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課題

核酸PCR増幅産物、該PCR増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸分離検出を、短時間かつ高い分離性能で行うことができるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤、及びこの充填剤を用いるイオン交換クロマトグラフィーによる標的核酸の分離検出方法を提供する

解決手段

基材微粒子の表面に強カチオン性基と弱アニオン性基とを有する、イオン交換クロマトグラフィー用充填剤。

概要

背景

イオン交換クロマトグラフィーは、カラム充填剤が有するイオン交換基検出対象物質が有するイオン性基との間に働く静電的相互作用を利用して検出対象物質を分離する液体クロマトグラフィーの1つである。
特に、核酸タンパク質多糖類等の生体高分子の分離に優れているため、生化学分野、医学分野等で汎用されている。
イオン交換クロマトグラフィーには、アニオン交換クロマトグラフィーカチオン交換クロマトグラフィーとがある。アニオン交換クロマトグラフィーは、カチオン性基を有するカラム充填剤を用いて、アニオン性物質を分離する方法である。カチオン交換クロマトグラフィーは、アニオン性基を有するカラム充填剤を用いて、カチオン性の物質を分離する方法である。

アニオン交換クロマトグラフィーに用いられるカラム充填剤が有するカチオン性基としては、例えば、ジエチルアミノエチル基のような弱カチオン性基、4級アンモニウム基のような強カチオン性基があり、これらのカチオン性基を有するカラム充填剤は市販されており、各種研究分野で使用されている。

近年、様々な遺伝子検査技術が開発されており、核酸等の検出対象物質を、短時間で、かつ高精度に分離検出することが重要になっている。
核酸とは、塩基、糖、リン酸からなるヌクレオチドリン酸エステル結合で連なった生体高分子であり、糖構造の違いによってデオキシリボ核酸(DNA)とリボ核酸(RNA)とに分類される。
例えば、核酸のPCR増幅産物、該PCR増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸をイオン交換クロマトグラフィーにより分離する場合には、該標的核酸が有するリン酸基マイナス電荷を利用したアニオン交換クロマトグラフィーが用いられており、これらの標的核酸を鎖長別に分離検出できる。

イオン交換クロマトグラフィーは、検体をセットするだけで結果が得られるため、検出対象物質を簡便に検出することができる。しかし、従来のカラム充填剤を用いるイオン交換クロマトグラフィーは、より短時間で検出対象物質を分離検出しようとした場合には分離性能が不充分であるという課題がある。イオン交換クロマトグラフィーの分離性能は、主に、カラム充填剤の表面の特性やカラムサイズに依存する。特に、カラム長を長くすると理論段数の向上に伴って分離性能が向上するが、分離検出に要する時間が長くなったり、カラム圧力が高くなったりする。カラム圧力が高いイオン交換クロマトグラフィーを行うには、耐圧性に優れた装置が必要となるため、装置が高価になったり、装置が大がかりになったりするという問題がある(特許文献1)。

概要

核酸のPCR増幅産物、該PCR増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸の分離検出を、短時間かつ高い分離性能で行うことができるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤、及びこの充填剤を用いるイオン交換クロマトグラフィーによる標的核酸の分離検出方法を提供する基材微粒子の表面に強カチオン性基と弱アニオン性基とを有する、イオン交換クロマトグラフィー用充填剤。なし

目的

本発明は、核酸のPCR増幅産物、該PCR増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸を、短時間かつ高精度に分離検出できるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤、及びこの充填剤を用いるイオン交換クロマトグラフィーによる標的核酸の分離検出方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

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請求項1

請求項2

強カチオン性基は、4級アンモニウム基である、請求項1記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。

請求項3

弱アニオン性基は、カルボキシ基である、請求項1又は2記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。

請求項4

基材微粒子は、有機合成高分子からなる、請求項1乃至3のいずれか1項に記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。

請求項5

強カチオン性基と弱アニオン性基は、それぞれ独立した単量体由来するものである、請求項1乃至4のいずれか1項に記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤。

