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技術 染色体安定化に関する遺伝子を標的とする癌細胞特異的アポトーシス誘導剤

出願人 株式会社ジーンケア研究所
発明者 高木基樹二見和伸嶋本顕古市泰宏
出願日 2012年3月2日 (8年5ヶ月経過) 出願番号 2012-046652
公開日 2012年7月12日 (8年0ヶ月経過) 公開番号 2012-131818
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析 特有な方法による材料の調査、分析 突然変異または遺伝子工学 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 架橋結合体 リラクシング オーバーハング部分 NDC メチル基転移反応 学術的 ランダムインテグレーション HIP
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重要な関連分野

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図面 (20)

課題

解決手段

染色体の安定化に関連する遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物。この化合物は、染色体の安定化に関連する種々の遺伝子について、該遺伝子の発現を抑制することにより、癌細胞特異的にアポトーシス誘導し、細胞増殖を抑制する。

概要

背景

細胞においては、種々の機能(遺伝子)の働きによって、染色体が安定に保たれている。この染色体の安定化に寄与する、細胞における代表的な機能(遺伝子)としては、例えば、以下のようなものを挙げることができる。

(a)ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子
ヒト染色体不安定性疾患の患者由来細胞では、染色体の切断・欠失転座・異数化が見られ、またこれら疾患の患者由来細胞はDNA損傷を引き起こす薬剤に対して感受性を示すなど、染色体の不安定化が生じていることから、ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子は染色体安定化に関与している。

(b)染色体DNAの複製開始、複製フォークの進行を含む染色体DNA複製反応
染色体DNA複製反応は細胞が増殖する時に、染色体DNAを複製する役割を担っており、1個の細胞が2個に分裂する際に正確に染色体を2倍に複製して染色体数を維持する機能をもつ。

(c)DNA損傷チェックポイント
DNA損傷チェックポイントは、細胞周期G1期、S期、G2期M期の各ステージから次のステージへ移行する際に、染色体に切断・化学修飾架橋を含むDNA損傷をチェックする役割を担っており、次の細胞周期のステージへ移行する前に染色体上のDNA損傷を取り除く機能をもつ。

(d)姉妹染色分体凝集・分離
姉妹染色分体凝集・分離は、体細胞において複製を終えた姉妹染色分体を娘細胞に正確に分離する役割を担っている。

(e)塩基除去修復
塩基除去修復は、染色体DNA中の塩基に酸化メチル化を含む化学修飾損傷が生じた場合に、修飾された塩基を取り除く役割を担っている。

(f)ミスマッチ除去修復
ミスマッチ除去修復は、染色体DNA中の正しい塩基対G−CとA−T以外のミスマッチ塩基対を認識して、正しい塩基対に修復する役割を担っている。

(g)ヌクレオチド除去修復
ヌクレオチド除去修復は、紫外線照射によって染色体DNA中に生じる、シクロブタンピリミジン量体や6−4光産物、またシスプラチンによって染色体DNA中の隣り合った塩基の間で生じる、DNA鎖内架橋などの損傷を認識して、損傷部を除去して修復する役割を担っている。

(h)相同組換え修復
相同組換え修復は、塩基除去修復、ミスマッチ除去修復、ヌクレオチド除去修復などの修復機構不完全で生じたDNA損傷、また染色体DNA中に生じた切断、ギャップなどを含む様々なDNA損傷を、損傷をもたない相同染色体鋳型として修復する役割を担っている。

(i)非相同末端結合修復(非相同組換え修復
非相同末端結合修復(非相同組換え修復)は、染色体DNA中に生じた二重鎖切断末端を結合して修復する役割を担っている。

(j)二本鎖DNA切断修復
二本鎖DNA切断修復は、染色体DNA中に生じた二重鎖切断を修復する役割を担っており、相同組換え修復や非相同末端結合修復(非相同組換え修復)がこの修復機構に含まれる。

(k)DNA複製後修復(DNA損傷トレランス
DNA複製後修復(DNA損傷トレランス)は、損傷をもつ染色体DNAが複製される場合に、損傷が存在するDNA鎖の複製を可能にする機構で、残されたDNA損傷は複製後に修復される。

(l)DNA架橋損傷修復
DNA架橋損傷修復は、シスプラチンなどの架橋剤によって生じた、染色体内染色体間におけるDNA架橋損傷を修復する役割を担っている。

(m)DNA−タンパク質架橋損傷修復
DNA−タンパク質架橋損傷修復は、DNA修復反応中間体である酵素タンパク質−DNAの共有結合体が形成された場合、また、染色体DNA中の塩基とタンパク質の架橋結合が形成された場合に、共有結合体や架橋結合体を除去する役割を担っている。

(n)DNAポリメラーゼ
DNAポリメラーゼは、複製、組換え、修復などの染色体安定化機構において、DNA合成反応を行う役割を担っている。

(o)ヌクレアーゼ
ヌクレアーゼは、複製、組換え、修復などの染色体安定化機構において、DNA分解反応を行う役割を担っている。

(p)ヌクレオチド浄化
ヌクレオチド浄化は、DNA合成反応の基質となるヌクレオチド中の塩基に酸化やメチル化を含む化学修飾損傷が生じた場合に、修飾された塩基を取り除く役割を担っている。

(q)クロマチン構造維持
クロマチン構造維持は、染色体の高次構造を介した複製、組換え、修復などの染色体安定化機構に働く。

(r)テロメア構造維持
テロメア構造維持は、染色体末端テロメア長の制御、テロメア領域の特殊な高次構造の形成・維持を介して、染色体安定化に重要な役割を担っている。

また、上記の機能に関連する種々の遺伝子について、染色体の安定化に関与することが報告されている。例えば、染色体の安定化に関与する種々の遺伝子について、様々な知見が報告されている(非特許文献1〜83参照)。
しかしながら、染色体の安定化に関与する上述の機能(遺伝子)と、癌細胞特異的アポトーシス誘導との関連は、これまでのところ知られていなかった。

概要

癌細胞特異的なアポトーシス誘導剤の提供。染色体の安定化に関連する遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物。この化合物は、染色体の安定化に関連する種々の遺伝子について、該遺伝子の発現を抑制することにより、癌細胞特異的にアポトーシス誘導し、細胞増殖を抑制する。なし

目的

本発明は、癌細胞特異的なアポトーシス誘導剤の提供を課題とする

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

請求項2

染色体の安定化の阻害が、以下の(a)〜(r)のいずれかの機能を阻害することによる、請求項1に記載のアポトーシス誘導剤。(a)ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子(b)染色体DNAの複製開始、複製フォークの進行を含む染色体DNA複製反応(c)DNA損傷チェックポイント(d)姉妹染色分体凝集・分離(e)塩基除去修復(f)ミスマッチ除去修復(g)ヌクレオチド除去修復(h)相同組換え修復(i)非相同末端結合修復(非相同組換え修復)(j)二本鎖DNA切断修復(k)DNA複製後修復(DNA損傷トレランス)(l)DNA架橋損傷修復(m)DNA−タンパク質架橋損傷修復(n)DNAポリメラーゼ(o)ヌクレアーゼ(p)ヌクレオチド浄化(q)クロマチン構造維持(r)テロメア構造維持

請求項3

請求項2の(a)〜(r)のいずれかの機能に関与する遺伝子の発現を阻害する化合物を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤。

請求項4

以下のいずれかの遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤。APE2、ATR、BRCA1、Chk1、Cdc5、Cdc6、Cdc7、Cdc45、Cdt1、CSA、CSB、Ctf18、DDB1、DDB2、DNA2、DUT、Elg1、EndoV、Esp1、Exonuclease1、FBH1、FEN1、Geminin、Hus1、KNTC2 (NDC80)、Ku80、Ligase1、Mad2、MBD4、Mcm3、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Mcm8、Mcm10、MGMT、MLH3、Mms4、MPGMSH2、Mus81、NBS1、NEIL2、NEIL3、NTH1、Orc1、Orc3、PARP1、PCNA、Pif1、PMS1、PMS2、PNK、Pola p180、Pola p70、Pola Spp1(Prim2a)、Polb、Pold p125、Pole Dpb3、Pole Dpb4、Pole Pol2、Poli、Poll、Polm、Psf1、Psf2、Psf3、Rad1、Rad18、Rad23A、Rad23B、Rad51、Rad51D、Rad54、Rad6A、RPA34、RPA70、Scc1、Scc3、Sir2、SIRT1 (Sirtuin)、TDG、TDP1、TIMELESS、Tin2、Topoisomerase I、Topoisomerase IIIa、Topoisomerase IIIb、Ubc13、UNG、XAB2、XPC、XPF、XPG、Xrcc2、XRCC4

