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技術 生体関連物質保持薄片の製造方法

出願人 三菱ケミカル株式会社
発明者 清水浩司大槻宙平石丸輝太
出願日 2009年9月29日 (11年3ヶ月経過) 出願番号 2009-224060
公開日 2011年4月14日 (9年8ヶ月経過) 公開番号 2011-072201
状態 特許登録済
技術分野 加工の種類に特徴のある切断 非金属の切断装置1 突然変異または遺伝子工学 微生物・酵素関連装置
主要キーワード 薄片表面 配列治具 多孔板間 ゲル前駆体溶液 ハードメタル 各中空繊維 架橋性プレポリマー ABS樹脂
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重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2011年4月14日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (9)

課題

切断によるゲルくずれを抑制した生体関連物質保持薄片の製造方法を提供することを目的とする。

解決手段

ゲルを介して生体関連物質を保持した複数の繊維が各繊維軸が略同一となるように包埋された包埋物を、該包埋物の繊維軸に対して交差する方向に刃物で切断し、薄片を製造する方法であって、刃物の逃げ角を0°以上0.9°以下の範囲となるようにして切断することを特徴とする、生体関連物質保持薄片の製造方法。

概要

背景

近年、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするDNAマイクロアレイ法(DNAチップ法)と呼ばれる分析法が数多く開発され注目を集めている。これらの方法は、いずれも核酸間のハイブリダイゼーション反応に基づく核酸の検出・定量法である。
DNAマイクロアレイは多種類知られており、繊維を利用したDNAマイクロアレイもある。繊維を利用したDNAマイクロアレイの製造法としては、配列化した複数の中空繊維からなる繊維束エポキシ樹脂ポリプロピレンポリスチレンポリウレタン樹脂等で包埋した後、各中空繊維中空部に、DNAプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入し、重合反応を行い、各中空繊維の中空部にDNAプローブを保持する。その後、包埋物を繊維軸と交差する方向に切断することにより、DNA固定化薄片、すなわちDNAマイクロアレイが製造される(特許文献1、2)。切断する技術としては、使用する刃物刃先角度と、切断する速度を調整することで変形を抑え薄く均一に切断する方法(特許文献3)などが知られている。
しかし、特許文献3に開示されている方法では、逃げ角1〜2°を採用しており、刃物の先端部分のみ包埋物と接触し、刃物の下面は包埋物と接触しない状態で包埋物を切断している。そうすると、切断時に刃物が包埋物に食い込もうとする下方向への力と、それに反して、刃物の弾性などで上方向に戻ろうとする力によって、微小刃先振動が生じ、繊維内に保持されたゲルがくずれてしまう場合がある。

概要

切断によるゲルくずれを抑制した生体関連物質保持薄片の製造方法を提供することを目的とする。ゲルを介して生体関連物質を保持した複数の繊維が各繊維軸が略同一となるように包埋された包埋物を、該包埋物の繊維軸に対して交差する方向に刃物で切断し、薄片を製造する方法であって、刃物の逃げ角を0°以上0.9°以下の範囲となるようにして切断することを特徴とする、生体関連物質保持薄片の製造方法。

目的

本発明は、切断によるゲルくずれを抑制した生体関連物質保持薄片の製造方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

ゲルを介して生体関連物質を保持した複数の繊維が各繊維軸が略同一となるように包埋された包埋物を、該包埋物の繊維軸に対して交差する方向に刃物で切断し、薄片を製造する方法であって、刃物の逃げ角を0°以上0.9°以下の範囲となるようにして切断することを特徴とする、生体関連物質保持薄片の製造方法。

技術分野

0001

本発明は生体関連物質保持薄片の製造方法に関する。

背景技術

0002

近年、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするDNAマイクロアレイ法(DNAチップ法)と呼ばれる分析法が数多く開発され注目を集めている。これらの方法は、いずれも核酸間のハイブリダイゼーション反応に基づく核酸の検出・定量法である。
DNAマイクロアレイは多種類知られており、繊維を利用したDNAマイクロアレイもある。繊維を利用したDNAマイクロアレイの製造法としては、配列化した複数の中空繊維からなる繊維束エポキシ樹脂ポリプロピレンポリスチレンポリウレタン樹脂等で包埋した後、各中空繊維中空部に、DNAプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入し、重合反応を行い、各中空繊維の中空部にDNAプローブを保持する。その後、包埋物を繊維軸と交差する方向に切断することにより、DNA固定化薄片、すなわちDNAマイクロアレイが製造される(特許文献1、2)。切断する技術としては、使用する刃物刃先角度と、切断する速度を調整することで変形を抑え薄く均一に切断する方法(特許文献3)などが知られている。
しかし、特許文献3に開示されている方法では、逃げ角1〜2°を採用しており、刃物の先端部分のみ包埋物と接触し、刃物の下面は包埋物と接触しない状態で包埋物を切断している。そうすると、切断時に刃物が包埋物に食い込もうとする下方向への力と、それに反して、刃物の弾性などで上方向に戻ろうとする力によって、微小刃先振動が生じ、繊維内に保持されたゲルがくずれてしまう場合がある。

