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技術 血管形成に関連する障害を診断及び治療するための組成物と方法

出願人 ジェネンテック,インコーポレイテッド
発明者 ベーカー,ケヴィン,ピー.フェララ,ナポレオンゲルバー,ハンズピータージェリッツェン,メアリー,イー.ゴッダード,オードリーゴドウスキー,ポールジェー.ガーニー,オースティンエル.ヒラン,ケネス,ジェー.マースターズ,スコットエー.パン,ジェームスパオニ,ニコラス,エフ.ステファン,ジーン-フィリップ,エフ.ワタナベ,コリン,ケー.ウィリアムズ,ピー.,ミッキーウッド,ウィリアム,アイ.
出願日 2011年8月8日 (10年2ヶ月経過) 出願番号 2011-173336
公開日 2012年1月12日 (9年9ヶ月経過) 公開番号 2012-005493
状態 特許登録済
技術分野 ペプチド又は蛋白質 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード 固定補助 許容能力 中間平 最大壁厚 変更内 開放率 補償メカニズム テスト用サンプル
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (20)

課題

ヒトを含む哺乳動物における血管新生及び/又は心臓血管形成を刺激又は阻害するための組成物及び方法を提供する。

解決手段

製薬組成物は、これらの用途の一又は複数について同定されたポリペプチド又はそれに対するアンタゴニストに基づく。ここでの組成物により診断、予防又は治療される疾患は、創傷等の外傷、種々の癌、及びアテローム性硬化症及び心臓肥大を含む血管疾患を含む。さらに、新規なポリペプチド及びこれらのポリペプチドをコードする核酸分子に係る。またここで、これらの核酸配列を含むベクター及び宿主細胞異種ポリペプチドに融合した新規のポリペプチドを含むキメラポリペプチド分子、新規のポリペプチドに結合する抗体、及び本ポリペプチドの製造方法。

概要

背景

2.発明の背景
2.1.血管形成
血管形成誘導は、既存の血管から新しい血管の増殖又は出芽(sprouting)として定義され、胚発育期間に主として生じる複雑な過程である。成人の正常な生理学的状態下では、血管形成は、髪の毛の成長及び創傷治癒などの非常に限定された状況下においてのみ生じる(Auerbach, W.及びAuerbach, R., 1994, Pharmacol Ther 63(3):265-3 11;Ribatti等, 1991, Haematologica 76(4):3 11-20;Risau, 1997, Nature 386(6626):67 1-4)。制御されない血管形成が、限定はしないが、心臓血管疾患、癌、関節リウマチ乾癬及び糖尿病網膜症を含む広い範囲の疾患の原因であることが徐々に認識されてきた(Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31;Isner, 1999,Circulation 99(13):1653-5;Koch, 1998, Arthritis Rheum 41(6):951-62;Walsh, 1999, Rheumatology (Oxford) 38(2):103-12;Ware及びSimons, 1997, Nat Med 3(2):158-64)。
2.2.心疾患及び要因
約500万人のアメリカ人が心不全にかかり、毎年約400,000人が心不全の新しい患者となる。アメリカ合衆国における65以上の人々の入院の単独では最多の原因である。急性心筋梗塞を含む急性心不全に対する対応の最近の進歩の結果、慢性の心不全が発症した患者数が拡大している。1979年から1995年まで、鬱血性心不全(CHF)の患者は377,000人から872,000人(130パーセント増)に昇り、CHFによる死亡は116パーセント増えた。
CHFは、左心室機能不全運動耐性(exercise tolerance)の低下、生命水準の悪化、顕著な寿命の低下により特徴付けられる症候群である。心不全の必須条件は、心臓体組織の代謝必要量を満たすのに十分な速度で血液を押し出すことが不可能であることである(換言すれば、心拍出量不足である)。
末梢血管収縮心拍数の増加、心収縮性の増加、血漿容量の増加を含む、少なくとも4種の主要な補償メカニズムが心不全の場合に活性化される。これらの効果は、交感神経系レニン-アンジオテンシン系により主に媒介される。Eichhorn, American Journal of Medicine, 104: 163-169(1998)参照。交感神経系からの出力が増えると脈拍、心拍数、及び収縮性が上昇する。アンジオテンシIIは、1)血管平滑筋収縮を直接刺激し、2)アルドステロン抗利尿ホルモン分泌刺激することにより血漿容量の拡大を促進させ、3)交感神経媒介血管緊張を刺激し、4)血管拡張ナトリウム利尿活性を有するブラジキニン変性触媒することにより、血圧を上昇させる。Brown and Vaughan, Circulation, 97: 1411-1420(1998)による検討を参照。以下に記載するように、アンジオテンシンIIはまた、ミオサイト壊死(心臓収縮機能の悪化)及び心臓線維症(心臓拡張及び場合によっては収縮機能の悪化)を促進することで直接的に有害な影響を有する。Weber, Circulation, 96: 4065-4082(1998)参照。

鬱血性心不全(CHF)の共通した特徴は心臓肥大であり、心臓の拡大は力学的及びホルモン的刺激の両方により活性化され、心臓が心拍出量の増加の要求に適合できるようにする。Morgan and Baker,Circulation, 83: 13-25 (1991)。この肥大反応は、多くの場合、高血圧大動脈弁狭窄症心筋梗塞心筋症弁膜逆流、及び心内短絡のような様々な特徴的な病状に関わり、その全てが慢性的血行動態過負荷となる。
肥大は通常、腫瘍形成を含まず、自然成長に関与しない器官又は構造の大きさの増大として定義される。心臓の肥大は、個々の細胞(ミオサイト)の質量の増加、又は組織を形成する細胞数の増加(過形成)のどちらか又は両方により起こる。胎児心臓の拡大は主にミオサイト数の増加(出生直後まで続く)に依存するが、出生後の心臓ミオサイトは増殖能力を失う。更なる発達は個々の細胞の肥大を通して起こる。
成人のミオサイトの拡大は最初に個々の筋繊維の負担を少なくすることを可能にすることにより、障害性心機能に対しては短時間の応答として最初は有益である。しかしながら、過酷で長時間の過負荷を受けると、肥大細胞は劣化し始め、死亡する。Katz, "Heart Failure", in: Katz A.M. ed., Physiology of the Heart(New York: Raven Press, 1992)pp. 638-668。心臓肥大は、心不全の臨床経過での死亡率及び罹患率にとって重大な危険因子である。Katz, TrendsCardiovasc. Med.,5: 37-44 (1995)。心臓肥大の原因及び症状の更なる詳細については、例えばHeart Disease, A Textbook of Cardiovascular Medicine, Braunwald, E. ed. (W.B. Saunders Co., 1988),Chapter 14, "Pathophysiology of Heart Failure"。
細胞レベルでは、心臓はミオサイト及び包括的に非ミオサイトと呼ばれる周囲の支持細胞で構成される。非ミオサイトは最初線維芽細胞間葉細胞であり、またそれらは内皮及び平滑筋細胞を含む。実際、ミオサイトは成人心筋質量の大部分を形成しているが、心臓に存在する全細胞数の約30%にしか相当しない。ホルモン的、生理的、血行力学的、及び病理学的な刺激に対する反応では、成人心室筋細胞は、肥大化プロセスの活性化を通して負担が増えるのに適合することができる。この反応は、細胞の分裂及び心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の遺伝子を含む胎児遺伝子の活性化の付随なしに起こる、個々の心筋細胞収縮性タンパク質含有量とミオサイトの細胞サイズの増加により特徴付けられる。Chien等,FASEB J., 5: 3037-3046(1991); Chien等, Annu. Rev. Physiol., 55: 77-95(1993)。細胞外マトリックス内及び心筋内冠動脈周りにある間質性コラーゲン蓄積と関連したミオサイトの大きさの増大の結果として起こる心筋質量の増加は、ヒトにおいて圧負荷に引き続いて起こる左心室肥大において記述されている。Caspari等, Cardiovasc.Res., 11:554-558(1977); Schwarz等, Am. J. Cardiol., 42: 895-903(1978); Hess等, Circulation, 63: 360-371(1981); Pearlman等, Lab. Invest., 46 158-164(1982)。

また非ミオサイト支持細胞によって産生されたパラ分泌因子はさらに心臓肥大の発達に関わり得ることが示唆され、さらに様々な非ミオサイト由来肥大因子、例えば白血球抑制因子(LIF)及びエンドセリン等が同定されている。Metcalf, Growth Factors, 7: 169-173(1992); Kurzrock等, Endocrinne Reviews, 12: 208-217(1991); Inoue等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2863-2867(1989); Yanagisawa and Masaki, TredsPharm. Sci., 10: 374-378(1989); 米国特許第5573762(1996年11月12日公開)。心臓肥大の潜在的な介在物質とされる更なる例示的な因子は、カルジオトロフィン-1(CT-1)(Pennica等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 1142-1146(1995))、カテコールアミン類副腎皮質ステロイド類、アンジオテンシン、及びプロスタグランジン類を含む。
現在のところ、心肥大治療は潜在的な心臓疾患に依存して異なる。カテコールアミン類、副腎皮質ステロイド類、アンジオテンシン、プロスタグランジン類、LIF、エンドセリン、(エンドセリン-1、-2、及び-3及び大(big)エンドセリンを含む)及びCT-1は、肥大の潜在的な介在物質とされる因子にはいる。例えば、β-アドレナリン受容体遮断薬(β-遮断薬、例えばプロプラノロールチモロール、タートアルロール(tertalolol)、カルテオロールナドロールベタキソロールペンブトロールアセトブトロールアテノロールメトプロロールカルベジロール、等)及びベラパミルは、肥大型心筋症の治療に広く用いられている。症状(例えば胸痛)及び運動負荷でのβ-遮断薬の有益な効果は、主に心拍数を減らすことに依存し、その結果弛緩期延長し、受動的心室充満を増大する。Thompson等, Br. Heart J., 44: 488-98(1980); Harrison等,Circulation, 29: 84-98 (1964)。ベラパミルは心室充満を向上させ、恐らく心筋虚血を減少させるということが記載されている。Bonow 等, Circulation, 72: 853-64(1985)。
またニフェジピン及びジルチアゼムは時に肥大型心筋症の治療に利用される。Lorell等, Circulation, 65:499-507(1982); Betocchi等, Am. J.Cardiol.,78:451-457(1996)。しかしながら、強力な血管拡張特性のために、特に流出障害をもつ患者には、ニフェジピンは害になりうる。ジソピラミドはその負の筋収縮特性によって症状を和らげるのに使用される。Pollick, N. Engl. J. Med., 307: 997-999(1982)。しかしながら、多くの患者において、最初の効果は徐々に減ってくる。Wigle等,Circulation, 92: 1680-1692(1995)。抗高血圧薬治療は、血圧の上昇に関連する心臓肥大に有益な効果を有することが報告されている。抗高血圧治療に使用される、単独で又は組み合わせて使用される薬の例としては、カルシウムアンタゴニスト、例えばニトレンジピンアドレナリン受容体阻害薬、例えば上に挙げたもの;例えばキナプリルカプトプリルエナラプリルラミプリルベナゼプリルホシプリルリシノプリルのようなアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害薬;利尿薬、例えばクロロチアジドヒドロクロロチアジドヒドロフルメチアジドメチルクロチアジド(methylchlothiazide)、ベンズチアジド、ジクロロフェナミドアセタゾラミド、及びインダパミド;及びカルシウムチャネル阻害剤、例えばジルチアゼン、ニフェジピン、ベラパミル、及びニカルジピンがある。
例えば、ジルチアゼン及びカプトリルを用いた高血圧の治療は、左心室筋質量の減少を示すが、心臓拡張機能のドップラー指数は正常にならなかった。Szlachcic等, Am. J. Cardiol.,63: 198-201(1989); Shahi等, Lancet, 336: 458-461(1990)。これらの発見は、過剰量となった間質性コラーゲンが左心室肥大の退化後に残りうることを表すと解釈される。Rossi等, Am. Heart J., 124: 700-709(1992)。上掲のRossi等は、実験用ラットにおいて、圧負担心臓肥大での間質性線維症及び心筋細胞肥大の抑制及び退化でのカプトプリルの影響を研究した。

心筋収縮能を直接増加する薬剤(変力剤)は、初め、心不全を持つ患者に、短期間において心拍出量を改善するために有用であると思われていた。しかしながら、ジゴキシゲニンを除いた全ての陽性変力剤は、短期的に心臓の性能を改善するにしても、長期的には死亡率を高める。Massie, Curr. Op. in Cardiology, 12: 209-217(1997); Reddy等, Curr. Opin. Cardiol., 12:233-241(1997)。最近、β-アドレナリン受容体阻害剤は心不全での利用が提唱されている。臨床試験から明らかになったことは、心臓機能の改善が死亡率を増加させずに達成されうることが示唆されるが、患者の生存率が向上することは未だ実証されていない。また、CHF治療のカルジオトロピン-1又はそのアンタゴニスト、又は成長ホルモン及び/又はインシュリン様成長因子-Iに関する米国特許第5935924号、5624806号;5661122号;及び5610134号及び国際公開第95/28173号参照。他の治療様式心臓移植であるが、これはドナー心臓入手可能性により制限がある。
エンドセリンは21アミノ酸を含んでなる血管収縮ペプチドであり、ブタ動脈内皮培養上清から単離され、構造的に決定される。Yanagisawa等, Nature, 332: 411-415 (1998)。エンドセリンは後に様々な作用が発見され、エンドセリンアンタゴニストのようなエンドセリン抗体は心筋梗塞、腎不全、及び他の病気の治療に有効であることが証明されている。エンドセリンは生体内に存在し、血管収縮活性を示すため、それは循環系の調節に関する内生要因であることが予想され、さらに高血圧、心筋梗塞のような心疾患、急性腎不全のような腎臓病に関与しうる。エンドセリンアンタゴニストは、例えば米国特許第5773414号;日本特許公開3130299/1991号、欧州特許457195号、欧州特許460679号;及び欧州特許552489号に記載されている。エンドセリン受容体アンタゴニストを同定するための新規のエンドセリンB受容体は米国特許番号5773223号に記載されている。
心疾患の現在の治療は主に、カプトプリル、及び利尿薬のようなアンジオテンシン転換酵素(ACE)抑制剤の使用に向けられている。これらの薬剤は、血流力学的側面、及び運動負荷を改善し、CHFを持つ患者の死亡率及び発病率を減少させる。Kramer等,Circulation, 67(4): 807-816(1983); Captopril Multicenter Research Group, J.A.C.C., 2(4): 755-763(1983); The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1435(1987); The SOLVDInvestigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302(1991)。さらにそれらは高血圧、左心室機能障害、アテローム硬化血管疾患、及び糖尿病性ネフロパシーに利用される。上掲のBrown及びVaughan。しかしながら、効果が証明されたにも関わらず、ACE抑制剤の反応は限度がある。例えば、心不全の状況で延命したとき、ACE抑制剤は末期心不全への進行を遅らせるようだが、ACE抑制剤に関し大多数の患者が機能的クラスIIIの心不全を有する。
さらに、機能的許容能力の改善及び運動時間はほんのわずかで、死亡率は減少はするが、依然として高い。The CONSESUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1453(1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302(1991); Cohn等, N. Engl. J. Med., 325(5): 303-310(1991); The Captopril-Digoxin Multicenter Research Group, JAMA, 259(4): 539-544(1988)。従って、ACE抑制剤は心不全患者の60%以上において症状を緩和することができず、約15-20%まで心不全の死亡率を減少させるにすぎないようである。さらに副作用については、上掲のBroun及びVaughan参照。

ACE抑制剤の代替物は、特定のAT1受容体アンタゴニストによって表される。臨床研究では、心臓血管及び腎臓の疾患の治療において、これら2つの様態の効果の比較が計画されている。しかしながら、動物モデルのデータはACE/AngII経路が、心臓肥大に明確に関係しているが、唯一のものではないか、この役割での活性な主要経路ではないことを示唆する。マウス遺伝子ノックアウトモデルは経路の個々の成分を試験するために作成されている。あるそのようなモデルで、AngIIに対する主要な心臓病受容体、ATsub1Aが遺伝学的に欠失された;これらのマウスは、AngIIが実験的に与えられたとき 、肥大が発達しなかった(AngIIの二次的な肥大除去におけるモデルでの基本的な成功を確認)。しかしながら、大動脈がこれらの動物(高血圧心臓ストレスモデル)で収縮されたとき、心臓はなお肥大性になる。このことは、このレセプター(ATsub1A)に無関係な別のシグナル伝達経路が高血圧において活性化されていることを示唆している。ACE抑制剤は恐らくこれらの経路を抑制することはできないであろう。Harada等,Circulation, 97: 1952-1959(1998)参照。また、心臓肥大の過程及び機構に関連するに関してはHomcy, Circulation, 97: 1890-1892(1998)参照。
毎年約750,000人の患者が急性心筋梗塞(AMI)に懸かり、アメリカ合衆国での全死亡のおよそ4分の1がAMIによるものである。近年、血栓溶解剤、例えばストレプトキナーゼウロキナーゼ、及び特に組織プラスミノゲン活性剤(t-PA)は、心筋梗塞に罹患した患者の生存率を大きく向上させた。1.5から4時間の連続静脈注射として投与したとき、t-PAは治療を施した患者の69%から90%が90分で冠血管解放を引き起こす。Topol等, Am. J. Cardiol., 61: 723-728(1988); Neuhaus等, J. Am. Coll. Cardiol.,12: 581-587(1988); Neuhaus等, J. Am. Coll. Cardiol., 14: 1566-1569(1989)。最も高い開放率は、高い投与量又は急速な投与療法において報告されている。Topol, J. Am. Coll. Cardiol., 15: 922-924(1990)。またt-PAは一回のボーラスとして投与され得るし、それに関連する短い半減期に依存しているが、注入療法に適している。Tebbe等, Am. J. Cardiol., 64: 448-453(1989)。t-PA変異体は、特に長い半減期及び高いフィブリン特異性を有するように作成されているが、TNKt-PA(aT103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAAt-PA変異体、Keyt等, PROc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3670-3674(1994))は特にボーラス投与に適している。しかしながら、これら全ての発達にもかかわらず、患者の生存長期予後は、心臓肥大の監視及び治療を含む患者の注入後の監視及び治療にかなり依存する。