請求項5

請求項4に記載の各遺伝子の塩基配列が、配列番号:1〜637、810〜908に記載の塩基配列からなる群より選択される、請求項4に記載のアポトーシス誘導剤。

請求項6

請求項4に記載のいずれかの遺伝子の発現を抑制する化合物が、該遺伝子に対してRNAi効果を有する二本鎖RNAである、請求項4に記載のアポトーシス誘導剤。

請求項7

二本鎖RNAが、請求項4に記載のいずれかの遺伝子のmRNAにおける連続する任意の20〜30塩基と相同な配列からなるセンスRNAおよび該センスRNAに相補的な配列からなるアンチセンスRNAからなる二本鎖RNAである、請求項6に記載のアポトーシス誘導剤。

請求項8

請求項4に記載のいずれかの遺伝子に対してRNAi効果を有する二本鎖RNAを発現し得るDNAを有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤。

請求項9

請求項4に記載のいずれかの遺伝子の発現を抑制する化合物が以下の(a)または(b)である、請求項4に記載のアポトーシス誘導剤。(a)前記遺伝子の転写産物、またはその一部に対するアンチセンス核酸(b)前記遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸

請求項10

請求項4に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤。

請求項11

請求項4に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物が、以下の(a)〜(c)のいずれかの化合物である、請求項10に記載のアポトーシス誘導剤。(a)前記遺伝子によってコードされるタンパク質に対してドミナントネガティブ性質を有する変異体タンパク質(b)前記遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体(c)前記遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する低分子化合物

請求項12

請求項1〜11のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤を有効成分とする、抗癌剤

請求項13

以下の(a)〜(c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法。(a)請求項4に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチド被検化合物を接触させる工程(b)前記タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合活性を測定する工程(c)前記遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと結合する化合物を選択する工程

請求項14

以下の(a)〜(c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法。(a)請求項4に記載のいずれかの遺伝子を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程(b)前記遺伝子の発現レベルを測定する工程(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程

請求項15

以下の(a)〜(c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法。(a)請求項4に記載のいずれかの遺伝子の転写調節領域レポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを低下させる化合物を選択する工程

請求項16

以下の(a)〜(c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法。(a)請求項4に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程(b)前記タンパク質の活性を測定する工程(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活性を低下させる化合物を選択する工程

請求項17

以下の工程(a)および(b)を含む、請求項4または10に記載のアポトーシス誘導剤を医薬組成物として製造する方法。(a)請求項13〜16のいずれかに記載の方法によって、化合物をスクリーニングする工程(b)該化合物を薬学上許容される担体と混合する工程

技術分野

0001

本発明は、染色体の安定化に関与する遺伝子を標的とする癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、および該アポトーシス誘導剤スクリーニング方法に関する。

背景技術

0002

細胞においては、種々の機能(遺伝子)の働きによって、染色体が安定に保たれている。この染色体の安定化に寄与する、細胞における代表的な機能(遺伝子)としては、例えば、以下のようなものを挙げることができる。

0003

(a)ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子
ヒト染色体不安定性疾患の患者由来細胞では、染色体の切断・欠失転座・異数化が見られ、またこれら疾患の患者由来細胞はDNA損傷を引き起こす薬剤に対して感受性を示すなど、染色体の不安定化が生じていることから、ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子は染色体安定化に関与している。

0004

(b)染色体DNAの複製開始、複製フォークの進行を含む染色体DNA複製反応
染色体DNA複製反応は細胞が増殖する時に、染色体DNAを複製する役割を担っており、1個の細胞が2個に分裂する際に正確に染色体を2倍に複製して染色体数を維持する機能をもつ。

0005

(c)DNA損傷チェックポイント
DNA損傷チェックポイントは、細胞周期G1期、S期、G2期M期の各ステージから次のステージへ移行する際に、染色体に切断・化学修飾架橋を含むDNA損傷をチェックする役割を担っており、次の細胞周期のステージへ移行する前に染色体上のDNA損傷を取り除く機能をもつ。

0006

(d)姉妹染色分体凝集・分離
姉妹染色分体凝集・分離は、体細胞において複製を終えた姉妹染色分体を娘細胞に正確に分離する役割を担っている。

0007

(e)塩基除去修復
塩基除去修復は、染色体DNA中の塩基に酸化メチル化を含む化学修飾損傷が生じた場合に、修飾された塩基を取り除く役割を担っている。

0008

(f)ミスマッチ除去修復
ミスマッチ除去修復は、染色体DNA中の正しい塩基対G−CとA−T以外のミスマッチ塩基対を認識して、正しい塩基対に修復する役割を担っている。

0009

(g)ヌクレオチド除去修復
ヌクレオチド除去修復は、紫外線照射によって染色体DNA中に生じる、シクロブタンピリミジン量体や6−4光産物、またシスプラチンによって染色体DNA中の隣り合った塩基の間で生じる、DNA鎖内架橋などの損傷を認識して、損傷部を除去して修復する役割を担っている。

0010

(h)相同組換え修復
相同組換え修復は、塩基除去修復、ミスマッチ除去修復、ヌクレオチド除去修復などの修復機構不完全で生じたDNA損傷、また染色体DNA中に生じた切断、ギャップなどを含む様々なDNA損傷を、損傷をもたない相同染色体鋳型として修復する役割を担っている。

0011

(i)非相同末端結合修復(非相同組換え修復
非相同末端結合修復(非相同組換え修復)は、染色体DNA中に生じた二重鎖切断末端を結合して修復する役割を担っている。

0012

(j)二本鎖DNA切断修復
二本鎖DNA切断修復は、染色体DNA中に生じた二重鎖切断を修復する役割を担っており、相同組換え修復や非相同末端結合修復(非相同組換え修復)がこの修復機構に含まれる。

0013

(k)DNA複製後修復(DNA損傷トレランス
DNA複製後修復(DNA損傷トレランス)は、損傷をもつ染色体DNAが複製される場合に、損傷が存在するDNA鎖の複製を可能にする機構で、残されたDNA損傷は複製後に修復される。

0014

(l)DNA架橋損傷修復
DNA架橋損傷修復は、シスプラチンなどの架橋剤によって生じた、染色体内染色体間におけるDNA架橋損傷を修復する役割を担っている。

0015

(m)DNA−タンパク質架橋損傷修復
DNA−タンパク質架橋損傷修復は、DNA修復反応中間体である酵素タンパク質−DNAの共有結合体が形成された場合、また、染色体DNA中の塩基とタンパク質の架橋結合が形成された場合に、共有結合体や架橋結合体を除去する役割を担っている。

0016

(n)DNAポリメラーゼ
DNAポリメラーゼは、複製、組換え、修復などの染色体安定化機構において、DNA合成反応を行う役割を担っている。

0017

(o)ヌクレアーゼ
ヌクレアーゼは、複製、組換え、修復などの染色体安定化機構において、DNA分解反応を行う役割を担っている。

0018

(p)ヌクレオチド浄化
ヌクレオチド浄化は、DNA合成反応の基質となるヌクレオチド中の塩基に酸化やメチル化を含む化学修飾損傷が生じた場合に、修飾された塩基を取り除く役割を担っている。

0019

(q)クロマチン構造維持
クロマチン構造維持は、染色体の高次構造を介した複製、組換え、修復などの染色体安定化機構に働く。

0020

(r)テロメア構造維持
テロメア構造維持は、染色体末端テロメア長の制御、テロメア領域の特殊な高次構造の形成・維持を介して、染色体安定化に重要な役割を担っている。

0021

また、上記の機能に関連する種々の遺伝子について、染色体の安定化に関与することが報告されている。例えば、染色体の安定化に関与する種々の遺伝子について、様々な知見が報告されている(非特許文献1〜83参照)。
しかしながら、染色体の安定化に関与する上述の機能(遺伝子)と、癌細胞特異的アポトーシス誘導との関連は、これまでのところ知られていなかった。

先行技術

0022

Wood, R.D., Mitchell, M., Sgourou, J. and Lindahl, T. (2001). Human DNA repair genes Science, 291, 1284-1289.
Nyberg, K.A., Michelson, R.J., Putnam, C.W. and Weinert, T.A. (2002). Toward maintaining the genome: DNA damage and replication checkpoints Annu.Rev.Genet. 36, 617-656.
Sogo, J.M., Lopes, M. and Foiani, M. (2002). Fork reversal and ssDNA accumulation at stalled replication forks owing to checkpoint defects Science, 297, 599-602.
Casper, A.M., Ngheim, P., Arlt, M.F. and Glover, T.W. (2002).ATRregulates fragile site stability Cell, 111, 779-789.
Zhou, B.-B.S. and Bartek, J. (2004). Targeting the checkpoint kinases: chemosensitization versus chemoprotection Nature Review, 4, 1-10.
Rich, T., Allen, R. and Wyllie, A.H. (2000). Defying death after DNA damage Nature, 407, 777-783.
Nigg, E.A. (2002). Centrosome aberrations:cause or consequence of cancer progression Nature Review, 2, 815-825.
Miller, H. and Grollman, A.P. (2003). DNA repair investigations using siRNA DNA repair, 2, 759-763.
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発明が解決しようとする課題

