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技術 非ヒト動物を検出するためのプライマー・プローブセット

出願人 ハウス食品グループ本社株式会社
発明者 渡辺聡平尾宜司
出願日 2011年2月25日 (9年9ヶ月経過) 出願番号 2011-040504
公開日 2012年9月13日 (8年2ヶ月経過) 公開番号 2012-175928
状態 特許登録済
技術分野 酵素、微生物を含む測定、試験 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード トリガイ ムール貝 検査対象中 ランチョン 含有加工 いわし油 分析環境 品質確認
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2012年9月13日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (4)

課題

非ヒト動物DNAを核酸増幅反応により増幅して検出する方法において、ヒトのDNAを増幅することなく、非ヒト動物のDNAを動物種に関係なく増幅することを可能にする手段を提供する。

解決手段

(1)のプライマーペアと、(2)のペプチド核酸(PNA)プローブとを含む、非ヒト動物に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域に相当するDNA断片を増幅するための、プライマープローブセット:(1)特定の塩基配列を3’末端側に含む二種のオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、(2)特定の塩基配列を含むPNAオリゴマーからなるプローブ。

概要

背景

ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase chain reaction,以下「PCR」という)法を用いた検査法は、食品検査に数多く取り入れられ、現在では食物アレルゲンの検査法(非特許文献1)、、鶏等の検出法(非特許文献2)、植物片異物検査法(特許文献1)、遺伝子組換え作物の検査法などが実用化されている(特許文献2)。これら検査法は、いずれも食品試料から抽出精製したDNAを鋳型として、PCRにより特定の生物種固有DNA配列増幅試みるものである。判定は、特定の生物種のDNA配列に由来する増幅産物、すなわち目的の長さのDNA断片の有無を確認することによって行う。目的の長さのDNA断片が確認された場合には、特定のDNA配列を持つ生物種が食品に含まれている(陽性)と判定し、確認されなかった場合には、含まれていない(陰性)と判定する。

検査において、PCRに用いるDNA試料液がPCR増幅に適した品質であることは重要である。品質の悪いDNA試料液を用いれば、特定のDNA配列が食品に含まれていたとしてもPCRで増幅されないため、偽陰性の判定となる可能性が生ずる。特に、食物アレルゲンの検査における偽陰性は、食物アレルギー患者の誤食被害に繋がる恐れがある。従って、検査を行う前に、食品試料から抽出精製したDNA試料液がPCRに適した品質かを確認する必要がある。確認するポイントは、DNA試料液に、PCR反応阻害する食品由来夾雑物の影響がないこと、十分量のDNAが抽出されていること、抽出DNAが酸、熱、圧力などによる加工やDNA抽出過程極度に分解されていないことの3点である。

食品試料から抽出精製したDNA試料液の品質を確認する方法としては、生物種に広く共通して存在するDNA配列を増幅するPCR法が幾つか報告されている。これらの方法により、食品試料から抽出精製したDNAを鋳型として目的の長さのDNA断片が増幅されれば、DNA試料液の品質が適切であると判断して、食物アレルゲン検査等のPCR検査を行なうこととなる。ここで注意が必要なことは、食品試料以外の環境中の生物にも広くDNAが存在しているということである。特に、ヒト、真菌、細菌DNAは飛沫胞子菌体などの形で室内を浮遊しているため、分析試料試薬などへの混入リスクが高い。PCRは数コピーの鋳型DNAからの増幅が可能であることから、分析環境からこれらDNAが混入した場合、食品試料ではなく、環境中の生物由来DNAを鋳型とした増幅が起こり、誤った検査結果が得られる可能性がある。従って、分析環境から混入するDNA由来の増幅を防止することは、検査結果の正確性を高める上で重要であり、そのためには食品に用いられる植物、動物DNAを増幅するが、ヒト、真菌、細菌DNAを増幅しないPCR法をDNAの品質確認に用いることが重要となる。

これまで報告されている生物種に広く共通して存在するDNA配列を増幅するPCR法としては、まず、Allmannの真核生物DNAを検出するPCR法(非特許文献3)がある。しかし、この方法ではヒト、真菌DNAからも増幅産物が得られてしまう。この他、食物アレルゲン検査における品質確認に用いられる動物DNA検出PCR法(非特許文献1)もあるが、やはりヒトDNAからも増幅産物が得られてしまう。また、食品に用いる動物の一種であるクラゲのDNAなどからは増幅産物が得られず、動物種により得られた増幅産物の長さが大きく異なる。植物DNA検出PCR法(非特許文献1)は、ヒト、真菌、細菌DNAからは増幅産物が得られないものの、動物DNAを検出できない。

概要

非ヒト動物DNAを核酸増幅反応により増幅して検出する方法において、ヒトのDNAを増幅することなく、非ヒト動物のDNAを動物種に関係なく増幅することを可能にする手段を提供する。(1)のプライマーペアと、(2)のペプチド核酸(PNA)プローブとを含む、非ヒト動物に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域に相当するDNA断片を増幅するための、プライマープローブセット:(1)特定の塩基配列を3’末端側に含む二種のオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、(2)特定の塩基配列を含むPNAオリゴマーからなるプローブ。なし

目的

本発明は、核酸増幅反応に供するための非ヒト動物DNA含有試料の品質確認を行うために、非ヒト動物DNAを核酸増幅反応により増幅する方法において、ヒト、真菌及び細菌のDNAを増幅することなく、非ヒト動物のDNAを、動物種に関係なく増幅することを可能にする手段を提供することを目的とする。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
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請求項1

下記(1)及び(2)から選択されるプライマーペアと、下記(3)〜(6)から選択されるペプチド核酸(PNA)プローブとを含む、非ヒト動物由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域に相当するDNA断片増幅するためのプライマープローブセット:プライマーペア:(1) 5’-gtttccctcaggatagctgg-3’ (配列番号1) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が20〜30塩基鎖長を有するオリゴヌクレオチドと、5’-cctctaatcattcgctttaccgg-3’ (配列番号2) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が23〜33塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーペア(2) 配列番号1に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドとからなり、前記(1)のプライマーペアと同一の領域を増幅することができるプライマーペアPNAプローブ:(3) N-agacccgacgcacccccgc-C (配列番号3) に示す塩基配列 (NはPNAオリゴマー鎖のN末端側を、CはPNAオリゴマー鎖のC末端側を指す)を含む、全体が19〜29塩基の鎖長を有するPNAオリゴマーからなるプローブ(4) 配列番号3に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるPNAオリゴマーからなり、前記(1)または(2)のプライマーペアを用いた核酸増幅反応において、ヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAが存在する場合に、該DNAとハイブリダイズして該DNAの増幅を阻止することができるプローブ(5) 前記(3)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ(6) 前記(4)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ。