2.3.成長因子
報告によると、様々な自然発生ポリペプチド内皮細胞の増殖を誘導する。これらのポリペプチドは、塩基性の及び酸性線維芽細胞増殖因子(FGF)(Burgess及びMaciag, Annual Rev. Biochem., 58:575(1989))、血小板由来内皮細胞増殖因子(PD-ECGF)(Ishikawa等, Nature, 338: 557(1989))、及び血管内皮成長因子(VEGF)である。Leung等, Science, 246: 1306(1989); Ferrara及びHenzel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161:851(1989);Tischer等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 165: 1198(1989); 1996年7月31日に特許付与された欧州特許第471754B号。
ヒトVEGF(hVEGF)cDNA核酸移入した細胞による条件培地毛細血管内皮細胞の増殖を促進するのに対し、コントロールではそうではなかった。Leung等, Science 246: 1306(1989)。いくつかの付加cDNAはhVEGFの121-、189-、及び206-アミノ酸アイソフォーム(また集合的にhVEGF関連タンパク質と呼ばれる)をコードするヒトcDNAライブラリで同定された。121-アミノ酸タンパク質は、hVEGFの残基116及び159の間の44アミノ酸が欠失している特徴によってhVEGFと異なる。189-アミノ酸タンパク質は、hVEGFの残基116で24アミノ酸が挿入している特徴によってhVEGFと異なり、明らかにヒト血管透過性因子(hVPF)と同一である。206-アミノ酸タンパク質は、hVEGFの残基116で41アミノ酸が挿入している特徴によってhVEGFと異なる。Houck等, Mol. Endocrin., 5: 1806(1991); Ferrara等, J. Cell. Biochem., 47:211(1991);Endocrine Reviews, 13:18(1992); Keck等, Science, 246: 1309(1989); Connolly等, J. Biol. Chem., 264: 20017(1989); 1990年5月30日に公開された欧州特許第370989号。
現在、前から存在する内皮からの新しい血管の形成を含む脈管形成は、様々な疾患の病因と関連しているということがかなり証明されている。これらは、固形腫瘍及び転移アテローム性動脈硬化症水晶体後線維増殖症血管腫慢性炎症増殖性網膜症(例えば糖尿病性網膜症)のような眼内新生血管症候群、加齢性黄斑変性(AMD)、血管新生緑内障移植された角膜細胞及び他の細胞の免疫反応リウマチ様関節炎、及び乾癬を含む。Folkman等, J. Biol. Chem., 267: 10931-10934(1992); Klagsbrun等, Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239(1991); 及びGarner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition(Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710。
腫瘍成長の場合には、脈管形成は過形成から腫瘍形成への変化、固形腫瘍の成長用の滋養物の提供に非常に重要であると思われる。Folkman等, Nature, 339: 58(1989)。新血管新生は、正常な細胞に比べて腫瘍細胞の成長を有利にし、増殖自立性を与える。通常、腫瘍は、利用可能な毛細血管床からの距離に依存した、たかだか数立方ミリメートルの大きさにのみ増殖可能な異常な単一細胞として発症し、長期間、更なる増殖及び汎発を伴わない「休眠状態」で留まることができる。その後、特定の腫瘍は、内皮細胞を活性化する血管原性表現型にスイッチし、新規の毛細血管中へと成長し、成熟を行う。これら新規形成された血管は、原発腫瘍の成長の継続を可能ならしめるだけでなく、転移性腫瘍細胞の汎発及び再コロニー化も可能にする。従って、腫瘍部分微細血管密度乳癌並びにいくつかの他の腫瘍での患者生存率の間には相関関係が見られる。Weidner等, N. Engl. J. Med, 324: 1-6(1991); Horak等, Lancet, 340: 1120-1124(1992); Macchiarini等, Lancet, 340: 145-146(1992)。血管形成スイッチをコントロールする正確なメカニズムはよく理解されていない、しかし、腫瘍塊新血管形成の結果、多くの血管形成の刺激因子及び阻害因子正味バランスが保たれることになる(Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31)。
脈管形成の正の制御因子を探求することで、aFGF、bFGF、TGF-α、TGF-β、HGF、TNF-α、アンジオテンシン、IL-8、等を含む多くの候補が与えられた。上掲のFolkman等, J. B. C.、及び上掲のKlagsbrun等。これまでに定義された負の制御因子はトロンボスポンジン(Good等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87: 6624-6628(1990))、プロラクチンの16-キロダルトンN-末端断片(Clapp等, Endocrinology, 133: 1292-1299(1993))、アンジオスタチン(O'Reilly等, Cell, 79: 315-328(1994))、及びエンドスタチン。O'Reilly等, Cell, 88: 277-285(1996)。

ここ数年の研究で、血管内皮細胞の増殖を刺激するだけでなく、血管浸透及び脈管形成を誘発することのVEGFの重要な役割が明らかになっている。Ferrara等, Endocr. Rev., 18: 4-25(1997)。一つのVEGF対立遺伝子さえ喪失すると胎児死亡に至るという知見は、血管系の発達と分化におけるこの因子が担っている代替のない役割を示している。さらに、VEGFは腫瘍及び眼内疾患に関連した新血管新生の重要な媒介物であることが示されている。Ferrara等, Endocr. Rev., 上掲。VEGFmRNA検査した多くのヒト腫瘍過剰発現している。Berkman等, J. Clin. Invest., 91:153-159(1993);Brown等, Human Pathol., 26:89-91(1995);Brown等, Cancer Res., 53:4727-4735(1993);Mattern等, Brit. J. Cancer, 73:931-934(1996);Dvorak等, Am. J. Pathol., 146:1029-1039(1995)。
また、眼の流体中のVEGFの濃度レベルは、糖尿病及び他の虚血関連網膜症を有する患者における血管の活性増殖の存在性と高い相関関係がある。Aiello等, N. Engl. J. Med., 331:1480-1487(1994)。さらに、近年の研究により、AMDの影響を受けている患者の脈絡膜新生血管膜にVEGFが局在化していることが示されている。Lopez等, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37:855-868(1996)。
抗-VEGF中和抗体は、ヌードマウスにおいて、様々なヒト腫瘍株化細胞の成長を抑制し(Kim等, Nature, 362:841-844(1993);Warren等, J. Clin. Invest., 95:1789-1797(1995);Borgstrom等, Cancer Res., 56:4032-4039(1996);Melnyk等, Cancer Res., 56:921-924(1996))、また虚血性網膜疾患における眼内血管形成を阻害する。Adamis等, Arch. Ophthalmol., 114:66-71(1996)。よって、抗-VEGFモノクローナル抗体又はVEGF作用に対する他のインヒビターは、固形腫瘍及び種々の眼内新血管疾患の治療用候補薬とされている。このような抗体は、例えば1998年1月14日に公開されたEP817,648及び1998年10月15日に共に公開された国際公開第98/45331号及び国際公開第98/45332号に記載されている。

ある種の細胞により発現する遺伝子の複合体を素早く誘導することができる、トランスフォーミングガン遺伝子を含む、いくつかの他の成長因子及び分裂促進因子が存在する。Lau及びNathans, Molecular Aspects of Cellular Regulation, 6:165-202(1991)。前初期遺伝子又は初期反応遺伝子と命名されているこれらの遺伝子は、新規タンパク質合成と無関係に、成長因子又は分裂促進因子と接触後数分間で転写的に活性化される。これらの前初期遺伝子のグループは、分化及び増殖、再生、及び傷治療等の複雑な生物学的プロセスを調整するのに必要な、分泌性細胞外タンパク質をコードする。Ryseck等, Cell Growth Differ., 2:235-233(1991)。
このグループに属する高度に関連したタンパク質には、cef10(Simmons等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1178-1182(1989))、血清-又は血小板誘導成長因子(PDGF)により素早く活性化されるcyr61(O'Brien等, Mol. Cell. Biol., 10:3569-3577(1990))、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)による活性化後に高レベルヒト血管内皮細胞により分泌され、PDGF様の生物学的及び免疫学的活性を示し、特定の細胞表面レセプターに対してPDGFと競合するヒト結合組織成長因子(CTGF)(Bradham等, J. Cell. Biol., 114:1285-1294(1991))、fisp-12(Ryseck等, Cell Growth Differ., 2:235-233(1991))、ヒト血管IBP-様成長因子(VIGF)(WO96/17931)、及び通常は成人腎臓細胞に静止され、骨髄芽球-関連-ウイルスI型誘発腎芽細胞腫において過剰発現することが見出されているnovが含まれる。Joloit等, Mol. Cell. Biol., 12:10-21(1992)。
これらの前初期遺伝子の発現は、成長因子により誘発される事象カスケードにおける「第3のメッセンジャー」として作用する。また、それらは複雑な生物学的プロセス、例えば分化及び細胞増殖が通常の事象である傷治療を統合及び調整するのに必要であると考えられている。
付加的な分裂促進因子として、インシュリン様成長因子結合タンパク質(IGFBPs)が、インシュリン様成長因子(IGF)との複合体において、線維芽細胞及び平滑筋細胞表面レセプターへのIGFの結合性を増加させるように刺激することが示されている。Clemmonsら., J. Clin. Invest., 77: 1548(1986)。様々なインビトロでのIGF作用に対するIGFBPの阻害効果は、脂肪細胞によるグルコース輸送の刺激、軟骨細胞によるサルフェートの取り込み、及び線維芽細胞中へのチミジンの取り込みを含む。Zapf等, J. Clin. Invest., 63:1077(1979)。さらに、正常な細胞での、成長因子媒介性分裂促進因子活性におけるIGFBPの阻害効果が示されている。

2.4.さらなる治療の必要性
多くの病気及び疾患における血管内皮細胞の成長及び血管形成の役割に鑑みると、これらのプロセスに起因する一又は複数の生物学的影響を低減又は抑制する手段を有していることが好ましい。また、正常及び病気の状態、特にガンにおいて病原性ポリペプチドの存在を検査する手段を有していることも望ましい。さらに、特定の側面では、心臓肥大の治療には一般的に適用できる治療法がないので、心臓ミオサイト肥大を防止又は低減可能な因子を同定することは、病態生理学的な心臓成長を阻害するための新規な治療方策の開発において非常に重要である。様々な心臓血管及び発癌遺伝子疾患のためのいくつかの治療様式が存在するが、さらなる治療的アプローチがなお必要とされている。

概要

ヒトを含む哺乳動物における血管新生及び/又は心臓血管形成を刺激又は阻害するための組成物及び方法を提供する。製薬組成物は、これらの用途の一又は複数について同定されたポリペプチド又はそれに対するアンタゴニストに基づく。ここでの組成物により診断、予防又は治療される疾患は、創傷等の外傷、種々の癌、及びアテローム性硬化症及び心臓肥大を含む血管疾患を含む。さらに、新規なポリペプチド及びこれらのポリペプチドをコードする核酸分子に係る。またここで、これらの核酸配列を含むベクター及び宿主細胞異種ポリペプチドに融合した新規のポリペプチドを含むキメラポリペプチド分子、新規のポリペプチドに結合する抗体、及び本ポリペプチドの製造方法。なし

目的

従って、血管形成の促進又は阻害、血管内皮細胞成長の阻害又は刺激、血管内皮細胞の成長又は増殖の刺激、腫瘍成長の阻害、血管形成依存性組織成長の阻害、血管形成依存性組織成長の刺激、心臓肥大の阻害及び心臓肥大の刺激、例えば鬱血性心不全の治療等の効果が望まれている

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技術分野

0001

1.発明の分野
本発明は、かかる生物学的効果を必要とする哺乳動物において血管形成及び/又は心臓血管新生の調節(例えば、促進又は阻害)に有用な組成物及び方法に関する。さらに、本発明は、血管形成に関与する疾患(例えば、心臓血管並びに腫瘍学的疾患)の診断及び治療に関する。

背景技術

0002

2.発明の背景
2.1.血管形成
血管形成誘導は、既存の血管から新しい血管の増殖又は出芽(sprouting)として定義され、胚発育期間に主として生じる複雑な過程である。成人の正常な生理学的状態下では、血管形成は、髪の毛の成長及び創傷治癒などの非常に限定された状況下においてのみ生じる(Auerbach, W.及びAuerbach, R., 1994, Pharmacol Ther 63(3):265-3 11;Ribatti等, 1991, Haematologica 76(4):3 11-20;Risau, 1997, Nature 386(6626):67 1-4)。制御されない血管形成が、限定はしないが、心臓血管疾患、癌、関節リウマチ乾癬及び糖尿病網膜症を含む広い範囲の疾患の原因であることが徐々に認識されてきた(Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31;Isner, 1999,Circulation 99(13):1653-5;Koch, 1998, Arthritis Rheum 41(6):951-62;Walsh, 1999, Rheumatology (Oxford) 38(2):103-12;Ware及びSimons, 1997, Nat Med 3(2):158-64)。
2.2.心疾患及び要因
約500万人のアメリカ人が心不全にかかり、毎年約400,000人が心不全の新しい患者となる。アメリカ合衆国における65以上の人々の入院の単独では最多の原因である。急性心筋梗塞を含む急性心不全に対する対応の最近の進歩の結果、慢性の心不全が発症した患者数が拡大している。1979年から1995年まで、鬱血性心不全(CHF)の患者は377,000人から872,000人(130パーセント増)に昇り、CHFによる死亡は116パーセント増えた。
CHFは、左心室機能不全運動耐性(exercise tolerance)の低下、生命水準の悪化、顕著な寿命の低下により特徴付けられる症候群である。心不全の必須条件は、心臓体組織の代謝必要量を満たすのに十分な速度で血液を押し出すことが不可能であることである(換言すれば、心拍出量不足である)。
末梢血管収縮心拍数の増加、心収縮性の増加、血漿容量の増加を含む、少なくとも4種の主要な補償メカニズムが心不全の場合に活性化される。これらの効果は、交感神経系レニン-アンジオテンシン系により主に媒介される。Eichhorn, American Journal of Medicine, 104: 163-169(1998)参照。交感神経系からの出力が増えると脈拍、心拍数、及び収縮性が上昇する。アンジオテンシIIは、1)血管平滑筋収縮を直接刺激し、2)アルドステロン抗利尿ホルモン分泌刺激することにより血漿容量の拡大を促進させ、3)交感神経媒介血管緊張を刺激し、4)血管拡張ナトリウム利尿活性を有するブラジキニン変性触媒することにより、血圧を上昇させる。Brown and Vaughan, Circulation, 97: 1411-1420(1998)による検討を参照。以下に記載するように、アンジオテンシンIIはまた、ミオサイト壊死(心臓収縮機能の悪化)及び心臓線維症(心臓拡張及び場合によっては収縮機能の悪化)を促進することで直接的に有害な影響を有する。Weber, Circulation, 96: 4065-4082(1998)参照。

0003

鬱血性心不全(CHF)の共通した特徴は心臓肥大であり、心臓の拡大は力学的及びホルモン的刺激の両方により活性化され、心臓が心拍出量の増加の要求に適合できるようにする。Morgan and Baker,Circulation, 83: 13-25 (1991)。この肥大反応は、多くの場合、高血圧大動脈弁狭窄症心筋梗塞心筋症弁膜逆流、及び心内短絡のような様々な特徴的な病状に関わり、その全てが慢性的血行動態過負荷となる。
肥大は通常、腫瘍形成を含まず、自然成長に関与しない器官又は構造の大きさの増大として定義される。心臓の肥大は、個々の細胞(ミオサイト)の質量の増加、又は組織を形成する細胞数の増加(過形成)のどちらか又は両方により起こる。胎児心臓の拡大は主にミオサイト数の増加(出生直後まで続く)に依存するが、出生後の心臓ミオサイトは増殖能力を失う。更なる発達は個々の細胞の肥大を通して起こる。
成人のミオサイトの拡大は最初に個々の筋繊維の負担を少なくすることを可能にすることにより、障害性心機能に対しては短時間の応答として最初は有益である。しかしながら、過酷で長時間の過負荷を受けると、肥大細胞は劣化し始め、死亡する。Katz, "Heart Failure", in: Katz A.M. ed., Physiology of the Heart(New York: Raven Press, 1992)pp. 638-668。心臓肥大は、心不全の臨床経過での死亡率及び罹患率にとって重大な危険因子である。Katz, TrendsCardiovasc. Med.,5: 37-44 (1995)。心臓肥大の原因及び症状の更なる詳細については、例えばHeart Disease, A Textbook of Cardiovascular Medicine, Braunwald, E. ed. (W.B. Saunders Co., 1988),Chapter 14, "Pathophysiology of Heart Failure"。
細胞レベルでは、心臓はミオサイト及び包括的に非ミオサイトと呼ばれる周囲の支持細胞で構成される。非ミオサイトは最初線維芽細胞間葉細胞であり、またそれらは内皮及び平滑筋細胞を含む。実際、ミオサイトは成人心筋質量の大部分を形成しているが、心臓に存在する全細胞数の約30%にしか相当しない。ホルモン的、生理的、血行力学的、及び病理学的な刺激に対する反応では、成人心室筋細胞は、肥大化プロセスの活性化を通して負担が増えるのに適合することができる。この反応は、細胞の分裂及び心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の遺伝子を含む胎児遺伝子の活性化の付随なしに起こる、個々の心筋細胞収縮性タンパク質含有量とミオサイトの細胞サイズの増加により特徴付けられる。Chien等,FASEB J., 5: 3037-3046(1991); Chien等, Annu. Rev. Physiol., 55: 77-95(1993)。細胞外マトリックス内及び心筋内冠動脈周りにある間質性コラーゲン蓄積と関連したミオサイトの大きさの増大の結果として起こる心筋質量の増加は、ヒトにおいて圧負荷に引き続いて起こる左心室肥大において記述されている。Caspari等, Cardiovasc.Res., 11:554-558(1977); Schwarz等, Am. J. Cardiol., 42: 895-903(1978); Hess等, Circulation, 63: 360-371(1981); Pearlman等, Lab. Invest., 46 158-164(1982)。