0023

本発明は、癌細胞特異的なアポトーシス誘導剤の提供を課題とする。より詳しくは、染色体の安定化を阻害する化合物、染色体の安定化に関与する遺伝子の発現を阻害する化合物、または、該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を阻害する化合物を有効成分とする癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、並びに該アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。さらに、アポトーシス誘導剤を医薬組成物として製造する方法の提供を課題とする。

課題を解決するための手段

0024

本発明者らは上記の課題を解決すべく、細胞において染色体の安定化に関連する種々の機能について、該機能の異常によってアポトーシスが癌細胞特異的に誘導されるか否かについての検討を行った。細胞における染色体の安定化に関連する機能としては、染色体の安定化に深く関与する以下の機能を選択した。(a)ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子、(b)染色体DNAの複製開始、複製フォークの進行を含む染色体DNA複製反応、(c)DNA損傷チェックポイント、(d)姉妹染色分体凝集・分離、(e)塩基除去修復、(f)ミスマッチ除去修復、(g)ヌクレオチド除去修復、(h)相同組換え修復、(i)非相同末端結合修復(非相同組換え修復)、(j)二本鎖DNA切断修復、(k)DNA複製後修復(DNA損傷トレランス)、(l)DNA架橋損傷修復、(m)DNA−タンパク質架橋損傷修復、(n)DNAポリメラーゼ、(o)ヌクレアーゼ、(p)ヌクレオチド浄化、(q)クロマチン構造維持、(r)テロメア構造維持。

0025

本発明者らは、上記の各種機能に関与する種々の遺伝子について、該遺伝子の発現抑制効果を有するsiRNAを用いて、該遺伝子の癌細胞におけるアポトーシス誘導効果を検討した。その結果、前記の各機能に関与する複数の遺伝子について、その発現を抑制することにより、癌細胞においてアポトーシスが誘導され、細胞増殖の抑制が引き起こされることを見出した。さらに本発明者らは、該遺伝子の発現を抑制しても、正常細胞(野生型細胞)についてはアポトーシスの誘導が起こらないことを初めて見出した。該遺伝子は、非常に優れた副作用の少ない抗癌剤制癌剤)のターゲット分子と考えられる。

0026

上述の結果から、上記の各種機能に関与する遺伝子の発現を抑制することにより、アポトーシスを誘導することが可能であることが示された。また、該遺伝子は、上記の各種機能に深く関与しており、通常、該遺伝子の発現が抑制されることにより、上記機能は細胞において正常に働かなくなる。従って、本発明者らによって見出された上記知見は、とりもなおさず、上記の各種機能の異常によって、癌細胞特異的にアポトーシスが誘導されることを示すものである。よって、上記の各種機能を阻害させる化合物は、癌細胞特異的なアポトーシス誘導作用を有するものと考えられる。

0027

さらに、上記の各種機能の異常により、染色体が不安定化することが知られている。従って、細胞における染色体の不安定化が、癌細胞特異的なアポトーシス誘導の引き金となっていることが考えられる。即ち、細胞における染色体安定化を阻害する化合物、あるいは、染色体安定化に関与する遺伝子の機能を阻害する化合物は、癌細胞特異的なアポトーシス誘導剤となることが期待される。

0028

本発明は、染色体の安定化を阻害する化合物、染色体の安定化に関与する遺伝子の発現を阻害する化合物、または、該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を阻害する化合物を有効成分とする癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、並びに該アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法に関し、より詳しくは、
〔1〕 染色体の安定化を阻害する化合物を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、
〔2〕 染色体の安定化の阻害が、以下の(a)〜(r)のいずれかの機能を阻害することによる、〔1〕に記載のアポトーシス誘導剤、
(a)ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子
(b)染色体DNAの複製開始、複製フォークの進行を含む染色体DNA複製反応
(c)DNA損傷チェックポイント
(d)姉妹染色分体凝集・分離
(e)塩基除去修復
(f)ミスマッチ除去修復
(g)ヌクレオチド除去修復
(h)相同組換え修復
(i)非相同末端結合修復(非相同組換え修復)
(j)二本鎖DNA切断修復
(k)DNA複製後修復(DNA損傷トレランス)
(l)DNA架橋損傷修復
(m)DNA−タンパク質架橋損傷修復
(n)DNAポリメラーゼ
(o)ヌクレアーゼ
(p)ヌクレオチド浄化
(q)クロマチン構造維持
(r)テロメア構造維持
〔3〕 〔2〕の(a)〜(r)のいずれかの機能に関与する遺伝子の発現を阻害する化合物を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、
〔4〕 以下のいずれかに記載の遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、
APE2、ATR、BRCA1、Chk1、Cdc5、Cdc6、Cdc7、Cdc45、Cdt1、CSA、CSB、Ctf18、DDB1、DDB2、DNA2、DUT、Elg1、EndoV、Esp1、Exonuclease1、FBH1、FEN1、Geminin、Hus1、KNTC2 (NDC80)、Ku80、Ligase1、Mad2、MBD4、Mcm3、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Mcm8、Mcm10、MGMT、MLH3、Mms4、MPG、MSH2、Mus81、NBS1、NEIL2、NEIL3、NTH1、Orc1、Orc3、PARP1、PCNA、Pif1、PMS1、PMS2、PNK、Pola p180、Pola p70、Pola Spp1(Prim2a)、Polb、Pold p125、Pole Dpb3、Pole Dpb4、Pole Pol2、Poli、Poll、Polm、Psf1、Psf2、Psf3、Rad1、Rad18、Rad23A、Rad23B、Rad51、Rad51D、Rad54、Rad6A、RPA34、RPA70、Scc1、Scc3、Sir2、SIRT1 (Sirtuin)、TDG、TDP1、TIMELESS、Tin2、Topoisomerase I、Topoisomerase IIIa、Topoisomerase IIIb、Ubc13、UNG、XAB2、XPC、XPF、XPG、Xrcc2、XRCC4
〔5〕 〔4〕に記載の各遺伝子の塩基配列が、配列番号:1〜637、810〜908に記載の塩基配列からなる群より選択される、〔4〕に記載のアポトーシス誘導剤、
〔6〕 〔4〕に記載のいずれかの遺伝子の発現を抑制する化合物が、該遺伝子に対してRNAi効果を有する二本鎖RNA(siRNA)である、〔4〕に記載のアポトーシス誘導剤、
〔7〕 二本鎖RNAが、〔4〕に記載のいずれかの遺伝子のmRNAにおける連続する任意の20〜30塩基と相同な配列からなるセンスRNAおよび該センスRNAに相補的な配列からなるアンチセンスRNAからなる二本鎖RNAである、〔6〕に記載のアポトーシス誘導剤、
〔7b〕 RNAi効果を有する二本鎖RNAが、該二本鎖の一方の鎖が配列番号:724〜809(ただし、該配列において、末端のTTを除いた領域が二本鎖の一方の鎖を構成する)、または974〜1063のいずれかに記載の塩基配列であり、他方の鎖が該塩基配列と相補的な塩基配列であることを特徴とする二本鎖RNAである、〔6〕に記載のアポトーシス誘導剤、
〔7c〕 RNAi効果を有する二本鎖RNAが、該二本鎖の一方の鎖が配列番号:724〜809(ただし、該配列において、末端のTTを除いた領域が二本鎖の一方の鎖を構成する)、または974〜1063のいずれかに記載の塩基配列において1もしくは少数の塩基が付加、欠失、置換された塩基配列であり、他方の鎖が該塩基配列と相補的な塩基配列であることを特徴とする二本鎖RNAであって、上記〔4〕に記載のいずれかの遺伝子の発現を抑制する機能を有する二本鎖RNAである、〔6〕に記載のアポトーシス誘導剤、
〔7d〕 前記二本鎖RNAの一方の末端が閉じた構造である(ヘアピンを形成する)分子を有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、
〔8〕 〔4〕に記載のいずれかの遺伝子に対してRNAi効果を有する二本鎖RNAを発現し得るDNAを有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、
〔9〕 〔4〕に記載のいずれかの遺伝子の発現を抑制する化合物が以下の(a)または(b)である、〔4〕に記載のアポトーシス誘導剤、
(a)前記遺伝子の転写産物、またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)前記遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
〔10〕 〔4〕に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、
〔11〕 〔4〕に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物が、以下の(a)〜(c)のいずれかの化合物である、〔10〕に記載のアポトーシス誘導剤、
(a)前記遺伝子によってコードされるタンパク質に対してドミナントネガティブ性質を有する変異体タンパク質
(b)前記遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体
(c)前記遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する低分子化合物
〔12〕 〔1〕〜〔11〕のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤を有効成分とする、抗癌剤、
〔13〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法、
(a)〔4〕に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチド被検化合物を接触させる工程
(b)前記タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合活性を測定する工程
(c)前記遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと結合する化合物を選択する工程
〔14〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法、
(a)〔4〕に記載のいずれかの遺伝子を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔15〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法、
(a)〔4〕に記載のいずれかの遺伝子の転写調節領域レポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔16〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法、
(a)〔4〕に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記タンパク質の活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活性を低下させる化合物を選択する工程
〔17〕 以下の工程(a)および(b)を含む、〔4〕または〔10〕に記載のアポトーシス誘導剤を医薬組成物として製造する方法、
(a)〔13〕〜〔16〕のいずれかに記載の方法によって、化合物をスクリーニングする工程
(b)該化合物を薬学上許容される担体と混合する工程、を提供するものである。
また、本発明の具体的な一態様においては、配列番号:724〜809、974〜1063のいずれかに記載の塩基配列を該二本鎖RNAの一方の鎖とするsiRNA分子(配列番号:724〜809、974〜1063のいずれかに記載の塩基配列と、その相補鎖からなるsiRNA分子)を有効成分として含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、
〔18〕対象細胞へ、上記のいずれかのアポトーシス誘導剤を投与する(接触させる)工程を含む、該細胞のアポトーシスを誘導する方法、
〔19〕 上記のアポトーシス誘導剤もしくは上記の抗癌剤を個体(癌患者等)へ投与する工程を含む、癌の治療方法
〔20〕 染色体の安定化を阻害する化合物(例えば、上記〔4〕に記載のいずれかの遺伝子の発現、または該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物)のアポトーシス誘導剤の製造における使用、
〔21〕 上記のアポトーシス誘導剤の抗癌剤の製造における使用、
を提供する。

