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図面 (2)

課題

煩雑な作業を必要とすることなく、インターフェロンリバビリンとの併用治療の効果を予測する方法、特に、インターフェロンとリバビリンとを実際に投与することなく併用治療の効果を予測する方法を提供することを目的とする。

解決手段

インターフェロンとリバビリンとをC型肝炎ウイルス保因者に投与する前に前記C型肝炎ウイルス保因者の細胞中生体物質発現レベルを測定する工程を含み、前記生体物質が、MX1、IFIT1、ISG15、IFI27からなる群より選択される少なくとも1つである、慢性C型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果の予測方法

概要

背景

慢性C型肝炎(以下、CHと記載することもある)は、フラビウイルス科へパシウイルス属に属するC型肝炎ウイルス(HCV)に感染することにより起こる疾患であり、現在世界人口の3%以上がこのウイルスに感染している。
C型肝炎ウイルスは、直径55〜57nmの球形をした、約9.5kbの線状1本鎖RNAをゲノムとして持ち、ウイルスの遺伝子とこれを包んでいるヌクレオカプシドコア粒子)、そして、これを被う外殻エンベロープ)の二重構造から成り立っている。
慢性C型肝炎はかつて非A非B型肝炎と呼ばれていた疾患の1つであり、1989年にChooらが患者血漿チンパンジー接種し、その血漿中からウイルス遺伝子クローニングすることで初めてC型肝炎ウイルスが同定された(非特許文献1)。

C型肝炎ウイルスには複数の遺伝子型があり、現在はタイプ1a、1b、2a、2b、3a、3b、4、5a、6aといった分類がされている。これらの遺伝子型のうち、日本においてはインターフェロンによる治療が効きにくいとされる1b型が70‐85%を占める。以降2a型が10‐15%、2b型が約5%で他の遺伝子型はまれである。

C型肝炎ウイルスは、初感染で劇症化する例はまれであるが、急性肝炎発症後、アラニンアミノトランスフェラーゼALT)値が高値に保たれたままウイルスも持続することにより慢性肝炎移行する例が多く、無症候性キャリアとなる場合もある。初感染者の約70%はキャリアとなり慢性化すると報告されている。また、慢性C型肝炎は自然治癒することはまれであり、患者の30‐50%が、感染後20‐30年の間に肝硬変を発症する。さらに、肝硬変患者の60‐80%が肝癌を発症する。

慢性C型肝炎の治療法としては以前よりインターフェロンが用いられてきたが、著効率は30%程度に過ぎなかった。しかしながら近年では、インターフェロンと抗ウイルス薬の1種であるリバビリンとの併用治療が行なわれている。

現在では、インターフェロンにポリエチレングリコールを結合して血中半減期を長くしたポリエチレングリコール化インターフェロンとリバビリンとの併用治療が標準的な治療方法となっている。しかしながら日本人が感染しているC型肝炎ウイルスにおいて、一番多い遺伝子型である1b型感染の高ウイルス量症例では、上記の併用治療でもなお、著効例の割合は約50‐60%程度であり、約半数の患者に対しては効果が認められない。
さらに、例えば、ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−2bとリバビリンとの併用治療の薬剤投与期間は48〜72週間にも及び、この間、発熱頭痛倦怠感食欲不振、体の痒み、脱毛血小板減少等の副作用頻度も多い。また薬価も高いため、インターフェロンとリバビリンとの併用治療は、患者の身体的、精神的、経済的負担が無視できない。

従って、インターフェロンとリバビリンとの併用治療が有効か否かを治療前に判定することができれば、併用治療が効かない患者に対して、副作用のある治療を避けることができ、また、そのような患者に対しては他の治療方法を施すことが可能になる。
慢性C型肝炎治療のためのインターフェロンとリバビリンとの併用治療の有効性判定方法として、遺伝子型1bのC型肝炎ウイルスに感染している患者から採取された検体中に含まれるC型肝炎ウイルスコア領域中のアミノ酸配列、第70番目アルギニンが他のアミノ酸に変異しているか否か及び第91番目のアミノ酸がメチオニンか否かを調べることが提案されている(特許文献1)。しかしながら、この方法では、ウイルス中の変異しているアミノ酸の同定まで行うことが必要であり、非常に煩雑である。またこの方法では治療後の再発例を予測する事が出来ない。

