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技術 難培養性細菌の培養方法

出願人 国立大学法人神戸大学
発明者 吉田優東健山本幸司西谷洋輔
出願日 2009年7月10日 (10年8ヶ月経過) 出願番号 2009-164258
公開日 2011年1月27日 (9年1ヶ月経過) 公開番号 2011-015664
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物、その培養処理
主要キーワード 純化精製 防衛システム 酸化ダメージ 生体検体 確認実験 KCl緩衝液 タンパク質合成能力 存在確認
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (10)

課題

本発明は、従来in vitroでの培養ができなかったH.ハイルマニー菌培養物を提供することを課題とし、また、H.ハイルマニー菌の培養方法を提供することを課題とする。さらには、H.ハイルマニー菌培養用培地及びH.ハイルマニー菌の検査方法を提供することを課題とする。

解決手段

H.ハイルマニー感染動物ホモジェナイズし、ヘリコバクターピロリ選択サプリメント含むpH2.2 HCl-KCl緩衝液で処理する。また基礎培地にヘリコバクターピロリ選択サプリメント及びカタラーゼ含む栄養培地を用いることにより、in vitroの系においてH.ハイルマニー菌を培養可能となる。また、前記栄養培地で培養して得られたコロニー採取して、再度当該栄養培地で培養する工程を少なくとも2回繰り返すことにより、他の微生物を含まないH.ハイルマニー菌培養物が得られる。

概要

背景

胃炎胃潰瘍患者胃生検材料からヘリコバクターピロリ(H.ピロリ)が高率に検出されることが1983年に報告され(Warren JR, Mashall BJ, Lancet, 1273-1275 (1983))、それ以来、胃炎、又は十二指腸潰瘍発症ヘリコバクター属細菌が関わっていることが次第に明らかとなってきた。ヒトのH.ピロリ感染症は、慢性胃炎潰瘍の他、リンパ腫腺腫などの発生にも関与している。H.ハイルマニー菌はヒトをはじめ多くの哺乳動物胃内に生息が確認されており、H.ピロリ菌と同様に胃炎、胃潰瘍、胃癌、リンパ腫などを引き起こすことが報告されており(非特許文献1)、胃MALT型リンパ腫の原因菌である可能性が示唆されている(非特許文献2)。H.ハイルマニー菌は、グラム陰性螺旋桿菌であり、5〜7巻の螺旋を有する。両極に、10〜20本の鞭毛を有し、運動性があり、ウレアーゼ活性を有する。H.ピロリ菌感染者の0.66%、H.ハイルマニー菌感染者の1.47%にリンパ腫が発生することが報告されている。

しかしながら、H.ハイルマニー菌は、in vitroでの培養方法確立されておらず、in vivoで菌の継代が行なわれているのみである(非特許文献3)。また、H.ハイルマニー菌の分離培養について試みたものの、発育が認められなかったという報告もある(非特許文献4)。

自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物について、例えばコレラ菌赤痢菌大腸菌等は平板培養法でのコロニー形成菌数が顕著に減少することをColwell等は指摘している(Microbial. Ecol. 8313-323 (1982))。これに対して蛍光染色法による全菌数は変化しないこと、及びコロニー形成菌数よりもはるかに多数の菌がタンパク質合成能力を有していることが確認されている(Can. J. Microbiol., 25, 415-420 (1979))。このような微生物の生理状態をColwell等はVBNC(Viable But Not Culturable)と称している。VBNCをカタラーゼを含む栄養培地で培養し、培養した微生物を分離することを特徴とする微生物の取得方法について、開示があり(特許文献1)、この実施例ではVBNC状のE. coli K-12を用いている。細菌は、エネルギー代謝を行い、宿主細胞生体防衛システムによりこの過程過酸化水素細胞内で発生させることが知られている。細胞内において発生した過酸化水素は、さらに有毒スーパーオキシドヒドロキシラジカルを発生させる。H.ピロリのような病原性細菌では、特に過酸化水素やヒドロキシラジカルにさらされるといわれている(非特許文献5)。カタラーゼにより、細菌の過酸化水素による直接的及び間接酸化ダメージが回避されることが報告されている(非特許文献6、7)。

しかしながら、特許文献1が公開された2004年3月25日よりも後に、H.ハイルマニー菌は、in vitroでの培養は困難であることが各種報告されている。例えば、ブタの胃に感染させたH.ハイルマニー菌を取得したものを材料としたもの(非特許文献8)、マウスの胃に感染させたH.ハイルマニー菌を取得したものを材料としたもの(非特許文献9)、販売カタログ掲載されるマウスの胃で継代されたH.ハイルマニー菌(非特許文献10)などが挙げられる。このように、H.ハイルマニー菌については、in vitroでの培養方法が提供されている状況とはいえず、そのために本菌の病原性並びに遺伝子等の解析について詳細な検討が非常に困難であり、研究の進展に妨げとなっていた。

