図面 (/)

技術 検体分類の正確性を向上する方法及び試薬キット

出願人 林標揚
発明者 林標揚
出願日 2008年10月20日 (12年2ヶ月経過) 出願番号 2011-509836
公開日 2011年7月21日 (9年5ヶ月経過) 公開番号 2011-521239
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析
主要キーワード プレートバー 携帯工具 総合指標 検査試験紙 保護袋 トリビューン オンライン版 正確率
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2011年7月21日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (3)

課題・解決手段

本発明は検体におけるYKL−40及びMASP2蛋白結合検出することによって検体分類の正確性を向上する方法を開示し、検体におけるYKL−40及びMASP2の含有量を検出するステップと、YKL−40及びMASP2蛋白含有量の比を変数にし、異なる閾値に基づいて癌診断感度及び特異性に対してROC曲線を描き、且つ曲線下の面積AUCを計算するステップと、AUC値、感度及び特異性に基づいて検体に対して分類を行うステップとを含む。本発明はさらに検体におけるYKL−40及びMASP2を検出するための試薬キットを開示する。

概要

背景

肝癌(HCC)はよくある、且つ致命の悪性腫瘍である。統計によると、毎年約500,000の肝癌患者が新たに増加し、且つ約500,000人が該疾病によって死亡している(Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., and Pisani, P. (2001) Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer 94, 153-156.を参照する)。従来の肝癌診断手段は超音波検出及びアルファ胎児性蛋白(alpha−fetoprotein,AFP)検出を含み、2つは通常、結合して使用される(Spangenberg, H. C., Thimme, R., and Blum, H. E. (2006) Serum markers of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis 26, 385-390.を参照する)。アルファ胎児性蛋白を生物マーカーとしてROC曲線によって肝癌診断を行った時に、その検出陽性閾値は一般的に20ng/mlである(陳季武、範培昌、アルファ胎児性蛋白を快速で検出する免疫クロマトグラフィー試験片研究開発、[分析科学学報]、2002年第4期、P.273−276を参照する)。超音波とアルファ胎児性蛋白との結合検出感度及び特異性がそれぞれ50−85%及び70−90%であったが、その偽陽性及び偽陰性率が40%にも達している(Tu, D. G., Wang, S. T., Chang, T. T., Chiu, N. T., and Yao, W. J. (1999) the value of serum tissue polypeptide specific antigen in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Cancer 85, 1039-1043; Buscarini, L., Sbolli, G., Cavanna, L.,Civardi, G., Di Stasi, M., Buscarini, E., and Fornari, F. (1987) Clinical and diagnostic features of 67 cases of hepatocellular carcinoma. Oncology 44, 93-97.を参照する)。そのため、検出がより便利で、感度及び特異性がより高く、且つ正確率がより高い肝癌診断手段に対する要望は科学技術者に対していよいよ差し迫ってきている。

YKL−40がヒト軟骨糖蛋白39(HcGP−39)(またはキチナーゼ様蛋白質、chitinase 3−like 1とも呼ばれる)の略称であり、またはCHI3L1、YKL40とも略称される。研究によると、血清におけるYKL−40のレベルは、骨関節炎原発性大腸癌乳腺癌再発卵巣癌などのような複数の疾病状況に関するため、一部の疾病の診断、予後評価、治療効果モニタリング及び疾病経過のモニタリングに用いられることができることを発見した。例えば、卵巣癌の診断及び予後に用いられることができる(程明剛など、卵巣癌患者の診断及び予後における血清YKL−40の応用。[広東医学]2008年29巻2期、P.255−256を参照する)。イェール大学医学院研究者は2007年11月15日に出版された[ニューイングランドジャーナルオブ・メディシン](The New England Journal of Medicine)に、臨床試験結果は、該分子重篤喘息生理反応を決定する時に重要な作用を有し、普通の人と比べると、喘息病患者のYKL−40血清がより多く、同時に喘息の重篤な程度とも関連することを示したという文章発表した(生物ネットワーク:http://www.ebiotrade.com/newsf/2007-11/20071116165039.htmを参照する)。米国カリフォルニア大学サンディエゴ校Johansen等は、YKL−40が癌胎児抗原CEA)及び乳酸脱水素酵素から独立した生物マーカーであり、YKL−40レベルが高い一般の人々は、その胃腸管腫瘍罹患リスクが2.7倍に増加し、且つ胃腸管腫瘍と診断された後の予後がよくない(中国医学トリビューンオンライン版を参照する。ネットワーク:http://www.cmt.com.cn/article/080221/a080221b0301.htm)。人々はさらに、血清YKL−40レベルはさらに肝臓繊維化指標とすることができることを発見した(Johansen, J. S., Christoffersen, P., Moller, S., Price, P. A., Henriksen, J. H., Garbarsch, C., and Bendtsen, F. (2000) Serum YKL-40 is increased in patients with hepatic fibrosis. Journal of hepatology 32, 911-920.を参照する)が、肝癌診断におけるYKL−40検出の応用に関する報道は現在までになされていない。