その他にも、C型肝炎ウイルスに感染している患者において、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を調べるために、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の前後に、ANXA3、PCNA、LMNB1、PAK1、4EBP1、KARS、PSME2、ENO1、STAT1、PHB、SP−100、およびPPP1CB等からなる特定生体物質発現レベルを測定し、発現レベルに差異が見出されることをインターフェロンとリバビリンとの併用治療の有効性を示す指標とする手法が開発されている(特許文献2)。しかしながらこの手法では、治療効果を予測するために、インターフェロンとリバビリンの投与前後で二度の発現レベルの測定が必要であり、作業が煩雑である。また、被験者に直接インターフェロンとリバビリンの投与を行う場合は、重大な副作用の恐れを排除できない。
さらに、以上に挙げた方法は、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の有効例を予測する方法であり、治療による経済的負担、副作用をさけるべく、無効例を積極的に予測する方法ではなかった。

概要

煩雑な作業を必要とすることなく、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を予測する方法、特に、インターフェロンとリバビリンとを実際に投与することなく併用治療の効果を予測する方法を提供することを目的とする。インターフェロンとリバビリンとをC型肝炎ウイルス保因者に投与する前に前記C型肝炎ウイルス保因者の細胞中生体物質の発現レベルを測定する工程を含み、前記生体物質が、MX1、IFIT1、ISG15、IFI27からなる群より選択される少なくとも1つである、慢性C型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果の予測方法。なし

目的

本発明は、煩雑な作業を必要とすることなく、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を予測する方法、特に、インターフェロンとリバビリンとを実際に投与することなく併用治療の効果を予測する方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

インターフェロンリバビリンとをC型肝炎ウイルス保因者投与する前に前記C型肝炎ウイルス保因者の細胞中生体物質発現レベルを測定する工程を含み、前記生体物質が、MX1、IFIT1、ISG15、IFI27からなる群より選択される少なくとも1つである、慢性C型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果の予測方法

請求項2

インターフェロンとリバビリンとをC型肝炎ウイルス保因者に投与する前に前記C型肝炎ウイルス保因者の細胞中の生体物質の発現レベルを測定する工程を含み、前記生体物質が、PSMB10、TRAF2、RXRA、OASI、IKKG/NEMO、MyD88、IFITM3、IL10RB、RNF125、BCL3、NFKB2からなる群より選択される少なくとも1つである、慢性C型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療後再発の予測方法。

請求項3

前記細胞肝臓細胞である、請求項1又は2のいずれかに記載の予測方法。

請求項4

前記インターフェロンがポリエチレングリコール化インターフェロンである、請求項1から3のいずれかに記載の予測方法。

請求項5

列番号14、配列番号21、配列番号37、配列番号59、配列番号74、配列番号100、配列番号101、配列番号107、配列番号115、配列番号120、配列番号135、配列番号150、配列番号184、配列番号193または配列番号234に示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つを含んでなる、慢性C型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果又はインターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発を予測するためのキット

技術分野

0001

本発明は、C型肝炎ウイルスに起因する慢性C型肝炎に対する、インターフェロン及びリバビリンによる併用治療の効果の予測方法併用治療後再発の予測方法、およびその為のキットに関する。

背景技術

0002

慢性C型肝炎(以下、CHと記載することもある)は、フラビウイルス科へパシウイルス属に属するC型肝炎ウイルス(HCV)に感染することにより起こる疾患であり、現在世界人口の3%以上がこのウイルスに感染している。
C型肝炎ウイルスは、直径55〜57nmの球形をした、約9.5kbの線状1本鎖RNAをゲノムとして持ち、ウイルスの遺伝子とこれを包んでいるヌクレオカプシドコア粒子)、そして、これを被う外殻エンベロープ)の二重構造から成り立っている。
慢性C型肝炎はかつて非A非B型肝炎と呼ばれていた疾患の1つであり、1989年にChooらが患者血漿チンパンジー接種し、その血漿中からウイルス遺伝子クローニングすることで初めてC型肝炎ウイルスが同定された(非特許文献1)。