概要

本発明は、従来in vitroでの培養ができなかったH.ハイルマニー菌の培養物を提供することを課題とし、また、H.ハイルマニー菌の培養方法を提供することを課題とする。さらには、H.ハイルマニー菌培養用培地及びH.ハイルマニー菌の検査方法を提供することを課題とする。H.ハイルマニー感染動物の胃のホモジェナイズし、ヘリコバクターピロリ選択サプリメント含むpH2.2 HCl-KCl緩衝液で処理する。また基礎培地にヘリコバクターピロリ選択サプリメント及びカタラーゼ含む栄養培地を用いることにより、in vitroの系においてH.ハイルマニー菌を培養可能となる。また、前記栄養培地で培養して得られたコロニー採取して、再度当該栄養培地で培養する工程を少なくとも2回繰り返すことにより、他の微生物を含まないH.ハイルマニー菌培養物が得られる。

目的

本発明は、従来in vitroでの培養ができなかったH.ハイルマニー菌の培養物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

ヘリコバクターハイルマニー(H.ハイルマニー)菌のみからなり、他の微生物を含まないH.ハイルマニー菌培養物

請求項2

培養物が、動物組織を含まない請求項1に記載のH.ハイルマニー菌培養物。

請求項3

培養物が、in vitroの系で培養されたものである請求項1又は2に記載のH.ハイルマニー菌培養物。

請求項4

基礎培地に少なくともカタラーゼ含む、H.ハイルマニー菌の培養用栄養培地

請求項5

基礎培地が、トリプチケースソイ寒天培地である請求項4に記載の栄養培地。

請求項6

さらに、乳酸トリメトプリムを含む請求項4又は5に記載の栄養培地。

請求項7

以下の組成物を含む請求項4〜6のいずれか1に記載の栄養培地:トリプチケースソイ寒天培地;ヒツジ血液(5〜15w/v%);乳酸トリメトプリム(2〜10mg/ml);カタラーゼ(50〜1000U/ml)。

請求項8

請求項4〜7のいずれか1に記載の栄養培地を用いて培養する、H.ハイルマニー菌の培養方法

請求項9

以下の工程を含む、請求項8に記載の培養方法:1)ヒト又は動物より採取したH.ハイルマニー菌を、請求項4〜7のいずれか1に記載の栄養培地を用いて培養する工程;2)上記1)の工程で得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを請求項4〜7のいずれか1に記載の栄養培地を用いて再度培養する工程。

請求項10

上記2)の工程の後に得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを請求項4〜7のいずれか1に記載の栄養培地を用いて再度培養する工程を少なくとも2回繰り返し、H.ハイルマニー菌を純化する工程を含む請求項9に記載の培養方法。

請求項11

培養されたH.ハイルマニー菌培養物が、H.ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないことを確認する工程を含む、請求項8〜10のいずれか1に記載の培養方法。

請求項12

請求項8〜11のいずれか1に記載の培養方法により培養されたH.ハイルマニー菌培養物。

請求項13

請求項8〜11のいずれか1に記載の培養方法を用いるH.ハイルマニー菌の分離方法

請求項14

請求項8〜11のいずれか1に記載の培養方法を用いるH.ハイルマニー菌の検査方法

請求項15

請求項1〜3および請求項11のいずれか1に記載のH.ハイルマニー菌培養物を検出することを特徴とするH.ハイルマニー菌の検査方法。

技術分野

0001

本発明は、難培養性細菌のうち特にヘリコバクターハイルマニー(Helicobacter heilmannii、以下単に「H.ハイルマニー」ともいう。)菌の培養方法に関し、さらにはH.ハイルマニー菌培養物、H.ハイルマニー菌の培養に用いる栄養培地、及びH.ハイルマニー菌の検査方法に関する。