請求項2

検査対象から調製されたDNA試料鋳型とし、請求項1に記載のプライマー・プローブセットを用いてDNA断片の増幅を行う増幅工程と、増幅工程により標的増幅産物が得られているか否かを確認する確認工程とを含む、非ヒト動物DNAの検出方法

請求項3

確認工程において標的増幅産物が得られていることが確認された場合に、前記DNA試料が核酸増幅反応の試料として適した品質を有していると結論付ける工程を更に含む、請求項2に記載の方法。

請求項4

増幅工程において、ヒトに由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの増幅が阻止される、請求項2又は3に記載の方法。

請求項5

請求項1に記載のプライマー・プローブセットを含む、非ヒト動物DNA検出用キット

請求項6

検査対象から調製されたDNA試料を鋳型とし、下記(1)及び(2)から選択されるプライマーペアと、下記(3)〜(6)から選択されるペプチド核酸(PNA)プローブとを含むプライマー・プローブセットを用いてDNA断片の増幅を行う増幅工程と、増幅工程により得られた標的増幅産物の塩基配列に基づいて該標的増幅産物の起源生物種推定する推定工程とを含む、検査対象に含まれるDNAの起源生物種を推定する方法:プライマーペア:(1) 5’-gtttccctcaggatagctgg-3’ (配列番号1) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が20〜30塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドと、5’-cctctaatcattcgctttaccgg-3’ (配列番号2) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が23〜33塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーペア(2) 配列番号1に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドとからなり、前記(1)のプライマーペアと同一の領域を増幅することができるプライマーペアPNAプローブ:(3) N-agacccgacgcacccccgc-C (配列番号3) に示す塩基配列 (NはPNAオリゴマー鎖のN末端側を、CはPNAオリゴマー鎖のC末端側を指す)を含む、全体が19〜29塩基の鎖長を有するPNAオリゴマーからなるプローブ(4) 配列番号3に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるPNAオリゴマーからなり、前記(1)または(2)のプライマーペアを用いた核酸増幅反応において、ヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAが存在する場合に、該DNAとハイブリダイズして該DNAの増幅を阻止することができるプローブ(5) 前記(3)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ(6) 前記(4)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ。

技術分野

0001

本発明は、核酸増幅反応において、非ヒト動物(ヒト以外の動物を指す)に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域を種に関係なく増幅するが、ヒトに由来するものは増幅しない、非ヒト動物を選択的に検出するためのプライマープローブセットに関する。

0002

本発明のプライマー・プローブセットは非ヒト動物DNA含有試料が核酸増幅反応のための鋳型として適した品質を有することを確認するために用いることができる。

0003

本発明のプライマー・プローブセットはまた、得られた標的増幅産物起源生物種推定するために用いることができる。

背景技術

0004

ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase chain reaction,以下「PCR」という)法を用いた検査法は、食品検査に数多く取り入れられ、現在では食物アレルゲンの検査法(非特許文献1)、、鶏等の検出法(非特許文献2)、植物片異物検査法(特許文献1)、遺伝子組換え作物の検査法などが実用化されている(特許文献2)。これら検査法は、いずれも食品試料から抽出精製したDNAを鋳型として、PCRにより特定の生物種固有DNA配列の増幅を試みるものである。判定は、特定の生物種のDNA配列に由来する増幅産物、すなわち目的の長さのDNA断片の有無を確認することによって行う。目的の長さのDNA断片が確認された場合には、特定のDNA配列を持つ生物種が食品に含まれている(陽性)と判定し、確認されなかった場合には、含まれていない(陰性)と判定する。

0005

検査において、PCRに用いるDNA試料液がPCR増幅に適した品質であることは重要である。品質の悪いDNA試料液を用いれば、特定のDNA配列が食品に含まれていたとしてもPCRで増幅されないため、偽陰性の判定となる可能性が生ずる。特に、食物アレルゲンの検査における偽陰性は、食物アレルギー患者の誤食被害に繋がる恐れがある。従って、検査を行う前に、食品試料から抽出精製したDNA試料液がPCRに適した品質かを確認する必要がある。確認するポイントは、DNA試料液に、PCR反応阻害する食品由来夾雑物の影響がないこと、十分量のDNAが抽出されていること、抽出DNAが酸、熱、圧力などによる加工やDNA抽出過程極度に分解されていないことの3点である。

0006

食品試料から抽出精製したDNA試料液の品質を確認する方法としては、生物種に広く共通して存在するDNA配列を増幅するPCR法が幾つか報告されている。これらの方法により、食品試料から抽出精製したDNAを鋳型として目的の長さのDNA断片が増幅されれば、DNA試料液の品質が適切であると判断して、食物アレルゲン検査等のPCR検査を行なうこととなる。ここで注意が必要なことは、食品試料以外の環境中の生物にも広くDNAが存在しているということである。特に、ヒト、真菌、細菌DNAは飛沫胞子菌体などの形で室内を浮遊しているため、分析試料試薬などへの混入リスクが高い。PCRは数コピーの鋳型DNAからの増幅が可能であることから、分析環境からこれらDNAが混入した場合、食品試料ではなく、環境中の生物由来DNAを鋳型とした増幅が起こり、誤った検査結果が得られる可能性がある。従って、分析環境から混入するDNA由来の増幅を防止することは、検査結果の正確性を高める上で重要であり、そのためには食品に用いられる植物、動物DNAを増幅するが、ヒト、真菌、細菌DNAを増幅しないPCR法をDNAの品質確認に用いることが重要となる。

