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技術 生物学的に活性なポリペプチドの特性を改変するための組成物および方法

出願人 アムニクスオペレーティングインコーポレイテッド
発明者 ボーギン,オレンステマー,ウィレムピー.シェレンベルガー,フォルカーイン,ヨンワン,チア-ウェイジーシング,ナサンシー.
出願日 2008年8月15日 (12年4ヶ月経過) 出願番号 2010-521048
公開日 2010年12月2日 (10年0ヶ月経過) 公開番号 2010-536341
状態 拒絶査定
技術分野 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 微生物、その培養処理 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質 医薬品製剤 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造
主要キーワード プリセット基準 結合接点 ポリ有機酸 口取り 予備負荷 ライリン スネイル 初期スパイク
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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は1つ以上のアクセサリーポリペプチドに連結した生物学的に活性ポリペプチドに関する。本発明はまた、主題タンパク性物質をコードするベクター包含する組み換えポリペプチド、並びに該ベクターを含む宿主細胞を提供する。主題の組成物医薬品用途の範囲を包含する種々の利用性を有する。一実施形態において、生物学的に活性なポリペプチドを生成する方法が提供され、この方法は、a)宿主細胞における修飾ポリペプチド発現が、該生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に、より高い量の可溶性型の該生物学的に活性なポリペプチドをもたらすように、アクセサリーポリペプチドと連結された生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を提供する工程;b)該修飾ポリペプチドを該宿主細胞内で発現させることにより、該生物学的に活性なポリペプチドを生成する工程;を含む。

概要

背景

組み換えタンパク質は新しい治療薬の開発のための極めて魅力的な候補となっている。しかしながら、タンパク質医薬品の生成は特定の生物学的に活性ポリペプチドの十分な収量を得るためには多大なプロセスの最適化を必要とする。エシェリシアコリ細胞質内の組み換えタンパク質の発現は、特に哺乳類組み換えタンパク質の場合、封入体として知られている不溶性凝集塊の形成をもたらす場合が多い。E.coliの封入体からの組み換えタンパク質の高い細胞密度発酵及び精製は、治療用タンパク質経費効果的な生成に関わる2つの主な障害である(非特許文献1)。同様に、数百のタンパク質を種々の活性に関してスクリーニングする必要がある研究目的のためには、可溶性で活性なタンパク質の発現が望ましく、これにより封入体を先ず精製して次に各々別個にタンパク質を変性して再折畳する必要がある工程を回避できる。

E.coliの細胞質空間内で発現される場合に不溶性の封入体を形成する多くの薬学的に重要なタンパク質の例は、ヒト成長ホルモン(hGH)(非特許文献2;非特許文献3)、ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)(非特許文献4;非特許文献5)及びインターフェロンアルファ(IFNアルファ;非特許文献6)を包含する。更に又、抗体の免疫グロブリンドメイン及びそのフラグメント、例えばドメイン抗体フラグメント(dAb)、Fvフラグメント、単鎖Fvフラグメント(scFv)、FabフラグメントFab’2フラグメント及び多くの非抗体タンパク質(例えばFnIIIドメイン)は一般的に細菌宿主の細胞質内での発現の際には封入体を形成する(非特許文献7;非特許文献8;非特許文献9)。