背景技術

0002

胃炎胃潰瘍患者胃生検材料からヘリコバクター・ピロリ(H.ピロリ)が高率に検出されることが1983年に報告され(Warren JR, Mashall BJ, Lancet, 1273-1275 (1983))、それ以来、胃炎、又は十二指腸潰瘍発症ヘリコバクター属細菌が関わっていることが次第に明らかとなってきた。ヒトのH.ピロリ感染症は、慢性胃炎潰瘍の他、リンパ腫腺腫などの発生にも関与している。H.ハイルマニー菌はヒトをはじめ多くの哺乳動物胃内に生息が確認されており、H.ピロリ菌と同様に胃炎、胃潰瘍、胃癌、リンパ腫などを引き起こすことが報告されており(非特許文献1)、胃MALT型リンパ腫の原因菌である可能性が示唆されている(非特許文献2)。H.ハイルマニー菌は、グラム陰性螺旋桿菌であり、5〜7巻の螺旋を有する。両極に、10〜20本の鞭毛を有し、運動性があり、ウレアーゼ活性を有する。H.ピロリ菌感染者の0.66%、H.ハイルマニー菌感染者の1.47%にリンパ腫が発生することが報告されている。

0003

しかしながら、H.ハイルマニー菌は、in vitroでの培養方法は確立されておらず、in vivoで菌の継代が行なわれているのみである(非特許文献3)。また、H.ハイルマニー菌の分離培養について試みたものの、発育が認められなかったという報告もある(非特許文献4)。

0004

自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物について、例えばコレラ菌赤痢菌大腸菌等は平板培養法でのコロニー形成菌数が顕著に減少することをColwell等は指摘している(Microbial. Ecol. 8313-323 (1982))。これに対して蛍光染色法による全菌数は変化しないこと、及びコロニー形成菌数よりもはるかに多数の菌がタンパク質合成能力を有していることが確認されている(Can. J. Microbiol., 25, 415-420 (1979))。このような微生物の生理状態をColwell等はVBNC(Viable But Not Culturable)と称している。VBNCをカタラーゼを含む栄養培地で培養し、培養した微生物を分離することを特徴とする微生物の取得方法について、開示があり(特許文献1)、この実施例ではVBNC状のE. coli K-12を用いている。細菌は、エネルギー代謝を行い、宿主細胞生体防衛システムによりこの過程過酸化水素細胞内で発生させることが知られている。細胞内において発生した過酸化水素は、さらに有毒スーパーオキシドヒドロキシラジカルを発生させる。H.ピロリのような病原性細菌では、特に過酸化水素やヒドロキシラジカルにさらされるといわれている(非特許文献5)。カタラーゼにより、細菌の過酸化水素による直接的及び間接酸化ダメージが回避されることが報告されている(非特許文献6、7)。

0005

しかしながら、特許文献1が公開された2004年3月25日よりも後に、H.ハイルマニー菌は、in vitroでの培養は困難であることが各種報告されている。例えば、ブタの胃に感染させたH.ハイルマニー菌を取得したものを材料としたもの(非特許文献8)、マウスの胃に感染させたH.ハイルマニー菌を取得したものを材料としたもの(非特許文献9)、販売カタログ掲載されるマウスの胃で継代されたH.ハイルマニー菌(非特許文献10)などが挙げられる。このように、H.ハイルマニー菌については、in vitroでの培養方法が提供されている状況とはいえず、そのために本菌の病原性並びに遺伝子等の解析について詳細な検討が非常に困難であり、研究の進展に妨げとなっていた。

0006

特開2004-89106号公報(2004年3月25日公開)

先行技術

0007

J Clin Microbiol, 42:2144-51 (2004)
Gastroenterology 118:821-28 (2000)
J Clin Microbiol Infect Dis, 15:95-96 (1996)
第37回関東信越地区医学検査学会2000.10.14-15、「Helicobacter heilmanniiの分離培養への試み」
Microbiology, 149: 665-672 (2003)
Arch. Microbiol., 172: 63-67 (1999)
Arch. Microbiol., 173: 307-310 (2000)
Braz J Medical Biol Res, 39:253-261 (2006)
Infect Immun. 2007 Mar;75(3):1214-22. Epub 2006 Dec 28.
ATCC(R)catalog, 49286TM, 2008 ATCC. All Rights Reserved.