0007

これまで報告されている生物種に広く共通して存在するDNA配列を増幅するPCR法としては、まず、Allmannの真核生物DNAを検出するPCR法(非特許文献3)がある。しかし、この方法ではヒト、真菌DNAからも増幅産物が得られてしまう。この他、食物アレルゲン検査における品質確認に用いられる動物DNA検出PCR法(非特許文献1)もあるが、やはりヒトDNAからも増幅産物が得られてしまう。また、食品に用いる動物の一種であるクラゲのDNAなどからは増幅産物が得られず、動物種により得られた増幅産物の長さが大きく異なる。植物DNA検出PCR法(非特許文献1)は、ヒト、真菌、細菌DNAからは増幅産物が得られないものの、動物DNAを検出できない。

0008

特許第4205485号公報
特許第4291568号公報
特許第4417728号公報
WO 92/20702

先行技術

0009

平成22年9月10日消食表第286号消費者次長通知アレルギー物質を含む食品の検査方法について (平成22年9月10日 消費者庁食品表示課 事務連絡
Tanabe S et al,; A real-time quantitativePCRdetection method for pork, chicken, beef, mutton, and horseflesh in foods. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2007) 71 (12), 3131-3135.
Allmann, M., Candrian, U., Hofelein, C., Luthy, J.; Polymerase chain reaction (PCR): a possible alternative to immunochemical methods assuring safety and quality of food. Detection of wheat contamination in non-wheat food products. Z. Lebensm. Unters. Forsch. A. 196, 248-251(1993))
P. E. Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500
M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 9677-9678
M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1895-1897
M. Egholm et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1993, 800-801
K.L. Dueholm et al., J. Org. Chem., 1994, 59, 5767-5773

発明が解決しようとする課題

0010

本発明は、核酸増幅反応に供するための非ヒト動物DNA含有試料の品質確認を行うために、非ヒト動物DNAを核酸増幅反応により増幅する方法において、ヒト、真菌及び細菌のDNAを増幅することなく、非ヒト動物のDNAを、動物種に関係なく増幅することを可能にする手段を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0011

動物の核ゲノム上の28SrRNA遺伝子(ゲノムDNA)領域の中に、真菌とは相同性が低く、広く動物種に共通する塩基配列を見出して、動物共通プライマーペアを設計した。また、二つの動物共通プライマーに挟まれた配列上に、ヒトに特有の塩基配列を見出して、ヒト由来DNAの増幅を抑えるペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid。以下「PNA」という)プローブを設計した。そうして、これら動物共通プライマーペアとPNAプローブを用いてPCR等の核酸増幅反応を行うことで、広く非ヒト動物DNA全般から目的の長さの標的増幅産物が得られ、且つ、分析環境から混入するヒト由来DNAの増幅を抑えられることを見出し、本発明を完成させるに至った。

0012

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(I)
下記(1)及び(2)から選択されるプライマーペアと、下記(3)〜(6)から選択されるペプチド核酸(PNA)プローブとを含む、非ヒト動物に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域に相当するDNA断片を増幅するためのプライマー・プローブセット:
プライマーペア:
(1) 5’-gtttccctcaggatagctgg-3’ (配列番号1) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が20〜30塩基鎖長を有するオリゴヌクレオチドと、5’-cctctaatcattcgctttaccgg-3’ (配列番号2) に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が23〜33塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーペア
(2) 配列番号1に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドとからなり、前記(1)のプライマーペアと同一の領域を増幅することができるプライマーペア
PNAプローブ:
(3) N-agacccgacgcacccccgc-C (配列番号3) に示す塩基配列 (NはPNAオリゴマー鎖のN末端側を、CはPNAオリゴマー鎖のC末端側を指す)を含む、全体が19〜29塩基の鎖長を有するPNAオリゴマーからなるプローブ
(4) 配列番号3に示す塩基配列に対し相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるPNAオリゴマーからなり、前記(1)または(2)のプライマーペアを用いた核酸増幅反応において、ヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAが存在する場合に、該DNAとハイブリダイズして該DNAの増幅を阻止することができるプローブ
(5) 前記(3)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ
(6) 前記(4)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブ。
(II)
検査対象から調製されたDNA試料を鋳型とし、(I)に記載のプライマー・プローブセットを用いてDNA断片の増幅を行う増幅工程と、増幅工程により標的増幅産物が得られているか否かを確認する確認工程とを含む、非ヒト動物DNAの検出方法
(III)
確認工程において標的増幅産物が得られていることが確認された場合に、前記DNA試料が核酸増幅反応の試料として適した品質を有していると結論付ける工程を更に含む、(II)に記載の方法。
(IV)
増幅工程において、ヒトに由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの増幅が阻止される、(II)又は(III)に記載の方法。
(V)
(I)に記載のプライマー・プローブセットを含む、非ヒト動物DNA検出用キット
(VI)
検査対象から調製されたDNA試料を鋳型とし、前記(I)記載の(1)及び(2)から選択されるプライマーペアと、前記(I)記載の(3)〜(6)から選択されるペプチド核酸(PNA)プローブとを含むプライマー・プローブセットを用いてDNA断片の増幅を行う増幅工程と、増幅工程により得られた標的増幅産物の塩基配列に基づいて該標的増幅産物の起源生物種を推定する推定工程とを含む、検査対象に含まれるDNAの起源生物種を推定する方法。

発明の効果

0013

本発明によれば、分析環境などから混入するヒトDNAの共存下においても、非ヒト動物を主原料とする食品から抽出精製されたDNA試料液の品質が核酸増幅反応による増幅に適したものであるかを確認するための、プライマー・プローブセットが提供される。

0014

さらに、本発明のプライマー・プローブセットを用いた核酸増幅反応により目的の長さの増幅産物が得られた試料においては、その増幅産物の塩基配列を確認することによって、その増幅産物が由来する生物種を推定することができる。