0004

また非ミオサイト支持細胞によって産生されたパラ分泌因子はさらに心臓肥大の発達に関わり得ることが示唆され、さらに様々な非ミオサイト由来肥大因子、例えば白血球抑制因子(LIF)及びエンドセリン等が同定されている。Metcalf, Growth Factors, 7: 169-173(1992); Kurzrock等, Endocrinne Reviews, 12: 208-217(1991); Inoue等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2863-2867(1989); Yanagisawa and Masaki, TredsPharm. Sci., 10: 374-378(1989); 米国特許第5573762(1996年11月12日公開)。心臓肥大の潜在的な介在物質とされる更なる例示的な因子は、カルジオトロフィン-1(CT-1)(Pennica等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 1142-1146(1995))、カテコールアミン類副腎皮質ステロイド類、アンジオテンシン、及びプロスタグランジン類を含む。
現在のところ、心肥大の治療は潜在的な心臓疾患に依存して異なる。カテコールアミン類、副腎皮質ステロイド類、アンジオテンシン、プロスタグランジン類、LIF、エンドセリン、(エンドセリン-1、-2、及び-3及び大(big)エンドセリンを含む)及びCT-1は、肥大の潜在的な介在物質とされる因子にはいる。例えば、β-アドレナリン受容体遮断薬(β-遮断薬、例えばプロプラノロールチモロール、タートアルロール(tertalolol)、カルテオロールナドロールベタキソロールペンブトロールアセトブトロールアテノロールメトプロロールカルベジロール、等)及びベラパミルは、肥大型心筋症の治療に広く用いられている。症状(例えば胸痛)及び運動負荷でのβ-遮断薬の有益な効果は、主に心拍数を減らすことに依存し、その結果弛緩期延長し、受動的心室充満を増大する。Thompson等, Br. Heart J., 44: 488-98(1980); Harrison等,Circulation, 29: 84-98 (1964)。ベラパミルは心室充満を向上させ、恐らく心筋虚血を減少させるということが記載されている。Bonow 等, Circulation, 72: 853-64(1985)。
またニフェジピン及びジルチアゼムは時に肥大型心筋症の治療に利用される。Lorell等, Circulation, 65:499-507(1982); Betocchi等, Am. J.Cardiol.,78:451-457(1996)。しかしながら、強力な血管拡張特性のために、特に流出障害をもつ患者には、ニフェジピンは害になりうる。ジソピラミドはその負の筋収縮特性によって症状を和らげるのに使用される。Pollick, N. Engl. J. Med., 307: 997-999(1982)。しかしながら、多くの患者において、最初の効果は徐々に減ってくる。Wigle等,Circulation, 92: 1680-1692(1995)。抗高血圧薬治療は、血圧の上昇に関連する心臓肥大に有益な効果を有することが報告されている。抗高血圧治療に使用される、単独で又は組み合わせて使用される薬の例としては、カルシウムアンタゴニスト、例えばニトレンジピンアドレナリン受容体阻害薬、例えば上に挙げたもの;例えばキナプリルカプトプリルエナラプリルラミプリルベナゼプリルホシプリルリシノプリルのようなアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害薬;利尿薬、例えばクロロチアジドヒドロクロロチアジドヒドロフルメチアジドメチルクロチアジド(methylchlothiazide)、ベンズチアジド、ジクロロフェナミドアセタゾラミド、及びインダパミド;及びカルシウムチャネル阻害剤、例えばジルチアゼン、ニフェジピン、ベラパミル、及びニカルジピンがある。
例えば、ジルチアゼン及びカプトリルを用いた高血圧の治療は、左心室筋質量の減少を示すが、心臓拡張機能のドップラー指数は正常にならなかった。Szlachcic等, Am. J. Cardiol.,63: 198-201(1989); Shahi等, Lancet, 336: 458-461(1990)。これらの発見は、過剰量となった間質性コラーゲンが左心室肥大の退化後に残りうることを表すと解釈される。Rossi等, Am. Heart J., 124: 700-709(1992)。上掲のRossi等は、実験用ラットにおいて、圧負担心臓肥大での間質性線維症及び心筋細胞肥大の抑制及び退化でのカプトプリルの影響を研究した。

0005

心筋収縮能を直接増加する薬剤(変力剤)は、初め、心不全を持つ患者に、短期間において心拍出量を改善するために有用であると思われていた。しかしながら、ジゴキシゲニンを除いた全ての陽性変力剤は、短期的に心臓の性能を改善するにしても、長期的には死亡率を高める。Massie, Curr. Op. in Cardiology, 12: 209-217(1997); Reddy等, Curr. Opin. Cardiol., 12:233-241(1997)。最近、β-アドレナリン受容体阻害剤は心不全での利用が提唱されている。臨床試験から明らかになったことは、心臓機能の改善が死亡率を増加させずに達成されうることが示唆されるが、患者の生存率が向上することは未だ実証されていない。また、CHF治療のカルジオトロピン-1又はそのアンタゴニスト、又は成長ホルモン及び/又はインシュリン様成長因子-Iに関する米国特許第5935924号、5624806号;5661122号;及び5610134号及び国際公開第95/28173号参照。他の治療様式心臓移植であるが、これはドナー心臓入手可能性により制限がある。
エンドセリンは21アミノ酸を含んでなる血管収縮ペプチドであり、ブタ動脈内皮培養上清から単離され、構造的に決定される。Yanagisawa等, Nature, 332: 411-415 (1998)。エンドセリンは後に様々な作用が発見され、エンドセリンアンタゴニストのようなエンドセリン抗体は心筋梗塞、腎不全、及び他の病気の治療に有効であることが証明されている。エンドセリンは生体内に存在し、血管収縮活性を示すため、それは循環系の調節に関する内生要因であることが予想され、さらに高血圧、心筋梗塞のような心疾患、急性腎不全のような腎臓病に関与しうる。エンドセリンアンタゴニストは、例えば米国特許第5773414号;日本特許公開3130299/1991号、欧州特許457195号、欧州特許460679号;及び欧州特許552489号に記載されている。エンドセリン受容体アンタゴニストを同定するための新規のエンドセリンB受容体は米国特許番号5773223号に記載されている。
心疾患の現在の治療は主に、カプトプリル、及び利尿薬のようなアンジオテンシン転換酵素(ACE)抑制剤の使用に向けられている。これらの薬剤は、血流力学的側面、及び運動負荷を改善し、CHFを持つ患者の死亡率及び発病率を減少させる。Kramer等,Circulation, 67(4): 807-816(1983); Captopril Multicenter Research Group, J.A.C.C., 2(4): 755-763(1983); The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1435(1987); The SOLVDInvestigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302(1991)。さらにそれらは高血圧、左心室機能障害、アテローム硬化血管疾患、及び糖尿病性ネフロパシーに利用される。上掲のBrown及びVaughan。しかしながら、効果が証明されたにも関わらず、ACE抑制剤の反応は限度がある。例えば、心不全の状況で延命したとき、ACE抑制剤は末期心不全への進行を遅らせるようだが、ACE抑制剤に関し大多数の患者が機能的クラスIIIの心不全を有する。
さらに、機能的許容能力の改善及び運動時間はほんのわずかで、死亡率は減少はするが、依然として高い。The CONSESUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1453(1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302(1991); Cohn等, N. Engl. J. Med., 325(5): 303-310(1991); The Captopril-Digoxin Multicenter Research Group, JAMA, 259(4): 539-544(1988)。従って、ACE抑制剤は心不全患者の60%以上において症状を緩和することができず、約15-20%まで心不全の死亡率を減少させるにすぎないようである。さらに副作用については、上掲のBroun及びVaughan参照。

0006

ACE抑制剤の代替物は、特定のAT1受容体アンタゴニストによって表される。臨床研究では、心臓血管及び腎臓の疾患の治療において、これら2つの様態の効果の比較が計画されている。しかしながら、動物モデルのデータはACE/AngII経路が、心臓肥大に明確に関係しているが、唯一のものではないか、この役割での活性な主要経路ではないことを示唆する。マウス遺伝子ノックアウトモデルは経路の個々の成分を試験するために作成されている。あるそのようなモデルで、AngIIに対する主要な心臓病受容体、ATsub1Aが遺伝学的に欠失された;これらのマウスは、AngIIが実験的に与えられたとき 、肥大が発達しなかった(AngIIの二次的な肥大除去におけるモデルでの基本的な成功を確認)。しかしながら、大動脈がこれらの動物(高血圧心臓ストレスモデル)で収縮されたとき、心臓はなお肥大性になる。このことは、このレセプター(ATsub1A)に無関係な別のシグナル伝達経路が高血圧において活性化されていることを示唆している。ACE抑制剤は恐らくこれらの経路を抑制することはできないであろう。Harada等,Circulation, 97: 1952-1959(1998)参照。また、心臓肥大の過程及び機構に関連するに関してはHomcy, Circulation, 97: 1890-1892(1998)参照。
毎年約750,000人の患者が急性心筋梗塞(AMI)に懸かり、アメリカ合衆国での全死亡のおよそ4分の1がAMIによるものである。近年、血栓溶解剤、例えばストレプトキナーゼウロキナーゼ、及び特に組織プラスミノゲン活性剤(t-PA)は、心筋梗塞に罹患した患者の生存率を大きく向上させた。1.5から4時間の連続静脈注射として投与したとき、t-PAは治療を施した患者の69%から90%が90分で冠血管解放を引き起こす。Topol等, Am. J. Cardiol., 61: 723-728(1988); Neuhaus等, J. Am. Coll. Cardiol.,12: 581-587(1988); Neuhaus等, J. Am. Coll. Cardiol., 14: 1566-1569(1989)。最も高い開放率は、高い投与量又は急速な投与療法において報告されている。Topol, J. Am. Coll. Cardiol., 15: 922-924(1990)。またt-PAは一回のボーラスとして投与され得るし、それに関連する短い半減期に依存しているが、注入療法に適している。Tebbe等, Am. J. Cardiol., 64: 448-453(1989)。t-PA変異体は、特に長い半減期及び高いフィブリン特異性を有するように作成されているが、TNKt-PA(aT103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAAt-PA変異体、Keyt等, PROc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3670-3674(1994))は特にボーラス投与に適している。しかしながら、これら全ての発達にもかかわらず、患者の生存長期予後は、心臓肥大の監視及び治療を含む患者の注入後の監視及び治療にかなり依存する。

0007

2.3.成長因子
報告によると、様々な自然発生ポリペプチド内皮細胞の増殖を誘導する。これらのポリペプチドは、塩基性の及び酸性線維芽細胞増殖因子(FGF)(Burgess及びMaciag, Annual Rev. Biochem., 58:575(1989))、血小板由来内皮細胞増殖因子(PD-ECGF)(Ishikawa等, Nature, 338: 557(1989))、及び血管内皮成長因子(VEGF)である。Leung等, Science, 246: 1306(1989); Ferrara及びHenzel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161:851(1989);Tischer等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 165: 1198(1989); 1996年7月31日に特許付与された欧州特許第471754B号。
ヒトVEGF(hVEGF)cDNA核酸移入した細胞による条件培地毛細血管内皮細胞の増殖を促進するのに対し、コントロールではそうではなかった。Leung等, Science 246: 1306(1989)。いくつかの付加cDNAはhVEGFの121-、189-、及び206-アミノ酸アイソフォーム(また集合的にhVEGF関連タンパク質と呼ばれる)をコードするヒトcDNAライブラリで同定された。121-アミノ酸タンパク質は、hVEGFの残基116及び159の間の44アミノ酸が欠失している特徴によってhVEGFと異なる。189-アミノ酸タンパク質は、hVEGFの残基116で24アミノ酸が挿入している特徴によってhVEGFと異なり、明らかにヒト血管透過性因子(hVPF)と同一である。206-アミノ酸タンパク質は、hVEGFの残基116で41アミノ酸が挿入している特徴によってhVEGFと異なる。Houck等, Mol. Endocrin., 5: 1806(1991); Ferrara等, J. Cell. Biochem., 47:211(1991);Endocrine Reviews, 13:18(1992); Keck等, Science, 246: 1309(1989); Connolly等, J. Biol. Chem., 264: 20017(1989); 1990年5月30日に公開された欧州特許第370989号。
現在、前から存在する内皮からの新しい血管の形成を含む脈管形成は、様々な疾患の病因と関連しているということがかなり証明されている。これらは、固形腫瘍及び転移アテローム性動脈硬化症水晶体後線維増殖症血管腫慢性炎症増殖性網膜症(例えば糖尿病性網膜症)のような眼内新生血管症候群、加齢性黄斑変性(AMD)、血管新生緑内障移植された角膜細胞及び他の細胞の免疫反応リウマチ様関節炎、及び乾癬を含む。Folkman等, J. Biol. Chem., 267: 10931-10934(1992); Klagsbrun等, Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239(1991); 及びGarner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition(Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710。
腫瘍成長の場合には、脈管形成は過形成から腫瘍形成への変化、固形腫瘍の成長用の滋養物の提供に非常に重要であると思われる。Folkman等, Nature, 339: 58(1989)。新血管新生は、正常な細胞に比べて腫瘍細胞の成長を有利にし、増殖自立性を与える。通常、腫瘍は、利用可能な毛細血管床からの距離に依存した、たかだか数立方ミリメートルの大きさにのみ増殖可能な異常な単一細胞として発症し、長期間、更なる増殖及び汎発を伴わない「休眠状態」で留まることができる。その後、特定の腫瘍は、内皮細胞を活性化する血管原性表現型にスイッチし、新規の毛細血管中へと成長し、成熟を行う。これら新規形成された血管は、原発腫瘍の成長の継続を可能ならしめるだけでなく、転移性腫瘍細胞の汎発及び再コロニー化も可能にする。従って、腫瘍部分微細血管密度乳癌並びにいくつかの他の腫瘍での患者生存率の間には相関関係が見られる。Weidner等, N. Engl. J. Med, 324: 1-6(1991); Horak等, Lancet, 340: 1120-1124(1992); Macchiarini等, Lancet, 340: 145-146(1992)。血管形成スイッチをコントロールする正確なメカニズムはよく理解されていない、しかし、腫瘍塊新血管形成の結果、多くの血管形成の刺激因子及び阻害因子正味バランスが保たれることになる(Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31)。
脈管形成の正の制御因子を探求することで、aFGF、bFGF、TGF-α、TGF-β、HGF、TNF-α、アンジオテンシン、IL-8、等を含む多くの候補が与えられた。上掲のFolkman等, J. B. C.、及び上掲のKlagsbrun等。これまでに定義された負の制御因子はトロンボスポンジン(Good等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87: 6624-6628(1990))、プロラクチンの16-キロダルトンN-末端断片(Clapp等, Endocrinology, 133: 1292-1299(1993))、アンジオスタチン(O'Reilly等, Cell, 79: 315-328(1994))、及びエンドスタチン。O'Reilly等, Cell, 88: 277-285(1996)。

0008

ここ数年の研究で、血管内皮細胞の増殖を刺激するだけでなく、血管浸透及び脈管形成を誘発することのVEGFの重要な役割が明らかになっている。Ferrara等, Endocr. Rev., 18: 4-25(1997)。一つのVEGF対立遺伝子さえ喪失すると胎児死亡に至るという知見は、血管系の発達と分化におけるこの因子が担っている代替のない役割を示している。さらに、VEGFは腫瘍及び眼内疾患に関連した新血管新生の重要な媒介物であることが示されている。Ferrara等, Endocr. Rev., 上掲。VEGFmRNA検査した多くのヒト腫瘍過剰発現している。Berkman等, J. Clin. Invest., 91:153-159(1993);Brown等, Human Pathol., 26:89-91(1995);Brown等, Cancer Res., 53:4727-4735(1993);Mattern等, Brit. J. Cancer, 73:931-934(1996);Dvorak等, Am. J. Pathol., 146:1029-1039(1995)。
また、眼の流体中のVEGFの濃度レベルは、糖尿病及び他の虚血関連網膜症を有する患者における血管の活性増殖の存在性と高い相関関係がある。Aiello等, N. Engl. J. Med., 331:1480-1487(1994)。さらに、近年の研究により、AMDの影響を受けている患者の脈絡膜新生血管膜にVEGFが局在化していることが示されている。Lopez等, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37:855-868(1996)。
抗-VEGF中和抗体は、ヌードマウスにおいて、様々なヒト腫瘍株化細胞の成長を抑制し(Kim等, Nature, 362:841-844(1993);Warren等, J. Clin. Invest., 95:1789-1797(1995);Borgstrom等, Cancer Res., 56:4032-4039(1996);Melnyk等, Cancer Res., 56:921-924(1996))、また虚血性網膜疾患における眼内血管形成を阻害する。Adamis等, Arch. Ophthalmol., 114:66-71(1996)。よって、抗-VEGFモノクローナル抗体又はVEGF作用に対する他のインヒビターは、固形腫瘍及び種々の眼内新血管疾患の治療用候補薬とされている。このような抗体は、例えば1998年1月14日に公開されたEP817,648及び1998年10月15日に共に公開された国際公開第98/45331号及び国際公開第98/45332号に記載されている。

0009

ある種の細胞により発現する遺伝子の複合体を素早く誘導することができる、トランスフォーミングガン遺伝子を含む、いくつかの他の成長因子及び分裂促進因子が存在する。Lau及びNathans, Molecular Aspects of Cellular Regulation, 6:165-202(1991)。前初期遺伝子又は初期反応遺伝子と命名されているこれらの遺伝子は、新規タンパク質合成と無関係に、成長因子又は分裂促進因子と接触後数分間で転写的に活性化される。これらの前初期遺伝子のグループは、分化及び増殖、再生、及び傷治療等の複雑な生物学的プロセスを調整するのに必要な、分泌性細胞外タンパク質をコードする。Ryseck等, Cell Growth Differ., 2:235-233(1991)。
このグループに属する高度に関連したタンパク質には、cef10(Simmons等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1178-1182(1989))、血清-又は血小板誘導成長因子(PDGF)により素早く活性化されるcyr61(O'Brien等, Mol. Cell. Biol., 10:3569-3577(1990))、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)による活性化後に高レベルヒト血管内皮細胞により分泌され、PDGF様の生物学的及び免疫学的活性を示し、特定の細胞表面レセプターに対してPDGFと競合するヒト結合組織成長因子(CTGF)(Bradham等, J. Cell. Biol., 114:1285-1294(1991))、fisp-12(Ryseck等, Cell Growth Differ., 2:235-233(1991))、ヒト血管IBP-様成長因子(VIGF)(WO96/17931)、及び通常は成人腎臓細胞に静止され、骨髄芽球-関連-ウイルスI型誘発腎芽細胞腫において過剰発現することが見出されているnovが含まれる。Joloit等, Mol. Cell. Biol., 12:10-21(1992)。
これらの前初期遺伝子の発現は、成長因子により誘発される事象カスケードにおける「第3のメッセンジャー」として作用する。また、それらは複雑な生物学的プロセス、例えば分化及び細胞増殖が通常の事象である傷治療を統合及び調整するのに必要であると考えられている。
付加的な分裂促進因子として、インシュリン様成長因子結合タンパク質(IGFBPs)が、インシュリン様成長因子(IGF)との複合体において、線維芽細胞及び平滑筋細胞表面レセプターへのIGFの結合性を増加させるように刺激することが示されている。Clemmonsら., J. Clin. Invest., 77: 1548(1986)。様々なインビトロでのIGF作用に対するIGFBPの阻害効果は、脂肪細胞によるグルコース輸送の刺激、軟骨細胞によるサルフェートの取り込み、及び線維芽細胞中へのチミジンの取り込みを含む。Zapf等, J. Clin. Invest., 63:1077(1979)。さらに、正常な細胞での、成長因子媒介性分裂促進因子活性におけるIGFBPの阻害効果が示されている。

