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技術 複数の核酸からのタンパク質発現

出願人 エフ.ホフマン-ラロシュアーゲー
発明者 ゴエプフェルトウルリックノエトゲンヘンドリックコペツキーエルハルトスターンアン
出願日 2008年10月9日 (12年8ヶ月経過) 出願番号 2010-527368
公開日 2010年12月24日 (10年5ヶ月経過) 公開番号 2010-540583
状態 特許登録済
技術分野 ペプチド又は蛋白質 微生物、その培養処理 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード 部分段階 完全選択 容積的 羊毛由来 陰イオン交換物質 アッセンブル 組込型 アフィニティー物質
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図面 (9)

課題・解決手段

本発明は、以下の段階: (i)浮遊培養での増殖に適応しており、無血清培地での増殖に適応しており、マイコプラズマを含まず、かつウイルスを含まない、CHO細胞を提供する段階、(ii)原核生物複製起点、原核生物選択剤に対する耐性を付与する第一の核酸異種免疫グロブリン重鎖をコードする第二の核酸、異種免疫グロブリンの軽鎖をコードする第三の核酸、真核生物選択剤に対する耐性を付与する第四の核酸を含むベクターを提供する段階、(iii) (a) 第一の真核生物選択剤に対する耐性を付与する第四の核酸を含む該ベクターを該CHO細胞にトランスフェクトする段階、(b) 該第一の真核生物選択剤を含有する培養培地中での増殖によりCHO細胞を選択する段階、(c) 該第一の真核生物選択剤とは異なる第二の真核生物選択剤に対する耐性を付与する第四の核酸を含む該ベクターを、該選択したCHO細胞にトランスフェクトする段階、(d) 該第一および該第二の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖によりCHO細胞を選択する段階を含む、該CHO細胞をトランスフェクトする段階、(iv) 該第二、および第三の核酸の発現に適した条件の下、該第一および第二の真核生物選択剤の存在している培地中で、該トランスフェクトされたCHO細胞を培養する段階、ならびに(v)分泌された異種免疫グロブリンを培養培地から回収する段階を含む、CHO細胞における分泌された異種免疫グロブリンの組み換え産生のための方法について報告する。

概要

背景

発明の背景
組み換えポリペプチドの産生のための発現系は、当技術分野の現況においては周知であり、例えば、Marino, M. H., Biopharm. 2 (1989) 18-33(非特許文献1); Goeddel, D.V., et al., MethodsEnzymol. 185 (1990) 3-7(非特許文献2); Wurm, F., and Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159(非特許文献3)によって記述されている。薬学的用途に用いるためのポリペプチドは、好ましくは、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、COS細胞HEK細胞BHK細胞、PER.C6(登録商標)細胞などのような、哺乳類細胞において産生される。発現プラスミド必須要素は、例えば大腸菌(E.coli)の場合、原核生物複製起点および原核生物の選択マーカーを含む、原核生物のプラスミド増殖単位、真核生物の選択マーカー、ならびに、プロモーター構造遺伝子およびポリアデニル化シグナルを含んだ転写ターミネーターをそれぞれが含む、関心対象の構造遺伝子の発現のための一つまたは複数の発現カセットである。哺乳類細胞における一過性発現のために、SV40OriまたはOriPなどの、哺乳類の複製起点を含めることができる。プロモーターとして、構成的または誘導性プロモーターを選択することができる。転写の最適化のために、コザック(Kozak)配列を5'非翻訳領域に含めることができる。mRNAプロセッシング、特にmRNAスプライシングおよび転写終結のため、構造遺伝子の構造(エキソン/イントロン構造)に依るmRNAスプライシングシグナル、ならびにポリアデニル化シグナルを含めることができる。

遺伝子の発現は一過性の発現としてまたは永続性の発現として行われる。関心対象のポリペプチドは、概して、分泌ポリペプチドであり、それゆえ、細胞を通じた細胞外培地へのポリペプチドの輸送/分泌に必要なN末端伸長部(シグナル配列としても公知)を含む。一般に、シグナル配列は、分泌ポリペプチドをコードする任意の遺伝子に由来することができる。異種のシグナル配列が使われるなら、それは宿主細胞により認識されプロセッシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される)ものであることが好ましい。酵母での分泌のためには、例えば、発現される異種遺伝子天然のシグナル配列を、酵母インベルターゼシグナル配列、α因子リーダー(サッカロマイセス(Saccharomyces)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)およびハンゼヌラ(Hansenula)α-因子リーダーを含む、二つ目は米国特許第5,010,182号(特許文献1)に記述されている)、酸性ホスファターゼシグナル配列、またはC.アルビカンス(C. albicans)グルコアミラーゼシグナル配列(EP 0 362 179(特許文献2))などの、分泌遺伝子に由来する同種の酵母シグナル配列によって置換することができる。哺乳類細胞発現では、関心対象のタンパク質の天然のシグナル配列は十分ではあるが、例えばヒトまたはマウス由来免疫グロブリンのための、同じまたは関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、およびウイルス分泌シグナル配列、例えば、単純ヘルペス糖タンパク質Dシグナル配列などの、他の哺乳類シグナル配列が適当でありうる。そのようなプレセグメントをコードするDNA断片は、関心対象のポリペプチドをコードするDNA断片にインフレームライゲーションされる。

今日、CHO細胞は薬学的ポリペプチドの発現のために、実験室において小規模で、または生産過程において大規模で、広く使われている。CHO細胞の特徴的な特性および遺伝的な背景は、それが広く普及し用いられているため、周知である。それゆえ、CHO細胞は規制当局によって、ヒトに適用するための治療用タンパク質の産生が承認されている。

EP 0 569 678(特許文献3)には、腫瘍転移免疫学的予防のための細胞性ワクチンとしてMHC遺伝子の二重形質移入体報告されている。WO 97/08342(特許文献4)には、レポーター遺伝子を用いて哺乳類細胞におけるプロモーター配列活性を測定するための改良法が報告されている。WO 2005/113770(特許文献5)には、RhoAまたはRhoCの合成を特異的に阻害するために抗RhoA siRNAおよび抗RhoC siRNAを用いることが報告されている。米国特許第7,202,072号(特許文献6)には、酵母細胞における真核生物のアルカリホスファターゼ変異体の組み換え産生または発現のための方法が報告されている。WO 2001/038557(特許文献7)には、蛍光タンパク質の2シストロン性の発現を用いて多重形質転換された細胞をスクリーニングする方法が報告されている。WO 1999/47647(特許文献8)には、関心対象の複数のタンパク質またはRNAを発現する組み換え真核細胞株を作出するための方法が報告されている。WO 2003/076588(特許文献9)には、コード化された担体を用いたトランスフェクション材料による細胞のトランスフェクションのための、方法を含めた、系、組成物およびキットが報告されている。米国特許第5,089,397号(特許文献10)には、ヒトメタロチオネイン-IIプロモーターの制御下に所望のタンパク質をコードしている配列を持ったDNA配列で形質転換されたCHO細胞を含む、所望のタンパク質の組み換え産生のための発現系が報告されている。米国特許第2003/0040047号(特許文献11)には、組み換えタンパク質を産生するための方法が報告されている。Lamangoら(Lamango, N.S., et al., Arch. Biochem. Biophys. 330 (1996) 238-250(非特許文献4))は、プロホルモン転換酵素2の産生が神経内分泌ポリペプチド7B2の存在に依存していることを報告している。Waldenstroem, M., et al., Gene 120 (1992) 175-181(非特許文献5)により、非組込型複製性BPV-Iゲノムを内部に持った細胞へのBPV-Iに基づく発現ベクターのトランスフェクションが報告されている。米国特許第4,912,038号(特許文献12)には、イヌおよびヒト32K肺サーファクタントタンパク質を得るための方法およびベクターが報告されている。WO 89/10959(特許文献13)には、遺伝子操作されている真核細胞における哺乳類ポリペプチドの発現および組み換えDNA技術が報告されている。DD287531(特許文献14)には、ヒト成長ホルモンのための発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子のための発現ベクターの繰り返し同時移入が報告されている。

概要

本発明は、以下の段階: (i)浮遊培養での増殖に適応しており、無血清培地での増殖に適応しており、マイコプラズマを含まず、かつウイルスを含まない、CHO細胞を提供する段階、(ii)原核生物の複製起点、原核生物選択剤に対する耐性を付与する第一の核酸異種免疫グロブリン重鎖をコードする第二の核酸、異種免疫グロブリンの軽鎖をコードする第三の核酸、真核生物選択剤に対する耐性を付与する第四の核酸を含むベクターを提供する段階、(iii) (a) 第一の真核生物選択剤に対する耐性を付与する第四の核酸を含む該ベクターを該CHO細胞にトランスフェクトする段階、(b) 該第一の真核生物選択剤を含有する培養培地中での増殖によりCHO細胞を選択する段階、(c) 該第一の真核生物選択剤とは異なる第二の真核生物選択剤に対する耐性を付与する第四の核酸を含む該ベクターを、該選択したCHO細胞にトランスフェクトする段階、(d) 該第一および該第二の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖によりCHO細胞を選択する段階を含む、該CHO細胞をトランスフェクトする段階、(iv) 該第二、および第三の核酸の発現に適した条件の下、該第一および第二の真核生物選択剤の存在している培地中で、該トランスフェクトされたCHO細胞を培養する段階、ならびに(v)分泌された異種免疫グロブリンを培養培地から回収する段階を含む、CHO細胞における分泌された異種免疫グロブリンの組み換え産生のための方法について報告する。

目的

本発明の第一の局面は、
(a) -浮遊培養での増殖に適応しており、
-無血清培地での増殖に適応しており、
-マイコプラズマを含まず、かつ
- 任意のウイルスを含まない、
CHO細胞を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

(a)-浮遊培養での増殖に適応しており、 -無血清培地での増殖に適応しており、 -マイコプラズマを含まない、CHO細胞を提供する段階、(b) -原核生物複製起点、- 原核生物選択剤に対する耐性を付与する第一の核酸配列、-異種免疫グロブリン重鎖をコードする第二の核酸配列、および異種免疫グロブリンの軽鎖をコードする第三の核酸配列を含む核酸を提供する段階であって、ここで、該提供する核酸と、第一の真核生物選択剤に対する耐性を付与するさらなる第四の核酸配列とを含む、第一のトランスフェクションベクターを提供し、ここで、該提供する核酸と、該第一の真核生物選択剤とは異なる第二の真核生物選択剤に対する耐性を付与するさらなる第四の核酸配列とを含む、第二のトランスフェクションベクターを提供する、段階、(c)(i) 該第一のトランスフェクションベクターを該CHO細胞にトランスフェクトする段階、 (ii) 第一のトランスフェクションベクターが耐性を付与する第一の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖により、(i)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階、 (iii) 該第二のトランスフェクションベクターを、(ii)において選択された該CHO細胞にトランスフェクトする段階、 (iv) 第一のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第一の真核生物選択剤、および第二のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第二の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖により、(iii)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階を以上の順序で含む、該CHO細胞をトランスフェクトする段階、(d) 該第二および/または第三の核酸の発現に適した条件の下で、該第一および該第二の真核生物選択剤の存在している培地中で、該トランスフェクトされたCHO細胞を培養する段階、(e)分泌された異種免疫グロブリンを培養培地から回収し、それによって、培養培地に分泌される異種免疫グロブリンをCHO細胞において産生する段階を含む、CHO細胞における培養培地に分泌される異種免疫グロブリンの組み換え産生のための方法。

請求項2

CHO細胞がCHO K1細胞、またはCHO DG44細胞、またはCHO XL99細胞、またはCHO DXB11細胞、またはCHODP12細胞であることを特徴とする、請求項1記載の方法。

請求項3

第二および/または第三の核酸が雑種イントロン核酸配列(hybrid intronic nucleic acid sequence)を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。

請求項4

第一のトランスフェクションベクターおよび第二のトランスフェクションベクターが、真核生物選択剤に対する耐性を付与する核酸だけが異なることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。

請求項5

段階(b)の後に段階(b1):(b1) -原核生物の複製起点、 - 原核生物選択剤に対する耐性を付与する第一の核酸配列、 -異種免疫グロブリンの重鎖をコードする第二の核酸配列、および/または異種免疫グロブリンの軽鎖をコードする第三の核酸配列を含む核酸を提供する段階であって、ここで、該提供する核酸と、第一の真核生物選択剤とは異なり、第二の真核生物選択剤とも異なる第三の真核生物選択剤に対する耐性を付与するさらなる第四の核酸配列とを含む、第三のトランスフェクションベクターを提供する、段階をさらに含み、かつ段階(c) (iv)の後に以下の段階(v)および(vi):(v) 該第三のトランスフェクションベクターを、(iv)において選択されたCHO細胞にトランスフェクトする段階、(vi) 第一のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第一の真核生物選択剤、および第二のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第二の真核生物選択剤、および第三のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第三の真核生物選択剤を含有する培養培地における選択増殖により、(v)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階をさらに含み、かつ段階(d)において、トランスフェクトされたCHO細胞を培養するための培地が第三の真核生物選択剤をさらに含むことをさらに含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。

請求項6

段階(c)および段階(d)が同じ培地中で行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。

請求項7

培地が、無血清培地、または確定された動物由来成分を補充した無血清培地、または動物由来成分を含まない培地、または無タンパク質培地、確定された動物由来成分を補充した無タンパク質培地、または確定された無タンパク質培地、または化学合成培地であることを特徴とする、請求項6記載の方法。

請求項8

段階(d)において、培養する段階が500リットル未満の容積中、真核生物選択剤の存在下におけるものであること、および培養する段階が500リットル以上の容積中、真核生物選択剤の非存在下におけるものであること、および分泌された異種免疫グロブリンの回収が該真核生物選択剤を含まない培養培地からであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。

請求項9

CHO細胞の産生性が、分割バッチ(split-batch)培養としての10世代の培養後、40世代にわたり70%以上かつ130%以下の産生性であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。

請求項10

CHO細胞の産生性が、流加培養としての21日以内において、異種免疫グロブリンについて少なくとも1.5 g/lであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。

請求項11

(f)異種免疫グロブリンを一つまたは複数のクロマトグラフィー段階により精製する段階をさらに含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。

請求項12

段階(c)のトランスフェクトされたCHO細胞が、-部分段階(ii)において選択されたCHO細胞の倍加時間の150%以下の倍加時間、- (ii)において選択されたCHO細胞の容積収量と比べて少なくとも125%の容積収量を有することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。