図面の簡単な説明

0015

様々な動物のDNA試料液に対する本発明のプライマー・プローブセット(配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示す塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号3に示す塩基配列からなるPNAプローブとからなるプライマー・プローブセット)のPCR増幅産物確認結果(PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真)を示す。括弧:約60-83 bpの増幅産物のバンドが得られた範囲。
様々な植物のDNA試料液に対する本発明のプライマー・プローブセット(配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示す塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号3に示す塩基配列からなるPNAプローブとからなるプライマー・プローブセット)のPCR増幅産物確認結果(PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真)を示す。括弧:約60-83 bpの増幅産物のバンドが得られた範囲。
様々なヒトDNA試料液に対する本発明のプライマー・プローブセット(配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示す塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号3に示す塩基配列からなるPNAプローブとからなるプライマー・プローブセット)のPCR増幅産物確認結果(PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真)を示す。矢印:約83 bpの増幅産物のバンドが得られた範囲。
様々な市販品から抽出したDNA試料液に対する本発明のプライマー・プローブセット(配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示す塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号3に示す塩基配列からなるPNAプローブとからなるプライマー・プローブセット)のPCR増幅産物確認結果(PCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動写真)を示す。括弧:約60-83 bpの増幅産物のバンドが得られた範囲。

0016

本発明のプライマー・プローブセットは、動物の核ゲノム上にある、28SリボソームRNA(28SrRNA)をコードするゲノムDNA中の、特定の種に限定されず動物が共通して有する塩基配列に基づいて設計した一対のオリゴヌクレオチドからなるプライマーペアと、該プライマーペアにより増幅される28SrRNA遺伝子の領域における、ヒト特異的な塩基配列に基づいて設計されたPNAオリゴマーとを含む。

0017

本発明のプライマー・プローブセットは、非ヒト動物に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域をDNA断片として増幅するが、分析環境から混入するヒトに由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAでの対応領域を増幅しないプライマー・プローブセットである。

0018

本発明において「非ヒト動物に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域に相当するDNA断片」とは、非ヒト動物の28SrRNAをコードするゲノムDNAを鋳型として核酸増幅反応を行った場合に増幅されるDNA断片をいい、「非ヒト動物に由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAの標的領域に相当するDNA断片を増幅する」とは、非ヒト動物の28S rRNAをコードするゲノムDNAを鋳型として核酸増幅反応を行った場合に、目的とする増幅産物(配列番号1の塩基配列からなるプライマーと配列番号2の塩基配列からなるプライマーとの組み合わせの場合、約60-83bpの増幅産物)が得られることをいう。

0019

「分析環境から混入するヒトDNA」とは、分析環境の室内を浮遊したり器具等に付着するヒト唾液の飛沫等を介して混入するヒトDNAをいい、「ヒトに由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAからの増幅が阻止される」とは、ヒトに由来する28SリボソームRNAをコードするゲノムDNAを鋳型として核酸増幅反応を行った場合に増幅が起こらないことをいう。

0020

本発明において、「非ヒト動物共通PCR」とは、食品材料や食品中に含まれる非ヒト動物DNAを鋳型としたPCR増幅をいう。

0021

本発明において、「非ヒト動物」とはヒト以外の動物であれば限定はされない。非ヒト動物の具体例としては、鉢虫綱棘皮動物甲殻類軟体類脊索動物などの、一般的な食品材料として用いられる非ヒト動物が挙げられる。ここで鉢虫綱としてはクラゲ等が挙げられる。棘皮動物としてはウニナマコ等が挙げられる。甲殻類としてはエビカニシャコアミ等が挙げられる。軟体類としてはイカタコ等が挙げられる。脊索動物としてはホヤヤツメウナギ目魚類両生類哺乳類(ヒトを除く)、爬虫類鳥類等が挙げられる。

0022

プライマーペア及びPNAプローブ
本発明で用いられるプライマーペアは、好ましくは、(1) 配列番号1に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が20〜30塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列を3’末端側に含む、全体が23〜33塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーペアである。

0023

なお本発明において「オリゴヌクレオチド」とはDNA又はRNAを指し、典型的にはDNAを指す。

0024

配列番号1に示す塩基配列では3’末端の1塩基目、配列番号2に示す塩基配列は3’末端の1塩基目と2塩基目に真菌DNAとは異なる動物DNAに特異的な塩基が設定されていることを特徴とする。このため、上記(1)のプライマーペアは少なくとも3’末端側部分において動物の28SrRNA遺伝子領域における、それぞれの塩基配列に相補的な塩基配列にアニーリングすることができる。配列番号1に示す塩基配列を3’末端側に含む前記オリゴヌクレオチドはフォワードプライマーであり、配列番号2に示す塩基配列を3’末端側に含む前記オリゴヌクレオチドはリバースプライマーである。

0025

プライマーが鋳型DNAにアニーリングし、DNAポリメラーゼが作用する際には、3’末端側の領域が重要となるが、5’末端側の領域の重要性は低い。このため、配列番号1に示す塩基配列が3’末端側に含まれているオリゴヌクレオチドであれば、その5’末端側に任意の0〜10個、好ましくは0〜5個の塩基が付加された、全体が20〜30塩基、好ましくは20〜25塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドであっても、フォワードプライマーとしての機能に問題は生じない。同様に、配列番号2に示す塩基配列が3’末端側に含まれているオリゴヌクレオチドであれば、その5’末端側に任意の0〜10個、好ましくは0〜5個の塩基が付加された、全体が23〜33塩基、好ましくは23〜28塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドであっても、リバースプライマーとしての機能に問題は生じない。

0026

本発明で用いられるプライマーペアとしては更に、(2) 配列番号1に示す塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドと、配列番号2に示す塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドとからなり、前記(1)のプライマーペアと同一の領域を増幅することができるプライマーペアを用いることができる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、例えば、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。より具体的には、例えば、0.5〜1.0 M 程度の NaClを含むハイブリダイゼーション溶液中、60℃〜68℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で0.1〜1×SSC中(1×SSC: 150mM NaCl, 15mMクエン酸ナトリウムからなる)で1時間洗浄する条件をいう。前記(2)のプライマーペアにおいてフォワードプライマーとして用いることができるハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとしては、配列番号1に示す塩基配列と60%以上、好ましくは80%以上、更に好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができ、特に好ましくは、少なくとも、3’末端の1塩基が、配列番号1に示す塩基配列の3’末端の1塩基と同一であるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。同様に、前記(2)のプライマーペアにおいてリバースプライマーとして用いることができるハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドとしては、配列番号2に示す塩基配列と60%以上、好ましくは80%以上、更に好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができ、特に好ましくは、少なくとも、3’末端の1塩基が、配列番号2に示す塩基配列の3’末端の1塩基と同一であるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。前記(2)のプライマーペアにおけるフォワードプライマー塩基数は特に限定されないが、通常は17〜40塩基以下、好ましくは18〜30塩基以下、より好ましくは19〜25塩基以下である。前記(2)のプライマーペアにおけるリバースプライマー塩基数は特に限定されないが、通常は20〜43塩基以下、好ましくは21〜33塩基以下、より好ましくは22〜28塩基以下である。