0010

2.4.さらなる治療の必要性
多くの病気及び疾患における血管内皮細胞の成長及び血管形成の役割に鑑みると、これらのプロセスに起因する一又は複数の生物学的影響を低減又は抑制する手段を有していることが好ましい。また、正常及び病気の状態、特にガンにおいて病原性ポリペプチドの存在を検査する手段を有していることも望ましい。さらに、特定の側面では、心臓肥大の治療には一般的に適用できる治療法がないので、心臓ミオサイト肥大を防止又は低減可能な因子を同定することは、病態生理学的な心臓成長を阻害するための新規な治療方策の開発において非常に重要である。様々な心臓血管及び発癌遺伝子疾患のためのいくつかの治療様式が存在するが、さらなる治療的アプローチがなお必要とされている。

0011

3.発明の概要
本発明は、哺乳類における血管形成及び/又は心臓血管新生を調節(例えば、促進又は阻害)するための組成物及び方法に関する。本発明は、ある種の生物学的活性の調節(例えば、促進又は阻害)をテストする種々の心臓血管アッセイにおいて陽性であることをテストする化合物(即ち、タンパク質)の同定に基づく。従って、血管形成の促進又は阻害、血管内皮細胞成長の阻害又は刺激、血管内皮細胞の成長又は増殖の刺激、腫瘍成長の阻害、血管形成依存性組織成長の阻害、血管形成依存性組織成長の刺激、心臓肥大の阻害及び心臓肥大の刺激、例えば鬱血性心不全の治療等の効果が望まれているところでは、当該化合物は、ある効果、例えば、血管形成の促進又は阻害、血管内皮細胞増殖の阻害又は刺激、血管内皮細胞の生育又は増殖の刺激、腫瘍成長の阻害、血管形成依存性組織成長、例えばうっ血性心不全の治療の心肥大の阻害及び心肥大の刺激などが望まれる、疾患の診断及び/又は治療(予防及び寛解を含む)に有用な薬剤及び/又は薬物成分であると考えられる。さらに、本発明の組成物及び方法は、血管形成関連疾患の治療のため、臨床試験における効果をモニタリングするため、及びそのような血管形成関連疾患になり易い患者を同定するための臨床的評価を受ける患者の診断上のモニタリングを提供する。
一実施態様において、本発明は薬剤的許容される担体と混合されたPROポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体を含んでなる組成物を提供する。一態様では、組成物は治療的有効量のポリペプチドを含有する。他の態様では、組成物はさらなる活性成分、すなわち、心臓血管、内皮又は血管形成薬又はアンジオスタチック(angiostatic)薬、好ましくは血管形成又はアンジオスタティック薬を含有する。好ましくは組成物は無菌である。PROポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体は、液状の製薬調製物の形態で投与することができ、これは、貯蔵安定性が延びるように保存できる。保存された液状の製薬調製物は複数回投与用のPROポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体を含有していてもよく、よって繰り返し使用に適している。好ましい実施態様において、組成物は抗体を含み、抗体はモノクローナル抗体抗体断片ヒト化抗体又は一本鎖抗体である。

0012

さらなる実施態様において、本発明は薬剤的に許容される担体と、治療的有効量のPROポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体との混合物を含有する、心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療に有用なこのような組成物の調製方法を提供する。
またさらなる態様において、本発明は:
(a)PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含有する物質の組成物;
(b)該組成物を収容する容器;及び
(c)心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療における該PROポリペプチドの使用を記した、該容器に添付されるラベル又は当該容器に収納される包装挿入物具備する製造品を提供し、前記アゴニスト又はアンタゴニストはPROポリペプチドに結合する抗体であってよい。該組成物は、治療的有効量のPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含んでいてよい。
他の実施態様において、本発明は、PROポリペプチドのアゴニストを同定する方法を提供し、それは:
(a)細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、PROポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ;そして
(b)前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定することを含んでなり、前記細胞性反応の誘発が前記試験化合物が有効なアゴニストであることを示す。
他の実施態様において、本発明は、PROポリペプチドのアゴニストを同定する方法を提供し、それは:
(a)細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、PROポリペプチドによる細胞増殖の刺激に適した条件下で接触させ;そして
(b)前記細胞の増殖を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定することを含んでなり、当該細胞増殖の刺激が前記試験化合物が有効なアゴニストであることを示す。

0013

他の実施態様では、本発明はPROポリペプチドの活性を阻害する化合物の同定方法を提供し、それは、試験化合物をPROポリペプチドと、試験化合物とポリペプチドとが相互作用するのに十分な条件及び時間で接触させ、PROポリペプチドの活性が阻害されるか否かを測定することを含む。特に好ましい態様では、試験化合物又はPROポリペプチドのいずれかが固体支持体固定化される。他の好ましい態様では、非固定化成分は検出可能な標識を担持する。好ましい態様では、この方法は:
(a)細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、PROポリペプチドの存在下で、PROポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ;そして
(b)前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定する工程を含む。
他の好ましい態様においては、この方法は:
(a)細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、PROポリペプチドの存在下で、PROポリペプチドによる細胞増殖の刺激に適した条件下で接触させ;そして
(b)前記細胞の増殖を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定する工程を含む。
他の実施態様では、本発明は、通常はPROポリペプチドを発現する細胞における当該細胞の発現を阻害する化合物の同定方法を提供し、当該方法は、細胞と試験化合物とを接触させ、PROポリペプチドの発現が阻害されるか否かを測定することを含む。好ましい態様では、この方法は:
(a)細胞とスクリーニングすべき試験化合物とをPROポリペプチドを発現させるのに適した条件下で接触させ;そして
(b)前記ポリペプチドの発現の阻害を測定する工程を含む。
またさらなる実施態様では、本発明は、前掲の方法により同定された化合物等の、PROポリペプチドの発現を阻害する化合物を提供する。

0014

本発明の他の態様は、前掲の方法により同定されてもよいPROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストに向けられる。
PROポリペプチドの一又は複数の機能又は活性を阻害するPROポリペプチドのアンタゴニストの一種は抗体である。よって、他の態様では、本発明はPROポリペプチドに結合する単離された抗体を提供する。好ましい態様において、抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは非ヒト相補性決定領域(CDR)残基及びヒトフレームワーク領域(FR)残基を有する。抗体は標識されていても固体支持体上に固定化されていてもよい。さらなる態様では、抗体は抗体断片、一本鎖抗体、又はヒト化抗体である。好ましくは、抗体はポリペプチドに特異的に結合する。
またさらなる態様において、本発明はPROポリペプチドをコードする核酸配列中の変異に関連した疾患又は疾患に対する感受性を診断する方法であって、PROポリペプチドコード化核酸配列中の前記変異の存在又は非存在を決定することを含んでなり、前記変異の存在または非存在が前記疾患又は前記疾患に対する感受性の存在を示す方法を提供する。
またさらなる態様において、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を診断する方法を提供し、それは、(a)前記哺乳動物から得た組織細胞試験試料、及び(b)同じ細胞型の公知の正常組織細胞の対照試料におけるPROポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベル分析することを含んでなり、対照試料に比較した場合の試験試料中の発現レベルの高低が、前記哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患の存在を示す。PROポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、場合によっては、対照試料と比較した際の試験試料中のmRNA又はポリペプチドのレベルの測定によってなされてもよい。
またさらなる態様において、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を診断する方法を提供し、それは、前記哺乳動物から得た組織細胞の試験試料におけるポリペプチドの有無を検出することを含んでなり、前記試験試料における前記ポリペプチドの有無が前記哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患の存在を示す。

0015

またさらなる態様では、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を診断する方法を提供し、それは、(a)前記哺乳動物から得た組織細胞の試験試料を抗-PRO抗体と接触させ、そして(b)試験試料中での前記抗体とPROポリペプチドとの複合体形成を検出することを含んでなり、前記複合体の形成が前記哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患の存在を示す。検出は、定性的でも定量的でもよく、同じ細胞型の公知の正常組織細胞の対照試料における複合体形成のモニタリングと比較して実施してもよい。試験試料における複合体形成量の多少が、試験組織細胞を得た当該哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成不全の存在を示す。抗体は、好ましくは検出可能な標識を担持している。複合体形成は、例えば、光学顕微鏡フローサイトメトリー蛍光定量法、又はこの分野で知られた他の技術によってモニターできる。試験試料は通常、心臓血管、内皮又は血管形成疾患を持つと推定される個体から得る。
他の実施態様では、本発明は、試料中のPROポリペプチドの存在を測定する方法を提供し、それは、PROポリペプチドを含有すると推測される試料を抗-PRO抗体と接触させ、前記抗体の前記試料の成分への結合を測定することを含んでなる。特別な態様では、当該試料はPROポリペプチドを含むと推定される細胞を含み、抗体は細胞に結合する。抗体は、好ましくは検出可能に標識され及び/又は固体支持体に固定化される。
さらなる態様において、本発明は、抗-PRO抗体と担体とを適切な包装内に具備してなる心臓血管、内皮又は血管形成疾患の診断キットを提供する。好ましくは、そのようなキットは、前記抗体をPROポリペプチド存在検出に使用するための指示書をさらに具備する。好ましくは、担体は例えばバッファーである。好ましくは、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は癌である。
さらに他の実施態様では、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を治療する方法を提供し、それは、PROポリペプチドの有効量を当該哺乳動物に投与することを含んでなる。好ましくは、疾患は心臓肥大、創傷又は火傷などの外傷、又は癌の一型である。さらなる態様では、心臓血管、内皮又は血管形成疾患が癌の一型であるならば、哺乳動物は、血管形成術、又は心臓血管、内皮又は血管形成疾患を治療するための薬剤、例えばACEインヒビター、又は化学治療薬にさらに曝露される。好ましくは哺乳動物はヒト、好ましくは心臓肥大を起こす危険性のあるヒト、より好ましくは心筋梗塞を罹患しているヒトである。
他の好ましい態様において、心臓肥大は、PEG2αレベルの上昇が存在することにより特徴付けられる。あるいは、心臓肥大は心筋梗塞により誘発され、ここで、好ましくはPROポリペプチドの投与は、心筋梗塞に続いて48時間、好ましくは24時間以内に開始される。

0016

他の好ましい実施態様において、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は心臓肥大であり、前記PROポリペプチドは心臓血管、内皮又は血管形成薬と共に投与される。この目的のために好ましい心臓血管、内皮又は血管形成薬は、抗高血圧薬、ACEインヒビター、エンドセリンレセプターアンタゴニスト及び血栓溶解剤からなるグループから選択される。血栓溶解剤が投与される場合、好ましくは、PROポリペプチドはこのような薬剤の投与後に投与される。より好ましくは、血栓溶解剤は組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子である。
他の好ましい態様において、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は心臓肥大であり、PROポリペプチドは急性心筋梗塞の治療のための一次血管形成術に続いて投与され、ここで好ましくは、当該哺乳動物は血管形成術又は心臓血管、内皮又は血管形成薬にさらに曝露される。
他の好ましい実施態様において、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は癌であり、PROポリペプチドは化学治療薬、成長阻害薬又は細胞毒性薬組合せて投与される。
さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物の心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療方法を提供し、それは、PROポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト又は抗体の有効量を当該哺乳動物に投与することを含んでなる。好ましくは、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は心臓肥大、外傷、癌、又は加齢性黄斑変性である。また好ましくは哺乳動物はヒトであり、有効量の血管形成又はアンジオスタチック薬はアゴニスト、アンタゴニスト又は抗体と共に投与される。

0017

またさらなる実施態様において、本発明は、心臓血管、内皮又は血管形成疾患を患っている哺乳動物の心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療方法を提供し、それは、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストのいずれかをコードする核酸分子を哺乳動物に投与することを含んでなり、ここで前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体であってよい。好ましい実施態様において哺乳動物はヒトである。他の好ましい実施態様において、遺伝子は、エキソビボ遺伝子治療を介して投与される。さらなる好ましい実施態様において、遺伝子はベクター、より好ましくはアデノウイルスアデノ関連ウイルス、レンチウイルス、又はレトロウイルスベクター内に包含される。
また、他の態様において、本発明は、プロモータ、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるレトロウイルスベクターを含有する組換えレトロウイルス粒子を提供し、ここでレトロウイルスベクターはレトロウイルス構造タンパク質を付随している。好ましくは、シグナル配列は哺乳動物、例えば天然PROポリペプチドからのものである。
また、さらなる実施態様において、本発明は、レトロウイルス構造タンパク質を発現する核酸構造体を含有し、プロモータ、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるレトロウイルスベクターをさらに含有するエキソビボ産生細胞(Producer cell)を提供し、ここで当該産生細胞は、組換えレトロウイルス粒子を生産させる構造タンパク質を付随するレトロウイルスベクターを包含する。
また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の内皮細胞の成長を阻害する方法を提供し、それは(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、当該哺乳動物の内皮細胞の成長は阻害され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、内皮細胞の成長は腫瘍又は網膜疾患に関連している。
また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の内皮細胞の成長を刺激する方法を提供し、それは(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、当該哺乳動物の内皮細胞の成長が刺激され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の心臓肥大を阻害する方法を提供し、それは(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、前記哺乳動物の心臓肥大が阻害され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、心臓肥大は心筋梗塞によって誘発されたものである。

0018

また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の心臓肥大を刺激する方法を提供し、それは(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、前記哺乳動物の心臓肥大が刺激され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物は鬱血性心不全を罹患したヒトである。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物においてPROポリペプチドにより誘発される血管形成を阻害する方法を提供し、それは、当該哺乳動物に治療的有効量の抗-PRO抗体を投与することを含んでなる。好ましくは、哺乳動物は鬱血性心不全を罹患したヒトである。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物においてPROポリペプチドにより誘発される血管形成を刺激する方法を提供し、それは、当該哺乳動物に治療的有効量のPROポリペプチドを投与することを含んでなる。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、より好ましくは血管形成は組織再生又は外傷治癒を促進する。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのPRO21, PRO181, PRO205, PRO214, PRO221, PRO229, PRO231, PRO238, PRO241, PRO247, PRO256, PRO258, PRO263, PRO265, PRO295, PRO321, PRO322, PRO337, PRO363, PRO365, PRO444, PRO533, PRO697, PRO720, PRO725, PRO771, PRO788, PRO791, PRO819, PRO827, PRO828, PRO836, PRO846, PRO865, PRO1005, PRO1006, PRO1007, PRO1025, PRO1029, PRO1054, PRO1071, PRO1075, PRO1079, PRO1080, PRO1114, PRO1131, PRO1155, PRO1160, PRO1184, PRO1186, PRO1190, PRO1192, PRO1195, PRO1244, PRO1272, PRO1273, PRO1274, PRO1279, PRO1283, PRO1286, PRO1306, PRO1309, PRO1325, PRO1329, PRO1347, PRO1356, PRO1376, PRO1382, PRO1411, PRO1412, PRO1419, PRO1474, PRO1477, PRO1488, PRO1508, PRO1550, PRO1556, PRO1760, PRO1782, PRO1787, PRO1801, PRO1868, PRO1887, PRO1890, PRO3438, PRO3444, PRO4302, PRO4324, PRO4333, PRO4341, PRO4342, PRO4353, PRO4354, PRO4356, PRO4371, PRO4405, PRO4408, PRO4422, PRO4425, PRO4499, PRO5723, PRO5725, PRO5737, PRO5776, PRO6006, PRO6029, PRO6071, PRO7436, PRO9771, PRO9821, PRO9873, PRO10008, PRO10096, PRO19670, PRO20040, PRO20044, PRO21055, PRO21384又はPRO28631ポリペプチド、そのアゴニスト又はそのアンタゴニストの投与を含んでなる哺乳動物における内皮細胞の増殖を調節(例えば、阻害又は刺激)する方法であって、前記哺乳動物において内皮細胞の増殖が調節される方法を提供する。

0019

また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのPRO162, PRO181, PRO182, PRO195, PRO204, PRO221, PRO230, PRO256, PRO258, PRO533, PRO697, PRO725, PRO738, PRO826, PRO836, PRO840, PRO846, PRO865, PRO982, PRO1025, PRO1029, PRO1071, PRO1080, PRO1083, PRO1134, PRO1160, PRO1182, PRO1184, PRO1186, PRO1192, PRO1265, PRO1274, PRO1279, PRO1283, PRO1306, PRO1308, PRO1309, PRO1325, PRO1337, PRO1338, PRO1343, PRO1376, PRO1387, PRO1411, PRO1412, PRO1415, PRO1434, PRO1474, PRO1488, PRO1550, PRO1556, PRO1567, PRO1600, PRO1754, PRO1758, PRO1760, PRO1787, PRO1865, PRO1868, PRO1917, PRO1928, PRO3438, PRO3562, PRO4302, PRO4333, PRO4345, PRO4353, PRO4354, PRO4405, PRO4408, PRO4430, PRO4503, PRO5725, PRO6714, PRO9771, PRO9820, PRO9940, PRO10096, PRO21055, PRO21184又はPRO21366ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの投与を含んでなる哺乳動物における平滑筋細胞の増殖を調節(例えば、阻害又は刺激)する方法であって、前記哺乳動物において平滑筋細胞の増殖が調節される方法を提供する。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのPRO21ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの投与を含んでなる哺乳動物における心肥大を調節(例えば、誘導又は減少)する方法であって、前記哺乳動物において心肥大が刺激される方法を提供する。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのPRO4302ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの投与を含んでなる哺乳動物における内皮細胞のアポトーシスを調節(例えば、誘導又は減少)する方法であって、前記哺乳動物において心肥大が調節される方法を提供する。
さらに他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのPRO1376又はPRO1449ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの治療的有効量を投与することを含んでなる哺乳動物における血管形成を調節(例えば、阻害又は刺激)する方法であって、前記血管形成が調節される方法を提供する。
さらに他の実施態様において、本発明は、PRO178, PRO195, PRO228, PRO301, PRO302, PRO532, PRO724, PRO730, PRO734, PRO793, PRO871, PRO938, PRO1012, PRO1120, PRO1139, PRO1198, PRO1287, PRO1361, PRO1864, PRO1873, PRO2010, PRO3579, PRO4313, PRO4527, PRO4538, PRO4553, PRO4995, PRO5730, PRO6008, PRO7223, PRO7248 or PRO7261ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる哺乳動物における内皮細胞管形成を調節(例えば、誘導又は減退)することにより血管形成を調節(例えば、誘導又は減退)する方法であって、前記哺乳動物における内皮細胞管形成が調節される方法を提供する。
本発明の他の実施態様において、本発明はPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸配列を提供する。