先行技術

0003

特開2000-270878号公報
特開2002-311028号公報
特開2002-86391号公報

発明が解決しようとする課題

0004

ゲルを介して繊維内にDNA等を保持させたDNAマイクロアレイの場合、くずれたゲルが、他の繊維内に保持されたゲル上に付着すると、正確な解析を行うことができなくなる。

0005

本発明は、切断によるゲルくずれを抑制した生体関連物質保持薄片の製造方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0006

本発明は、ゲルを介して生体関連物質を保持した複数の繊維が各繊維軸が略同一となるように包埋された包埋物を、該包埋物の繊維軸に対して交差する方向に刃物で切断し、薄片を製造する方法であって、刃物の逃げ角を0°以上0.9°以下の範囲となるようにして切断することを特徴とする、生体関連物質保持薄片の製造方法である。

発明の効果

0007

本発明により、切断によるゲルくずれを抑制した生体関連物質保持薄片を製造することができる。

図面の簡単な説明

0008

刃物で包埋物を切断する模式図
刃物を横から見た模式図
測定した位置関係を拡大した模式図
逃げ角0°で切断して得られた薄片の表面画像の一部
逃げ角0.5°で切断して得られた薄片の表面画像の一部
逃げ角0.9°で切断して得られた薄片の表面画像の一部
逃げ角1°で切断して得られた薄片の表面画像の一部
逃げ角-1°で切断して得られた薄片の表面画像の一部