図面の簡単な説明

0029

図1は、実施例にて用いた遺伝子名、アクセッション番号(Accession no.)、siRNA配列、配列番号、HeLa細胞における遺伝子発現抑制、MTTアッセイ(HeLa細胞)、Tunel法の結果、TIG3細胞における遺伝子発現抑制、MTTアッセイ(TIG3細胞)を示す。「HeLa細胞における遺伝子発現抑制」の列は、各遺伝子に対するsiRNAをそれぞれHeLa細胞に導入し、導入48時間後の各mRNAの発現をTaqmanPCRにより定量した結果を示す。「MTTアッセイ(HeLa細胞)」の列は、各遺伝子に対するsiRNAをHeLa細胞に導入し、導入4日後の細胞生存率をMTTアッセイで調べた結果を示す。「Tunel法」の列は、染色が認められた場合、即ちアポトーシス陽性の場合をYESと表示した。「TIG3細胞における遺伝子発現抑制」の列は、各遺伝子に対するsiRNAをTIG3細胞に導入し、72時間後のmRNAの発現をTaqman PCRにより定量した結果を示す。NDは検出不能を示す。「MTTアッセイ(TIG3細胞)」の列は、各遺伝子に対するsiRNAをそれぞれTIG3細胞に導入し、4日後の細胞生存率をMTTアッセイで調べた結果を示す。 なお、遺伝子はそれぞれの有する機能によって分別した。
図2は、図1続きの図である。
図3は、図2の続きの図である。
図4は、図3の続きの図である。
図5は、HeLa細胞における各遺伝子のmRNA発現の抑制によるアポトーシスの誘導を示す写真である。各遺伝子に対するsiRNAをそれぞれHeLa細胞に導入し、TUNEL法を用いて導入48時間後のHeLa細胞におけるアポトーシス誘導を検討した結果を示す。各図左の緑色(モノクロ図面を掲載)はアポトーシスが誘導された核を、各図右は視野に存在する細胞の核を示す。
図6図5の続きの写真である。
図7図6の続きの写真である。
図8図7の続きの写真である。
図9図8の続きの写真である。
図10は、anti-ssDNA抗体を用いて染色体DNA中の一本鎖DNA露出した領域を免疫染色した結果を示す写真である。1遺伝子に対し、3枚組みの写真を示す。左からanti-ssDNA像、核染色像、重ね合わせ像である。
図11は、図10の続きの図である。
図12は、図11の続きの図である。
図13は、図12の続きの図である。
図14は、図13の続きの図である。
図15は、図14の続きの図である。
図16は、図15の続きの図である。
図17は、図16の続きの図である。
図18は、図17の続きの図である。
図19は、図18の続きの図である。
図20は、図19の続きの図である。
図21は、図20の続きの図である。
図22は、図21の続きの図である。
図23は、図22の続きの図である。
図24は、図23の続きの図である。
図25は、図24の続きの図である。
図26は、図25の続きの図である。
図27は、図26の続きの図である。
図28は、実施例にて用いた遺伝子名、アクセッション番号(アクセッションNo.)、その他アクセッションNo.、siRNA配列、配列番号、HeLa細胞における遺伝子発現抑制、HeLa細胞における増殖抑制、TIG3細胞における遺伝子発現抑制、TIG3細胞における増殖抑制を示す。「40nM HeLa細胞における遺伝子発現抑制」の列は、各遺伝子に対するsiRNA配列をそれぞれHeLa細胞に導入し、導入48時間後の各mRNAの発現をTaqman PCRにより定量した結果を示す。「40nM HeLa細胞における増殖抑制」の列は、各遺伝子に対するsiRNA配列をそれぞれHeLa細胞に導入し、導入4日後の細胞生存率をMTTアッセイで調べた結果を示す。「40nM TIG3細胞における遺伝子発現抑制」の列は、各遺伝子に対するsiRNAをTIG3細胞に導入し、72時間後のmRNAの発現をTaqman PCRにより定量した結果を示す。なお、図中の「**」は、“未決定(Not determined)”を表す。「40nM TIG3細胞における増殖抑制」の列は、各遺伝子に対するsiRNA配列をそれぞれTIG3細胞に導入し、導入4日後の細胞生存率をMTTアッセイで調べた結果を示す。 なお、遺伝子はそれぞれの有する機能によって分別した。
図29は、図28の続きの図である。
図30は、図29の続きの図である。
図31は、KNTC2(NDC80)遺伝子の別名、アクセッション番号(アクセッションNo.)、mRNA登録、siRNA ID、siRNA配列、配列番号、HeLa細胞におけるmRNA発現、HeLa細胞における増殖抑制、HeLa細胞におけるアポトーシス、HDF細胞におけるmRNA発現、HDF細胞における増殖抑制、HDF細胞におけるアポトーシスを示す。HeLa細胞における「mRNA発現」の列は、KNTC2(NDC80)遺伝子に対するsiRNA配列をそれぞれHeLa細胞に導入し、導入48時間後の各mRNAの発現をTaqman PCRにより定量した結果を示す。HeLa細胞における「増殖抑制」の列は、KNTC2(NDC80)遺伝子に対するsiRNA配列をそれぞれHeLa細胞に導入し、導入4日後の細胞生存率をMTTアッセイで調べた結果を示す。HeLa細胞における「アポトーシス」の列は、染色が認められた場合、即ちアポトーシス陽性の場合をYESと表示した。HDF細胞における「mRNA発現」の列は、KNTC2(NDC80)遺伝子に対するsiRNA配列をそれぞれHDF細胞に導入し、導入48時間後の各mRNAの発現をTaqman PCRにより定量した結果を示す。HDF細胞における「増殖抑制」の列は、KNTC2(NDC80)遺伝子に対するsiRNA配列をそれぞれHDF細胞に導入し、導入4日後の細胞生存率をMTTアッセイで調べた結果を示す。HDF細胞における「アポトーシス」の列は、染色が認められた場合、即ちアポトーシス陽性の場合をYESと表示した。
図32は、実施例にて用いた遺伝子名、siRNA ID、siRNA配列、配列番号、HeLa細胞におけるmRNA発現、HeLa細胞における増殖抑制、HeLa細胞におけるアポトーシス、HDF細胞におけるmRNA発現、HDF細胞における増殖抑制、HDF細胞におけるアポトーシスを示す。HeLa細胞におけるmRNA「発現」の列は、各遺伝子に対するsiRNA配列をそれぞれHeLa細胞に導入し、導入48時間後の各mRNAの発現をTaqman PCRにより定量した結果を示す。HeLa細胞における「増殖」抑制の列は、各遺伝子に対するsiRNA配列をそれぞれHeLa細胞に導入し、導入4日後の細胞生存率をMTTアッセイで調べた結果を示す。HeLa細胞における「アポトーシス」の列は、染色が認められた場合、即ちアポトーシス陽性の場合を+(プラス)と表示した。HDF細胞におけるmRNA「発現」の列は、各遺伝子に対するsiRNA配列をそれぞれHDF細胞に導入し、導入48時間後の各mRNAの発現をTaqman PCRにより定量した結果を示す。HDF細胞における「増殖」抑制の列は、各遺伝子に対するsiRNA配列をそれぞれHDF細胞に導入し、導入4日後の細胞生存率をMTTアッセイで調べた結果を示す。HDF細胞における「アポトーシス」の列は、染色が認められた場合、即ちアポトーシス陽性の場合を+(プラス)、アポトーシス陰性の場合を−(マイナス)と表示した。
図33は、HeLa細胞およびTIG3細胞におけるPif1、Mms4、TopoisomeraseIIIa、Mus81、SIRT1 (Sirtuin)、Esp1、MPG、Poll、Polm、EndoVの各遺伝子のmRNA発現の抑制によるアポトーシスの誘導を示す写真である。各遺伝子に対するsiRNAをそれぞれHeLa細胞およびTIG3細胞に導入し、TUNEL法を用いて導入48時間後のHeLa細胞および導入72時間後のTIG3細胞におけるアポトーシス誘導を検討した結果を示す。
図34は、図33の続きの写真である。
図35は、HeLa細胞およびTIG3細胞におけるKNTC2(NDC80)遺伝子のmRNA発現の抑制によるアポトーシスの誘導を示す写真である。KNTC2(NDC80)遺伝子に対するsiRNAをそれぞれHeLa細胞およびTIG3細胞に導入し、TUNEL法を用いて導入48時間後のHeLa細胞および導入72時間後のTIG3細胞におけるアポトーシス誘導を検討した結果を示す。左側の写真にはアポトーシスが誘導された核が写っている。右側の写真には視野に存在する細胞の核が写っている。
図36は、anti-ssDNA抗体を用いて染色体DNA中の一本鎖DNAが露出した領域を免疫染色した結果を示す写真である。