0020

一態様では、単離された核酸分子は、(a)ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つPROポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖に対して少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%又は98%の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約99%の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
他の態様では、単離された核酸分子は、(a)ここに開示する全長PROポリペプチドcDNAコード化配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くPROポリペプチドのコード化配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通PROポリペプチドの細胞外ドメインのコード化配列、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片のコード化配列を持つDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖に対して少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%又は98%の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約99%の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
さらなる態様では、本発明は(a)ここに開示するATCC寄託されたヒトタンパク質cDNAの任意のものにコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖に対して少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%又は98%の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約99%の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失しているか又は膜貫通ドメインが不活性化されているPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそのようなコード化ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供し、そのようなポリペプチドの膜貫通ドメインはここに開示される。従って、ここに記載されるPROポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。

0021

他の実施態様はPROポリペプチドコード化配列の断片、又はその相補鎖に向けられ、それらは、例えば、場合によっては抗-PRO抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするPROポリペプチドのコード化断片のハイブリッド形成プローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。このような核酸断片は、通常は少なくとも約20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700又は800ヌクレオチド長であり、あるいは、少なくとも約1000ヌクレオチド長であって、ここで「約」という語の内容は参照する長さのプラス又はマイナス10%のヌクレオチド配列長を指すことを意味する。PROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くの周知の配列アラインメントプログラムの任意のものを用いてPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の公知のヌクレオチド配列とを整列させ、いずれのPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより、定法で同定してもよいことを付言しておく。このようなPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列は全てここで考慮される。また、これらのヌクレオチド分子断片、好ましくは抗-PRO抗体に対する結合部位を含むPROポリペプチド断片によってコードされるPROポリペプチド断片も考慮される。

0022

他の実施態様では、本発明は、上記で特定された単離された核酸配列の任意のものにコードされる単離されたPROポリペプチドを提供する。
ある態様では、本発明は、ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つPROポリペプチドに対して少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%又は98%のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPROポリペプチドを提供する。
さらなる態様では、本発明は、ここに開示するATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAの任意のものにコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%又は98%のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPROポリペプチドを提供する。
特別な実施態様では、本発明は、N-末端シグナル配列及び/又は開始メチオニンを持たず、上記したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる単離されたPROポリペプチドを提供する。それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をPROポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、培養培地からPROポリペプチドを回収することを含む。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインの欠失した又は膜貫通ドメインが不活性化された、単離されたPROポリペプチドを提供する。それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をPROポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地からPROポリペプチドを回収することを含む。
さらに他の実施態様では、本発明は、ここで同定される天然PROポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体又は小分子である。
さらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関し、それは、PROポリペプチドを候補分子と接触させ、前記PROポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニタリングすることを含む。好ましくは、PROポリペプチドは天然PROポリペプチドである。

0023

またさらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチド、又はここに記載するPROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体を、担体と組み合わせて含有する物質の組成物に関する。場合によっては、担体は薬剤的に許容される担体である。
本発明の他の実施態様は、PROポリペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体の、PROポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗-PRO抗体に起因する状態の治療において有用な医薬の調製のための使用に向けられる。
本発明のさらなる実施態様では、本発明は、ここに記載するポリペプチドの任意のものをコードするDNAを含むベクターを提供する。そのようなベクターの任意のものを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はCHO細胞大腸菌、又はバキュウロウイルス感染昆虫細胞であってよい。ここに記載する任意のポリペプチドの製造方法がさらに提供され、それは、宿主細胞を所望のポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から所望のポリペプチドを回収することを含む。
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ここに記載する任意のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンFc領域に融合したここに記載の任意のポリペプチドを含む。
他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びcDNAヌクレオチド配列又はアンチセンスプローブの単離に有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。