0009

以下、本発明を好ましい実施態様を含めて説明する。
本発明の生体関連物質保持薄片は、以下の工程によって製造される。なお、工程(1)と工程(2)の順序は問わない。
(1)配列化した複数の繊維からなる繊維束をエポキシ樹脂、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン樹脂等で包埋する。
(2)各繊維(該繊維が中空繊維の場合は中空部、多孔質繊維の場合は多孔質部)内に、DNAプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入し、重合反応を行い、各繊維内にDNAプローブを保持する。
(3)包埋物を繊維軸と交差する方向に切断する。
本発明において、生体関連物質とは、DNA、RNA、ペプチド核酸等の核酸、蛋白質多糖類等のことである。
生体関連物質を保持する繊維に使用することができる繊維としては、合成繊維半合成繊維再生繊維天然繊維等が挙げられる。合成繊維の代表例としては、ナイロン6ナイロン66芳香族ポリアミド等の各種繊維、ポリエチレンテレフタレートポリブチレンテレフタレートポリ乳酸ポリグリコール酸ポリカーボネート等のポリエステル系の各種繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系の各種繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系の各種繊維、ポリビニルアルコール系の各種繊維、ポリ塩化ビニリデン系の各種繊維、ポリ塩化ビニル系繊維ポリウレタン系の各種繊維、フェノール系繊維ポリフッ化ビニリデンポリテトラフルオロエチレン等から成るフッ素系繊維ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系の各種繊維等が挙げられる。半合成繊維の例としては、ジアセテートトリアセテートキチンキトサン等を原料としたセルロース系の各種再生繊維(レーヨンキュプラポリノジック等)などが挙げられる。天然繊維の代表例としては、綿、亜麻等の植物繊維羊毛等の動物繊維石綿等の鉱物繊維等が挙げられる。
繊維の形態としては、多孔質繊維、中空繊維などの公知の繊維を使用することができる。繊維の直径は、1mm以下、数十ミクロン以上が好ましい。
ゲルを介して生体関連物質を保持するとは、例えば、繊維が中空繊維の場合は中空部、多孔質繊維の場合は多孔質部に、ゲルが化学的又は物理的な相互作用を利用して保持され、保持されているゲルに生体関連物質が化学的又は物理的な相互作用を利用して保持されている状態をいう。
本発明に用いることができるゲルは、特に制限されないが、例えば、アクリルアミド、N,N−ジメチルアクリルアミド、N−イソプロピルアクリルアミド、N−アクリロイルアミノエトキシエタノール、N−アクリロイルアミノプロパノールN−メチロールアクリルアミド、N−ビニルピロリドンヒドロキシエチルメタクリレート、(メタアクリル酸アリデキストリン等から選ばれた少なくとも一種類の単量体と、メチレンビス(メタ)アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ(メタ)アクリレート等の多官能性単量体を、水性媒体中で共重合したゲルを用いることができる。
次に複数の繊維が包埋された包埋物について説明する。
複数の繊維を各繊維軸が略同一となるように整然と配列するには、例えば、WO00/53736号記載の配列治具を用いて規則正しく配列させる。配列を構成する繊維の本数は、1cm2あたり10〜1,000,000本で配列させることが好ましい。
前記配列した繊維を固定するために、配列状態の繊維間に包埋剤を均一に注入して硬化させる。包埋剤の種類は、架橋性プレポリマーから成る包埋剤、重合オリゴマー触媒から成る包埋剤及び熱可塑性ポリマー等が挙げられる。
架橋性プレポリマーから成る包埋剤としては、ポリウレタン樹脂が挙げられる。ポリウレタン樹脂は、主剤である架橋性プレポリマーのポリイソシアネート硬化剤を加えて作ることが出来る。硬化剤の例としては、アルコール類ケトン類アミド類エステル類ヒマシ油系ポリオール等が挙げられる。これらの中でも沸点が60℃以上のものが特に好ましく、具体例としてはグリセロール、ポリエチレングリコール、メチルエチルケトンアセトアミド、N,N−ジメチルホルムアミド酢酸エチル等を挙げることができる。また、ポリウレタン樹脂以外に、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂等を利用することもできる。
重合性オリゴマーと触媒から成る包埋剤としては、(メタ)アクリル酸エステル〔A〕と〔A〕成分に可溶な(メタ)アクリル系重合体または共重合体〔B〕を含有するアクリル系シラップが例として挙げられる。
〔A〕成分の具体例としては、例えば、アクリル酸メチルアクリル酸エチルアクリル酸n−ブチル、アクリル酸t−ブチルアクリル酸2−エチルヘキシル等のアクリル酸エステル;メタクリル酸メチルメタクリル酸エチルメタクリル酸n−ブチルメタクリル酸i−ブチル、メタクリル酸t−ブチル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸2−エチルキシル、メタクリル酸トリデシルメタクリル酸ステアリルメタクリル酸シクロヘキシルメタクリル酸ベンジル、メタクリル酸2−ヒドロキシエチル、メタクリル酸2−ヒドロキシプロピル、メタクリル酸ジメチルアミノエチル、メタクリル酸ジエチルアミノエチルメタクリル酸グリシジル、メタクリル酸テトラヒドロフルフリルメタクリル酸アリル等のメタクリル酸エステルが挙げられ、これらは、1種または2種以上を混合して使用することができる。
〔A〕成分として上述のいずれかのモノマーを単独で(一種類だけで)硬化させて得られる樹脂ガラス転移温度(硬い状態から軟らかい状態に変わる温度)が低い場合には、柔らかくなる傾向にあり、ガラス転移温度が高いと得られる硬化物は硬くなる傾向にある。そこで、所望する包埋剤硬度発現させるには、この〔A〕成分のホモポリマーとしてのガラス転移温度をもとに、〔A〕成分を適宜選択して使用することが好ましい。
〔B〕成分として用いられる(メタ)アクリル系重合体は、〔A〕成分に可溶である必要がある。なお、本発明において「可溶」とは、分散状態も含む。〔B〕成分の具体例としては、例えば、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸n−ブチル、メタクリル酸i−ブチル、メタクリル酸t−ブチル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸2−エチルへキシル、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸n−ブチル、アクリル酸t−ブチル、アクリル酸2−エチルヘキシル等から選ばれる単量体の単独重合体もしくは共重合体が挙げられる。これらは、1種または2種以上を混合して使用することができる。〔A〕成分と〔B〕成分の使用割合は、〔A〕成分と〔B〕成分から成るアクリル系シラップを100質量部としたとき〔A〕成分は40〜80質量部の範囲、〔B〕成分は20〜60質量部の範囲であり、好ましくは、〔A〕成分は40〜70質量部の範囲、〔B〕成分は30〜60質量部の範囲である。
また、薄片化を行う上で、〔A〕成分と〔B〕成分から成るアクリル系シラップに、ウレタンオリゴマーウレタンポリマー又はその他のゴム成分を適宜添加することが好ましい。アクリル系シラップの重合開始剤としては、使用する溶剤に溶解可能なアゾ系、過酸化物系、レドックス系等の開始剤を使用することができる。例として、2,2′−アゾビスイソブチロニトリル、2,2′−アゾビス(2−メチルブチロニトリルイソブチロニトリル過酸化ベンゾイル、又は過酸化ベンゾイル−ジメチルアニリン系等が挙げられる。
熱可塑性ポリマーである包埋剤としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ABS樹脂メタクリル樹脂ポリ塩化ビニルポリアミド、ポリカーボネート、ポリアセタール、PBT樹脂、ポリフェニレンサルファイドポリアリレートポリサルホンポリエーテルサルホンポリエーテルエーテルケトンポリメチルペンテンポリエーテルイミド等が挙げられる。
前記包埋剤により包埋した包埋物は、生体関連物質マイクロアレイとして利用する場合、生体関連物質の検出において低蛍光強度が要求されることがある。そのような場合には、前記包埋剤にカーボンブラック消光剤等を添加することが好ましい。また、使用する繊維の種類に応じて、繊維と包埋剤との密着性を考慮し包埋剤を選択することが好ましい。例えば、ポリメタクリル酸メチル中空繊維には、アクリレート系シラップから成る包埋剤が好ましい。
本発明の包埋剤の硬化温度は、繊維材料のガラス転移温度以下であることが好ましい。100℃以下であることがさらに好ましい。このように複数の繊維が包埋された包埋物を、硬度が70〜95(JIS K 7215により測定)で、繊維を交差する方向で薄片化することにより、薄片の表面が平滑で、且つ繊維の脱落のない生体関連物質が保持された繊維配列体薄片を得ることができる。本発明において、包埋剤の硬度とは、JIS K 7215により測定されるものであり、加圧面が包埋物に密着してから5秒後に測定した硬度をいう。包埋物の硬度が、70未満及び95より大きければ、表面が粗面化したり、繊維が脱落したりするので好ましくない。
次に繊維を配列させた包埋物の薄片化について説明する。
薄片化する際は、包埋物を、該包埋物の繊維軸に対して交差する方向、通常は直交する方向で切断すればよい。切断に用いる刃物の刃先角度は20°以下であることが好ましく、15°以下であることがさらに好ましい。刃物の材質としては、例えば、カーボン鋼、SUS、超硬合金等が例示できる。また、装置としては市販のミクロトームを使用して薄片化を実施することも可能である。
薄片の厚さは、任意に調整することが可能であるが、通常1〜5000μm、好ましくは10〜2000μmである。このように作成された薄片は、多数の遺伝子の発現状態ゲノムの変異を一括して検出できる生体関連物質マイクロアレイとして使用できる。