0030

本発明者らによって、細胞における染色体の安定化を阻害することにより、癌細胞(腫瘍細胞)において特異的にアポトーシスが誘導されることが見出された。
本発明はまず、染色体の安定化を阻害する化合物を含む、癌細胞特異的(癌細胞に対する)アポトーシス誘導剤を提供する。

0031

本発明のアポトーシス誘導剤は、癌細胞に対して選択的にアポトーシス誘導作用を有することを特徴とするものである。本発明において「癌細胞特異的」とは、正常細胞に対しては実質的なアポトーシス誘導作用を示さず、癌細胞に対して実質的にアポトーシス誘導作用を示すことを言うが、好ましくは、正常細胞に対しては、アポトーシス誘導作用が見られず、癌細胞に対してアポトーシス誘導作用を有することを言う。

0032

アポトーシスとは一般的に、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死を言う。アポトーシスの形態としては、例えば、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化細胞表層微絨毛消失細胞質の凝集等が挙げられる。従って、本発明におけるアポトーシス誘導作用とは、例えば、細胞において上記のアポトーシスの形態を誘導する作用を指すが、必ずしも、上記の形態の誘導のみに限定されるものではない。当業者においては、細胞のアポトーシス誘導が起こっているか否かについて、適宜、判断することが可能である。

0033

本発明の、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤は、例えばアポトーシス誘導作用を機序とする抗癌剤(制癌剤)となるものと考えられる。本発明のアポトーシス誘導剤は、癌細胞特異的にアポトーシスを誘導し、正常細胞にはアポトーシスが誘導されないことから、副作用の少ない、安全な抗癌剤となるものと期待される。

0034

なお、本発明における「抗癌剤」は、制癌剤と表記することも可能である。また、前記「抗癌剤」は、「抗腫瘍剤」、「抗腫瘍薬剤」または「抗腫瘍医薬組成物」等と表現される場合もある。

0035

本発明において「染色体の安定化が阻害される」とは、例えば、染色体DNA中に修復されずに残った損傷が蓄積した状態となること等を指し、具体的には、染色体DNA中に一本鎖が露出した領域が蓄積したり、二本鎖DNA切断部分が多数出現する状態を指すが、必ずしもこのような状態に限定されない。

0036

本発明における「染色体の安定化」は、例えば、細胞における以下の機能によって維持されている。従って、以下の機能を阻害することによって、染色体の安定化が阻害される。
(a)ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子
(b)染色体DNAの複製開始、複製フォークの進行を含む染色体DNA複製反応
(c)DNA損傷チェックポイント
(d)姉妹染色分体凝集・分離
(e)塩基除去修復
(f)ミスマッチ除去修復
(g)ヌクレオチド除去修復
(h)相同組換え修復
(i)非相同末端結合修復(非相同組換え修復)
(j)二本鎖DNA切断修復
(k)DNA複製後修復(DNA損傷トレランス)
(l)DNA架橋損傷修復
(m)DNA−タンパク質架橋損傷修復
(n)DNAポリメラーゼ
(o)ヌクレアーゼ
(p)ヌクレオチド浄化
(q)クロマチン構造維持
(r)テロメア構造維持

0037

本発明の好ましい態様において、染色体の安定化阻害とは、例えば、上記の(a)〜(r)のいずれかの機能を阻害することを挙げることができる。
即ち本発明の好ましい態様においては、上記(a)〜(r)のいずれかの機能を阻害する化合物を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤に関する。

0038

本発明において、上記(a)〜(r)のいずれかの機能を阻害するためには、例えば、該機能に関与する遺伝子(本明細書においては、「染色体安定化関連遺伝子」と記載する場合あり)の発現を阻害する、もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能(活性)を阻害することが挙げられる。

0039

上記の各機能に関与する遺伝子としては、例えば、以下の遺伝子を挙げることができるが、上記の各機能に関与する遺伝子であれば、特に制限されない。

0040

(a)ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子
ヒト染色体不安定性疾患としては、例えば色素性乾皮症コケイン症、ナイミーヘン症、血管拡張性失調症ファンコニ貧血症、あるいは早老症等が挙げられる。これら各疾患に関連する遺伝子を以下に記載する。
・色素性乾皮症: (a1)XPB、(a2)XPD、(a3)XPG、(a4)XPF、(a5)XPC、(a6)RAD23B、(a7)CETN2、(a8)RAD23A、(a9)ERCC1
・コケイン症: (a10)CSA、(a11)CSB、(a12)XAB
・ナイミーヘン症: (a13)NBS1
・血管拡張性失調症: (a14)ATM
・ファンコニー貧血症: (a15)FANCA、(a16)FANCC、(a17)FANCD2、(a18)FANCE、(a19)FANCF、(a20)FANCG
・早老症: (a21)WRN、(a22)BLM、(a23)RTS

0041

(b)染色体DNAの複製開始、複製フォークの進行を含む染色体DNA複製反応
(b1)Mcm10、(b2)Orc1、(b3)Orc3、(b4)Cdc6、(b5)Cdt1、(b6)Geminin、(b7)Mcm3、(b8)Mcm4、(b9)Mcm5、(b10)Mcm6、(b11)Mcm7、(b12)Mcm8、(b13)Cdc7、(b14)Cdc5、(b15)Psf1、(b16)Psf2、(b17)Psf3、(b18)Cdc45、(b19)Pola p180、(b20)Pola p70、(b21)Pola Spp1(Prim2a)、(b22)RPA70、(b23)RPA34、(b24)PCNA、(b25)Elg1、(b26)Ligase1、(b27)Pole Pol2、(b28)Pole Dpb3、(b29)Topoisomerase I、(b30)TDP1、(b31)Orc2、(b32)Orc4、(b33)Orc5、(b34)Orc6、(b35)Mcm2、(b36)Dbf4、(b37)TopBP1、(b38)Sld5、(b39)Pola Spp2、(b40)RFC1、(b41)RFC2、(b42)RFC3、(b43)RFC4、(b44)RFC5、(b45)Pif1、(b46)Pold p50、(b47)Pole Dpb2、(b48)Topoisomerase Iia、(b49)Topoisomerase Iib 、(b50)RPA14、(b51)FEN1、(b52)DNA2、(b53)Pold p125、(b54)Pold p68、(b55)Pold p12、(b56)Pole Dpb4