0003

C型肝炎ウイルスには複数の遺伝子型があり、現在はタイプ1a、1b、2a、2b、3a、3b、4、5a、6aといった分類がされている。これらの遺伝子型のうち、日本においてはインターフェロンによる治療が効きにくいとされる1b型が70‐85%を占める。以降2a型が10‐15%、2b型が約5%で他の遺伝子型はまれである。

0004

C型肝炎ウイルスは、初感染で劇症化する例はまれであるが、急性肝炎発症後、アラニンアミノトランスフェラーゼALT)値が高値に保たれたままウイルスも持続することにより慢性肝炎移行する例が多く、無症候性キャリアとなる場合もある。初感染者の約70%はキャリアとなり慢性化すると報告されている。また、慢性C型肝炎は自然治癒することはまれであり、患者の30‐50%が、感染後20‐30年の間に肝硬変を発症する。さらに、肝硬変患者の60‐80%が肝癌を発症する。

0005

慢性C型肝炎の治療法としては以前よりインターフェロンが用いられてきたが、著効率は30%程度に過ぎなかった。しかしながら近年では、インターフェロンと抗ウイルス薬の1種であるリバビリンとの併用治療が行なわれている。

0006

現在では、インターフェロンにポリエチレングリコールを結合して血中半減期を長くしたポリエチレングリコール化インターフェロンとリバビリンとの併用治療が標準的な治療方法となっている。しかしながら日本人が感染しているC型肝炎ウイルスにおいて、一番多い遺伝子型である1b型感染の高ウイルス量症例では、上記の併用治療でもなお、著効例の割合は約50‐60%程度であり、約半数の患者に対しては効果が認められない。
さらに、例えば、ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ−2bとリバビリンとの併用治療の薬剤投与期間は48〜72週間にも及び、この間、発熱頭痛倦怠感食欲不振、体の痒み、脱毛血小板減少等の副作用頻度も多い。また薬価も高いため、インターフェロンとリバビリンとの併用治療は、患者の身体的、精神的、経済的負担が無視できない。

0007

従って、インターフェロンとリバビリンとの併用治療が有効か否かを治療前に判定することができれば、併用治療が効かない患者に対して、副作用のある治療を避けることができ、また、そのような患者に対しては他の治療方法を施すことが可能になる。
慢性C型肝炎治療のためのインターフェロンとリバビリンとの併用治療の有効性判定方法として、遺伝子型1bのC型肝炎ウイルスに感染している患者から採取された検体中に含まれるC型肝炎ウイルスコア領域中のアミノ酸配列、第70番目アルギニンが他のアミノ酸に変異しているか否か及び第91番目のアミノ酸がメチオニンか否かを調べることが提案されている(特許文献1)。しかしながら、この方法では、ウイルス中の変異しているアミノ酸の同定まで行うことが必要であり、非常に煩雑である。またこの方法では治療後の再発例を予測する事が出来ない。

0008

その他にも、C型肝炎ウイルスに感染している患者において、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を調べるために、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の前後に、ANXA3、PCNA、LMNB1、PAK1、4EBP1、KARS、PSME2、ENO1、STAT1、PHB、SP−100、およびPPP1CB等からなる特定生体物質発現レベルを測定し、発現レベルに差異が見出されることをインターフェロンとリバビリンとの併用治療の有効性を示す指標とする手法が開発されている(特許文献2)。しかしながらこの手法では、治療効果を予測するために、インターフェロンとリバビリンの投与前後で二度の発現レベルの測定が必要であり、作業が煩雑である。また、被験者に直接インターフェロンとリバビリンの投与を行う場合は、重大な副作用の恐れを排除できない。
さらに、以上に挙げた方法は、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の有効例を予測する方法であり、治療による経済的負担、副作用をさけるべく、無効例を積極的に予測する方法ではなかった。