請求項6

請求項1乃至5のいずれか1項に記載のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いる、標的核酸分離検出方法

請求項7

標的核酸は、核酸PCR増幅産物、該PCR増幅産物の制限酵素断片、又は核酸の制限酵素断片である、請求項6記載の標的核酸の分離検出方法。

請求項8

標的核酸は、ウイルス由来又はヒト由来のものである、請求項6又は7記載の標的核酸の分離検出方法。

技術分野

背景技術

0002

イオン交換クロマトグラフィーは、カラム充填剤が有するイオン交換基検出対象物質が有するイオン性基との間に働く静電的相互作用を利用して検出対象物質を分離する液体クロマトグラフィーの1つである。
特に、核酸タンパク質多糖類等の生体高分子の分離に優れているため、生化学分野、医学分野等で汎用されている。
イオン交換クロマトグラフィーには、アニオン交換クロマトグラフィーカチオン交換クロマトグラフィーとがある。アニオン交換クロマトグラフィーは、カチオン性基を有するカラム充填剤を用いて、アニオン性物質を分離する方法である。カチオン交換クロマトグラフィーは、アニオン性基を有するカラム充填剤を用いて、カチオン性の物質を分離する方法である。

0003

アニオン交換クロマトグラフィーに用いられるカラム充填剤が有するカチオン性基としては、例えば、ジエチルアミノエチル基のような弱カチオン性基、4級アンモニウム基のような強カチオン性基があり、これらのカチオン性基を有するカラム充填剤は市販されており、各種研究分野で使用されている。

0004

近年、様々な遺伝子検査技術が開発されており、核酸等の検出対象物質を、短時間で、かつ高精度に分離検出することが重要になっている。
核酸とは、塩基、糖、リン酸からなるヌクレオチドリン酸エステル結合で連なった生体高分子であり、糖構造の違いによってデオキシリボ核酸(DNA)とリボ核酸(RNA)とに分類される。
例えば、核酸のPCR増幅産物、該PCR増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸をイオン交換クロマトグラフィーにより分離する場合には、該標的核酸が有するリン酸基マイナス電荷を利用したアニオン交換クロマトグラフィーが用いられており、これらの標的核酸を鎖長別に分離検出できる。

0005

イオン交換クロマトグラフィーは、検体をセットするだけで結果が得られるため、検出対象物質を簡便に検出することができる。しかし、従来のカラム充填剤を用いるイオン交換クロマトグラフィーは、より短時間で検出対象物質を分離検出しようとした場合には分離性能が不充分であるという課題がある。イオン交換クロマトグラフィーの分離性能は、主に、カラム充填剤の表面の特性やカラムサイズに依存する。特に、カラム長を長くすると理論段数の向上に伴って分離性能が向上するが、分離検出に要する時間が長くなったり、カラム圧力が高くなったりする。カラム圧力が高いイオン交換クロマトグラフィーを行うには、耐圧性に優れた装置が必要となるため、装置が高価になったり、装置が大がかりになったりするという問題がある(特許文献1)。

先行技術

0006

特開2002−194117号公報

発明が解決しようとする課題

0007

本発明は、核酸のPCR増幅産物、該PCR増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸を、短時間かつ高精度に分離検出できるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤、及びこの充填剤を用いるイオン交換クロマトグラフィーによる標的核酸の分離検出方法を提供することを目的とする。
本発明は、イオン交換クロマトグラフィー用充填剤、及び該充填剤を用いたイオン交換クロマトグラフィーによる標的核酸の分離検出方法に関する。

課題を解決するための手段

0008

本発明者らは、イオン交換クロマトグラフィーに用いる充填剤として、基材微粒子の表面に、強カチオン性基と弱アニオン性基とを有する充填剤を用いることにより、核酸のPCR増幅産物、該PCR増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸を、短時間かつ高精度に分離検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

