することを目的としている。ヒト化の方策は、抗体構造データの幾つかの合意された理解に基づいている。第1に、可変ドメインは、種内で保存されているが、進化的に遠い種同士(例えばマウスとヒト)の間では異なるペプチド配列の隣接地帯を含有する。第2に、その他の隣接地帯は、種内で保存されていないが、同じ個体内の抗体生成細胞の間でさえも異なる。第3に、抗体と抗原の接触は、主に可変ドメインの非保存領域を介して起こる。第4に、抗体可変ドメインの分子アーキテクチャーは、種の間で十分に類似することから、種間で対応するアミノ酸残基の位置が、実験データを使用せずに位置のみに基づいて特定される場合がある。

0018

ヒト化の方策は、マウス配列に特徴的なアミノ酸残基をヒト抗体の対応する位置に存在する残基で置き換えることで、結果として得られる抗体のヒトにおける免疫原性を低下させることができるという前提に基づいている。しかしながら、種間の配列の置き換えると、通常は抗体によるその抗原への結合を低下させることになる。そのため、ヒト化の技術は、免疫原性を低下させるための元のマウス配列の置き換えと、ヒト化分子が抗原結合の治療有用性を維持する必要性とのバランスを取ることにある。このバランスは2つの手法を使用して取られている。

0019

特許文献5に例示されている1つの手法では、特徴的な点として、ヒト型である残基が、(i)抗原との相互作用において有意な化学的役割を果たさず、(ii)側鎖が溶媒内に突出して配置されていることが判明している又は予測されているマウス可変ドメイン残基で置き換えられている。即ち、抗原結合部位から遠い外部残基をヒト化されるのに対して、内部残基、抗原結合残基、並びに可変ドメイン間の界面を形成する残基は、マウス型のままである。この手法の1つの欠点は、残基が抗原結合において有意な化学的役割を果たさず、特定の3次元抗体構造において溶媒内に配置されるかどうかを判定するために、かなり広範な実験データが必要となる点である。

0020

特許文献6に例示されている別のより一般的な手法では、保存されていると考えられるマウス可変ドメインペプチド配列の隣接地帯が、ヒト抗体の対応する地帯置換される。このより一般的な手法では、抗原結合に関与する非保存の領域を除いて、全ての可変ドメイン残基がヒト化される。置き換えに適切な隣接地帯を決定するに当たり、特許文献6では、Wu and Kabat, J Exp Med. 132(2):211−250 (1970)にて以前に開発されている抗体可変ドメイン配列の分類を利用している。

0021

Wu及びKabatは、抗体ペプチド配列のアライメント開拓しており、この点における両者の寄与は数倍にも及んでいる。第一に、Kabat及びWuは、可変ドメイン間の配列類似性の研究を通して、全脊椎動物種の全抗体にわたってある程度は相同である対応する残基を同定した。これらは、同様の三次元構造を採用し、同様の機能的役割を果たし、近隣残基と同様に相互作用し、同様の化学的環境に存在することから、同定が可能であった。第2に、Kabat及びWuは、相同の免疫グロブリン残基が同じ位置番号割り付けられているペプチド配列番号付け系を考案した。当業者であれば、配列そのものを超えた何れかの実験データに依存することなく、通常Kabat番号付けと呼ばれるものを何れかの可変ドメイン配列に明白に割り付けることができる。第3に、Kabat番号を有する配列位置のそれぞれについて、Kabat及びWuは可変性を計算した。この可変性とは、可変ドメイン配列がアラインされる場合における多少の可能なアミノ酸の発見を意味する。Kabat及びWuは、4つの低可変性の隣接領域内に埋め込んだ3つの高可変性の隣接領域を同定した。その他の研究者等は、概ねこれらの領域(超可変領域)における可変性を以前に報告しており、高可変性領域が、抗原結合に使用されるアミノ酸残基を表すと提唱している。Kabat及びWuは、これらの可変地帯を構成する残基を以前に区分けしており、これらを、抗体と抗原の間の化学的相補性を指す「相補性決定領域」(CDR)と呼んだ。抗原認識ではなく可変ドメインの3次元折り畳みにおける役割は、残余の低可変領域に起因するとされており、これは現在では「フレームワーク領域」と呼ばれている。第4に、Kabat及びWuは、抗体ペプチド及び核酸配列の公的データベース確立しており、これは現在でも継続して維持され、当業者に周知である。

0022

Kabatの分類の使用において特許文献6に開示されるヒト化の方法は、1つの抗体由来のCDR、及び種、起源、特異性、サブクラス又はその他の特徴が異なる別の抗体由来のフレームワーク領域を含むキメラ抗体をもたらす。しかしながら、何れの特定の配列又は特性も、フレームワーク領域に起因するとはされておらず、実際に特許文献6では、何れのセットのフレームワークも何れのセットのCDRと組み合わせることができると教示している。以来、フレームワーク配列は、良好な抗原結合を維持するのに必要な抗体の可変領域の三次元構造を与える上で重要であると認識されている。その後のこの分野の進歩は、対応するマウス抗体のアビディティ相対比較した場合の一部のヒト化抗体を使用した場合に観察される抗原に対するアビディティの喪失を取り扱う特許文献6の適用範囲内における改良となっている。

0023

特許文献7は、抗体をヒト化するための特許文献6の1つの改良を開示しており、立体的又はその他の化学的な不適合成のためにマウス抗体内に存在する結合可能な構造へのCDRの折り畳みを妨害するヒト化フレームワークにおける構造モチーフにおける問題点がアビディティ喪失の原因であるとする前提に基づいている。この問題を論じるために、特許文献7は、ヒト化するマウス抗体のフレームワーク配列に対して直鎖ペプチド配列において緊密に相同であるヒトフレームワーク配列を使用することを教示している。従って、特許文献7の方法は、種間のフレームワーク配列を比較することに焦点を置いている。一般的には、全ての使用可能なヒト可変ドメイン配列を特定のマウス配列と比較し、対応するフレームワーク残基の間の同一性パーセントを計算する。ヒト可変ドメインは、ヒト化プロジェクトのためのフレームワーク配列が提供されるように、最高パーセントを有するものが選択される。特許文献7は又、結合可能な構造においてCDRを支持するのに重要なマウスフレームワーク由来の特定のアミノ酸残基を、ヒト化フレームワーク内で保持することが重要であるとも教示している。

0024

その他の手法では、Riechmann, et al., Nature 332(6162):323−327 (1988)に記載の通り、低アビディティのヒト化コンストラクトが得られた後に、単一残基をマウス配列に先祖返りさせ、抗原結合を試験することにより、特定のフレームワークアミノ酸残基の重要性が実験的に測定されている。フレームワーク配列におけるアミノ酸の重要性を同定する別の例の手法は、特許文献8及び特許文献9に開示されている。これらの参考文献は、ヒト化抗体においてはアビディティを維持するために対応するマウスアミノ酸との置換を必要とする場合があるフレームワーク内の特定のKabat残基位置を開示している。従って、一部がヒト型であり一部がマウス型である結果として構築されたフレームワークは、依然としてヒト免疫原性又は低下した抗原結合を示すことが多く、このため、治療的使用に好適なフレームワークを得るには、フレームワークの構築において数多くの反復が必要となる。
従って、ヒトにおいてより抗原性が低いαvβ6抗体を開発することが当該技術分野で必要とされている。本発明は、αvβ6に対する特異的な反応性を有するヒト化抗体の生成を提供する。本発明は又、このようなヒト化抗体を作成する方法であって、好適なヒトフレームワーク配列を確実に同定するヒト化抗体を提供することで、非ヒトCDR領域サポートし、更にヒトにおいて高い抗原結合性と低い免疫原性を維持するヒト化抗体を提供することにより行われる方法も提供する。本発明は又、種々の疾患及び障害の処置、診断及び/又は予防における、このようなαvβ6に対する反応性を有するヒト化抗体の使用も提供する。

先行技術

0025

米国特許第6,787,322B2号明細書
米国特許第6,692,741B2号明細書
国際公開第99/07405号パンフレット
国際公開第03/100033号パンフレット
米国特許第5,869,619号明細書
米国特許第5,225,539号明細書
米国特許第5,693,761号明細書
米国特許第5,821,337号明細書
米国特許第5,859,205号明細書

課題を解決するための手段

0026

本発明は、αvβ6に対する高親和性ヒト化抗体の発見及び特徴付け、例えばこのような抗体の相補性決定領域(CDR)における中核的なアミノ酸の同定及び分析、並びにフレームワーク配列における重要なアミノ酸残基の同定及び分析に少なくとも部分的に基づいている。

0027

一実施形態において、本発明は、αvβ6インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化モノクローナル抗体であって、該抗体がそれぞれ配列番号1及び配列番号2の重軽鎖可変ドメインを含む抗体に関する。このようなヒト化抗体は、マウス3G9抗体のヒト化に由来する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、相補性決定領域(CDR)1、2及び3が配列番号1のアミノ酸残基31〜35、50〜65及び98〜109によりそれぞれ定義される重鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、CDR1、2及び3が配列番号2のアミノ酸残基24〜35、51〜57及び90〜98によりそれぞれ定義される軽鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、フレームワーク領域(FR)1、2、3及び4が配列番号1のアミノ酸残基1〜30、36〜49、66〜97及び110〜120によりそれぞれ定義される重鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、フレームワーク領域(FR)1、2、3及び4が配列番号2のアミノ酸残基1〜23、36〜50、58〜89及び99〜108によりそれぞれ定義される軽鎖を含む。

0028

特定の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号1のQ3M及びN74Sからなる重鎖アミノ酸置換のうちの少なくとも1つを含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、配列番号2のE1Q、L47W、I58V、A60V及びY87Fからなる軽鎖アミノ酸置換のうちの少なくとも1つを含む。

0029

特定の実施形態において、ヒト化抗体は、重鎖が配列番号1のアミノ酸置換Q3M及びN74Sからなる重鎖型1(「HV1」)を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、重鎖が配列番号1のアミノ酸置換N74Sからなる重鎖型2(「HV2」)を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、重鎖が配列番号1からなる重鎖3型(「HV3」)を含む。

0030

特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖が配列番号2のアミノ酸置換L47W、I58V、A60V及びY87Fからなる軽鎖型1(「LV1」)を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖が配列番号2のアミノ酸置換L47W及びI58Vからなる軽鎖型2(「LV2」)を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖が配列番号2のアミノ酸置換L47Wからなる軽鎖3型(「LV3」)を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖が配列番号2のアミノ酸置換E1Q及びL47Wからなる軽鎖型4(「LV4」)を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖が配列番号2からなる軽鎖5型(「LV5」)を含む。

0031

特定の実施形態において、ヒト化抗体は、重鎖が配列番号1からなるHV3、及び軽鎖が配列番号2からなるLV5を含む重軽鎖可変ドメインを含む。

0032

特定の実施形態において、ヒト化抗体は、マウス6.3G9抗体に由来するCDRを有する(ATCC受入番号PTA−3649)。

0033

関連する実施形態において、本発明は又、αvβ6インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化モノクローナル抗体であって、抗体が配列番号3及び配列番号4の重軽鎖可変ドメインを含む抗体にも関する。このようなヒト化抗体は、マウス8G6抗体のヒト化に由来する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、相補性決定領域(CDR)1、2及び3が配列番号3のアミノ酸残基(即ち一部の保存された変異を除く)31〜35、50〜66及び99〜115によりそれぞれ定義される重鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、CDR1、2及び3が配列番号4のアミノ酸残基24〜38、54〜60及び93〜101によりそれぞれ定義される軽鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、フレームワーク(FR)1、2、3及び4が配列番号3のアミノ酸残基1〜30、36〜49、67〜98及び116〜126によりそれぞれ定義される重鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、FR1、2、3及び4が配列番号4のアミノ酸残基1〜23、39〜53、61〜92及び102〜111によりそれぞれ定義される軽鎖を含む。

0034

特定の実施形態において、ヒト化抗体は配列番号3のA24G、G26S、Q39L、M48I、V68A、R72V及びT74Kからなる重鎖アミノ酸置換のうちの少なくとも1つを含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は配列番号4のE1D、L46F及びY49Kからなる軽鎖アミノ酸置換のうちの少なくとも1つを含む。

0035

特定の実施形態において、ヒト化抗体は重鎖型1(「HV1’」)を含み、重鎖は配列番号3のアミノ酸置換A24G、G26S、Q39L、M48I、V68A、R72V及びT74Kからなる。特定の実施形態において、ヒト化抗体は重鎖型2(「HV2’」)を含み、重鎖は配列番号3のアミノ酸置換M48I、V68A、R72V及びT74Kからなる。特定の実施形態において、ヒト化抗体は重鎖3型(「HV3’」)を含み、重鎖は配列番号3のアミノ酸置換V68A、R72V及びT74Kからなる。

0036

特定の実施形態において、ヒト化抗体は軽鎖型1(「LV1’」)を含み、軽鎖は配列番号4のアミノ酸置換E1D、L46F及びY49Kからなる。特定の実施形態において、ヒト化抗体は軽鎖型2(「LV2’」)を含み、軽鎖は配列番号4のアミノ酸置換L46F及びY49Kからなる。特定の実施形態において、ヒト化抗体は軽鎖3型(「LV3’」)を含み、軽鎖は配列番号4のアミノ酸置換Y49Kからなる。

0037

特定の実施形態において、ヒト化抗体は、マウス6.8G6抗体に由来するCDRを有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、αvβ6への結合においてマウス8G6抗体と競合することができる。

0038

本発明は又、上述の抗体の何れかと同じエピトープに結合するヒト化抗体を包含する。

0039

本発明は又、ヒト化抗体をコードする核酸を含む組換えベクターにより生成される該抗体を包含する。特定の実施形態において、組換えベクターはpKJS195(配列番号5)、pKJS189(配列番号6)及びpKJS196(配列番号7)からなる群より選択されるプラスミドである場合がある。

0040

本発明は又、配列番号1〜7の何れか1つのコード配列を含む、単離された核酸及び配列番号1〜7の何れか1つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを包含する。

0041

本発明は又、上述のヒト化抗体の何れかの核酸を含む組換えベクターを包含する。

0042

本発明は又、上述のヒト化抗体の何れかの核酸を含む組換えベクターを含む宿主細胞を包含する。

0043

本発明は又、本発明のヒト化抗体1つ以上及び薬学的に許容される担体を含む組成物を包含する。これらの組成物の一部においては、ヒト化抗体は毒素又は放射性核種のような細胞毒性因子(即ち細胞の生存性及び/又は機能を損傷させる薬剤)にコンジュゲートする。組成物は疾患を処置(例えば軽減、緩和、低減、予防、発症延期)するためにαvβ6により媒介される疾患を有する、又は有する危険性がある被験体(例えばヒトのような哺乳動物)に投与できる。このような疾患の例には、線維症(例えば硬皮症瘢痕化肝線維症肺線維症又は腎線維症);乾癬;癌(本明細書において別途記載、例えば上皮癌口腔癌皮膚癌子宮頚癌、卵巣癌、咽頭癌喉頭癌、食道癌肺癌、乳癌、腎臓癌膵臓癌前立腺癌又は結腸直腸癌);アルポート症候群;肺、肝臓、腎臓及び他の内臓の急性及び慢性の傷害;及び肺、肝臓、腎臓及び他の内臓の硬化症が含まれるが、これらに限定されない。このような疾患を有する危険性は、遺伝的素因;特定の生活様式、例えば喫煙及びアルコール症アスベストのような環境汚染物質への曝露生理学病態、例えば糖尿病肝炎ウィルス感染(例えばC型肝炎ウィルス感染)、自己免疫疾患;及び医療処置、例えば放射線処置に起因するものである場合がある。

0044

本発明は又、ヒト化抗体の発現に適切な条件下で上記宿主細胞の何れかを培養することにより、上記ヒト化抗体の何れかを調製する方法であって、ヒト化抗体鎖が発現され、ヒト化抗体が生成される、方法も包含する。特定の実施形態において、本方法は、ヒト化抗体を単離する手順を更に含む。特定の実施形態において、宿主細胞はCHO細胞である。

0045

ハイブリドーマクローン6.3G9及び6.8G6は、ブダペスト条約に基づきAmerican Type Culture Collection(“ATCC”;P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA)に2001年8月16日に寄託されており、それぞれ受入番号ATCCPTA−3649及び−3645を有する。

0046

本発明のヒト化抗体は、完全な抗体、例えば2重鎖及び2軽鎖を含む抗体を指すか、又は完全な抗体の抗原結合フラグメント、例えばFabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント又はF(v)フラグメントを指す。本発明のヒト化抗体は、何れかのアイソタイプ及びサブタイプ、例えばIgA(例えばIgAl及びIgA2)、IgG(例えばIgGl、IgG2、IgG3及びIgG4)、IgEIgDIgMであってもよく、この場合、免疫グロブリンの軽鎖は、κ型である場合もあれば、λ型である場合もある。

0047

幾つかの実施形態において、本発明のヒト化抗体は、抗体の抗原結合能力に影響することなく抗体のエフェクター機能(例えばFc受容体又は補体因子に結合する抗体の能力)が改変されるように重鎖の特定の位置の1つ以上(例えば2つ、3つ、4つ、5つ又は6つ)において突然変異(例えば欠失、置換又は付加)を含む場合がある。

0048

他の実施形態において、本発明のヒト化抗体は、グリコシル部位が排除されるようにグリコシル化のための部位であるアミノ酸残基において突然変異を含有する場合がある。このようなヒト化抗体は、臨床上有益な低減されたエフェクター機能又は他の望ましくない機能を有するが、抗原結合親和性は保持する。グリコシル化部位の突然変異は又、プロセスの開発(例えばタンパク質発現及び精製)にも有益である。