発明が解決しようとする課題

0008

本発明は、従来in vitroでの培養ができなかったH.ハイルマニー菌の培養物を提供することを課題とし、また、H.ハイルマニー菌の培養方法を提供することを課題とする。さらには、H.ハイルマニー菌培養用培地及びH.ハイルマニー菌の検査方法を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

0009

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、基礎培地に少なくともカタラーゼ含む栄養培地を用いることによりH.ハイルマニー菌をin vitroの系において培養可能となることを見出した。また、前記栄養培地で培養して得られたコロニー採取して、再度当該栄養培地で培養することにより、他の微生物を含まないH.ハイルマニー菌培養物を得ることに成功し、本発明を完成した。

0010

すなわち本発明は、以下よりなる。
1.H.ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないH.ハイルマニー菌培養物。
2.培養物が、動物組織を含まない前項1に記載のH.ハイルマニー菌培養物。
3.培養物が、in vitroの系で培養されたものである前項1又は2に記載のH.ハイルマニー菌培養物。
4.基礎培地に少なくともカタラーゼ含む、H.ハイルマニー菌の培養用栄養培地。
5.基礎培地が、トリプチケースソイ寒天培地である前項4に記載の栄養培地。
6.さらに、乳酸トリメトプリムを含む前項4又は5に記載の栄養培地。
7.以下の組成物を含む前項4〜6のいずれか1に記載の栄養培地:
トリプチケースソイ寒天培地;
ヒツジ血液(5〜15w/v%);
乳酸トリメトプリム(2〜10mg/ml);
カタラーゼ(50〜1000U/ml)。
8.前項4〜7のいずれか1に記載の栄養培地を用いて培養する、H.ハイルマニー菌の培養方法。
9.以下の工程を含む、前項8に記載の培養方法:
1)ヒト又は動物より採取したH.ハイルマニー菌を、前項4〜7のいずれか1に記載の栄養培地を用いて培養する工程;
2)上記1)の工程で得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを前項4〜7のいずれか1に記載の栄養培地を用いて再度培養する工程。
10.上記2)の工程の後に得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを前項4〜7のいずれか1に記載の栄養培地を用いて再度培養する工程を少なくとも2回繰り返し、H.ハイルマニー菌を純化する工程を含む前項9に記載の培養方法。
11.培養されたH.ハイルマニー菌培養物が、H.ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないことを確認する工程を含む、前項8〜10のいずれか1に記載の培養方法。
12.前項8〜11のいずれか1に記載の培養方法により培養されたH.ハイルマニー菌培養物。
13.前項8〜11のいずれか1に記載の培養方法を用いるH.ハイルマニー菌の分離方法
14.前項8〜11のいずれか1に記載の培養方法を用いるH.ハイルマニー菌の検査方法。
15.前項1〜3および前項11のいずれか1に記載のH.ハイルマニー菌培養物を検出することを特徴とするH.ハイルマニー菌の検査方法。

発明の効果

0011

本発明の培養方法により、従来in vitroでの培養ができなかったH.ハイルマニー菌を培養することができた。本発明の培養方法により得られたH.ハイルマニー菌培養物を使用することで、本菌の病原性並びに遺伝子等の解析など、従来未解明であった研究を進めることができる。また、本発明の培養方法を用いることで、胃の生検検体よりH.ハイルマニー菌の存在の有無を確認することによるH.ハイルマニー菌の検査を行うことができる。さらに、精製菌体タンパク質を用いて、特異的抗体を検出することで、血清、尿から、その感染診断を行うことができる。

図面の簡単な説明

0012

H.ハイルマニー菌の培養方法の概略を示す図である。
本発明の培養物からの細菌の16SrRNA遺伝子配列を検出する方法の概略を示す図である。
胃粘膜肉眼所見及び組織所見を示す写真図である。(実験例1−1)
豚胃粘膜から精製されたDNAをテンプレートとして、H.ハイルマニー16Sプライマー用いたPCRによりH.ハイルマニー菌16SrRNA増幅産物の存在を示す写真図である。(実験例1−1)
本発明の栄養培地で培養された培養物の写真図である(実験例1−2)。左が単離培養前、右が培養を繰り返し純化したH.ハイルマニー菌を示す。
本発明の栄養培地で純化培養された培養物(コロニー)からDNAを精製し、H.ハイルマニー菌ウレアーゼプライマーならびにウレアーゼBプライマーを用いてウレアーゼAならびにウレアーゼB遺伝子の増幅産物の存在を示す図である。(実験例1−3)
本発明の栄養培地で培養された培養物のウレアーゼA遺伝子配列を示す図である。(実験例1−3)
本発明の栄養培地で培養された培養物のウレアーゼB遺伝子配列を示す図である。(実験例1−3)
マウス胃粘膜から本発明の栄養培地で培養された培養物の写真図(A)である(実験例2)。純化精製された培養物より得られたDNAをテンプレートとして、H.ハイルマニー16Sプライマー用いたPCRによりH.ハイルマニー菌16SrRNA増幅産物の存在を示す写真図である。(実験例2−1)