0009

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤(以下、単に「充填剤」ともいう)は、基材微粒子の少なくとも表面に強カチオン性基と弱アニオン性基とを有する。

0010

上記強カチオン性基は、pH1から14の全ての範囲で解離するカチオン性基である。すわなち、強カチオン性基は、水溶液のpHに影響を受けず解離した(カチオン化した)状態を保つことが可能である。
上記強カチオン性基として、好ましくは4級アンモニウム基が挙げられる。4級アンモニウム基としては、例えば、トリメチルアンモニウム基トリエチルアンモニウム基、ジメチルエチルアンモニウム基等のトリアルキルアンモニウム基が挙げられる。また、トリアルキルアンモニウム基のカウンターイオンとしては、塩化物イオン臭化物イオンヨウ化物イオン等のハロゲン化物イオンが挙げられる。

0011

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤における強カチオン性基の量は特には限定されないが、好ましい下限は充填剤の乾燥重量1gあたり1μeq、好ましい上限は充填剤の乾燥重量1gあたり500μeqである。強カチオン性基の量が1μeq/g未満であると、充填剤の検出対象物質に対する保持力が弱くなり、分離性能が不充分になる。強カチオン性基の量が500μeq/gを超えると、充填剤の検出対象物質に対する保持力が強くなるため、検出対象物質を短時間で溶出させ難くなり、分離検出に要する時間が長くなる。

0012

上記弱アニオン性基は、pkaが3以上のアニオン性基である。すなわち、弱アニオン性基は、水溶液のpHによる影響を受け、解離状態が変化する。pHが3を超えると、カルボキシ基等の弱アニオン性基のプロトンは解離し、マイナス電荷を持つ割合が増える。pHが3未満になると、カルボキシ基等の弱アニオン性基のプロトンが結合した非解離状態の割合が増える。

0013

上記弱アニオン性基としては、例えば、カルボキシ基、リン酸基等が挙げられる。なかでも、カルボキシ基が好ましい。

0014

弱アニオン性基を後述する基材微粒子の表面に導入する方法は特には限定されない。例えば、カルボキシ基を基材微粒子の表面に導入する方法としては、カルボキシ基を有する単量体を共重合して基材微粒子とする方法、基材微粒子を構成する単量体中のエステル部を加水分解する方法、基材微粒子をオゾン水処理することによりカルボキシ基を形成する方法、基材微粒子をオゾンガス処理することによりカルボキシ基を形成する方法、基材微粒子にプラズマ処理を施しカルボキシ基を形成する方法、基材微粒子にカルボキシ基を有するシランカップリング剤を反応させる方法、エポキシ基を有する単量体を共重合させて基材微粒子を得た後にエポキシ基の開環によってカルボキシ基を形成する方法等が挙げられる。なかでも、基材微粒子が、疎水性構造部分、特に炭素−炭素の二重結合を有するものである場合、オゾン水処理によってカルボキシ基を形成する方法が好ましい。

0015

基材微粒子をオゾン処理することにより、基材微粒子の表面にカルボキシ基を形成させる方法について説明する。
オゾンは二重結合との反応性が高く、二重結合と反応したオゾンは、中間体であるオゾナイドを形成し、その後、カルボキシ基等が形成される。

0016

オゾン処理としては、オゾンガス処理、オゾン水処理等が挙げられ、オゾン水処理が好ましい。オゾン水とは、オゾンガスが水に溶解したものを意味する。
上記オゾン水を用いることにより、オゾン水中粒子を分散させるだけで粒子表面を簡便に酸化させることができる。その結果、基材微粒子における疎水性の構造部分が酸化され、カルボキシ基、水酸基アルデヒド基ケト基等の親水性基が形成されると考えられる。
オゾンには強力な酸化作用があるが、オゾン水を用いて処理することにより、オゾンガスを用いる処理よりも、粒子表面をより均一に酸化させることができ、粒子表面にカルボキシ基をより均一に形成することができるので好ましい。