ヒトタンパク質は、典型的には多数の疎水性アミノ酸を含む疎水性コア部を用いて折り畳まれる。研究によればタンパク質は、特に、タンパク質のネイティブ結合相手不在であるために折り畳みの支援が得られず、そして疎水性パッチ露出しているような、ある生物に由来する遺伝子が別の発現宿主内で発現される場合に、凝集して封入体を形成することができることが分かっている。これは特に大きい進化的距離を横断する場合に当てはまり、例えば真核生物から単離したcDNAは、原核生物内の組み換え遺伝子として発現される場合に、凝集して封入体を形成する危険性が高くなる。cDNAは翻訳可能mRNAを適切にコードし得るが、生じるタンパク質は外来微小環境内に出現することになる。これは、濃度が十分高い場合には、一般的には凝集塊として蓄積する誤って折り畳まれた不活性のタンパク質をもたらす場合が多い。他のエフェクター、例えば原核生物細胞の内部の微小環境(pH、浸透圧)は遺伝子の本来の発生元のものとは異なり、そしてタンパク質の折り畳みに影響する場合がある。タンパク質を折り畳む機序は又、宿主依存性であり、そしてこのため非相同宿主内には非存在である場合があり、そして通常は疎水性コア部の一部として埋没したままとなる疎水性の残基がむしろ露出したままとなり、他のタンパク質上の疎水性の部位との相互作用のために使用可能となる。発現されたタンパク質の内部ポリペプチドの切断及び除去のためのプロセス系もまた細菌内には非存在である場合がある。更に又、タンパク質濃度を低く維持する場合がある精密な制御もまた原核生物細胞内では失われている場合があり、そして過剰発現は、適切に折り畳まれていてもその環境を飽和させることにより沈殿する場合があるタンパク質で細胞充填してしまう場合がある。

封入体内に存在する凝集した状態からの生物学的に活性な生成物回収は典型的にはカオトロピック剤又は酸を用いた展開と、その後の最適化された再折り畳み用緩衝液中への希釈又は透析により達成される。しかしながら、多くのポリペプチド(特に構造的に複雑なオリゴマータンパク質及び多数のジスルフィド結合を含有するもの)は化学変性後に活性なコンフォメーションを容易には採らない。

一次構造における小さい変化は、おそらくは折り畳みの経路改変することにより溶解性に影響する場合がある(Mitraki,A.ら、(1989)Bio/Technology 7,690;Baneyx,F,ら、2004 Nat Biotechnol,22,1399;Ventura,S.2005 Microb Cell Fact,4,11)。高密度の発酵の間における不溶性凝集塊の形成を低減するために、一部のグループは非相同の融合タンパク質を目的のタンパク質に連結させている。そのような融合配列の例はグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼPDI)、チオレドキシン(TRX)、マルトース結合タンパク質(MBP)、His6タグ,キチン結合ドメイン(CBD)及びセルロース結合ドメイン(CBD)である(Sahadev,S.ら、2007,Mol.Cell.Biochem.;Dysom,M.R.ら、2004,BMCBiotechnol,14,32)。総括すれば、これらの手順は、それらが全てのタンパク質に対して功を奏するわけではないため、タンパク質特異的であることが分かっている。

種々の融合タンパク質が折り畳みを向上させるために設計されているが、タンパク質の化学的PEG化もまたタンパク質の溶解性を増強し、凝集を低減し、免疫原性を低減し、そしてタンパク質分解を低減することが報告されている。しかしなお過剰生成されたポリペプチドの適切な折り畳みは、凝集が濃度依存的な様式で起こる細胞質の高度に濃縮された粘稠な環境の内部においては問題であり続けている。細菌宿主内の哺乳類タンパク質の発現のための別の手順はリーダーペプチドを回避しており、そして宿主の細胞質内で直接活性なタンパク質を発現する。しかしながらこのプロセスは凝集及び封入体の形成をもたらす傾向がある。

細菌内での活性形態の哺乳類タンパク質の発現のための1つの広範に使用されている手順は、典型的には分泌指向するシグナルペプチド又はリーダーペプチドを用いて、E.coliのような細菌宿主のペリプラズム空間の非還元環境内にタンパク質を指向させることである。ペリプラズム内への(稀には培地中への)分泌はタンパク質分泌、折り畳み及びジスルフィド形成のネイティブな真核生物のプロセスを模倣していると考えられ、そして頻繁には活性なタンパク質をもたらす。この手順は多くの深刻な難点を有している。ペリプラズムは低い収量を与える傾向があり;該プロセスは一般的にはより小型のタンパク質に限定され;該プロセスはタンパク質特異的である傾向があり;そしてまたペリプラズムタンパク質を抽出するための操作法は細胞質からの抽出ほどはロバストではなく、これが低収量に寄与している。このような理由のために、細菌のペリプラズム内のタンパク質の発現は大部分の医薬タンパク質には適用されず、これらは典型的には酵母又は哺乳類細胞系内で商業的に発現されている。