0009

特開2007−43985号公報
特開2009−178057号公報

先行技術

0010

Choo QL、et al., Science. 244、359−362(1989)

発明が解決しようとする課題

0011

以上のように、煩雑な作業を必要とすることなく、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を予測する方法については、いまだ報告がなかった。

0012

そこで、本発明は、煩雑な作業を必要とすることなく、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を予測する方法、特に、インターフェロンとリバビリンとを実際に投与することなく併用治療の効果を予測する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、インターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発の有無を予測する方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0013

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、いくつかの自然免疫関連遺伝子の発現量を測定することで、治療有効例、再発例、治療無効例を高確率にて判別する方法を開発した。
すなわち、本発明は、インターフェロンとリバビリンとをC型肝炎ウイルス保因者に投与する前に前記C型肝炎ウイルス保因者の細胞中生体物質の発現レベルを測定する工程を含み、前記生体物質が、MX1、IFIT1、ISG15、IFI27からなる群より選択される少なくとも1つである、慢性C型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果の予測方法である。

0014

また、本発明は、インターフェロンとリバビリンとをC型肝炎ウイルス保因者に投与する前に前記C型肝炎ウイルス保因者の細胞中の生体物質の発現レベルを測定する工程を含み、前記生体物質が、PSMB10、TRAF2、RXRA、OASI、IKKG/NEMO、MyD88、IFITM3、IL10RB、RNF125、BCL3、NFKB2からなる群より選択される少なくとも1つである、慢性C型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発の予測方法である。
また、本発明は、配列番号14、配列番号21、配列番号37、配列番号59、配列番号74、配列番号100、配列番号101、配列番号107、配列番号115、配列番号120、配列番号135、配列番号150、配列番号184、配列番号193または配列番号234に示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つを含んでなる、慢性C型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果又はインターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発を予測するためのキットである。

発明の効果

0015

本発明の予測方法により、これまで、実際にインターフェロンとリバビリンとを投与してみなければわからなかった併用治療の効果が、投与前の遺伝子発現情報のみを用いて効率よく判定可能となる。また、併用治療後の再発の有無が、投与前の遺伝子発現情報のみを用いて効率よく判定可能となる。このため、煩雑な作業を必要とすることなく、併用治療の効果、併用治療後の再発を予測することができる。
本発明の予測方法により、副作用を回避できる見通しのよい肝炎治療を行うことができる。治療無効例、再発例についても高確率で予測できるため、患者個人遺伝子情報に応じた治療方法の選択が可能である。例えば治療無効であることが予想される症例であれば副作用の発現を我慢して投与するといったことを避けることができ、再発が予想される症例では、治療期間を延長するといった判断が可能となる。
さらに、併用治療開始前に治療の効果有無が予想できるため、インターフェロン等の高価な医薬を投与して患者や社会経済的な負担をかけることを避けることもでき、保険医療の向上や医療費削減に有用である。

図面の簡単な説明

0016

図1は、実験全体の概略を示す図である。
図2上は、インターフェロンとリバビリンの併用治療効果の予測と実際の診断結果の対応を示す図である。図2下は、併用治療効果のあった症例のうち、再発有無の予測と実際の再発症例の対応を示す図である。

0017

C型肝炎ウイルス保因者
本発明で、C型肝炎ウイルス保因者というときは、遺伝子型で、タイプ1a、1b、2a、2b、3a、3b、4、5a、または6aのいずれかのウイルスに感染している対象を示し、遺伝子型を特に限定するものではない。

0018

インターフェロンとリバビリンとの併用治療
インターフェロンとリバビリンの併用治療とは、インターフェロンと共にリバビリンを投与する慢性C型肝炎の治療方法である。併用治療に用いるインターフェロンの型は特に限定されず、慢性C型肝炎の治療に用いられるいずれのインターフェロンであってもかまわない。通常、インターフェロンα、特にインターフェロンα2aとインターフェロンα2bが用いられるが、これらに限定されるものではない。また、インターフェロンの血中半減期を長くするために、ポリエチレングリコールを結合させたインターフェロン(ポリエチレングリコール化インターフェロン)を用いることが望ましい。