0049

本発明の特定の実施形態において、ヒト化抗体は、自身のCDRがマウス3G9抗体に由来するアグリコシル軽鎖を含む。特定の実施形態において、ヒト化3G9抗体はCDR1領域が配列番号2のアミノ酸残基26においてアスパラギン(N)からセリン(S)への置換を含有する軽鎖可変ドメインを含有する。マウス3G9CDR1領域はこのアミノ酸部位においてアスパラギンを含有する。しかしながら、3G9抗体のヒト化型においては、5種類の軽鎖型(LV1、LV2、LV3、LV4及びLV5)が全て、この位置において3G9CDR1内にセリンを含有する。ヒト化3G9抗体の全軽鎖型におけるこの部位のアグリコシル化はタンパク質発現及び軽鎖精製の両方のために有益であることが解っている。特定の実施形態において、ヒト化3G9抗体は正常なFc受容体結合のために通常は必要であるグリコシル化部位において突然変異を含有する。特定の実施形態において、ヒト化3G9抗体はアスパラギン(N)からグルタミン(Q)へのアミノ酸置換を含有する。特定の実施形態において、ヒト化3G9抗体はプラスミドpKJS196(配列番号7)を含む組換えベクターにより生成される重鎖3型(HV3)においてNからQへのアミノ酸置換を含有する。特定の実施形態において、NからQへのアミノ酸置換は配列番号7のアミノ酸残基319において起こる。ヒト化3G9抗体の重鎖3型(HV3)におけるコン部位のアグリコシル化はヒト化抗体の抗原結合親和性に影響することなく正常なFc受容体結合に必要なグリコシル化シグナルを除去することがわかっている。特定の実施形態において、ヒト化3G9抗体はプラスミドpKJS189(配列番号6)を含む組換えベクターにより生成される重鎖3型(HV3)及びプラスミドpKJS195(配列番号5)を含む組換えベクターにより生成される軽鎖5型(LV5)を含む。特定の実施形態において、ヒト化3G9抗体はプラスミドpKJS196(配列番号7)を含む組換えベクターにより生成されるアグリコシル重鎖3型(a−HV3)及びプラスミドpKJS195(配列番号5)を含む組換えベクターにより生成される軽鎖5型(LV5)を含む。

0050

更に別の実施形態において、重鎖又は軽鎖は親和性又は力価を増大させる突然変異を含有できる。

0051

本発明のヒト化抗体はαvβ6のそのリガンド、例えばLAP及びフィブロネクチンへの結合により媒介される何れかの臨床的に望ましくない病態又は疾患(本明細書において考察する通り)を処置するのに有用である。これらのヒト化抗体は、より高い親和性又はアビディティ、及びリガンドへの結合のカチオン依存性又は非依存性により、以前より知られているαvβ6抗体よりも強力であってもよい。マウスモノクローナル抗体とは対照的に、本発明のヒト化抗体は被験体、特にヒトの身体において抗マウス免疫グロブリン抗体生成を誘発せず、むしろ、延長された血半減期を示し、有害作用の頻度が低下しており、このため、αvβ6により媒介される疾患の処置における薬効においてマウスモノクローナル抗体よりも優秀であることが期待される。

0052

別の態様において、本発明は、αvβ6結合抗体のようなαvβ6結合リガンドを使用した癌を診断、処置及び予防する方法に関する。一実施形態において、本発明は、患者における原発腫瘍の二次的な位置への転移を低減又は予防する方法であって、原発腫瘍内の1つ以上の細胞上のインテグリンαvβ6の1つ以上のサブユニットに結合する1つ以上のリガンドの治療有効量を患者に投与する工程を含み、リガンドのインテグリンへの結合は腫瘍細胞の死滅化学的感受性又は浸潤性の低下をもたらす、方法を提供する。関連する実施形態において、本発明は、患者における転移前腫瘍から転移腫瘍への進行を低減又は予防する方法であって、転移前腫瘍内の1つ以上の細胞上のインテグリンαvβ6の1つ以上のサブユニットに結合する1つ以上のリガンドの治療有効量を患者に投与する工程を含み、リガンドのインテグリンへの結合は原発腫瘍を囲む組織区域内への転移前癌細胞の浸潤の低減又は予防をもたらす、方法を提供する。本発明の特定のこのような実施形態において、腫瘍細胞は癌腫、例えば腺癌である。より特定される実施形態において、癌腫は乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫である。より特定すれば、癌腫は乳癌(例えば限定しないが上皮内乳癌腫(insitu breast carcinoma)、例えば上皮内腺管癌(DCIS)又は上皮内小葉癌(LCIS))、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、子宮頚癌腫又は肺癌腫である。

0053

本発明のこの態様による好適な実施形態は、αvβ6結合抗体又はそのαvβ6エピトープ結合フラグメントであるαvβ6インテグリン結合リガンドを使用する。特定のこのような実施形態によれば、抗体はモノクローナル抗体(キメラ、霊長類化又はヒト化である場合がある)、例えば全体が参考として本明細書で援用される米国特許出願公開第2005/0255102Al号に開示されているものである。好適なこのような抗体には、1A8、3G9、8G6、2Bl、2B10、2Al、2E5、1G10、7G5、1C5、10D5(ATCC寄託番号HB12382)及びCSβ6と標記されたαvβ6結合モノクローナル抗体並びにそのフラグメント、キメラ及びハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。本発明のこのような実施形態における使用に特に好適なものは、モノクローナル抗体3G9及び8G6である。又、本発明のこのような実施形態における使用に同様に特に好適なものは、ヒト化モノクローナル抗体、例えばhu3G9(BG00011)と呼ばれるヒト化3G9抗体、及びhu8G6と呼ばれるヒト化8G6抗体である。

0054

本発明のこのような特定の治療実施形態において、αvβ6結合リガンド(例えばαvβ6結合抗体)は、細胞又は組織上の1つ以上のαvβ6インテグリンへのαvβ6結合リガンド−毒性化合物コンジュゲートの結合時に細胞又は組織の死滅をもたらす、又は誘発する1つ以上の細胞毒性化合物又は薬剤とコンジュゲート又は結合させる。本発明の追加の治療実施形態において、αvβ6結合リガンド(例えばαvβ6結合抗体)は、1つ以上のこのような細胞毒性化合物又は薬剤と組み合わせて患者に投与される。本発明のこれらの態様に従って好適に使用することができる細胞毒性化合物又は薬剤には、細胞毒性因子(例えばシスプラチンカルボプラチンオキサリプラチンパクリタキセルメルファランドキソルビシンメトトレキセート5−フルオロウラシルエトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミドブレオマイシンカリケアマイシンマイタンシン、トリコテネ(trichothene)、CC1065、ジフテリアA鎖、緑膿菌外毒素A鎖、リ
シンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、α−サルシン、Aleuritesfordiiタンパク質、ジアンシン(dianthin)タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質、モモルジカ・チャランティア(momordicacharantia)阻害物質、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サポナリアオフィシナリス(sapaonariaofficinalis)阻害物質、ゲロニン(gelonin)、ミトリン(mitogellin)、レストクトシン
(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)、トリコテセン(tricothecene)、リボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼ)、放射性同位体(例えば211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、並びにLuの放射性同位体)及びプロドラッグ活性化酵素(例えばアルカリホスファターゼアリールスルファターゼシトシンデアミナーゼプロテアーゼ、D−アラニルカルボキシペプチダーゼ炭水化物開裂酵素、P−ラクタマーゼ及びペニシリンアミダーゼ)が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、αvβ6インテグリン結合1つ以上のリガンドは、αvβ6インテグリン結合1つ以上のリガンドの有効量及び1つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物の形態で患者に投与する。αvβ6インテグリン結合1つ以上のリガンド、及び/又はαvβ6インテグリン結合1つ以上のリガンドを含む薬学的組成物は、薬学的組成物を投与する何れかの好適な様式、例えば限定しないが経口投与非経口投与(例えば筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下の経路による)、頭蓋内投与、経皮投与肺内投与及び鼻内投与により患者に投与できる。

0055

別の実施形態において、本発明は、浸潤性癌腫に進行する可能性がより高い、及び/又は、インテグリンαvβ6の1つ以上のサブユニットに結合するリガンドを使用した処置に応答する可能性がより高い、腺癌のような癌腫を診断又は発見する方法を提供する。このような好適な方法は、例えば、(a)腫瘍又はその一部分を含む癌性上皮組織試料、及び非癌性上皮組織試料を患者から得る;(b)インテグリンαvβ6の1つ以上のサブユニットに結合する1つ以上のリガンドに組織試料を接触させる;及び(c)組織試料におけるインテグリンαvβ6の発現レベルを測定することを含む場合があり、非癌性組織試料におけるインテグリンαvβ6の発現レベルに比べて癌性組織試料におけるインテグリンαvβ6の発現レベルが増大していることは、(a)in situ又は非浸潤性の形態から浸潤性の転移性形態に進行する可能性がより癌種;及び/又は(b)αvβ6結合リガンド、特に、上述のような1つ以上の細胞毒性化合物又は薬剤にコンジュゲートされるかこれと組み合わせて投与されるαvβ6結合リガンドの結合に依存している上述の処置方法の1つ以上による処置に応答する可能性がより高い癌腫が患者に存在することを示す。このような方法は、種々の癌腫、例えば限定しないが上述の上皮組織が関与するものを診断又は発見するのに好適である。特定のこのような実施形態において、インテグリンαvβ6の1つ以上のサブユニットに結合するリガンドはαvβ6インテグリン結合抗体(上述のようなモノクローナル抗体である場合がある)又はそのαvβ6エピトープ結合フラグメントである。本発明のこのような診断方法における使用に特に好適なものは、検出可能に標識された、即ち、発色原標識(例えばジアミノベンジジン又は4−ヒドロキシアゾベンゼン−2−カルボン酸)、酵素標識(例えばリンゴ酸デヒドロゲナーゼスタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ−5−ステロイドイソメラーゼ酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼトリオースリン酸イソメラーゼペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼグルコースオキシダーゼβ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼカタラーゼグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼグルコアミラーゼ又はアセチルコリンエステラーゼ)、放射性同位体標識(例えば3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc又は109Pd)、非放射性同位体標識(例えば157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、56Fe、99mTc又は112In)、蛍光標識(例えば152Eu標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識、o−フタルデヒド標識又はフルオレサミン標識)、毒性標識(例えばジフテリア毒素標識、リシン標識又はコレラ毒素標識)、化学発光標識(例えばルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識又はエクオリン標識)、X線撮影用標識(例えばバリウム又はセシウム)、スピンラベル(例えば重水素)及び核磁気共鳴造影剤標識(例えばGd、Mn及び鉄)のような少なくとも1つの検出可能な標識を含むか、それにコンジュゲートされるか、又はそれに結合された、αvβ6結合リガンド(例えば抗体)である。

0056

別の実施形態において、本発明は、患者におけるαvβ6陽性転移腫瘍細胞を排除する方法であって、1つ以上のαvβ6陽性転移腫瘍細胞上のインテグリンαvβ6の1つ以上のサブユニットに結合する1つ以上のリガンドの治療有効量を患者に投与する工程を含み、リガンドのインテグリンへの結合は転移腫瘍細胞の死滅、化学的感受性又は浸潤性の低下をもたらす、方法を提供する。このような方法は、転移性の癌腫、例えば限定しないが上述の上皮組織が関与するものから生じるもののような、患者における種々の転移腫瘍細胞を排除するのに好適である。本発明のこの態様による好適な実施形態は、上述のαvβ6結合抗体又はそのαvβ6エピトープ結合フラグメント、特にモノクローナル抗体又はその変異型又はフラグメントであるαvβ6インテグリン結合リガンドを使用する。本発明の特定のこのような治療実施形態において、αvβ6結合リガンド(例えばαvβ6結合抗体)は細胞又は組織上の1つ以上のαvβ6インテグリンへのαvβ6結合リガンド−毒性化合物コンジュゲートの結合時に細胞又は組織の死滅をもたらす、又はそれを誘発する1つ以上の細胞毒性化合物又は薬剤とコンジュゲート又は結合させる。本発明の別の治療実施形態において、αvβ6結合リガンド(例えばαvβ6結合抗体)は1つ以上の細胞毒性化合物又は薬剤と組み合わせて患者に投与する。本発明のこれらの態様に従って好適に使用することができる細胞毒性の化合物又は薬剤には、上述の細胞毒性因子、放射性同位体及びプロドラッグ活性化酵素が含まれるが、これらに限定されない。本発明のこの態様によれば、αvβ6インテグリン結合リガンド又はリガンド及び1つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物は、上述の投与様式に従って患者に投与できる。