封入体を形成することなく細菌の細胞質内で哺乳類タンパク質を発現させるために試みられている別の手順は、広範囲生物工学的な用途において役割を果たす分子シャペロンのような折り畳みヘルパータンパク質を過剰発現することである(Mogkら、2002 Chembiochem 3,807)。今日まで、数種の異なるファミリーシャペロンが報告されている。全ては、展開された、又は部分的に展開されたタンパク質に結合し、そして細菌の細胞質内に折り畳まれたタンパク質を正確に放出するその能力を特徴としている。十分特性化された例は熱ショックタンパク質のファミリー(Hsp)であり、これらはBuchner,J.,Faseb J.1996 10,10により、そしてBeissinger,M.及びBuchner,1998.J.Biol.Chem.379,245により記載される通り、それらの相対分子量に従って設計されている。多くの細菌及び真核生物のシャペロンがタンパク質の過剰発現を目的に細菌において、そして程度は低いが哺乳類細胞においても試みられているが、この手順は一般的に効果が殆ど又は全くなく、そして、発現最適化のための実施頻度は更に低い。

従って、生物学的に活性なタンパク質の生成のため、そして原核生物のような宿主細胞を利用して大規模な生成を行うために、それらの溶解性を向上させるための方法及び組成物の必要性は多大である。

概要

本発明は1つ以上のアクセサリーポリペプチドに連結した生物学的に活性なポリペプチドに関する。本発明はまた、主題タンパク性物質をコードするベクターを包含する組み換えポリペプチド、並びに該ベクターを含む宿主細胞を提供する。主題の組成物は医薬品用途の範囲を包含する種々の利用性を有する。一実施形態において、生物学的に活性なポリペプチドを生成する方法が提供され、この方法は、a)宿主細胞における修飾ポリペプチドの発現が、該生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に、より高い量の可溶性型の該生物学的に活性なポリペプチドをもたらすように、アクセサリーポリペプチドと連結された生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を提供する工程;b)該修飾ポリペプチドを該宿主細胞内で発現させることにより、該生物学的に活性なポリペプチドを生成する工程;を含む。

目的

封入体を形成することなく細菌の細胞質内で哺乳類タンパク質を発現させるために試みられている別の手順は、広範囲の生物工学的な用途において役割を果たす分子シャペロンのような折り畳みヘルパータンパク質を過剰発現することである

効果

実績

技術文献被引用数
3件
牽制数
2件

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請求項1

生物学的に活性ポリペプチドを生成する方法であって、a)宿主細胞における修飾ポリペプチド発現が、該生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に、より高い量の可溶性型の該生物学的に活性なポリペプチドをもたらすように、アクセサリーポリペプチドと連結された生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を提供する工程;b)該修飾ポリペプチドを該宿主細胞内で発現させることにより、該生物学的に活性なポリペプチドを生成する工程;を含む、方法。

請求項2

宿主細胞における前記修飾ポリペプチドの発現が、前記生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に、少なくとも約2倍多い可溶性型の生物学的に活性なポリペプチドをもたらす、請求項1記載の方法。

請求項3

宿主細胞における前記修飾ポリペプチドの発現が、前記生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に、少なくとも約5倍多い可溶性型の生物学的に活性なポリペプチドをもたらす、請求項1記載の方法。

請求項4

宿主細胞における前記修飾ポリペプチドの発現が、前記生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に、少なくとも約10倍多い可溶性型の生物学的に活性なポリペプチドをもたらす、請求項1記載の方法。