0027

核酸増幅反応において標的以外の塩基配列が増幅されず、標的増幅産物を確認し易いことを期待する上での理想は、センス側、アンチセンス側のプライマーをそれぞれ1種類にすること、様々な動物DNAをほぼ同じ長さの標的増幅産物として検出できるようにすることである。本発明では、この要件を満たしつつ、100 bp程度の短めの増幅産物を形成することができるプライマーペアを選択することができた。

0028

本発明に用いられるPNAプローブは、好ましくは(3) 配列番号3に示す塩基配列を含む、全体が19〜29塩基の鎖長を有するPNAオリゴマーからなるプローブである。

0029

PNA(ペプチド核酸)とは、ニールセンにより開発された、ペプチド骨格核酸塩基をもつ分子であり(「Science 254」、(1991年)、Nielsen, P. E.、Egholm, M.、Berg, R. H. and Buchardt, O.著、1497頁〜1500頁)、具体的にはN-(2-アミノエチル)グリシン骨格単位とし、これにメチレンカルボニル基を介して核酸塩基を結合させた構造をもった化合物である(「PNA−その性状と応用」、ダコ・ジャパン(株)発行)。PNAオリゴマーは、オリゴヌクレオチドの5炭糖-リン酸骨格が、N-(2-アミノエチル)グリシンがペプチド結合してなるポリアミド骨格に置換された構造を有するオリゴヌクレオチド類似体である。

0030

プローブが鋳型DNAに相補的に結合する際には、両末端の領域に付加される塩基配列の重要性は低い。このため、配列番号3に示す塩基配列が、連続した部分配列として任意の位置に含まれているPNAオリゴマーであれば、該配列の両末端の一方又は両方に、合計で0〜10個、好ましくは0〜5個の塩基が付加された、全体が19〜29塩基、好ましくは19〜24塩基の鎖長を有するPNAオリゴマーであっても、プローブとしての機能に問題は生じず、プローブとして使用可能である。

0031

本発明で用いられるPNAプローブは、前記(1)または(2)のプライマーペアを用いた核酸増幅反応の反応系中にヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAが存在する場合に、該DNAと特異的にハイブリダイズして該DNAの増幅を阻止することができる。一方、非ヒト動物の28SリボソームRNAをコードするDNAにはハイブリダイズせず、その増幅を妨げない。

0032

本発明で用いられるPNAプローブとしては更に、(4) 配列番号3に示す塩基配列に対し完全に相補的な塩基配列からなるDNA断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるPNAオリゴマーからなり、前記(1)または(2)のプライマーペアを用いた核酸増幅反応において、ヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAが存在する場合に、該DNAとハイブリダイズして該DNAの増幅を阻止することができるプローブを用いることができる。「ストリンジェントな条件」は上述の通りである。前記(4)のPNAプローブとしては、配列番号3に示す塩基配列と60%以上、好ましくは80%以上、更に好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列からなるPNAオリゴマーを挙げることができる。前記(4)のPNAプローブにおけるPNAオリゴマーの塩基数は特に限定されないが、通常は16〜39塩基、好ましくは17〜29塩基、特に好ましくは18〜24塩基である。ヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAの「増幅を阻止する」とは、該DNAの断片の増幅を検出限界以下にまで抑制することを指す。

0033

本発明で用いられるPNAプローブとしては更に、前記(3)又は(4)のプローブを構成するPNAオリゴマーに対して完全に相補的な塩基配列からなるPNAオリゴマーからなるプローブを用いることもできる。このようなプローブは、前記(3)又は(4)のプローブとハイブリダイズするヒトの28SリボソームRNAをコードするDNAの相補的DNAとハイブリダイズし、前記(3)又は(4)のプローブと同様の機能を奏することができる。

0034

上記のPNAプローブを構成するPNAオリゴマーのN末端のアミノ基は遊離の形態(-NH2)であることが好ましく、C末端のカルボキシル基アミド化された形態(-C(=O)NH2)であることが好ましい。

0035

本発明が提供する配列番号1と2のプライマーおよび3のプローブは、論理的設計に加え、プライマー塩基配列プローブ塩基配列を工夫した中で最良の形態と判断されたプライマー・プローブセットについて、PCR反応条件を鋭意検討し、最終的には実際の性能評価試験を行い、意図した特異性感度を発揮していることを確認したものである。

0036

理論上は首尾よく設計されたプライマー・プローブであっても、必要な感度と特異性を保有し得ない場合がある。例えば、後述する比較例1に示すように、配列番号1と同様に広く動物種全般の塩基配列に結合すると考えて設計した下記の配列番号4のフォワードプライマーを、配列番号1のフォワードプライマーの代わりに用いた場合の結果や、後述する比較例2に示すように、配列番号3のプローブと同様にヒトに特有の塩基配列に結合すると考えて設計した下記の配列番号5のプローブを、配列番号3のプローブの代わりに用いた場合の結果が挙げられる。そのため、単に論理的にプライマー、プローブを設計すれば、必要な特異性を確保できるとは限らない。本発明のプライマー及びプローブは、論理的設計に加え、更なる工夫を施し、意図した感度と特異性を確保していることを確認したものである。

0037

プライマーとなるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法を利用したDNA自動合成装置を利用して合成することができる。

0038

プローブとなるPNAオリゴマーは、特許文献3に記載された技術を利用して合成することが可能である。更に、当技術分野で公知の方法、例えば、t-Boc/ベンジルオキシカルボニル保護基戦略を使ったメリフィールド(Merrifield)固相合成により合成することができる(非特許文献4〜8及び特許文献4)。