0019

なお上記の併用治療について、2009年における慢性C型肝炎の治療ガイドラインでは、遺伝子型1bのC型肝炎ウイルスにおいては、血清中のC型肝炎ウイルスのRNA濃度が5.0LogIU/mL、もしくは300fmol/L以上の高ウイルス量の場合、ポリエチレングリコール化インターフェロンα2aとリバビリン、もしくはポリエチレングリコール化インターフェロンα2bとリバビリンとの併用治療を48週間〜72週間実施することとされている。血清中のC型肝炎ウイルスのRNA濃度が5.0LogIU/mL、もしくは300fmol/L未満の低ウイルス量の場合は、ポリエチレングリコール化インターフェロンα2aを24週間から48週間投与することとされている。なお、本発明の方法により効果や再発の有無を予測できる併用治療は、必ずしもこのガイドラインに従った併用治療に限定されるものではなく、他のインターフェロンとリバビリンとの併用治療であってもよい。

0020

治療の効果
実際の治療効果は、インターフェロンとリバビリンとの併用治療後、血液中のC型肝炎ウイルスのRNA量が検出感度以下になったか否かで判断できる。C型肝炎ウイルスは、ウイルスに由来するRNAに対してPCRリアルタイムPCR、bDNA法等を実施することにより検出、定量することができる。検出感度、測定範囲の広さはともにリアルタイムPCRが最も優れているが、治療効果を判断する基準としてのウイルス量の評価方法は特に限定されるものではない。
なお、ここで言う「治療の効果がある」とは、将来、再発する例も含めるものであり、一過的にせよ、インターフェロンとリバビリンとの併用治療後、血液中のC型肝炎ウイルスのRNA量が検出感度以下になるものを言う。

0021

従って、本発明における併用治療の効果の予測方法は、併用治療中、併用治療後の全体を通じて、一過的にせよC型肝炎ウイルスのRNA量が検出感度以下になる者であるか、または、全体を通じてC型肝炎ウイルスのRNAが検出され続ける者であるかを予測する方法である。

0022

再発
再発とは、インターフェロンとリバビリンの併用治療により、ウイルスのRNA量が検出感度以下になるが、併用治療終了後に、ウイルスのRNAが再度検出されることを言う。

0023

従って、本発明における再発の予測方法とは、併用治療によりウイルスのRNA量が検出感度以下になる者のうち、併用治療終了後にウイルスのRNAが再度検出される者であるか、再度検出されない者であるかを予測する方法である。

0024

細胞
C型肝炎ウイルス保因者から採取されたものであれば由来する組織はどのようなものであってもかまわない。例えば末梢血由来の細胞や、肝臓由来の細胞(肝臓細胞)が好ましいが、これらのうち感度が良好な肝臓由来の細胞が特に好ましい。

0025

生体物質
生体物質とは生物体内に存在する化学物質であり、 ここでは生体を構成する基本材料である生体高分子や、それらを元に人工的に合成された生体高分子を指す。複数の生体物質を測定するに際しては、検出方法経済性簡便性から、生体物質としてはmRNAやそれを基に合成、増幅される核酸の量を測定することが好ましいが、種類が少ない場合はタンパク質測定対象とすることも可能である。

0026

発現レベルを測定する
特定のmRNAの発現レベルを測定するに際しては、PCR、Real−Time PCR、ノーザンブロット法DNAマイクロアレイ等、特定のタンパク質の発現レベルを測定するに際しては、ウェスタンブロット法ELISA法抗体アレイ等、検出対象となる生体物質に対する特異性のある方法であれば、当業者に公知のさまざまな手法を用いることが可能である。
これら生体物質の発現レベルの測定は、直接測定する以外に、酵素処理によって逆転写や増幅等の改変を行ったものを測定してもよい。
生体物質の発現レベルは、当該生体物質の量と相関のあるシグナルを検出、数値化することで比較可能となる。シグナルはとしては、蛍光物質放射性物質酵素等その他当業者に公知のいずれのものでも使用することが可能である。

0027

MX1
MX1とは、GeneBankのアクセッション番号NM_002462に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号100に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0028