0017

上記オゾン水における溶存オゾン濃度は特に限定されないが、好ましい下限は20ppmである。溶存オゾン濃度が20ppm未満であると、カルボキシ基を形成するのに長時間を必要としたり、カルボキシ基の形成が不充分となって、検出対象物質等の非特異吸着を充分に抑制することができずに分離性能が低下したりすることがある。溶存オゾン濃度のより好ましい下限は50ppmである。

0018

上記オゾン水は、例えば、特開2001−330969号公報に記載されているように、水とオゾンガスとを、気体のみを透過し液体の透過を阻止するオゾンガス透過膜を介して接触させる方法等により調製することができる。

0019

アルカリ条件下においては、基材微粒子の表面に導入されたカルボキシ基はほぼ解離した状態にあり、核酸塩基中の僅かなカチオンとの間に弱いカチオン交換相互作用が生じると考えられる。
また、上記オゾン水によって処理することで、カルボキシ基の他、水酸基、アルデヒド基、ケト基等の親水性基が形成され、これらの親水性基の存在によって充填剤の表面と核酸との間に働く疎水性相互作用が弱まると考えられる。
従って、本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いた場合、主たる相互作用である充填剤表面と核酸との間に働くアニオン交換相互作用に加え、上述したように、弱いカチオン交換相互作用が働いたり、疎水性相互作用が弱まったりすることによって分離性能が向上するものと考えられる。

0020

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤の基材微粒子の表面に導入される上記弱アニオン性基量は、上記強カチオン性基量以下であれば特に限定されない。

0021

上記基材微粒子としては、例えば、重合性単量体等を用いて得られる有機合成高分子系の微粒子シリカ等の無機系の微粒子等を用いることができるが、有機合成高分子系の微粒子が好ましく、特に、疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子と、該疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合されたイオン交換基を有する親水性重合体からなる層とからなるものがより好ましい。

0022

上記疎水性架橋重合体は、1種の疎水性架橋性単量体単独重合して得られる疎水性架橋重合体、2種以上の疎水性架橋性単量体を共重合して得られる疎水性架橋重合体、少なくとも1種の疎水性架橋性単量体と少なくとも1種の疎水性非架橋性単量体とを共重合して得られる疎水性架橋重合体のいずれであってもよい。
また、必要に応じて、疎水性架橋性単量体及び疎水性非架橋性単量体以外の、反応性基を有する単量体を共重合させてもよい。

0023

上記疎水性架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する架橋性重合性有機単量体であれば特に限定されず、単量体1分子中にビニル基を2個以上有するものが挙げられる。例えば、エチレングリコールジ(メタアクリレートポリエチレングリコールジ(メタ)アクリレート、プロピレングリコールジ(メタ)アクリレート、ポリプロピレングリコールジ(メタ)アクリレート等のジ(メタ)アクリル酸エステルや、テトラメチロールメタントリ(メタ)アクリレート、トリメチロールプロパントリ(メタ)アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ(メタ)アクリレート等のトリ(メタ)アクリル酸エステル又はテトラ(メタ)アクリル酸エステルや、ジビニルベンゼンジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等の芳香族系化合物等が挙げられる。尚、(メタ)アクリレートは、アクリレート又はメタクリレートである。

0024

上記疎水性非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架橋性の重合性有機単量体であれば特に限定されず、単量体1分子中にビニル基を1個有するものが挙げられる。例えば、メチル(メタ)アクリレート、エチル(メタ)アクリレート、プロピル(メタ)アクリレート、イソプロピル(メタ)アクリレート、ブチル(メタ)アクリレート、t−ブチル(メタ)アクリレート等の(メタ)アクリル酸エステルや、スチレンメチルスチレン等のスチレン系単量体等が挙げられる。

0025

上記疎水性架橋重合体が、上記疎水性架橋性単量体と上記疎水性非架橋性単量体との共重合体の場合、疎水性架橋重合体における疎水性架橋性単量体に由来するセグメント含有割合の好ましい下限は10重量%、より好ましい下限は20重量%である。疎水性架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合が10重量%未満であると、得られるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤の耐圧性、耐膨潤性等が低下し、分離性能が低下することがある。