図面の簡単な説明

0024

図1は、天然配列PRO181cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:1)を示し、配列番号:1は、ここで「DNA23330-1390」と命名されるクローンである。
図2は、図1に示した配列番号:1のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:2)を示す。
図3は、天然配列PRO178 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:3)を示し、配列番号:3は、ここで「DNA23339-1130」と命名されるクローンである。
図4は、図3に示した配列番号:3のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:4)を示す。
図5は、天然配列PRO444 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:5)を示し、配列番号:5は、ここで「DNA26846-1397」と命名されるクローンである。
図6は、図5に示した配列番号:5のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:6)を示す。
図7は、天然配列PRO195 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:7)を示し、配列番号:7は、ここで「DNA26847-1395」と命名されるクローンである。
図8は、図7に示した配列番号:7のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:8)を示す。
図9は、天然配列PRO182 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:9)を示し、配列番号:9は、ここで「DNA27865-1091」と命名されるクローンである。
図10は、図9に示した配列番号:9のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:10)を示す。
図11は、天然配列PRO205 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:11)を示し、配列番号:11は、ここで「DNA30868-1156」と命名されるクローンである。
図12は、図11に示した配列番号:11のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:12)を示す。
図13は、天然配列PRO204 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:13)を示し、配列番号:13は、ここで「DNA30871-1157」と命名されるクローンである。
図14は、図13に示した配列番号:13のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:14)を示す。
図15は、天然配列PRO1873 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:15)を示し、配列番号:15は、ここで「DNA30880」と命名されるクローンである。
図16は、図15に示した配列番号:15のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:16)を示す。
図17は、天然配列PRO214 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:17)を示し、配列番号:17は、ここで「DNA32286-1191」と命名されるクローンである。
図18は、図17に示した配列番号:17のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:18)を示す。
図19は、天然配列PRO221 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:19)を示し、配列番号:19は、ここで「DNA33089-1132」と命名されるクローンである。
図20は、図19に示した配列番号:19のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:20)を示す。
図21は、天然配列PRO228 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:21)を示し、配列番号:21は、ここで「DNA33092-1202」と命名されるクローンである。
図22は、図21に示した配列番号:21のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:22)を示す。
図23は、天然配列PRO229 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:23)を示し、配列番号:23は、ここで「DNA33100-1159」と命名されるクローンである。
図24は、図23に示した配列番号:23のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:24)を示す。
図25は、天然配列PRO230 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:25)を示し、配列番号:25は、ここで「DNA33223-1136」と命名されるクローンである。
図26は、図25に示した配列番号:25のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:26)を示す。
図27は、天然配列PRO7223 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:27)を示し、配列番号:27は、ここで「DNA34385」と命名されるクローンである。
図28は、図27に示した配列番号:27のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:28)を示す。
図29は、天然配列PRO241 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:29)を示し、配列番号:29は、ここで「DNA34392-1170」と命名されるクローンである。
図30は、図29に示した配列番号:29のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:30)を示す。
図31は、天然配列PRO263 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:31)を示し、配列番号:31は、ここで「DNA34431-1177」と命名されるクローンである。
図32は、図31に示した配列番号:31のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:32)を示す。
図33は、天然配列PRO321 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:33)を示し、配列番号:33は、ここで「DNA34433-1308」と命名されるクローンである。
図34は、図33に示した配列番号:33のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:34)を示す。
図35は、天然配列PRO231 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:35)を示し、配列番号:35は、ここで「DNA34434-1139」と命名されるクローンである。
図36は、図35に示した配列番号:35のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:36)を示す。
図37は、天然配列PRO238 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:37)を示し、配列番号:37は、ここで「DNA35600-1162」と命名されるクローンである。
図38は、図37に示した配列番号:37のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:38)を示す。
図39は、天然配列PRO247 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:39)を示し、配列番号:39は、ここで「DNA35673-1201」と命名されるクローンである。
図40は、図39に示した配列番号:39のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:40)を示す。
図41は、天然配列PRO256 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:41)を示し、配列番号:41は、ここで「DNA35880-1160」と命名されるクローンである。
図42は、図41に示した配列番号:41のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:42)を示す。
図43は、天然配列PRO258 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:43)を示し、配列番号:43は、ここで「DNA35918-1174」と命名されるクローンである。
図44は、図43に示した配列番号:43のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:44)を示す。
図45は、天然配列PRO265 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:45)を示し、配列番号:45は、ここで「DNA36350-1158」と命名されるクローンである。
図46は、図45に示した配列番号:45のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:46)を示す。
図47は、天然配列PRO21 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:47)を示し、配列番号:47は、ここで「DNA36638-1056」と命名されるクローンである。
図48は、図47に示した配列番号:47のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:48)を示す。
図49は、天然配列PRO295 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:49)を示し、配列番号:49は、ここで「DNA38268-1188」と命名されるクローンである。
図50は、図49に示した配列番号:49のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:50)を示す。
図51は、天然配列PRO302 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:51)を示し、配列番号:51は、ここで「DNA40370-1217」と命名されるクローンである。
図52は、図51に示した配列番号:51のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:52)を示す。
図53は、天然配列PRO301 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:53)を示し、配列番号:53は、ここで「DNA40628-1216」と命名されるクローンである。
図54は、図53に示した配列番号:53のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:54)を示す。
図55は、天然配列PRO337 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:55)を示し、配列番号:55は、ここで「DNA43316-1237」と命名されるクローンである。
図56は、図55に示した配列番号:55のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:56)を示す。
図57は、天然配列PRO7248 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:57)を示し、配列番号:57は、ここで「DNA44195」と命名されるクローンである。
図58は、図57に示した配列番号:57のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:58)を示す。
図59は、天然配列PRO846 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:59)を示し、配列番号:59は、ここで「DNA44196-1353」と命名されるクローンである。
図60は、図59に示した配列番号:59のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:60)を示す。
図61は、天然配列PRO1864 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:61)を示し、配列番号:61は、ここで「DNA45409-2511」と命名されるクローンである。
図62は、図61に示した配列番号:61のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:62)を示す。
図63は、天然配列PRO363 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:63)を示し、配列番号:63は、ここで「DNA45419-1252」と命名されるクローンである。
図64は、図63に示した配列番号:63のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:64)を示す。
図65は、天然配列PRO730 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:65)を示し、配列番号:65は、ここで「DNA45624-1400」と命名されるクローンである。
図66は、図65に示した配列番号:65のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:66)を示す。
図67は、天然配列PRO365 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:67)を示し、配列番号:67は、ここで「DNA46777-1253」と命名されるクローンである。
図68は、図67に示した配列番号:67のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:68)を示す。
図69は、天然配列PRO532 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:69)を示し、配列番号:69は、ここで「DNA48335」と命名されるクローンである。
図70は、図69に示した配列番号:69のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:70)を示す。
図71は、天然配列PRO322 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:71)を示し、配列番号:71は、ここで「DNA48336-1309」と命名されるクローンである。
図72は、図71に示した配列番号:71のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:72)を示す。
図73は、天然配列PRO1120 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:73)を示し、配列番号:73は、ここで「DNA48606-1479」と命名されるクローンである。
図74は、図73に示した配列番号:73のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:74)を示す。
図75は、天然配列PRO7261 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:75)を示し、配列番号:75は、ここで「DNA49149」と命名されるクローンである。
図76は、図75に示した配列番号:75のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:76)を示す。
図77は、天然配列PRO533 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:77)を示し、配列番号:77は、ここで「DNA49435-1219」と命名されるクローンである。
図78は、図77に示した配列番号:77のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:78)を示す。
図79は、天然配列PRO724 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:79)を示し、配列番号:79は、ここで「DNA49631-1328」と命名されるクローンである。
図80は、図79に示した配列番号:79のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:80)を示す。
図81は、天然配列PRO734 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:81)を示し、配列番号:81は、ここで「DNA49817」と命名されるクローンである。
図82は、図81に示した配列番号:81のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:82)を示す。
図82は、図81に示した配列番号:81のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:82)を示す。
図83は、天然配列PRO771 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:83)を示し、配列番号:83は、ここで「DNA49829-1346」と命名されるクローンである。
図84は、図83に示した配列番号:83のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:84)を示す。
図85は、天然配列PRO2010 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:85)を示し、配列番号:85は、ここで「DNA50792」と命名されるクローンである。
図86は、図85に示した配列番号:85のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:86)を示す。
図87は、天然配列PRO871 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:87)を示し、配列番号:87は、ここで「DNA50919-1361」と命名されるクローンである。
図88は、図87に示した配列番号:87のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:88)を示す。
図89は、天然配列PRO697 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:89)を示し、配列番号:89は、ここで「DNA50920-1325」と命名されるクローンである。
図90は、図89に示した配列番号:89のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:90)を示す。
図91は、天然配列PRO1083 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:91)を示し、配列番号:91は、ここで「DNA50921-1458」と命名されるクローンである。
図92は、図91に示した配列番号:91のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:22)を示す。
図93は、天然配列PRO725 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:93)を示し、配列番号:93は、ここで「DNA52758-1399」と命名されるクローンである。
図94は、図93に示した配列番号:93のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:94)を示す。
図95は、天然配列PRO720 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:95)を示し、配列番号:95は、ここで「DNA53517-1366-1」と命名されるクローンである。
図96は、図95に示した配列番号:95のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:96)を示す。
図97は、天然配列PRO738 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:97)を示し、配列番号:97は、ここで「DNA53915-1258」と命名されるクローンである。
図98は、図97に示した配列番号:97のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:98)を示す。
図99は、天然配列PRO865 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:99)を示し、配列番号:99は、ここで「DNA53974-1401」と命名されるクローンである。
図100は、図99に示した配列番号:99のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:100)を示す。
図101は、天然配列PRO840 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:101)を示し、配列番号:101は、ここで「DNA53987-1438」と命名されるクローンである。
図102は、図101に示した配列番号:101のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:102)を示す。
図103は、天然配列PRO1080 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:103)を示し、配列番号:103は、ここで「DNA56047-1456」と命名されるクローンである。
図104は、図103に示した配列番号:103のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:104)を示す。
図105は、天然配列PRO1079 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:105)を示し、配列番号:105は、ここで「DNA56050-1455」と命名されるクローンである。
図106は、図105に示した配列番号:105のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:106)を示す。
図107は、天然配列PRO793 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:107)を示し、配列番号:107は、ここで「DNA56110-1437」と命名されるクローンである。
図108は、図107に示した配列番号:107のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:108)を示す。
図109は、天然配列PRO788 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:109)を示し、配列番号:109は、ここで「DNA56405-1357」と命名されるクローンである。
図110は、図109に示した配列番号:109のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:110)を示す。
図111は、天然配列PRO938 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:111)を示し、配列番号:111は、ここで「DNA56433-1406」と命名されるクローンである。
図112は、図111に示した配列番号:111のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:112)を示す。
図113は、天然配列PRO1012 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:113)を示し、配列番号:113は、ここで「DNA56439-1376」と命名されるクローンである。
図114は、図113に示した配列番号:113のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:114)を示す。
図115は、天然配列PRO1477 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:115)を示し、配列番号:115は、ここで「DNA56529-1647」と命名されるクローンである。
図116は、図115に示した配列番号:115のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:116)を示す。
図117は、天然配列PRO1134 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:117)を示し、配列番号:117は、ここで「DNA56865-1491」と命名されるクローンである。
図118は、図117に示した配列番号:117のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:118)を示す。
図119は、天然配列PRO162 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:119)を示し、配列番号:119は、ここで「DNA56965-1356」と命名されるクローンである。
図120は、図119に示した配列番号:119のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:120)を示す。
図121は、天然配列PRO1114 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:121)を示し、配列番号:121は、ここで「DNA57033-1430-1」と命名されるクローンである。
図122は、図121に示した配列番号:121のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:122)を示す。
図123は、天然配列PRO828 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:123)を示し、配列番号:123は、ここで「DNA57037-1444」と命名されるクローンである。
図124は、図123に示した配列番号:123のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:124)を示す。
図125は、天然配列PRO827 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:125)を示し、配列番号:125は、ここで「DNA57039-1402」と命名されるクローンである。
図126は、図125に示した配列番号:125のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:126)を示す。
図127は、天然配列PRO1075 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:127)を示し、配列番号:127は、ここで「DNA57689-1385」と命名されるクローンである。
図128は、図127に示した配列番号:127のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:128)を示す。
図129は、天然配列PRO1007 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:129)を示し、配列番号:129は、ここで「DNA57690-1374」と命名されるクローンである。
図130は、図129に示した配列番号:129のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:130)を示す。
図131は、天然配列PRO826 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:131)を示し、配列番号:131は、ここで「DNA57694-1341」と命名されるクローンである。
図132は、図131に示した配列番号:131のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:132)を示す。
図133は、天然配列PRO819 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:133)を示し、配列番号:132は、ここで「DNA57695-1340」と命名されるクローンである。
図134は、図133に示した配列番号:133のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:134)を示す。
図135は、天然配列PRO1006 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:135)を示し、配列番号:135は、ここで「DNA57699-1412」と命名されるクローンである。
図136は、図135に示した配列番号:135のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:136)を示す。
図137は、天然配列PRO982 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:137)を示し、配列番号:137は、ここで「DNA57700-1408」と命名されるクローンである。
図138は、図137に示した配列番号:137のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:138)を示す。
図139は、天然配列PRO1005 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:139)を示し、配列番号:139は、ここで「DNA57708-1411」と命名されるクローンである。
図140は、図139に示した配列番号:139のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:140)を示す。
図141は、天然配列PRO791 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:141)を示し、配列番号:141は、ここで「DNA57838-1337」と命名されるクローンである。
図142は、図141に示した配列番号:141のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:142)を示す。
図143は、天然配列PRO1071 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:143)を示し、配列番号:143は、ここで「DNA58847-1383」と命名されるクローンである。
図144は、図143に示した配列番号:143のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:144)を示す。
図145は、天然配列PRO1415 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:145)を示し、配列番号:145は、ここで「DNA58852-1637」と命名されるクローンである。
図146は、図145に示した配列番号:145のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:146)を示す。
図147は、天然配列PRO1054 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:147)を示し、配列番号:147は、ここで「DNA58853-1423」と命名されるクローンである。
図148は、図147に示した配列番号:147のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:148)を示す。
図149は、天然配列PRO1411 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:149)を示し、配列番号:149は、ここで「DNA59212-1627」と命名されるクローンである。
図150は、図149に示した配列番号:149のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:150)を示す。
図151は、天然配列PRO1184 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:151)を示し、配列番号:151は、ここで「DNA59220-1514」と命名されるクローンである。
図152は、図151に示した配列番号:151のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:152)を示す。
図153は、天然配列PRO1029 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:153)を示し、配列番号:153は、ここで「DNA59493-1420」と命名されるクローンである。
図154は、図153に示した配列番号:153のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:154)を示す。
図155は、天然配列PRO1139 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:155)を示し、配列番号:155は、ここで「DNA59497-1496」と命名されるクローンである。
図156は、図155に示した配列番号:155のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:156)を示す。
図157は、天然配列PRO1190 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:157)を示し、配列番号:157は、ここで「DNA59586-1520」と命名されるクローンである。
図158は、図157に示した配列番号:157のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:158)を示す。
図159は、天然配列PRO1309 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:159)を示し、配列番号:159は、ここで「DNA59588-1571」と命名されるクローンである。
図160は、図159に示した配列番号:159のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:160)を示す。
図161は、天然配列PRO836 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:161)を示し、配列番号:161は、ここで「DNA59620-1463」と命名されるクローンである。
図162は、図161に示した配列番号:161のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:162)を示す。
図163は、天然配列PRO1025 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:163)を示し、配列番号:163は、ここで「DNA59622-1334」と命名されるクローンである。
図164は、図163に示した配列番号:163のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:164)を示す。
図165は、天然配列PRO1131 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:165)を示し、配列番号:165は、ここで「DNA59777-1480」と命名されるクローンである。
図166は、図165に示した配列番号:165のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:166)を示す。
図167は、天然配列PRO1182 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:167)を示し、配列番号:167は、ここで「DNA59848-1512」と命名されるクローンである。
図168は、図167に示した配列番号:167のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:168)を示す。
図169は、天然配列PRO1155 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:169)を示し、配列番号:169は、ここで「DNA59849-1504」と命名されるクローンである。
図170は、図169に示した配列番号:169のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:170)を示す。
図171は、天然配列PRO1186 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:171)を示し、配列番号:171は、ここで「DNA60621-1516」と命名されるクローンである。
図172は、図171に示した配列番号:171のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:172)を示す。
図173は、天然配列PRO1198 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:173)を示し、配列番号:173は、ここで「DNA60622-1525」と命名されるクローンである。
図174は、図173に示した配列番号:173のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:174)を示す。
図175は、天然配列PRO1265 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:175)を示し、配列番号:175は、ここで「DNA60764-1533」と命名されるクローンである。
図176は、図175に示した配列番号:175のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:176)を示す。
図177は、天然配列PRO1361 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:177)を示し、配列番号:177は、ここで「DNA60783-1611」と命名されるクローンである。
図178は、図177に示した配列番号:177のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:178)を示す。
図179は、天然配列PRO1287 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:179)を示し、配列番号:179は、ここで「DNA61755-1554」と命名されるクローンである。
図180は、図179に示した配列番号:179のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:180)を示す。
図181は、天然配列PRO1308 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:181)を示し、配列番号:181は、ここで「DNA62306-1570」と命名されるクローンである。
図182は、図181に示した配列番号:181のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:182)を示す。
図183は、天然配列PRO4313 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:183)を示し、配列番号:183は、ここで「DNA62312-2558」と命名されるクローンである。
図184は、図183に示した配列番号:183のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:184)を示す。
図185は、天然配列PRO1192 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:185)を示し、配列番号:185は、ここで「DNA62814-1521」と命名されるクローンである。
図186は、図185に示した配列番号:185のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:186)を示す。
図187は、天然配列PRO1160 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:187)を示し、配列番号:187は、ここで「DNA62872-1509」と命名されるクローンである。
図188は、図187に示した配列番号:187のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:188)を示す。
図189は、天然配列PRO1244 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:189)を示し、配列番号:189は、ここで「DNA64883-1526」と命名されるクローンである。
図190は、図189に示した配列番号:189のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:190)を示す。
図191は、天然配列PRO1356 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:191)を示し、配列番号:191は、ここで「DNA64886-1601」と命名されるクローンである。
図192は、図191に示した配列番号:191のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:192)を示す。
図193は、天然配列PRO1274 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:193)を示し、配列番号:193は、ここで「DNA64889-1541」と命名されるクローンである。
図194は、図193に示した配列番号:193のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:194)を示す。
図195は、天然配列PRO1272 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:195)を示し、配列番号:195は、ここで「DNA64896-1539」と命名されるクローンである。
図196は、図195に示した配列番号:195のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:196)を示す。
図197は、天然配列PRO1412 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:197)を示し、配列番号:197は、ここで「DNA64897-1628」と命名されるクローンである。
図198は、図197に示した配列番号:197のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:198)を示す。
図199は、天然配列PRO1286 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:199)を示し、配列番号:199は、ここで「DNA64903-1553」と命名されるクローンである。
図200は、図199に示した配列番号:199のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:200)を示す。
図201は、天然配列PRO1347 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:201)を示し、配列番号:201は、ここで「DNA64950-1590」と命名されるクローンである。
図202は、図201に示した配列番号:201のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:202)を示す。
図203は、天然配列PRO1273 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:203)を示し、配列番号:203は、ここで「DNA65402-1540」と命名されるクローンである。
図204は、図203に示した配列番号:203のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:204)を示す。
図205は、天然配列PRO1283 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:205)を示し、配列番号:205は、ここで「DNA65404-1551」と命名されるクローンである。
図206は、図205に示した配列番号:205のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:206)を示す。
図207は、天然配列PRO1279 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:207)を示し、配列番号:207は、ここで「DNA65405-1547」と命名されるクローンである。
図208は、図207に示した配列番号:207のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:208)を示す。
図209は、天然配列PRO1306 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:209)を示し、配列番号:209は、ここで「DNA65410-1569」と命名されるクローンである。
図210は、図209に示した配列番号:209のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:210)を示す。
図211は、天然配列PRO1195 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:211)を示し、配列番号:211は、ここで「DNA65412-1523」と命名されるクローンである。
図212は、図211に示した配列番号:211のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:212)を示す。
図213は、天然配列PRO4995 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:213)を示し、配列番号:213は、ここで「DNA66307-2661」と命名されるクローンである。
図214は、図213に示した配列番号:213のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:214)を示す。
図215は、天然配列PRO1382 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:215)を示し、配列番号:215は、ここで「DNA66526-1616」と命名されるクローンである。
図216は、図215に示した配列番号:215のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:216)を示す。
図217は、天然配列PRO1325 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:217)を示し、配列番号:217は、ここで「DNA66659-1593」と命名されるクローンである。
図218は、図217に示した配列番号:217のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:218)を示す。
図219は、天然配列PRO1329 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:219)を示し、配列番号:219は、ここで「DNA66660-1585」と命名されるクローンである。
図220は、図219に示した配列番号:219のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:220)を示す。
図221は、天然配列PRO1338 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:221)を示し、配列番号:221は、ここで「DNA66667-1596」と命名されるクローンである。
図222は、図221に示した配列番号:221のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:222)を示す。
図223は、天然配列PR1337 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:223)を示し、配列番号:223は、ここで「DNA66672-1586」と命名されるクローンである。
図224は、図223に示した配列番号:223のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:224)を示す。
図225は、天然配列PRO1343 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:225)を示し、配列番号:225は、ここで「DNA66675-1587」と命名されるクローンである。
図226は、図225に示した配列番号:225のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:226)を示す。
図227は、天然配列PRO1376 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:27)を示し、配列番号:27は、ここで「DNA67300-1605」と命名されるクローンである。
図228は、図227に示した配列番号:227のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:228)を示す。
図229は、天然配列PRO1434 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:229)を示し、配列番号:229は、ここで「DNA68818-2536」と命名されるクローンである。
図230は、図229に示した配列番号:229のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:230)を示す。
図231は、天然配列PRO3579 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:231)を示し、配列番号:231は、ここで「DNA68862-2546」と命名されるクローンである。
図232は、図231に示した配列番号:231のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:232)を示す。
図233は、天然配列PRO1387 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:233)を示し、配列番号:233は、ここで「DNA68872-1620」と命名されるクローンである。
図234は、図233に示した配列番号:233のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:234)を示す。
図235は、天然配列PRO1419 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:235)を示し、配列番号:235は、ここで「DNA71290-1630」と命名されるクローンである。
図236は、図235に示した配列番号:235のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:236)を示す。
図237は、天然配列PRO1488 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:237)を示し、配列番号:237は、ここで「DNA73736-1657」と命名されるクローンである。
図238は、図237に示した配列番号:237のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:238)を示す。
図239は、天然配列PRO1474 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:239)を示し、配列番号:239は、ここで「DNA73739-1645」と命名されるクローンである。
図240は、図239に示した配列番号:239のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:240)を示す。
図241は、天然配列PRO1508 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:241)を示し、配列番号:241は、ここで「DNA73742-1662」と命名されるクローンである。
図242は、図241に示した配列番号:241のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:242)を示す。
図243は、天然配列PRO1754 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:243)を示し、配列番号:243は、ここで「DNA76385-1692」と命名されるクローンである。
図244は、図243に示した配列番号:243のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:244)を示す。
図245は、天然配列PRO1550 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:245)を示し、配列番号:245は、ここで「DNA76393-1664」と命名されるクローンである。
図246は、図245に示した配列番号:245のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:246)を示す。
図247は、天然配列PRO1758 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:247)を示し、配列番号:247は、ここで「DNA76399-1700」と命名されるクローンである。
図248は、図247に示した配列番号:247のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:248)を示す。
図249は、天然配列PRO1917 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:249)を示し、配列番号:249は、ここで「DNA76400-2528」と命名されるクローンである。
図250は、図249に示した配列番号:249のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:250)を示す。
図251は、天然配列PRO1787 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:251)を示し、配列番号:251は、ここで「DNA76510-2504」と命名されるクローンである。
図252は、図251に示した配列番号:251のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:252)を示す。
図253は、天然配列PRO1556 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:253)を示し、配列番号:253は、ここで「DNA76529-1666」と命名されるクローンである。
図254は、図253に示した配列番号:253のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:254)を示す。
図255は、天然配列PRO1760 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:255)を示し、配列番号:255は、ここで「DNA76532-1702」と命名されるクローンである。
図256は、図255に示した配列番号:255のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:256)を示す。
図257は、天然配列PRO1567 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:257)を示し、配列番号:257は、ここで「DNA76541-1675」と命名されるクローンである。
図258は、図257に示した配列番号:257のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:258)を示す。
図259は、天然配列PRO1600 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:259)を示し、配列番号:259は、ここで「DNA77503-1686」と命名されるクローンである。
図260は、図259に示した配列番号:259のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:260)を示す。
図261は、天然配列PRO1868 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:261)を示し、配列番号:261は、ここで「DNA77624-2515」と命名されるクローンである。
図262は、図261に示した配列番号:261のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:262)を示す。
図263は、天然配列PRO1890 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:263)を示し、配列番号:263は、ここで「DNA79230-2525」と命名されるクローンである。
図264は、図263に示した配列番号:263のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:264)を示す。
図265は、天然配列PRO1887 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:265)を示し、配列番号:265は、ここで「DNA79862-2522」と命名されるクローンである。
図266は、図265に示した配列番号:265のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:266)を示す。
図267は、天然配列PRO4353 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:267)を示し、配列番号:267は、ここで「DNA80145-2594」と命名されるクローンである。
図268は、図267に示した配列番号:267のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:268)を示す。
図269は、天然配列PRO1782 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:269)を示し、配列番号:269は、ここで「DNA80899-2501」と命名されるクローンである。
図270は、図269に示した配列番号:269のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:270)を示す。
図271は、天然配列PRO1928 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:271)を示し、配列番号:271は、ここで「DNA81754-2532」と命名されるクローンである。
図272は、図271に示した配列番号:271のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:272)を示す。
図273は、天然配列PRO1865 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:273)を示し、配列番号:273は、ここで「DNA81757-2512」と命名されるクローンである。
図274は、図273に示した配列番号:273のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:274)を示す。
図275は、天然配列PRO4341 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:275)を示し、配列番号:275は、ここで「DNA81761-2583」と命名されるクローンである。
図276は、図275に示した配列番号:275のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:276)を示す。
図277は、天然配列PRO6714 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:277)を示し、配列番号:277は、ここで「DNA82358-2738」と命名されるクローンである。
図278は、図277に示した配列番号:277のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:278)を示す。
図279は、天然配列PRO5723 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:279)を示し、配列番号:279は、ここで「DNA82361」と命名されるクローンである。
図280は、図279に示した配列番号:279のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:280)を示す。
図281は、天然配列PRO3438 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:281)を示し、配列番号:281は、ここで「DNA82364-2538」と命名されるクローンである。
図282は、図281に示した配列番号:281のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:282)を示す。
図283は、天然配列PRO6071 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:283)を示し、配列番号:283は、ここで「DNA82403-2959」と命名されるクローンである。
図284は、図283に示した配列番号:283のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:284)を示す。
図285は、天然配列PRO1801 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:285)を示し、配列番号:285は、ここで「DNA83500-2506」と命名されるクローンである。
図286は、図285に示した配列番号:285のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:286)を示す。
図287は、天然配列PRO4324 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:287)を示し、配列番号:287は、ここで「DNA83560-2569」と命名されるクローンである。
図288は、図287に示した配列番号:287のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:288)を示す。
図289は、天然配列PRO4333 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:289)を示し、配列番号:289は、ここで「DNA84210-2576」と命名されるクローンである。
図290は、図289に示した配列番号:289のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:290)を示す。
図291は、天然配列PRO4405 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:291)を示し、配列番号:291は、ここで「DNA84920-2614」と命名されるクローンである。
図292は、図291に示した配列番号:291のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:292)を示す。
図293は、天然配列PRO4356 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:293)を示し、配列番号:293は、ここで「DNA86576-2595」と命名されるクローンである。
図294は、図293に示した配列番号:293のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:294)を示す。
図295は、天然配列PRO3444 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:295)を示し、配列番号:295は、ここで「DNA87997」と命名されるクローンである。
図296は、図295に示した配列番号:295のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:296)を示す。
図297は、天然配列PRO4302 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:297)を示し、配列番号:297は、ここで「DNA92218-2554」と命名されるクローンである。
図298は、図297に示した配列番号:297のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:298)を示す。
図299は、天然配列PRO4371 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:299)を示し、配列番号:299は、ここで「DNA92233-2599」と命名されるクローンである。
図300は、図299に示した配列番号:299のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:300)を示す。
図301は、天然配列PRO4354 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:301)を示し、配列番号:301は、ここで「DNA92256-2596」と命名されるクローンである。
図302は、図301に示した配列番号:301のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:302)を示す。
図303は、天然配列PRO5725 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:303)を示し、配列番号:303は、ここで「DNA92265-2669」と命名されるクローンである。
図304は、図303に示した配列番号:303のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:304)を示す。
図305は、天然配列PRO4408 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:305)を示し、配列番号:305は、ここで「DNA92274-2617」と命名されるクローンである。
図306は、図305に示した配列番号:305のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:306)を示す。
図307は、天然配列PRO9940 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:307)を示し、配列番号:307は、ここで「DNA92282」と命名されるクローンである。
図308は、図307に示した配列番号:307のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:308)を示す。
図309は、天然配列PRO5737 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:309)を示し、配列番号:309は、ここで「DNA92929-2534-1」と命名されるクローンである。
図310は、図309に示した配列番号:309のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:310)を示す。
図311は、天然配列PRO4425 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:311)を示し、配列番号:311は、ここで「DNA93011-2637」と命名されるクローンである。
図312は、図311に示した配列番号:311のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:312)を示す。
図313は、天然配列PRO4345 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:313)を示し、配列番号:313は、ここで「DNA94854-2586」と命名されるクローンである。
図314は、図313に示した配列番号:313のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:314)を示す。
図315は、天然配列PRO4342 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:315)を示し、配列番号:315は、ここで「DNA96787-2534-1」と命名されるクローンである。
図316は、図315に示した配列番号:315のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:316)を示す。
図317は、天然配列PRO3562 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:317)を示し、配列番号:317は、ここで「DNA96791」と命名されるクローンである。
図318は、図317に示した配列番号:317のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:318)を示す。
図319は、天然配列PRO4422 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:319)を示し、配列番号:319は、ここで「DNA96867-2620」と命名されるクローンである。
図320は、図319に示した配列番号:319のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:320)を示す。
図321は、天然配列PRO5776 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:321)を示し、配列番号:321は、ここで「DNA96872-2674」と命名されるクローンである。
図322は、図321に示した配列番号:321のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:322)を示す。
図323は、天然配列PRO4430 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:323)を示し、配列番号:323は、ここで「DNA96878-2626」と命名されるクローンである。
図324は、図323に示した配列番号:323のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:324)を示す。
図325は、天然配列PRO4499 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:325)を示し、配列番号:325は、ここで「DNA96889-2641」と命名されるクローンである。
図326は、図325に示した配列番号:325のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:326)を示す。
図327は、天然配列PRO4503 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:327)を示し、配列番号:327は、ここで「DNA100312-2645」と命名されるクローンである。
図328は、図327に示した配列番号:327のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:328)を示す。
図329は、天然配列PRO10008 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:329)を示し、配列番号:329は、ここで「DNA101921」と命名されるクローンである。
図330は、図329に示した配列番号:329のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:330)を示す。
図331は、天然配列PRO5730 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:331)を示し、配列番号:331は、ここで「DNA101926」と命名されるクローンである。
図332は、図331に示した配列番号:331のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:332)を示す。
図333は、天然配列PRO6008 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:333)を示し、配列番号:333は、ここで「DNA102844」と命名されるクローンである。
図334は、図333に示した配列番号:333のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:334)を示す。
図335は、天然配列PRO4527 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:335)を示し、配列番号:335は、ここで「DNA103197」と命名されるクローンである。
図336は、図335に示した配列番号:335のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:336)を示す。
図337は、天然配列PRO4538 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:337)を示し、配列番号:337は、ここで「DNA103208」と命名されるクローンである。
図338は、図337に示した配列番号:337のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:338)を示す。
図339は、天然配列PRO4553 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:339)を示し、配列番号:339は、ここで「DNA103223」と命名されるクローンである。
図340は、図339に示した配列番号:339のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:340)を示す。
図341は、天然配列PRO6006 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:341)を示し、配列番号:341は、ここで「DNA105782-2693」と命名されるクローンである。
図342は、図341に示した配列番号:341のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:342)を示す。
図343は、天然配列PRO6029 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:343)を示し、配列番号:343は、ここで「DNA105849-2704」と命名されるクローンである。
図344は、図343に示した配列番号:343のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:344)を示す。
図345は、天然配列PRO9821 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:345)を示し、配列番号:345は、ここで「DNA108725-2766」と命名されるクローンである。
図346は、図345に示した配列番号:345のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:346)を示す。
図347は、天然配列PRO9820 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:347)を示し、配列番号:347は、ここで「DNA108769-2765」と命名されるクローンである。
図348は、図347に示した配列番号:347のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:348)を示す。
図349は、天然配列PRO9771 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:349)を示し、配列番号:349は、ここで「DNA119498-2965」と命名されるクローンである。
図350は、図349に示した配列番号:349のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:350)を示す。
図351は、天然配列PRO7436 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:351)を示し、配列番号:351は、ここで「DNA119535-2756」と命名されるクローンである。
図352は、図351に示した配列番号:351のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:352)を示す。
図353は、天然配列PRO10096 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:353)を示し、配列番号:353は、ここで「DNA125185-2806」と命名されるクローンである。
図354は、図353に示した配列番号:353のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:354)を示す。
図355は、天然配列PRO19670 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:355)を示し、配列番号:355は、ここで「DNA131639-2874」と命名されるクローンである。
図356は、図355に示した配列番号:355のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:356)を示す。
図357は、天然配列PRO20044 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:357)を示し、配列番号:357は、ここで「DNA139623-2893」と命名されるクローンである。
図358は、図357に示した配列番号:357のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:358)を示す。
図359は、天然配列PRO9873 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:359)を示し、配列番号:359は、ここで「DNA143076-2787」と命名されるクローンである。
図360は、図359に示した配列番号:359のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:360)を示す。
図361は、天然配列PRO21366 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:361)を示し、配列番号:361は、ここで「DNA143276-2975」と命名されるクローンである。
図362は、図361に示した配列番号:361のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:362)を示す。
図363は、天然配列PRO20040 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:363)を示し、配列番号:363は、ここで「DNA164625-2890」と命名されるクローンである。
図364は、図363に示した配列番号:363のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:364)を示す。
図365は、天然配列PRO21184 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:365)を示し、配列番号:365は、ここで「DNA167678-2963」と命名されるクローンである。
図366は、図365に示した配列番号:365のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:366)を示す。
図367は、天然配列PRO21055 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:367)を示し、配列番号:367は、ここで「DNA170021-2923」と命名されるクローンである。
図368は、図367に示した配列番号:367のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:368)を示す。
図369は、天然配列PRO28631 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:369)を示し、配列番号:369は、ここで「DNA170212-3000」と命名されるクローンである。
図370は、図369に示した配列番号:369のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:370)を示す。
図371は、天然配列PRO21384 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:371)を示し、配列番号:371は、ここで「DNA177313-2982」と命名されるクローンである。
図372は、図371に示した配列番号:371のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:372)を示す。
図373は、天然配列PRO1449 cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:373)を示し、配列番号:373は、ここで「DNA64908-1163-1」と命名されるクローンである。
図374は、図373に示した配列番号:373のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:374)を示す。
図375は、PRO1449と約78%のアミノ酸同一性を有するPRO1449のマウスオルソログを用いた、マウス胎児におけるインサイツハイブリダイゼーションホールマウントによる結果を示す。結果から、PRO1449オルソログは発生中の脈管構造中で発現されることが示される。さらに、切片は、内皮細胞及び内皮細胞の前駆細胞中での発現を示す。
図376は、PRO1449と約78%のアミノ酸同一性を持つPRO1449のオルソログが、多くの炎症化及び疾患性の組織の脈管構造中で発現されており、正常な成体の血管中では非常に低いか、又は欠損していることを示す。
図377は、PRO1449と約78%のアミノ酸同一性を持つPRO1449のオルソログが、ニワトリ胎児の眼中における異所性の血管を誘導することを示す。