MASP2はマンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ2(mannan-binding lectin associated serine protease-2)の略語であり、ヒトの免疫欠損病に関し、人間の体の自然免疫防御において重要な役割を果たしている(蔡学敏等、ヒトマンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ2N端断片の原核発現、[免疫学雑誌]、2007年03期P.235〜238を参照する)が、肝癌診断におけるその応用に関する報道はまだない。

本発明者の研究は、MASP2遺伝子が肝臓において特異的に発現されている遺伝子であることを明らかにした。大量の研究によって、該2種の蛋白はともに肝癌症状と関係し、肝癌患者の血清におけるYKL−40の含有量が正常の検体より明らかに高く、一方、肝癌患者人体におけるMASP2の発現量が正常の検体より低いことを本発明者は偶発的に発見した。よって我々は、癌症における1種の高発現蛋白(この蛋白はある癌症に対してのみ特異的でなくてもよく、異なる癌症においてともに高発現であってもよい)と、1つの組織または器官特異的発現蛋白の該組織または器官における低発現(組織または器官特異的機能を実行する特異的蛋白の癌症による減少)とを連係することによって、癌症を診断する結合生マーカーとし、癌検出の感度及び特異性を向上できる仮説提出した。YKL−40及びMASP2の2種の蛋白を例とし、肝癌臨床応用の生物マーカーとすることができるか、及びその結合検出が疾病の診断及び予後の正確性を向上できるかを観察した。

概要

本発明は検体におけるYKL−40及びMASP2蛋白を結合検出することによって検体分類の正確性を向上する方法を開示し、検体におけるYKL−40及びMASP2の含有量を検出するステップと、YKL−40及びMASP2蛋白含有量の比を変数にし、異なる閾値に基づいて癌診断の感度及び特異性に対してROC曲線を描き、且つ曲線下の面積AUCを計算するステップと、AUC値、感度及び特異性に基づいて検体に対して分類を行うステップとを含む。本発明はさらに検体におけるYKL−40及びMASP2を検出するための試薬キットを開示する。

目的

本発明の主要な目的は、検体におけるYKL−40及びMASP2蛋白を結合検出することによって検体分類の正確性を向上する方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

この技術が所属する分野

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

検体分類の正確性を向上する方法において、検体における蛋白YKL−40及びMASP2を結合検出することを特徴とする検体分類の正確性を向上する方法。

請求項2

前記結合検出は、(1)検体におけるYKL−40及びMASP2の含有量を検出するステップと、(2)検出されたYKL−40及びMASP2の含有量に対して数学分析を行うステップと、(3)数学分析の結果に基づき、測定検体に対して分類を行うステップと、を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項3

前記YKL−40及びMASP2の含有量がそれぞれ検出されることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。

請求項4

前記数学分析はROC曲線を作成することであり、YKL−40及びMASP2蛋白含有量の比を変数にし、異なる閾値に基づいてROC曲線を作成して曲線下の面積AUCを計算し、且つ所望の感度及び特異性に応じて測定検体に対して分類を行うことを特徴とする請求項2に記載の方法。

請求項5

YKL−40とMASP2とのうちの少なくとも1つの含有量がELISA技術によって測定されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。

請求項6

前記検体は全血血漿血清、尿、脳脊髄液唾液及びから構成された群から選択されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。

請求項7

癌症診断、予後評価、治療効果モニタリング及び疾病経過のモニタリングに用いられることを特徴とする請求項1に記載の方法。

請求項8

前記癌症が肝癌であることを特徴とする請求項7に記載の方法。

請求項9

請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法を実施するための試薬キットであって、(1)YKL−40及びMASP2を結合できる抗体と、(2)YKL−40及び/またはMASP2が(1)により限定された抗体に結合された時に、YKL−40及びMASP2に結合することができる標識抗体と、を含む、試薬キット。

請求項10

さらに、(3)既知量のYKL−40及びMASP2を含有する溶液によって構成される標準検体と、(4)抗体と結合して抱合体を形成することができる測定用抗体標識と、を含むことを特徴とする請求項9に記載の試薬キット。

請求項11

個体の特定の組織または器官の癌症または疾病に対して診断、予後評価、治療効果のモニタリングまたは疾病経過のモニタリングを行う方法であって、(1)個体の血液検体における癌症または疾病高発現の蛋白または遺伝子を測定するステップと、(2)血液における、特定組織または器官の特異的な蛋白または遺伝子の低発現を測定するステップと、(3)検出された蛋白含有量または遺伝子発現結果に対して数学分析を行うステップと、(4)数学分析結果に基づき、測定された個体検体に対して分類を行い、癌症または疾病の診断結果を下すステップと、を含む、方法。

