図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2011年3月3日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (8)

課題

容易に合成できるペプチドを有効成分として含有し、副作用のない血管内皮細胞遊走阻害剤を提供することを目的とする。

解決手段

血管内皮細胞の遊走阻害剤は、アミノ酸配列がArg−Ala−Asp−His−Pro−Phe、Tyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leu、Tyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr、及び、Glu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leuから選択される1以上のペプチドを有効成分として含有する。

概要

背景

癌等の種々の病気においては、血管新生病状の悪化、進行に関与している。このため、このような病気の進行を抑えるために、患者血管新生抑制薬剤投与することが有効であると考えられている。

例えば、血管新生が関与して進行していく病気として子宮内膜症がある。この子宮内膜症の患者に血管新生抑制剤を投与すると、血管新生を抑制し病状の悪化の抑制効果、或いは、改善効果があるものの、性周期排卵に対して副作用が生じることが判明している。

一方で、血管新生抑制タンパク質ペプチドは、これらの副作用を起こさないことが動物実験で確認されており、タンパク質・ペプチドによる子宮内膜症治療は最も安全で有効な方法であると考えられている(例えば、非特許文献1)。

概要

容易に合成できるペプチドを有効成分として含有し、副作用のない血管内皮細胞遊走阻害剤を提供することを目的とする。血管内皮細胞の遊走阻害剤は、アミノ酸配列がArg−Ala−Asp−His−Pro−Phe、Tyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leu、Tyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr、及び、Glu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leuから選択される1以上のペプチドを有効成分として含有する。

目的

本発明は、上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、容易に合成できるペプチドを有効成分として含有し、血管新生を抑制し得る、副作用のない血管内皮細胞の遊走阻害剤を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

アミノ酸配列がArg−Ala−Asp−His−Pro−Phe、Tyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leu、Tyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr、及び、Glu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leuから選択される1以上のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする血管内皮細胞遊走阻害剤

請求項2

VEGF及び/又はbFGFに起因する血管内皮細胞の遊走を阻害することを特徴とする請求項1に記載の血管内皮細胞の遊走阻害剤。

技術分野

0001

本発明は、ペプチドを有効成分とする血管内皮細胞遊走阻害剤に関する。

背景技術

0002

癌等の種々の病気においては、血管新生病状の悪化、進行に関与している。このため、このような病気の進行を抑えるために、患者血管新生抑制薬剤投与することが有効であると考えられている。

0003

例えば、血管新生が関与して進行していく病気として子宮内膜症がある。この子宮内膜症の患者に血管新生抑制剤を投与すると、血管新生を抑制し病状の悪化の抑制効果、或いは、改善効果があるものの、性周期排卵に対して副作用が生じることが判明している。

0004

一方で、血管新生抑制タンパク質・ペプチドは、これらの副作用を起こさないことが動物実験で確認されており、タンパク質・ペプチドによる子宮内膜症治療は最も安全で有効な方法であると考えられている(例えば、非特許文献1)。

先行技術

0005

「Short synthetic endostatin peptides inhibit endothelial migration in vitro and endometriosis in a mouse model」;Christian M.Becker,M.d.,David A.Sampson,B.A.,Sarah M.Short,Ph.D.,Kashi Javaherian,Ph.D.,Judah Folman,M.D.,Robert J.D’Amato,M.D.;Fertility and Sterility Vol.85,No.1,January 2006

発明が解決しようとする課題

0006

非特許文献1に開示されているペプチドは、アミノ酸残基が24残基〜28残基であり、残基数が多く、ペプチドの合成を容易に行うことが困難である。

0007

また、タンパク質は、その作製に手間がかかる上、組織での透過性、安定性純度などに問題がある。

0008

本発明は、上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、容易に合成できるペプチドを有効成分として含有し、血管新生を抑制し得る、副作用のない血管内皮細胞の遊走阻害剤を提供することにある。

課題を解決するための手段

0009

本発明に係る血管内皮細胞の遊走阻害剤は、
アミノ酸配列がArg−Ala−Asp−His−Pro−Phe、Tyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leu、Tyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr、及び、Glu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leuから選択される1以上のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする。

0010

また、好ましくは、VEGF及び/又はbFGFに起因する血管内皮細胞の遊走を阻害することを特徴とする。

発明の効果

0011

本発明に係る血管内皮細胞の遊走阻害剤は、6残基或いは9残基のアミノ酸配列であるペプチドを有効成分としている。アミノ酸配列が短いので、ペプチドを容易に合成することができる。また、有効成分がペプチドであるので、子宮内膜症等の患者に投与しても副作用が生じないという利点がある。