IFIT1
IFIT1とは、GeneBankのアクセッション番号NM_001548に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号135に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0029

ISG15
ISG15とは、GeneBankのアクセッション番号NM_005101に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号107に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0030

IFI27
IFI27とは、GeneBankのアクセッション番号NM_005532に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号120に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0031

PSMB10
PSMB10とは、GeneBankのアクセッション番号NM_002801に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号150に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0032

TRAF2
TRAF2とは、GeneBankのアクセッション番号NM_021138に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号21に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0033

RXRA
RXRAとは、GeneBankのアクセッション番号NM_002957に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号234に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0034

OASI
OASIとは、GeneBankのアクセッション番号NM_016816に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号101に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0035

IKKG/NEMO
IKKG/NEMOとは、GeneBankのアクセッション番号NM_001099857に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号59に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0036

MyD88
MyD88とは、GeneBankのアクセッション番号NM_002468に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号14に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0037

IFITM3
IFITM3とは、GeneBankのアクセッション番号NM_021034に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号115に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0038

IL10RB
IL10RBとは、GeneBankのアクセッション番号NM_000628に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号37に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0039

RNF125
RNF125とは、GeneBankのアクセッション番号NM_017831に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号193に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0040

BCL3
BCL3とは、GeneBankのアクセッション番号NM_005178に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号74に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0041

NFKB2
NFKB2とは、GeneBankのアクセッション番号NM_002502に示されるmRNA配列の一部とその相補配列、及びそれがコードするアミノ酸配列の一部を含むどのようなものであってもかまわないが、具体的には配列番号184に記載の核酸配列もしくはその相補配列の全部もしくは一部を含む配列であることが望ましい。

0042

予測方法
上記の生体物質の発現レベルを測定した後、それぞれの生体物質の発現レベルが、あらかじめ蓄積されている各群の代表値と比較し、そのうちの何れに近いかなどを検討することで、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果の予測や、治療後の再発可能性を評価することができる。この場合、発現レベルを各群ごとに比較できる手法であればどのような統計的手法を用いてもかまわない。生体物質の発現レベルが各群の代表値の何れに含まれるかを調べるために、当業者に公知の何れのクラスタリング手法を用いることも可能である。

0043

キット
上記の予測を簡易に実施するために、検出方法がより簡易な、以下のようなキットを作成することも可能である。
すなわち、C型肝炎ウイルス保因者における、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を予測する為のキットとして、MX1、IFIT1、ISG15、IFI27にそれぞれ由来する塩基配列に含まれる連続する少なくとも10ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも10ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ、好ましくは2つ以上を含んでなる、インターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を検出する為のキットが提供される。
これらは、代表的には、配列表の配列番号100、135、107、120に示す塩基配列に含まれる連続する少なくとも10ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも10ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つを含んでなる、C型肝炎ウイルス保因者におけるインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を検出する為のキットである。

0044

また、C型肝炎ウイルス保因者における、インターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発を予測する為のキットとして、PSMB10、TRAF2、RXRA、OASI、IKKG/NEMO、MyD88、IFITM3、IL10RB、RNF125、BCL3、NFKB2にそれぞれ由来する塩基配列に含まれる連続する少なくとも10ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも10ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つ、好ましくは2つ以上を含んでなる、インターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発を予測するためのキットが提供される。
これらは、代表的には、配列表の配列番号150、21、234、101、59、14、115、37、193、74、184に示す塩基配列に含まれる連続する少なくとも10ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも10ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの少なくとも1つを含んでなる、C型肝炎ウイルス保因者におけるインターフェロンとリバビリンとのの併用治療後の再発を予測する為のキットである。
このようなキットに含まれるオリゴヌクレオチドをプローブとして、例えば、ノーザンブロッティング手法を用い、細胞におけるmRNAの解析を行うことで、細胞中に含まれる対象のRNA量を簡便に調べることが可能である。
さらに、これらのオリゴヌクレオチドを複数固体支持体上に固定化したDNAマイクロアレイを作成することによって、効率的に検出を行うことも可能である。このようなDNAマイクロアレイには、上記のヌクレオチド以外にも、例えば後述の表1〜7に示すような自然免疫等に関連した複数種類の遺伝子やその他コントロールとなる遺伝子が搭載されていることが望ましい。