請求項12

肝癌の診断、予後評価、治療効果のモニタリングまたは疾病経過のモニタリング用方法であって、(1)個体の血液検体における肝炎ウイルスの発現を測定するステップと、(2)個体の血液検体におけるYKL−40及びMASP2の発現を測定するステップと、(3)検出された肝炎ウイルス発現レベルと、YKL−40及びMASP2の発現レベルに対して数学分析を行うステップと、(4)数学分析結果に基づき、測定された血液検体に対して分類を行い、肝癌の判断結果を下すステップと、を含む、方法。

請求項13

請求項12に記載の方法を実施するための試薬キットであって、(1)肝炎ウイルス、YKL−40及びMASP2を結合できる抗体と、(2)肝炎ウイルス及び/またはYKL−40及び/またはMASP2が(1)により限定された抗体に結合された時に、肝炎ウイルス及び/またはYKL−40及びMASP2に結合することができる標識抗体と、を含む、試薬キット。

技術分野

0001

本発明は生物医薬技術分野に属し、具体的に言うと、本発明は検体分類の正確性を向上する方法、及び検体におけるYKL−40及びMASP2蛋白を検出するための試薬キットに係る。

背景技術

0002

肝癌(HCC)はよくある、且つ致命の悪性腫瘍である。統計によると、毎年約500,000の肝癌患者が新たに増加し、且つ約500,000人が該疾病によって死亡している(Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., and Pisani, P. (2001) Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer 94, 153-156.を参照する)。従来の肝癌診断手段は超音波検出及びアルファ胎児性蛋白(alpha−fetoprotein,AFP)検出を含み、2つは通常、結合して使用される(Spangenberg, H. C., Thimme, R., and Blum, H. E. (2006) Serum markers of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis 26, 385-390.を参照する)。アルファ胎児性蛋白を生物マーカーとしてROC曲線によって肝癌診断を行った時に、その検出陽性閾値は一般的に20ng/mlである(陳季武、範培昌、アルファ胎児性蛋白を快速で検出する免疫クロマトグラフィー試験片研究開発、[分析科学学報]、2002年第4期、P.273−276を参照する)。超音波とアルファ胎児性蛋白との結合検出感度及び特異性がそれぞれ50−85%及び70−90%であったが、その偽陽性及び偽陰性率が40%にも達している(Tu, D. G., Wang, S. T., Chang, T. T., Chiu, N. T., and Yao, W. J. (1999) the value of serum tissue polypeptide specific antigen in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Cancer 85, 1039-1043; Buscarini, L., Sbolli, G., Cavanna, L.,Civardi, G., Di Stasi, M., Buscarini, E., and Fornari, F. (1987) Clinical and diagnostic features of 67 cases of hepatocellular carcinoma. Oncology 44, 93-97.を参照する)。そのため、検出がより便利で、感度及び特異性がより高く、且つ正確率がより高い肝癌診断手段に対する要望は科学技術者に対していよいよ差し迫ってきている。

0003

YKL−40がヒト軟骨糖蛋白39(HcGP−39)(またはキチナーゼ様蛋白質、chitinase 3−like 1とも呼ばれる)の略称であり、またはCHI3L1、YKL40とも略称される。研究によると、血清におけるYKL−40のレベルは、骨関節炎原発性大腸癌乳腺癌再発卵巣癌などのような複数の疾病状況に関するため、一部の疾病の診断、予後評価、治療効果モニタリング及び疾病経過のモニタリングに用いられることができることを発見した。例えば、卵巣癌の診断及び予後に用いられることができる(程明剛など、卵巣癌患者の診断及び予後における血清YKL−40の応用。[広東医学]2008年29巻2期、P.255−256を参照する)。イェール大学医学院研究者は2007年11月15日に出版された[ニューイングランドジャーナルオブ・メディシン](The New England Journal of Medicine)に、臨床試験結果は、該分子重篤喘息生理反応を決定する時に重要な作用を有し、普通の人と比べると、喘息病患者のYKL−40血清がより多く、同時に喘息の重篤な程度とも関連することを示したという文章発表した(生物ネットワーク:http://www.ebiotrade.com/newsf/2007-11/20071116165039.htmを参照する)。米国カリフォルニア大学サンディエゴ校Johansen等は、YKL−40が癌胎児抗原CEA)及び乳酸脱水素酵素から独立した生物マーカーであり、YKL−40レベルが高い一般の人々は、その胃腸管腫瘍罹患リスクが2.7倍に増加し、且つ胃腸管腫瘍と診断された後の予後がよくない(中国医学トリビューンオンライン版を参照する。ネットワーク:http://www.cmt.com.cn/article/080221/a080221b0301.htm)。人々はさらに、血清YKL−40レベルはさらに肝臓繊維化指標とすることができることを発見した(Johansen, J. S., Christoffersen, P., Moller, S., Price, P. A., Henriksen, J. H., Garbarsch, C., and Bendtsen, F. (2000) Serum YKL-40 is increased in patients with hepatic fibrosis. Journal of hepatology 32, 911-920.を参照する)が、肝癌診断におけるYKL−40検出の応用に関する報道は現在までになされていない。