図面の簡単な説明

0012

実施例1におけるVEGF誘導によるHUVEC遊走へのペプチドの影響を示す図である。
実施例2におけるVEGF誘導によるHUVEC遊走へのペプチドの影響を示す図である。
実施例3における吸光度測定結果である。
(A)、(B)、(C)は、実施例4における管腔形成に対するペプチドの影響を示す撮影図である。
実施例4における管腔の長さの測定結果である。
実施例5におけるbFGF誘導によるHUVEC遊走に対するペプチドの影響を示す図である。
実施例6におけるVEGF誘導によるHUVEC遊走に対するペプチドの影響を示す図である。

0013

本実施の形態に係る血管内皮細胞の遊走阻害剤は、アミノ酸配列がArg−Ala−Asp−His−Pro−Phe、Tyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leu、Tyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr、及び、Glu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leuから選択される1以上のペプチドを有効成分として含有している。

0014

血管新生のプロセスにおいて、血管内皮細胞が特定の方向へ遊走することになるが、上記のペプチドは、この血管内皮細胞の遊走を特異的に阻害することで、結果的に血管新生を抑制することになる。

0015

また、通常、癌細胞等が分泌する血管内皮増殖因子(VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor))や塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF(basicFibroblast Growth Factor))等の血管増殖因子によって、血管内皮細胞の遊走が惹起されるが、上記のペプチドはVEGF、bFGFいずれの血管増殖因子に起因する血管内皮細胞の遊走をも阻害する。

0016

また、本実施の形態に係る血管内皮細胞の遊走阻害剤は、上記のペプチドを有効成分としているので、例えば、子宮内膜症の患者に投与しても、性周期や排卵に対して副作用が起こらない。

0017

このように、これらのペプチドは血管内皮細胞の遊走を阻害することにより、血管新生を抑制することができるので、これらのペプチドを含有する血管内皮細胞の遊走阻害剤は、血管新生が関与する癌や子宮内膜症等、種々の病気の治療等に有効である。

0018

そして、上述のペプチドは、それぞれアミノ酸残基が6残基或いは9残基と、非特許文献1にて報じられているペプチドのアミノ酸残基(24残基〜28残基)に比べて非常に短い。

0019

アミノ酸残基が短いので、ペプチドの合成工程が少なく、容易に合成することができる。そして、合成工程が少ないことから、高い収率で合成することができる。

0020

なお、これらのペプチドは、公知の有機合成化学的な合成方法遺伝子工学的な合成方法等によって、上記の配列になるよう合成すればよい。

0021

本実施の形態に係る血管内皮細胞の遊走阻害剤の投与は、錠剤丸剤カプセル剤顆粒剤散剤液剤などによる経口投与、あるいは静脈注射筋肉注射などの注射剤坐剤経皮などによる非経口投与のいずれの形態であってもよい。

0022

血管内皮細胞の遊走阻害剤を非経口投与のための注射剤として用いる場合、無菌水性または非水性の溶液剤、懸濁剤などに上述したペプチドを添加して用いればよい。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水などが挙げられる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤としては、例えばプロピレングリコールポリエチレングリコールオリーブ油等の植物油エタノール等のアルコール類などが挙げられる。

0023

血管内皮細胞の遊走阻害剤を経口投与のための固体組成物として用いる場合、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤などの形態とすることができる。このような固体組成物は、例えば、乳糖マンニトールブドウ糖ヒドロキシプロピルセルロース微結晶セルロースデンプンポリビニルピロリドンメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどの不活性希釈剤を、有効成分としてのペプチドと混合して調製することができる。

0024

血管内皮細胞の遊走阻害剤を経口投与のための液体組成物として用いる場合、薬理上許容される乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤甘味剤風味剤芳香剤防腐剤を含有してもよい。

0025

アミノ酸配列がArg−Ala−Asp−His−Pro−Pheであるペプチド(以下、ペプチド1と記す)がヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(以下、HUVECと記す)の遊走を阻害するかを検証した。

0026

基礎培地(0.1%牛血清アルブミンを含むM199培地)に、懸濁したヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(2.5×105cell/ml)を入れ、これを、ゼラチン処理したインサート膜ポアサイズ8μmの膜)に400μl入れた。