0010

図1は、刃物で包埋物を切断する模式図を表している。薄片3は、繊維1を包埋した包埋物2を、包埋物2の繊維軸に対して交差する方向4に刃物5を用いて切断することで製造される。本明細書で記載した刃物の刃先角度は、図1中の6に該当する。刃物の逃げ角は、切断面と刃物下面とのなす角度、すなわち、図1中の7に該当する。包埋物の切断は、包埋物2を刃物5に向かって移動させ切断しても、刃物5を包埋物2に向かって移動させ切断してもよい。

0011

逃げ角7は、0°以上0.9°以下が好ましく、0°以上0.5°以下がより好ましい。さらに、0°であることが最も好ましい。逃げ角をマイナスの角度とした場合、切断時に刃物下面が常に切断面を押さえつけながら切断されるため、切断面の表面が刃物によって傷つけられ、ゲルのくずれが多くなってしまう。一方、逃げ角を1°以上にすると、刃物の先端部分のみブロックと接触し、刃物の下面はブロックと接触しない状態で切断される。そうすると、切断時に刃物がブロックに食い込もうとする下方向への力と、それに反して、刃物の弾性などで上方向に戻ろうとする力によって、微小な刃先の振動が生じて繊維内に保持されたゲルがくずれやすい。また、さらに大きい角度にすると、切断時に刃物が割れてしまうこともある。

0012

切断装置に取り付けた後の逃げ角7を測定する方法を説明する。図2Aは、刃物を横から見た模式図を表している。例えば、刃物下面から、非接触型レーザー変位計8によって刃物の1箇所の高さを測定する。図2Aで、例えば、測定位置Aとする。次に、測定位置Aから刃物のみね側に向かって水平に任意の距離9移動させた位置の刃物の高さを変位計8で測定する。これを測定位置Bとする。