0004

MASP2はマンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ2(mannan-binding lectin associated serine protease-2)の略語であり、ヒトの免疫欠損病に関し、人間の体の自然免疫防御において重要な役割を果たしている(蔡学敏等、ヒトマンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ2N端断片の原核発現、[免疫学雑誌]、2007年03期P.235〜238を参照する)が、肝癌診断におけるその応用に関する報道はまだない。

0005

本発明者の研究は、MASP2遺伝子が肝臓において特異的に発現されている遺伝子であることを明らかにした。大量の研究によって、該2種の蛋白はともに肝癌症状と関係し、肝癌患者の血清におけるYKL−40の含有量が正常の検体より明らかに高く、一方、肝癌患者人体におけるMASP2の発現量が正常の検体より低いことを本発明者は偶発的に発見した。よって我々は、癌症における1種の高発現蛋白(この蛋白はある癌症に対してのみ特異的でなくてもよく、異なる癌症においてともに高発現であってもよい)と、1つの組織または器官特異的発現蛋白の該組織または器官における低発現(組織または器官特異的機能を実行する特異的蛋白の癌症による減少)とを連係することによって、癌症を診断する結合生マーカーとし、癌検出の感度及び特異性を向上できる仮説提出した。YKL−40及びMASP2の2種の蛋白を例とし、肝癌臨床応用の生物マーカーとすることができるか、及びその結合検出が疾病の診断及び予後の正確性を向上できるかを観察した。

発明が解決しようとする課題

0006

前記発見に基づき、本発明の主要な目的は、検体におけるYKL−40及びMASP2蛋白を結合検出することによって検体分類の正確性を向上する方法を提供することにある。

0007

本発明のもう1つの目的は、検体におけるYKL−40及びMASP2蛋白を検出するための試薬キットを提供することにある。

0008

本発明の更なる1つの目的は、検体における癌高発現蛋白及び組織または器官特異的発現蛋白を結合検出することによって検体の分析感度を向上する方法を提供することにある。

0009

本発明のもう1つの更なる目的は、検体における癌高発現蛋白及び組織または器官特異的発現蛋白を検出するための試薬キットを提供することにある。

課題を解決するための手段

0010

前記目的を実現するため、本発明は以下のような技術案を採用する。

0011

検体分類の正確性を向上する方法において、検体における蛋白YKL−40及びMASP2を結合検出することを特徴とする。

0012

前記結合検出は、
(1)検体におけるYKL−40及びMASP2の含有量を検出するステップと、
(2)検出されたYKL−40及びMASP2の含有量に対して数学分析を行うステップと、
(3)数学分析の結果に基づき、測定検体に対して分類を行うステップと、
を含む。

0013

癌症を含む疾病の診断、予後評価、治療効果のモニタリング及び疾病経過のモニタリングにおける前記方法の応用である。

0014

検体におけるYKL−40及びMASP2蛋白を検出するための試薬キットであって、
(1)YKL−40及びMASP2を結合できる抗体と、
(2)YKL−40及び/またはMASP2が(1)により限定された抗体に結合された時に、YKL−40及びMASP2に結合することができる標識抗体と、
を含む。

0015

個体の癌検出の感度を向上する方法であって、
(1)個体の検体における癌高発現の蛋白含有量を測定するステップと、
(2)個体の検体における、特定組織または器官の特異的発現の蛋白含有量を測定するステップと、
(3)検出された検体における癌高発現蛋白含有量及び組織または器官特異的発現の蛋白含有量に対して数学分析を行うステップと、
(4)数学分析結果に基づき、個体を癌症または健康に分類するステップと、
を含む、方法。

0016

検体における癌高発現蛋白及び組織または器官特異的発現蛋白を検出するための試薬キットであって、
(1)癌高発現蛋白及び組織または器官特異的発現蛋白を結合できる抗体と、
(2)癌高発現蛋白及び/または組織もしくは器官特異的発現蛋白が(1)により限定された抗体に結合された時に、癌高発現蛋白及び組織または器官特異的発現蛋白に結合することができる標識抗体と、
を含む、試薬キット。

0017

研究は、本発明の方法及び試薬キットを採用して個体の検体における蛋白YKL−40及びMASP2を結合検出することによって、癌診断の感度、特異性及び正確率を有効に向上でき、且つ複数の疾病の診断、予後評価、治療効果評価及び疾病経過のモニタリングに普及させることができることを示した。

図面の簡単な説明

0018

図1は肝癌患者の血清検体に対してYKL−40検出を行ったROC曲線画面である。
図2は肝癌患者の血清検体に対してMASP2検出を行ったROC曲線画面である。
図3は肝癌患者の血清検体に対してYKL−40及びMASP2結合検出を行ったROC曲線画面である。