0013

本発明は、従来in vitroでの培養ができなかったH.ハイルマニー菌の培養方法、前記培養方法により得られるH.ハイルマニー菌培養物、H.ハイルマニー菌の培養に用いる栄養培地、さらにはH.ハイルマニー菌の検査方法に関する。

0014

まずはじめに、H.ハイルマニー菌の培養方法の概略を、図1に従い説明する。図1は、具体的な例を示すものであって、本発明はこれに限定されるものではない。H.ハイルマニー菌は生体検体から採取することができ、例えばH.ハイルマニー菌の感染動物の胃組織から採取することができる。当該感染動物は、H.ハイルマニー菌が感染可能な動物であればよく、特に限定されない。H.ハイルマニー菌は、例えばマウス、カニクイザル、ブタ、イヌ、ヒト等から採取することができる。例えば、実験動物からは当該実験動物の胃を摘出したものを生体検体とし、ヒトの場合は胃組織を生検採取により採取したものを生体検体とし、採取することができる。あるいは、in vivoの系でストックされている市販のH.ハイルマニー菌を用いることもできる。

0015

生体検体などからH.ハイルマニー菌を単離するための最初の選択培地として、本発明のH.ハイルマニー菌培養用の栄養培地を使用することができる。具体的には、H.ハイルマニー菌が感染しているか、又は感染が疑われる動物あるいはヒトから採取した生体検体を高酸緩衝液ホモジェナイズしたものを、本発明のH.ハイルマニー菌培養用の栄養培地に直接接種して培養することができる。

0016

ここで、本発明のH.ハイルマニー菌培養用の栄養培地には、基礎培地に少なくともカタラーゼを含むことを特徴とする。基礎培地として、トリプチケースソイ寒天培地を用いる。さらに、当該栄養培地には、ヒツジ血液や乳酸トリメトプリムを含むことができる。

0017

好適な栄養培地は、トリプチケースソイ寒天培地;ヒツジ血液(5〜15w/v%、より好適には約5w/v%);乳酸トリメトプリム(2〜10mg/l、より好適には約2mg/l);カタラーゼ(50〜1000U/ml、好適には100〜200U/ml、より好適には約100mg/l)を含むことができる。さらに、バンコマイシンセフスロジン及びアンホテリシンBなどを含むことができる。

0018

H.ハイルマニー菌は、当該栄養培地に接種し、37±0.5℃で1〜10日間、好ましくは約5日間、微好気性培養、例えば5%CO2存在下で培養することができる。培養の際に、湿度を高くすることでH.ハイルマニー菌の発育を向上させることができる。例えば、湿度は95%以上とすることができる。

0019

さらに以下の工程を含む培養方法により培養することができる。
1)ヒト又は動物より採取したH.ハイルマニー菌を、当該栄養培地を用いて培養する工程。
2)上記1)の工程で得られた培養物(コロニー)の一部を採取し、採取したコロニーを当該栄養培地を用いて再度培養する工程。

0020

本発明の培養方法では、上記2)の工程の後に得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを当該栄養培地を用いて再度培養する工程を少なくとも2回、好ましくは3回以上繰り返し、H.ハイルマニー菌を純化する工程を含む。上記採取したコロニーを当該栄養培地を用いて培養する工程を繰り返すことにより、H.ハイルマニー菌を純化することができる。上記のように培養して得られた培養物(コロニー)の一部を、当該栄養培地に塗抹し、継代培養することができる。本発明の培養方法では、さらに、前記の培養方法により培養されたH.ハイルマニー菌培養物がH.ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないことを確認する工程を含んでいてもよい。

0021

上記のように培養して分離された培養物は、H.ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないことを特徴とする。本発明は、上記得られたH.ハイルマニー菌培養物にも及ぶ。H.ハイルマニー菌は、従来は純粋培養ができず、例えば実験動物やヒト等の胃内、即ちin vivoでしか生存できなかったため、胃からの分離物にはH.ハイルマニー菌のほか、他の微生物や動物細胞混入していた。しかし、本発明の培養方法により初めて純粋培養が可能となり、他の微生物や動物細胞が混入していないH.ハイルマニー菌のみを含む培養物を分離することができる。これにより、H.ハイルマニー菌の微生物学的研究、さらに全遺伝子解析が可能となる。他の微生物の例として、例えば動物の胃内で生存可能な他の細菌、例えばH.ピロリ、大腸菌(Escherichia coli)、乳酸菌(Lactobacillus属菌)、バチルス(Bacillus)属菌等が挙げられる。