0057

別の実施形態において、本発明は、患者の組織又は臓器から腫瘍を外科的に摘出した後に前記患者から残存するαvβ6陽性腫瘍細胞を排除する方法であって、前記組織又は臓器に残存する1つ以上の腫瘍細胞上のインテグリンαvβ6の1つ以上のサブユニットに結合する1つ以上のリガンドの治療有効量を前記患者に投与する工程を含み、前記リガンドの前記インテグリンへの結合が、前記腫瘍細胞の死滅、化学的感受性又は浸潤性の低下をもたらす、方法を提供する。このような方法は、癌腫、例えば限定しないが上述の上皮組織が関与するものから生じるもののような、種々の患者組織における種々の転移腫瘍細胞を排除するのに好適である。本発明のこの態様による好適な実施形態は、上述のαvβ6結合抗体又はそのαvβ6エピトープ結合フラグメント、特にモノクローナル抗体又はその変異型又はフラグメントであるαvβ6インテグリン結合リガンドを使用する。本発明の特定のこのような治療実施形態において、αvβ6結合リガンド(例えばαvβ6結合抗体)は細胞又は組織上の1つ以上のαvβ6インテグリンへのαvβ6結合リガンド−毒性化合物コンジュゲートの結合時に細胞又は組織の死滅をもたらす、又はそれを誘発する1つ以上の細胞毒性化合物又は薬剤とコンジュゲート又は結合させる。本発明のこれらの態様に従って好適に使用することができる細胞毒性の化合物又は薬剤には、上述の細胞毒性因子、放射性同位体及びプロドラッグ活性化酵素が含まれるが、これらに限定されない。
本発明のその他の好ましい実施形態は、以下の図面及び本発明の説明及び特許請求の範囲を鑑みれば、当業者に明らかになるであろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
配列番号1の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号2の軽鎖可変ドメインを含む、αvβ6に特異的に結合するヒト化抗体。
(項目2)
前記重鎖可変ドメインが、配列番号1のアミノ酸残基31〜35(CDR1)、50〜65(CDR2)及び98〜109(CDR3)により規定される相補性決定領域(CDR)を含む、項目1に記載のヒト化抗体。
(項目3)
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号2のアミノ酸残基24〜35(CDR1)、51〜57(CDR2)及び90〜98(CDR3)により規定される相補性決定領域(CDR)を含む、項目1に記載のヒト化抗体。
(項目4)
前記重鎖可変ドメインが、配列番号1のアミノ酸残基1〜30(FR1)、36〜49(FR2)、66〜97(FR3)及び110〜120(FR4)により規定されるフレームワーク領域(FR)を含む、項目1に記載のヒト化抗体。
(項目5)
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号2のアミノ酸残基1〜23(FR1)、36〜50(FR2)、58〜89(FR3)及び99〜108(FR4)により規定されるフレームワーク領域(FR)を含む、項目1に記載のヒト化抗体。
(項目6)
前記抗体が、前記CDR1配列、CDR2配列、CDR3配列又はフレームワーク配列の重鎖又は軽鎖可変ドメインに少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、項目1〜5の何れか1項に記載のヒト化抗体。
(項目7)
前記抗体が、前記重鎖可変ドメインに、配列番号1のQ3M及びN74Sからなるアミノ酸置換のうちの少なくとも1つを含む、項目6に記載のヒト化抗体。
(項目8)
前記抗体が、前記重鎖可変ドメイン(HV1)に、配列番号1のQ3M及びN74Sからなるアミノ酸置換を含む、項目7に記載のヒト化抗体。
(項目9)
前記抗体が、前記重鎖可変ドメイン(HV2)に、配列番号1のN74Sからなるアミノ酸置換を含む、項目7に記載のヒト化抗体。
(項目10)
前記抗体が、前記重鎖可変ドメイン(HV3)に配列番号1の配列を含む、項目7に記載のヒト化抗体。
(項目11)
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメインに、配列番号2のE1Q、L47W、I58V、A60V及びY87Fからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、項目6に記載のヒト化抗体。
(項目12)
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン(LV1)に、配列番号2のL47W、I58V、A60V及びY87Fからなるアミノ酸置換を含む、項目11に記載のヒト化抗体。
(項目13)
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン(LV2)に、配列番号2のL47W及びI58Vからなるにアミノ酸置換を含む、項目11に記載のヒト化抗体。
(項目14)
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン(LV3)に、配列番号2のL47Wからなるアミノ酸置換を含む、項目11に記載のヒト化抗体。
(項目15)
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン(LV4)に、配列番号2のE1Q及びL47Wからなるアミノ酸置換を含む、項目11に記載のヒト化抗体。
(項目16)
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン(LV5)に、配列番号2の配列を含む、項目11に記載のヒト化抗体。
(項目17)
配列番号1の重鎖可変ドメイン配列(HV3)及び配列番号2の軽鎖可変ドメイン(LV5)を含む、αvβ6に特異的に結合するヒト化抗体。
(項目18)
記相性決定領域(CDR)がマウス3G9抗体に由来する、項目1又は17に記載のヒト化抗体。
(項目19)
前記抗体がαvβ6への結合においてマウス3G9抗体と競合することができる、項目1に記載のヒト化抗体。
(項目20)
前記抗体が該抗体をコードする核酸を含む組換えベクターにより生成される、項目1又は17に記載のヒト化抗体。
(項目21)
前記組換えベクターがpKJS195、pKJS189及びpKJS196からなる群より選択されるプラスミドである、項目20に記載のヒト化抗体。
(項目22)
前記プラスミドpKJS195が配列番号5を含む、項目21に記載のヒト化抗体。
(項目23)
前記プラスミドpKJS189が配列番号6を含む、項目21に記載のヒト化抗体。
(項目24)
前記プラスミドpKJS196が配列番号7を含む、項目21に記載のヒト化抗体。
(項目25)
項目1及び17に記載の抗体の何れか1つにより認識されるエピトープに対する特異性を有するヒト化抗体。
(項目26)
αvβ6を特異的に結合するヒト化抗体であって、
(a)マウス3G9抗体由来の3つの軽鎖相補性決定領域(CDR)及びヒト免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖可変領域フレームワーク(FR)配列を含む、ヒト化軽鎖;ならびに
(b)マウス3G9抗体由来の3つの重鎖相補性決定領域(CDR)及びヒト免疫グロブリン重鎖由来の重鎖可変領域フレームワーク(FR)配列を含む、ヒト化重鎖
を含む、ヒト化抗体。
(項目27)
配列番号1〜5の何れか1つのコード配列を含む、単離された核酸分子
(項目28)
配列番号1〜5の何れか1つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
(項目29)
項目27に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
(項目30)
ヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする融合遺伝子を更に含み、該遺伝子が、αvβ6に対する結合特異性を有する非ヒト抗体の軽鎖に由来するCDR及びヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、項目29に記載の組換えベクター。
(項目31)
前記非ヒト抗体がマウス3G9抗体である、項目30に記載の組換えベクター。
(項目32)
前記ベクターがプラスミドpKJS195である、項目30に記載の組換えベクター。
(項目33)
ヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする融合遺伝子を更に含み、該遺伝子が、αvβ6に対する結合特異性を有する非ヒト抗体の重鎖に由来するCDR及びヒト起源の重鎖に由来するフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、項目29に記載の組換えベクター。
(項目34)
前記非ヒト抗体がマウス3G9抗体である、項目33に記載の組換えベクター。
(項目35)
前記ベクターがプラスミドpKJS189である、項目33に記載の組換えベクター。
(項目36)
前記ベクターがプラスミドpKJS196である、項目33に記載の組換えベクター。
(項目37)
項目29〜36の何れか1項に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
(項目38)
哺乳動物においてαvβ6により媒介される疾患を予防又は処置するための組成物であって、項目1、17及び26の何れか1項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
(項目39)
前記抗体が細胞毒性因子にコンジュゲートされる、項目38に記載の組成物。
(項目40)
ヒト化抗体を調製する方法であって、ヒト化抗体の発現に適切な条件下で項目37に記載の宿主細胞を培養する工程を含み、ヒト化抗体鎖が発現され、ヒト化抗体が生成される、方法。
(項目41)
前記ヒト化抗体を単離する工程を更に含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記宿主細胞がCHO細胞である、項目40に記載の方法。
(項目43)
αvβ6により媒介される疾患を有する、又は有する危険性がある被験体を処置する方法であって、該被験体に項目38に記載の組成物を投与し、それによって該疾患の発症を軽減又は延期する工程を含む、方法。
(項目44)
前記被験体がヒトである、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記疾患が線維症である、項目43に記載の方法。
(項目46)
前記線維症が硬皮症、瘢痕化、肝線維症、腎線維症又は肺線維症である、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記疾患が乾癬である、項目43に記載の方法。
(項目48)
前記疾患が癌である、項目43に記載の方法。
(項目49)
前記癌が上皮癌である、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記癌が口腔癌、皮膚癌、子宮頚癌、卵巣癌、喉頭癌(pharyngealcancer)、喉頭癌
(laryngeal cancer)、食道癌、肺癌、乳癌、腎臓癌又は結腸直腸癌である、項目4
8に記載の方法。
(項目51)
前記疾患がアルポート症候群である、項目48に記載の方法。
(項目52)
αvβ6に特異的に結合するヒト化抗体であって、配列番号3の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号4の軽鎖可変ドメインを含む、ヒト化抗体。
(項目53)
前記重鎖可変ドメインが、配列番号3のアミノ酸残基31〜35(CDR1)、50〜66(CDR2)及び99〜115(CDR3)により規定される相補性決定領域(CDR)を含む、項目52に記載のヒト化抗体。
(項目54)
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号4のアミノ酸残基24〜38(CDR1)、54〜60(CDR2)及び93〜101(CDR3)により規定される相補性決定領域(CDR)を含む、項目52に記載のヒト化抗体。
(項目55)
前記重鎖可変ドメインが、配列番号3のアミノ酸残基1〜30(FR1)、36〜49(FR2)、67〜98(FR3)及び116〜126(FR4)により規定されるヒトフレームワーク領域(FR)を含む、項目52に記載のヒト化抗体。
(項目56)
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号4のアミノ酸残基1〜23(FR1)、39〜53(FR2)、61〜92(FR3)及び102〜111(FR4)により規定されるヒトフレームワーク領域(FR)を含む、項目52に記載のヒト化抗体。
(項目57)
前記抗体が、前記CDR1配列、CDR2配列、CDR3配列又はフレームワーク配列の重鎖又は軽鎖可変ドメインに少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、項目52〜56の何れか1項に記載のヒト化抗体。
(項目58)
前記抗体が、前記重鎖可変ドメインに、配列番号3のA24G、G26S、Q39L、M48I、V68A、R72V及びT74Kからなるアミノ酸置換のうちの少なくとも1つを含む、項目57に記載のヒト化抗体。
(項目59)
前記抗体が、前記重鎖可変ドメイン(HV1’)に、配列番号3のA24G、G26S、Q39L、M48I、V68A、R72V及びT74Kからなるアミノ酸置換を含む、項目58に記載のヒト化抗体。
(項目60)
前記抗体が、前記重鎖可変ドメイン(HV2’)に、配列番号3のM48I、V68A、R72V及びT74Kからなるアミノ酸置換を含む、項目58に記載のヒト化抗体。
(項目61)
前記抗体が、前記重鎖可変ドメイン(HV3’)に、配列番号3のV68A、R72V及びT74Kからなるアミノ酸置換を含む、項目58に記載のヒト化抗体。
(項目62)
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメインに、配列番号4のE1D、L46F及びY49Kからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、項目57に記載のヒト化抗体。
(項目63)
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン(LV1’)に、配列番号4のE1D、L46F及びY49Kからなるアミノ酸置換を含む、項目62に記載のヒト化抗体。
(項目64)
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン(LV2’)に、配列番号4のL46F及びY49Kからなるアミノ酸置換を含む、項目62に記載のヒト化抗体。
(項目65)
前記抗体が、前記軽鎖可変ドメイン(LV3’)に、配列番号4のY49Kからなるアミノ酸置換を含む、項目62に記載のヒト化抗体。
(項目66)
前記相補性決定領域(CDR)がマウス8G6抗体に由来する、項目52〜56の何れか1項に記載のヒト化抗体。
(項目67)
前記抗体がαvβ6への結合においてマウス8G6抗体と競合することができる、項目52〜56の何れか1項に記載のヒト化抗体。
(項目68)
配列番号3〜4の何れか1つのコード配列を含む、単離された核酸分子
(項目69)
配列番号3〜4の何れか1つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
(項目70)
項目68に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
(項目71)
ヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする融合遺伝子を更に含み、該遺伝子が、αvβ6に対する結合特異性を有する非ヒト抗体の軽鎖に由来するCDR及びヒト起源の軽鎖に由来するフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、項目70に記載の組換えベクター。
(項目72)
前記非ヒト抗体がマウス8G6抗体である、項目71に記載の組換えベクター。
(項目73)
ヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする融合遺伝子を更に含み、該遺伝子が、αvβ6に対する結合特異性を有する非ヒト抗体の重鎖に由来するCDR及びヒト起源の重鎖に由来するフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、項目70に記載の組換えベクター。
(項目74)
前記非ヒト抗体がマウス8G6抗体である、項目73に記載の組換えベクター。
(項目75)
項目70〜74の何れか1項に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
(項目76)
哺乳動物においてαvβ6により媒介される疾患を予防又は処置するための組成物であって、項目52〜56の何れか1項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
(項目77)
前記抗体が細胞毒性因子にコンジュゲートされる、項目76に記載の組成物。
(項目78)
ヒト化抗体を調製する方法であって、ヒト化抗体の発現に適切な条件下で項目75に記載の宿主細胞を培養する工程を含み、ここで、ヒト化抗体鎖が発現され、ヒト化抗体が生成される、方法。
(項目79)
前記ヒト化抗体を単離する工程を更に含む、項目78の方法。
(項目80)
前記宿主細胞がCHO細胞である、項目78に記載の方法。
(項目81)
αvβ6により媒介される疾患を有する、又は有する危険性がある被験体を処置する方法であって、該被験体に項目76に記載の組成物を投与し、それによって、該疾患の発症を軽減又は延期する工程を含む、方法。
(項目82)
前記被験体がヒトである、項目81に記載の方法。
(項目83)
前記疾患が線維症である、項目81に記載の方法。
(項目84)
前記疾患が癌である、項目81に記載の方法。
(項目85)
前記疾患がアルポート症候群である、項目81に記載の方法。
(項目86)
プラスミドpKJS189(配列番号6)を含む組換えベクターにより生成される重鎖可変ドメイン3型(HV3)及びプラスミドpKJS195(配列番号5)を含む組換えベクターにより生成される軽鎖可変ドメイン5型(HV5)を含む、ヒト化抗体。
(項目87)
プラスミドpKJS196(配列番号7)を含む組換えベクターにより生成されるアグリコシル重鎖可変ドメイン3型(a−HV3)及びプラスミドpKJS195(配列番号5)を含む組換えベクターにより生成される軽鎖可変ドメイン5型(HV5)を含む、ヒト化抗体。
(項目88)
患者における原発腫瘍の二次的な位置への転移を低減又は予防する方法であって、該原発腫瘍内の1つ以上の細胞上のインテグリンαvβ6の1つ以上のサブユニットに結合する1つ以上のリガンドの治療有効量を該患者に投与する工程を含み、該リガンドの該インテグリンへの結合が、該腫瘍細胞の死滅、化学的感受性又は浸潤性の低下をもたらす、方法。
(項目89)
前記腫瘍が癌腫である、項目88に記載の方法。
(項目90)
前記癌腫が腺癌である、項目89に記載の方法。
(項目91)
前記癌腫が、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫からなる群より選択される、項目89に記載の方法。
(項目92)
前記癌腫が乳癌腫である、項目89に記載の方法。
(項目93)
前記乳癌腫が上皮内乳癌腫(in situ breast carcinoma)である、項目92に記載の方法。
(項目94)
前記上皮内乳癌腫が、上皮内腺管癌(DCIS)及び上皮内小葉癌(LCIS)からなる群より選択される、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記癌腫が子宮内膜癌腫である、項目89に記載の方法。
(項目96)
前記癌腫が膵臓癌腫である、項目89に記載の方法。
(項目97)
前記癌腫が結腸直腸癌腫である、項目89に記載の方法。
(項目98)
前記癌腫が子宮頚癌腫である、項目89に記載の方法。
(項目99)
前記癌腫が肺癌腫である、項目89に記載の方法。
(項目100)
αvβ6インテグリンに結合する前記リガンドが、抗体又はそのαvβ6エピトープ結合フラグメントである、項目88に記載の方法。
(項目101)
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目100に記載の方法。
(項目102)
前記モノクローナル抗体が、キメラ、霊長類化又はヒト化モノクローナル抗体である、項目101に記載の方法。
(項目103)
前記モノクローナル抗体が、2A1、2E5、1A8、2B10、2B1、1G10、7G5、1C5、8G6、3G9、10D5及びCSβ6からなる群より選択される、項目101に記載の方法。
(項目104)
前記モノクローナル抗体が3G9である、項目101に記載の方法。
(項目105)
前記モノクローナル抗体が8G6である、項目101に記載の方法。
(項目106)
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、項目101に記載の方法。
(項目107)
前記ヒト化モノクローナル抗体がhu3G9(BG00011)である、項目106に記載の方法。
(項目108)
前記ヒト化モノクローナル抗体がhu8G6である、項目106に記載の方法。
(項目109)
前記リガンドが少なくとも1つの細胞毒性化合物にコンジュゲートされる、項目88に記載の方法。
(項目110)
前記リガンドが、少なくとも1つの細胞毒性化合物の前記患者への投与と組み合わせて該患者に投与される、項目88に記載の方法。
(項目111)
前記細胞毒性化合物が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、メルファラン、ドキソルビシン、メトトレキセート、5−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、トリコテネ、CC1065、ジフテリアA鎖、緑膿菌外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α−サルシン、Aleuritesfordiiタンパク質、ジアンシンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質、モモルジカ・チャランティア阻害物質、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、リボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼからなる群より選択される、項目109又は110に記載の方法。
(項目112)
前記細胞毒性化合物が、放射性同位体及びプロドラッグ活性化酵素からなる群より選択される、項目109又は項目110に記載の方法。
(項目113)
前記放射性同位体が、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、並びにLuの放射性同位体からなる群より選択される、項目112に記載の方法。
(項目114)
前記プロドラッグ活性化酵素が、アルカリホスファターゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミナーゼ、プロテアーゼ、D−アラニルカルボキシペプチダーゼ、炭水化物開裂酵素、P−ラクタマーゼ及びペニシリンアミダーゼからなる群より選択される、項目112に記載の方法。
(項目115)