0019

以下は具体的な実施例にあわせて、本発明に対してさらに説明する。以下の実施例は本発明を説明することにのみ用いられるため、本発明の範囲を限定するものではない。

0020

周知のように、個体が癌症になりはじめ、または癌症の臨床段階になった時に、癌ウイルスまたは癌遺伝子が高発現され、このような高発現された蛋白、例えばYKL−40は癌症の生物マーカーとすることができ、一方、該個体の関係組織または器官の機能が低下することによって、該組織または器官における特異的発現の蛋白、例えば肝臓において特異的に発現するMASP2の発現レベルが低下するため、組織または器官特異的発現蛋白の低発現レベルは癌生物マーカーとする潜在力を同様に持っている。本分野の当業者が熟知のように、単一の生物マーカーの検出は時には偽陽性または偽陰性の増加になり、検出の正確率の下降に至るため、個体検体における癌高発現の蛋白、例えばYKL−40の含有量と特定組織または器官の特異的発現蛋白、例えば肝臓において特異的に発現するMASP2の低発現レベルとを同時に検出する、すなわち、従来の対形成されたマーカーのベースにさらに新マーカーを加えることによって検出の感度を向上することは、癌検出の感度を向上でき、これは下記の実施例において検証されるであろう。

0021

無論、本発明の個体癌検出感度向上方法と関連試薬キットは各種の癌症と器官病変の診断、予後評価、治療効果評価及び疾病経過のモニタリングに応用できる。

0022

例えば、血液検体の結合検出を例とし、ある特定組織または器官の癌症または疾病に対する本発明の適用は、個体血液検体における癌症または疾病の高発現の蛋白または遺伝子を検出するステップと、特定組織または器官の特異的蛋白または遺伝子の血液における低発現を検出するステップと、検出された蛋白含有量または遺伝子の発現結果に対して数学分析を行うステップと、数学分析結果に基づき、測定された個体検体に対して分類を行い、癌症または疾病の診断結果を下すステップと、を含む。このような結果は健康、癌症または疾病の前期、癌症または疾病の中期、癌症または疾病の晩期などに分けることができる。

0023

理解すべきは、本明細書における述語「結合検出」の含意は、検体における特定蛋白の含有量を検出することを含むだけでなく、さらに検出された蛋白含有量にする数学分析を含んでもよく、且つ、さらに数学分析の結果に基づき、測定された検体に対して分類を行うことを含んでもよい。

0024

ELISA
本発明はELISA技術を使用して、個体検体に対して癌高発現蛋白、例えばYKL40、及び組織または器官特異的発現蛋白、例えばMASP2の検出を行う。

0025

酵素結合免疫吸着検査法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)は分子生物学分野における常用蛋白質含量分析方法であり、抗原測定に使用されてもよいし、抗体測定に使用されてもよい。試薬由来、検体の性状及び検査に必要な条件に基づき、本発明は複数種の異なるタイプ、例えば二重抗体サンドイッチエライザ法、2部位1ステップ法間接抗体法、競合法、捕捉法によるIgM抗体検出、及びビオチンアビジンステムを用いたELISAなどを採用できる。

0026

試薬キット
好ましくは、本発明のELISAは試薬キットを用いて完成し、快適な操作が実現されることによって、従来の実験検出の煩雑を避ける。本発明のELISA試薬キットはYKL40免疫酵素標識試薬キットと、MASP2免疫酵素標識試薬キットと、YKL40及びMASP2免疫酵素標識試薬キットとを含む。疾病診断の感度、特異性及び正確率を向上するため、好ましくは、YKL40及びMASP2検出試薬キットを使用し、2群の検出結果がそれぞれまたは同時に得られることによって、快適な効果を達成できる。

0027

本発明のYKL40及びMASP2検出試薬キットは少なくとも、
(1)YKL−40及びMASP2を結合できる抗体と、
(2)YKL−40及び/またはMASP2が(1)により限定された抗体に結合された時に、YKL−40及びMASP2に結合することができる標識抗体と、
を含む。

0028

前記試薬キットはさらに、
(3)既知量のYKL−40及びMASP2を含有する溶液によって構成され、遺伝子組換え微生物発現、動物またはヒトの体液から由来できる標準検体と、
(4)報告方法とする酵素標識用試薬、例えばペルオキシダーゼ、または抗体と結合して抱合体を形成することができる蛍光標識のような測定用抗体標識と、
を含む。

0029

さらに好ましくは、試薬キットは、(5)スペースが1種または複数種の容器、96ウェルプレートまたはプレートバー収納できる限定スペースに分けられ、該容器が薬瓶テストチューブ及び類似物で、各容器には本発明の方法に用いられる1つの単一な成分が含有されている、携帯工具と、(6)呈色試薬酵素阻害剤緩衝液希釈剤洗浄試薬及び類似物のような補助試薬と、(7)ボトル、テストチューブ及び類似物に書かれてもよいし、1枚の単独の用紙、または容器の外部または内部に書かれてもよいし、CD、CD−ROM、画像などのようなマルチメディア形式であってもよい使用説明書と、のうちの少なくとも1つを含む。