0022

また、凍結保存は、本発明の栄養培地で培養した培養物、即ちH.ハイルマニー菌を、ブルセラ培地(20%グリセロール及び10%馬血清を含む)に懸濁し、−80℃にて凍結保存することができる。

0023

本発明のH.ハイルマニー菌の培養方法は、生体検体から採取したH.ハイルマニー菌の培養方法や、継代後に培養した菌の培養方法にも及ぶ。上記の培養方法によりH.ハイルマニー菌培養物を分離することができる。本発明は、H.ハイルマニー菌の分離方法にも及ぶ。

0024

上記において、得られた培養物に他の微生物が含まれないことを確認するための方法として、得られた培養物の全ゲノム解析や16SリボソームRNA(16SrRNA)遺伝子の塩基配列解析等を挙げることができる。16SrRNAの塩基配列は、培養物からDNAを抽出し、16SrRNA遺伝子ユニバーサルプライマーを用いて増幅、大腸菌にトランスフォーメーション後、得られたそれぞれのコロニーからプラスミドを精製し、挿入塩基配列を解読することにより解析することができる。H.ハイルマニー菌の16SrRNA遺伝子は、GenBankAccession No.AF506794に登録される塩基配列、若しくは当該塩基配列のうち、1〜複数個ヌクレオチド置換し、欠失し、又は付加又は導入される配列のオリゴヌクレオチドからなる。当該配列により、H.ハイルマニー菌を同定することができる。上記配列は、例えば16SrRNA遺伝子に対するユニバーサルプライマー又はH.ハイルマニー菌の16SrRNA遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した遺伝子産物について、塩基配列を確認し、上述のH.ハイルマニー菌の16SrRNA遺伝子との配列を比較することにより、H.ハイルマニー菌を確認することができる(図2参照)。増幅した遺伝子産物と上述の16SrRNA遺伝子との配列のホモロジーが、少なくとも95%以上、好ましくは98.5%以上、より好ましくは99%以上の場合に、H.ハイルマニー菌を同定することができる。

0025

さらには、本発明は上述の培養方法を用いることを特徴とするH.ハイルマニー菌の検査方法にも及ぶ。具体的には上記の培養方法により培養して得られたH.ハイルマニー菌培養物を検出することを特徴とする。例えば、H.ハイルマニー菌の感染の可能性が疑われる場合に、胃の生検検体を採取し、本発明の栄養培地を用いて培養し、培養物が得られるか否か、あるいは得られた培養物の解析、例えば培養物から抽出した遺伝子をH.ハイルマニー16SプライマーをもちいたPCR法で増幅されるかどうかを解析することにより、H.ハイルマニー菌の存在を確認することができる。さらに、分離された培養物から抽出した遺伝子を16SrRNA遺伝子ユニバーサルプライマーをもちいて増幅し、大腸菌にトランスフォーメーションすることでその配列を解析することで、H.ハイルマニー菌以外の菌が存在していないかを確認することができる。さらに、精製菌体のタンパク質を用いてEnzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)システム構築することで、感染が疑われるヒトを含む動物などの血清、尿から、その感染診断を行うことができる。

0026

本発明の理解を深めるために、以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは明らかである。

0027

(実施例1)豚胃粘膜からのH.ハイルマニー菌の単離培養
H.ハイルマニー菌の培養は、図1に示す手順にて行なった。具体的には、実験例1−2に記載の方法により行なった。

0028

(実験例1−1)豚胃粘膜におけるH.ハイルマニー菌の存在確認
1)方法
豚の胃組織を採取し、胃粘膜の組織所見をH&E染色にて観察したところ、胃粘膜に著明リンパ濾胞が認められる豚胃粘膜組織が存在した。豚胃粘膜の肉眼所見及び組織所見を図3に示した。当該豚の胃粘膜にH.ハイルマニー菌が感染しているかどうかをH.ハイルマニー16Sプライマーを用いたPCR法で確認した。具体的には、豚の胃粘膜を、溶解緩衝液(Lysis buffer:10 mM Tris-HCl, 1% SDS, 240μg/ml Proteinase K)、フェノールクロロホルムイソアミルアルコールエタノールを用いてDNAを抽出した。抽出したDNAについて、以下に示すH.ハイルマニー16Sプライマーを用いてPCR(polymerase chain reaction)の手法によりDNAを増幅させた。陽性コントロールは、in vivoの系でストックされている市販のH.ハイルマニー菌より抽出したDNAにPCR増幅産物とした。

0029

H.ハイルマニー16Sプライマー
a)フォワードプライマー: TTGGGAGGCTTTGTCTTTCCA(配列番号1)
b)リバースプライマー: GATTAGCTCTGCCTCGCGGCT(配列番号2)