請求項13

異種免疫グロブリンが抗Aβ抗体であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。

請求項14

異種免疫グロブリンが抗P-セレクチン抗体であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。

請求項15

異種免疫グロブリンが抗IL-13Rα抗体であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。

請求項16

異種免疫グロブリンが抗CD4抗体コンジュゲートであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。

請求項17

以下の方法:(a) -浮遊培養での増殖に適応しており、-無血清培地での増殖に適応しており、-マイコプラズマを含まない、CHO細胞を提供する段階、(b) -原核生物の複製起点、- 原核生物選択剤に対する耐性を付与する第一の核酸配列、-異種免疫グロブリンの重鎖をコードする第二の核酸配列、および異種免疫グロブリンの軽鎖をコードする第三の核酸配列を含む核酸を提供する段階であって、ここで、該提供する核酸と、第一の真核生物選択剤に対する耐性を付与するさらなる第四の核酸配列とを含む、第一のトランスフェクションベクターを提供し、ここで、該提供する核酸と、該第一の真核生物選択剤とは異なる第二の真核生物選択剤に対する耐性を付与するさらなる第四の核酸配列とを含む、第二のトランスフェクションベクターを提供する、段階、(c)(i) 該第一のトランスフェクションベクターを該CHO細胞にトランスフェクトする段階、 (ii) 第一のトランスフェクションベクターが耐性を付与する第一の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖により、(i)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階、 (iii) 該第二のトランスフェクションベクターを(ii)において選択された該CHO細胞にトランスフェクトする段階、 (iv) 第一のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第一の真核生物選択剤、および第二のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第二の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖により、(iii)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階を以上の順序で含む、該CHO細胞をトランスフェクトする段階により得ることができる、CHO細胞。

請求項18

請求項1〜12のいずれか一項記載の方法により産生される抗Aβ抗体。

請求項19

請求項1〜12のいずれか一項記載の方法により産生される抗P-セレクチン抗体。

請求項20

請求項1〜12のいずれか一項記載の方法により産生される抗IL-13Rα抗体。

請求項21

請求項1〜12のいずれか一項記載の方法により産生される抗CD4抗体コンジュゲート。

技術分野

0001

本発明はポリペプチド産生の分野に関する。より正確には、関心対象免疫グロブリン発現カセットをそれぞれが含んだ異なるベクタートランスフェクトされている哺乳類細胞における、免疫グロブリンの産生について報告する。

背景技術

0002

発明の背景
組み換えポリペプチドの産生のための発現系は、当技術分野の現況においては周知であり、例えば、Marino, M. H., Biopharm. 2 (1989) 18-33(非特許文献1); Goeddel, D.V., et al., MethodsEnzymol. 185 (1990) 3-7(非特許文献2); Wurm, F., and Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159(非特許文献3)によって記述されている。薬学的用途に用いるためのポリペプチドは、好ましくは、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、COS細胞HEK細胞BHK細胞、PER.C6(登録商標)細胞などのような、哺乳類細胞において産生される。発現プラスミド必須要素は、例えば大腸菌(E.coli)の場合、原核生物複製起点および原核生物の選択マーカーを含む、原核生物のプラスミド増殖単位、真核生物の選択マーカー、ならびに、プロモーター構造遺伝子およびポリアデニル化シグナルを含んだ転写ターミネーターをそれぞれが含む、関心対象の構造遺伝子の発現のための一つまたは複数の発現カセットである。哺乳類細胞における一過性発現のために、SV40OriまたはOriPなどの、哺乳類の複製起点を含めることができる。プロモーターとして、構成的または誘導性プロモーターを選択することができる。転写の最適化のために、コザック(Kozak)配列を5'非翻訳領域に含めることができる。mRNAプロセッシング、特にmRNAスプライシングおよび転写終結のため、構造遺伝子の構造(エキソン/イントロン構造)に依るmRNAスプライシングシグナル、ならびにポリアデニル化シグナルを含めることができる。

0003

遺伝子の発現は一過性の発現としてまたは永続性の発現として行われる。関心対象のポリペプチドは、概して、分泌ポリペプチドであり、それゆえ、細胞を通じた細胞外培地へのポリペプチドの輸送/分泌に必要なN末端伸長部(シグナル配列としても公知)を含む。一般に、シグナル配列は、分泌ポリペプチドをコードする任意の遺伝子に由来することができる。異種のシグナル配列が使われるなら、それは宿主細胞により認識されプロセッシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される)ものであることが好ましい。酵母での分泌のためには、例えば、発現される異種遺伝子天然のシグナル配列を、酵母インベルターゼシグナル配列、α因子リーダー(サッカロマイセス(Saccharomyces)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)およびハンゼヌラ(Hansenula)α-因子リーダーを含む、二つ目は米国特許第5,010,182号(特許文献1)に記述されている)、酸性ホスファターゼシグナル配列、またはC.アルビカンス(C. albicans)グルコアミラーゼシグナル配列(EP 0 362 179(特許文献2))などの、分泌遺伝子に由来する同種の酵母シグナル配列によって置換することができる。哺乳類細胞発現では、関心対象のタンパク質の天然のシグナル配列は十分ではあるが、例えばヒトまたはマウス由来の免疫グロブリンのための、同じまたは関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、およびウイルス分泌シグナル配列、例えば、単純ヘルペス糖タンパク質Dシグナル配列などの、他の哺乳類シグナル配列が適当でありうる。そのようなプレセグメントをコードするDNA断片は、関心対象のポリペプチドをコードするDNA断片にインフレームライゲーションされる。

0004

今日、CHO細胞は薬学的ポリペプチドの発現のために、実験室において小規模で、または生産過程において大規模で、広く使われている。CHO細胞の特徴的な特性および遺伝的な背景は、それが広く普及し用いられているため、周知である。それゆえ、CHO細胞は規制当局によって、ヒトに適用するための治療用タンパク質の産生が承認されている。

0005

EP 0 569 678(特許文献3)には、腫瘍転移免疫学的予防のための細胞性ワクチンとしてMHC遺伝子の二重形質移入体が報告されている。WO 97/08342(特許文献4)には、レポーター遺伝子を用いて哺乳類細胞におけるプロモーター配列活性を測定するための改良法が報告されている。WO 2005/113770(特許文献5)には、RhoAまたはRhoCの合成を特異的に阻害するために抗RhoA siRNAおよび抗RhoC siRNAを用いることが報告されている。米国特許第7,202,072号(特許文献6)には、酵母細胞における真核生物のアルカリホスファターゼ変異体の組み換え産生または発現のための方法が報告されている。WO 2001/038557(特許文献7)には、蛍光タンパク質の2シストロン性の発現を用いて多重形質転換された細胞をスクリーニングする方法が報告されている。WO 1999/47647(特許文献8)には、関心対象の複数のタンパク質またはRNAを発現する組み換え真核細胞株を作出するための方法が報告されている。WO 2003/076588(特許文献9)には、コード化された担体を用いたトランスフェクション材料による細胞のトランスフェクションのための、方法を含めた、系、組成物およびキットが報告されている。米国特許第5,089,397号(特許文献10)には、ヒトメタロチオネイン-IIプロモーターの制御下に所望のタンパク質をコードしている配列を持ったDNA配列で形質転換されたCHO細胞を含む、所望のタンパク質の組み換え産生のための発現系が報告されている。米国特許第2003/0040047号(特許文献11)には、組み換えタンパク質を産生するための方法が報告されている。Lamangoら(Lamango, N.S., et al., Arch. Biochem. Biophys. 330 (1996) 238-250(非特許文献4))は、プロホルモン転換酵素2の産生が神経内分泌ポリペプチド7B2の存在に依存していることを報告している。Waldenstroem, M., et al., Gene 120 (1992) 175-181(非特許文献5)により、非組込型複製性BPV-Iゲノムを内部に持った細胞へのBPV-Iに基づく発現ベクターのトランスフェクションが報告されている。米国特許第4,912,038号(特許文献12)には、イヌおよびヒト32K肺サーファクタントタンパク質を得るための方法およびベクターが報告されている。WO 89/10959(特許文献13)には、遺伝子操作されている真核細胞における哺乳類ポリペプチドの発現および組み換えDNA技術が報告されている。DD287531(特許文献14)には、ヒト成長ホルモンのための発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子のための発現ベクターの繰り返し同時移入が報告されている。

0006

米国特許第5,010,182号
EP 0 362 179
EP 0 569 678
WO 97/08342
WO 2005/113770
米国特許第7,202,072号
WO 2001/038557
WO 1999/47647
WO 2003/076588
米国特許第5,089,397号
米国特許第2003/0040047号
米国特許第4,912,038号
WO 89/10959
DD287531

先行技術

0007

Marino, M. H., Biopharm. 2 (1989) 18-33
Goeddel, D.V., et al., MethodsEnzymol. 185 (1990) 3-7
Wurm, F., and Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159
Lamango, N.S., et al., Arch. Biochem. Biophys. 330 (1996) 238-250
Waldenstroem, M., et al., Gene 120 (1992) 175-181

0008

本発明の第一の局面は、
(a) -浮遊培養での増殖に適応しており、
-無血清培地での増殖に適応しており、
-マイコプラズマを含まず、かつ
- 任意のウイルスを含まない、
CHO細胞を提供する段階、
(b) -原核生物の複製起点、
- 原核生物選択剤に対する耐性を付与する第一の核酸配列
-異種免疫グロブリン重鎖をコードする第二の核酸配列、および/または異種免疫グロブリンの軽鎖をコードする第三の核酸配列、
を含む核酸を提供する段階であって、
ここで、該第一のならびに該第二のおよび/または第三の核酸と、第一の真核生物選択剤に対する耐性を付与するさらなる第四の核酸配列とを含む、該提供する核酸を含んだ第一のトランスフェクションベクターを提供し、かつ
ここで、第一のトランスフェクションベクターに含まれる該提供する核酸におけるものと同一の第一のならびに第二のおよび/または第三の核酸と、該第一の真核生物選択剤とは異なる第二の真核生物選択剤に対する耐性を付与する、該第一のトランスフェクションベクターにおける第四の核酸配列とは異なるさらなる第四の核酸配列とを含む、該提供する核酸を含んだ第二のトランスフェクションベクターを提供する、段階、
(c)(i) 該第一のトランスフェクションベクターを該CHO細胞にトランスフェクトする段階、
(ii) 第一のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第一の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖により(i)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階、
(iii) 該第二のトランスフェクションベクターを(ii)において選択された該CHO細胞にトランスフェクトする段階、
(iv) 該第一のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第一の真核生物選択剤を含有し、かつ該第二のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第二の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖により、(iii)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階
を以上の順序で含む、段階(b)のトランスフェクションベクターを該提供するCHO細胞にトランスフェクトする段階、および該トランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階、
(d) 該第二および/または第三の核酸の発現に適した条件の下において、該第一および第二の真核生物選択剤を含有する培地中で、段階(c)でトランスフェクトされかつ選択されたCHO細胞を培養する段階、
(e)分泌された異種免疫グロブリンを培養培地から回収し、それによって、培養培地に分泌される異種免疫グロブリンをCHO細胞において産生する段階
を含む、
CHO細胞における培養培地に分泌される異種免疫グロブリンの組み換え産生のための方法である。

0009

本発明による方法の一つの態様において、CHO細胞はCHO K1細胞、またはCHO DG44細胞、またはCHO XL99細胞、またはCHO DXB11細胞、またはCHODP12細胞である。別の態様において、第二および第三の核酸の転写に利用されるプロモーターは、第四の核酸の転写に利用されるプロモーターとは異なる。さらなる態様は、第二および第三の核酸の転写に利用されるプロモーターが同じであるというものである。一つの態様において、第二および第三の核酸の転写に利用されるプロモーターはCMVプロモーターである。別の態様において、第四の核酸の転写に利用されるプロモーターはSV40プロモーターである。一つの態様において、異種免疫グロブリンは抗Aβ抗体である。例示的な抗Aβ抗体は、例えば、WO 2003/070760に報告されている。

0010

一つの態様において、段階(c) (ii)および/または(iv)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階は、選択剤不含の培養培地中での10〜72時間の増殖の後、(ii)の場合には第一の真核生物選択剤または(iv)の場合には第一および第二の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖によるものである。

0011

さらなる態様において、第二および第三の核酸のコドン使用頻度は、CHO細胞における翻訳のために最適化される。また、一つの態様は、第二および/または第三の核酸がイントロン核酸配列を含むというものである。別の態様では、第一のトランスフェクションベクターおよび第二のトランスフェクションベクターは、真核生物選択剤に対する耐性を付与する核酸だけが、すなわち、第四の核酸だけが異なり、他の点では、核酸配列に基づき少なくとも95%同一であることを含む。別の態様において、トランスフェクションベクターは、第一、第二および第三の真核生物選択剤に対する耐性を付与する核酸だけが各々異なる。

0012

一つの態様において、前記の方法は、
段階(b)の後に段階(b1):
(b1) -原核生物の複製起点、
- 原核生物選択剤に対する耐性を付与する第一の核酸配列、
-異種免疫グロブリンの重鎖をコードする第二の核酸配列、および/または異種免疫グロブリンの軽鎖をコードする第三の核酸配列
を含む核酸を提供する段階であって、
ここで、第一および第二のトランスフェクションベクターに含まれる該提供する核酸におけるものと同一の第一のならびに第二のおよび/または第三の核酸と、第一の真核生物選択剤とは異なり、第二の真核生物選択剤とも異なる第三の真核生物選択剤に対する耐性を付与する、第一および第二のトランスフェクションベクターにおける第四の核酸とは異なるさらなる第四の核酸配列とを含む、該提供する核酸を含んだ第三のトランスフェクションベクターを提供する、段階
をさらに含み、
かつ段階(c) (iv)の後に以下の段階(v)および(vi)
(v) 該第三のトランスフェクションベクターを(iv)において選択されたCHO細胞にトランスフェクトする段階、
(vi) 第一のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第一の真核生物選択剤および第二のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第二の真核生物選択剤および第三のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第三の真核生物選択剤を含有する培養培地における選択増殖により、(v)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階
をさらに含み、
かつさらに、段階(d)においてトランスフェクトされたCHO細胞を培養するための培地が該第一、第二および第三の真核生物選択剤を含む。

0013

一つの態様において、段階(c) (vi)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階は、選択剤不含の培養培地中での10〜72時間の増殖の後、第一および第二および第三の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖によるものである。

0014

別の態様において、本発明による方法はさらなる段階
(f) 段階(e)の組み換えにより産生され回収された異種免疫グロブリンを一つまたは複数のクロマトグラフィー段階により精製する段階
を含む。

0015

一つの態様は、段階(c)および段階(d)が同じ培地中で行われるというものである。別の態様は、培地が無血清培地、または確定された動物由来成分を補充した無血清培地、または動物由来成分を含まない培地、または無タンパク質培地、または化学合成培地、または確定された無タンパク質培地であるというものである。段階(d)におけるさらなる態様においては、培養する段階が500リットル未満の容積中、真核生物選択剤の存在下におけるものであり、かつ培養する段階が500リットル以上の容積中、真核生物選択剤の非存在下におけるものであり、ここで、分泌された異種免疫グロブリンの回収が該真核生物選択剤を含まない培養培地からであるものである。さらなる態様において、段階(d)における培養する段階は、事前に設定された最終の培養容積までの培養容積の増大をそれぞれが伴う連続的な培養を含んでおり、ここで、培養は、真核生物選択剤の存在下において最終培養の培養容積の1% (v/v)の培養容積まで行われ、かつ真核生物選択剤の非存在下において最終培養の培養容積の1% (v/v)超の培養容積で行われる。