0045

サンプルの準備
自己免疫性肝炎アルコール性肝障害B型肝炎ウイルス関連抗原/抗体もしくは抗HIV抗体が検出される患者の何れにもあてはまらないことが確認された患者の中から、C型肝炎ウイルス遺伝子型1bに感染し、過去にインターフェロンによる治療や免疫調節療法を受けたことの無い慢性C型肝炎患者87人と、C型肝炎ウイルスに感染していない脂肪肝患者10人とを対象とした。
インターフェロンとリバビリンとの併用治療の前に血清中のC型肝炎ウイルスRNAをAmplicor−HCVMonitor Assay(ロシュ社製)を使用して定量した。また、アスパレートアミノトランスフェラーゼAST)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、全ビリルビンアルカリフォスファターゼ(ALP)、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼγ‐GTP)、白血球細胞血小板ヘモグロビンアルブミン量を測定した。
慢性C型肝炎患者から採取された肝生検標本組織学的な病期診断はMetavire classification systemに従って行った。

0046

インターフェロンとリバビリンとの併用治療のプロトコール
慢性C型肝炎の全ての患者に対し、ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ2b(Schering−Plough社製)及びリバビリン(Schering−Plough社製)の併用治療を48週間行った。ポリエチレングリコール化インターフェロンアルファ2bについては薬剤投与開始時点において体重1キログラム当たり、一週間に1.5μg投与し、リバビリンについては製造者が開示する推奨量に従って投与した。

0047

薬剤応答の定義
まず、薬剤投与後4週の時点で血清中にC型肝炎ウイルスRNAが検出されなかった患者をRapid Virological Responder(RVR)、それ以外をnonRVRとして2群に分類した。
次に薬剤投与後12週の時点で血清中にC型肝炎ウイルスRNAが検出されなかった患者をComplete Early Virological Responder(cEVR)、薬剤投与後12週の時点で血清中のC型肝炎ウイルスRNAが検出はされるが、その量が薬剤投与前に比較して2桁以上減少した患者をPartial EVR(pEVR)、それ以外の患者をnonEVRとして3群に分類した。

0048

併用治療終了後、6ヶ月にわたりC型肝炎ウイルスRNAが検出されなかった患者をSustained Virological Responder(SVR)、併用治療終了時にはC型肝炎ウイルスRNAが検出されなかったが、その後再び検出された患者をRelapse(R)、併用治療全体を通じてC型肝炎ウイルスが検出され続けた患者をNon−Virological Responder(NR)として3群に分類した。

0049

RNA抽出
肝臓由来の細胞(肝臓細胞)の一種である、肝生検標本由来の細胞からRNAを抽出することとした。肝生検標本はRNAを抽出するまでRNA Later(Ambion社製)に入れ、−80℃に保存した。Total RNAはmirVana(TM)miRNA Isolation kitを使用し、製造者が開示する説明書に従って抽出した。

0050

DNAマイクロアレイによる発現量データの取得
三菱レイヨン社製DNAチップジェノパールを用い、表1〜7に記載の自然免疫関連遺伝子237種類(Chip1に200種、Chip2に37種)のオリゴDNAプローブを搭載したDNAマイクロアレイを作製した。

0051

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0058

肝生検標本から得られたTotal RNAは、MessageAmp−Biotin Enhanced Kit(Ambion)を用い、製造者が開示する説明書に従ってビオチン標識及び増幅反応を行った。得られたビオチン標識済みRNA5μgを、キットに付属のFragmentation Bufferを用いて94℃にて7分30秒加熱し、断片化した。