0030

2)結果
PCR増幅産物は、陽性コントロールと同じ位置にバンドを認め、実験例1で使用した豚胃粘膜には、H.ハイルマニー菌が含まれていることが確認された(図4)。

0031

(実験例1−2)マウス感染胃粘膜からのH.ハイルマニー菌の培養
1)方法
実験例1−1の豚の胃粘膜を、リン酸緩衝液中でホモジェナイズしたものをマウスに経口投与した。1ヶ月間、マウスを通常通り飼育した後、屠殺し、胃粘膜を採取した。マウスの胃粘膜を、ヘリコバクターピロリ選択サプリメントを含むpH2.2 HCl-KCl緩衝液でホモジェナイズし、1〜2時間、37℃でインキュベートしたものを、以下のH.ハイルマニー菌の培養用栄養培地(本発明の栄養培地)に塗抹し、5%CO2、湿度95%以上において37±0.5℃、3〜4日間培養した。

0032

H.ハイルマニー菌培養用栄養培地組成
基本培地
5w/v%ヒツジ血液加トリプチケースソイII寒天培地(ベクトンディッキンソン製)
添加物
ウシ肝臓由来カタラーゼ(Wako製)100U/ ml
抗生物質
ヘリコバクターピロリ選択サプリメント(DENT:SR147)(関東化学製)
上記サプリメントには、バンコマイシン:10mg/l、乳酸トリメトプリム:5mg/l、セフスロジン:5mg/l、アンホテリシンB:5mg/lを含む。

0033

2)結果
上記栄養培地で培養した結果、培養物が得られた(図5左)。培養を2度繰り返し、コロニーを純化した(図5右)。

0034

(実験例1−3)H.ハイルマニー菌ウレアーゼ遺伝子の解析
本実験例では、実験例1−2で培養し、分離された培養物のウレアーゼAならびにウレアーゼB遺伝子を解析した。

0035

1)実験方法
分離された培養物について、実験例1−1と同手法によりDNAを抽出し、H.ハイルマニーウレアーゼAならびにウレアーゼBプライマー用いてPCRを行い、増幅産物を得た。PCR増幅産物を1%アガロースゲル電気泳動した。さらにそれぞれの遺伝子の塩基配列を決定した。
H.ハイルマニーウレアーゼAプライマー
a)フォワードプライマー: ACTTGTTACCATCCACACTC(配列番号3)
b)リバースプライマー:CGCAGTTAATGGTGCCAA (配列番号4)
H.ハイルマニーウレアーゼBプライマー
a)フォワードプライマー: GGCGATAAAGTCAGACTAGG(配列番号5)
b)リバースプライマー: GCGAATCCTAGAGTCAGCAA(配列番号6)

0036

2)結果
本発明の栄養培地で分離した培養物(4コロニー)のすべてにおいて、陽性コントロールと同じサイズのバンドが確認された。これにより、栄養培地から分離した培養物は、H.ハイルマニー菌ウレアーゼ遺伝子をもっていることが示唆された。図6から8において、陽性コントロールは、in vivoの系でストックされている市販のH.ハイルマニー菌より抽出したDNAである。分離された培養物、ウレアーゼA(図7)ならびにウレアーゼB遺伝子(図8)の塩基配列は、H.ハイルマニー菌の配列と98.5%以上一致した。

0037

(実験例1−4)H.ハイルマニー菌以外の菌が培養物に含まれていないことの確認実験
(16SrRNA遺伝子の解析による他の細菌が混在していないことの確認)
本実験例では、実験例1−2で培養し、分離された培養物の16SrRNA遺伝子の塩基配列を解析した。

0038

1)実験方法
本発明の栄養培地で分離した培養物より、溶解緩衝液(Lysis buffer:10 mM Tris-HCl, 1% SDS, 240μg/ml Proteinase K)、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール、エタノールを用いてDNAを抽出した。抽出したDNAについて、以下に示す16SrRNA遺伝子ユニバーサルプライマーを用いてPCR(polymerase chain reaction)の手法によりDNAを増幅させ、PCR産物を得た。PCR産物をTAベクターにつないで大腸菌(E. coli)に導入(トランスフォーメーション)した。選択培地で前記大腸菌を培養し、ベクターが導入された大腸菌を選択した。異なる10個のコロニーをピックアップして培養後、プラスミドを抽出し、前記プラスミドの挿入配列遺伝子の塩基配列を解析した。