0026

上記イオン交換基を有する親水性重合体は、イオン交換基を有する親水性単量体から構成されるものであり、1種以上のイオン交換基を有する親水性単量体に由来するセグメントを含めばよい。即ち、上記イオン交換基を有する親水性重合体を形成させる方法としては、イオン交換基を有する親水性単量体を単独で重合させる方法、イオン交換基を有する親水性単量体とイオン交換基を有さない親水性単量体とを共重合させる方法等が挙げられる。

0027

上記イオン交換基を有する親水性単量体としては、上記強カチオン性基を有するものが好ましく、4級アンモニウム基を有するものがより好ましい。例えば、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリドアクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルジメチルエチルアンモニウムクロリド等が挙げられる。

0028

本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤の平均粒子径は特に限定されないが、好ましい下限は0.1μm、好ましい上限は20μmである。平均粒子径が0.1μm未満であると、カラムの内圧が高くなり分離性能が悪くなることがある。平均粒子径が20μmを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなり分離性能が悪くなることがある。

0029

DNAやRNA等の核酸のPCR増幅産物、該PCR増幅産物の制限酵素断片、DNAやRNA等の核酸を制限酵素で処理した核酸の制限酵素断片等の標的核酸を、本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いたイオン交換クロマトグラフィーで分析する際の溶離液組成としては、公知の条件を用いることができる。

0030

上記溶離液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましく、例えば、トリス塩酸緩衝液、トリスとEDTAとを含むTE緩衝液、トリスと酢酸とEDTAとを含むTAE緩衝液、トリスとホウ酸とEDTAとを含むTBA緩衝液等が挙げられる。

0031

上記溶離液のpHは特に限定されないが、好ましい下限は5、好ましい上限は10である。上記溶離液のpHのより好ましい下限は6、より好ましい上限は9である。pHがこの範囲にあれば、わずかながら核酸塩基にプラス電荷が存在し、イオン交換クロマトグラフィー用充填剤の弱アニオン性基との間に弱いカチオン交換相互作用が働くので分離性能が向上すると考えられる。

0033

上記溶離液の塩濃度としては、分離検出条件に合わせ適宜調整すればよいが、好ましい下限は10mmol/L、好ましい上限は2000mmol/Lであり、より好ましい下限は100mmol/L、より好ましい上限は1500mmol/Lである。

0034

核酸のPCR増幅産物、該PCR増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸の分離検出方法も本発明の1つである。本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いたイオン交換クロマトグラフィーによる標的核酸の分離検出方法について以下詳述する。

0035

本発明の分離検出方法が適用可能な標的核酸(検出対象物質)としては、ウイルスの存在や型を判別するためのウイルス由来の核酸(DNAやRNA)、遺伝子多型一塩基多型)を判別するためのヒト由来のDNA等を例示することができる。

0036

上記、DNA又はRNAは、公知の方法によりDNA又はRNAの抽出、精製の後、必要によりPCR(Polymerase Chain Reaction)法等により増幅し、該増幅産物を本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーに供する。

0037

ウイルスがRNAウイルスである場合等は、抽出、精製したRNAに対してRT−PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)反応を行い、PCR増幅産物を得ることができる。

0038

また、本発明の分離検出方法を用いて遺伝子多型を判別する場合には、PCR−RFLP(PCR−Restriction Fragment Length Polymorphism:制限酵素断片長多型)法として公知の技術を応用することができる。RFLP法は、PCR増幅産物中の遺伝子変異部を認識する制限酵素が存在する場合、共通配列部位にプライマーを設定し、その内側、すなわち、PCR増幅産物内に多型性をもたせて増幅し、得られたPCR増幅産物を上記制限酵素で切断し、その断片の長さにより、多型の有無を判定する方法である。制限酵素による切断が起きた場合と起きなかった場合では、生じる断片の数もサイズも異なるので、それに基づいて切断が起きたか否か、ひいては目的の位置の塩基が何であったかを知ることができる。