前記リガンドが、該リガンド及び1つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物の形態で前記患者に投与される、項目88に記載の方法。
(項目116)
前記リガンド又は組成物が、経口投与、非経口投与、頭蓋内投与、肺内投与及び鼻内投与からなる群より選択される経路を介して前記患者に投与される、項目88又は項目115に記載の方法。
(項目117)
前記リガンド又は組成物が、筋肉内投与静脈内投与、動脈内投与及び皮下投与からなる群より選択される非経腸経路を介して前記患者に投与される、項目116に記載の方法。
(項目118)
前記非経腸経路が、注射を介して前記患者に前記リガンド又は組成物を投与することを含む、項目117に記載の方法。
(項目119)
浸潤性癌腫に進行する可能性がより高い癌腫を診断する方法であって、
(a)腫瘍又はその一部分を含む癌性上皮組織試料、及び非癌性上皮組織試料を患者から得る工程;
(b)インテグリンαvβ6の1つ以上のサブユニットに結合する1つ以上のリガンドと該組織試料とを接触させる工程;及び、
(c)該組織試料におけるインテグリンαvβ6の発現レベルを測定する工程
を含み、
該非癌性組織試料におけるインテグリンαvβ6の発現レベルに比べて該癌性組織試料におけるインテグリンαvβ6の発現レベルが増大していることが、浸潤性癌腫に進行する可能性がより高い癌腫が該患者に存在することを示す、方法。
(項目120)
前記腫瘍が癌腫である、項目119に記載の方法。
(項目121)
前記癌腫が腺癌である、項目120に記載の方法。
(項目122)
前記癌腫が、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫からなる群より選択される、項目120に記載の方法。
(項目123)
前記癌腫が乳癌腫である、項目122に記載の方法。
(項目124)
前記乳癌腫が上皮内乳癌腫である、項目123に記載の方法。
(項目125)
前記上皮内乳癌腫が、上皮内腺管癌(DCIS)及び上皮内小葉癌(LCIS)からなる群より選択される、項目124に記載の方法。
(項目126)
前記癌腫が子宮内膜癌腫である、項目124に記載の方法。
(項目127)
前記癌腫が膵臓癌腫である、項目120に記載の方法。
(項目128)
前記癌腫が結腸直腸癌腫である、項目120に記載の方法。
(項目129)
前記癌腫が子宮頚癌腫である、項目120に記載の方法。
(項目130)
前記癌腫が肺癌腫である、項目120に記載の方法。
(項目131)
αvβ6インテグリンに結合する前記リガンドが、抗体又はそのαvβ6エピトープ結合フラグメントである、項目119に記載の方法。
(項目132)
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目131に記載の方法。
(項目133)
前記モノクローナル抗体が、キメラ、霊長類化又はヒト化モノクローナル抗体である、項目132に記載の方法。
(項目134)
前記モノクローナル抗体が、2A1、2E5、1A8、2B10、2B1、1G10、7G5、1C5、8G6、3G9、10D5及びCSβ6からなる群より選択される、項目132に記載の方法。
(項目135)
前記モノクローナル抗体が3G9である、項目132に記載の方法。
(項目136)
前記モノクローナル抗体が8G6である、項目132に記載の方法。
(項目137)
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、項目132に記載の方法。
(項目138)
前記ヒト化モノクローナル抗体がhu3G9(BG00011)である、項目137に記載の方法。
(項目139)
前記ヒト化モノクローナル抗体がhu8G6である、項目137に記載の方法。
(項目140)
前記リガンドが少なくとも1つの検出可能な標識にコンジュゲートされる、項目119に記載の方法。
(項目141)
前記検出可能な標識が、発色原標識、酵素標識、放射性同位体標識、非放射性同位体標識、蛍光標識、毒性標識、化学発光標識、X線撮影用標識、スピンラベル及び核磁気共鳴造影剤標識からなる群より選択される、項目140に記載の方法。
(項目142)
前記発色原標識が、ジアミノベンジジン及び4−ヒドロキシアゾベンゼン−2−カルボン酸からなる群より選択される、項目141に記載の方法。
(項目143)
前記酵素標識が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ−5−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼからなる群より選択される、項目141に記載の方法。
(項目144)
前記放射性同位体標識が、3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc及び109Pdからなる群より選択される、項目141に記載の方法。
(項目145)
前記非放射性同位体標識が、157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、56Fe、99mTc及び112Inからなる群より選択される、項目141に記載の方法。
(項目146)
前記蛍光標識が、152Eu標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識、o−フタルデヒド標識及びフルオレサミン標識からなる群より選択される、項目141に記載の方法。
(項目147)
前記毒性標識が、ジフテリア毒素標識、リシン標識及びコレラ毒素標識からなる群より選択される、項目141に記載の方法。
(項目148)
前記化学発光標識が、ルミノール標識、イソルミノール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識及びエクオリン標識からなる群より選択される、項目141に記載の方法。
(項目149)
前記X線撮影用標識がバリウム又はセシウムである、項目141に記載の方法。
(項目150)
前記スピンラベルが重水素である、項目141に記載の方法。
(項目151)
前記核磁気共鳴造影剤標識が、Gd、Mn及び鉄からなる群より選択される、項目141に記載の方法。
(項目152)
患者におけるαvβ6陽性転移腫瘍細胞を排除する方法であって、1つ以上のαvβ6陽性転移腫瘍細胞上のインテグリンαvβ6の1つ以上のサブユニットに結合する1つ以上のリガンドの治療有効量を該患者に投与する工程を含み、該リガンドの該インテグリンへの結合が、該転移腫瘍細胞の死滅、化学的感作又は浸潤性の低下をもたらす、方法。
(項目153)
前記腫瘍細胞が転移癌腫に由来する、項目152に記載の方法。
(項目154)
前記癌腫が腺癌である、項目153に記載の方法。
(項目155)
前記癌腫が、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫からなる群より選択される、項目153に記載の方法。
(項目156)
前記癌腫が乳癌腫である、項目153に記載の方法。
(項目157)
前記乳癌腫が上皮内乳癌腫である、項目156に記載の方法。
(項目158)
前記上皮内乳癌腫が、上皮内腺管癌(DCIS)及び上皮内小葉癌(LCIS)からなる群より選択される、項目157に記載の方法。
(項目159)
前記癌腫が子宮内膜癌腫である、項目153に記載の方法。
(項目160)
前記癌腫が膵臓癌腫である、項目153に記載の方法。
(項目161)
前記癌腫が結腸直腸癌腫である、項目153に記載の方法。
(項目162)
前記癌腫が子宮頚癌腫である、項目153に記載の方法。
(項目163)
前記癌腫が肺癌腫である、項目153に記載の方法。
(項目164)
αvβ6インテグリンに結合する前記リガンドが、抗体又はそのαvβ6エピトープ結合フラグメントである、項目152に記載の方法。
(項目165)
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目164に記載の方法。
(項目166)
前記モノクローナル抗体が、キメラ、霊長類化又はヒト化モノクローナル抗体である、項目165に記載の方法。
(項目167)
前記モノクローナル抗体が、2A1、2E5、1A8、2B10、2B1、1G10、7G5、1C5、8G6、3G9、10D5及びCSβ6からなる群より選択される、項目165に記載の方法。
(項目168)
前記モノクローナル抗体が3G9である、項目165に記載の方法。
(項目169)
前記モノクローナル抗体が8G6である、項目165に記載の方法。
(項目170)
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、項目165に記載の方法。
(項目171)
前記ヒト化モノクローナル抗体がhu3G9(BG00011)である、項目170に記載の方法。
(項目172)
前記ヒト化モノクローナル抗体がhu8G6である、項目170に記載の方法。
(項目173)
前記リガンドが少なくとも1つの細胞毒性化合物にコンジュゲートされる、項目152に記載の方法。
(項目174)
前記リガンドが、少なくとも1つの細胞毒性化合物の前記患者への投与と組み合わせて該患者に投与される、項目152に記載の方法。
(項目175)
前記細胞毒性化合物が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、メルファラン、ドキソルビシン、メトトレキセート、5−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、トリコテネ、CC1065、ジフテリアA鎖、緑膿菌外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α−サルシン、Aleuritesfordiiタンパク質、ジアンシンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質、モモルジカ・チャランティア阻害物質、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、リボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼからなる群より選択される、項目173又は項目174に記載の方法。
(項目176)
前記細胞毒性化合物が、放射性同位体及びプロドラッグ活性化酵素からなる群より選択される、項目173又は項目174に記載の方法。
(項目177)
前記放射性同位体が、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、並びにLuの放射性同位体からなる群より選択される、項目176に記載の方法。
(項目178)
前記プロドラッグ活性化酵素が、アルカリホスファターゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミナーゼ、プロテアーゼ、D−アラニルカルボキシペプチダーゼ、炭水化物開裂酵素、P−ラクタマーゼ及びペニシリンアミダーゼからなる群より選択される、項目176に記載の方法。
(項目179)
前記リガンドが、該リガンド及び1つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物の形態で前記患者に投与される、項目152に記載の方法。
(項目180)
前記リガンド又は組成物が、経口投与、非経口投与、頭蓋内投与、肺内投与及び鼻内投与からなる群より選択される経路を介して前記患者に投与される、項目152又は項目179に記載の方法。
(項目181)
前記リガンド又は組成物が、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与及び皮下投与からなる群より選択される非経腸経路を介して前記患者に投与される、項目180に記載の方法。
(項目182)
前記非経腸経路が、注射を介して前記患者に前記リガンド又は組成物を投与することを含む、項目181に記載の方法。
(項目183)
患者の組織又は臓器から腫瘍を外科的に摘出した後に該患者から残存するαvβ6陽性腫瘍細胞を排除する方法であって、該組織又は臓器に残存する1つ以上の腫瘍細胞上のインテグリンαvβ6の1つ以上のサブユニットに結合する1つ以上のリガンドの治療有効量を該患者に投与する工程を含み、該リガンドの該インテグリンへの結合が、該腫瘍細胞の死滅、化学的感受性又は浸潤性の低下をもたらす、方法。
(項目184)
前記腫瘍細胞が転移癌腫に由来する、項目183に記載の方法。
(項目185)
前記癌腫が腺癌である、項目184に記載の方法。
(項目186)
前記癌腫が、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫からなる群より選択される、項目184に記載の方法。
(項目187)
前記癌腫が乳癌腫である、項目184に記載の方法。
(項目188)
前記乳癌腫が上皮内乳癌腫である、項目187に記載の方法。
(項目189)
前記上皮内乳癌腫が、上皮内腺管癌(DCIS)及び上皮内小葉癌(LCIS)からなる群より選択される、項目188に記載の方法。
(項目190)
前記癌腫が子宮内膜癌腫である、項目184に記載の方法。
(項目191)
前記癌腫が膵臓癌腫である、項目184に記載の方法。
(項目192)
前記癌腫が結腸直腸癌腫である、項目184に記載の方法。
(項目193)
前記癌腫が子宮頚癌腫である、項目184に記載の方法。
(項目194)
前記癌腫が肺癌腫である、項目184に記載の方法。
(項目195)
αvβ6インテグリンに結合する前記リガンドが、抗体又はそのαvβ6エピトープ結合フラグメントである、項目183に記載の方法。
(項目196)
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目195に記載の方法。
(項目197)
前記モノクローナル抗体が、キメラ、霊長類化又はヒト化モノクローナル抗体である、項目196に記載の方法。
(項目198)
前記モノクローナル抗体が、2A1、2E5、1A8、2B10、2B1、1G10、7G5、1C5、8G6、3G9、10D5及びCSβ6からなる群より選択される、項目196に記載の方法。
(項目199)
前記モノクローナル抗体が3G9である、項目196に記載の方法。
(項目200)
前記モノクローナル抗体が8G6である、項目196に記載の方法。
(項目201)
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、項目196に記載の方法。
(項目202)
前記ヒト化モノクローナル抗体がhu3G9(BG00011)である、項目201に記載の方法。
(項目203)
前記ヒト化モノクローナル抗体がhu8G6である、項目201に記載の方法。
(項目204)
前記リガンドが少なくとも1つの細胞毒性化合物にコンジュゲートされる、項目183に記載の方法。
(項目205)
前記リガンドが、少なくとも1つの細胞毒性化合物の前記患者への投与と組み合わせて該患者に投与される、項目183に記載の方法。
(項目206)
前記細胞毒性化合物が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、メルファラン、ドキソルビシン、メトトレキセート、5−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、トリコテネ、CC1065、ジフテリアA鎖、緑膿菌外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α−サルシン、Aleuritesfordiiタンパク質、ジアンシンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質、モモルジカ・チャランティア阻害物質、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、リボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼからなる群より選択される、項目204又は205に記載の方法。
(項目207)
前記細胞毒性化合物が、放射性同位体及びプロドラッグ活性化酵素からなる群より選択される、項目204又は項目205に記載の方法。
(項目208)
前記放射性同位体が、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、並びにLuの放射性同位体からなる群より選択される、項目207に記載の方法。
(項目209)
前記プロドラッグ活性化酵素が、アルカリホスファターゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミナーゼ、プロテアーゼ、D−アラニルカルボキシペプチダーゼ、炭水化物開裂酵素、P−ラクタマーゼ及びペニシリンアミダーゼからなる群より選択される、項目207に記載の方法。
(項目210)
前記リガンドが、該リガンド及び1つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物の形態で前記患者に投与される、項目183に記載の方法。
(項目211)
前記リガンド又は組成物が、経口投与、非経口投与、頭蓋内投与、肺内投与及び鼻内投与からなる群より選択される経路を介して前記患者に投与される、項目183又は項目210に記載の方法。
(項目212)
前記リガンド又は組成物が、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与及び皮下投与からなる群より選択される非経腸経路を介して前記患者に投与される、項目211に記載の方法。
(項目213)
前記非経腸経路が、注射を介して前記患者に前記リガンド又は組成物を投与することを含む、項目212に記載の方法。
(項目214)
患者における原発性の前転移性又は前浸潤性腫瘍の転移性又は浸潤性腫瘍への進行を低減又は予防する方法であって、該前転移性又は前浸潤性腫瘍内の1つ以上の細胞上のインテグリンαvβ6の1つ以上のサブユニットに結合する1つ以上のリガンドの治療有効量を該患者に投与する工程を含み、該リガンドの該インテグリンへの結合が、該患者における該原発腫瘍を囲む組織領域への該前転移性又は前浸潤性癌細胞の浸潤の低減又は予防をもたらす、方法。
(項目215)
前記前転移性又は前浸潤性腫瘍が癌腫である、項目214に記載の方法。
(項目216)
前記癌腫が腺癌である、項目215に記載の方法。
(項目217)
前記癌腫が、乳癌腫、子宮内膜癌腫、膵臓癌腫、結腸直腸癌腫、肺癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌腫、前立腺癌腫、肝臓癌腫、食道癌腫、頭頚部癌腫、胃癌腫及び脾臓癌腫からなる群より選択される、項目215に記載の方法。
(項目218)
前記癌腫が乳癌腫である、項目215に記載の方法。
(項目219)
前記乳癌腫が上皮内乳癌腫である、項目218に記載の方法。
(項目220)
前記上皮内乳癌腫が、上皮内腺管癌(DCIS)及び上皮内小葉癌(LCIS)からなる群より選択される、項目219に記載の方法。
(項目221)
前記癌腫が子宮内膜癌腫である、項目215に記載の方法。
(項目222)
前記癌腫が膵臓癌腫である、項目215に記載の方法。
(項目223)
前記癌腫が結腸直腸癌腫である、項目215に記載の方法。
(項目224)
前記癌腫が子宮頚癌腫である、項目215に記載の方法。
(項目225)
前記癌腫が肺癌腫である、項目215に記載の方法。
(項目226)
αvβ6インテグリンに結合する前記リガンドが、抗体又はそのαvβ6エピトープ結合フラグメントである、項目214に記載の方法。
(項目227)
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目226に記載の方法。
(項目228)
前記モノクローナル抗体が、キメラ、霊長類化又はヒト化モノクローナル抗体である、項目227に記載の方法。
(項目229)
前記モノクローナル抗体が、2A1、2E5、1A8、2B10、2B1、1G10、7G5、1C5、8G6、3G9、10D5及びCSβ6からなる群より選択される、項目227に記載の方法。
(項目230)
前記モノクローナル抗体が3G9である、項目227に記載の方法。
(項目231)
前記モノクローナル抗体が8G6である、項目227に記載の方法。
(項目232)
前記モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である、項目227に記載の方法。
(項目233)
前記ヒト化モノクローナル抗体がhu3G9(BG00011)である、項目232に記載の方法。
(項目234)
前記ヒト化モノクローナル抗体がhu8G6である、項目232に記載の方法。
(項目235)
前記リガンドが少なくとも1つの細胞毒性化合物にコンジュゲートされる、項目214に記載の方法。
(項目236)
前記リガンドが、少なくとも1つの細胞毒性化合物の前記患者への投与と組み合わせて該患者に投与される、項目214に記載の方法。
(項目237)
前記細胞毒性化合物が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、メルファラン、ドキソルビシン、メトトレキセート、5−フルオロウラシル、エトポシド、メクロレタミン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、トリコテネ、CC1065、ジフテリアA鎖、緑膿菌外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α−サルシン、Aleuritesfordiiタンパク質、ジアンシンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質、モモルジカ・チャランティア阻害物質、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、リボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼからなる群より選択される、項目235又は236に記載の方法。
(項目238)
前記細胞毒性化合物が、放射性同位体及びプロドラッグ活性化酵素からなる群より選択される、項目235又は項目236に記載の方法。
(項目239)
前記放射性同位体が、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、並びにLuの放射性同位体からなる群より選択される、項目238に記載の方法。
(項目240)
前記プロドラッグ活性化酵素が、アルカリホスファターゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミナーゼ、プロテアーゼ、D−アラニルカルボキシペプチダーゼ、炭水化物開裂酵素、P−ラクタマーゼ及びペニシリンアミダーゼからなる群より選択される、項目238に記載の方法。
(項目241)
前記リガンドが、該リガンド及び1つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物の形態で前記患者に投与される、項目214に記載の方法。
(項目242)
前記リガンド又は組成物が、経口投与、非経口投与、頭蓋内投与、肺内投与及び鼻内投与からなる群より選択される経路を介して前記患者に投与される、項目214又は項目241に記載の方法。
(項目243)
前記リガンド又は組成物が、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与及び皮下投与からなる群より選択される非経腸経路を介して前記患者に投与される、項目242に記載の方法。
(項目244)
前記非経腸経路が、注射を介して前記患者に前記リガンド又は組成物を投与することを含む、項目243に記載の方法。