請求項5

宿主細胞における前記修飾ポリペプチドの発現が、前記生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に、約2倍〜約10倍多い可溶性型の生物学的に活性なポリペプチドをもたらす、請求項1記載の方法。

請求項6

前記アクセサリーポリペプチドが約50超のアミノ酸を含む請求項1記載の方法。

請求項7

前記アクセサリーポリペプチドが約100超のアミノ酸を含む請求項1記載の方法。

請求項8

前記生物学的に活性なポリペプチドがヒト成長ホルモン(hGH)、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、インターフェロンアルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマインスリンエリスロポエチン腫瘍壊死因子−アルファ(TFN−アルファ)、IL−1RA、エキセナチドウリカーゼ及びプラムリチドからなる群より選択される、請求項1記載の方法。

請求項9

前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも40連続するアミノ酸を含み、更に、(a)該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン(G)、アスパルテート(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタメート(E)及びプロリン(P)残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約80%超を構成し;並びに/又は、(b)少なくとも50%の該アミノ酸がChou−Fasmanアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている;請求項1記載の方法。

請求項10

前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも40連続するアミノ酸を含み、該アクセサリーポリペプチドが対象において約4時間超のインビトロ血清中半減期を有し、そして更に、(a)該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン(G)、アスパルテート(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタメート(E)及びプロリン(P)残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約80%超を構成し;並びに/又は、(b)少なくとも50%の該アミノ酸がChou−Fasmanアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている;請求項1記載の方法。

請求項11

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも50%がグリシン(G)残基である、請求項1記載の方法。

請求項12

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも80%がグルタミン酸(E)、グリシン(G)及びセリン(S)からなる群より選択される、請求項1記載の方法。

請求項13

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の50%未満がグリシン(G)残基である、請求項1記載の方法。

請求項14

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも50%がセリン(S)残基である、請求項1記載の方法。

請求項15

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも50%がセリン(S)及びグリシン(G)残基の何れかである、請求項1記載の方法。

請求項16

前記アクセサリーポリペプチドが、(a)3つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン(A)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)及びチロシン(Y)からなる群より選択され;そして(b)10以上のアミノ酸を含む;ことを特徴とする、請求項1記載の方法。

請求項17

前記アクセサリーポリペプチドが3つの型のアミノ酸よりなり、各型がアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、セリン(S)、及びスレオニン(T)からなる群より選択される、請求項16記載の方法。

請求項18

前記アクセサリーポリペプチドが3つの型のアミノ酸よりなり、各型がグルタミン酸(E)、グリシン(G)、及びセリン(S)からなる群より選択される、請求項16記載の方法。

請求項19

前記アクセサリーポリペプチドが、(a)2つの型のアミノ酸よりなり、その1つはグリシン(G)であり、そしてもう1つの型はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)、アラニン(A)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、バリン(V)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)、及びシステイン(C)からなる群より選択され;そして(b)10以上のアミノ酸残基を含み、そのうち50%以下がグリシンである;ことを特徴とする、請求項1記載の方法。

請求項20

前記アクセサリーポリペプチドが、(a)50以上のアミノ酸を含み;(b)2つの型のアミノ酸よりなり;そして(c)総アミノ酸の50%以下がアラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、及びヒスチジン(H)からなる群より選択される;ことを特徴とする、請求項1記載の方法。