0016

一つの態様において、CHO細胞の産生性は、分割バッチ(split-batch)培養としての10世代の培養後、40世代にわたり70%以上かつ130%以下の産生性である。別の態様において、CHO細胞の産生性は、分割バッチ培養としての10世代の培養後、60世代にわたり50%以上かつ150%以下の産生性である。さらなる態様において、CHO細胞の産生性は、流加培養として21日以内に異種免疫グロブリンについて少なくとも1.5 g/lである。

0017

本発明の第二の局面は、以下の方法:
(a) -浮遊培養での増殖に適応しており、
-無血清培地での増殖に適応しており、
-マイコプラズマを含まず、かつ
- 任意のウイルスを含まない、
CHO細胞を提供する段階、
(b) -原核生物の複製起点、
- 原核生物選択剤に対する耐性を付与する第一の核酸配列、
-異種免疫グロブリンの重鎖をコードする第二の核酸配列、および/または異種免疫グロブリンの軽鎖をコードする第三の核酸配列、
を含む核酸を提供する段階であって、
ここで、該第一のならびに第二のおよび/または第三の核酸と、第一の真核生物選択剤に対する耐性を付与するさらなる第四の核酸配列とを含む、該提供する核酸を含んだ第一のトランスフェクションベクターを提供し、かつ
ここで、第一のトランスフェクションベクターに含まれる該提供する核酸におけるものと同一の第一のならびに第二のおよび/または第三の核酸と、該第一の真核生物選択剤とは異なる第二の真核生物選択剤に対する耐性を付与する、該第一のトランスフェクションベクターにおける第四の核酸配列とは異なるさらなる第四の核酸配列とを含む、該提供する核酸を含んだ第二のトランスフェクションベクターを提供する、段階、
(c)(i) 該第一のトランスフェクションベクターを該CHO細胞にトランスフェクトする段階、
(ii) 第一のトランスフェクションベクターが耐性を付与する第一の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖により(i)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階、
(iii) 該第二のトランスフェクションベクターを(ii)において選択された該CHO細胞にトランスフェクトする段階、
(iv) 第一のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第一の真核生物選択剤、および第二のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第二の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖により(iii)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階
を以上の順序で含む、該CHO細胞をトランスフェクトする段階
により得ることができるCHO細胞である。

図面の簡単な説明

0018

プラスミドp5128の注釈付きプラスミドマップ
プラスミドp5137の注釈付きプラスミドマップ。
プラスミドp5151の注釈付きプラスミドマップ。
プラスミドp5057の注釈付きプラスミドマップ。
プラスミドp5069の注釈付きプラスミドマップ。
(A)サブクローニング後に限界希釈法で得たクローンおよび本発明による方法で得たクローンの抗体力価; X軸: (1) G24、(2)限界希釈、(3) 本発明による方法; Y軸:免疫グロブリン濃度[μg/ml]。(B) サブクローニング後に限界希釈法で得たクローンおよび本発明による方法で得たクローンの特異的な産生率; X軸: (1) G24、(2) 限界希釈、(3) 本発明による方法; Y軸: 特異的な産生率[pg/d*細胞]。
抗体のプロテインAHPLC精製後のSDS-Page。四種のサンプル35-45、37-65、39-4および43-16の場合、二本のバンドが目に見え、上側のバンドが重鎖であり、下側が軽鎖である。サンプル25g7は、抗体に関連する副産物(重鎖の上および重鎖と軽鎖の間)を有する対照抗体である。サンプル: (1)分子量マーカー、(2) 35-45、(3) 37-65、(4) 39-4、(5) 43-16)、(6) 25g7、(7)参照基準抗体、(8)培地25×。
プラスミドp6311の注釈付きプラスミドマップ。
プラスミドp5321の注釈付きプラスミドマップ。

実施例

0019

発明の詳細な説明
本発明を実行するのに有用である、当業者に公知の方法および技術は、例えば、Ausubel, F. M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I〜III (1997), Wiley and Sons; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記述されている。

0020

一般的なクロマトグラフィー法およびそれらの使用法は当業者に公知である。例えば、

を参照されたい。

0021

組み換えにより産生された異種免疫グロブリンの精製のためには、異なるカラムクロマトグラフィー段階の組み合わせが利用されることが多い。一般的に、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーに続いてさらに一つまたは二つの分離工程が行われる。最終の精製工程は、凝集した免疫グロブリン、残存するHCP (宿主細胞タンパク質)、DNA (宿主細胞核酸)、ウイルスまたは内毒素のような微量不純物および夾雑物の除去のためのいわゆる「最終精製(polishing)工程」である。この最終精製工程のためには、流入式の陰イオン交換物質が用いられることが多い。

0022

微生物タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー(例えばプロテインAまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィー)、イオン交換クロマトグラフィー(例えば陽イオン交換(カルボキシメチル樹脂)、陰イオン交換(アミノエチル樹脂)および混合モード交換)、硫黄親和性(thiophilic)吸着(例えばβ-メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを用いる)、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー(例えばフェニル-セファロースアザ-アレノフィリック(aza-arenophilic)樹脂またはm-アミノフェニルボロン酸を用いる)、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー(例えばNi(II)およびCu(II)-アフィニティー物質を用いる)、サイズ排除クロマトグラフィーならびに電気泳動法(ゲル電気泳動キャピラリー電気泳動など)のような、種々の方法がタンパク質の回収および精製のために十分に確立され、広く使われている(Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。

0023

本出願のなかで用いられる「アミノ酸」という用語は、カルボキシα-アミノ酸の群を意味し、これらは直接的にまたは前駆体の形態で核酸によりコードされ得る。個々のアミノ酸は、3つのヌクレオチド、いわゆるコドンまたは塩基トリプレットからなる核酸によってコードされる。各アミノ酸は少なくとも1種のコドンによってコードされる。異なるコドンによる同一アミノ酸のコード化は「遺伝暗号縮重」として公知である。本出願のなかで用いられる「アミノ酸」という用語は、天然のカルボキシα-アミノ酸を意味し、アラニン(3文字表記: ala、1文字表記: A)、アルギニン(arg、R)、アスパラギン(asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(cys、C)、グルタミン(gln、Q)、グルタミン酸(glu、E)、グリシン(gly、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(ile、I)、ロイシン(leu、L)、リジン(lys、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(phe、F)、プロリン(pro、P)、セリン(ser、S)、トレオニン(thr、T)、トリプトファン(trp、W)、チロシン(tyr、Y)、およびバリン(val、V)を含んでいる。

0024

本出願のなかで互換的に用いられる用語「核酸」または「核酸配列」とは、個々のヌクレオチド(塩基とも呼ばれる) a、c、gおよびt (またはRNAではu)からなる重合体分子をいい、例えばDNA、RNAまたはそれらの修飾体をいう。このポリヌクレオチド分子は、天然ポリヌクレオチド分子もしくは合成ポリヌクレオチド分子または一つもしくは複数の天然ポリヌクレオチド分子と一つもしくは複数の合成ポリヌクレオチド分子との組み合わせでありうる。この定義によって同様に包含されるのは、一つまたは複数のヌクレオチドが変化している(例えば突然変異誘発により)、欠失している、または付加されている、天然ポリヌクレオチド分子である。核酸は、単離されているか、または別の核酸に、例えば発現カセット、プラスミドもしくは宿主細胞の染色体に組み込まれているかのどちらかでありうる。核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって特徴付けられる。

0025

当業者には、例えばポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換する手順および方法が周知である。それゆえ、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって、および同じくそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列によって特徴付けられる。

0026

「ポリペプチド」とは、天然に産生されたかまたは合成により産生されたかを問わず、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸からなる重合体である。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドは「ペプチド」ということができるが、二種もしくはそれ以上のポリペプチドからなる分子、または100アミノ酸残基超の一種のポリペプチドを含む分子は「タンパク質」ということができる。ポリペプチドは、炭水化物基(carbohydrate group)、金属イオン、またはカルボン酸エステルなどの非アミノ酸成分を含むこともできる。非アミノ酸成分は、ポリペプチドが発現される細胞によって付加され、細胞の種類によって変化しうる。ポリペプチドは、そのアミノ酸骨格構造またはそれをコードする核酸という観点から本明細書において定義される。炭水化物基などの付加物は、ほとんどの場合に明記されないが、それでも存在してもよい。

0027

「免疫グロブリン」という用語は、完全な免疫グロブリンおよび免疫グロブリンコンジュゲートを含むさまざまな形態の免疫グロブリン構造を包含する。本発明において利用される免疫グロブリンは、好ましくはヒト抗体、またはヒト化抗体、またはキメラ抗体、またはT細胞抗原を除去した抗体である(例えばWO 98/33523、WO 98/52976およびWO 00/34317を参照のこと)。抗体の遺伝子操作は、例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; 米国特許第5,202,238号および米国特許第5,204,244号; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125に記述されている。免疫グロブリンは、例えば、Fv、FabおよびF(ab)2ならびに一本鎖(scFv)または二重特異性抗体を含む、種々の型で存在することができる(例えばHuston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; 概論としては、Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984); およびHunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16)。

0028

「完全な免疫グロブリン」という用語は、二本のいわゆる軽鎖および二本のいわゆる重鎖を含む免疫グロブリンを意味する。完全な免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の各々が、抗原相互作用することが可能な結合領域を含んだ可変ドメイン(可変領域) (一般にポリペプチド鎖アミノ末端部分)を含む。完全な免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の各々が定常領域(一般にカルボキシル末端部分)を含む。重鎖の定常領域は、抗体の、i)食細胞などの、Fcγ受容体(FcγR)を有している細胞との結合、またはii) Brambell受容体としても公知の新生児Fc受容体(FcRn)を有している細胞との結合を媒介する。それは、構成成分(component)(C1q)のような古典的補体系の因子を含む一部の因子との結合も媒介する。免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なるセグメント、すなわち四つのフレームワーク領域(FR)および三つの超可変領域(CDR)を含む。

0029

「免疫グロブリンコンジュゲート」という用語は、ペプチド結合を介してさらなるポリペプチドに結合された免疫グロブリン重鎖または軽鎖の少なくとも一つのドメインを含むポリペプチドを意味する。さらなるポリペプチドは、非免疫グロブリンペプチド、例えばホルモン、または増殖受容体、または抗融合ペプチド、または補体因子などである。例示的な免疫グロブリンコンジュゲートはWO 2007/045463に報告されている。

0030

「異種免疫グロブリン」という用語は、哺乳類細胞または宿主細胞によって天然には産生されない免疫グロブリンを意味する。本発明の方法によって産生される免疫グロブリンは、組み換え手段によって産生される。そのような方法は、当技術分野の現況においては広く知られており、真核細胞におけるタンパク質の発現を、その後の、異種免疫グロブリンの回収および単離、ならびに通常は薬学的に許容される純度までの精製とともに含む。免疫グロブリンの産生、すなわち発現のため、軽鎖をコードする核酸および重鎖をコードする核酸を、標準的な方法により発現カセットにそれぞれ挿入する。免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードする核酸は、従来の手順を用いて容易に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのような核酸の供給源となりうる。発現カセットは発現プラスミドに挿入することが可能であり、これを次に、他の形では免疫グロブリンを産生しない宿主細胞にトランスフェクトする。適切な原核または真核宿主細胞において発現を実施し、溶解後の細胞からまたは培養上清から免疫グロブリンを回収する。

0031

「単離されたポリペプチド」とは、本来ポリペプチドと結び付いている炭化水素、脂質、または他のタンパク質性不純物のような、夾雑細胞成分を本質的に含んでいないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形態、すなわち少なくとも約80%純粋、少なくとも約90%純粋、少なくとも約95%純粋、95%超純粋、または99%超純粋のポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が、単離されたポリペプチドを含むことを示す一つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルクマシーブリリアンブルー染色後の単一バンド出現によるものである。しかしながら、「単離された」という用語は、同一のポリペプチドが二量体または選択的にグリコシル化もしくは誘導体化された形態のような、別の物理的な形で存在することを除外するものではない。

0032

「異種DNA」または「異種ポリペプチド」とは、所与の宿主細胞の内部に天然では存在しない、DNA分子もしくはポリペプチド、またはDNA分子の集団もしくはポリペプチドの集団をいう。特定の宿主細胞に対して異種であるDNA分子には、宿主DNAが非宿主DNA (すなわち外因性DNA)と組み合わされている限り、宿主細胞種に由来するDNA (すなわち内因性DNA)を含めてもよい。例えば、プロモーターを含む宿主DNAセグメントに機能的に連結されているポリペプチドをコードする非宿主DNAセグメントを含むDNA分子は、異種DNA分子であるとみなされる。その反対に、異種DNA分子は、外因性プロモーターと機能的に連結された内因性構造遺伝子を含むこともできる。

0033

非宿主DNA分子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。

0034

「細胞」または「宿主細胞」という用語は、例えば異種ポリペプチドをコードする核酸がトランスフェクトされうるまたはされる細胞をいう。「細胞」という用語は、プラスミドの増殖に使われる原核細胞も、核酸の発現およびコードされるポリペプチドの産生に使われる真核細胞もともに含む。一つの態様において、真核細胞は哺乳類細胞である。別の態様において、哺乳類細胞はCHO細胞、好ましくはCHO K1細胞(ATCCCCL-61もしくはDSMACC110)、またはCHO DG44細胞(CHO-DHFR[-]、DSM ACC 126としても公知)、またはCHO XL99細胞、CHO-T細胞(例えばMorgan, D., et al., Biochemistry 26 (1987) 2959-2963を参照のこと)、またはCHO-S細胞、またはSuper-CHO細胞(Pak, S. C. O., et al. Cytotechnology. 22 (1996) 139-146)である。これらの細胞が無血清培地での増殖または浮遊状態での増殖に適応していなければ、本方法での使用前の適応が実施されなければならない。本明細書において用いられる場合、「細胞」という表現は、対象細胞およびその子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、初代対象細胞およびそこより得られる培養物を、継代(transfer)または継代培養(subcultivation)の数に関係なく含む。意図的または偶発的な突然変異により、全ての子孫はDNA含量が正確に同一ではないかもしれないことも理解されたい。元の形質転換細胞中でスクリーニングされたものと同じ機能または生物活性を有する変種子孫が含まれる。

0035

本明細書において用いられる「発現」という用語は、細胞内で起こる転写および/または翻訳過程をいう。細胞における関心対象の核酸配列の転写レベルは、細胞に存在している対応するmRNAの量に基づいて判定することができる。例えば、関心対象の配列から転写されたmRNAは、RT-PCRによりまたはノザンハイブリダイゼーションにより定量化することができる(Sambrook, et al., 1989, 前記を参照のこと)。関心対象の核酸によってコードされるポリペプチドは、ポリペプチドを認識し、かつそれに結合する免疫グロブリンを用いて、種々の方法により、例えばELISAにより、ポリペプチドの生物活性をアッセイすることにより、またはウエスタンブロッティングもしくは放射免疫アッセイなどの、そのような活性とは無関係のアッセイ法を利用することにより定量化することができる(Sambrook, et al., 1989, 前記を参照のこと)。