0039

プライマーによる増幅領域は、制限酵素による切断が起きた場合に生じる2個の断片が、それぞれ本発明のイオン交換クロマトグラフィーで明瞭に検出できるサイズ、好ましくは、小さい方の断片が1bp以上、さらに好ましくは20bp以上となるように設定する。また、生じる2個の断片のサイズの差が、本発明の分離検出方法で明瞭に検出できるように、好ましくは、1bp以上、さらに好ましくは20bp以上になるように設定する。増幅領域のサイズの上限は特にないが、あまりに大きいとPCRの時間もコストもかかり、また、それによる利点もないので、好ましくは、1000bp以下である。プライマーの塩基長は、それぞれの機能が発揮される長さであればよく、プライマーの塩基長の例としては15〜30bp程度、好ましくは20〜25bp程度である。

0040

PCR法による増幅は、1段階で行なってもよいが、感度をより高めるために、第1段階のPCRでより広い範囲の領域を増幅し、得られたPCR増幅産物を鋳型として、その中に含まれる領域を第2段階のPCRでさらに増幅してもよい(nested PCR)。この場合、第2段階のPCRに用いるプライマーは両方とも、第1段階のPCRに用いるプライマーと異なるものであってもよいし、一方のみ異なるプライマーを用い、他方は第1段階のPCRで用いたプライマーと同じものを用いてもよい(hemi−nested PCR)。

0041

PCR法自体は公知であり、そのためのキットも市販されているので、容易に実施することができる。PCR法に用いるプライマーの設計やDNAの増幅の条件は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd ed.),Volume 2,Chapter 8,pp.8.1−8.126,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpingHarbor,2001を参照できる。

発明の効果

0042

本発明によれば、核酸のPCR増幅産物、該PCR増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸の分離検出を、短時間かつ高い分離性能で行うことができるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。さらに、本発明によれば、上記イオン交換クロマトグラフィー用充填剤をカラム充填剤として用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、標的核酸を短時間で精度よく分析できる分離検出方法を提供することができる。

図面の簡単な説明

0043

実施例1で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いて得られたクロマトグラムである。
比較例1で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いて得られたクロマトグラムである。
比較例2の比較用カラムを用いて得られたクロマトグラムである。
実施例1で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用い、インフルエンザウイルスAH1型、AH3型B型を分離検出したクロマトグラムである。
実施例1で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用い、UGT1A1*6のWildTypeとMutantを分離検出したクロマトグラムである。

実施例

0044

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。

0045

(実施例1)
攪拌機付き反応器中、3重量%ポリビニルアルコール(日本合成化学社製)水溶液2000mLに、テトラエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学工業社製)300g、トリエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学工業社製)100g及び過酸化ベンゾイルキシダ化学社製)1.0gの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて80℃で1時間重合した。次に、強カチオン性のイオン交換基(4級アンモニウム基)を有する単量体として、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド(和光純薬工業社製)100gをイオン交換水に溶解し、水溶液とした。この水溶液を上記反応器中にさらに添加し、前記と同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下にて80℃で2時間重合した。得られた重合物を水及びアセトン洗浄することにより、基材微粒子の表面に4級アンモニウム基を有する重合体粒子を得た。

0046

得られた重合体粒子10gを溶存オゾン濃度100ppmのオゾン水300mLに浸漬し、30分間攪拌した。攪拌後、遠心分離機日立製作所社製、「Himac CR20G」)を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。
この操作を2回繰り返して重合体粒子にオゾン水処理を施し、基材微粒子の表面に4級アンモニウム基とカルボキシ基をと有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を得た。
得られたイオン交換クロマトグラフィー用充填剤の平均粒子径を、粒度分布計Accusizer780(Particle Sizing Systems社製)を用いて測定したところ、平均粒子径は10μmであった。
なお、オゾン水は、内径15cm×長さ20cmの円柱形を有する外套内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径0.5mm×厚さ0.04mm×長さ350cmの中空管状のオゾンガス透過膜400本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム積水化学工業社製)を用いて調製した。