0027

基礎培地(0.1%牛血清アルブミンを含むM199培地)に、10ng/mlの血管内皮増殖因子(以下、VEGFと記す)を入れた誘導培地を調製した。そして、この誘導培地に、ペプチド1を添加した。誘導培地は、ペプチド1が25μM、50μM、100μM、200μMの培地をそれぞれ調製した。

0028

24well培養プレートに、それぞれの誘導培地を400μl入れ、上記のインサートを置いた。

0029

それぞれについて、CO2インキュベーター中で6時間培養を行った。この培養において、HUVECの遊走が生じると、HUVECはインサート膜上部(基礎培地側)からインサート膜下部(誘導培地側)へと移動することになる。

0030

なお、参考例として、上記の誘導培地をそのまま用いて上記同様にHUVECの培養を行った(以下、Positive Controlと記す)。更に、参考例として、上記誘導培地の代わりに、上記の基礎培地を用いて上記同様にHUVECの培養を行った(以下、Negative Controlと記す)。

0031

培養後、それぞれのインサート膜上部のHUVECを綿棒で除去し、インサート膜下部に移動してきたHUVECを染色した。そして、それぞれのインサート膜の任意の3点を選び、顕微鏡倍率:200)で観察することによって、遊走した細胞数計測した。なお、培養時間が6時間と短いため、HUVECの増殖は生じないと考えられるので、ここでは細胞増殖については考慮しない。

0032

その結果を図1に示す。図1は、VEGF誘導によるHUVEC遊走へのペプチドの影響を示しており、それぞれ、Positive ControlにおけるHUVECの遊走細胞数を100とした相対値を表している。

0033

誘導培地のペプチド1の濃度が高くなるに従って、大凡HUVECの細胞数が少なくなっていることがわかる。したがって、ペプチド1によってHUVECの遊走が阻害されることを立証した。

0034

アミノ酸配列がTyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leuであるペプチド(以下、ペプチド2と記す)がHUVECの遊走を阻害するかを検証した。

0035

基礎培地(0.1%牛血清アルブミンを含むM199培地)に、懸濁したヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(2.5×105cell/ml)を入れ、これを、ゼラチン処理したインサート膜(ポアサイズ8μmの膜)に400μl入れた。

0036

基礎培地(0.1%牛血清アルブミンを含むM199培地)に、10ng/mlのVEGFを入れた誘導培地を調製した。そして、この誘導培地に、ペプチド2を添加した。誘導培地中のペプチド2の濃度が、それぞれ、25μM、50μM、100μM、200μMとなるように調製した。

0037

24well培養プレートに、それぞれの誘導培地を400μl入れ、上記のインサートを置いた。

0038

それぞれについて、CO2インキュベーター中で6時間培養を行った。

0039

なお、参考例として、Positive Control、及び、Negative Controlについても実施例1と同様に行った。

0040

培養後、それぞれについて、実施例1と同様の手法にて、遊走した細胞数を計測した。

0041

その結果を図2に示す。誘導培地のペプチド2の濃度が高くなるに従って、HUVECの細胞数が少なくなっていること、即ち、ペプチド2がHUVECの遊走を阻害したことがわかる。このように、ペプチド2によっても、HUVECの遊走が阻害されることを立証した。

0042

ペプチド1及びペプチド2のHUVEC増殖への影響について実験を行った。

0043

HUVECが1.5×104cells/mlとなるように、専用培地(HuMediaEG−2)に懸濁し、96well培養プレートに100μl/wellで播種した。

0044

細胞が付着した後、専用培地を各ペプチド100μM含有させたそれぞれの専用培地に交換し、CO2インキュベーター中で72時間培養を行った。

0045

また、参考例として、いずれのペプチドも含有しない専用培地に交換し、CO2インキュベーター中で72時間培養を行った(以下、Controlと記す)。

0046

培養後、それぞれについて、WST−1試薬による発色法により、マイクロプレートリーダーで450nmでの吸光度を測定することで、HUVEC増殖への影響を検討した。

0047

それぞれの吸光度の測定結果を図3に示す。Controlに比べて、ペプチド1を含有させた専用培地で培養したHUVECではやや細胞数が減少している。また、ペプチド2を含有させた専用培地で培養したHUVECは若干の細胞数の増加がみられる。この結果から、ペプチド1及びペプチド2は、HUVECの増殖にはさほど影響を与えていないと考えられる。