0036

「発現カセット」とは、少なくとも細胞に含まれる核酸の発現のために、プロモーターおよびポリアデニル化部位などの、必要な調節要素を含んだ構築体をいう。

0037

「トランスフェクションベクター」とは、トランスフェクションベクターに含まれるコード核酸/構造遺伝子の宿主細胞での発現に必要な全ての要素を与える核酸(核酸分子とも表される)である。トランスフェクションベクターは、例えば大腸菌の場合、原核生物の複製起点、および原核生物選択剤に対する耐性を付与する核酸を順に含んだ、原核生物のプラスミド増殖単位を含み、トランスフェクションベクターは、真核生物選択剤に対する耐性を付与する一つもしくは複数の核酸、および関心対象のポリペプチドをコードする一つもしくは複数の核酸をさらに含む。各々がプロモーター、コード核酸、およびポリアデニル化シグナルを含んだ転写ターミネーターを含む発現カセットのなかに、それぞれ選択剤に対する耐性を付与する核酸および関心対象のポリペプチドをコードする核酸が配置されることが好ましい。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれ、そのような構造遺伝子はプロモーター「に機能的に連結されている」といわれる。同様に、調節要素がコアプロモーターの活性を調節する場合、調節要素およびコアプロモーターは機能的に連結されている。

0038

「プロモーター」とは、それに機能的に連結されている遺伝子/構造遺伝子または核酸配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列をいう。プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および転写開始のためのシグナルを含む。使われるプロモーターは、選択された配列の発現を企図している宿主細胞の細胞種において機能すると考えられる。種々の異なる供給源由来の構成的、誘導性および抑制性プロモーターを含めて多数のプロモーターが当技術分野において周知であり(かつGenBankなどのデータベースにおいて特定されており)、クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチドの中で(例えば、ATCCなどの寄託機関および他の商業的または個別的な供給源から)入手可能である。「プロモーター」は、機能的に連結された構造遺伝子の転写を指令するヌクレオチド配列を含む。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近くの、遺伝子5'非コード領域または非翻訳領域に位置している。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、共通ヌクレオチド配列によって特徴付けられることが多い。これらのプロモーター要素には、RNAポリメラーゼ結合部位TATA配列、CAAT配列、分化特異的要素(DSE; McGehee, R.E., et al., Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551-560)、環状AMP応答要素(CRE)、血清応答要素(SRE; Treisman, R., Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47-58)、グルココルチコイド応答要素(GRE)、ならびにCRE/ATF (O'Reilly, M.A., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938-19943)、AP2 (Ye, J., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728-25734)、SP1、cAMP応答要素結合タンパク質(CREB; Loeken, M. R., Gene Expr. 3 (1993) 253-264)およびオクタマー因子(概論としては、Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987)、およびLemaigre, F. P. and Rousseau, G. G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14を参照のこと)などの、他の転写因子のための結合部位が含まれる。高レベル発現のための強力なプロモーターと特定されている真核生物プロモーターには、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターマウスメタロチオネイン-Iプロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列チャイニーズハムスター伸長因子1α(CHEF-1、例えば米国特許第5,888,809号を参照のこと)、ヒトEF-1α、ユビキチンおよびヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター(CMVIE)がある。

0039

「プロモーター」は構成的であっても誘導性であってもよい。エンハンサー(すなわち、プロモーターに作用して転写を増大させるシス作用性DNA要素)は、プロモーターとともに機能して、プロモーターのみによって得られるよりも発現レベルを高めるために必要になることもあり、転写調節要素として含まれうる。多くの場合、プロモーターを含むポリヌクレオチドセグメントは、エンハンサー配列(例えば、CMVまたはSV40)も同様に含むであろう。

0040

本明細書において用いられる「エンハンサー」とは、それに機能的に連結されている遺伝子またはコード配列の転写を増強するポリヌクレオチド配列をいう。プロモーターとは異なり、エンハンサーは方向および位置に対して比較的非依存性であり、転写単位の5'または3'側に(Lusky, M., et al., Mol. Cell Bio., 3 (1983) 1108-1122)、イントロン内に(Banerji, J., et al., Cell, 33 (1983) 729-740)およびコード配列それ自体の内部に(Osborne, T. F., et al., Mol. Cell Bio., 4 (1984) 1293-1305)見いだされている。それゆえ、エンハンサーは転写開始部位の上流もしくは下流に、またはプロモーターからかなりの距離のところに配置されてもよいが、実際のところ、エンハンサーはプロモーターと物理的かつ機能的に重複しうる。種々の異なる供給源由来の多数のエンハンサーが当技術分野において周知であり(かつGenBankなどのデータベースにおいて特定されており)、クローニングされたポリヌクレオチド配列としてまたはその中で(例えば、ATCCなどの寄託機関および他の商業的または個別的な供給源から)入手可能である。プロモーター配列(よく用いられるCMVプロモーターなどの)を含むいくつかのポリヌクレオチドは、エンハンサー配列も含む。例えば、上記の強力なプロモーターはすべて、強力なエンハンサーも含むことができる(例えばBendig, M., M., Genetic Engineering 7 (Academic Press, 1988) 91-127を参照のこと)。

0041

「選択剤に対する耐性を付与する核酸」とは、それを保有している細胞が選択剤の存在下で、それについて、またはそれに対して特異的に選択されるのを可能にする核酸である。そのような核酸は選択マーカーとも表される。典型的には、選択マーカーは選択剤(薬物)に対する耐性を付与するか、または宿主細胞での代謝的もしくは異化的な欠陥を補うであろう。選択マーカーは陽性陰性または二作用性であってよい。有用な陽性選択マーカー抗生物質耐性遺伝子である。この選択マーカーは、それによって形質転換された細胞が、対応する選択剤の存在下で、すなわち、例えば対応する抗生物質の存在下での選択増殖の下で陽性選択されるのを可能にする。非形質転換細胞培養液中の、選択的増殖条件の下で、すなわち、選択剤の存在下で増殖または生存することができない。陽性選択マーカーは、そのマーカーを保有する細胞の選択を可能とするのに対し、陰性選択マーカーは、そのマーカーを保有する細胞が選択的に取り除かれるのを可能にする。真核生物の選択マーカーには、例えば、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(APH) (例えばハイグロマイシン(hyg)、ネオマイシン(ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII、neo)およびG418などの選択剤に対する耐性を付与する)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR) (選択剤メトトレキサートに対する耐性を付与する)、チミジンキナーゼ(tk)、グルタミンシンテターゼ(GS)、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ(選択剤インドールに対する耐性を付与する)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(選択剤ヒスチジノールDに対する耐性を付与する)、シチジンデアミナーゼアデノシンデアミナーゼに対する遺伝子、ならびにピューロマイシンブレオマイシンフレオマイシンクロラムフェニコール、ゼオシン(Zeocin)およびミコフェノール酸に対する耐性を付与する核酸が含まれる。さらなる選択マーカー核酸は、例えば、WO 92/08796およびWO 94/28143に報告されている。原核生物の選択マーカーには、例えば、β-ラクタマーゼ遺伝子(選択剤アンピシリンに対する耐性を付与する)が含まれる。

0042

遺伝子の発現は一過性の発現としてまたは永続性の発現として行われる。関心対象のポリペプチドは、概して、分泌ポリペプチドであり、それゆえ、細胞壁を通じた細胞外培地へのポリペプチドの輸送/分泌に必要なN末端伸長部(シグナル配列としても公知)を含む。一般に、シグナル配列は、分泌ポリペプチドをコードする任意の遺伝子に由来することができる。異種のシグナル配列が使われるなら、それは宿主細胞により認識されプロセッシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される)ものであることが好ましい。酵母での分泌のためには、例えば、発現される異種遺伝子の天然のシグナル配列を、酵母インベルターゼシグナル配列、α因子リーダー(サッカロマイセス、クルイベロマイセス、ピキアおよびハンゼヌラα因子リーダーを含む、二つ目は米国特許第5,010,182号に記述されている)、酸性ホスファターゼシグナル配列、またはC.アルビカンスグルコアミラーゼシグナル配列(EP 0 362 179)などの、分泌遺伝子に由来する同種の酵母シグナル配列によって置換することができる。哺乳類細胞発現では、関心対象のタンパク質の天然のシグナル配列は十分ではあるが、例えばヒトまたはマウス由来の免疫グロブリンのための、同じまたは関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、およびウイルス分泌シグナル配列、例えば、単純ヘルペス糖タンパク質Dシグナル配列などの、他の哺乳類シグナル配列が適当でありうる。そのようなプレセグメントをコードするDNA断片は、関心対象のポリペプチドをコードするDNA断片にインフレームでライゲーションされる、すなわち機能的に連結される。

0043

本発明の第一の局面は、
(a)浮遊培養での増殖に適応しており、無血清培地での増殖に適応しており、かつマイコプラズマを含まない、CHO細胞を提供する段階;
(b) 以下の要素:
-原核生物の複製起点、
- 原核生物選択剤に対する耐性を付与する第一の核酸配列、
-異種免疫グロブリンの重鎖をコードする第二の核酸配列および異種免疫グロブリンの軽鎖をコードする第三の核酸配列、
-真核生物選択剤に対する耐性を付与する第四の核酸配列
を含み、ここで、該第一から第四の核酸配列の各々が発現カセットに含まれている、トランスフェクションベクターを提供する段階、
(c)(i) 該第一から第三の核酸および第一の真核生物選択剤に対する耐性を付与する第四の核酸配列を含むトランスフェクションベクターを、該CHO細胞にトランスフェクトする段階、
(ii) 該第一の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖により(i)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階、
(iii) 該第一から第三の核酸と、該第一の真核生物選択剤と異なる第二の真核生物選択剤に対する耐性を付与する、(i)において使われたトランスフェクションベクターにおけるものとは異なる第四の核酸配列とを含むトランスフェクションベクターを、(ii)において選択された該CHO細胞にトランスフェクトする段階、
(iv) 該第一および該第二の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖により、(iii)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階、
を以上の順序で含む、該CHO細胞をトランスフェクトする段階および選択する段階、
(d) 該第二および第三の核酸の発現に適した条件の下で、該第一および第二の真核生物選択剤を含有する培養培地中で、段階(c)のトランスフェクトされかつ選択されたCHO細胞を培養する段階、
(e)分泌された異種免疫グロブリンを培養培地から回収し、それによって、異種免疫グロブリンを組み換えにより産生する段階
を含む、CHO細胞における分泌された異種免疫グロブリンの組み換え産生のための方法である。

0044

本発明による方法は、大規模の、すなわち工業的な、分泌された異種免疫グロブリンの産生に適している。所望のポリペプチドの大規模での産生のための細胞の培養は、一般に一連の個々の培養からなり、最終培養を除く全ての培養、すなわち大規模の培養を除く全ての培養、すなわち一連の培養の中での最後の培養を除く全ての培養が、培養容器中である種の細胞密度に達するまで行われる。所定の細胞密度に達したら、全培養液またはその一部を用いて、より大容積、つまり前培養の1000倍までの容積を有する、次の培養容器に播種する。より大容積での少なくとも一回のさらなる培養の基礎となる培養の全てが、種系列発酵(seed train fermentation)と表される。主要な発酵とも表される、大規模の培養の場合においてのみ、すなわち、より大容積でのさらなる培養の基礎となるように意図していない培養の場合においてのみ、培養の終点が、培養培地中で産生された分泌された異種免疫グロブリンの濃度に応じて判定される。本出願のなかで用いられる「大規模」という用語は、工業的産生過程の最終培養を意味する。大規模の培養は、少なくとも100 lの容積、より好ましくは少なくとも500 lの容積、最も好ましくは、少なくとも1000 l、20,000 lまでの容積で行われることが好ましい。一つの態様において、最終の、すなわち大規模の、培養培地は真核生物選択剤を含有しない。

0045

一つの態様において、トランスフェクトされたCHO細胞の培養は、500リットル未満の容積では真核生物選択剤の存在下において行われ、かつトランスフェクトされたCHO細胞の培養は、500リットル以上の容積では真核生物選択剤の非存在下において行われ、その上、分泌された異種免疫グロブリンの回収は真核生物選択剤のない培養培地から行われる。さらなる態様において、培養は、最終の培養容積までの培養容積の増大を伴う連続的な培養を含んでおり、ここで、培養は、真核生物選択剤の存在下においては最終のまたは主要な培養の培養容積の1% (v/v)の培養容積まで行われ、かつあらゆる真核生物選択剤の非存在下においては最終培養の培養容積の1% (v/v)超の培養容積で行われる。さらなる態様において、培養は、培養容積の増大を伴う連続的な種系列の培養を含んでおり、ここで、種系列の培養の各々が真核生物選択剤の存在下において行われ、主要な発酵はあらゆる真核生物選択剤の非存在下において行われる。一つの態様において、トランスフェクトされたCHO細胞の培養は、種系列の発酵では真核生物選択剤の存在下において行われ、トランスフェクトされたCHO細胞の培養は、主要な発酵では真核生物選択剤の非存在下において行われ、その上、分泌された異種免疫グロブリンの回収は、真核生物選択剤を含有していない主要な培養培地から行われる。これらの態様において、真核生物選択剤は増殖期の間に加えられ、CHO細胞の産生期の間に取り除かれる。「産生期」という用語は、大容積の、すなわち主要な発酵でのCHO細胞の培養であって、その後に産生された異種免疫グロブリンが回収される培養を意味する。

0046

本発明による方法の別の態様において、CHO細胞の産生性は、分割バッチ培養としての10世代の培養後において、40世代にわたり70%以上かつ130%以下の産生性である。一つの態様において、CHO細胞の産生性は、分割バッチ培養としての10世代の培養後において、60世代にわたり50%以上かつ150%以下の産生性である。CHO細胞の産生性は、別の態様においては流加培養として21日以内に、異種免疫グロブリンについて少なくとも1.5 g/lである。一つの態様において、本発明による方法を用いて得られたCHO細胞の特異的な産生性は、1 μg超/106細胞/日、5 μg超/106細胞/日、または10 μg超/106細胞/日である。一つの態様において、分泌された異種免疫グロブリンは、完全にプロセッシングされた、分泌された異種免疫グロブリンである。「完全にプロセッシングされた、分泌された異種免疫グロブリン」という用語は、(i)培養培地に分泌され、そのシグナル配列が切断され、(ii)抗原結合領域を含み、(iii) 二次的な修飾、例えば付着された単糖類もしくは多糖類、および/または正しく形成されたジスルフィド結合を有する、免疫グロブリンを意味する。

0047

本発明の一つの態様において、異種免疫グロブリンは抗Aβ抗体である。別の態様において、抗Aβ抗体の重鎖可変ドメインは、SEQID NO: 1、2または3より選択されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む。さらなる態様において、抗Aβ抗体の軽鎖可変ドメインは、SEQ ID NO: 4、5または6より選択されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む。さらなる態様において、抗Aβ抗体は、SEQ ID NO: 7、8または9より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む。さらなる態様において、抗Aβ抗体は、SEQ ID NO: 10、11または12より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。