0039

本発明で用いられるプライマー及びPNAプローブは、必要に応じて、適宜標識化等の修飾が施されたものであってもよい。標識化のための標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン(DIG)やビオチンなどの有機化合物等を使用することができる。

0040

検査対象
本発明のプライマー・プローブセットを用いた核酸増幅反応は、食品、食品原料等の検査対象から抽出したDNA試料を鋳型とすることができる。本発明に係る、非ヒト動物DNAの増幅を確認する方法は、特に、核酸増幅反応によってアレルギーの原因となる特定の食品原料を検出する検査を行う際の、前検査あるいは同時検査のために使用することができる。すなわち、核酸増幅反応を用いた小麦、そば、落花生、エビ、カニ等の検出法(非特許文献1)や、牛、豚、鶏等の検出法(非特許文献2)を使用する際に、前検査あるいは同時検査として、検査対象となるDNA試料液に対して、本発明のプライマー・プローブセットを用いた核酸増幅を行うことが好ましい。

0041

「検査対象」としては食品、食品原料等の、非ヒト動物の成分が含有されている可能性のあるものであれば特に限定されない。食品原料としては生又は加熱した食品材料等が挙げられる。食品としては加工食品、飲料等が挙げられる。

0042

本発明を用いて、PCR等の核酸増幅反応に供するDNA試料が該反応に適切な品質かを確認することで、核酸増幅反応を用いた検査の信頼性を高めることができる。

0043

すなわち、本発明の特徴である広範囲の非ヒト動物のDNAを増幅可能なプライマーを利用した検査対象から調製されたDNA試料を鋳型とする核酸増幅反応において、目的の長さの増幅産物が確認できれば、DNA試料中の夾雑物が十分に除去されていること、検査対象中のDNAの分解が極端でないこと、DNAが核酸増幅反応に供するために十分な量存在することを確認することができるため、DNA試料が核酸増幅反応の鋳型として適切な品質であると判断できる。本発明の方法により適切な品質であると判断されたDNA試料を用いることで、任意の特定の配列の増幅を試みる核酸増幅法において「陽性」、「陰性」を正しく判定することができる。一方、本発明の方法によりDNA試料の品質が不適切だと判断された場合、該試料を鋳型とした核酸増幅反応による検査は不能であると判断することができる。

0044

また、食品原料、食品等の検査対象には異物等が検出される場合も想定されるが、当該異物がどのような由来であるかが不明な場合がある。そこで、本発明のプライマー・プローブセットを用いた核酸増幅反応を応用することで、異物がどのような動物由来のものであるかを推定することができる。例えば、水産系の加工品の異物として、動物の幼生が見つかる場合や、畜産系の加工品の異物として、骨などの動物組織破片が見つかる場合もある。これらは形態観察だけでは動物種の推定が難しい場合もあるが、本発明のプライマー・プローブセットを用いた核酸増幅反応で得られた増幅産物であるDNA断片の塩基配列を解析し、その配列を公共あるいは個人が持つデータベースと照合すれば、当該異物の動物種を推定することが可能である。但し、被験DNA試料液中に、一種類の動物DNAが寡占的である場合にのみ、その推定が可能であり、複数の動物DNAが複雑に混じり合っている場合には、その推定は困難となる場合もありうる。

0045

このように、本発明のプライマー・プローブセットの適用性は広く、核酸増幅反応に供するDNA試料の品質確認や、異物分析等で利用が可能である。

0046

検査対象からのDNAの調製
検査対象からのDNAの調製は、核酸抽出法として当業者に公知の任意の方法を用いて行うことができる。たとえば、フェノールクロロホルム法、界面活性剤による細胞溶解プロテアーゼ酵素による細胞溶解、ガラスビーズによる物理破壊方法凍結溶融を繰り返す処理方法などにより行うことができる。抽出のための試薬としては、市販されている各種DNA抽出キットを用いてもよい。必要に応じて、メンブランフィルターによる濾過ホモジナイズを行い検査対象からDNAを抽出することができる。

0047

核酸増幅反応
核酸増幅反応としてはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)や、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)等を適用することができる。好ましくは核酸増幅反応としてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いる。

0048

核酸増幅反応は上記のプライマー・プローブセットを用いる以外は特に制限はなく、常法に従って行えばよい。具体的には、核酸増幅反応がPCRである場合、鋳型DNAの変性、プライマーの鋳型DNAへのアニーリング、および耐熱性酵素TaqポリメラーゼやThermus themophilis由来のTthDNAポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ)を用いたプライマーの伸長反応を含むサイクルを繰り返すことにより、非ヒト動物の28SrRNAをコードするゲノムDNAの特定の塩基配列を含む断片を増幅させる。PCR反応液組成、PCR条件(温度サイクル、サイクルの回数等)は、当業者であれば、前記のプライマーペアを用いたPCRにおいてPCR増幅産物が得られるように、予備実験等により適切に選択および設定することができる。また、PCR反応液中のPNAプローブ量については、当業者であれば、ヒトゲノムDNA 50ngを鋳型に用いた前記のPCRにおいてPCR増幅産物が得られないようなPNAプローブの量を、予備実験等により適切に選択および設定することができる。上記のアニーリングの条件としては、62℃で、1.5mM程度のMgCl2を含むPCR反応液中で1分行うことを例示することができるが、これは一例に過ぎず、アニーリング温度、PCR反応液の組成、アニーリング時間等は、プライマーとなるオリゴヌクレオチド配列の長さや塩基組成などに応じて適宜設定することができる。これらPCRの一連の操作は、市販のPCRキットPCR装置を利用して、その操作説明書に従って行うことができる。PCR装置は、典型的にはGeneAmp PCR System 9700(アプライドバイオシステムズ社製)を用いることができるが、他のPCR装置も使用可能である。

0049

標的増幅産物の確認
核酸増幅反応により標的増幅産物が得られたかどうかは、アガロースゲル電気泳動、DNAハイブリダイゼーションリアルタイムPCR等の方法を用いて確認することができる。標的増幅産物の断片長は、増幅しようとする28SrRNA遺伝子領域の塩基配列において両プライマーに挟まれる領域の塩基数となる。本発明のプライマーペアを用いた場合は、標的増幅産物の断片長は約60-83bpである。このような標的増幅産物の長さであることは、DNAの断片化による影響が、非特許文献1で用いられるアレルギー検査法と極端に異ならない点で有効である。