0048

ペプチド1及びペプチド2のHUVEC管腔形成への影響について実験を行った。

0049

96well培養プレートのwellに、Matrigelをコートした。HUVECを1.0×105cells/mlとなるように専用培地(HuMediaEG−2)に懸濁し、これに各ペプチドを100μM加えたものをそれぞれ準備した。

0050

上記培養プレートに、各ペプチドを加えたそれぞれの専用培地を用いてHUVECを100μl/wellで播種し、CO2インキュベーター中で18時間培養した。

0051

また、参考例として、ペプチドを加えない専用培地を用いて上記同様にHUVECの培養を行った。

0052

培養後、それぞれの管腔形成の様子を倒立顕微鏡下で撮影し、画像処理により管腔の長さを測定し、各ペプチドによるHUVECの管腔形成への影響を検討した。

0053

その撮影図を図4に、また、管腔の長さの測定結果を図5に示す。図4(A)がControl、図4(B)がペプチド1を添加した専用培地にて培養した管腔形成の様子の撮影図、図4(C)がペプチド2を添加した専用培地にて培養した管腔形成の様子の撮影図である。いずれの撮影図を比べても管腔形成の様子に大きな差異は見られない。

0054

また、図5の管腔の長さの測定結果を見ても、管腔の長さはいずれの培地で培養した場合でもほとんど変わらないことがわかる。したがって、ペプチド1及びペプチド2は、管腔形成にほとんど影響を与えていないと考えられる。

0055

以上の実施例1、2、3、及び、4の結果から、ペプチド1及びペプチド2は、HUVECの増殖、及び、管腔形成にはほとんど影響を与えず、HUVECの遊走を特異的に阻害することが確認できる。

0056

実施例1及び実施例2では、HUVECの遊走を起因する細胞増殖因子としてVEGFを用いたが、他の細胞増殖因子でもHUVECの遊走が阻害されるか否か検証した。

0057

VEGFの代わりにbFGFを用い、実施例1と同様にして、ペプチド1を100μM含有する誘導培地にてHUVECの培養を行った。また、VEGFの代わりにbFGFを用い、実施例2と同様にして、ペプチド2を100μM含有する誘導培地にてHUVECの培養を行った。更に、参考例として、実施例1及び2における参考例と同様に、Positive Control、及び、Negative Controlについても行った。

0058

その結果を図6に示す。ペプチド1及びペプチド2をそれぞれ含有する誘導培地を用いて培養した場合、Positive Controlに比べて、インサート膜を通過したHUVECの細胞数が少ないことがわかる。ペプチド1及びペプチド2は、VEGFだけではなく、bFGFに起因するHUVECの遊走をも阻害することが確認できた。

0059

続いて、ペプチド2のC末端の3アミノ酸残基を除いたTyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr(以下、ペプチド2n)、及び、ペプチド2のN末端の3アミノ酸残基を除いたGlu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leu(以下、ペプチド2c)のHUVEC遊走への影響について検証した。

0060

ペプチド1及びペプチド2の代わりに、ペプチド2n及びペプチド2cを用いた以外は、実施例1及び実施例2と同様にして培養を行った。なお、誘導培地中のペプチド2n及びペプチド2cの濃度は、それぞれ200μMとした。また、Positive Control、及び、Negative Controlについても、実施例1と同様に行った。そして、実施例1及び実施例2と同様の手法にて、それぞれ培養したHUVECの細胞数を計測した。

実施例

0061

その結果を図7に示す。ペプチド2n、及び、ペプチド2cは、Positive Controlに比べて、インサート膜を通過したHUVECの細胞数が少ないことがわかる。したがって、ペプチド2n、及び、ペプチド2cは、いずれもHUVECの遊走を阻害することを確認した。

0062

血管内細胞の遊走阻害剤は、アミノ酸配列がArg−Ala−Asp−His−Pro−Phe、Tyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leu、Tyr−Ala−Glu−Glu−Arg−Tyr、及び、Glu−Arg−Tyr−Pro−Ile−Leuから選択される1以上のペプチドを有効成分として含有している。これらのペプチドは、血管内皮細胞の遊走を阻害する機能を備えている。これらのペプチドが血管内細胞の遊走を阻害することで、血管新生抑制作用を奏するので、血管新生が関与する癌や子宮内膜症等、種々の病気の治療等に用いることが可能である。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