図面の簡単な説明

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図1は、αvβ6に対する精製されたキメラ化された3G9変異型の結合ELISA試験である。可溶性αvβ6でコーティングしたプレートをマウス3G9抗体に由来する精製ハイブリドーマ(m3G9)、精製されたキメラ3G9抗体(ch3G9)又は軽鎖の第1CDR中のN−連結グリコシル化部位内にNからSへの置換を含有する精製キメラ3G9抗体(ch3G9S)の何れかと共に培養した。洗浄緩衝液洗浄した後、プレートをパーオキシドコンジュゲート抗マウスIgG(ハイブリドーマ誘導物質に対して)又は抗ヒトIgG(キメラ抗体に対して)と共に培養し、その後洗浄緩衝液で洗浄した。プレートをTMB溶液で発色させ、反応を硫酸で停止させ、プレートリーダーを使用してA450で試験した。キメラ3G9抗体の2形態の間には検出可能な有意差はなかった。
図2は、Easy Titer Assay(Pierce)を使用したトランスフェクトされた293E細胞由来の3G9ヒト化変異型の発現を示す結果である。一過性にトランスフェクトした293E細胞由来の上澄みを、Easy Titer法により製造元プロトコル(Pierce)に従って抗体力価について試験した。ヒト化3G9抗体の種々の変異型の発現を分析した。軽鎖型1を含有する3G9の変異型は発現が乏しいのに対し、軽鎖型2を含有する変異型はより高いレベルで発現されている。高度なヒト化ほど発現が高くなる傾向がある。
図3は、フローサイトメトリー試験により測定したαvβ6インテグリン発現SW480細胞へのhu−3G9抗体変異型のFACS分析の結果を示す。SW480細胞をトリプシン処理により回収し、洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁した。次に2x105細胞を指定したトランスフェクション体上澄みを含有するFACS緩衝液中1時間上で培養し、その力価をEasy Titer法により製造元のプロトコル(Pierce)に従って測定した。インキュベーションの後、細胞をFACS緩衝液で洗浄し、フィコエリスリンコンジュゲート抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch)を含有するFACS緩衝液中に再懸濁し、30分間氷上で培養した。次に細胞を洗浄し、FACS緩衝液200μL中に再懸濁した。標識された二次抗体の結合はフローサイトメトリーでモニタリングした。試験した全てのヒト化型は少なくともキメラ3G9と同程度にSW480細胞に結合した。軽鎖型2を含有する変異型はキメラ3G9の活性を有意に超過した。抗リンホトキシンベータ受容体抗体HuBHA10を陰性対照として使用した。
図4は、FDCP1−β6細胞へのhu−3G9抗体型2〜5の結合のFACS分析を示す。FACS分析は、SW480細胞の代わりにFDCP1−β6細胞を使用した以外、図3に記載した通り実施した。完全ヒト化変異5型(H3/L5)は、全ての他のヒト化型よりも有意に良好にFDCP1−β6に結合した。
図5は、FDCP1−β6細胞への精製したhu−3G9抗体型2〜5の結合のFACS分析を示す。FACS分析は、精製した3G9ヒト化変異型を使用しながら図4に記載した通り実施した。完全ヒト化変異5型(H3/L5)は、全ての他のヒト化型よりも有意に良好にFDCP1−β6に結合した。
図6は、αvβ6への精製hu−3G9抗体型2〜5の結合の結合ELISA試験である。結合ELISAは、図1に記載した通り実施した。ヒト化3G95型(H3/L5)は、抗体の他の誘導体よりもわずかに良好にαvβ6に結合したように観察された。
図7は、αvβ6への精製hu−3G9抗体型2〜5の結合の阻害ELISA試験である。プレートをLAP0.3μg/mL又はLAP−Fc融合タンパク質2.5μg/mLの何れかでコーティングし、一晩4℃で培養した。コーティング溶液を除去し、プレートを阻害し、洗浄し、カルシウム及びマグネシウムの存在下、図面の凡例に示す通り、ビオチニル化αvβ6及び3G9誘導体の混合物と共に培養した。プレートを再度洗浄し、エキストラジンセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(Sigma)と共に培養した。結合したタンパク質はTMB基質を使用して検出し、その後A450でプレートリーダー中で検出した。ヒト化3G95型(H3/L5)は抗体の他の誘導体よりもわずかに良好にLAPへのαvβ6の結合を阻害したように観察された。
図8は、精製hu−3G9抗体型2〜5の細胞接着試験の結果を示す。マイクロプレートを一晩4℃にて50μL/ウェルの0.5μg/mLLAPでコーティングした。次にプレートを洗浄し、阻害した。FDCP1−β6細胞(5×106細胞/mL)を培養フラスコから脱着させ、蛍光染料(Calcein−AM、Molecular Probes[米国オレゴン州ユージーン])で標識し、試験緩衝液に再懸濁した。プレートをカルシウム及びマグネシウムの存在下、上述の精製抗体及び標識FDCP1−β6細胞と共に培養した。プレートを洗浄し、プレート上に捕獲された細胞による蛍光を記録した。パーセント結合は全細胞の蛍光を結合細胞のものと比較することにより測定した。ヒト化3G95型(3H/5L)は抗体の他の誘導体よりもわずかに良好にLAPへのαvβ6発現細胞の結合を阻害したように観察された。
図9は、pKJS195のプラスミドマップ及び3G95型軽鎖配列の模式図である。このプラスミドは3G95型軽鎖(LV5)及びネオマイシン耐性遺伝子を含有する。軽鎖発現カセットはヒトCMV最初期プロモーター及び第1のイントロン(小欠失含有)並びにヒト成長ホルモンポリアデニル化配列を含有する。
図10は、pKJS189のプラスミドマップ及び3G9重鎖3型の配列の模式図である。このプラスミドは、3G9重鎖3型(HV3)及びデヒドロフォレート還元酵素(dhfr)遺伝子を含有する。重鎖発現カセットはヒトCMV最初期プロモーター及び第1のイントロン(小欠失含有)並びにヒト成長ホルモンポリアデニル化配列を含有する。dhfr発現カセットはSV40初期プロモーター及びSV40ポリアデニル化配列を含有する。
図11は、pKJS196のプラスミドマップ及びアグリコシル3G9重鎖3型の配列の模式図である。このプラスミドは、アグリコシル3G9重鎖3型(a−HV3)及びdhfr遺伝子を含有する。このコンストラクトは重鎖定常領域におけるN連結グリコシル化部位を消失させるN319Q置換以外はpKJS189と同一である。
図12は、Easy Titer試験(Pierce)を使用してCHO細胞に一過性にトランスフェクトしたhu−3G9CHO発現ベクター組立及び発現の結果を示す。Easy Titer試験は製造元のプロトコルに従って図2に記載する通り実施した。野生型(H3/L5)及びアグリコシル(a−H3/L5)ヒト化3G95型ベクターをCHO細胞に一過性にトランスフェクトし、効率的な組立及びこれらの細胞からのヒト化3G9の分泌を明らかにした。両方の形態のhu3G9抗体は等しく組み立てられ、CHO細胞内で発現された。
図13は、記載した原発腫瘍部位からリンパ節図13A〜13D)又は肺(図13E〜13F)の何れかに転移した特定のヒト癌腫におけるαvβ6発現(陰影部)のレベルを示す顕微鏡写真合成図である。
図14は、記載した原発腫瘍部位から記載した転移腫瘍部位に転移した特定のヒト癌腫におけるαvβ6発現(陰影部)のレベルを示す顕微鏡写真の合成図である。
図15は、原発子宮内膜癌の腫瘍(図15A、15C)において、及び該当リンパ節の転移(図15B、15D)において観察されたαvβ6発現(陰影部)のレベルを示す顕微鏡写真の合成図である。
図16は、ヒト乳腫瘍試料中で観察されたαvβ6発現(陰影部)のレベルを示す顕微鏡写真の合成図である。図16A:上皮内腺管癌(DCIS)を有する患者由来の原発腫瘍試料における発現。図16B:浸潤性乳房癌腫を有する患者由来の原発腫瘍試料における発現。
図17は、3人の異なる患者由来の原発及び転移の膵臓腺管腺癌腫瘍の該当試料において観察されたαvβ6発現(陰影部)のレベルを示す顕微鏡写真の合成図である。図17A〜17C:3人の異なる患者由来の原発腫瘍試料における発現。図17D〜17F:これらの同じ3患者由来の該当リンパ節転移における発現。図17G〜17H:3患者のうち2人より得られた正常膵臓組織における発現。
図18は、5人の異なる患者由来の原発及び転移の膵臓腺癌腫瘍の該当試料において観察されたαvβ6発現(陰影部)のレベルを示す顕微鏡写真の合成図である。図18A〜18E:5人の異なる患者由来の原発腫瘍試料における発現、3人は腺扁平上皮癌として特徴付けられる腫瘍を有し(図18A〜18C)、2人は低分化を特徴とする腫瘍を有する(図18D〜18E)。図18F〜18J:これらの同じ5患者由来の該当リンパ節転移における発現。図18K〜18L:5患者のうち2人より得られた正常膵臓組織における発現。
図19は、ヒト膵臓癌のBxPC−3マウス異種移植片モデルにおける腫瘍成育を抑制する抗αvβ6モノクローナル抗体(3G9)の能力を示す。図19A:ンαvβ6モノクローナル抗体(3G9)による免疫組織化学試験により染色された異種移植片腫瘍の切片の顕微鏡写真。図19B:αvβ6mAb3G9投与中のBxPC−3異種移植片腫瘍生育曲線(▲)、可溶性TGFbRII−Fc−Ig融合タンパク質(▼)、又はビヒクルPBS(■)。図19C:試験終了時(第66日)における個体別腫瘍サイズ散布図
図20は、β6を発現しているVB6細胞(β6でトランスフェクト)により、そして擬似トランスフェクト細胞による経マトリックス遊走、浸潤及びマトリックスメタロプロテイナーゼ9(MMP−9)生成に対する抗αvβ6モノクローナル抗体(3G9)及び可溶性TGF−β受容体抗体フラグメントコンジュゲート(sTGF−βRII−Fc)の作用を示す一連の棒グラフである。図20A及び20B:細胞外マトリックスを通過する細胞の遊走(図20A)又は浸潤(図20B)。“Unt”:未投与細胞;“3G9”:10μg/mL3G9抗−αvβ6モノクローナル抗体投与細胞;“sTGFbR−Fc”:10μg/mL可溶性TGF−βRII−Fcコンジュゲート投与細胞。白棒:β6インテグリン(VB6細胞)でトランスフェクト去れこれを発現している細胞;黒棒:β6インテグリンを発現していない擬似トランスフェクト細胞(Cl細胞)。図2OC:未投与(白棒)、10μg/mL3G9投与(斜線)又は10μg/mLsTGF−βRII−Fcコンジュゲート投与(黒棒)のCl又はVB6細胞によるMMP9の生成(ng/mL)。
図21は、LIM1863異種移植片モデルにおける支質内に浸潤している腫瘍細胞上のαvβ6発現(陰影部)を示す免疫組織化学的切片の顕微鏡写真である。連続切片に対する抗ヒトケラチン染色(図示なし)により、これらの細胞がヒト上皮(即ちLIM1863)腫瘍に由来することが確認された。
図22A〜22Fは、LIM1863異種移植片モデルにおける腫瘍生育及び支質浸潤に対するαvβ6mAb3G9及び組換え可溶性TGFbRII−Fc−Ig融合タンパク質の作用を示す。図22A:αvβ6mAb3G9(▲)、可溶性TGFbRII−Fc−Ig融合タンパク質(▼)又はビヒクルPBS(■)投与中のLIM1863異種移植片腫瘍成育曲線。図22B:試験終了時(第52日)における個体別腫瘍サイズの散布図。図22C:全腫瘍切片に渡るαvβ6陽性域の定量。図22D〜22F:各記載処置群から採取された腫瘍における代表的αvβ6染色を示す顕微鏡写真。
図22A〜22Fは、LIM1863異種移植片モデルにおける腫瘍生育及び支質浸潤に対するαvβ6mAb3G9及び組換え可溶性TGFbRII−Fc−Ig融合タンパク質の作用を示す。図22A:αvβ6mAb3G9(▲)、可溶性TGFbRII−Fc−Ig融合タンパク質(▼)又はビヒクルPBS(■)投与中のLIM1863異種移植片腫瘍成育曲線。図22B:試験終了時(第52日)における個体別腫瘍サイズの散布図。図22C:全腫瘍切片に渡るαvβ6陽性域の定量。図22D〜22F:各記載処置群から採取された腫瘍における代表的αvβ6染色を示す顕微鏡写真。
図22A〜22Fは、LIM1863異種移植片モデルにおける腫瘍生育及び支質浸潤に対するαvβ6mAb3G9及び組換え可溶性TGFbRII−Fc−Ig融合タンパク質の作用を示す。図22A:αvβ6mAb3G9(▲)、可溶性TGFbRII−Fc−Ig融合タンパク質(▼)又はビヒクルPBS(■)投与中のLIM1863異種移植片腫瘍成育曲線。図22B:試験終了時(第52日)における個体別腫瘍サイズの散布図。図22C:全腫瘍切片に渡るαvβ6陽性域の定量。図22D〜22F:各記載処置群から採取された腫瘍における代表的αvβ6染色を示す顕微鏡写真。
図22A〜22Fは、LIM1863異種移植片モデルにおける腫瘍生育及び支質浸潤に対するαvβ6mAb3G9及び組換え可溶性TGFbRII−Fc−Ig融合タンパク質の作用を示す。図22A:αvβ6mAb3G9(▲)、可溶性TGFbRII−Fc−Ig融合タンパク質(▼)又はビヒクルPBS(■)投与中のLIM1863異種移植片腫瘍成育曲線。図22B:試験終了時(第52日)における個体別腫瘍サイズの散布図。図22C:全腫瘍切片に渡るαvβ6陽性域の定量。図22D〜22F:各記載処置群から採取された腫瘍における代表的αvβ6染色を示す顕微鏡写真。
図22A〜22Fは、LIM1863異種移植片モデルにおける腫瘍生育及び支質浸潤に対するαvβ6mAb3G9及び組換え可溶性TGFbRII−Fc−Ig融合タンパク質の作用を示す。図22A:αvβ6mAb3G9(▲)、可溶性TGFbRII−Fc−Ig融合タンパク質(▼)又はビヒクルPBS(■)投与中のLIM1863異種移植片腫瘍成育曲線。図22B:試験終了時(第52日)における個体別腫瘍サイズの散布図。図22C:全腫瘍切片に渡るαvβ6陽性域の定量。図22D〜22F:各記載処置群から採取された腫瘍における代表的αvβ6染色を示す顕微鏡写真。
図22A〜22Fは、LIM1863異種移植片モデルにおける腫瘍生育及び支質浸潤に対するαvβ6mAb3G9及び組換え可溶性TGFbRII−Fc−Ig融合タンパク質の作用を示す。図22A:αvβ6mAb3G9(▲)、可溶性TGFbRII−Fc−Ig融合タンパク質(▼)又はビヒクルPBS(■)投与中のLIM1863異種移植片腫瘍成育曲線。図22B:試験終了時(第52日)における個体別腫瘍サイズの散布図。図22C:全腫瘍切片に渡るαvβ6陽性域の定量。図22D〜22F:各記載処置群から採取された腫瘍における代表的αvβ6染色を示す顕微鏡写真。
図23A〜23Dは、マウス3G9mAb又は対照mAbを投与した種々の細胞系統蛍光活性細胞ソーター(FACS)分析から得られたヒストグラムであり、NHPαvβ6発現細胞系統に対するm3G9の結合のレベルを示す(A、Vero;B、LLC−MK2;C、12MBr6;D、4MBr5)。
図24A〜24Bは、NHPαvβ6発現細胞系統に対するマウス3G9の結合のレベルを示す滴定曲線である(A、12MBr6;B、4MBr5)。
図25は、LAPへのNHPαvβ6発現細胞系統の接着を示す棒グラフである(A、12MBr6;B、4MBr5)。
図26A〜26Bは、LAPへのNHPαvβ6発現細胞系統の接着のm3G9による抑制を示す滴定曲線である(A、12MBr6;B、4MBr5)。
図27は、ヒト及び霊長類のαvβ6発現細胞系統による潜伏性THFβの活性化を示す棒グラフである。
図28は、SW480β6及び4MBr5細胞系統におけるm3G9によるTGFβ活性化の抑制を示す滴定曲線である。
図29は、ヒト腎疾患におけるαvβ6免疫染色を示す一連の顕微鏡写真である。(A)αvβ6mAb(赤)及び全サイトケラチンmAb(緑)で免疫染色した凍結ヒト腎切片。(B)αvβ6mAbで免疫染色したパラフィン包埋ヒト腎切片。
図30は、Col4A3+/−及びCol4A3−/−マウスのαvβ6免疫染色を示す。図30A:αvβ6mAb(赤)及び全サイトケラチンmAb(緑)で免疫染色した7週齢のCol4A3+/−マウス及びCol4A3−/−マウス由来の凍結腎切片の顕微鏡写真。図30B:αvβ6mAbで免疫染色した4〜8週齢のCol4A3+/−及びCol4A3−/−マウス由来のパラフィン包埋腎切片。図30C:4、7及び8週齢のCol4A3+/−及びCol4A3−/−マウス(n=3)由来の腎におけるαvβ6免疫染色の定量を示す棒グラフ。
図30は、Col4A3+/−及びCol4A3−/−マウス腎のαvβ6免疫染色を示す。図30A:αvβ6mAb(赤)及び全サイトケラチンmAb(緑)で免疫染色した7週齢のCol4A3+/−マウス及びCol4A3−/−マウス由来の凍結腎切片の顕微鏡写真。図30B:αvβ6mAbで免疫染色した4〜8週齢のCol4A3+/−及びCol4A3−/−マウス由来のパラフィン包埋腎切片。図30C:4、7及び8週齢のCol4A3+/−及びCol4A3−/−マウス(n=3)由来の腎におけるαvβ6免疫染色の定量を示す棒グラフ。
図30は、Col4A3+/−及びCol4A3−/−マウス腎のαvβ6免疫染色を示す。図30A:αvβ6mAb(赤)及び全サイトケラチンmAb(緑)で免疫染色した7週齢のCol4A3+/−マウス及びCol4A3−/−マウス由来の凍結腎切片の顕微鏡写真。図30B:αvβ6mAbで免疫染色した4〜8週齢のCol4A3+/−及びCol4A3−/−マウス由来のパラフィン包埋腎切片。図30C:4、7及び8週齢のCol4A3+/−及びCol4A3−/−マウス(n=3)由来の腎におけるαvβ6免疫染色の定量を示す棒グラフ。
図31は、αvβ6mAb結合の特異性を示す。図31A:NIH3T3及びNIH3T3b6細胞へのαvβ6mAb(3G9、8G6、8B6)、抗αvβ6(RMV−7)、陰性対照mAb(1E6及びMOPC21)及びアイソタイプ対照(ラットIgG1)の結合のフローサイトメトリー分析。図31B:抗αvβ6mAb(ヒト/マウスキメラ3G9)によるCol4A3−/−及びCol4A3−/−;β6−/−腎切片の免疫染色。図31C:抗αvポリクローナル抗体によるCol4A3−/−及びCol4A3−/−;β6−/−腎切片の免疫染色。
図31は、αvβ6mAb結合の特異性を示す。図31A:NIH3T3及びNIH3T3b6細胞へのαvβ6mAb(3G9、8G6、8B6)、抗αvβ6(RMV−7)、陰性対照mAb(1E6及びMOPC21)及びアイソタイプ対照(ラットIgG1)の結合のフローサイトメトリー分析。図31B:抗αvβ6mAb(ヒト/マウスキメラ3G9)によるCol4A3−/−及びCol4A3−/−;β6−/−腎切片の免疫染色。図31C:抗αvポリクローナル抗体によるCol4A3−/−及びCol4A3−/−;β6−/−腎切片の免疫染色。
図31は、αvβ6mAb結合の特異性を示す。図31A:NIH3T3及びNIH3T3b6細胞へのαvβ6mAb(3G9、8G6、8B6)、抗αvβ6(RMV−7)、陰性対照mAb(1E6及びMOPC21)及びアイソタイプ対照(ラットIgG1)の結合のフローサイトメトリー分析。図31B:抗αvβ6mAb(ヒト/マウスキメラ3G9)によるCol4A3−/−及びCol4A3−/−;β6−/−腎切片の免疫染色。図31C:抗αvポリクローナル抗体によるCol4A3−/−及びCol4A3−/−;β6−/−腎切片の免疫染色。
図32は、種々の投与によるCol4A3−/−腎のSMA免疫染色。図32A:3週齢〜8.5週齢まで投与したCol4A3−/−マウス及び未投与の齢該当Col4A3+/−マウスについて腎の免疫染色SMA(赤)及びラミニン(緑)を示す。核処置群の代表的切片の免疫染色(皮質及び髄質)を示す(群当たりn=8)。図32B及び32C:未投与のCol4A3+/−マウス及び3週齢〜7週齢まで、又は3週齢〜8.5週齢まで種々の薬剤を投与したCol4A3−/−マウスの腎におけるSMA定量。総画像サイズと相対比較した皮質(32B)及び髄質(32C)のパーセント陽性染色を示す。各処置群のN値は散布図で示す(陰性対照mAbである投与1E6に処置群を比較した場合*=p<0.01、**=p<0.05、***=p<0.001)。
図32は、種々の投与によるCol4A3−/−腎のSMA免疫染色。図32A:3週齢〜8.5週齢まで投与したCol4A3−/−マウス及び未投与の齢該当Col4A3+/−マウスについて腎の免疫染色SMA(赤)及びラミニン(緑)を示す。核処置群の代表的切片の免疫染色(皮質及び髄質)を示す(群当たりn=8)。図32B及び32C:未投与のCol4A3+/−マウス及び3週齢〜7週齢まで、又は3週齢〜8.5週齢まで種々の薬剤を投与したCol4A3−/−マウスの腎におけるSMA定量。総画像サイズと相対比較した皮質(32B)及び髄質(32C)のパーセント陽性染色を示す。各処置群のN値は散布図で示す(陰性対照mAbである投与1E6に処置群を比較した場合*=p<0.01、**=p<0.05、***=p<0.001)。