0050

上記の標的増幅産物の塩基配列、殊にプライマー配列部分を除いた塩基配列を、GenBank等に登録されている塩基配列と比較することによって、その増幅産物の起源生物種を推定することができ、検査結果の信頼性を高めることができる。

0051

標的増幅産物の塩基配列解析による生物種の推定
本発明では、得られた標的増幅産物の起源生物種、特に動物種を、標的増幅産物の塩基配列を指標として確認する工程を行うこともできる。具体的には、標的増幅産物をアガロース電気泳動等により精製し、バンドを切り出してDNAを抽出し、得られたDNA断片をダイレクトシーケンス法に供して塩基配列を決定するか、または、適当なベクターに挿入後、大腸菌等にクローニングして培養した後に、得られたDNA断片の塩基配列を確認する。配列の確認はサンガー法やマキサムギルバート法等の一般的な方法によって行えばよい。確認された塩基配列のうち、プライマー配列を除いた塩基配列を公共あるいは個人が持つデータベースと照合することで、当該異物の生物種を推定することが可能である。本願発明によって得られる増幅領域は、GenBank等において比較的広範囲なデータが開示されているため、生物種の推定に有効である。

0052

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

0053

実施例1:動物共通PCRプライマー・PNAプローブセットの、食品に用いられる動物、植物に対する特異性評価
(1)試料の調製
DNAの取得
サバフグマカレイブリアジ、サバ、カツオマグロ、シマホッケ、サンマボラ、マダラ、アンコウ、アオメエソ(メヒカリ)、サケカラフトシシャモドジョウマイワシウナギエイ、マボヤ、マダコ、コウイカヤリイカスルメイカアワビサザエ、ツブガイホンミルマテガイ、シジミトリガイアサリハマグリ、ホッキガイ、バカガイ(アオヤギ)、ホタテマガキムラサキイガイムール貝)、アカガイウシブタヒツジウマニワトリ、ウシエビ(ブラックタイガー)、アキアミホッコクアカエビアマエビ)、イセエビタラガニズワイガニナンキョクオキアミ、イサザアミ、シャコ、マナマコ、エゾバフンウニ、クラゲ、コメ、とうもろこし、小麦、大豆、落花生、そば、ばれいしょ、トマト人参玉ねぎ白菜ホウレンソウ、きゅうり、アロエベラパイナップルパパイヤ、オレンジメロン、いちじく、マンゴーバナナアボカドブルーベリーブドウキウイリンゴ市場から購入した。

0054

DNA試料液は、Genomic-tip 20/Gを用い、非特許文献1に記載された方法、または、Genomic-tip 100/Gを用い、Genomic DNA Handbook (QIAGEN) のTissueに記載された方法に従って抽出し取得した。

0055

取得したDNAは、PCRに供するために、分光光度計波長260nmにおける吸光度を測定した結果から濃度を測定した。動物試料から得たDNAは200 pg/μLに、植物試料から得たDNAは20 ng/μLに滅菌超純水希釈した。タラから得たDNAについては、2 ng/μL、20 ng/μLにそれぞれ滅菌超純水で希釈したDNA試料液も作製した。

0056

植物試料から得たDNA試料液は、植物DNA検出PCR法(非特許文献1)で標的増幅産物の出現を確認したものを用いた。動物試料から得たDNA試料液は、クラゲ以外は動物DNA検出PCR法(非特許文献1)で増幅産物の出現を確認したものを用いた。クラゲから得たDNA試料液は、動物DNA検出PCR法で増幅産物が確認できなかったため、そのまま用いた。

0057

(2)PCR
上記のようにして調製した各DNA試料液を用いてPCRを行った。PCRは、下記表1に示す反応液組成と、表2に示す温度条件で、フォワードプライマーに配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマー、リバースプライマーに配列番号2に示す塩基配列からなるリバースプライマー、PNAプローブに配列番号3に示す塩基配列からなるPNAプローブを用い、0.2 mlチューブより、PCR装置にABIPRISM9700(アプライドバイオシステムズ社製)を使用して行った。

0058

0059

0060

(3)PCR増幅産物の有無および断片長の確認
PCR後の反応液7.5 μLをそれぞれエチジウムブロマイド含有の3.5%アガロースゲル電気泳動に供した。同時に分子量マーカーとして20 bp DNA Ladder(タカラバイオ株式会社)を0.5 μL供し、UV照射視覚化することで、PCR増幅産物の有無および断片長の確認を行った。

0061

結果、調べた56種類の動物DNA全てにおいて標的増幅産物が得られ、目的の断片長以外の増幅産物は得られないことを確認した。図1には、マダラ(No.11)を除く動物55種で、DNA 500pgから目的の断片長と同じ長さ(60-83bp)の標的増幅産物が得られた結果を示す。なお、マダラは、DNA 500pgでは標的増幅産物が得られなかったが、DNA 5ngで標的増幅産物が得られた(図1右下)。

0062

植物については27試料中18試料で増幅産物が標的増幅産物の範囲付近に得られ、9試料からは増幅産物は得られなかった(図2)。得られた増幅産物は、パイナップルで2本、その他の17種では1本だった。

0063

これらの結果から、配列番号1と2と3のプライマー・プローブセットを用いたPCRは、食品に用いられる動物種の配列から、それぞれ予想された長さの増幅産物が得られることが示された。また、一部の食品に用いられる植物でも標的増幅産物と同じ位置に増幅産物が得られることが示された。

0064

実施例2:標的増幅産物の塩基配列解析による生物種の推定
実施例1に示したPCRで得られたウシDNA由来の標的増幅産物の塩基配列を、ダイレクトシーケンス法により確認した。

0065

ダイレクトシーケンスした塩基配列データをGenBanknucleotide sequence databaseとBLASTsearchによって比較解析し、その塩基配列の類似性に基づいて、増幅されたDNA断片の生物種を推定した。