0025

5.発明の詳細な説明
5.1.定義
「心臓血管、内皮及び血管形成疾患」、「心臓血管、内皮及び血管形成機能不全」、「心臓血管、内皮又は血管形成疾患」及び「心臓血管、内皮又は血管形成機能不全」という用語は相互交換可能に使用され、並びに血管、例えば動脈、毛細管静脈、及び/又はリンパ管それ自体の病気の、糖尿病などの血管に影響を与える全身疾患の一部を称する。これには、血管形成及び/又は心臓血管新生を刺激する徴候、及び血管形成及び/又は心臓血管新生を阻害する徴候が含まれている。このような疾患には、例えば動脈の病気、例えばアテローム性動脈硬化、高血圧、炎症性脈管炎レーノー病及びレーノー現象動脈瘤、及び動脈再狭窄;静脈及びリンパ管の疾患、例えば血栓静脈炎リンパ管炎、及びリンパ浮腫;及び他の血管疾患、例えば末梢血管病、癌、例えば血管腫瘍、例えば血管腫(毛細管及び海綿状)、グロムス腫瘍毛細管拡張症細菌性血管腫症血管内皮腫血管肉腫血管外皮細胞腫カポジ肉腫リンパ管腫、及びリンパ管肉腫腫瘍血管形成、外傷、例えば傷、火傷、及び他に損傷を被った組織、移植固定、瘢痕化虚血再潅流傷害慢性関節リュウマチ脳血管の病気、腎臓病、例えば急性腎不全、及び骨粗鬆症が含まれる。また、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、心臓肥大、及び心不全、例えばCHFも含まれる。
ここで使用される場合の「肥大」とは、腫瘍形成に関与しない正常な成長とは無関係に組織又は構造体の大きさが増加することとして定義される。器官又は組織の肥大は個々の細胞の大きさの増加(真性肥大)、又は組織を形成する細胞数の増加(過形成)、又はその両方のいずれかによる。ある種の器官、例えば心臓は誕生後、短い期間で分割能力を失う。従って、「心臓肥大」は心臓の大きさが増加するものとして定義され、成人においては、細胞分割が付随することのない、収縮性タンパク質の含有量とミオサイトの細胞サイズの増加により特徴付けられる。肥大を刺激する原因となるストレスの特徴(例えば、プレロードの増加、アフターロードの増加、心筋梗塞の場合と同様のミオサイトの損失、収縮性の一次低下)が、反応の性質の決定において重要な役割を担っていることは明らかである。心臓肥大の初期段階は、通常、ミオフィブリルミトコンドリアのサイズの増加、並びにミトコンドリアと核の拡大により形態学的に特徴付けられる。この段階において、筋細胞は正常なものよりもより大きくなり、細胞組織はかなり保存される。心臓肥大の段階がさらに進行すると、特定のオルガネラ、例えばミトコンドリアの数及びサイズが優先的に増加し、新規の収縮エレメント不規則な方法で、細胞の局在領域に添加される。長年にわたって肥大を被っている細胞は、隣接するミオフィブリルを置換し、正常なZ膜レジストレーション破壊を引き起こす、高度に分葉された膜を有する、かなり拡大した核を含む、細胞組織体におけるより明らかな分裂を示す。「心臓肥大」という用語は、根底にある心疾患に関係なく、心筋の種々の度合いの構造的ダメージにより特徴付けられる病状の進行における全ての段階を含むように使用される。この故に、その用語は、心臓肥大の進行における生理学的病状、例えば血圧の上昇、大動脈狭窄、又は心筋梗塞も含まれる。

0026

「心不全」は、心臓が代謝中の組織の要求が必要とする速さで血液を送らない心機能の異常を指す。心不全は虚血、先天的リュウマチ性又は特発的形態を含む、種々の因子が原因となり得る。
「うっ血性心不全」(CHF)は、末梢組織まで酸素化された血液を送達させるために、十分な心拍出量(経時的に心臓により押し出される血液量)を供給することのできない心臓の進行性の病状である。 CHFが進行すると、構造的及び血行力学的ダメージが生じる。これらのダメージは色々と現れ、一つの特徴的徴候は心室肥大である。CHFは多くの心疾患の共通した終末結果である。
「心筋梗塞」は、しばしば多重冠動脈血栓症を伴う、冠動脈のアテローム性動脈硬化の結果であると一般的にされている。それは、心室壁全厚みにわたって心筋壊死がある壁内梗塞、及び心室壁を通って心外膜に至る全ての経路に伸長することなく、壊死が内皮下層心筋壁内、又はその両方にある副心内膜(非壁内)梗塞2つのタイプに分けることができる。心筋梗塞は、血行力学的影響の変化と心臓のダメージを受けた構造及び健康なゾーンにおける変化の両方に原因があることが知られている。よって、例えば心筋梗塞により心臓の最大流出量及び心臓動容量が低減する。また、心筋梗塞に関連して、間隙に生じるDNA合成が刺激され、影響を受けていない心臓領域におけるコラーゲンの形成が増加する。
長期間にわたる高血圧において、心臓のストレス及び圧力が増加する結果、例えば全末梢耐性が増加して、心臓肥大は長期間「高血圧」を付随するようになる。慢性的に圧力が加わる結果、肥大した心室の特徴は、心拡張の実行が損なわれることである。Fouad等, J. Am. Coll. Cardiol., 4:1500-1506(1984);Smith等, J. Am. Coll. Cardiol., 5:869-874(1985)。長期間にわたる左心室の弛緩が、心収縮機能が正常又は通常であるにかかわらず、早期に本質的な高血圧にみられた。Hartford等,Hypertension, 6: 329-338(1984)。しかし、血圧レベルと心臓肥大との間には近い並行性はない。ヒトにおいて、抗高血圧治療に応じて左心室機能の改善が報告されているが、利尿薬(ヒドロクロロチアジド)、β-ブロッカー(プレノロール)、又はカルシウムチャンネルブロッカー(ジルチアゼム)で治療している患者は、心拡張機能が改善されることなく左心室肥大への逆戻りがみられる。Inouye等, Am. J. Cardiol., 53:1583-7(1984)。

0027

心臓肥大に関連した他の複合的心疾患は「肥大性心筋症」である。この病状は形態学的、機能的及び臨床的特性が非常に多様であること(Maron等, N. Engl. J. Med., 316:780-789(1987);Spirito等, N. Engl. J. Med., 320:749-755(1989);Louie及びEdwards, PROg. Cardiovasc. Dis., 36:275-308(1994);Wigle等,Circulation, 92:1680-1692(1995))により特徴付けられる、その異種性は全年齢の患者を悩ますという点で強調される。Spirito等, N. Engl. J. Med., 336:775-785(1997)。また、肥大心筋症の原因となる要因は多様であり、ほとんど理解されていない。一般的に、サルコメアタンパク質をコードする遺伝子における変異が肥大性心筋症に関与している。近年のデータでは、β-ミオシン重鎖変異が、家族性肥大性心筋症の原因の約30から40パーセントであると計測されていることを示唆している。Watkins等, N. Engl. J. Med., 326:1108-1114(1992);Schwartz等, Circulation, 91:532-540(1995);Marian及びRoberts, Circulation, 92:1336-1347(1995);Thierfelder等, Cell, 77:701-712(1994);Watkins等, Nat. Gen., 11:434-437(1995)。β-ミオシン重鎖の他にも、他の位置の遺伝子変異に、心臓トロポニンT、アルファトポミオシン心臓ミオシン結合プロテインC、必須ミオシン軽鎖、及び調節性ミオシン軽鎖が含まれる。Malik及びWatkins, Curr. Opin. Cardiol., 12:295-302(1997)を参照されたい。
上弁「大動脈狭窄」は、上行大動脈が狭くなることにより特徴付けられる遺伝性血管疾患であるが、肺動脈を含む他の動脈もさらに影響をうけるおそれがある。未治療の大動脈狭窄では、心内圧力が増加し、結果として心臓肥大が生じ、最終的には心不全及び死に至る。この疾患の病因は十分には理解されていないが、中間平滑筋の過形及び肥大がことによってはこの疾患の顕著な特徴である。エラスチン遺伝子の分子変異体が大動脈狭窄の進行の病因に関与していることが、1997年7月22日公開の米国特許第5,650,282号に報告されている。
心臓弁逆流」は心臓弁の疾患の結果による心臓病の結果として生じる。リュウマチ熱のような種々の病気は、弁オリフィスの収縮又は引っ張りを引き起こすものであるが、他の病気は、心内膜炎、心内膜又は心房オリフィスの内側の膜の炎症、及び心臓の動きに関する。欠損、例えば弁狭窄又は弁の欠損近接により、心臓腔における血液の蓄積、又は弁を通過しての血液の逆流が生じる。弁狭窄又は不全を長期間治癒しないと、心臓肥大や心筋に関連したダメージを被る結果となり、最終的には弁の交換が必要となる。
これら全て、及び心臓肥大が付随するしないに関わらず他の心臓血管、内皮及び血管形成疾患の治療が本発明に含まれる。

0028

「癌」、「癌性」及び「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌リンパ腫芽細胞腫黒色腫肉腫、及び白血病を含む癌腫が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌小細胞肺癌非小細胞肺癌胃癌ホジキン及び非ホジキンリンパ腫膵臓癌神経膠芽細胞腫子宮頸癌卵巣癌肝臓癌、例えば肝癌(hepatic carcinoma)及び肝細胞腫(hepatoma)、膀胱癌、乳癌、大腸癌結腸直腸癌子宮体癌唾液腺癌、腎細胞癌及びウィルムス腫瘍等の腎臓癌基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌産卵口癌、甲状腺癌精巣癌、食道癌、及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。ここでの治療に好適な癌は乳癌、大腸癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌及び上述に記した血管腫瘍に係るものである。
ここで用いられる「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び/又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、131I、125I、90Y及び186Re)、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物起源酵素活性毒素等の毒素、又はそれらの断片を含むことを意図する。
「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学治療薬の例には、アルキル化剤葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の代謝拮抗物質抗生物質ピリミジン類似物、5-フルオロウラシルシスプラチンプリンヌクレオシドアミン類、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド、又はコルチコステロイド類が含まれる。特定の例には、アドリアマイシンドキソルビシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara-C」)、シクロホスファミドチオテパブスルファン、サイトシンタキソール、トキソテアメトトレキセート、シスプラチン、メルファランビンブラスチンブレオマイシンエトポシドイフォスファミドマイトマイシンCミトキサントロンビンクリスチンビノレルビンカルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリンダクチノマイシンマイトマイシンエスペラマイシン(米国特許第4,675,187号参照)、メルファラン及び関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように機能するホルモン薬もこの定義に含まれる。

0029

「成長阻害薬」は、ここで用いられる場合、インビトロ又はインビボで、細胞、例えばWnt-過剰発現癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を称する。即ち、成長阻害薬は、S期における悪性細胞パーセンテージをかなり低減させるものである。成長阻害薬の例は、細胞周期の進行を(S期以外の位置で)阻止する薬剤、例えば、G1停止及びM期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なM期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール、及びトポII阻害剤、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。G1停止させるこれらの薬剤は、S期停止にも波及し、例えば、DNAアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソンダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5-フルオロウラシル及びAra-Cである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael,編集, Chapter 1, Murakamiらによる表題「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」(WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に13頁に見出される。さらなる例には、腫瘍壊死因子(TNF)、酸性又は塩基性FGF又は肝実質細胞成長因子(HGF)の血管形成活性を阻害又は中和可能な抗体、組織因子凝固活性を阻害又は中和可能な抗体、プロテインC又はプロテインS(1991年2月21日に公開されたWO91/01753を参照されたい)、又はHER2レセプターに結合可能な抗体(WO89/06692)、例えば4D5抗体(及びそれらの機能的等価物)(例えばWO92/22653)が含まれる。
「治療」とは、心臓血管、内皮及び血管形成疾患の病的状態の進行の防止又は改変を意図して行われる。治療の概念は最も広い意味に使用され、任意の段階の心臓血管、内皮及び血管形成疾患の防止(予防)、緩和、低減、及び治癒を特に含む。従って、「治療」は治癒的処置、及び予防的又は防止的手段の両方を称し、目的は肥大のような心臓血管、内皮及び血管形成疾患を防止し又は遅延させ(低減させ)又は改善することにある。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。疾患は、特発症、心栄養性(cardiotrophic)、又は筋栄養性の原因、又は虚血又は虚血発作、例えば心筋梗塞を含む、任意の原因の結果によるものである。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式で薬剤を投与し、初期治療効果、例えば抗肥大効果を長時間に渡って維持することを称する。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園スポーツ、又はペット動物、例えばイヌウマネコウシヒツジ、ブタなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数のさらなる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び任意の順序での連続した投与を含む。