0042

(c)DNA損傷チェックポイント
(c1)ATR、(c2)Chk1、(c3)NBS1、(c4)Hus1、(c5)Rad1、(c11)Mad2、(c12)BubR1、(c12)ATM、(c13)Rad50、(c14)Mre11、(c15)Mdc1、(c16)53BP1、(c17)Rad17、(c22)BubR1、(c23)ATRIP、(c24)Chk2、(c25)H2AX、(c26)RFC1、(c27)RFC2、(c28)RFC3、(c29)RFC4、(c30)RFC5、(c31)ATM、(c32)BRCA1、(c33)Chk1、(c34)Chk2、(c35)14-3-3eta、(c36)14-3-3sigma、(c37)cdc25A、(c38)cdc25c、(c39)wee1、(c40)ATR、(c41)ATRIP、(c42)Rad17、(c43)RFC2、(c44)RFC3、(c45)RFC4、(c46)RFC5、(c47)HUS1、(c48)Rad1、(c49)Rad9、(c50)P53、(c51)Rad50、(c52)Mre11、(c53)NBS1、(c54)TopBP1、(c55)53BP1、(c56)H2AX

0043

(d)姉妹染色分体凝集・分離
(d1)Ctf18、(d2)Scc1、(d3)Scc3、(d4)Dcc1、(d5)Trf4-1、(d6)Trf4-2、(d7)Smc1、(d8)Smc3、(d9)Pds1(Securin)、(d10)Mad2、(d11)BubR1、(d12)Esp1

0044

(e)塩基除去修復
(e1)UNG、(e2)MBD4、(e3)TDG、(e4)NTH1、(e5)NEIL2、(e6)NEIL3、(e7)APE2、(e8)PARP1、(e9)PNK、(e10)Polb、(e11)OGG1、(e12)APE1、(e13)XRCC1、(e14)Ligase3、(e15)SMUG1、(e16)TDG、(e17)MYH、(e18)MPG、(e19)NEIL1、(e20)ADPRT、(e21)ADPRTL2、(e22)MGMT、(e23)ABH1、(e24)ABH2、(e25)ABH3

0045

(f)ミスマッチ除去修復
(f1)MSH2、(f2)PMS1、(f3)PMS2、(f4)MLH3、(f5)Exonuclease1、(f6)MSH3、(f7)MSH6、(f8)MSH5、(f9)MLH1、(f10)MSH4、(f11)PMS2L3、(f12)Trex1、(f13)Trex2、(f14)PMS2L4

0046

(g)ヌクレオチド除去修復
(g1)XPC、(g2)Rad23A、(g3)Rad23B、(g4)CSA、(g5)CSB、(g6)XPG、(g7)XPF、(g8)DDB1、(g9)DDB2、(g10)XAB2、(g11)XPB、(g12)ERCC1、(g13)XPD、(g14)XPA、(g15)DDB2、(g16)Mms19、(g17)CETN2、(g18)RPA70、(g19)RPA34、(g20)RPA14、(g21)GTF2H1、(g22)GTF2H2、(g23)GTF2H3、(g24)GTF2H4、(g25)CDK7、(g26)CCNH、(g27)MNAT1、(g28)LigaseI、(g29)CSA、(g30)CSB

0047

(h)相同組換え修復
(h1)Rad51、(h2)Rad51L1、(h3)Rad51C、(h4)Rad51L3、(h5)DMC1、(h6)XRCC2、(h7)XRCC3、(h8)Rad52、(h9)Rad54L、(h10)Rad54B、(h11)BRCA1、(h12)BRCA2、(h13)Rad50、(h14)Mre11、(h15)NBS1、(h16)TopoisomeraseIIIa、(h17)TopoisomeraseIIIb、(h18)WHIP、(h19)WRN、(h20)BLM、(h21)RecQ1、(h22)RecQ5

0048

(i)非相同末端結合修復(非相同組換え修復)
(i1)Ku70、(i2)Ku80、(i3)DNA-pk、(i4)Ligase4、(i5)XRCC4、(i6)Artemis、(i7)WRN

0049

(j)二本鎖DNA切断修復
(j1)Rad51、(j2)Rad51D、(j3)Xrcc2、(j4)Rad54、(j5)BRCA1、(j6)Ku80、(j7)XRCC4、(j8)Rad52、(j9)Rad51C、(j10)Dmc1、(j11)Rad54B、(j12)DNA-pk、(j13)Ku70、(j14)Ligase4、(j15)Rad51B、(j16)XRCC3、(j17)BRCA2、(j18)Artemis

0050

(k)DNA複製後修復(DNA損傷トレランス)
(k1)Rad6A、(k2)Rad6B、(k3)Rad18、(k4)Ubc13、(k5)FBH1

0051

(l)DNA架橋損傷修復
(l1)FANCA、(l2)FANCC、(l3)FANCD2、(l4)FANCE、(l5)FANCF、(l6)FANCG

0052

(m)DNA-タンパク質架橋損傷修復
(m1)TDP1

0053

(n)DNAポリメラーゼ
(n1)Poli、(n2)Polh、(n3)Polq、(n4)Polk、(n5)Polz(REV3)、(n6)Poll、(n7)Polm、(n8)Rev1、(n9)Polb、(n10)Polg、(n11)Pold p50、(n12)Pole Pol2、(n13)REV7、(n14)Poln、(n15)Pola P180、(n16)Pola p70、(n17)Pola Spp1、(n18)Pola Spp2、(n19)Pold p68、(n20)Pold p12、(n21)Pole Dpb2、(n22)Pole Dpb3、(n23)Pole Dpb4

0054

(o)ヌクレアーゼ
(o1)FEN1、(o2)TREX1、(o3)TREX2、(o4)Exonuclease1、(o5)SPO11、(o6)ENDOV、(o7)APE1、(o8)APE2、(o9)Mre11、(o10)Artemis

0055

(p)ヌクレオチド浄化
(p1)MTH1、(p2)DUT、(p3)p53R2

0056

(q)クロマチン構造維持
(q1)H2AX、(q2)Sir2、(q3)SIRT1 (Sirtuin)

0057

(r)テロメア構造維持
(r1)Tin2、(r2)Sir2、(r3)hTert、(r4)TRF1、(r5)TRF2、(r6)Tankyrase、(r7)Pot1、(r8)Rap1、(r9)Pif1

0058

上記(a)〜(r)の各機能に関与する遺伝子としては、好ましくは、後述の実施例に記載された遺伝子を好適に示すことができる。具体的には、以下に記載の遺伝子を挙げることができる。
APE2、ATR、BRCA1、Chk1、Cdc5、Cdc6、Cdc7、Cdc45、Cdt1、CSA、CSB、Ctf18、DDB1、DDB2、DNA2、DUT、Elg1、EndoV、Esp1、Exonuclease1、FBH1、FEN1、Geminin、Hus1、KNTC2 (NDC80)、Ku80、Ligase1、Mad2、MBD4、Mcm3、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Mcm8、Mcm10、MGMT、MLH3、Mms4、MPG、MSH2、Mus81、NBS1、NEIL2、NEIL3、NTH1、Orc1、Orc3、PARP1、PCNA、Pif1、PMS1、PMS2、PNK、Pola p180、Pola p70、Pola Spp1(Prim2a)、Polb、Pold p125、Pole Dpb3、Pole Dpb4、Pole Pol2、Poli、Poll、Polm、Psf1、Psf2、Psf3、Rad1、Rad18、Rad23A、Rad23B、Rad51、Rad51D、Rad54、Rad6A、RPA34、RPA70、Scc1、Scc3、Sir2、SIRT1 (Sirtuin)、TDG、TDP1、TIMELESS、Tin2、Topoisomerase I、Topoisomerase IIIa、Topoisomerase IIIb、Ubc13、UNG、XAB2、XPC、XPF、XPG、Xrcc2、XRCC4

0059

本発明の好ましい態様においては、染色体安定化関連遺伝子(例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子)の発現、または、該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤を提供する。

0060

本明細書において記載された遺伝子名は、広く一般的に知られた名称であることから、当業者であれば、該遺伝子の塩基配列についての情報を、遺伝子名を基に、公共の文献データベース、あるいは、遺伝子データベース(例えば、GenBank等)から、適宜取得することができる。