0048

本発明の一つの態様において、異種免疫グロブリンは抗P-セレクチン抗体である。さらなる態様において、抗P-セレクチン抗体は、SEQID NO: 13、14または15より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む。さらなる態様において、抗P-セレクチン抗体は、SEQ ID NO: 16、17または18より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。

0049

本発明の一つの態様において、異種免疫グロブリンは抗IL-13Rα抗体である。さらなる態様において、抗IL-13Rα抗体は、SEQID NO: 19、20、21、22または23より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む。さらなる態様において、抗IL-13Rα抗体は、SEQ ID NO: 24、25、26、27または28より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。

0050

本発明の一つの態様において、異種免疫グロブリンは抗CD4抗体-コンジュゲートである。別の態様において、コンジュゲート中の抗CD4抗体の重鎖可変ドメインは、SEQID NO: 29、30または31より選択されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む。さらなる態様において、コンジュゲート中の抗CD4抗体の軽鎖可変ドメインは、SEQ ID NO: 32、33または34より選択されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む。さらなる態様において、コンジュゲート中の抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 35、36または37より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む。さらなる態様において、コンジュゲート中の抗CD4抗体は、SEQ ID NO: 38、39または40より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。

0051

ヒトでの使用を対象とした治療用物質、すなわちポリペプチドの大規模産生に使用可能な哺乳類細胞は、別個の基準を満たさなければならない。これらには、特に、その細胞が無血清培地中で、好ましくは未確定哺乳類由来成分を含まない培地中で、または確定された哺乳類由来成分を補充した無血清培地中で培養可能でなければならないことがある。血清は多数の化合物の混合物である。通常は、ウシ血清が哺乳類細胞の培養に使われている。ある種から別の種に伝染する疾患に関して生じている問題により、血清および他の未確定の哺乳類由来化合物の使用は回避されなければならない。本出願のなかで用いられる「未確定の哺乳類由来化合物」という用語は、哺乳類に由来する、とりわけウシブタヒツジまたは子ヒツジから選択される化合物であって、その組成を80% (w/w)未満まで、好ましくは90% (w/w)未満まで特定できる化合物を意味する。「確定された哺乳類由来化合物」とは、哺乳類から得られる、とりわけウシ、ブタ、ヒツジまたは子ヒツジから選択される化合物であって、その組成を95% (w/w)超まで、好ましくは98% (w/w)超まで、最も好ましくは99% (w/w)超まで特定できる化合物である。確定された哺乳類由来化合物の一例は、羊毛由来コレステロール、および牛乳由来ガラクトースである。一つの態様において、確定された哺乳類非由来化合物または未確定の哺乳類非由来化合物を培地に補充することができる。そのような哺乳類非由来化合物の一例は、タラ肝油である。

0052

それゆえ、本発明の一つの態様において、培養に用いられる培地は、無血清培地、または確定された哺乳類由来成分を補充した無血清培地、または哺乳類由来成分を含まない培地、または無タンパク質培地、確定された哺乳類由来成分を補充した無タンパク質培地、または化学合成培地、または哺乳類由来成分を含まない培地、または確定された無タンパク質培地である。哺乳類由来成分を含まない培地の例は、Invitrogen Corp.から入手可能なCD CHO培地、またはGibcoから入手可能なProCHO4である。無タンパク質培地の一例は、Hycloneから入手可能なHyQSFM4CHOである。

0053

本発明による方法の別の態様においては、同じ培地中で行われる、最初のトランスフェクションから始めて分泌された異種免疫グロブリンの回収で終える方法がある。「同じ培地中」という用語は、本出願のなかでは、最初のトランスフェクションから始めて培養培地からの分泌された異種免疫グロブリンの回収で終えるのに同じ培地が使われることを意味する。これは、全ての段階で培地に同じ添加物が加えられなければならないことを意味していない、すなわち、方法のうちの異なる段階では異なる添加物が培地に補充されてもよい。添加物は、全部で20% (w/w)未満まで、一つの態様において15% (w/w)未満まで、別の態様において10% (w/w)未満まで培地に加えられる化合物である。一つの態様において、本発明による方法で用いられる培地は、全ての段階で同じ培地であり、分泌された異種免疫グロブリンの大規模産生に適した培地である。

0054

驚くべきことに、本発明による方法を用いて、一回トランスフェクトされたCHO細胞に比べて類似の増殖特性および向上した産生性を有する多重にトランスフェクトされたCHO細胞を得ることができると分かった。「類似の増殖特性」という用語は、多重にトランスフェクトされたCHO細胞が、一回トランスフェクトされたCHO細胞と同じ時間内に、細胞密度について少なくとも50%まで増殖することを意味する。別の態様において、多重にトランスフェクトされたCHO細胞は、一回トランスフェクトされた細胞と同じ時間内に細胞密度について少なくとも90%まで増殖する。さらなる態様において、多重にトランスフェクトされた細胞の倍加時間は、一回トランスフェクトされた細胞の倍加時間のせいぜい150%である。一つの態様において、多重にトランスフェクトされたCHO細胞は、二回または三回トランスフェクトされたCHO細胞である。別の態様において、多重にトランスフェクトされた細胞は、培養培地において向上した容積収量を有する。大規模の発酵過程の全産生性は容積収量、すなわち培養の単位容積あたりのポリペプチドの量によって最良に判定される。この容積収量は、細胞密度、各細胞の特異的産生性および培養時間の積である。したがって、低い細胞密度だが高い特異的産生性による培養は、同じ培養時間での高い細胞密度だが低い特異的産生性による培養と同じ時間内で同じ容積収量を有するであろう。このように、多重にトランスフェクトされたCHO細胞および本発明による方法を用い、一回トランスフェクトされたCHO細胞に比べて類似の増殖特性、しかし向上した容積収量/産生性を有するCHO細胞が得られる。

0055

分泌された異種免疫グロブリンは、当業者に公知のクロマトグラフィー法により培養培地から回収することができる。それゆえ、一つの態様において、本発明による方法は、異種免疫グロブリンを一つまたは複数のクロマトグラフィー段階で精製する最終の段階を含む。

0056

本発明による方法で用いるのに適したベクターは、原核生物の複製起点、および原核生物選択剤に対する耐性を付与する第一の核酸、および/または異種免疫グロブリンの重鎖をコードする第二の核酸、および/または異種免疫グロブリンの軽鎖をコードする第三の核酸、ならびに真核生物選択剤に対する耐性を付与する第四の核酸を含む。

0057

含まれる第一の核酸は、培養培地への原核生物選択剤の添加に対して耐性を付与する。例示的な原核生物選択剤は、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリンまたはエリスロマイシンである。「選択剤に対する耐性を付与する核酸」という用語およびその文法的に等価な用語は、本出願のなかでは、該核酸によってコードされるポリペプチドが修飾もしくは分解により該選択剤を中和できる、または該選択剤の作用に対抗できることを意味する。したがって、選択剤に対する耐性を付与する核酸を含んだ細胞は、選択剤が培養培地に存在しても生存および増殖する能力を有する。例示的な真核生物選択剤は、例えばネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、メトトレキサート、ジェネティシン(登録商標) (G418)またはミコフェノール酸である。選択剤は、原核生物および真核生物選択剤が金属ではないという条件で選択される。

0058

本発明による方法によって提供されるCHO細胞のトランスフェクションは、トランスフェクションおよび選択の一連の段階として行われる。本発明による方法において適当なCHO細胞は、例えばCHO K1細胞、またはCHO DG44細胞、またはCHO XL99細胞、またはCHO DXB11細胞、またはCHODP12細胞、またはsuper-CHO細胞である。本発明の範囲内で、トランスフェクト細胞は、当技術分野において公知の実質的にあらゆる種類のトランスフェクション法により得ることができる。例えば、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによって細胞に核酸を導入することができる。あるいは、FuGENE 6 (Roche Diagnostics GmbH, Germany)、X-tremeGENE (Roche Diagnostics GmbH, Germany)、リポフェクトアミン(LipofectAmine) (Invitrogen Corp., USA)およびヌクレオトランスフェクション(AMAX Corp.)のようなリポフェクション試薬を用いることもできる。あるいは、レトロウイルスレンチウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに基づく適切なウイルスベクター系によって細胞に核酸を導入することもできる(Singer, O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 5313-5314)。

0059

トランスフェクションの後、陽性のトランスフェクト細胞を選択剤の存在下において、すなわち、選択増殖によって選択する。驚くべきことに、二種以上の真核生物選択剤は、培養CHO細胞が、本発明によるこれらの真核生物選択剤に対する耐性を付与する必要な全ての対応する核酸でトランスフェクトされていれば、増殖および異種ポリペプチドの発現を妨げずに培養培地に存在できることが分かった。三種の真核生物選択剤が同時に存在しても、倍加時間が、非トランスフェクトCHO細胞または一回トランスフェクトされたCHO細胞の倍加時間の150%超まで変化することなく、CHO細胞を培養できることも分かった。それゆえ、多重にトランスフェクトされたCHO細胞は、異なる真核生物選択剤に対して該CHO細胞にそれまでは存在しなかった新たな耐性を付与する第四の核酸として、以前にはトランスフェクトされていない異なる核酸を含んだ、本発明による方法の各トランスフェクション段階における核酸を含む。それゆえ、第二のトランスフェクション段階の後、成功裏にトランスフェクトされた細胞は、異なる二種の真核生物選択剤が同時に存在する培養によって選択される。第三のトランスフェクションの後、トランスフェクト細胞の選択のため、異なる三種の真核生物選択剤の同時存在下において培養することができる。

0060

このように、本発明による方法にしたがって異なるトランスフェクション段階で利用されるベクターは、真核生物選択剤に対する耐性を付与する核酸すなわち第四の核酸を除き、核酸レベルで少なくとも95%同一である。

0061

分泌された異種免疫グロブリンの発現のために、真核生物選択剤に対する耐性を付与する核酸を含む、CHO細胞にトランスフェクトするベクターは、該異種免疫グロブリンの軽鎖をコードする核酸および/または該異種免疫グロブリンの重鎖をコードする核酸も含む。ベクターが免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖のどちらかをコードする核酸しか含んでいない場合、対応する該免疫グロブリンの他方の鎖をコードする核酸を含んだ別のベクターを、各段階でCHO細胞に同様にトランスフェクトする。

0062

一つの態様において、本発明によるトランスフェクションベクター(すなわち第一、第二、および第三のトランスフェクションベクター)に含まれる第一から第四の核酸配列は、発現カセットに含まれる。「発現カセット」とは、少なくとも細胞中に含まれる核酸の発現のための、プロモーターおよびポリアデニル化部位などの、必要な調節要素、例えばプロモーター、発現する核酸、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含んだ構築体をいう。発現カセットに含まれるプロモーターは、機能的に連結された核酸の転写の量を決定し、それとともに、該核酸の翻訳の量を決定する。第二のプロモーターに比べてより多量の核酸の翻訳を誘導する第一のプロモーターは、該第二のプロモーターに対して「より強力なプロモーター」といわれる。分泌された異種免疫グロブリンを産生し、かつ選択剤に対する耐性を付与するポリペプチドを産生しないことが企図される。したがって、それに応じて、宿主細胞の転写および翻訳機構の能力が分けられねばならない。それゆえ、一つの態様において、第二および第三の核酸の転写に利用されるプロモーターは、第四の核酸の転写に利用されるプロモーターとは異なる。別の態様において、異種免疫グロブリンの鎖をコードする第二および第三の核酸の転写産物の量は、選択剤に対する耐性を付与する第四の核酸の転写産物の量よりも多い。したがって、第二および第三の核酸の発現に利用されるプロモーターは、第四の核酸の発現に利用されるプロモーターよりも強力である。別の態様において、第二および第三の核酸の転写に利用されるプロモーターは、同じものであるが、第四の核酸のプロモーターとは異なる。一つの態様において、第二および第三の核酸の発現のためのプロモーターはCMVプロモーターまたはその変種であり、第四の核酸の発現のためのプロモーターはSV40プロモーターまたはその変種である。

0063

本発明による方法のさらなる態様において、第二および第三の核酸のコドン使用頻度は、CHO細胞における発現のために最適化される。これにより、組み換えCHO細胞に存在する転移RNAのさらに効率的な使用が可能になる。別の態様において、第二および/または第三の核酸はイントロン核酸配列を含み、別の態様において、イントロン核酸はマウス/ヒト雑種イントロンである。真核細胞のゲノムにおいて、ゲノムDNA配列はコード(エキソン)核酸配列および非コード(イントロン)核酸配列を含む。DNAのプレmRNAへの転写の後、プレmRNAはこれらのイントロン核酸配列およびエキソン核酸配列も含む。翻訳の前に、非コードイントロン核酸配列はそれらを一次mRNA転写産物からスプライシングすることによりmRNAプロセッシングの間に除去されて、成熟mRNAを生ずる。一次mRNAのスプライシングは、適切に隔置されたスプライス受容部位とともにスプライス供与部位によって制御される。スプライス供与部位はイントロン配列の5'末端に位置しており、スプライス受容部位はイントロン配列の3'末端に位置しており、両方ともプレmRNAスプライシングの間に部分的にしか除去されない。

0064

分泌ポリペプチドを産生するため、異種免疫グロブリンの鎖をコードする核酸は、シグナル配列/リーダーペプチドをコードするDNAセグメントを含む。シグナル配列は、新たに合成されたポリペプチドを、ポリペプチドの分泌の経路を決めうる小胞体(ER)膜に向け、それを通過させる。シグナル配列は、ER膜の横断の間にシグナルペプチダーゼによって切断される。シグナル配列の機能には、宿主細胞の分泌機構による認識が不可欠である。それゆえ、使用されるシグナル配列は、宿主細胞の分泌機構のタンパク質および酵素によって認識されなければならない。

0065

一つの態様において、本発明による方法は、段階(c)において、第三のトランスフェクション段階:
(v) 第一および第二の真核生物選択剤とは異なる第三の真核生物選択剤に対する耐性を付与する、(i)および(iii)において使われたトランスフェクションベクターにおけるものとは異なる第四の核酸配列を含むベクターを、(iv)において選択されたCHO細胞にトランスフェクトする段階、
(vi) 第一および第二および第三の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖により、(v)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階
を含む。