図32は、種々の投与によるCol4A3−/−腎のSMA免疫染色。図32A:3週齢〜8.5週齢まで投与したCol4A3−/−マウス及び未投与の齢該当Col4A3+/−マウスについて腎の免疫染色SMA(赤)及びラミニン(緑)を示す。核処置群の代表的切片の免疫染色(皮質及び髄質)を示す(群当たりn=8)。図32B及び32C:未投与のCol4A3+/−マウス及び3週齢〜7週齢まで、又は3週齢〜8.5週齢まで種々の薬剤を投与したCol4A3−/−マウスの腎におけるSMA定量。総画像サイズと相対比較した皮質(32B)及び髄質(32C)のパーセント陽性染色を示す。各処置群のN値は散布図で示す(陰性対照mAbである投与1E6に処置群を比較した場合*=p<0.01、**=p<0.05、***=p<0.001)。
図33A及び33Bは、コラーゲン1α1(図33A)及びコラーゲン1α2(図33B)のmRNAレベルのTaqman分析を示す散布図である。RNAは7週齢の未投与及び投与Col4A3−/−マウス及び7週齢の未投与Col4A3+/+マウスの腎から単離した。
図34は、遅延mAb投与によるSMA免疫染色Col4A3−/−腎を示す散布図の対である。未投与8.5週齢Col4A3+/−;未投与6週齢Col4A3−/−;未投与8.5週齢Col4A3−/−;及び6週齢〜8.5週齢に1E6及び3G9を投与された8.5週齢Col4A3−/−。N値は散布図で示す。*=p<0.0005、処置群を陰性対照1E6投与Col4A3−/−マウスと比較。**=p<0.02、処置群を未投与6週齢Col4A3−/−マウスと比較。
図35は、7週齢のCol4A3−/−マウスの腎における遺伝子発現及びモジュレーションパターンを示す。p<0.01における野生型(WT)及び未投与Alport(UN)群の間の2倍超の変動について選択された395GeneChipプローブセットを示す。熱マップのコラムは個々の実験群に関する相対的な遺伝子発現レベルのパターンを示す。各コラムは5匹のマウスの単一の実験群に関する395の正規化平均プローブセットシグナル強度値を示す。実験条件に全体に渡って遺伝子発現が変化することは着色棒により示される着色変動において反映される。二次元ヒエラルヒークラスタリングを実施することにより、実験群間の関係(樹状図で示す)を調べた。
図36A〜36Dは、Col4A3−/−腎における腎疾患に関連するαvβ6依存性遺伝子の機能的アノテーションを示す棒グラフである。野生型と比べてAlport腎において過剰又は過少発現される遺伝子に対応するプローブセットの一覧に対し、別個にIngenuityPathways分析(IPA)を実施した。IPAのために使用した一覧はAlportと野生型の群の間で有意(2倍超、p<0.01)な変動について当初選択されていた395のプローブセットのサブセットとした。7週齢のマウスのAlport腎における遺伝子の過剰発現(A、B)及びダウンモジュレーション(C、D)に関連する生物学的機能(A、C)及び標準的な経路(B、D)の順位付け一覧を示す。
図37A〜37Cは、Col4A3−/−腎において差次的に発現され、αvβ6mAb投与を阻害することによりモジュレートされた遺伝子のサブセット及びネットワーク分析の模式図である。図37A:プローブセット一覧のベン図。ベン図の円の面積、その和集合及び積集合は対応する一覧におけるプローブセット数に比例する。図37B、37C:αvβ6阻害mAb3G9(図37B)及び8G6(図37C)により有意(投与及びナイーブのAlport腎の間で2倍超の変動)に影響を受けたプローブセットの一覧から推論された最高得点の調節ネットワーク。ネットワークの端縁ノードとして示され、その細胞局在化に従って配置された遺伝子内の相互作用の方向を示す。
図38は、TGF−β1発現の免疫組織化学的及びTaqman分析を示す。図38A:TGF−β1発現について免疫染色された指定の薬剤を投与したCol4A3+/−及びCol4A3−/−マウス由来の腎切片。各処置群の代表切片について染色を示す。図38B:処置群におけるTGF−β1mRNAレベルのTaqman分析。
図39は、腎におけるコラーゲン発現に関するトリクローム染色を示す。10週齢のCol4A3+/+;β6+/+、Col4A3−/−;β6+/+、及びCol4A3−/−;β6−/−マウスの染色。腎の皮質(図39A)及び髄質(図39B)の領域について代表的な組織切片を示す。
図40A及び40Bは、3G9投与の用量滴定によるSMA免疫染色を示す散布図である。3〜7週齢において週3回、指定の用量のmu3G9又は10mg/kgのmu1E6(IgG対照)を投与した後の腎の糸球体(皮質)(図40A)及び間質(髄質)(図40B)の領域について、SMA免疫染色の定量的分析を示す。皮質のED50=0.4mg/kg;髄質のED50=0.3mg/kg。水平線平均値を示す。
図40A及び40Bは、3G9投与の用量滴定によるSMA免疫染色を示す散布図である。3〜7週齢において週3回、指定の用量のmu3G9又は10mg/kgのmu1E6(IgG対照)を投与した後の腎の糸球体(皮質)(図40A)及び間質(髄質)(図40B)の領域について、SMA免疫染色の定量的分析を示す。皮質のED50=0.4mg/kg;髄質のED50=0.3mg/kg。水平線は平均値を示す。
図41は、正常腎及びUUO後の腎における免疫組織学的分析のαvβ6発現を示す一連の顕微鏡写真である。図41A:正常未傷害腎;図41B:UUO後7日;図41C:UUO後10日;図41D:UUO後14日。
図42は、照射後18週においてαvβ6アップレギュレーションが起こることを示す一連の顕微鏡写真である。14Gyを照射したC57BL/6マウスを指定の時点において屠殺し、肺切片を抗β6抗体で染色した。
図43は、線維症の域においてアップレギュレートされたαvβ6発現が持続することを示す対の顕微鏡写真である。肺切片を図1と同様にβ6発現について染色した。切片は14Gy照射後24時間(左)又は27時間(右)に屠殺したマウスより得た。両方の切片とも、高レベルのαvβ6を発現している多くの上皮細胞を伴った線維性患部を示す。隣接する非線維性の上皮では、αvβ6発現は24週まで高いレベルが維持されたが、27週までには著明さが大きく低減している。
図44は、Itgb6−/−マウスが放射線誘導肺線維症から保護されていることを示す一連の顕微鏡写真である。Itgb6+/+及びItgb6−/−マウス(C57BL/6バックグラウンド)を14Gy胸部照射に曝露した。27週間後、マウスを屠殺し、左肺をMassonのトリクロームで染色した。代表的な肺を示し;全体で21/23のItgb6+/+マウスが顕著な線維症を有していたのに対し、17匹のItgb6−/−マウスの何れも線維症を有していなかった。
図45は、ヒドロキシプロリンにより測定した場合、Itgb6−/−マウスが放射線誘導線維症から保護されていることを示す棒グラフである。照射Itgb6+/+肺のコラーゲン含有量は未照射のItgb6+/+肺及び照射及び未照射のItgb6−/−肺のものより有意に高い(照射Itgb6+/+の場合はp<0.03、各群につきN=5〜6)。
図46は、αvβ6インテグリンの非存在は肺照射後の生存に影響しないことを示す折れ線グラフである。Itgb6+/+及びItgb6−/−マウスの群に14Gyを照射した。2群に関する生存曲線に有意差はなかった(WT=Itgb6+/+、KO=Itgb6−/−)。
図47は、照射後26週において屠殺した3G9、可溶性TGFβR又は対照AbをIP投与されたマウスにおける肺線維症測定を示す散布図である。肺線維症は1mg/kg/週の3G9を投与されたマウスにおいて予防されている。各点は個々のマウスを示し、棒は平均を示す。0.3mg/kg群と対照群との間には線維症に差はなかった。1mg/kg群は対照より有意に低値の線維症であった。10mg/kg及び可溶性TGFβ受容体群は低値の線維症を示したが、対照群との差は有意ではなかった。
図48は、(照射後26週において屠殺した)3G9、可溶性TGFβR又は対照AbをIP投与された全マウス(照射後20〜26週における屠殺されたマウス、瀕死状態のマウス及び死亡状態で発見されたマウス)における肺線維症測定を示す散布図である。データは図47と同様に示した。0.3mg/kg群と対照群との間には線維症に差はなかった。1mg/kg群、10mg/kg及び可溶性TGFβ受容体群は対照より有意に低値の線維症であった。
図49は、照射後26週において屠殺した3G9、可溶性TGFβR又は対照AbをIP投与されたマウスのBAL分画細胞計数を示す棒グラフである。
図50は、IP3G9抗体注射を受けた14Gy照射マウスは対照と同様の生存性を有したことを示す折れ線グラフである。複合分析として全群に対して生存分析を実施した(p=0.088、C=対照、0.3=0.3mg/kg、1=lmg/kg、SoIR=可溶性TGFβ受容体、10=10mg/kg)。
図51は、3G9(1、3、6又は10mg/kg)を毎週SC投与されたマウスにおける肺線維症測定を示す棒グラフである。全マウス(死亡/瀕死発見マウス及び屠殺マウス)、28〜32週に屠殺したマウス、及び死亡/瀕死発見マウスに関する別個の結果を示す。全抗体群と比べて対照群において有意に増大した線維症が存在する(全投薬vs対照でp<0.05)。
図52は、照射後28又は32週において屠殺した3G9又は対照AbをSC投与されたマウスのBAL分画細胞計数を示す棒グラフである。3、6及び10mg/kgの3G9投薬は好中球及びリンパ球の両方の有意に増大したパーセンテージをもたらした(全比較につきp<0.05)。
図53は、対照vs3G9投与マウスにおけるBAL細胞の出現を示す一連の顕微鏡写真である。正常肺胞マクロファージが対照のサイトスピンに観察される。1mg/kgの3G9を投与したマウスに由来するBAL細胞は対照と同様である。3mg/kgの用量において、多くの大型の泡状のマクロファージ顕在化している。(同様のマクロファージはItgb6−/−マウスにおいても観察される)。より高用量(6mg/kg及びここで示す10mg/kg)においては、増大した数の好中球(矢尻)及びリンパ球並びに一部の細胞破砕物が著明となっている。
図54は、照射後28週において屠殺したマウスコホートに関するKaplan−Meier生存曲線を示す折れ線グラフである。
図55は、照射後32週において屠殺したマウスコホートに関するKaplan−Meier生存曲線を示す折れ線グラフである。
図56は、照射後32週まで生存したマウスと比較した場合に照射後29〜32週に死亡したマウスにおいてRV/LV質量比が増大していることを示す棒グラフである。マウスの心臓ホルマリンに固定した。右心室(RV)を左心室隔壁(LV)から分離し、組織を計量した。同じ系統の7匹の未照射マウスを対照として使用した。棒は平均±SDを表す。照射マウスに関するデータは、全マウス(1E6対照抗体又は他の用量の3G9を投与)、対照抗体1E6投与マウス、及び何れかの用量の3G9を投与したマウスにつき示す。マウスの数は以下の通り、即ち:未照射マウス、N=7;1E6投与マウスm:生存N=10、死亡N=5;3G9投与マウス:生存、N=8、死亡N=9であった。RV/LV比は生存したマウスにおいては未照射対照との有意差はなかった。これとは対照的に、未照射マウスと比べて死亡マウス(全マウス及び1E6及び3G9サブセット)においてRV/LV比は有意に増大していた(P<0.02)。更に、生存したマウスの同等な群と比べて死亡マウス(全マウス及び1E6及び3G9サブセット)においてRV/LV比は有意に増大していた(P<0.0007)。
図57は、対照抗体(1E6)、左、又は抗αvβ6抗体(3G9、1mg/kg/週)、右、を投与した死亡状態発見マウス由来の肺を示す顕微鏡写真の対である。肺胞壁における赤血球非存在の末梢域が観察される。この外観灌流の消失と合致している。
図58は、ヒト肺疾患においてαvβ6発現が強力にアップレギュレートされることを示す、ヒト肺疾患におけるαvβ6の発現を示す一連の顕微鏡写真である。ヒト及びマウスの肺のパラフィン組織切片をαvβ6特異的抗体で免疫染色することにより正常(図58A)及び疾患:特発性肺線維症図58B)、広汎性間質性肺疾患図58C)及び広汎性間質性肺疾患(図58D)の肺における発現の相対的レベル可視化した。染色は表16−1(実施例16)において後述する41人の異なる患者の試料中において観察されたアップレギュレーションのレベルの代表例である。
図59は、ブレオマイシン誘導肺線維症のマウスモデルにおいてαvβ6発現が強力にアップレギュレートされることを示す、ブレオマイシン肺線維症におけるαvβ6の発現を示す一連の顕微鏡写真である。マウス肺のパラフィン組織切片をαvβ6特異的抗体で免疫染色することによりブレオマイシン滴注肺における発現の相対的レベルを可視化した。
図60は、ブレオマイシン投与SV129マウスにおける肺のヒドロキシプロリン含有量に対するmu3G9投与の作用を示す一連の棒グラフである。記載した種々の投与期間に関して示す最初の3つの実験では、各マウスに4mg/kgのmu3G9(阻害αvβ6mAb)、1E6(対照IgG1)を投与した。第4の実験では、ブレオマイシン投与後15〜60日に週当たり3回、各マウスに4mg/kgのmu3G9(阻害αvβ6mAb)、4B4(非阻害αvβ6mAb)又は8G6(第2の阻害αvβ6mAb)を投与した。エラーバー標準誤差を示す。群平均及び標準偏差は実施例16の付録Aに示す。
図61は、ブレオマイシン投与C57B16マウスにおけるコラーゲン含有量(組織形態学検査)に対するmu3G9投与の作用を示す一連の棒グラフである。マウスに週当たり3投薬のmu3G9(阻害αvβ6mAb)、8G6(第2の阻害αvβ6mAb)、8B3(非阻害αvβ6mAb)、1E6(対照IgG1mAb)又はsTGFbR(TGF−β阻害に関する可溶性TGF−β受容体陽性対照)を投与した。示した最初の3実験(図61A、61B及び61C)においては、ブレオマイシン攻撃前1日からマウスに投与し、第14日に安楽死させた。最初の2つの実験(図61A及び61B)では、各薬剤の用量は4mg/kgとし、第3の実験(図61C)では、mu3G9の用量を図示する通り変動させた。第4の実験(図61D)では、ブレオマイシン攻撃後14日からマウスに投与し、第28日に安楽死させた。組織学的切片をトリクローム染色し、画像化し、青色染色(コラーゲン含有)組織の面積をMetamorphソフトウェアを使用して全組織面積のパーセンテージとして計算した。エラーバーは標準誤差を示す。群平均及び標準偏差は実施例16の付録Bに示す。*=ANOVAによりPBS処置群と有意差有り。
図62は、コラーゲンレポーターマウスを使用したブレオマイシン肺線維症におけるmu3G9を示す棒グラフである。ブレオマイシンをコラーゲン−ルシフェラーゼレポーターマウス内に気管滴注した。マウスには、PBS、5mg/kgの可溶性TGFbRII−Ig又は0.1、0.3、1.0、3及び10mg/kgの用量のmu3G9を2週間、週一回、ブレオマイシン傷害の前日から投与した。mu3G94mg/kgを週3回投与したマウスの別の群も設けた(3x4mg/kg)。シャムマウスには気管内食塩水滴注し、PBSを投与した。肺ルシフェラーゼ含有量を第14日に測定した。エラーバーは標準誤差を示す。群平均及び標準偏差は実施例16の付録Cに示す。*=ANOVAによりPBS処置群と有意差有り。
図63は、ブレオマイシン攻撃マウスにおける主要なBAL細胞の集団に対するmu3G9の低有効性用量の作用を評価するための経時変化を示す一連の折れ線グラフである。マウスには第0日に肺内にブレオマイシンを滴注した。マウスには第−1日及び第+6日において、PBS、0.3、1.0及び3.0mg/kgのmu3G9、又は1.0mg/kgの対照IgG1(1E6)を投与した。第2、5、8及び11日にマウスを屠殺し、肺を採取し、総BAL細胞数を評価した。マクロファージ、好中球及びリンパ球の集団をサイトスピンの分画染色により分析した。群平均及び標準偏差は実施例16の付録Cに示す。
図64は、ブレオマイシン攻撃マウスにおける第5日の主要なBAL細胞の集団に対するmu3G9の高用量の作用を示す一連の棒グラフである。マウスには第0日に肺内にブレオマイシンを滴注した。マウスには第−1日、第+1日及び第+3日において、PBS、4、20及び40mg/kgのmu3G9、又は20及び40mg/kgの対照IgG1mAb(1E6)を投与した。第5日にマウスを屠殺し、肺を採取し、総BAL細胞数を評価した。マクロファージ、好中球及びリンパ球の集団をサイトスピンの分画染色により分析した。群平均及び標準偏差は実施例16の付録Dに示す。*=p<0.05ではPBS投与のブレオマイシン攻撃対照に対して有意であるが1E6IgG1mAbを投与した対照に対しては有意でない。
図65は、ハムスターにおいては多重用量のブレオマイシンモデルにおけるmu3G9の作用が欠如していることを示す。ハムスターには第0、7及び14日に肺内にブレオマイシン(BL)又は食塩水(SA)を滴注した。第0日よりハムスターにPBS、mu3G9(Ab1)又は対照IgG1(1E6)を投与した。追加の群では、第7日(Ab2)及び第14日(Ab3)にmu3G9を投与した。全抗体とも5mg/kgの用量で週当たり3回投与した。生存ハムスターは第28日に屠殺し、肺を採取し、ヒドロキシプロリン含有量(図65AA)及び脂質の過酸化図65B)について評価した。エラーバーは標準誤差を示す。多重用量ブレオマイシン試験中を通して生存したマウス(図65C)。PBS又はIgG投与対照群と比較した場合に、mu3G9投与ハムスターの生存性に有意差はなかった。群平均及び標準偏差は実施例16の付録Cに示す。
図65は、ハムスターにおいては多重用量のブレオマイシンモデルにおけるmu3G9の作用が欠如していることを示す。ハムスターには第0、7及び14日に肺内にブレオマイシン(BL)又は食塩水(SA)を滴注した。第0日よりハムスターにPBS、mu3G9(Ab1)又は対照IgG1(1E6)を投与した。追加の群では、第7日(Ab2)及び第14日(Ab3)にmu3G9を投与した。全抗体とも5mg/kgの用量で週当たり3回投与した。生存ハムスターは第28日に屠殺し、肺を採取し、ヒドロキシプロリン含有量(図65AA)及び脂質の過酸化(図65B)について評価した。エラーバーは標準誤差を示す。多重用量ブレオマイシン試験中を通して生存したマウス(図65C)。PBS又はIgG投与対照群と比較した場合に、mu3G9投与ハムスターの生存性に有意差はなかった。群平均及び標準偏差は実施例16の付録Cに示す。
図65は、ハムスターにおいては多重用量のブレオマイシンモデルにおけるmu3G9の作用が欠如していることを示す。ハムスターには第0、7及び14日に肺内にブレオマイシン(BL)又は食塩水(SA)を滴注した。第0日よりハムスターにPBS、mu3G9(Ab1)又は対照IgG1(1E6)を投与した。追加の群では、第7日(Ab2)及び第14日(Ab3)にmu3G9を投与した。全抗体とも5mg/kgの用量で週当たり3回投与した。生存ハムスターは第28日に屠殺し、肺を採取し、ヒドロキシプロリン含有量(図65AA)及び脂質の過酸化(図65B)について評価した。エラーバーは標準誤差を示す。多重用量ブレオマイシン試験中を通して生存したマウス(図65C)。PBS又はIgG投与対照群と比較した場合に、mu3G9投与ハムスターの生存性に有意差はなかった。群平均及び標準偏差は実施例16の付録Cに示す。
図66は、実験投与により有意に影響を受けるものとして発見された遺伝子に関する正規化されたシグナル強度のプロファイルを示す。マウスには5mg/kgのsTGFbRII−Ig(sR)又はPBS又は0.3〜30mg/kgの特定用量のmu3G9を第1、8、15及び22日に投与し、第29日(回復期無し)又は第78日(7週間回復期)に安楽死させた。RNAを投与マウスの肺から調製し、転写産物を分析した。
図67は、処置群における3mg/kgの3G9で上昇傾向を示す遺伝子に関する遺伝子発現のプロファイルを示す。マウスには5mg/kgのsTGFbRII−Ig(sR)又はPBS又は0.3〜30mg/kgの特定用量のmu3G9を第1、8、15及び22日に投与し、第29日(回復期無し)又は第78日(7週間回復期)に安楽死させた。RNAを投与マウスの肺から調製し、転写産物を分析した。
図68は、mu3G9により有意に影響を受ける遺伝子のIPAアノテーションを示す対の棒グラフである。
図69A及び69Bは、マウス肺におけるmu3G9により影響を受ける調節ネットワークを模式的に示すネットワークマップである。
図69A及び69Bは、マウス肺におけるmu3G9により影響を受ける調節ネットワークを模式的に示すネットワークマップである。
図70は、mu3G9投与に対するMMP−12転写産物の用量応答を示す棒グラフである。
図71は、正常及び照射マウスにおけるBAL液タンパク質レベルの一連の散布図である。
図72は、28週において、照射誘導線維症によりアップレギュレートされる、及びmu3G9投与によりダウンレギュレートされるタンパク質を示す一連の散布図である。