0061

本発明の上記のいずれかに記載の各遺伝子の塩基配列、および該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の具体例を、配列表に掲載する。上記遺伝子の配列情報が取得可能なNCBIのアクセッション番号、および該番号によって取得される遺伝子の塩基配列の配列番号との関係を表1〜16に示す。また、本発明の上記の各遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の一例についても、配列表に示す。

0062

0063

0064

0065

0066

0067

0068

0069

0070

0071

0072

0073

0074

0075

0076

0077

0078

なお、上記に記載の各遺伝子は、塩基配列中多型の有無等により、同一の遺伝子であっても複数のアクセッション番号が付与されている場合がある。この「多型」とは、一塩基の置換、欠失、挿入変異からなる一塩基多型(SNPs)に限定されず、連続する数塩基の置換、欠失、挿入変異も含まれる。従って、上記の各遺伝子の塩基配列としては、必ずしも表1〜表16に記載のアクセッション番号によって取得される配列、あるいは、配列番号:1〜637、810〜908に記載された配列に限定されない。同様に、上記の各遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列も、配列番号:638〜723、909〜973に記載されたアミノ酸配列に特に限定されない。

0079

本発明の上記タンパク質は、配列番号:638〜723、909〜973に記載されたアミノ酸配列に限定されず、該アミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号:638〜723、909〜973に記載されたタンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる。

0080

また、本発明の染色体安定化関連遺伝子(例えば、上記の各遺伝子)は特に制限されるものではないが、通常、動物由来であり、より好ましくは哺乳動物由来であり、最も好ましくはヒト由来である。

0081

即ち、本発明はヒトの癌細胞についての特異的なアポトーシス誘導剤に限定されず、ヒト以外の動物の癌細胞に対するアポトーシス誘導剤も本発明に含まれる。従って、本発明の遺伝子には、上記の各遺伝子についてのヒト以外の動物におけるホモログカウンターパート)遺伝子が含まれる。例えば、配列番号:1〜637、810〜908に記載の各塩基配列からなる遺伝子に対応する他の動物における内在性の遺伝子(ホモログ等)が含まれる。該塩基配列からなるDNAに対応する他の動物の内在性のDNAは、一般的に、該配列番号に記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上(例えば、95%以上、さらには96%、97%、98%または99%以上)の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また、該DNAは、生体内から単離した場合、該配列番号に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2×SSC、0.1%SDS、50℃」、「2×SSC、0.1%SDS、42℃」、「1×SSC、0.1%SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1%SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1%SDS、65℃」の条件を挙げることができる。当業者においては、他の動物における本発明の上記の各遺伝子に相当する内在性遺伝子に関する情報(配列等)について、配列表に掲載された塩基配列を基に適宜取得することが可能である。

0082

また本発明は、染色体安定化関連遺伝子(例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子)の発現を抑制する化合物を提供する。

0083

本発明の染色体安定化関連遺伝子(例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子)の発現を抑制する化合物としては、例えば、該遺伝子に対してRNAi(RNA interferance;RNA干渉)効果を有する二本鎖RNAを好適に挙げることができる。一般的にRNAiとは、標的遺伝子mRNA配列と相同な配列からなるセンスRNAおよびこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる二本鎖RNAを細胞内に導入することにより、標的遺伝子mRNAの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現が阻害される現象を言う。

0084

RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素RNaseIII核酸分解酵素ファミリー一種)が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このsiRNAも含まれる。さらに、本発明の二本鎖RNAを発現し得るDNAもまた、本発明に含まれる。

0085

本発明の好ましい態様においては、染色体安定化関連遺伝子(例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子)の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA(siRNA)であって、配列番号:724〜809、974〜1063のいずれかに記載の塩基配列からなるRNAと、該RNAと相補的な配列からなるRNAとがハイブリダイズした構造を含む二本鎖RNAを有効成分として含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤を提供する。

0086

例えば、配列番号:724に記載の塩基配列(5'- ggaaaaucuggccacucucTT-3')を含む本発明のsiRNAとは、以下のような構造のRNA分子を例示することができる。

(上記「I」は水素結合を表す。)

0087

なお、上記RNA分子において一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA(shRNA)も本発明に含まれる。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る分子もまた本発明に含まれる。

0088

例えば、
5'-ggaaaaucuggccacucuc (xxxx)n gagaguggccagauuuucc-3' のような分子もまた本発明に含まれる。(上記「(xxxx)n」は任意塩基および配列数からなるポリヌクレオチドを表す。)

0089

上記siRNAの好ましい態様としては、染色体安定化関連遺伝子(例えば上記のいずれかに記載の遺伝子)の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA(siRNA)であって、配列番号:724〜809、974〜1063のいずれかに記載の塩基配列からなるRNAと、該RNAと相補的な配列からなるRNAとがハイブリダイズした構造を含む二本鎖RNAを好適に示すことができる。ただし、二本鎖RNAの末端において、例えば、1もしくは複数のRNAが付加もしくは欠失された構造の二本鎖RNAもまた、本発明に含まれる。

0090

即ち本発明は、本発明の二本鎖RNAを発現し得るDNA(ベクター)を提供する。本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA(ベクター)は、通常、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、容易に作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。

0091

RNAiのために使用されるRNAは、染色体安定化関連遺伝子(例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子)もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一(相同)である必要はないが、完全な同一(相同)性を有することが好ましい。

0092

本発明のRNAi効果を有する二本鎖RNAは、通常、染色体安定化関連遺伝子(例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子)のmRNAにおける連続する任意のRNA領域と相同な配列からなるセンスRNA、および該センスRNAに相補的な配列からなるアンチセンスRNAからなる二本鎖RNAである。上記「連続する任意のRNA領域」の長さは、通常20〜30塩基であり、好ましくは21〜23塩基である。例えば、配列番号:724〜809、974〜1063のいずれかに記載のRNAを一方の鎖とするsiRNAの長さを挙げることができるが、必ずしもこれらの長さに限定されない。しかしながら、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。また、染色体安定化関連遺伝子(例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子)のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させ、その分解産物を本発明のアポトーシス誘導剤として利用することが可能である。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子(siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待されるmRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、RNAi効果を有する染色体安定化関連遺伝子(例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子)のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。ただし、より好ましくは、後述の実施例において用いた各種siRNAを好適に示すことができる。

0093

また、通常、末端に数塩基のオーバーハングを有する二本鎖RNAは、RNAi効果が高いことが知られており、本発明の二本鎖RNAは、末端に数塩基のオーバーハングを有することが望ましい。このオーバーハングを形成する塩基の長さは特に制限されない。また、このオーバーハングは、DNAおよびRNAのいずれであってもよい。好ましくは、2塩基のオーバーハングを例示することができる。本発明においては例えば、TT(チミンが2個)、UU(ウラシルが2個)、その他の塩基のオーバーハングを有する二本鎖RNA(最も好ましくは19塩基の二本鎖RNAと2塩基(TT)のオーバーハングを有する分子)を好適に用いることができる。本発明の二本鎖RNAには、このようにオーバーハングを形成する塩基がDNAであるような分子や、標的mRNA配列と相同な配列も含まれる。

0094

例えば、オーバーハング部分の塩基がTTである場合には、本発明のsiRNA分子としては、

のような分子(3'側にTTが付加された分子)を例示することができる。

0095

本発明の上記「染色体安定化関連遺伝子に対してRNAi効果を有する二本鎖RNA」は、当業者においては、該二本鎖RNAの標的となる染色体安定化関連遺伝子(例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子)の塩基配列をもとに、適宜作製することができる。染色体安定化関連遺伝子(例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子)の塩基配列は、上述のように公共の遺伝子データベースから容易に取得することができる。一例を示せば、配列番号:1〜637、810〜908のいずれかに記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖RNAを作製することができる。即ち、配列番号:1〜637、810〜908のいずれかに記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者においては、容易に行い得ることである。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択する方法は、例えば文献(Reynold et al. Nature biotechnology 22. 326-330 (2004)、Ui-Tei et al. Nucleic AcidsRes. 32. 936-948 (2004)、Boese Q, Leake D, Reynolds A, Read S, Scaringe SA, Marshall WS, Khvorova A. Mechanistic insights aid computational short interfering RNA design.Methods Enzymol. 2005;392:73-96.、Snove O Jr, Nedland M, Fjeldstad SH, Humberset H, Birkeland OR, Grunfeld T, Saetrom P. Designing effective siRNAs with off-target control. Biochem Biophys Res Commun. 2004;325(3):769-73.、YiuSM, Wong PW, Lam TW, Mui YC, Kung HF, Lin M, Cheung YT. Filtering of Ineffective siRNAs and Improved siRNA Design Tool. Bioinformatics. 200515;21(2):144-51、Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL. Improved and automated prediction of effective siRNA. Biochem Biophys Res Commun. 2004;319(1):264-74.、Amarzguioui M, Prydz H. An algorithm for selection of functional siRNA sequences. Biochem Biophys Res Commun. 2004;316(4):1050-8.、Sioud M, Leirdal M. Potential design rules and enzymatic synthesis of siRNAs. Methods Mol Biol. 2004;252:457-69.)等を参考にして、当業者においては、適宜実施することが可能である。また、一方の鎖(例えば、配列番号:724〜809、974〜1063のいずれかに記載の塩基配列)が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖(相補鎖)の塩基配列を知ることができる。siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することが可能である。