0030

好ましくは、抗体は固相担体に固定され、捕捉抗体に形成されることができる。

0031

前記抗体はYKL40及びMASP2を結合できるいずれかの抗体断片を含み、且つ組み換え体キメラ抗体ヒト抗体及びマウス抗体であってもよい。前記抗体はモノクロナール抗体またはポリクローナル抗体であってもよく、モノクロナール抗体が好ましい。

0032

好ましくは、抗体抱合体がELISA読み取り装置、例えば、マイクロプレートリーダーによって光度測定されることができる。

0033

検体
本発明に使用される検体は全血血漿、血清、尿、脳脊髄液唾液またはのような複数種の形式を含むことができ、好ましくは血清である。

0034

検体の調製方法遠心などのような一般的な方法であってもよく、例えば、文献Young, D. S. & Bermes, E. W. "Specimen collection and processing" in Tietz Textbook of Clinical Chemistry 2nd Edition" Eds. Burtis, C. A. & Ashwood, E. R., Saunders (1994);Methods in Enzymology, H. Van Vunakis and J. J. Langone (Eds), 1981, 72(B); Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, R. J. Burden and P. H. Van Knippenberg (Eds), Elsevier, 1985; Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, T. Chard, ibid, 3rd Edition, 1987; Methods in Enzymology, H. Van Vunakis and J. J. Langone (Eds) 1981, 74(C)を参照する。

0035

ROC曲線
ELISAによって検体における癌高発現蛋白、例えばYKL40、及び組織または器官特異的発現蛋白、例えばMASP2の濃度を検出した後、検出された検体における癌高発現蛋白、例えばYKL40、及び組織または器官特異的発現蛋白、例えばMASP2の濃度に対して数学分析方法によって統計学処理を行うことができ、これをベースにして検体分類意義を有するレベルわけ標準を得る。好ましくはこのような数学方法はコンピューターによって完成され、例えばこれらのデータでROC曲線を作成することによって、個体の検体に対して分類を行う。

0036

ROC曲線の全称は受信者動作特性曲線(receiver operator characteristic curve)であり、受信者操作特性曲線とも呼ばれ、主に臨床生物化学診断試験に応用される。ROC曲線は真陽性率(感度、または敏感性とも呼ばれ、sensitivity)及び偽陽性率(1−特異性、specificity)連続変数を反映する総合指標であり、構図法によって感度と特異性との相互関係を表しており、一連の異なる境界値(閾値または臨界値、cut-off value,診断試験結果が正常であるか異常であるかを区別する臨界値である)を連続変数とすることによって、一連の感度及び特異性を算出し、さらに感度を縦軸とし、1−特異性を横軸とすることによって作成された曲線であり、曲線下面積(AUC)が大きいほど、診断の正確性が高い。ROC曲線において、座標図左上方に最も接近する点が感度及び特異性がともに高い臨界値である。ROC曲線のAUC値が1.0〜0.5で、AUC>0.5の場合は、AUCが1に接近するほど、診断効果がよい。AUC値が0.5〜0.7であった場合は正確性が低い。AUC値が0.7〜0.9であった場合は一定の正確性がある。AUCが0.9以上であった場合は、正確性が比較的高い。

0037

ROC曲線の評価方法は伝統的な評価方法と異なっており、実際の状況に応じ、中間状態許容され、試験結果を複数の順序分類、例えば、正常、ほぼ正常、疑わしい、ほぼ異常及び異常の5つのステージに分けることができる。

0038

前記順序分類は疾病の診断にとって、陰性不確定、陽性に分けられ、さらに、癌診断にとって、癌症、健康に分けられる。

0039

よって、検体における蛋白YKL40及びMASP2の検出を例とし、本発明の検体分類正確性を向上する方法は、
(1)検体における蛋白YKL40及びMASP2の含有量をそれぞれ検出するステップと、
(2)YKL40とMASP2蛋白含有量との比を変数にし、異なる閾値に基づいて癌診断の感度及び特異性に対してROC曲線を作成し、且つ曲線下面積AUCを算出するステップと、
(3)所望の感度及び特異性に基づいて測定検体に対して分類する(癌症または健康)ステップと、を含む。

0040

ROC曲線の作成は従来の技術分野のソフトウエアまたはシステム、例えばMedCalc 9.2.0.1医学統計ソフトウエア、SPSS9.0、ROCPOWER.SAS、DESIGNROC.FOR、MULTIREADER_POWER.SAS、CREATE_ROC.SAS、GB STATV10.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, MD, USA)などを使用することができる。