0066

この態様において、段階(d)におけるトランスフェクトCHO細胞の培養に利用される培養培地は、第三の真核生物選択剤をさらに含む。

0067

本発明の第二の局面は、以下の方法:
(a) -浮遊培養での増殖に適応しており、
-無血清培地での増殖に適応しており、
-マイコプラズマを含まない、
CHO細胞を提供する段階、
(b) -原核生物の複製起点、
- 原核生物選択剤に対する耐性を付与する第一の核酸配列、
-異種免疫グロブリンの重鎖をコードする第二の核酸配列、および異種免疫グロブリンの軽鎖をコードする第三の核酸配列
を含む核酸を提供する段階であって、
ここで、該提供する核酸と、第一の真核生物選択剤に対する耐性を付与するさらなる第四の核酸配列とを含む、第一のトランスフェクションベクターを提供し、
ここで、該提供する核酸と、該第一の真核生物選択剤とは異なる第二の真核生物選択剤に対する耐性を付与する、該第一のトランスフェクションベクターにおける第四の核酸配列とは異なるさらなる第四の核酸配列とを含む、第二のトランスフェクションベクターを提供する、段階、
(c)(i) 該第一のトランスフェクションベクターを該CHO細胞にトランスフェクトする段階、
(ii) 第一のトランスフェクションベクターが耐性を付与する第一の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖により(i)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階、
(iii) 該第二のトランスフェクションベクターを(ii)において選択された該CHO細胞にトランスフェクトする段階、
(iv) 第一のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第一の真核生物選択剤、および第二のトランスフェクションベクターが耐性を付与する該第二の真核生物選択剤を含有する培養培地中での選択増殖により(iii)においてトランスフェクトされたCHO細胞を選択する段階
を以上の順序で含む、該CHO細胞をトランスフェクトする段階および選択する段階
で得ることができる、分泌された異種免疫グロブリンを発現するCHO細胞である。

0068

本出願のなかで用いられる「ウイルスを含まない」という用語は、培養中に発現されればヒトにとって有害であり、下流の加工処理作業では分離できない産物を生じうるいかなるウイルス核酸も、CHO細胞が含んでいないことを意味する。

0069

以下の実施例、および図面は、本発明の理解を助けるよう提供されており、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。記載した手順に、本発明の趣旨から逸脱することなく変更を加えられることが理解されよう。

0070

実施例
材料および方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に示されている。抗体鎖のアミノ酸は、EU付番にしたがって番号付けされている(Edelman, G. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))。

0071

組み換えDNA技術:
Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記述されているように標準的な方法を用いてDNAを操作した。分子生物学試薬は製造元使用説明書にしたがって用いた。

0072

遺伝子合成:
所望の遺伝子セグメントを、化学合成によって作出されたオリゴヌクレオチドから調製した。一つだけの制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接している、100〜600 bp長の遺伝子セグメントを、PCR増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによってアッセンブルし、引き続きpCR2.1-TOPO-TAクローニングベクター(Invitrogen Corp., USA)にA-突出部を介して、またはpPCR-Script AmpSK(+)クローニングベクター(Stratagene Corp., USA)にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子セグメントのDNA配列をDNA配列決定により確認した。

0073

タンパク質測定:
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、280 nmで光学密度(OD)を測定することにより、タンパク質濃度を測定した。

0074

抗体力価測定:
自家精製した抗体を参照基準として用いて抗ヒトFcELISAによりまたはプロテインAクロマトグラフィーにより抗体力価を測定した。

0075

SDS-PAGE
LDSサンプル用緩衝液、4倍濃縮物(4×):グリセロール4 g、TRIS-Base 0.682 g、TRIS-塩酸塩0.666 g、LDS (ドデシル硫酸リチウム) 0.8 g、EDTA(エチレンジアミン四酢酸) 0.006 g、1重量(w/w) %のServa Blue G250水溶液0.75 ml、1重量(w/w) %のフェノールレッド溶液0.75 mlに水を加えて全量を10 mlにする。

0076

分泌された抗体を含有する培養ブロス遠心分離して、細胞および細胞残屑を除去した。清澄化された上清アリコットを1/4容量(v/v)の4×LDSサンプル用緩衝液および1/10容量(v/v)の0.5 M 1,4-ジチオスレイトール(DTT)と混合した。次いでサンプルを70℃で10分間インキュベートし、タンパク質をSDS-PAGEによって分離した。NuPAGE(登録商標) Pre-Castゲルシステム(Invitrogen Corp.)を製造元の使用説明書にしたがって使用した。具体的には、10% NuPAGE(登録商標) Novex(登録商標) Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH 6.4)およびNuPAGE(登録商標) MOPS泳動用緩衝液を使用した。

0077

ウエスタンブロット
転写用緩衝液: 39 mMグリシン、48 mM TRIS-塩酸塩、0.04重量(w/w) %のSDSおよび20容積(v/v) %のメタノール

0078

SDS-PAGEの後、分離された抗体鎖をBurnette (Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203)の「Semidry-Blotting-Method」にしたがってニトロセルロースフィルタ膜(孔径: 0.45 μm)に電気泳動的に転写した。

0079

実施例1
抗Aβ抗体を発現するための発現ベクター
発現用の細胞株を本発明によって得ることができる一例の(好ましくはモノクローナル)抗体は、アミロイドβ-A4ペプチドに対する抗体(抗Aβ抗体)である。そのような抗体および対応する核酸配列は、例えば、WO 2003/070760もしくは米国特許第2005/0169925号に、またはSEQID NO: 1〜12に報告されている。

0080

抗Aβ抗体を発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株は、連続3回の完全なトランスフェクションおよび選択戦略で作出した。

0081

ゲノムヒトκ軽鎖定常領域遺伝子セグメント(C-κ、CL)を抗Aβ抗体の軽鎖可変領域に付加し、ヒトγ1重鎖定常領域遺伝子セグメント(CH1-ヒンジ-CH2-CH3)を抗Aβ抗体の重鎖可変領域に付加した。次いで完全なκ軽鎖およびγ1重鎖抗体遺伝子を5'末端でヒトサイトメガロウイルス(HCMV)プロモーターおよび3'末端でヒト免疫グロブリンポリアデニル化シグナル配列と連結した。

0082

(a)重鎖発現カセット
抗Aβ抗体重鎖の転写単位は以下の要素から構成される:
-ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト抗体生殖系列遺伝子に由来する5'非翻訳領域、
- ヒト抗体生殖系列遺伝子に由来するシグナル配列を含んだ抗Aβ抗体重鎖可変ドメイン、
-マウスIg重鎖エンハンサー要素を含むヒト/マウス重鎖雑種イントロン2 (例えば(Neuberger, M.S.,EMBO J. 2 (1983) 1373-1378を参照のこと)、
-ゲノムヒトγ1重鎖遺伝子定常領域、
-ヒト免疫グロブリンγ1重鎖ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列、
- それぞれ、5'末端および3'末端のユニークな制限部位AscIおよびSgrAI

0083

(b)軽鎖発現カセット
抗Aβ抗体軽鎖の転写単位は以下の要素から構成される:
-ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト抗体生殖系列遺伝子に由来する5'非翻訳領域、
- ヒト抗体生殖系列遺伝子に由来するシグナル配列を含んだ抗Aβ抗体軽鎖可変領域、
-マウスIgχ軽鎖エンハンサー要素を含むヒト/マウスκ軽鎖遺伝子雑種イントロン2 (Picard and Schaffner, A lymphocyte-specific enhancer in the mouse immunoglobulin kappa gene. Nature 307(1984) 80-82)、
- ヒトκ軽鎖遺伝子定常領域(C-κ)、
-ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列、
- それぞれ、5'末端および3'末端のユニークな制限部位Sse8387およびFseI。

0084

(c)発現プラスミド5128、5137および5151
抗Aβ抗体の発現および産生のため、軽鎖および重鎖発現カセットを単一の発現ベクターに(時計回りの方向で軽鎖の上流に重鎖を)配置した。含まれる選択可能なマーカー遺伝子だけが異なる、具体的には、選択剤ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはピューロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子だけが異なる、三種の同一の発現ベクターを作出した。これらのベクターには、選択または増幅に使われなかったマウスDHFR遺伝子も含まれる。

0085

発現ベクターは軽鎖および重鎖発現カセットに加えて、以下の要素を含む:
- 選択可能なマーカー(ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはピューロマイシン耐性遺伝子のどれか)、
-大腸菌においてプラスミドの複製を可能にする複製起点、
- 大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子、
-マウス由来のDHFR遺伝子。

0086

ハイグロマイシン選択可能なマーカー遺伝子を含んだ、発現ベクター5128のプラスミドマップを図1に示す。ネオマイシン選択可能なマーカー遺伝子を含んだ、発現ベクター5137のプラスミドマップを図2に示す。ピューロマイシン選択可能なマーカー遺伝子を含んだ、発現ベクター5151のプラスミドマップを図3に示す。

0087

実施例2
抗Aβ抗体を発現するCHO細胞のトランスフェクションおよび選択
8 mMグルタミンおよび1×HT補充成分(Gibco/Invitrogen)を含有する動物成分不含の合成ProCHO4培地(Cambrex Corp.)中の無血清浮遊培養での増殖に予め適応させた親CHO-K1細胞を宿主細胞株として用いた。この補充済のProCHO4培地を以下ではProCHO4完全培地と表す。接着性の増殖CHO-K1親細胞株はATTCからATCCCCL-61として受け取った。

0088

予め適応させた親宿主細胞を標準的な加湿条件(95%、37℃および5% CO2)下、動物成分不含の合成ProCHO4完全培地中にて浮遊状態で増殖させた。細胞密度に応じ一定の間隔で、細胞を新鮮培地中に分割した。細胞を指数増殖期に遠心分離によって収集し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(Phosphate Buffered Saline;PBS)で一回洗浄し、滅菌PBSに再懸濁した。

0089

トランスフェクションの前に、抗Aβ抗体を発現するプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼ酵素PvuIまたはAviIIを用いてβ-ラクタマーゼ遺伝子(大腸菌アンピシリン耐性マーカー遺伝子)内で直線化した。切断されたDNAを、エタノールで沈降し、真空下で乾燥し、滅菌PBSに溶解した。

0090

概して、トランスフェクションのため、(親のまたは既にトランスフェクトされた)CHO細胞に室温でPBS中およそ107個の細胞あたり直線化プラスミドDNA 20〜50 μgをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションは2 mm間隔のキュベット中にてGene Pulser XCellエレクトロポレーション装置(Bio-Rad Laboratories)により、単一180 Vのパルスによる矩形波プロトコルを用いて行った。トランスフェクションの後、細胞をProCHO4完全培地中、96ウェル培養皿プレーティングした。24時間の増殖の後、一種または複数種の選択剤を含有する溶液(ProCHO4完全選択培地; G418: 400 μg/ml;ハイグロマイシン: 600 μg/ml;ピューロマイシン: 8 μg/ml)を加えた。週に一回、ProCHO4完全選択培地を交換した。抗Aβ抗体の抗体濃度を、培養上清中のヒトIgG1に特異的なELISAアッセイ法により分析した。

0091

多産の抗Aβ抗体産生細胞株の選択のため、抗ヒトIgG1ELISAおよび/または分析的プロテインAHPLCを用い、6ウェル培養皿、Tフラスコおよび/またはエルレンマイア振盪フラスコ中での増殖後のProCHO4完全選択培地において産生性の試験を行った。

0092

二種の方法、つまり限界希釈(LD)法および蛍光標識細胞分取(FACS)法によってサブクローンを得た。

0093

限界希釈:
限界希釈のため、細胞を96ウェル培養プレート1ウェルにつき培地0.1 mlあたり細胞0.5〜2個の細胞密度でProCHO4馴化培地(50% (v/v)の新鮮ProCHO4完全選択培地および増殖される細胞に由来する50% (v/v)のProCHO4完全馴化選択培地からなる)中にてプレーティングした。週に一回、培地をProCHO4完全選択培地に交換した。抗Aβ抗体の抗体濃度を、培養上清中のヒトIgG1に特異的なELISAアッセイ法により分析した。

0094

クローンの特定および単離を含むフローサイトメトリーによる単細胞沈着:
安定的にトランスフェクトされたクローンの特定および単離は、分泌された、しかし依然として膜に付着した抗体に結合する、蛍光タグの付いたプロテインAを用い細胞表面標識化技術の助けを借りて実施した。染色された細胞の蛍光強度細胞選択の基準として用いた。

0095

蛍光標識細胞分取法の場合には、エレクトロポレーション処理した細胞の集団をProCHO4完全培地中にてTフラスコに直接播種した。適切な1つまたは複数の選択剤(G418、ハイグロマイシンおよび/またはピューロマイシン)をトランスフェクションから1日後に培養物に添加し、形質移入体のプールを増大させた。

0096

増大させた形質移入体のプールに由来する細胞を37℃で15分間Accumax (PAA Laboratories)で最初に処理し、次いで40 μMのナイロンメッシュに通して、残存する大きな細胞凝集塊を除去した。細胞を遠心分離によって回収し、5%FCS(Gibco/Invitrogen)を含有するPBSに細胞106〜107個/mlの細胞密度で再懸濁し、上で20分間インキュベートした。その後、細胞を暗所中、氷上にて30分間FCS-PBS 8 mlの容量中10 ng/mlのプロテインAAlexa Fluor 488 (Molecular Probes Inc.)で染色した。その後、細胞を5% FCS-PBSで一回および8 mM Ultra Glutamine (Cambrex Corp.)、1×HT補充成分および5% FCSを含有するProCHO4培地で一回洗浄した。最後に、細胞を洗浄用に用いた補充済のProCHO培地に細胞106〜107個/mlの細胞密度で再懸濁し、BDFACSAria細胞分別機(BD Biosciences)に移入した。

0097

単一の細胞をフローサイトメトリーによって分別し、ProCHO4馴化培地を含有する96ウェル培養プレートのウェルに沈着させた。分別され沈着された細胞には、ゲートで制御された生細胞最上位10%、7%または4%の蛍光強度を有する細胞が含まれた。48時間後、2倍濃度の適切な選択剤を含有するProCHO4完全選択培地を各ウェルに加えた。週に一回、培地をProCHO4完全選択培地に交換した。抗Aβ抗体の抗体濃度を、培養上清中のヒトIgG1に特異的なELISAアッセイ法により分析した。

0098

トランスフェクションおよび選択段階:
第一のトランスフェクションおよび選択段階のため、プラスミド5137を用いた。プラスミド5137をエレクトロポレーションにより、ProCHO4完全培地での増殖に適応させた親細胞株にトランスフェクトした。96ウェルプレートにおいて最大700 μg/mlのG418を補充したProCHO4完全培地の中でトランスフェクト細胞を培養した。培養上清中の抗体濃度を抗ヒトIgG1ELISAによって評価した。およそ1000クローンを試験し、それらのうちで選択したものを24ウェルプレート、6ウェルプレートおよびその後に振盪機フラスコの中でさらに培養した。およそ20クローンの増殖および産生性を抗ヒトIgG1 ELISAおよび/または分析的プロテインAHPLCにより、静置培養および浮遊培養において評価した。最良のクローン(最良のクローンとは最も産生性のクローンを意味するのではなく、さらなる段階のために最良の特性を持ったクローンを意味する)を、700 μg/mlのG418を補充したProCHO4馴化培地中での限界希釈によってサブクローニングした。選択したクローンを8C8と名付けた。