0059

本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと同様又は同等である如何なる方法及び物質も、本発明の実施又は試験で使用することができるが、好ましい方法及び物質を以下に説明する。以下には例示的な方法及び物質を記載するが、本明細書に記載のものと同様又は同等である方法及び材料も、本発明の実施で使用することができる。本明細書に記載する全ての刊行物及びその他の参考文献は全て、全体が参考として援用される。矛盾がある場合は、本明細書が定義を含めて優先される。物質、方法及び実施例は、単に例示するものであり、限定するものとは意図されない。本明細書全体を通して、「含む(comprise)」という用語、或いは「含む(comprises)」又は「含む(comprising)」等の変化形は、記載した整数又は整数群を包含することを意味し、その他何れかの整数又は整数群を除外することを意味しないものとして理解されるであろう。

0060

定義
「約」:何れかの数値を指す場合に本明細書で使用する場合、「約」という用語は、記載した値の±10%の値を意味する(例えば「約50℃」とは両端を含む45℃〜55℃の温度範囲を包含し;同様に「約100mM」とは両端を含む90mM〜110mMの濃度範囲を包含する)。

0061

「拮抗物質」:本明細書で使用される「拮抗物質」という用語は、細胞、組織又は生物中のαvβ6インテグリンの生物学的及び/又は生理学的作用を低減、実質的に低減又は完全に抑制する化合物、分子、部分又は複合体を指す。αvβ6に対するリガンドである場合がある拮抗物質は、種々の方法でこのような作用を発揮する場合があり、これらの方法には、細胞表面上のαvβ6への結合において他のリガンドと競合する方法;その他のリガンドに結合するインテグリンの能力を低減、実質的に低減又は抑制するようにαvβ6と相互作用する方法;その他のリガンドがもはや結合できない(又は低減又は実質的に低減した親和性及び/又は効率においてのみ結合できる)構造をインテグリンが採るように細胞表面αvβ6に結合するかその構造変化を誘導する方法;その他のリガンドの結合又はこのようなリガンドにより細胞上のαvβ6への結合時に誘導される生理学的シグナルが低減、実質的に低減又は完全に抑制されるように、細胞、組織又は生物において、生理学的変化(例えば、細胞内シグナル伝達複合体の増大;転写阻害物質の増大;細胞表面αvβ6発現の低減等)を誘導する方法;及び当業者が熟知するであろう、拮抗物質がその活性を実行するその他の機序、が含まれるが、これらに限定されない。当業者が理解する通り、拮抗物質は、それが拮抗する別のαvβ6結合部分(例えばαvβ6結合リガンド)と同様の構造を有する場合もあれば(例えば、拮抗物質は作動物質ムテイン、変異型、フラグメント又は誘導体である場合がある)、完全に無関係の構造を有する場合もある。

0062

「結合」:本明細書で使用される「結合した」という用語は、共有結合、例えば化学共役によるもの、又は非共有結合、例えばイオン性相互作用疎水性相互作用水素結合等である場合がある結合又は連結を指す。共有結合は、例えばエステルエーテルホスホエステル、チオエステルチオエーテルウレタンアミドアミンペプチドイミドヒドラゾンヒドラジド炭素硫黄結合、炭素−リン結合等であってもよい。「結合」という用語は、「共役」、「コンジュゲート」及び「連結」等のような用語よりも広義であり、これらを包含する。

0063

「コンジュゲート/コンジュゲーション」:本明細書で使用される「コンジュゲート」とは、αvβ6に結合するリガンド、例えばαvβ6結合抗体又はそれらのフラグメントへのある部分、例えば化学物質又は放射性同位体の共有結合による産物を指す。「コンジュゲーション」とは、前文において定義したコンジュゲートの形成を指す。タンパク質又はポリペプチド(抗体を含む)のような生物学的活性物質への化学物質又は放射性同位体のコンジュゲーションの技術分野における当業者により通常使用される方法は何れも、本発明で使用することができる。

0064

「疾患、障害、病態」:本明細書で使用される「疾患」又は「障害」という用語は、腫瘍、癌、アレルギー依存症自己免疫、感染、中毒又は最適な精神又は身体の機能の減損を含めたヒト又は動物の何れかの有害病態を指す。本明細書で使用される「病態」は、疾患及び障害を含むが、生理学的病態も指す。例えば生殖性は生理学的病態であるが、疾患又は障害ではない。従って、生殖性を減少させることによる妊娠の予防に好適な本発明の組成物は、病態(生殖性)の処置として記載されるが、障害又は疾患の処置とは記載されない。その他の病態については、当業者の知る通りである。

0065

「有効量」:本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の生物学的作用を実現するために必要又は十分である所定の化合物、コンジュゲート又は組成物の量を指す。本発明の方法による所定の化合物、コンジュゲート又は組成物の有効量は、この選択された結果を達成する量であると考えられ、このような量は、不必要な実験を必要とすることなく、当該技術分野で既知の及び/又は本明細書に記載の試験を使用して、当業者が日常的に決定することができる。例えば、癌の転移を処置又は予防するのに有効な量は、in
vivoにおける腫瘍細胞の基底膜又は内皮層への遊走及び浸潤を予防するのに必要な量であると考えられる。本用語は又、「十分な量」とも同義である。何れかの特定の用途に有効な量は、処置する疾患、障害又は病態、投与する特定の組成物、投与経路、被験体の体格、及び/又は疾患又は病態の重症度のような因子により異なる可能性がある。本発明の特定の化合物、コンジュゲート又は組成物の有効量は、不必要な実験を必要とすることなく、本明細書に示す指針に従って、当業者が経験的に決定することができる。

0066

「1つ」:本開示内容において「1つ」という用語を使用する場合、特に記載がない限り、「少なくとも1つ」又は「1つ以上」を意味する。即ち、「1つ」、「1つ以上」及び「少なくとも1つ」という用語は、本明細書で交換可能に使用できる。

0067

「ペプチド、ポリペプチド、タンパク質」:本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」並びに複数の「ポリペプチド」を包含することを意図しており、アミド結合ペプチド結合としても知られている)により線状に連結された単量体(アミノ酸)から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、複数のアミノ酸の何れかの鎖を指し、特定の長さの産物を指すわけではない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」又は複数のアミノ酸の鎖を指すために使用されるその他何れかの用語は、「ポリペプチド」の定義に包含され、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の何れかの代わりに、又はそれと交換可能に使用される場合がある。「ポリペプチド」という用語は又、ポリペプチドの発現後の修飾、例えば限定しないが、グリコシル化、アセチル化ホスホリル化アミド化、既知保護/阻害基による誘導体化タンパク質分解開裂、又は非天然のアミノ酸による修飾の産物を指すことも考慮する。ポリペプチドは天然の生物学的原料に由来する場合もあれば、組換え技術により生成される場合もあるが、所定の核酸配列から必ずしも翻訳されるわけではない。これは、化学合成を含めた何れかの様式で生成される場合がある。この定義によれば、本発明で使用されるポリペプチドは、約3以上、5以上、10以上、20以上、25以上、50以上、75以上、100以上、200以上、500以上、1000以上、又は2000以上のアミノ酸のサイズのものである場合がある。ポリペプチドは、所定の3次元構造を有する場合があるが、このような構造を必ずしも有するわけではない。所定の3次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれているとも呼ばれ、所定の3次元構造を有さず、むしろより多くの数の異なる構造を採用することができるポリペプチドは、折り畳まれていないと呼ばれる。本明細書で使用される糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えばセリン残基又はアスパラギン残基酸素含有又は窒素含有側鎖を介してタンパク質に連結している少なくとも1つの炭水化物部分に共役されたタンパク質を指す。本発明に従って使用される好ましいポリペプチドには、αvβ6上の1つ以上のエピトープを認識してそれに結合する抗体(特にモノクローナル抗体)を含むがこれに限定されない、リガンドであるポリペプチド、又は細胞表面上のαvβ6インテグリンに結合するポリペプチドが含まれる。

0068

「単離された」ポリペプチド又はそのフラグメント、変異型又は誘導体とは、その天然の存在域周囲にはないポリペプチドを考慮する。精製の特定のレベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、そのネイティブ又は天然の環境から取り出してもよい。組換えより生成されるポリペプチド及び宿主細胞に発現されるタンパク質は、何れかの好適な技法により分離、分画又は部分的又は実質的に精製されている天然又は組換えポリペプチドと同様に、本発明において単離されたと考えられる。

0069

同様に本発明のポリペプチドとして含まれるものには、上述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類縁体又は変異型及び何れかのこれらの組み合わせがある。「フラグメント」、「変異型」、「誘導体」及び「類縁体」という用語には、抗αvβ6抗体又は抗体ポリペプチドを指す場合、対応する天然抗体又はポリペプチドの抗原結合特性の少なくともある程度を保持する何れかのポリペプチド、即ち、αvβ6インテグリンの1つ以上のエピトープに結合する能力を保持するポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチドのフラグメントには、本明細書で別途考察する特定の抗体フラグメントに加えて、タンパク質分解フラグメント、並びに欠失フラグメントが含まれる。本発明に従って有用な抗αvβ6抗体及び抗体ポリペプチドの変異型には、上述のようなフラグメント、更にはアミノ酸の置換、欠失又は挿入によりアミノ酸配列が改変されているポリペプチドも含まれる。変異型は天然である場合もあれば、非天然である場合もある。非天然の変異型は、当該技術分野で既知の突然変異誘発法を使用して生成される場合がある。変異型のポリペプチドは、保存又は非保存アミノ酸の置換、欠失又は付加を含む場合がある。本発明に従って有用な抗αvβ6抗体及び抗体ポリペプチドの誘導体には、天然ポリペプチドに存在しない追加の特徴を示すように改変されているポリペプチドがある。例としては融合タンパク質が含まれる。変異型ポリペプチドは又、本明細書において「ポリペプチド類縁体」と呼ばれる場合もある。本明細書で使用される、抗αvβ6抗体又は抗体ポリペプチドの「誘導体」とは、官能側鎖基の反応により化学的に誘導された1つ以上の残基を有する目的のポリペプチドを指す。又、「誘導体」として含まれるものには、20の標準アミノ酸の1つ以上の天然のアミノ酸誘導体を含有するペプチドもある。例えば、4−ヒドロキシプロリンプロリンで置換される場合があり;5−ヒドロキシリジンリジンで置換される場合があり;3−メチルヒスチジンはヒスチジンで置換される場合があり;ホモセリンはセリンで置換される場合があり;オルニチンはリジンで置換される場合がある。

0070

「実質的に、実質的な」:本明細書で使用されるタンパク質のコンジュゲーションは、コンジュゲートしたタンパク質の受容体への結合の速度及び/又は量が、コンジュゲートしていない対応するサイトカイン、ケモカイン、成長因子又はポリペプチドホルモンの結合の速度及び/又は量の少なくとも約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%又は約100以上である場合に、タンパク質がその受容体に結合する能力を「実質的に」妨害していないとされる。

0071

「処置」:本明細書で使用される「処置」、「処置する」、「処置された」又は「処置すること」という用語は、特に目的が望ましくない生理学的変化又は障害、例えば多発性硬化症の進行を予防又は緩徐化(低減)するような、予防及び/又は施療を指す。有益な又は望ましい臨床的結果には、症状の軽減、疾患の範囲の低減、疾患の安定化された(即ち悪化しない)病態、疾患の進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の改善又は緩和、及び緩解(部分的又は完全)が、検知可能か不可能かにかかわらず含まれるが、これらに限定されない。「処置」は又、処置を受けない場合に予測される生存と比較した場合の延長された生存を意味してもよい。処置を要するものには、病態又は障害を既に有するもの、並びに病態又は障害を有し易いもの、又は病態又は障害を予防するものが含まれる。「被験体」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後又は処置が望ましい何れかの被験体、特に哺乳動物被験体を意味する。哺乳動物被験体には、ヒト及びその他の霊長類、家畜動物牧場動物、及び動物園競技又はペット用の動物、例えばイヌネコモルモットウサギ、ラット、マウス、ウマウシ乳牛等が含まれる。

0072

概要
本発明は、インテグリンαvβ6に対して特異的なヒト化抗体を特徴とする。本明細書には、本発明の抗体を製造する種々の方法を記載する。当該技術分野で既知であるが、本明細書に具体的に記載していない方法も本発明の適用範囲に含まれる。

0073

本発明は又、インテグリンαvβ6は、それが非転移性であるかより転移能が低い腫瘍細胞上で観察される発現レベルと比べて転移性であるかより転移能が高い腫瘍細胞上で増量されて発現されるという点において、腫瘍細胞表面上で差次的に発現されるという発見に少なくとも部分的に基づいている。この差次的発現を分析するために、本発明は、インテグリンαvβ6に結合するリガンド、特に抗体(更に具体的には、本発明により提供されるヒト化抗体)を使用する。他の実施形態において、本発明は、腫瘍細胞の浸潤性及び/又は転移性の能力の測定において、及び進行性又は転移性の癌腫に進行する可能性がより高い特定の腺癌及びin situ癌腫(DCIS及びLCISを含む)のような癌腫の発見において、この差次的発現の同定を使用する方法を提供する。本発明は又、腫瘍を構成している細胞がインテグリンαvβ6に結合する1つ以上のリガンドを使用した処置に応答する可能性がより高い腫瘍を同定する方法を提供する。本発明は又、腫瘍の転移の診断及び処置/予防、及び腫瘍の外科的摘出後の残存する転移腫瘍細胞を排除する方法も提供する。

0074

ヒト化抗体
一実施形態において、本発明により提供される抗体はモノクローナル抗体であり、これは好ましい実施形態においては他の種に由来する同属体抗αvβ6抗体のヒト化型である。ヒト化抗体は、抗原結合に必要ではないヒト免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖のアミノ酸の一部又は全て(例えば定常領域及び可変ドメインのフレームワーク領域)を使用して同属体、非ヒト抗体の軽鎖又は重鎖から対応するアミノ酸を置換する組換えDNA技術により生成された抗体である。一例として、所定の抗原に対するマウス抗体のヒト化型はその重軽鎖の両方において、(1)ヒト抗体の定常領域;(2)ヒト抗体の可変ドメイン由来のフレームワーク領域;及び(3)マウス抗体由来のCDRを有する。必要に応じて、ヒトフレームワーク領域の1つ以上の残基をマウス抗体の対応する位置における残基に変化させることにより、抗原に対するヒト化抗体の結合親和性を維持することができる。この変化を「復帰突然変異」と称する場合がある。ヒト化抗体は一般的に、キメラヒト抗体と比べて、前者がかなり少量の非ヒト成分を含有することから、ヒトにおいて免疫応答を誘発する可能性がより低い。