0066

その結果、得られた塩基配列はウシの28SrRNA遺伝子領域の塩基配列(Accession No. AY639443)における配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号2に示す塩基配列からなるリバースプライマーとに挟まれる領域と一致した。このことから、本発明のプライマーを用いたPCRで得られた目的の長さの増幅産物の塩基配列を解析することで、その生物種を推定できることが示された。

0067

実施例3:動物共通PCRプライマー・PNAプローブセットの、分析環境から混入するDNA、ヒトDNAに対する特異性評価
(1)試料の調製、PCRと標的増幅産物の確認
ヒトDNAは、試薬メーカー3社(Novagen、Biochain、GenScript)からそれぞれ1種類ずつ精製済みDNA溶液を購入した。これらのDNA溶液を用い、それぞれ滅菌水を用いて20 ng/μLから10倍ずつ20 pg/μL(103倍)まで段階希釈したDNA試料液を作製した。

0068

また、ヒト唾液を、滅菌超純水を用いて10倍ずつ106倍まで段階希釈した液を作製した。

0069

これらのDNA試料液、または滅菌超純水2.5 μLについて、それぞれ実施例1に記載の、本発明によるPCR(PNAプローブを含むPCR)、または、実施例1に記載した反応液組成のうちPNAプローブの代わりに滅菌超純水を用いたPCR(PNAプローブを含まないPCR)を行った。PCR後の反応液について、実施例1と同様にしてPCR増幅産物の有無および断片長の確認を行った。

0070

(2)分析環境から混入するDNAに対する排他性の評価結果
DNA溶液の代わりに滅菌超純水を添加した、PNAプローブを含むPCR反応液を、蓋を開けたまま1時間分析環境に放置後、PCRを行う実験を20反応液×3回行ったが、計60反応液のいずれからも何の増幅産物も得られなかった(データ省略)。

0071

(3) ヒトDNAに対する排他性の評価結果
試薬メーカー3社から購入した3種類のヒトDNAをそれぞれ鋳型として、PNAプローブを含むPCRを行った結果、Novagen、GenScriptから購入したヒトDNAで50 ngからの増幅を完全に阻害した(図3)。Biochainから購入したヒトDNAで5 ng、50 ngからそれぞれごく薄い標的増幅産物が得られたものの、この増幅産物はGenBankデータベース中のラット配列(Accession No. AY739179)と一致したことから、原因はラット由来DNAの微量の混入だと推測した。

0072

ヒト唾液の段階希釈液をDNA試料液に用い、PNAプローブを含まないPCRを行った結果、希釈無し、10倍、102倍、103倍希釈液でそれぞれ標的増幅産物が得られた。一方、PNAプローブを含むPCRを行った結果、いずれの希釈液からも増幅産物は得られなかった。

0073

これらの結果から、配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号2に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのプライマーペアを用いたPCRに、配列番号3に示す塩基配列からなるPNAプローブを添加することによって、ヒトDNAを増幅しないことが示された。

0074

実施例4:動物共通PCRプライマー・PNAプローブセットの、市販動物含有加工食品中の動物由来DNAのPCR増幅
(1)試料の調製、PCRと標的増幅産物の確認
ランチョンミートウインナーソーセージ牛肉味付、やきとり(たれ味)、白湯スープの素、アンチョビソース、いか味付、いわし油漬、さんま塩焼、スパゲッティ用調味料、とりささみ水煮、貝柱水煮、乾燥スープコンソメ)、中華だし、風味調味料(かつお)、風味かまぼこ(タラ100%と表示)、コンビーフ(牛肉)、まぐろ水煮、ずわいがにほぐしみ、あさり水煮、オイスターソースナンプラーは市場から購入した。DNA試料液は、Genomic-tip 20/Gを用い、非特許文献1に記載された方法、または、Genomic-tip 100/Gを用い、Genomic DNA Handbook (QIAGEN) のTissueに記載された方法に従って抽出し取得した。

0075

取得したDNAは、PCRに供するために、分光光度計で波長260nmにおける吸光度を測定した結果から濃度を測定し、20ng/μLに滅菌超純水で希釈した。

0076

これらのDNA試料液2.5 μLについて、それぞれ実施例1に記載のPCRを行った。PCR後の反応液について、実施例1と同様にしてPCR増幅産物の有無および断片長の確認を行った。

0077

DNA試料液中のPCRを阻害する夾雑物の有無の判定は、上記のようにして調製した各DNA試料液2.5 μLについて、それぞれ大豆DNA 5 pgを添加した植物DNA検出法(非特許文献1)で標的増幅産物を確認できたかによって行った。

0078

動物のうち、畜肉、軟体類、甲殻類をそれぞれ含む市販品を用いて増幅の有無の評価を行った。

0079

図4に示すように、動物を含む市販品のうち、PCR阻害が見られた4品(図4中、下線で示すアンチョビーソース、中華だし、オイスターソース、ナンプラー)以外は全て標的増幅産物が見られた。タラ100%と表示された風味かまぼこも標的増幅産物が見られた。従って、動物を含む市販品でPCR増幅可能と考えた。

0080

比較例1
配列番号1の5’末端側の6塩基上流に設計した配列番号4に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示す塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号3に示す塩基配列からなるプローブとのセットを用いて、実施例3と同様にヒトDNAを鋳型としてPCRを行った結果、ヒトDNAからの増幅産物が得られた。したがって、本研究の目的とする動物共通PCRプライマー・PNAプローブセットとして配列番号4、2、3のセットは不適当と考えた。
配列番号4: 5’-ccatctagtagctggttccct-3’

実施例

0081

比較例2
配列番号3に示す塩基配列のN末端側の4塩基を欠いた配列番号5に示す塩基配列からなるプローブと、配列番号1に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマー・プローブセットを用いて、実施例3と同様にヒトDNAを鋳型としてPCRを行った結果、ヒトDNAからの増幅産物が得られた。したがって、本研究の目的とする動物共通PCRプライマー・PNAプローブセットとして配列番号1、2、5のセットは不適当と考えた。
配列番号5: H2N-ccgacgcacccccgc-CONH2

0082

配列番号1:プライマー
配列番号2:プライマー
配列番号3:人工的に合成されたペプチド核酸(PNA)プローブ
配列番号4:プライマー
配列番号5:人工的に合成されたペプチド核酸(PNA)プローブ

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