0059

断片化したビオチン標識済みRNA溶液を、最終的な組成が0.12M Tris−HCl/0.12M NaCl/0.05% Tween20となるように各種試薬を添加し、150μlのハイブリダイゼーションサンプルとした。
DNAマイクロアレイとハイブリダイゼーションサンプルを65℃で16時間反応させ、その後洗浄液(0.12M Tris−HCl/0.12M NaCl/0.05% Tween20)により65℃にて20分間の洗浄を二回行った。更にDNAマイクロアレイを保存液(0.12M Tris−HCl/0.12M NaCl)により65℃にて10分間の液置換を行った。

0060

洗浄後のDNAマイクロアレイは、保存液により2μg/mlに溶解したStreptavidin−Cy5(GE Healthcare BioScience KK)中に室温で30分間浸漬し、その後洗浄液にて室温で5分間の洗浄を4回行い、さらに保存液にて5分間の液置換を行った。

0061

Cy5標識後のDNAマイクロアレイは、専用のDNAマイクロアレイ検出器を用い、0秒から40秒の複数の露光時間で蛍光を検出し、スポットそれぞれにおいて、当該スポット中に飽和画素を含まない画像のうち、最長の露光時間の画像を用いて蛍光シグナル強度を数値化した。

0062

統計解析の方法
薬剤応答の定義に従って分けられた群間における数値データの解析はスチューデントt検定を用いて統計解析を行った。SVR、R,NRの3グループ間における血清中の各成分等の比較については、Kruskal−Willis検定もしくはフィッシャーの直接確率検定を用いた。また、何れの検定においても、P値が0.05未満の場合において統計的に有意差があるものとみなした。

0063

結果
まず、SVR、R、NR及び脂肪肝患者の臨床的特徴について、平均値を示した(表8)。

0064

0065

以下の通り、慢性C型肝炎患者と脂肪肝患者間における特徴的な遺伝子発現パターンを調べた。また、慢性C型肝炎患者について、併用治療の効果を治療開始4週目、12週目及び治療終了後に確認し、それぞれの時点におけるC型肝炎ウイルスの反応の状態ごとに、特徴的な遺伝子発現パターンを調べた(図1)。
まず、慢性C型肝炎患者と脂肪肝患者のサンプル間において特徴的に異なる遺伝子発現パターンを調べたところ、53種類の遺伝子においてシグナル強度平均値に有意差が認められた(表9)。

0066

0067

慢性C型肝炎患者のうち、SVRとNRのサンプル間では14種類の遺伝子においてシグナル強度平均値に有意差が認められた(表10)。

0068

0069

慢性C型肝炎患者のうち、RVRとnonRVRのサンプル間では4種類の遺伝子に対応したプローブにおいてシグナル強度平均値に有意差が認められた(表11)。

0070

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慢性C型肝炎患者のうち、cEVRとnonEVRのサンプル間では14種類の遺伝子に対応したプローブにおいてシグナル強度平均値に有意差が認められた(表12)。

0072

0073

LOOCV(Leave−One−Out Cross Validation)(Alain Dupuy、et al., JNCI. 99、147−157(2007)を参照)を用いて併用治療による最終的な治療効果の評価を行った。まず、慢性C型肝炎の全患者から、NRを区別する方法について、二群間分別を用いた効果予測LOOCVを用いて確認したところ、MX1、IFIT1、ISG15、IFI27を用いて評価した場合、正確性、感度、特異性はそれぞれ82.8%、73.9%、85.9%で判別することが可能あった(表13上及び図2上)。以上より、これらの遺伝子を用いることで、高い精度でインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果を予測することが可能となった。
また、NRでなかったもののうち、SVRとRを区別する方法について、上記と同様に確認したところ、PSMB10、TRAF2、RXRA、OASI、IKKG/NEMO、MyD88、IFITM3、IL10RB、RNF125、BCL3、NFKB2を用いて評価した場合に、正確性、感度、特異性はそれぞれ68.8%、65.4%、71.1%で区別することが可能であった(表13下及び図2下)。以上より、これらの遺伝子を用いることで、高い精度でインターフェロンとリバビリンとの併用治療後の再発を予測することが可能となった。

実施例

0074

0075

慢性C型肝炎に対するインターフェロンとリバビリンとの併用治療の効果や併用治療後の再発を予測することができる。

0076

配列番号1〜237:合成DNA

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