0099

第二のトランスフェクションおよび選択段階のため、プラスミド5128を用いた。プラスミド5128をエレクトロポレーションにより、700 μg/mlのG418を補充したProCHO4完全培地中で培養された細胞株クローン8C8にトランスフェクトした。200 μg/mlのG418および300 μg/mlのハイグロマイシンを補充したProCHO4馴化培地(ProCHO4二重選択培地)の中で約2〜3週間、トランスフェクト細胞を増殖させた。単一抗体を分泌する細胞をFACS解析により、プロテインAAlexa Fluorコンジュゲートによる染色後にその蛍光強度に基づいて特定し沈着させた。96ウェルプレートにおいてProCHO4二重選択培地の中で沈着細胞を培養した。培養上清中の抗体濃度を抗ヒトIgG1ELISAによって評価した。およそ500クローンを試験し、それらのうちで選択したものを24ウェルプレート、6ウェルプレートおよびその後に振盪機フラスコの中でさらに培養した。およそ14クローンの増殖および産生性を抗ヒトIgG1 ELISAおよび/または分析的プロテインAHPLCにより、静置培養および浮遊培養において評価した。選択したクローンを4F5と名付けた。

0100

第三のトランスフェクションおよび選択段階のため、プラスミド5151を用いた。プラスミド5151をエレクトロポレーションにより、ProCHO4二重選択培地中で培養された細胞株クローン4F5にトランスフェクトした。ProCHO4三重選択培地(200 μg/mlのG418および300 μg/mlのハイグロマイシンおよび4 μg/mlのピューロマイシンを補充したProCHO4馴化培地)の中で約2〜3週間、トランスフェクト細胞を増殖させた。単一抗体を分泌する細胞をFACS解析により、プロテインAAlexa Fluorコンジュゲートによる染色後にその蛍光強度に基づいて特定し沈着させた。96ウェルプレートにおいてProCHO4三重選択培地の中で沈着細胞を培養した。培養上清中の抗体濃度を抗ヒトIgG1ELISAによって評価した。およそ500クローンを試験し、それらのうちで選択したものを24ウェルプレート、6ウェルプレートおよびその後に振盪機フラスコの中でさらに培養した。およそ10クローンの増殖および産生性を抗ヒトIgG1 ELISAおよび/または分析的プロテインAHPLCにより、静置培養および浮遊培養において評価した。選択したクローンを20F2と名付けた。

0101

クローン20F2を、ProCHO4三重選択培地中での、すなわち三種の選択剤G418、ハイグロマイシンおよびピューロマイシンの同時存在下での流加浮遊培養における増殖後のその増殖、産生性および産物品質特性に基づいて選択した。

0102

クローン特性:
以下の表から分かるように、基礎の細胞株CHO-K1 (野生型)および選択のクローンを比較した場合、倍加時間および培養3日後の細胞密度は同程度であった。

0103

(表1) 増殖特性

0104

実施例3
抗Aβ抗体を発現するクローン20F2の安定性
増殖および産物形成の安定性を選択剤の存在下および非存在下(抗生物質有りおよび無し)で60日間(約60世代)にわたり時系列の細胞継代培養物において評価した。培養は上記のように実施した。

0105

(表2)クローン20F2の特徴

0106

(最大60世代までの)広範な継代の後、抗Aβ抗体産生クローン20F2が、それぞれ、三種の選択剤の存在下または非存在下での細胞増殖および産物形成に関して不安定であることを示す証拠は得られなかった。

0107

実施例4
抗P-セレクチン抗体を発現するための発現ベクター
発現用の細胞株を本発明によって得ることができる一例の(好ましくはモノクローナル)抗体は、ヒトP-セレクチン糖タンパク質に対する抗体(抗P-セレクチン抗体)である。そのような抗体および対応する核酸配列は、例えば、WO 2005/100402もしくは米国特許第2005/0226876号に、またはSEQID NO: 13〜18に記述されている。

0108

抗P-セレクチン抗体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞株は、連続2回の完全なトランスフェクションおよびクローン選択戦略で作出した。

0109

ゲノムヒトκ軽鎖定常領域遺伝子セグメント(C-κ)を抗P-セレクチン抗体の軽鎖可変領域に付加し、ヒトγ4重鎖定常領域遺伝子セグメント(CH1-ヒンジ-CH2-CH3)を抗P-セレクチン抗体の重鎖可変領域に付加した。次いで完全なκ軽鎖およびγ4重鎖抗体遺伝子を5'末端でヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびエンハンサー(CMVIE)、ならびに3'末端でシミアンウイルス40初期ポリアデニル化(SV40初期ポリA)シグナル配列と連結した。

0110

(a)重鎖発現カセット
抗P-セレクチン抗体重鎖の転写単位は以下の要素から構成される:
-ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター(CMVIE)、
- 5'非翻訳領域(5'UTR)、
-イントロン-エキソン遺伝子構造中のシグナルペプチドを含む抗P-セレクチン抗体γ4重鎖のコード配列、
-SV40初期ポリAシグナル配列。

0111

(b)軽鎖発現カセット
抗P-セレクチン抗体軽鎖の転写単位は以下の要素から構成される:
-ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター(CMVIE)、
- 5'非翻訳領域(5'UTR)、
-イントロン-エキソン遺伝子構造中の抗P-セレクチン抗体κ軽鎖のコード配列、
-SV40初期ポリAシグナル配列。

0112

(c)発現プラスミド5057および5069
抗P-セレクチン抗体の発現および産生のため、軽鎖および重鎖発現カセットを単一の発現ベクターに(重鎖の上流に軽鎖を)配置した。含まれる選択可能なマーカー遺伝子、具体的にはマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子だけが異なる、二種の同一の発現ベクターを作出した。

0113

発現ベクターは軽鎖および重鎖発現カセットに加えて、以下の要素を含む:
- 起点およびSV40初期プロモーターの制御下のマウスDHFR遺伝子または選択剤ネオマイシンに対する耐性を付与する遺伝子のどちらかの、選択可能なマーカー、
- pUC19から取った、大腸菌においてプラスミドの複製を可能にする複製起点(pUC起点)、
- 大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子。

0114

マウスDHFRマーカー遺伝子を含んだ、発現ベクター5057のプラスミドマップを図4に示す。ネオマイシン選択可能なマーカー遺伝子を含んだ、発現ベクター5069のプラスミドマップを図5に示す。

0115

実施例5
抗P-セレクチン抗体を発現するCHO細胞株のトランスフェクションおよび選択
確定された動物由来成分(羊毛およびタラ肝油由来のコレステロール)を補充したタンパク質不含のHyQSFM4CHO培地(Hyclone,カタログ番号SH30549)中の無血清浮遊培養での増殖に予め適応させたCHO-K1細胞を宿主細胞株として用いた。細胞を振盪フラスコ中、標準的な加湿条件(95%、37℃および5% CO2)下、および150 rpm/分での一定の撹拌下、タンパク質不含のHyQ SFM4CHO培地の中で増殖させた。細胞密度に応じて、細胞を新鮮培地中に分割した。

0116

接着性のCHO-K1細胞株はアメリカン・タイプ・カルチャーコレクションからATCCCCL-61として得た。

0117

第一のトランスフェクションおよび選択
トランスフェクションの前に、発現プラスミド5057を、制限酵素PvuIを用いてβ-ラクタマーゼ遺伝子内で直線化した。切断されたDNAを、QiaQuickスピンカラム(Qiagen)を用い製造元の推奨にしたがって精製した。

0118

トランスフェクションはGene Pulser XCell (BIO-RAD)および0.2 cmのキュベット(BIO-RAD,カタログ番号165-2086)を用いてエレクトロポレーションにより行った。トランスフェクションのため、CHO-K1細胞106〜107個を遠心分離によって収集し、PBSに再懸濁し、キュベットに移し、直線化プラスミドDNA 20〜50 μgと混合した。細胞を単一の矩形波パルス(160 V, 15 ms)に曝露し、その後、およそ細胞4×105個/mlの密度までHyQSFM4CHO培地に希釈し、T75細胞培養フラスコに播種した。選択剤の補充なしで48時間の増殖の後、細胞を、細胞104〜105個/mlの密度まで200 nMMTXを補充したHyQ SFM4CHO培地に希釈し、96ウェルプレートに1ウェルあたり細胞3〜7000個で播種した。およそ2週間後、ウェルごとに新鮮培地を加え、さらに2週間後、培地を新鮮培地に完全に置き換えた。4日後、抗ヒトFcELISAにより抗体産生について培養上清を試験した。合計で約600クローンをスクリーニングした。

0119

10 μg/ml超の抗体力価を有する45クローンを選び出し、48ウェルプレートに移した。これらのクローンをさらなる継代にわたり振盪機フラスコにおいて増殖させ、その後、最終の産生性評価のために無血清の産生用培地に移した。125 mlの振盪機フラスコに、200 nMMTXを補充した培地中、細胞105〜106個/mlを播種した。生存細胞密度および生存度を1週間にわたってモニタリングした。最終日にプロテインAクロマトグラフィーによって抗体力価を測定した。これらのデータに基づき、さらに進展させるためクローンG24を選択した。G24は細胞3.3×106個/mlの最大の生存細胞密度に達した。抗体力価は402 μg/mlであった。平均の特異的産生率(SPR)は28 pg/(細胞*d)であった。

0120

第二のトランスフェクションおよび選択:
クローンG24を第二のトランスフェクションに供した。第二のトランスフェクションのために、プラスミド5069を用いた。プラスミドの直線化および精製ならびにG24のエレクトロポレーションは、第一のトランスフェクションに記述したように実施した。選択圧なしでの48時間の増殖の後、細胞を、細胞103〜104個/mlの密度まで200 nMMTXおよび400 μg/ml G418を補充したHyQSFM4CHO培地に希釈し、96ウェルプレートに1ウェルあたり細胞500個で播種した。およそ2週間後、ウェルごとに新鮮培地を加え、さらに1週間後、培養培地を新鮮培地に完全に置き換えた。4日後、抗ヒトFcELISAにより抗体産生について培養上清を試験した。全部でおよそ220クローンをスクリーニングした。

0121

次いで150 μg/ml超の抗体力価を有する13クローンを選び出し、24ウェルプレートに移した。これらのクローンをさらなる継代にわたり振盪機フラスコにおいて増殖させ、その後、最終の産生性評価のために無血清の産生用培地に移した。振盪機フラスコに、200 nMMTXおよび400 μg/ml G418を補充した培地50 ml中、細胞105〜106個/mlを播種した。生存細胞密度および生存度を1週間にわたってモニタリングした。最終日にプロテインAクロマトグラフィーによって抗体力価を測定した。これらのデータに基づき、クローンG24_x6を最良のクローンと見なした。G24_x6は細胞3.0×106個/mlの最大の生存細胞密度に達した。抗体力価は685 μg/mlであった。平均の特異的産生率(SPR)は48 pg/(細胞*d)であった。

0122

限界希釈:
本発明による方法と単純なサブクローニングとを、産生性に及ぼすその影響に関して比較するため、本発明者らは、クローンG24を96ウェルプレートでの限界希釈または単細胞沈着に供した。

0123

限界希釈のため、細胞を96ウェルプレートにおいて細胞0.5個/ウェルで、50% (v/v)の馴化培地、10%FCSおよび200 nMMTXを補充したHyQSFM4CHO培地に播種した。あるいは、FACSによって細胞1個/ウェルを96ウェルプレートに沈着させた。10日後、ウェルごとに新鮮なFCS 不含HyQ SFM4CHO培地、200 nM MTXを加え、さらに1週間後、培養培地をHyQ SFM4CHO培地、200 nM MTXに完全に置き換えた。4日後、抗ヒトFcELISAにより抗体産生について培養上清を試験した。全部でおよそ230クローンをスクリーニングした。

0124

130 μg/ml超の抗体力価を有する11サブクローンを24ウェルプレートに移した。6ウェルプレートでの継代の後、これらのクローンを振盪機フラスコに移し、その後、最終の産生性評価のために無血清の産生用培地に移した。振盪機フラスコに、200 nMMTXを補充した培地中、細胞105〜106個/mlを播種した。生存細胞密度および生存度を1週間にわたってモニタリングした。最終日にプロテインAクロマトグラフィーによって抗体力価を測定した。これらのデータに基づいて、G24_13を最良のクローンと見なした。G24_13は細胞3.6×106個/mlの最大の生存細胞密度に達した。抗体力価は472 μg/mlであった。平均の特異的産生率(SPR)は31 pg/(細胞*d)であった。

0125

表3に優良サブクローンのG24_13および本発明による方法で得た優良クローンのG24_x6の産生性データを、その親クローンのG24との比較でまとめた。本発明による方法を用いれば、50%超にまで、容積的および特異的産生性の増大したクローンを得られるのに対し、サブクローニングの後では、両パラメータのほんのわずかな増大しか認められなかった。

0126

図6は、振盪フラスコ中で調べた、G24の全サブクローンの容積的(A)および特異的(B)産生性に関する概要を示している。示すように、本発明による方法で得たクローンの平均の容積的および特異的産生性は、サブクローニング後よりも有意に高かった。

0127

(表3)最良の産生性クローンの、親クローンG24との比較での産生性。

0128

クローン特性:
以下の表から分かるように、一回トランスフェクトされた細胞株G24および選択のクローンを比較した場合、倍加時間および培養3日後の細胞密度は同程度であった。

0129

(表4) 増殖特性

0130

実施例6
抗P-セレクチン抗体を発現するCHO細胞株のトランスフェクションおよび選択
タンパク質不含のHyQSFM4CHO培地(Hyclone,カタログ番号SH30549)中の無血清浮遊培養での増殖に予め適応させたCHO-DG44細胞を宿主細胞株として用いた。宿主細胞株はトランスフェクション、スクリーニングおよびサブクローニング段階の間、市販の培地HyQ SFM4CHO-utility (Hyclone, カタログ番号SH30516)中で培養した。

0131

第一のトランスフェクションおよび選択
トランスフェクションの前に、発現プラスミド5057 (図4)を、制限酵素PvuIを用いてβ-ラクタマーゼ遺伝子内で直線化した。

0132

宿主細胞株のトランスフェクションは、AMAXA (Nucleofector Kit T,カタログ番号VCA-1002, トランスフェクションプログラムU-17)が提供しているヌクレオトランスフェクションによって実施した。トランスフェクション後48時間、10%ウシ胎仔血清を補充した培地中で細胞を培養した。

0133

トランスフェクト細胞を選択剤として40 nMのメトトレキサート(MTX)の存在下、10%ウシ胎仔血清を補充した培地中にて1ウェルあたり細胞1000個で96ウェルプレートにプレーティングし、およそ3週間インキュベートした。

0134

96ウェルプレートの上清においてELISAにより抗体濃度を測定した。約400の一次クローンをスクリーニングした。最も高い抗体産生性を有する24クローンを24ウェルプレートに移し、選択剤の存在下において、ウシ胎仔血清の補充なしで培養した。

0135

軽抗体鎖および重抗体鎖を検出するウエスタンブロッティングにより、産物の品質を分析した。最も高い産生性を示した、および検出可能な抗体由来の副産物なしに抗体を発現した(ウエスタンブロット) 9クローンを振盪フラスコの中で増殖させた。