請求項21

前記アクセサリーポリペプチドが10以上の反復モチーフを含む、請求項1記載の方法。

請求項22

多数のアクセサリーポリペプチドを含む、請求項1記載の方法。

請求項23

請求項1記載の修飾ポリペプチドを発現する、宿主細胞。

請求項24

請求項1記載のポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子ベヒクル

請求項25

前記アクセサリーポリペプチドが最大10コピー反復配列よりなり、各反復配列が約8〜約12のアミノ酸を有する、請求項1記載の方法。

請求項26

前記修飾ポリペプチドが前記アクセサリータンパク質プロテアーゼ切断部位を介して連結している、請求項1記載の方法。

請求項27

前記プロテアーゼ切断部位が前記生物学的に活性なポリペプチドをコードしている配列の一部ではない、請求項25記載の方法。

請求項28

前記プロテアーゼ切断部位がTEVプロテアーゼエンテロキナーゼ、第Xa因子トロンビン、PreScissionTMプロテアーゼ、3Cプロテアーゼ、ソルターゼA、及びグランザイムBからなる群より選択される、請求項26記載の方法

請求項29

前記アクセサリーポリペプチドがアフィニティータグを含む、請求項1記載の方法。

請求項30

前記アフィニティータグがFLAG、Hisタグ、CBD、GST、MBP及びTRXからなる群より選択される、請求項28記載の方法。

請求項31

前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項1記載の方法。

請求項32

前記宿主細胞がE.coliである、請求項1記載の方法。

請求項33

前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項1記載の方法。

請求項34

前記宿主細胞が哺乳類細胞及び酵母細胞からなる群より選択される、請求項1記載の方法。

請求項35

アクセサリーポリペプチドに連結した可溶性形態の生物学的に活性なポリペプチドを含む組成物であって、該アクセサリーポリペプチドは、該生物学的に活性なポリペプチドと連結されている場合には、連結された該生物学的に活性なポリペプチドが発現される宿主細胞のサイトゾル画分中において該生物学的に活性なポリペプチドの溶解性を増大させる、組成物。

請求項36

前記生物学的に活性なポリペプチドが前記アクセサリーポリペプチドにプロテアーゼ切断部位を介して連結している、請求項35記載の組成物。

請求項37

前記生物学的に活性なポリペプチドがヒト成長ホルモン(hGH)、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インスリン、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子−アルファ(TFN−アルファ)、IL−1RA、エキセナチド、ウリカーゼ及びプラムリチドからなる群より選択される、請求項35記載の組成物。

請求項38

前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも40連続するアミノ酸を含み、更に、(a)該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン(G)、アスパルテート(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタメート(E)及びプロリン(P)残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約80%超を構成し;並びに/又は、(b)少なくとも50%の該アミノ酸がChou−Fasmanアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている;請求項35記載の組成物。

請求項39

前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも40連続するアミノ酸を含み、該アクセサリーポリペプチドが対象において約4時間超のインビトロ血清中半減期を有し、そして更に、(a)該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン(G)、アスパルテート(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタメート(E)及びプロリン(P)残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約80%超を構成し;並びに/又は、(b)少なくとも50%の該アミノ酸がChou−Fasmanアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている;請求項35記載の組成物。

請求項40

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも50%がグリシン(G)残基である、請求項35記載の組成物。

請求項41

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも80%がグルタミン酸(E)、グリシン(G)及びセリン(S)からなる群より選択される、請求項35記載の組成物。

請求項42

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の50%未満がグリシン(G)残基である、請求項35記載の組成物。

請求項43

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも50%がセリン(S)残基である、請求項35記載の組成物。

請求項44

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも50%がセリン(S)及びグリシン(G)残基の何れかである、請求項35記載の組成物。

請求項45

前記アクセサリーポリペプチドが、(a)3つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン(A)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)及びチロシン(Y)からなる群より選択され;そして(b)10以上のアミノ酸を含む;ことを特徴とする、請求項35記載の組成物。

請求項46

前記アクセサリーポリペプチドが3つの型のアミノ酸よりなり、各型がアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、セリン(S)、及びスレオニン(T)からなる群より選択される、請求項45記載の組成物。

請求項47

前記アクセサリーポリペプチドが3つの型のアミノ酸よりなり、各型がグルタミン酸(E)、グリシン(G)、及びセリン(S)からなる群より選択される、請求項45記載の組成物。