0047

(比較例1)
オゾン水処理を行わなかったこと以外は、実施例1と同様の操作を行い、4級アンモニウム基のみを有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を得た。得られたイオン交換クロマトグラフィー用充填剤の平均粒子径は、実施例1と同様に10μmであった。

0048

(比較例2)
比較用カラムとして、TSK−gel DNA−STAT(東ソー社製、カラムサイズ:内径4.6mm×長さ100mm、イオン交換基:4級アンモニウム基)を準備した。

0049

<評価>
(1)分離性能の確認A
実施例1及び比較例1で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を、液体クロマトグラフィーシステムエンプティカラム(カラムサイズ:内径4.6mm×長さ20mm)に充填した。
得られたカラムを用いて、以下の条件で分離性能の比較を行った。実施例1で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムを用いて得られたクロマトグラムを図1に示し、比較例1で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムを用いて得られたクロマトグラムを図2に示した。
ステム:LC−20Aシリーズ島津製作所社製)
溶離液:第1液 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH7.5)
第2液 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液に1mol/L塩化ナトリウムを添加(pH7.5)
溶出法:第1液と第2液とを用いるリニアグラジエント法において、分離時間0分から30分にかけて、第2液の混合比率を直線的に増加させた。
0分(第2液 0%)→30分(第2液 100%)
検体:20bpDNALadderマーカータカラバイオ社製)
20bp、40bp、60bp、80bp、100bp、120bp、140bp、160bp、180bp、200bp、300bp、400bp、500bpの断片が含まれる。
流速:1.0mL/min
検出波長:260nm
試料注入量:10μL

0050

図1図2との比較から、強カチオン性基と弱アニオン性基とが共存するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を使用した実施例1の方が、強カチオン性基のみを有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を使用した比較例1より分離性能が優れていることが確認できた。

0051

(2)分離性能の確認B
比較例2の比較用カラムを用いて、以下の条件で測定した。得られたクロマトグラムを図3に示した。
システム:LC−20Aシリーズ(島津製作所社製)
溶離液:第1液 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH7.5)
第2液 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液に1mol/L塩化ナトリウムを添加(pH7.5)
溶出法:第1液と第2液とを用いるリニアグラジエント法において、分離時間0分から30分にかけて、第2液の混合比率を直線的に増加させた。
0分(第2液 75%)→30分(第2液 100%)
検体:20bpDNALadderマーカー(タカラバイオ社製)
流速:0.5mL/min
検出波長:260nm
試料注入量:10μL

0052

図1図3との比較から、実施例1は、比較例2よりも用いているカラム長さが短いにも関わらず、分離性能が優れていることが分かった。本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を使用すれば、従来の充填剤を使用した場合に対し、より短いカラム長で、高い分離性能を得ることができることが確認された。