0136

7および10日間のインキュベーション後のバッチ振盪フラスコにおいて産生性を分析した。産物の品質はプロテインAHPLC精製後のSDS-PAGEにより評価した(図7)。最良の産物濃度はクローン43-16で達せられた。細胞1個あたりの最良の特異的産生性はクローン35-45で達成された。どちらのクローンもSDS-PAGEにおいて検出可能な副産物を示さなかった。限界希釈によるサブクローニングのために両クローンを選択した。

0137

親クローン35-45および43-16を20 nMMTXの存在下、5% (v/v)のウシ胎仔血清を補充した市販のHyQ培地中、96ウェルプレートにて限界希釈によりサブクローニングした。20日間のインキュベーションの後、抗体産生をELISAによりスクリーニングした。産生性という観点から最良のサブクローンを振盪フラスコにおいて増殖させ、その後、最終の産生性評価のために無血清の産生用培地に移した。親クローン35-45および43-16のうちの、二つの最良のサブクローン35-45-F2および43-16-A10を標準的なバッチ振盪フラスコアッセイ法で評価した。産生性は、それぞれ、7日後に270 μg/mlおよび185 μg/mlならびに10日後に337 μg/mlおよび343 μg/mlであった。

0138

第二のトランスフェクションおよび選択:
ヌクレオフェクション法(Amaxa Nucleofector Kit T,VCA-1002, トランスフェクションプログラムU-17)を用いて、サブクローン43-16-A10に発現ベクターp5069 (図5)をトランスフェクトした。第二のトランスフェクションはまた、10%ウシ胎仔血清および20 nMMTXを補充したHyclone培地: HyQSFM4CHO-utility (カタログ番号SH30516)中で行った。2日後、第二のトランスフェクション細胞を1ウェルあたり細胞1000個で96ウェルプレートに移した。第二の選択剤として、250 μg/mlのG418を加えた。

0139

2週間の培養の後、2000超の一次ウェルを、抗ヒトFcELISAによる抗体力価測定によってスクリーニングした。最も高い産生性を有する50クローンを24ウェルプレート中に移し、3日後、抗ヒトFc ELISAによって二度目のスクリーニングを行った。全てのクローンを6ウェルプレートに移し、3日後、抗ヒトFc ELISAによってスクリーニングした。最良の産生性を有する6クローンを6ウェルプレートの段階から直接的にサブクローニングした。

0140

限界希釈:
限界希釈で、第二のトランスフェクションおよび選択のラウンドの最良の親クローン43-16A10_S1、43-16A10_S13、43-16A10_S14、43-16A10_S19、43-16A10_S24、43-16A10_S43をサブクローニングした。最良のサブクローン12個の産物の品質を24ウェルの段階よりSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングで評価した。抗体に関連する不要な副産物は検出されなかった。

0141

振盪フラスコにおける増殖のため6ウェルプレートでの産生性にしたがい3つのサブクローン43-16-A10-S1-16、43-16-A10-S24-11および43-16-A10-S43-14を選択した。最終の産生性評価のために、それらを無血清の産生用培地に移した。それらの産生性を第一のトランスフェクション後のサブクローン、つまりクローン43-16-A10と比較した。産生性は第二のトランスフェクションおよび選択後の2つのクローン43-16-A10-S1-16および43-16-A10-S24-11の場合、バッチ振盪フラスコ中で7日後に221 μg/mlから、それぞれ、436 μg/mlおよび407 μg/mlまで2倍に増大した。バッチ振盪フラスコ中で10日間のインキュベーション後、産生性は306 μg/mlから、それぞれ683 μg/mlおよび446 μg/mlまで増大した。

0142

細胞あたりの特異的産生性は、第一のトランスフェクション後のクローン43-16-A10の17 pg/細胞/日から、一つ目のトランスフェクトクローン43-16-A10-S1-16の40 pg/細胞/日まで、および二つ目のトランスフェクトクローン43-16-A10-S24-11の33 pg/細胞/日まで、同様に増大した。第二のトランスフェクションで、倍加時間は影響を受けなかった。第一のトランスフェクション後のクローン43-16-A10の倍加時間は、33時間であったが、43-16-A10-S1-16および43-16-A10-S24-11の両方のクローンの場合には32時間であった。

0143

実施例7
抗IL-13Rα抗体を発現するための発現ベクター
発現用の細胞株を本発明によって得ることができる別の例の(好ましくはモノクローナル)抗体は、IL-13受容体α1に結合する抗体(抗IL-13Rα1 抗IL-13Rα抗体)である。そのような抗体および対応する核酸配列は、例えば、WO 2006/072564またはSEQID NO: 19〜28に記述されている。

0144

ゲノムヒトκ軽鎖定常領域遺伝子セグメント(C-κ)を抗IL-13Rα抗体の軽鎖可変領域に付加し、ヒトγ1重鎖定常領域遺伝子セグメント(CH1-ヒンジ-CH2-CH3)を抗IL-13Rα抗体の重鎖可変領域に付加した。発現プラスミド5321は抗IL-13Rα抗体γ1重鎖および抗IL-13Rα抗体κ軽鎖の発現カセット、ならびにマウスDHFR遺伝子をコードする核酸を含む。注釈付きプラスミドマップを図9に示す。

0145

(a)重鎖発現カセット
抗IL-13Rα抗体コンジュゲート重鎖の転写単位は以下の要素から構成される:
-ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター(CMVIE)、
- 5'非翻訳領域(5'UTR)、
-イントロン-エキソン遺伝子構造中のシグナルペプチドを含む抗IL-13Rα抗体γ1重鎖コンジュゲートのコード配列、
- ヒトγ1免疫グロブリンポリアデニル化シグナル配列。

0146

(b)軽鎖発現カセット
抗IL-13Rα抗体軽鎖の転写単位は以下の要素から構成される:
-ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター(CMVIE)、
- 5'非翻訳領域(5'UTR)、
-イントロン-エキソン遺伝子構造中の抗IL-13Rακ軽鎖のコード配列、
-ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化シグナル配列。

0147

(c)発現プラスミド
抗IL-13Rα抗体コンジュゲートの発現および産生のため、軽鎖および重鎖発現カセットを単一の発現ベクターに(重鎖の上流に軽鎖を)配置した。含まれる選択可能なマーカー遺伝子、具体的には、マウスDHFR遺伝子およびマウスDHFR遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子の両方だけが異なる、二種の同一の発現ベクターを作出した。

0148

発現ベクターは軽鎖および重鎖発現カセットに加えて、以下の要素を含む:
-大腸菌においてプラスミドの複製を可能にする複製起点(pUC起点)、
- 大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子。

0149

実施例8
抗IL-13Rα抗体を発現するCHO細胞株のトランスフェクションおよび選択
第一のトランスフェクションおよび選択段階のため、プラスミド5321を用いた。プラスミド5321をエレクトロポレーションにより、ProCHO4完全培地での増殖に適応させた親細胞株にトランスフェクトした。プレートにおいて最大200 nMのメトトレキサートを補充したHyQSFMCHO培地(HyClone)の中でトランスフェクト細胞を培養した。培養上清中の抗体濃度を抗ヒトIgG1ELISAによって評価した。クローンを試験し、それらのうちで選択したものを24ウェルプレート、6ウェルプレートおよびその後に振盪機フラスコの中でさらに培養した。増殖および産生性を抗ヒトIgG1 ELISAおよび/または分析的プロテインAHPLCにより、静置培養および浮遊培養において評価した。最良のクローン(最良のクローンとは最も産生性のクローンを意味するのではなく、さらなる段階のために最良の特性を持ったクローンを意味する)を選択した。選択したクローンを200_019と名付けた。7日間の培養後、産生性は90 μg/mlで、平均の特異的産生率は7 pg/細胞*dであった。

0150

第二のトランスフェクションおよび選択段階のため、DHFRおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドを用いた。プラスミドをエレクトロポレーションにより、最大200 nMのメトトレキサートを補充したHyQSFMCHO培地(HyClone)の中で培養した選択細胞株にトランスフェクトした。二重選択培地にはさらに300 μg/mlのハイグロマイシンBを含めた。単一の抗体を分泌する細胞を、FACS解析によりプロテインAAlexa Fluorコンジュゲートでの染色後のその蛍光強度に基づいて特定し沈着させた。選択したクローンを5_17_35と名付けた。7日間の培養後、産生性は150 μg/mlで、平均の特異的産生率は10 pg/細胞*dであった。

0151

実施例9
抗CD4抗体コンジュゲートを発現するための発現ベクター
発現用の細胞株を本発明によって得ることができる別の例の(モノクローナル)抗体は、2つから8つの抗融合性ペプチドに結合された、ヒトCD4表面受容体に対する抗体(抗CD4抗体)である。そのような抗体および対応する核酸配列は、例えばPCT/EP2008/005894またはSEQID NO: 29〜40に報告されている。

0152

ゲノムヒトκ軽鎖定常領域遺伝子セグメント(C-κ)をSEQID NO: 39の抗CD4抗体の軽鎖可変領域に付加し、ヒトγ1重鎖定常領域遺伝子セグメント(CH1-ヒンジ-CH2-CH3)をSEQ ID NO: 36の抗CD4抗体の重鎖可変領域に付加した。発現プラスミド6311は、最後の一つ前のC末端アミノ酸の位置で、すなわち重鎖のC末端リジン残基を除去して、SEQ ID NO: 42のペプチド性グリシン-セリンリンカーによりSEQ ID NO: 41の抗融合性ペプチドをコードする核酸と連結された、抗CD4抗体γ1重鎖、および抗CD4抗体κ軽鎖、ならびに選択可能なマーカーのネオマイシンに対する耐性を付与する核酸を含む。注釈付きプラスミドマップを図8に示す。

0153

(a)重鎖発現カセット
抗CD4抗体コンジュゲート重鎖の転写単位は以下の要素から構成される:
-ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター(CMVIE)、
- 5'非翻訳領域(5'UTR)、
-イントロン-エキソン遺伝子構造中のシグナルペプチドを含む抗CD4抗体γ1重鎖コンジュゲートのコード配列、
-SV40初期ポリAシグナル配列。

0154

(b)軽鎖発現カセット
抗CD4抗体コンジュゲート軽鎖の転写単位は以下の要素から構成される:
-ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター(CMVIE)、
- 5'非翻訳領域(5'UTR)、
-イントロン-エキソン遺伝子構造中の抗CD4κ軽鎖のコード配列、
-SV40初期ポリAシグナル配列。

0155

(c)発現プラスミド
抗CD4抗体コンジュゲートの発現および産生のため、軽鎖および重鎖発現カセットを単一の発現ベクターに(重鎖の上流に軽鎖を)配置した。含まれる選択可能なマーカー遺伝子、具体的には、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子だけが異なる、三種の同一の発現ベクターを作出した。

0156

発現ベクターは軽鎖および重鎖発現カセットに加えて、以下の要素を含む:
- pUC18から取った、大腸菌においてプラスミドの複製を可能にする複製起点(pUC起点)、
- 大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子。

0157

実施例10
抗CD4抗体コンジュゲートを発現するCHO細胞株のトランスフェクションおよび選択
トランスフェクションおよび選択段階:
第一のトランスフェクションおよび選択段階のため、プラスミド6311を用いた。プラスミド6311をエレクトロポレーションにより、ProCHO4完全培地での増殖に適応させた親細胞株にトランスフェクトした。96ウェルプレートにおいて最大700 μg/mlのG418を補充したProCHO4完全培地の中でトランスフェクト細胞を培養した。培養上清中の抗体濃度を抗ヒトIgG1ELISAによって評価した。およそ5000クローンを試験し、それらのうちで選択したものを24ウェルプレート、6ウェルプレートおよびその後に振盪機フラスコの中でさらに培養した。およそ15クローンの増殖および産生性を抗ヒトIgG1 ELISAおよび/または分析的プロテインAHPLCにより、静置培養および浮遊培養において評価した。最良のクローン(最良のクローンとは最も産生性のクローンを意味するのではなく、さらなる段階のために最良の特性を持ったクローンを意味する)を、700 μg/mlのG418を補充したProCHO4馴化培地中での限界希釈によってサブクローニングした。

0158

二種の方法、つまり限界希釈(LD)法および蛍光標識細胞分取(FACS)法によってサブクローンを得た。

0159

限界希釈:
限界希釈のため、細胞を96ウェル培養プレート1ウェルにつき培地0.1 mlあたり細胞0.5〜2個の細胞密度でProCHO4選択培地中にてプレーティングした。

0160

クローンの特定および単離を含むフローサイトメトリーによる単細胞沈着:
蛍光標識細胞分取法の場合には、エレクトロポレーション処理した細胞の集団をProCHO4完全培地中にてTフラスコに直接播種した。適切な1つまたは複数の選択剤(G418、ハイグロマイシンおよび/またはピューロマイシン)をトランスフェクションから1日後に培養物に添加し、形質移入体のプールを増大させた。およそ112クローンの増殖および産生性を抗ヒトIgG1ELISAおよび/または分析的プロテインAHPLCにより、静置培養および浮遊培養において評価した。選択したクローンをI-17と名付けた。

0161

第二のトランスフェクションおよび選択段階のため、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドを用いた。プラスミドをエレクトロポレーションにより、700 μg/mlのG418を補充したProCHO4完全培地中で培養された細胞株クローンI-17にトランスフェクトした。200 μg/mlのG418および300 μg/mlのハイグロマイシンを補充したProCHO4馴化培地(ProCHO4二重選択培地)の中で約2〜3週間トランスフェクト細胞を増殖させた。単一抗体を分泌する細胞をFACS解析により、プロテインAAlexa Fluorコンジュゲートによる染色後にその蛍光強度に基づいて特定し沈着させた。96ウェルプレートにおいてProCHO4二重選択培地の中で沈着細胞を培養した。培養上清中の抗体濃度を抗ヒトIgG1ELISAによって評価した。選択したクローンを24_16と名付けた。

0162

第三のトランスフェクションおよび選択段階のため、ピューロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドを用いた。プラスミドをエレクトロポレーションにより、ProCHO4二重選択培地中で培養された細胞株クローン24_16にトランスフェクトした。ProCHO4三重選択培地(200 μg/mlのG418および300 μg/mlのハイグロマイシンおよび4 μg/mlのピューロマイシンを補充したProCHO4馴化培地)の中で約2〜3週間トランスフェクト細胞を増殖させた。単一抗体を分泌する細胞をFACS解析により、プロテインAAlexa Fluorコンジュゲートによる染色後にその蛍光強度に基づいて特定し沈着させた。96ウェルプレートにおいてProCHO4三重選択培地の中で沈着細胞を培養した。培養上清中の抗体濃度を抗ヒトIgG1ELISAによって評価した。選択したクローンを1_24と名付けた。

0163

クローン特性:
以下の表から分かるように、基礎の細胞株CHO-K1 (野生型)および選択されたクローンを比較した場合、倍加時間および培養3日後の細胞密度は同程度であった。

0164

(表5) 増殖特性

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