0039

16SrRNA遺伝子ユニバーサルプライマー
a)フォワードプライマー:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (配列番号7)
b)リバースプライマー: GACGGGCGGTGWGTRCA(配列番号8)

0040

2)結果
培養物(10コロニー)より抽出したDNAすべてで、データベース(GenBankAccession No.AF506794)のH.ハイルマニー菌の配列と98.5%以上一致した。これにより、本発明の栄養培地で分離した菌は、H.ハイルマニー菌、又はその近縁種であり、他の細菌が混ざっていないことが確認された。

0041

(実施例2)マウス感染胃粘膜よりH.ハイルマニー菌の培養
H.ハイルマニー菌(49286TM、ATCC(R))を感染させたマウス胃粘膜を、リン酸緩衝液中でホモジェナイズしたものをマウスに経口投与した。1ヶ月間、マウスを通常通り飼育した後、屠殺し、胃粘膜を採取した。マウスの胃粘膜を、ヘリコバクターピロリ選択サプリメントを含むpH2.2 HCl-KCl緩衝液でホモジェナイズし、1〜2時間、37℃でインキュベートしたものを、以下のH.ハイルマニー菌の培養用栄養培地(本発明の栄養培地)に塗抹し、5%CO2、湿度95%以上において37±0.5℃、3〜4日間培養した。この培養物を用い更に2回培養し、コロニーを純化した。

0042

H.ハイルマニー菌培養用栄養培地組成
・基本培地
5w/v%ヒツジ血液加トリプチケースソイII寒天培地(ベクトンディッキンソン製)
・添加物
ウシ肝臓由来カタラーゼ(Wako製)100U/ml
・抗生物質
ヘリコバクターピロリ選択サプリメント(DENT:SR147)(関東化学製)
上記サプリメントには、バンコマイシン:10mg/l、乳酸トリメトプリム:5mg/l、セフスロジン:5mg/l、アンホテリシンB:5mg/lを含む。

0043

(実験例2−1)培養物の確認
1)方法
得られた培養物から、上述の方法でDNAを精製し、H.ハイルマニー16Sプライマーを用いてPCRの手法によりDNAを増幅させた。陽性コントロールは、in vivoの系でストックされている市販のH.ハイルマニー菌より抽出したDNAにPCR増幅産物とした。

0044

2)結果
上記栄養培地で培養した結果、培養物が得られた(図9A)。また、培養物から得られたPCR増幅産物は、陽性コントロールと同じ位置にバンドを認め、培養物はH.ハイルマニー菌が含まれていることが確認された(図9B)。

0045

(実験例2−2)16SrRNA遺伝子の解析による他の細菌が混在していないことの確認
本実験例では、実施例2で培養し、分離された培養物の16SrRNA遺伝子の塩基配列を解析した。

0046

1)実験方法
本発明の栄養培地で分離した培養物より、溶解緩衝液(Lysis buffer:10 mM Tris-HCl, 1% SDS, 240μg/ml Proteinase K)、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール、エタノールを用いてDNAを抽出した。抽出したDNAについて、以下に示す16SrRNA遺伝子ユニバーサルプライマーを用いてPCR(polymerase chain reaction)の手法によりDNAを増幅させ、PCR産物を得た。PCR産物をTAベクターにつないで大腸菌(E. coli)に導入(トランスフォーメーション)した。選択培地で前記大腸菌を培養し、ベクターが導入された大腸菌を選択した。異なる10個のコロニーをピックアップして培養後、プラスミドを抽出し、前記プラスミドの挿入配列遺伝子の塩基配列を解析した。

0047

16SrRNA遺伝子ユニバーサルプライマー
a)フォワードプライマー:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (配列番号7)
b)リバースプライマー: GACGGGCGGTGWGTRCA(配列番号8)

実施例

0048

2)結果
培養物(10コロニー)より抽出したDNAすべてで、データベース(GenBankAccession No.AF506794)のH.ハイルマニー菌の配列と98.5%以上一致した。これにより、本発明の栄養培地で分離した菌は、H.ハイルマニー菌、又はその近縁種であり、他の細菌が混ざっていないことが確認された。

0049

以上詳述したように、本発明の培養方法により、従来in vitroでの培養ができなかったH.ハイルマニー菌を培養することができた。本発明の培養方法を用いることで、胃の生検検体について、H.ハイルマニー菌の存在の有無を確認することによりH.ハイルマニー菌の検査を行うことができる。また、本発明の栄養培地で培養された培養物を使用することで、本菌の病原性並びに遺伝子等の解析など、従来未解明であった研究を進めることができ、非常に有用である。

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