0096

また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド(RNA)でなくともよい。即ち、本発明において、siRNAを構成する1もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種アデニングアニンシトシン、チミン(ウラシル))であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことを言う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは2〜5個程度の少数を指す。

0097

また、本発明の二本鎖RNAの基となる遺伝子(標的遺伝子)の配列は、必ずしも遺伝子全長の塩基配列が判明している必要はない。選択すべき任意の連続するRNA領域(例えば、20〜30塩基)が判明していればよい。従って、EST(Expressed Sequence Tag)等のようにmRNAの一部は判明しているが、全長が判明していない遺伝子断片からも、該断片の塩基配列を基に本発明の二本鎖RNAを作製することが可能である。以下に、GenBankデータベースにおいて、上記のいずれかに記載の遺伝子と高い相同性を示したEST配列のアクセッション番号を、各遺伝子名ごとに分けて記載する。但し、これらは多数存在するEST配列のうちの一例に過ぎず、当業者においては、適切なEST断片に関する情報を公共のデータベースから容易に取得することができる。

0098

Mcm10:BQ230201、CK000876、BX324498、BM466246、BI086715、BE561621、BM781578、BE397209、BM781561、BF797760、BE268770、AI133628、BI860489、CA488245、BE018388、BM794417、AI005288、AV759891、BE536223、AI078425、BI023355、CB120985、AA305452、BX324497、AI636632、CB143720、BM465842、BM833978、AI962581、BE206240、BE536858、BQ432059、BX099770、BX346400、BE890219、BU542039、AI750442、BU542210、BQ929138、BG323332、AA312197、BG942019、BM755471、AA091854、BX346399、BG493975、T97047、BU615340、BG777950、BU618352、BG323324

0099

Orc1:BM556110、AL558857、AL528479、AL530422、AU125429、BQ229865、BX370588、AL563154、BU552785、BQ055912、CD642483、BE903488、BU854876、BM908744、BF205157、BX372245、BQ230059、BX110476、BM743410、BG821765、AL530421、BI222366、BU198520、BF796650、BM476715、AL552393、AU127396、BM740840、BE781976、AL580583、BG391980、BM852299、CD654548、BQ423782、AW378723、AL582531、AL561250、BU194186、BQ048846、BG822626、AL552501、BU854819、BQ433201、BE782505、BG257286、BX281133、CF140351、BF795920、BG390855、BG831652、BF794915、BF797918、BG325714、AI651655、BM833692、BQ883238、BX474463、AI038384、AU129034、BP431296、BG328342、BP430683、H51719、AI739661、T96858、BE782390、BU630113、BG025019、BE937466、AA332534、AI343281、AU149094、BP430714、BI087773、AW393255、AU151220、BE076727、AI452809、AW877655、AI003527、AI391554、AW602975、AW877662、AA633915、BF108860、AU149996、T96859、R83277

0100

Orc3:BM478060、BU509511、BQ718539、BU153003、AL533919、BQ220405、AU118962、BM550235、BG187255、AU117920、BQ719965、BQ716606、BQ953945、BU166296、AU119182、BI769170、BI819545、CD655888、BX409716、BI520392、BG214275、BI770086、BI091781、BM802602、BG187780、BU170385、BI769508、BX433033、BX507848、AU124361、BX488094、BM785800、BG205874、CD679490、BX490513、CB153029、AW967051、BM826548、AU139285、BG572634、AL533918、CB152486、AU136510、BE536929、BX352629、BQ102522、AW369628、AW449272、BF672680、BE882468、BX343146、BG943457、BF698289、CD702536、BF667912、AU280292、CA842624、BF674961、BF184165、BQ441255、BF794512、CD699734、AL600904、BX462706、BF215571、AL709158、AV753736、AI904063、CB123265、BX486937、BG214276、CD245870、BF059711、AI651375、BQ102253、AL711211、BF964587、AW500090、BM751168、CB963370、BI862225、AA442539、AW887723、AW801684、AV708200、BM152858、H17704、BF683230、BM848524、BQ772810、BQ361466、AL710982、CD242978、H11812、AA305227、AW607564、H94935、BU632641、BX328353、BI255412

0101

Cdc6:AL562624、AL521818、BM465884、BQ064897、BX451346、BX349920、BU846236、BQ675107、BI260747、BU633837、BG256606、BM464160、BQ228599、BG252312、BM559225、AL521819、BE907412、BQ070080、BU619893、BF698043、BE741201、AL526150、BG765988、BU173127、BF699051、AA502608、BG165110、AU129648、CA488634、BM450676、BF028885、CB135870、BF185000、BG026757、CA429336、BF977528、BF240966、BG766090、AI478744、BM803439、AA045217、AA813386、BE565947、BF571756、AL710150、BF307679、AA723372、BG721945、AI433558、BF208758、BI559407、BX482661、BF102841、BE779410、BQ441118、N69246、BF310791、CF123750、BI006635、BQ775002、AA907374、BM011340、CA429634、W03300、BM845715、AA113790、BF210909、BM706052、H59204、BI255053、AI424746、H59203、AI052065、BE073887、BE550416、AI341585、BG025851、BF221502、T83032、T90351、BG720011、AI953729、AI699473、BF115521、BF223422、AI808683、BE085836、AI699980、BX355209、BE086769、AW518847、AA099980、BE965778、AA836395、AI766778、BE869748、AI802324、AA584340、BE693538、AI567411

0102

Cdt1:BX332414、BQ935210、BU931977、BM811548、BU849056、BQ062875、BQ053758、BU187852、BX406047、AL555432、BQ278148、BX402195、BU845736、AL580756、BQ058496、AL581992、BX332413、AL557066、BU930971、BM016975、BX421258、BU190377、BQ960305、BG824304、AL520240、BM917547、BQ053108、AL582018、BG393757、AL520239、BF791881、BM019024、AL556319、BI092793、BI258203、AL559054、AL527465、AL558613、BU856820、AL524910、AL580393、BX333703、BQ063175、BG259986、BI335580、BG327660、BM556535、BI222927、BG251456、AL520887、BI224536、BI335105、AL524909、BQ053124、BI093258、BG745159、BX405984、AL515463、BE910713、AL518299、BQ054892、BQ053069、BI333817、AL518300、BU189533、BI260243、BF972427、BQ684815、BM695575、BQ652285、BQ649771、BQ647760、BQ647212、BQ645148、BG822442、AL581566、BQ652445、BQ649937、BE544515、AL577935、BX405983、BM927844、BE727635、AL515464、BU176676、BU931060、BU859159、BX366934、BX355022、BM800496、BM463356、BG389325、BU164161、BE388067、BX464574、BE778380、BF237902、BU158281、BM917445、BM809482

0103

Geminin:BM550773、AL522354、BI092791、BX375519、BX414734、AL562503、BI861855、BM471496、AL518006、BQ430578、AL580178、BG577005、BG032232、AL525229、AL518005、AL522353、CA417249、AU118695、BQ645204、BG612964、BI855710、BQ718513、BG577324、BI086620、AL558330、BG776051、BG777134、BE893489、BF967933、BG776192、AW996997、BF666338、BQ015308、BQ064691、CD366250、BE910343、BM699599、BG776218、BF029154、BU629613、CB992796、BG825264、BE613337、CB131959、CB049968、BQ772723、BE564333、BI759810、BF666672、BF808421、BF700297、BG337926、BE565866、BG776386、CD367234、BF213350、CB136099、BI830428、BG612435、BE535264、BQ575533、BF667576、BG505022、AA447810、CA442918、BU623074、BF696555、AA393139、CD708137、BF699912、BF967209、BF056288、CA503202、CA312813、BG530534、BF109418、AV756510、BG778341、AA235222、BI093913、BF248391、AI968057、CD686529、BU685799、BG777305、AV734242、AV689368、BF240393、AW006287、AI828103、BF003138、CB049969、BF947954、BF594599、BE048465、BG429246、BG180421、AI803434、AV734302、BE219705

0104

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0105

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