0041

肝癌の診断、予後評価、治療効果モニタリングまたは疾病経過のモニタリング
医学分野における本発明の具体的な応用は、主に肝癌の診断、予後評価、治療効果モニタリングまたは疾病経過のモニタリングの方面に体現され、操作方法及び該方法を実現する器具−試薬キットを含む。周知のように、肝炎の疾病経過は肝癌転換と密接に関連し、典型的な疾病経過は肝炎(例えばB型肝炎C型肝炎)→肝硬化→肝癌である。本発明者の研究は、肝炎ウイルスの発現も肝癌検出の生物マーカーとすることができ、それをYKL40及びMASP2の発現と結合して結合検出を行うことによって肝癌診断の成功率を顕著に向上させることができる。よって、本発明はさらに肝癌の診断、予後評価、治療効果モニタリングまたは疾病経過のモニタリング用方法を提供し、個体血液検体における肝炎の発現を検出するステップと、個体血液検体におけるYKL40及びMASP2の発現を検出するステップと、検出された肝炎ウイルス発現レベルとYKL40及びMASP2の発現レベルとに対して数学分析を行うステップと、数学分析の結果に基づき、測定された血液検体に対して分類を行い、肝癌の判断結果を下すステップと、を含み、このような結果は肝癌前期、肝癌中期、肝癌晩期などに分けることができる。

0042

そのうち、肝炎ウイルスの発現は本技術分野の標準方法、例えば標準の血液検体検査試験紙法、血液検体検査試薬キット法、及びルーチンの血液検体化学分析法などを採用してもよい。

0043

明らかに分かるように、血液検体における肝炎ウイルス発現、YKL40及びMASP2の発現を1つの試薬キットに整合して検出することによって、肝癌検出の便利性時効性及び経済性が実現される。よって、本発明はさらに肝癌の診断、予後評価、治療効果モニタリングまたは疾病経過のモニタリング用結合検出試薬キットを提供し、少なくとも(1)肝炎ウイルス、YKL−40及びMASP2を結合できる抗体と、(2)肝炎ウイルス及び/またはYKL−40及び/またはMASP2が(1)により限定された抗体に結合された時に、肝炎ウイルス及び/またはYKL−40及びMASP2に結合することができる標識抗体と、を含む。好ましくは、試薬キットはさらに、(3)既知量の肝炎ウイルス、YKL−40及びMASP2を含有する溶液によって構成され、遺伝子組換え微生物発現、動物またはヒトの体液から由来できる標準検体と、(4)報告方法とする酵素標識用試薬、例えばペルオキシダーゼ、または抗体と結合して抱合体を形成することができる蛍光標識のような測定用抗体標識と、を含む。

0044

以下は個体の血清を検体として肝癌診断を行うことを例として、本発明に対してさらに説明する。

0045

実施例1
検体の採取
浙江大学医学院第1付属病院ランダムに25例の50〜60の肝癌患者の血清1mLを採取して陽性対照とし、別に15例の50〜60歳の健康ボランティアの正常血液検体1mLを採取し、YKL−40及びMASP2の濃度測定を行う。

0046

YKL−40含有量の測定
メーカー指導に基づき、Quidel社(San Diego, CA,米国)のYKL−40試薬キットを使用し、且つBio−Rad 680型マイクロプレートリーダー(米国)で以下のステップを含むELISA操作を行う。

0047

1.冷蔵条件貯蔵した試薬キットを取り出し、放置し、温度を室温(20〜25℃)まで回復させ、検査待ちの検体総数品質基準数を計算する。各検体は1つの抗原被覆ウェルが必要で、毎回の実験は陽性対照、陰性対照及び校正品が必要であり、必要なマイクロウェル数量を確定する。プレートバーの温度が室温までに上げられたときに、プレートバーの保護袋を開け、抗原被覆のマイクロウェルプレートバーを取り出す。今回の実験に必要がない試薬バーをこの新たに密封できる袋に入れ、密封し、再び2〜8℃に保存する。
2.順に20μLの標準液対照液及び血清検体をマイクロウェルプレートに注入する。該プロセスは必ず30分以内に完了しなければならない。
3.各マイクロウェルに100μLの捕捉液を注入し、ピペットでウェルにおいて繰り返して吹き出して均一に混合させる。
4.マイクロウェルプレート用蓋カバーして、室温(18〜25℃)下で55〜65分間培養する。
5.以下のステップに従い、手動プレートを3回洗浄する。
A.激しく揺れ動かし、且つプレート内液体廃棄する。
B.ウェルに洗浄液をいっぱいに注ぎ、ウェルには残留気泡がないことを保証する。
C.前記2つのステップを2回繰り返す。
D.ウェルにおける洗浄液を揺れ動かし且つ除去し、全ての洗浄液を叩いて取り除くように、プレートを逆転してティッシュペーパーにおいて軽く叩く。マイクロウェルを観察し、残留の洗浄液がないことを確保する。
6.酵素標識抗体複合物のボトルに再生緩衝液7mLを加え、室温下で保存して使用待ちとする。
7.希釈された酵素複合物を同様な順でマイクロウェルプレートに100μLを加える。
8.マイクロウェルプレート用蓋でカバーして、室温(18〜28℃)下で55〜65分間培養する。
9.基質を調製し、基質緩衝液に1枚の基質固体を加え、30〜60分後溶解され、激しく揺れ動かし、溶液を完全に混合させる。
10.ステップ5におけるA〜Dの方法に従ってプレートを洗浄する。
11.同様な速度及び順で基質溶液100μLを各ウェルに注入する。
12.マイクロウェルプレートを室温(18〜28℃)下で55〜65分間培養させる。
13.同様な速度及び順で停止液100μLを各ウェルに注入する。検体の完全な混合を確保するように、停止液を注入した後マイクロウェルプレートを軽く叩く。
14.マイクロプレートリーダーの検出波長を405nmに設定し、各ウェルのOD値を検出する。停止液を加えた後の15分以内にデータを取る。
15.1つの直線検量線「Y=mx+b」によってYKL−40またはMASP2の結果を分析する。
16.検量線によって血清検体及び対照液におけるYKL−40またはMASP2の濃度を読み出す。