請求項48

前記アクセサリーポリペプチドが、(a)2つの型のアミノ酸よりなり、その1つはグリシン(G)であり、そしてもう1つの型はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)、アラニン(A)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、バリン(V)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)、及びシステイン(C)からなる群より選択され;(b)10以上のアミノ酸残基を含み、そのうち50%以下がグリシンである;ことを特徴とする、請求項35記載の組成物。

請求項49

前記アクセサリーポリペプチドが、(a)50以上のアミノ酸を含み;(b)2つの型のアミノ酸よりなり;(c)総アミノ酸の50%以下がアラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、及びヒスチジン(H)からなる群より選択される;ことを特徴とする、請求項35記載の組成物。

請求項50

前記アクセサリーポリペプチドが10以上の反復モチーフを含む、請求項35記載の組成物。

請求項51

前記アクセサリーポリペプチドが約+0.1以上の正味の正荷電の前記連結した生物学的に活性なポリペプチドを提供する、請求項35記載の組成物。

請求項52

前記アクセサリーポリペプチドが約−0.1以下の正味の負荷電の前記連結した生物学的に活性なポリペプチドを提供する、請求項35記載の組成物。

請求項53

前記アクセサリーポリペプチドが約+0.1以上の正味の正荷電の前記修飾ポリペプチドを提供する、請求項1記載の方法。

請求項54

前記アクセサリーポリペプチドが約−0.1以下の正味の負荷電の前記修飾ポリペプチドを提供する、請求項1記載の方法。

請求項55

a)緩徐放出剤、b)アクセサリーポリペプチドに連結した生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドであって、ここで、該アクセサリーポリペプチドは、該生物学的に活性なポリペプチドのプロテアーゼ耐性を増大させる、修飾ポリペプチド;を含む、医薬組成物

請求項56

前記修飾ポリペプチドが3を超える見かけ分子ファクターを与え、更に、該見かけの分子量ファクターが、該修飾ポリペプチドの予測された分子量に対する、サイズ排除クロマトグラフィーにより計測した該修飾ポリペプチドの見かけの分子量の比として求められる、請求項55記載の医薬組成物。

請求項57

前記修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターが5を超えるものである、請求項55記載の組成物。

請求項58

前記修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターが7を超えるものである、請求項55記載の組成物。

請求項59

前記修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターが9を超えるものである、請求項55記載の組成物。

請求項60

前記アクセサリーポリペプチドが約50超のアミノ酸を含む、請求項55記載の組成物。

請求項61

前記アクセサリーポリペプチドが約100超のアミノ酸を含む、請求項55記載の組成物。

請求項62

前記生物学的に活性なポリペプチドがヒト成長ホルモン(hGH)、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インスリン、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子−アルファ(TFN−アルファ)、IL−1RA、エキセナチド、ウリカーゼ及びプラムリチドからなる群より選択される、請求項55記載の組成物。

請求項63

前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも40連続するアミノ酸を含み、更に、(a)該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン(G)、アスパルテート(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタメート(E)及びプロリン(P)残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約80%超を構成し;並びに/又は、(b)少なくとも50%の該アミノ酸がChou−Fasmanアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている;請求項55記載の組成物。

請求項64

前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも40連続するアミノ酸を含み、該アクセサリーポリペプチドが対象において約24時間超のインビトロ血清中半減期を有し、そして更に、(a)該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン(G)、アスパルテート(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタメート(E)及びプロリン(P)残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約80%超を構成し;並びに/又は、(b)少なくとも50%の該アミノ酸がChou−Fasmanアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている;請求項55記載の組成物。

請求項65

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも50%がグリシン(G)残基である、請求項55記載の組成物。

請求項66

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも80%がグルタミン酸(E)、グリシン(G)及びセリン(S)からなる群より選択される、請求項55記載の組成物。

請求項67

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の50%未満がグリシン(G)残基である、請求項55記載の組成物。