0013

図2Bは、測定した位置関係を拡大した模式図を表している。三角形頂点A、頂点Bは、それぞれ図2Aの測定位置A、測定位置Bに該当する。頂点Cは、頂点Aから任意の距離9移動した点を表す。高さ距離10は、変位計によって測定した頂点Aと頂点Bの高さの差で求めることができる。これらより、逃げ角7は、

0014

によって算出することが可能である。

0015

刃物で切断して発生した、薄片上のくずれたゲルの量を測定する方法としては、顕微鏡落射照明で観察し、くずれたゲルを数えたりすることが可能である。ゲルが透明で認識できない場合は、例えば、ゲル表面に砥粒を付着させることで観察することができる。

0016

以下、本発明の実施例について説明する。
ゲル前駆体溶液の作製
N,N−ジメチルアクリルアミド(3.42部)、N,N’−メチレンビスアクリルアミド(0.38部)、グリセリン(47.5部)および2,2’−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジンジヒドロクロライド(0.1部)を、水(48.6部)に溶解してゲル前駆体溶液を調製した。
DNA固定化中空繊維の包埋物の作製
板の中央部に直径0.32mmの孔が0.42mm間隔で、格子状に19×12、228個配列された、厚さ0.1mmの多孔板2枚を用い、その多孔板の全ての孔に、カーボンブラックで着色したポリカーボネート製中空繊維(三菱レイヨン株式会社製、外径0.28mm、内径0.18mm、長さ500mm)を通過させ、この2枚の繊維を通過させた多孔板を50mm離間させ、離間した多孔板間に、カーボンブラックで着色したポリウレタン樹脂(日本ポリウレタン工業株式会社製、ニッポラン4276及びコロネート4403)を充填し、長さ50mm、7×12mm角角柱状の両端に樹脂で固定化されない部分を有する包埋物を得た。

0017

得られた包埋物の中空繊維の中空部にゲル前駆体溶液とそれぞれ異なる種類の40ベース核酸プローブとを気泡を巻き込ませながら充填し、ゲル前駆体溶液を重合させ、DNA固定化中空繊維の包埋物を作製した。
薄片表面上に付着した、くずれたゲルの測定方法
刃物で切断して得られた薄片を、砥粒を混合した水の中に浸漬させ、ゲルの表面に砥粒を付着させた。その後、薄片を、きれいな水の中ですすぎ、ゲル表面以外に乗った砥粒を洗いながした後、スライドガラスにのせ、ゲルが乾燥しないように水とカバーガラスをのせ、オリンパス製顕微鏡SZX12のステージ上に静置した。ズームを20倍にし、顕微鏡のピント位置を薄片の表面に合わせ、ニコンCCDカメラCS5270Bで撮像した。撮像した薄片の表面画像を、画像処理ソフトImage-Proを用いて、中空糸エリア外に付着した、くずれたゲルの領域を抽出し、その総画素数をくずれたゲルの総量とした。

0018

刃先角度20°の刃物(住友電工ハードメタル社製超硬薄刃材種AF1、両刃タイプ)を、逃げ角を0°にして、繊維軸に対して直交する方向で、DNA固定化中空繊維の包埋物を200mm/minの切断速度で、0.25mmの厚さに切断した。その後、薄片上のくずれたゲルを、上記くずれたゲルの測定方法に従い、くずれたゲルの総量を測定した。
図3は、観察した薄片の表面画像の一部である。くずれたゲル8の領域の個数は3個あり、その総量は41画素であった。

0019

逃げ角0.5°とし、その他の条件は、実施例1と同様とした。図4は、観察した薄片の表面画像の一部である。くずれたゲル8の領域の個数は19個あり、その総量は453画素であった。

0020

逃げ角を0.9°とし、その他の条件は、実施例1と同様とした。図5は、観察した薄片の表面画像の一部である。くずれたゲル8の領域の個数は31個あり、その総量は608画素であった。
<比較例1>

0021

逃げ角1°とし、その他の条件は、実施例1と同様とした。図6は、観察した薄片の表面画像の一部である。くずれたゲル8の領域の個数は33個あり、その総量は831画素であった。
<比較例2>

0022

逃げ角−1°とし、その他の条件は、実施例1と同様とした。図7は、観察した薄片の表面画像の一部である。くずれたゲル8の領域の個数は49個あり、その総量は1181画素であった。

実施例

0023

0024

1:繊維
2:包埋物
3:薄片
4:包埋物の繊維軸に対して交差する方向
5:刃物
6:刃先角度
7:逃げ角
8:変位計
9:測定点の距離
10:高さ距離
11:くずれたゲル

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