0048

結果
前記ステップによって得られた測定結果は表1に示す。

0049

表1から分かるように、YKL−40の濃度と肝癌症状とが密接な関係性を有する。すなわち、肝癌患者の血清におけるYKL−40蛋白の含有量が健康ボランティアの血清における含有量より顕著に高い。

0050

ROC曲線の作成
GB STATV10.0(Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, MD USA)システムを使用し、YKL−40蛋白の含有量を変数にし、異なる閾値に基づいて癌診断の感度及び特異性に対してROC曲線を作成し、且つ曲線下面積AUCを算出する。作成されたROC曲線及び算出された曲線下面積(AUC)は図1に示す。

0051

図1に示すように、ROC曲線のAUCは0.98である。YKL−40濃度の閾値が0.87(ng/mL)であった時に、肝癌診断の感度が0.92(すなわち92%)で、1−特異性が0.87(すなわち87%)で、肝癌診断の成功率が0.9(すなわち90%)である。

0052

実施例2
MASP2含有量の測定
実施例1と類似なステップを採用するが、異なるところは、メーカーの指導に基づき、オランダHycult生物技術公司(Uden,オランダ)のMASP2試薬キットを使用してELISA操作を行い、血清検体におけるMASP2蛋白の濃度を測定する。結果は表1に示す。

0053

表1から分かるように、MASP2の濃度と肝癌症状も密接な関係性を有する。すなわち、肝癌患者の血清におけるMASP2蛋白の含有量が健康ボランティアの血清における含有量より顕著に低い。

0054

ROC曲線の作成
GB STATV10.0システムを使用し、MASP2蛋白の含有量を変数にし、異なる閾値に基づいて癌診断の感度及び特異性に対してROC曲線を作成し、且つ曲線下面積(AUC)を算出する。図2に示す。

0055

図2に示すように、MASP2濃度の閾値が292.9(ng/mL)であった時に、肝癌診断の感度が0.87で、1−特異性が0.77で、実際の肝癌診断の成功率が0.8である。

0056

実施例3
YKL40及びMASP2を結合使用する。すなわち、GB STATV10.0システムを使用し、YKL40及びMASP2蛋白の含有量を変数にし、異なる閾値に基づいて癌診断の感度及び特異性に対してROC曲線を作成し、且つ曲線下面積AUCを算出する。図3に示す。

0057

図3に示すように、閾値が12.57(比の値)であった時に、診断の感度が100%で、実際の肝癌診断の成功率が90%である。今まで常用されているアルファ胎児性蛋白検出の成功率(ほぼ70%)より遥かに高い。

0058

また、図3図1及び図2との比較から分かるように、閾値が12.57であった時に、YKL40及びMASP2を結合検出したときの肝癌診断の感度がいずれか1種のマーカーを単独に使用した時より高く(結合使用時の感度が1で、YKL40またはMASP2の単独使用時の感度がそれぞれ0.92及び0.87である)、実際の肝癌診断の成功率が90%であった。

実施例

0059

以上は独立なYKL40またはMASP2試薬キットを使用してELISA操作を行い、肝癌診断を例として、YKL40及びMASP2を結合検出したときのROC曲線を作成することによって、本発明の技術案に対して説明を行ったが、本発明の開示に基づき、本発明の方法は無論その他の一部の疾病の診断、予後評価、治療効果モニタリングまたは疾病経過のモニタリングに普及させることもでき、これは本発明分野の当業者にとって明らかであるため、本発明の思想に逸脱してない限り、本発明分野の当業者がこの上で行う種々の変更及び改訂は、本発明の範囲に属すべきである。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

関連する公募課題一覧

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