請求項68

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも50%がセリン(S)残基である、請求項55記載の組成物。

請求項69

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも50%がセリン(S)及びグリシン(G)残基の何れかである、請求項55記載の組成物。

請求項70

前記アクセサリーポリペプチドが、(a)3つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン(A)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)及びチロシン(Y)からなる群より選択され;そして(b)10以上のアミノ酸を含む;ことを特徴とする、請求項55記載の組成物。

請求項71

前記アクセサリーポリペプチドが3つの型のアミノ酸よりなり、各型がアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、セリン(S)、及びスレオニン(T)からなる群より選択される、請求項70記載の組成物。

請求項72

前記アクセサリーポリペプチドが3つの型のアミノ酸よりなり、各型がグルタミン酸(E)、グリシン(G)、及びセリン(S)からなる群より選択される、請求項70記載の組成物。

請求項73

前記アクセサリーポリペプチドが、(a)2つの型のアミノ酸よりなり、その1つはグリシン(G)であり、そしてもう1つの型はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)、アラニン(A)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、バリン(V)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)、及びシステイン(C)からなる群より選択され;そして(b)10以上のアミノ酸残基を含み、そのうち50%以下がグリシンである;ことを特徴とする、請求項55記載の組成物。

請求項74

前記アクセサリーポリペプチドが、(a)50以上のアミノ酸を含み;(b)2つの型のアミノ酸よりなり;そして(c)総アミノ酸の50%以下がアラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、及びヒスチジン(H)からなる群より選択される;ことを特徴とする、請求項55記載の組成物。

請求項75

前記アクセサリーポリペプチドが10以上の反復モチーフを含む、請求項55記載の組成物。

請求項76

多数のアクセサリーポリペプチドを含む、請求項55記載の組成物。

請求項77

前記緩徐放出剤が重合体マトリックスである、請求項55記載の組成物。

請求項78

前記重合体マトリックスがポリ−d,l−ラクチドPLA)、ポリ−(d,l−ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)、PLGA−PEG共重合体アルギネートデキストラン及びキトサンからなる群より選択される、請求項77記載の組成物。

請求項79

前記緩徐放出剤が経皮パッチである、請求項55記載の組成物。

請求項80

前記アクセサリーポリペプチドが荷電したアミノ酸を含む、請求項55記載の組成物。

請求項81

前記アクセサリーポリペプチドが荷電したアミノ酸を含み、更に前記緩徐放出剤が荷電した重合体マトリックスを含む、請求項55記載の組成物。

請求項82

修飾ポリペプチドの生成方法であって、該方法は:(a)請求項55記載の修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程;(b)該修飾ポリペプチドを宿主細胞内で発現させることにより、該修飾ポリペプチドを生成する工程;を含む、方法。

請求項83

請求項55記載の修飾ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、遺伝子ベヒクル。

請求項84

請求項55記載の修飾ポリペプチドを発現する、宿主細胞。

請求項85

制御放出組成物の生成方法であって、該方法は:(a)請求項55記載の修飾ポリペプチドを提供する工程;(b)該修飾ポリペプチドを重合体マトリックスと混合する工程;を含む、方法。

請求項86

a)緩徐放出剤、b)アクセサリーポリペプチドに連結した生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドであって、該アクセサリーポリペプチドは、該生物学的に活性なポリペプチドの溶解性を増大させる、修飾ポリペプチド;を含む、医薬組成物。

請求項87

前記修飾ポリペプチドが3を超える見かけの分子量ファクターを与え、更に、該見かけの分子量ファクターが、該修飾ポリペプチドの予測された分子量に対する、サイズ排除クロマトグラフィーにより計測した該修飾ポリペプチドの見かけの分子量の比として求められる、請求項86記載の医薬組成物。

請求項88

前記修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターが5を超えるものである、請求項86記載の組成物。

請求項89

前記修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターが7を超えるものである、請求項86記載の組成物。