0075

本発明のヒト化抗体を製造するのに好適な方法は、例えば、Winter EP0239400;Jones, et al., Nature 321:522−525 (1986); Riechmann, et al., Nature 332:323−327 (1988); Verhoeyen, et al., Science 239:1534−1536 (1988); Queen, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA86:10029 (1989); 米国特許第6,180,370号;及びOrlandi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:3833 (1989)に記載されており、その開示内容は全体が参考として本明細書で援用される。一般的にヒト化抗体へのマウス(又は他の非ヒト)CDRの移植は、以下の通り行う。重軽鎖可変ドメインをコードするcDNAをハイブリドーマから単離する。CDRを含む可変ドメインのDNA配列を配列決定により決定する。CDRをコードするDNAは、部位指向性突然変異誘発によりヒト抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインコード配列の対応する領域に転移させる。次に所望のアイソタイプ(例えばCHの場合はγ1、CLの場合はκ)のヒト定常領域遺伝子セグメントを付加する。ヒト化重軽鎖遺伝子を哺乳動物宿主細胞(例えばCHO又はNSO細胞)中で同時発現することにより可溶性ヒト化抗体を製造する。抗体の大規模製造を容易にするには、このようなヒト化抗体を抗体発現細胞の入ったバイオリアクター中で生成するか、或いは乳汁中に抗体を発現するトランスジェニック哺乳動物(例えばヤギ、ウシ又はヒツジ)を生成する(例えば米国特許第5,827,690号を参照)ことが望ましい場合が多い。

0076

一方、ヒトフレームワークへのCDRの直接転移は、得られる抗体の抗原結合親和性を消失させる。その理由は一部の同属体抗体において、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸がCDRと相互作用し、これにより抗体の全体的抗原結合親和性に影響する。このような場合、同属体抗体の抗原結合活性を保持するには、アクセプター抗体のフレームワーク領域において「復帰突然変異」(前掲)を導入することが重要である。

0077

復帰突然変異を起こす一般的な手法は、当該技術分野で既知である。例えば、Queen, et al.(前掲)、Co, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA88:2869−2873 (1991)及び国際特許第WO90/07861号(Protein Design Labs Inc.)は、2つの重要な段階を含む手法を記載している。まず、ヒト可変フレームワーク領域を、同属体マウス抗体の可変領域フレームワークとの最適タンパク質配列相同性目標コンピュータ分析により選択する。次に、マウス可変領域の3次構造コンピュータモデル化することによりマウスCDRと相互作用する可能性があるフレームワークアミノ酸残基を可視化し、次にこれらのマウスアミノ酸残基を相同ヒトフレームワーク上に重ね合わせる。

0078

この2段階手法では、ヒト化抗体の設計に関する基準が幾つか存在する。第1の基準は、非ヒトドナー免疫グロブリンに通常は相同である特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークをヒトアクセプターとして使用すること、或いは多くのヒト抗体由来コンセンサスフレームワークを使用することである。第2の基準は、ヒトアクセプター残基が通常ではなく、ドナー残基がフレームワークの特定の残基におけるヒト配列に一般的である場合に、アクセプターではなくドナーのアミノ酸を使用することである。第3の基準は、CDRに直ぐ隣接する位置において、アクセプターではなくドナーフレームワークアミノ酸残基を使用することである。

0079

又、例えばTempest, Biotechnology 9:266−271 (1991)に記載のような異なる手法を使用する場合もある。この手法では、それぞれNEWM及びREI重軽鎖に由来する可変領域フレームワークを、マウス残基のラジカルな導入を行うことなくCDRグラフティングに使用する。この手法を使用する利点は、NEWM及びREI可変領域の3次元構造がX線結晶学的分析により判明し、このためCDRと可変領域フレームワーク領域残基の間の特定の相互作用が容易にモデル化できる点である。

0080

本発明者等は、WO03/100033に記載の通りハイブリドーマ6.3G9及び6.8G6から単離したmRNAから、抗体重鎖可変領域cDNA及び軽鎖可変領域cDNAを調製した。これらのハイブリドーマは、αvβ6インテグリンに結合するIgG1クラスのマウスモノクローナル抗体を生成する。キメラヒト抗体発現ベクターは、ヒト抗体重鎖定常領域又はヒト抗体軽鎖定常領域をコードする配列を含有する発現ベクター内にcDNAを挿入することにより構築した。次に、このようなベクターを動物細胞に導入することにより抗αvβ6キメラヒト抗体の生成を行う。生成したキメラ抗体の内、抗αvβ6キメラヒト抗体3G9及び8G6はαvβ6インテグリンと反応し、阻害活性を示すことが見出されている。

0081

上述の手法を使用して、キメラ抗体3G9及び8G6のヒト化型を作成した。3G9抗体については、本明細書に記載する実施例において説明する通り、マウス3G9可変重軽鎖領域のクローニングを行う。次に重軽鎖のマウス3G9可変領域をコードするcDNAを使用して、本明細書に記載する実施例において説明する通り、マウス3G9可変領域をヒトIgG1(重鎖の場合)及びヒトκ(軽鎖の場合)の定常領域に連結したマウス−ヒトキメラの発現のためのベクターを構築する。293−EBNA細胞内へのトランスフェクションの後の重軽鎖の3G9発現ベクターの発現は、キメラ3G9トランスフェクト細胞は重軽鎖を効率的に組み立て、抗体を分泌したことを示していた(実施例2を参照)。更に、キメラ3G9抗体のアグリコシル突然変異型も作成した。3G9の軽鎖の最初のCDRのN連結グリコシル化部位内のアスパラギン(N)からセリン(S)へのアミノ酸置換は、結合親和性を改変することなくタンパク質の発現及び精製を大幅に向上させることが示されている(図1)。

0082

ヒト化3G9抗体を生成するために、ヒト生殖細胞配列との相同性マッチングによりヒトアクセプターフレームワークドメインを選択した。実施例3に記載する通り、軽鎖については、ヒトL6アクセプターフレームワークは最も相同であることが見出され、重鎖についてはヒト3−7アクセプターフレームワークが最も相同であることが見出された。これらの選択されたヒトアクセプターフレームワークを使用しながら、重軽鎖可変ドメインを設計し、それぞれの変異型/型の多くを作成し、発現させた(実施例4)。

0083

本発明は、配列番号1の重鎖可変ドメイン及び配列番号2の軽鎖可変ドメインを含むものとしてヒト化3G9抗体を記載する。

0084

3G9重軽鎖の異なる変異型/型を種々の程度の復帰突然変異で作成することによりどの組み合わせがαvβ6に対して優れた結合親和性及び阻害活性を有する最良のヒト化抗体をもたらすか調べた。生成した5種類の軽鎖型及び3種類の重鎖型のうち、3G9重鎖3型(HV3)と3G9軽鎖5型(LV5)の対が最良のヒト化抗体をもたらした(実施例4)。このヒト化3G95型(H3/L5)抗体は、プラスミドpKJS189(配列番号6)を含む重鎖3型(H3)に関する組換えベクターをプラスミドpKJS195(配列番号5)を含む軽鎖5型(LV5)に対する組換えベクターと組み合わせて発現することにより生成される。

0085

0086

正常なFc受容体結合に必要であることが示されている定常領域のグリコシル化部位が除去されるように重鎖が突然変異しているヒト化3G95型(H3/L5)の別の型も作成した(実施例5)。ヒト化3G9抗体のこのアグリコシル型(a−H3/L5)は、重鎖3型(H3)の定常領域においてアミノ酸残基アスパラギン(N)をグルタミン(Q)と置換することにより生成される。アグリコシルヒト化3G9(a−H3/L5)抗体は、プラスミドpKJS196(配列番号7)を含むアグリコシル重鎖3型(a−H3)に関する組換えベクターをプラスミドpKJS195(配列番号5)を含むアグリコシル軽鎖5型(a−L5)に関する組換えベクターと組み合わせて発現することにより生成される(配列番号5;上記を参照)。

0087

0088

同様の手法をヒト化8G6抗体の設計に使用した(実施例7)。8G6可変軽鎖及び可変重鎖の3つの型が設計されており、第1の型が最大の復帰突然変異を含有し、第3の型が最小の復帰突然変異を含有した(最大「ヒト化」)(実施例5)。

0089

0090

その他の部分
以下に更に詳述する通り、本発明のヒト化モノクローナル抗体は、その他の部分を更に含むことにより、所望の機能を作用させる場合がある。例えば、ヒト化抗体は、抗体がターゲティングする細胞を殺傷するために毒素部分(例えば破傷風トキソイド又はリシン)又は放射性核種(例えば111In又は90Y)を含む場合がある(例えば米国特許第6,307,026号を参照)。ヒト化抗体は、単離又は検出を容易にするための部分(例えばビオチン蛍光部分放射性部分ヒスチジンタグ又は他のペプチドタグ)を含む場合がある。ヒト化抗体は又、その血清半減期を延長することができる部分、例えばポリエチレングリコール(PEG)部分を含む場合もある。

0091

種々の化学療法剤は、ターゲティングヒト化抗体に共役してもよい。好ましくは、結合時に内在化するヒト化抗体が最良であるが、非内在化ヒト化抗体の使用は除外されない。例えば、腫瘍細胞表面に結合し、腫瘍又は腫瘍細胞近接部内に薬剤を放出する抗体−薬剤コンジュゲートの使用、及び細胞内への拡散又は輸送により、使用薬剤に応じて抗腫瘍活性が得られる場合がある。コンジュゲートを調製するために使用できる薬剤の一覧は広範であり、所望の化合物に化学修飾を行うことによりその化合物の反応を本発明のコンジュゲートを調製する目的のためにより好都合なものとする方法は、当業者に既知であろう。例えば、薬剤は、血清中では差次的により安定しているが腫瘍細胞内部では活性剤を放出する「放出性リンカーを介して共役すると考えられる。数種の放出機序を特定の薬剤に応じて使用できる。これらの放出機序の例には、酸感受性ヒドラゾン、レドックス感受性リンカー、例えばジスルフィド及びタンパク質分解開裂されたペプチドリンカーの使用が含まれる。以下に示すものは、数種の異なるクラスに由来する一部の代表的な薬剤である:
(A)アルキル化剤:これらの薬剤の一部の特定の例には、シクロホスファミド、クロラムブシルブスルファン、メルファラン及びニトロソ尿素がある;
(B)代謝拮抗物質及び抗増殖材、例えばアントラサイクリンビンカ薬剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、ヌクレオシドプテリジンエンジイン:例としては、アドリアマイシンダウノルビシン、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、マイトマイシンCアクチノマイシン−D、5−フルオロウラシル、6−メルカプトプリンシトシンアラビノシドタキソールタキサンシトカラシンB、コルヒチン及びピューロマイシンエトポシド、メルファラン、ビンブラスチンビンクリスチン、カリケアマイシン、マイタンシノイド誘導体及びドリスタチン誘導体がある;
(C)ホルモン及びホルモン拮抗物質、例えばコルチコステロイドプロゲスチン及びエストロゲン

0092

プロドラッグは、抗体に連結されている場合「低効力の」化学的形態において存在するが、内在化時には酵素的に分解して高効力の薬剤形態を生じさせる薬剤として定義される。これと同じ応用を内在化しない抗体コンジュゲートに対しても行うことができ、例えば酵素的分解は、腫瘍細胞表面上で起こり、薬剤が隣接する腫瘍環境内に放出され、腫瘍細胞により同化される。この一部の例には、リン酸スルフェート及びペプチドを含有する薬剤がある。

0093

生物学的活性を有するタンパク質毒素、例えばリシンA鎖、ジフテリア毒素、シガトキシン破傷風又は毒性酵素の連結は本発明で考慮される抗体−コンジュゲートの別の形態である。このようなコンジュゲートは、化学的コンジュゲート法を使用して、又は抗体−毒性コンストラクトの直接の発現が可能な遺伝子操作法を使用して調製することができ、これらの方法は当業者が容易に知るところである。

0094

本発明のヒト化モノクローナル抗体は又、放射性核種のようなその他の部分を含む場合もある。放射線免疫療法において、癌を処置するために治療用放射同位体を特異的にターゲティングするためのヒト化αvβ6抗体の使用は、本発明により考慮される。関連する同位体の一覧には、90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re及び188Reが含まれる場合があるが、これらに限定されない。同様に考慮されるものには、α放射同位体、例えば211At、212Biがある。同位体連結の方法は変動し、使用する特定の同位体により異なる。何れかの特定の同位体の連結のコンジュゲーション化学の方法は、当業者が熟知し、決定できるであろう。

0095

放射線免疫診断において、ヒト化αvβ6抗体は、ターゲティングされた癌及び/又は何れかの特定の疾患の罹患臓器/組織に対する画像化及び線量算定を実施する機会を与える。このことは既知腫瘍部位に対して局在化を確認する、並びに治療薬投与の最適投薬を可能にするのに有用である。特に、純粋なγ同位体99MTcに追加して、陽電子放射線同位体(例えば86Y)を治療薬投与時に与えることができる。

0096

上述の放射線免疫療法/放射線免疫診断の適用は非内在化抗体の使用に限定されない。特に異化後にキレートとして細胞内に保持される同位体を使用して放射性同位体をターゲティングするための内在化抗体の効果的な使用の例が存在する。例えば、90Y標識抗体は、MX−DIPA又はCHX−DTPAのような高親和性キレート剤を使用して調製される。

0097

上述の抗体コンジュゲートの何れかには、フラグメントFab、F(ab’)2、scFv、ミニボディー、CH2ドメイン欠失抗体コンストラクト及びFcRn−突然変異型の使用も含まれる。これらのAbフラグメント又は遺伝子的に修飾されたコンストラクトは特定の用途において利点をもたらす未損傷のIgGとは異なる薬物動態、腫瘍浸透性及び腫瘍局在性を有する。例えば、より急速に浄化されるFabは、放射線免疫診断等の診断の用途に有用である場合がある。一方、放射線免疫療法又は薬剤ターゲティングのためには、より長い血清中t1/2を有するターゲティングビヒクルを選択することがより効果的である場合がある。

0098

疾患病態及び動物モデル
本発明のヒト化抗体は、αvβ6媒介疾患の予防を含む診断及び処置において有用である。例えば、これらのヒト化抗体は、TGF−βの活性化を阻害すること、又はフィブロネクチン、ビトロネクチン及びテナシンのようなその他何れかのリガンドへのαvβ6の結合を阻害することにより、線維症(例えば肺線維症、急性肺傷害、腎線維症、肝線維症、Alport症候群及び硬皮症)及び本明細書に別途記載するその他の疾患及び障害を処置するために使用することができる。特に、本発明のヒト化抗体は、傷害/線維症に関連する肺疾患(例えば、特発性肺線維症、放射線誘導線維症、慢性閉塞性肺疾患COPD)、硬皮症、ブレオマイシン誘導線維症、慢性喘息珪肺症、アスベスト誘導線維症、急性肺傷害及び急性呼吸窮迫症(例えば細菌性肺炎誘導性外傷誘導性、ウィルス性肺炎誘導性、換気装置誘導性、非肺敗血症誘導及び吸引誘導性)が含まれるがこれらに限定されない)を処置するために使用することができる。本発明のヒト化抗体は又、傷害/線維症に関連する慢性腎症(例えば、狼瘡、糖尿病、硬皮症、糸球体腎炎巣状分節状糸球体硬化症、IgG腎症、高血圧自家移植片及びAlport疾患が含まれるがこれらに限定されない)を処置するためにも使用することができる。ヒト化抗体は又、腸の線維症、硬皮症、放射線誘導線維症を処置するにも有用である。本発明のヒト化抗体は、肝線維症、例えば限定しないが胆管傷害誘導線維症を処置するためにも使用することができる。本発明のヒト化抗体が処置に有用である可能性があるその他の適応症には、頭頚部線維症、放射線誘導線維症、角膜瘢痕形成、LASIX、角膜移植柵状織切除術肥大性瘢痕形成、熱傷誘導線維症、外科的線維症、サルコイドーシス、乾癬及び脊髄傷害/線維症が含まれる。

0099

以下で詳述する通り、線維性の疾患又は病態以外に、本発明のヒト化抗体は癌又は癌の転移(腫瘍の成長及び浸潤を含む)、特に上皮癌を処置するのに有用である。上皮癌のサブセットは、扁平上皮癌腫、例えば頭頚部(口腔、喉頭、咽頭食道)、乳房、肺、前立腺子宮頚部結腸、膵臓、皮膚(基底細胞癌腫)及び卵巣の癌である。新規のαvβ6モノクローナル抗体を使用する本発明者等の試験によれば、αvβ6は、多くの上皮癌において、特に腫瘍のリーディングエッジ上において高度に発現している。新規の抗体は又、αvβ6により媒介されるその他何れかの疾患、例えば乾癬に対しても使用することができる。

0100

本発明の抗体の薬効は、種々の動物モデルにおいて試験することができ、その一部は後述する非限定的な実施例において説明する。肺線維症のマウスモデルには、ブレオマイシン(Pittet, et al., J. Clin. Invest. 107(12):1537−1544 (2001); 及びMunger, et al.,前掲)及び照射誘導性の肺線維症(Franko, et al., Rad. Res. 140:347−355 (1994))が含まれる。ブレオマイシン投与マウスにおいて、肺の上皮肺胞細胞においてαvβ6の発現が増大する。しかし、β6ノックアウトマウスは、ブレオマイシン誘導傷害及び線維症から保護された。

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