0053

(3)分離性能の確認C
実施例1で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムを用いて、以下の条件で、インフルエンザウイルスのPCR増幅産物に対する分離性能の確認を行った。得られたクロマトグラムを図4に示した。
システム:LC−20Aシリーズ(島津製作所社製)
溶離液:第1液 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH7.5)
第3液 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液に1mol/L硫酸アンモニウムを添加(pH7.5)
溶出法:第1液と第3液とを用いるリニアグラジエント法において、分離時間0分から5分にかけて、第3液の混合比率を直線的に増加させた。
0分(第3液 60%)→5分(第3液 100%)
検体:以下に示す3種類のインフルエンザウイルス株より精製したRNAに対してRT−PCR反応を行い、PCR増幅産物を得た。
AH1型株(A/New Caledonia/20/1999)、PCR産物431bp
AH3型株(A/Urugay/716/2007)、PCR産物1141bp
B型株(B/Florida/4/2006)、PCR産物329bp
RNAの精製には、RNA精製用キット(QIAamp Viral RNA mini Kit、Quiagen社製)を用いた。
RT−PCRには、RT−PCRキット(PrimeScript OneStep RT−PCR Kit Ver.2、タカラバイオ社製)を用いた。
また、RT−PCRに使用したプライマーは、以下の文献に記載されているものを用いた。
AH1型、B型・・・感染症雑誌第71巻 第6号
<AH1型株用プライマー>
5´−3´
Forward;TGAGGGAGCAATTGAGTTCA(配列番号1)
Reverse;TGCCTCAAATATTATTGTGT(配列番号2)
<B型株用プライマー>
5´−3´
Forward;AATCTTCTCAGAGGATATGA(配列番号3)
Reverse;TTGGCAGATGAGGTGAACTT(配列番号4)
AH3型・・・インフルエンザ診断マニュアル平成14年4月版(国立感染研究所発行
<AH3型株用プライマー>
5´−3´
Forward;AGCAAAAGCAGGGGATAATTC(配列番号5)
Reverse;TGCCTGAAACCGTACCAACC(配列番号6)
流速:1.5mL/min
検出波長:260nm
試料注入量:10μL
図4に示したように、本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いることにより、3種類のPCR増幅産物のピークは、分離検出時間5分という短時間で高精度に分離することができ、インフルエンザウイルスの型を判別できることが分かった。また、PCR原料等に由来するピークから良好に分離することができ、これらのピークの干渉を受けないことも分かった。

0054

(4)分離性能の確認D
実施例1で作製したイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムを用いて、以下の条件で、一塩基多型(SNP)の検出を行った。得られたクロマトグラムを図5に示した。
システム:LC−20Aシリーズ(島津製作所社製)
溶離液:第1液 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液(pH7.5)
第2液 25mmol/Lトリス塩酸緩衝液に1mol/L塩化ナトリウムを添加(pH7.5)
溶出法:第1液と第2液とを用いるリニアグラジエント法において、分離時間0分から5分にかけて、第2液の混合比率を直線的に増加させた。
0分(第2液 0%)→5分(第2液 100%)
検体:UGT1A1の配列を組み込んだプラスミドコントロールを用いて、UGT1A1*6領域をPCR反応により増幅した。次に、PCR増幅産物を制限酵素BsmB1により切断した。
このようにして、UGT1A1*6のWildTypeとMutantを準備した。
なお、PCRには、以下のプライマーを使用した。
5´−3´
Forward;tggagaccgtcctcgtt(配列番号7)
Reverse;aagacacgctgcaccaaataa(配列番号8)
PCR増幅産物のサイズ;706bp
また、制限酵素として、以下のものを使用した。
BsmBI(Biolabs社製)
認識部位
5´・・・CGTCTCN・・・3´
3´・・・GCAGAGNNNNN・・・5´
NはA又はT又はC又はGを表す。
流速:1.5mL/min
検出波長:260nm
試料注入量:10μL
図5に示したように、UGT1A1*6のWildTypeは制限酵素によって切断され、235bpと471bpの二つのピークが確認された。一方で、UGT1A1*6のMutantは制限酵素の認識部位を持たないため切断されず、一つのピーク(706bp)として確認された。この結果から、本発明のイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を用いることにより、分離検出時間5分という短時間で一塩基多型を検出できることが分かった。また、PCR原料等に由来するピークから良好に分離することができ、これらのピークの干渉を受けないことも分かった。

0055

本発明によれば、核酸のPCR増幅産物、該PCR増幅産物の制限酵素断片、核酸の制限酵素断片等の標的核酸の分離検出を、短時間かつ高い分離性能で行うことができるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を提供することができる。さらに、本発明によれば、上記イオン交換クロマトグラフィー用充填剤をカラム充填剤として用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、標的核酸を短時間で精度よく分析できる分離検出方法を提供することができる。

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