0030

「心臓血管、内皮及び血管形成薬」なる用語は、一般的に、心臓血管、内皮及び血管形成疾患の治療に作用する任意の薬剤を称する。心臓血管剤の例は、血圧、心拍数、心収縮、及び内皮及び平滑筋の生物学を調節する血管ホメオスタシスを促進するもので、全因子は心臓血管病における役割を有している。これらの特定の例には、アンジオテンシン-IIレセプターアンタゴニスト;エンドセリンレセプターアンタゴニスト、例えばBOSENTANTM及びMOXONODINTM;インターフェロン-ガンマ(IFN-γ);デス-アスパラタート-アンジオテンシンI;血栓溶解剤、例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、t-PA、及び半減期がより長く、非常に高いフィブリン特異性を有するように設計されたt-PA変異体、TNK-t-PA(T103N、N117Q、KHRR(296-299)AAAAt-PA変異体, Keyt等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3670-3674(1994)):強心薬又は昇圧薬、例えばジゴキシゲニン、及びβ-アドレナリン様レセプターブロック剤、例えばプロプラノロール、チモロール、タータロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、及びカーベジルロール;アンジオテンシン転換酵素(ACE)インヒビター、例えばクイナピリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル及びリシノプリル;ジウレティクス、例えばクロロチアザイドヒドロクロロチアザイド、ヒドロフルメタザイド、メチルクロチアザイド、ベンズチアザイド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、及びインダパミド;及びカルシウムチャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル及びニカルジピンが含まれる。この種の好ましい一カテゴリーは、心臓肥大、又は心臓肥大の進行における生理学的状態、例えば血圧の上昇、大動脈狭窄又は心筋梗塞の治療に使用される治療薬である。
「血管形成薬」及び「内皮薬」は、血管形成及び/又は内皮細胞の成長、又は適切であるならば血管形成を促進する活性剤である。これには、傷の治癒を促進する因子、例えば成長ホルモン、インシュリン様成長因子-I(IGF-I)、VEGF、VIGF、PDGF、表皮成長因子(EGF)、CTGF及びそのファミリーメンバー、EGF、及びTGF-α及びTGF-βが含まれる。
「アンジオスタチック薬」は血管形成又は管形成を阻害、又は癌細胞の成長を阻害又は防止する活性剤である。例には、上述した血管形成剤の抗体又は他のアンタゴニスト、例えばVEGFに対する抗体が含まれる。さらに、細胞治療薬、例えば細胞毒性薬、化学治療薬、成長阻害薬、アポトーシス薬、及び癌を治療する他の薬剤、例えば抗-HER-2、抗-CD20、及び生物活性及び有機化学薬が含まれる。
本発明における薬理学的意味で、活性剤、例えばPROポリペプチド、又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体の「治療的有効量」とは、哺乳動物の心臓血管、内皮及び血管形成疾患の治療に有効な量を称するものであり、経験的に決定することができる。
ここで使用される場合、活性剤、例えばPROポリペプチド、又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体の「有効量」とは記載した目的の実行に有効な量を称するものであり、このような量は、所望する効果に応じて経験的に決定することができる。
ここで用いられる用語「PROポリペプチド」及び「PRO」は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号(例えば、PRO/数字)は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。「数字」という用語がここで使用される実際の数値符号として与えられる「PRO/数字ポリペプチド」及び「PRO/数字」という用語は、天然配列ポリペプチド及び変異体(ここで更に詳細に定義する)を含む。ここに記載されるPROポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。

0031

「天然配列PROポリペプチド」は、天然由来の対応するPROポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列PROポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列PROポリペプチド」という用語には、特に、特定のPROポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示される天然配列PROポリペプチドは、添付の図面に示される全長アミノ酸配列を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドンは、図において太字及び下線で示した。しかし、添付の図面に開示したPROポリペプチドは、図面におけるアミノ酸位置1としてここに標記されるメチオニン残基で始まるように示されているが、図面におけるアミノ酸位置1の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をPROポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし可能でもある。
PROポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ECD」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないPROポリペプチドの形態を意味する。通常、PROポリペプチドECDは、それらの膜貫通及び/又は細胞質ドメインを1%未満、好ましくはそのようなドメインを0.5%未満しか持たない。本発明のPROポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約5アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、PROポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又は明細書で同定されたように膜貫通ドメイン及び/又は細胞外ドメインの境界のいずれかの側から約5を越えないアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わないにかかわらず、それらのポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
ここに開示する種々のPROポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書及び/又は添付の図面に示す。しかし、注記するように、シグナルペプチドのC-末端境界は変化しうるが、ここで最初に同定されたシグナルペプチドC-末端境界のいずれかの側で約5アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのC-末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる(例えば、Nielsen等, PROt. Eng. 10: 1-6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986))。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここで同定されたシグナルペプチドのC-末端境界の何れかの側の約5アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。

0032

「PROポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くPROポリペプチド配列、ここに開示されたような、シグナルペプチドを持つか持たないPROポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチド配列の任意の他の断片と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する活性PROポリペプチドを意味する。このようなPROポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のN-又はC-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたPROポリペプチドが含まれる。通常、PROポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くPROポリペプチド配列、ここに開示されたようなシグナルペプチドを持つか持たないPROポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチド配列の任意の他の特に明確にされた断片と、少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%又は98%のアミノ酸配列同一性、そして、或いは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、PRO変異体ポリペプチドは、少なくとも約10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150又は200アミノ酸長であり、或いは少なくとも約300アミノ酸長であり、又はそれより長い。

0033

ここに定義されるPROポリペプチド配列に対する「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、PRO配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表1に与えられている配列比較プログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表1に示したソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また表1に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標) V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bに対しての、それとの、又はそれと対照しての%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bに対して、それと、又はそれと対照して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた%アミノ酸配列同一性の計算の例として、表2-3は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の、「PRO」と称されるアミノ酸配列に対する%アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。

0034

特に断らない限りは、ここでの全ての%アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschul等, Nucleic AcidsRes. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.からダウンロードでき、また他の手段ではNational Institute of Health, Bethesda, MDから得られる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe-値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62である。
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bに対しての、それとの、又はそれに対照しての%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bに対しての、それとの又はそれに対照しての或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
さらに、%アミノ酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて決定してもよい。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。ここでの目的のために、%アミノ酸配列同一性値は、(a)天然PROポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列(即ち、対象とするPROポリペプチドが比較されるPROポリペプチド変異体であってもよい配列)との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、(b)対象とするPROポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Bに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Aを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Aが対象とする比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Bが対象とするPROポリペプチドのアミノ酸配列である。

0035

「PRO変異体ポリヌクレオチド」又は「PRO変異体核酸配列」は、以下に定義するような活性なPROポリペプチドをコードする核酸分子を意味し、ここに開示する全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無のPROポリペプチド細胞外ドメイン、又はここに開示する全長PROポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約80%の核酸配列同一性を有する。通常は、PRO変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無のPROポリペプチド細胞外ドメイン、又はここに開示する全長PROポリペプチド配列の他の断片をコードする核酸配列と少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 又は98%の核酸配列同一性、そして、或いは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然のヌクレオチド配列を含まない。
通常は、PRO変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 450又は600ヌクレオチド長であり、或いは少なくとも約900ヌクレオチド長、又はそれより長い。

0036

ここに同定されたPROポリペプチドコード化核酸配列に対する「パーセント(%)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、PROポリペプチドコード化配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、%核酸配列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表1に与えられている配列比較プログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表1に示したソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また図2A-Pに与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標)V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
ここでの目的のためには、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dに対しての、それとの又はそれに対照しての%核酸配列同一性(あるいは、与えられた核酸配列Dに対しての、それとの又はそれに対照しての或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムALIGN-2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた%核酸配列同一性の計算の例として、表4-5は、「比較DNA」と称される核酸配列の「PRO-DNA」と称される核酸配列に対する%核酸配列同一性の計算方法を示す。
特に断らない限りは、ここでの全ての%核酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschul等, Nucleic AcidsRes. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、あるいはその他、国立医療研究所, Bethesda, MDから得られる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe-値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62である。

0037

配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dに対しての、それとの、又はそれに対照しての%核酸配列同一性(あるいは、与えられた核酸配列Dに対しての、それとの又はそれに対照しての或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
さらに、%核酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム(Altschul等, Methodsin Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて決定してもよい。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。ここでの目的のために、%核酸配列同一性値は、(a)天然配列PROポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドコード化配列の核酸配列と、対象とする比較核酸分子(即ち、対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子の配列が比較される変異体ポリヌクレオチドであってもよい配列)との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一ヌクレオチドの数を、(b)対象とするPROポリペプチドコード化核酸のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Bに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Aを含んでなる単離された核酸分子」という表現では、核酸配列Aが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Bが対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
他の実施態様では、PRO変異体ポリヌクレオチドは、活性なPROポリペプチドをコードする核酸分子であり、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここでの明細書及び添付の図中に示される全長PROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成できる。PRO変異体ポリペプチドは、PRO変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。

0038

「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、自然に結合する全ての成分と結合していない。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、PROポリペプチドの自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1つの精製工程により調製される。
PROポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子、又は抗-PRO抗体をコードする「単離された」核酸分子は、同定され、PRO-コード化核酸の天然源、又は抗-PRO-コード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸分子は、自然に結合する全ての汚染物質と結合していない。単離されたPRO-コード化核酸分子又は単離された抗-PRO-コード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するPRO-コード化核酸分子又は抗-PRO-コード化核酸分子とは区別される。しかし、PROポリペプチドをコードする単離された核酸分子、又は抗-PRO抗体をコードする単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるPROポリペプチド又は抗-PRO抗体を通常は発現する細胞に含まれるPRO-核酸分子、又は抗-PRO-核酸分子を含む。

0039

「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なDNA配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのPROポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的ストランドがその融点より低い環境に存在する場合における変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの;(2)ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの;(3)42℃における50%ホルムアミド、5xSSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5xデンハード液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%のデキストラン硫酸と、42℃における0.2xSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び55℃での50%ホルムアミド、次いで55℃におけるEDTAを含む0.1xSSCからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件(例えば、温度、イオン強度及び%SDS)の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハード液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の37℃での終夜インキュベーション、次いで1xSSC中37-50℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。

0040

「エピトープタグ」なる修飾詞は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したPROポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な数の残基を有しているが、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8から50のアミノ酸残基(好ましくは約10から約20のアミノ酸残基)を有する。
PRO変異体における「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生PROポリペプチドの生物学的及び/又は免疫学的活性を保持するPROタンパク質の形態を称する。
ここで開示されているスクリーニングアッセイにより同定可能なPROポリペプチドに拮抗する分子(例えば、有機又は無機小分子、ペプチド等)における「生物学的活性」とは、ここで同定されたPROポリペプチドに結合又は複合体化、又は他の細胞タンパク質とPROポリペプチドとの相互作用を干渉、又はPROポリペプチドの転写又は翻訳を阻害する分子の能力を称するときに使用される。特に好ましい生物学的活性には、血管に影響を及ぼす全身疾患、例えば真性糖尿病、並びに動脈、毛細管、静脈及び/又はリンパ管の病気、及び癌に作用する心臓肥大活性が含まれる。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PROポリペプチドの一又は複数の生物学的活性、例えば適切であるならば、その分裂促進又は血管形成活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。PROポリペプチドのアンタゴニストは、PROポリペプチドの細胞レセプターへの結合に干渉する、PROポリペプチドにより活性化される細胞を無力化又は死亡させる、又はPROポリペプチドが細胞レセプターに結合した後に血管内皮細胞の活性化に干渉することにより作用する。PROポリペプチドアンタゴニストによる仲介のこのような点の全ては、この発明の目的と等しいと考えられる。アンタゴニストは、分裂促進、血管形成、又はPROポリペプチドの他の生物学的活性を阻害し、よって、腫瘍、特に固形悪性腫瘍、慢性関節リュウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化、糖尿病、他の網膜症、水晶体後繊維増殖症年齢関連性変性、新血管新生緑内障、血管腫、甲状腺過形成(グレイブス病を含む)、角膜及び他の組織の移植、及び慢性炎症を含む、所望しない過度の新血管新生により特徴付けられる病気又は疾患の治療に有用である。また、アンタゴニストは、所望しない過度の血管浸透性により特徴付けられる病気又は疾患、例えば脳腫瘍に関連した浮腫、悪性腫瘍に関連した腹水症、メーグス症候群、肺炎ネフローゼ症候群、心外膜液(例えば心膜炎に関連したもの)、胸膜滲出の治療に有用である。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PROポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然PROポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子等を含む。
「小分子」とは、ここでは約500ダルトン以下の分子量を有するものと定義する。
ここで使用される場合の「PROポリペプチドレセプター」なる用語は、PROポリペプチドの細胞性レセプター、通常は血管内皮細胞に見出される細胞表面レセプター、並びにPROポリペプチドに結合する能力を保持しているそれらの変異体を称する。

0041

「抗体」(ABs)と「免疫グロブリン」(Igs)は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンは、抗体及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含むものである。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、限定するものではないが、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片も含む。
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖からなる、約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(VH)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)を、他端に定常ドメインを有し;軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を称する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は相補性決定領域(CDR)と呼ばれる3つのセグメント濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、3つのCDRにより連結されたβシート配置を主にとる4つのFR領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のCDRは、FRにより近接して結合せしめられ、他の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。Kabat等, NIH Publ. No.91-3242, Vol.I, 647-669頁[1991]を参照のこと。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性への抗体の関与を示す。

0042

「抗体断片」には、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2及びFv断片;ダイアボディー(diabodies);直鎖状抗体(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062[1995]);単鎖抗体分子;及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りの「Fc」断片が産生される。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有し、更に抗原を架橋させ得るF(ab')2断片が得られる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメイン二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの3つのCDRは相互に作用してVH-VL二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、6つのCDRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(CH1)を有する。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1領域のカルボキシ末端数個の残基が付加している点でFab断片とは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基遊離チオール基を担持しているFab'に対するここでの命名である。F(ab')2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには5つの主たるクラス:IgAIgDIgEIgG及びIgMがあり、それらのいくつかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4、IgA及びIgA2に分割される。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、σ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び3次元構造はよく知られている。

0043

ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む通常の(ポリクローナル)抗体と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 (1975)により開示されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えDNA法によって作ることができる(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624-628(1991)、及びMarksほか, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号; Morrisonほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855[1984])。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそれらの断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエントのCDRの残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのFvFR領域残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986);Reichmann等, Nature 332, 323-329(1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、関心のある抗原でマカクザル免疫化することにより生産された抗体から由来するプリマタイズしたPRIMATIZEDTM抗体を含む。

0044

一本鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含有するもので、これらのドメインはポリペプチド単鎖に存在する。好ましくは、Fvポリペプチドは、sFvが抗原結合に対する所望の構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをVHとVLドメインの間に更に含んでいる。sFvのレビューには、例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg及びMoore編(Springer-Verlag, New York, 1994)pp.269-315を参照されたい。
「ダイアボディー」という用語は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を意味するもので、断片は軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を同じポリペプチド鎖(VH-VL)に含有する。同じ鎖上での二つのドメイン間の対合が許されないほど短いリンカーを使用することにより、ドメインが、他の鎖の相補的ドメインとの対合を強いられ、二つの抗原結合部位をつくりだす。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第404,097号;国際公開93/11161号;及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に更に詳しく記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(1)ローリ法(Lowry method)で測定した場合95%を越える抗体、最も好ましくは99重量%を越えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程により調製される。
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的に結合する」、又は「特異的である」抗体は、他の如何なるポリペプチド又はポリペプチドエピトープと実質的に結合することなく特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合するものである。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に複合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を称する。標識は、それ自身検出可能でもよく(例えば、放射性標識又は蛍光標識)、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。検出可能な標識として提供できる放射性核種は、例えば、I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、At-211、Cu-67、Bi-212、及びPd-109を含む。また、標識は毒素などの検出できない物質であってもよい。

0045

固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに含まれる固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス(例えば、孔制御ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミドポリスチレンポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートウェルを構成することができ;その他では精製カラム(例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム)とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物(PROポリペプチド又はここに開示されているそれらの抗体など)の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3又はIgG-4サブタイプ、IgA(IgA-1及びIgA-2を含む)、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
以下に示すように、表1はALIGN-2配列比較コンピュータプログラムの安全なソースコードを与える。このソースコードは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステムでの使用のために日常的にコンパイルされ、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを与える。
さらに、表2−5は、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いた%アミノ酸配列同一性(表2−3)及び%核酸配列同一性(表4−5)を決定するために下記の方法を使用した仮説的例示を示す図であり、「PRO」は対象とする仮説的PROポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」は対象とする「PRO」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「PRO-DNA」は対象とするPRO-コード化核酸配列を示し、「比較DNA」は対象とする「PRO-DNA」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を示し、「X」、「Y」及び「Z」は各々異なる仮説的アミノ酸残基を示し、「N」、「L」及び「V」は各々異なる仮説的ヌクレオチドを示す。

0046

0047

0048

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0050

5.2.本発明の組成物及び方法
5.2.1.PRO変異体
ここに記載した全長天然配列PROに加えて、PRO変異体も調製できると考えられる。PRO変異体は、PROポリペプチドDNAに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び/又は所望のPROポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がPROポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列PRO又はここに記載したPROポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列PROポリペプチドと比較した場合にPROポリペプチドのアミノ酸配列が変化するPROポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも1つのアミノ酸のPROポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、PROポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び/又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては1から5のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟型天然配列によって示される活性について試験することにより決定される。

0051

特別の実施態様では、関心のある保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表6に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表6に例示的置換を示し又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。

0052

PROポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、(a)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(b)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, PRO; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された(非保存)部位に導入されうる。

0053

変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発等の当該技術において公知の技術を使用して作成することができる。部位指向性突然変異誘発[Carter等, Nucl. AcidsRes., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)]、カセット突然変異誘発[Wells等, Gene, 34: 315 (1985)]、制限選択突然変異誘発[Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)]又は他の周知の技術が、PRO変異体DNAを製造するために、クローン化されたDNAに実施できる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である[Cunningham及びWells, Science, 244:1081-1085(1989)]。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。

0054

5.2.2.PROポリペプチドの修飾
PROポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、PROポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、PROポリペプチドの選択された側鎖又はN又はC末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばPROポリペプチドを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-PRO抗体の精製方法及びその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、1,1-ビスジアゾアセチル)-2-フェニルエタングルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸、3,3’-ジチオビススクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-3-[(p-アジドフェニル)-ジチオプロピイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化プロリン及びリシンヒドロキシル化セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基リン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、N末端アミンアセチル化、及び任意のC末端カルボキシル基アミド化を含む。

0055

本発明の範囲内に含まれるPROポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列PROポリペプチドに見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失(存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び/又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び/又は天然配列PROポリペプチドに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この成句は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び割合の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
PROポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列PROポリペプチド(O-結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされてもよい。PROアミノ酸配列は、場合によっては、DNAレベルでの変化、特に、PROポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。

0056

PROポリペプチド上に糖鎖の数を増加させる他の方法は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston,CRCCrit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
PROポリペプチド上に存在する糖鎖部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
PROポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、PROポリペプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。

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