請求項90

前記修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターが9を超えるものである、請求項86記載の組成物。

請求項91

前記アクセサリーポリペプチドが約50超のアミノ酸を含む、請求項86記載の組成物。

請求項92

前記アクセサリーポリペプチドが約100超のアミノ酸を含む、請求項86記載の組成物。

請求項93

前記生物学的に活性なポリペプチドがヒト成長ホルモン(hGH)、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インスリン、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子−アルファ(TFN−アルファ)、IL−1RA、エキセナチド、ウリカーゼ及びプラムリチドからなる群より選択される、請求項86記載の組成物。

請求項94

前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも40連続するアミノ酸を含み、更に、(a)該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン(G)、アスパルテート(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタメート(E)及びプロリン(P)残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約80%超を構成し;並びに/又は、(b)少なくとも50%の該アミノ酸がChou−Fasmanアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている;請求項86記載の組成物。

請求項95

前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも40連続するアミノ酸を含み、該アクセサリーポリペプチドが対象において約24時間超のインビトロ血清中半減期を有し、そして更に、(a)該アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン(G)、アスパルテート(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタメート(E)及びプロリン(P)残基の合計が、該アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約80%超を構成し;並びに/又は、(b)少なくとも50%の該アミノ酸がChou−Fasmanアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている;請求項86記載の組成物。

請求項96

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも50%がグリシン(G)残基である、請求項86記載の組成物。

請求項97

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも80%がグルタミン酸(E)、グリシン(G)及びセリン(S)からなる群より選択される、請求項86記載の組成物。

請求項98

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の50%未満がグリシン(G)残基である、請求項86記載の組成物。

請求項99

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも50%がセリン(S)残基である、請求項86記載の組成物。

請求項100

前記アクセサリーポリペプチドの全残基の少なくとも50%がセリン(S)及びグリシン(G)残基の何れかである、請求項86記載の組成物。

請求項101

前記アクセサリーポリペプチドが、(a)3つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン(A)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)及びチロシン(Y)からなる群より選択され;そして(b)10以上のアミノ酸を含む;ことを特徴とする、請求項86記載の組成物。

請求項102

前記アクセサリーポリペプチドが3つの型のアミノ酸よりなり、各型がアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、セリン(S)、及びスレオニン(T)からなる群より選択される、請求項101記載の組成物。

請求項103

前記アクセサリーポリペプチドが3つの型のアミノ酸よりなり、各型がグルタミン酸(E)、グリシン(G)、及びセリン(S)からなる群より選択される、請求項101記載の組成物。

請求項104

前記アクセサリーポリペプチドが、(a)2つの型のアミノ酸よりなり、その1つはグリシン(G)であり、そしてもう1つの型はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)、アラニン(A)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、バリン(V)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)、及びシステイン(C)からなる群より選択され;そして(b)10以上のアミノ酸残基を含み、そのうち50%以下がグリシンである;ことを特徴とする、請求項86記載の組成物。

請求項105

前記アクセサリーポリペプチドが、(a)50以上のアミノ酸を含み;(b)2つの型のアミノ酸よりなり;そして(c)総アミノ酸の50%以下がアラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、及びヒスチジン(H)からなる群より選択される;ことを特徴とする、請求項86記載の組成物。

請求項106

前記アクセサリーポリペプチドが10以上の反復モチーフを含む、請求項86記載の組成物。

請求項107

多数のアクセサリーポリペプチドを含む、請求項86記載の組成物。

請求項108

前記緩徐放出剤が重合体マトリックスである、請求項86記載の組成物。

請求項109

前記重合体マトリックスがポリ−d,l−ラクチド(PLA)、ポリ−(d,l−ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)、PLGA−PEG共重合体、アルギネート、デキストラン及びキトサンからなる群より選択される、請求項108記載の組成物。

請求項110

前記緩徐放出剤が経皮パッチである、請求項86記載の組成物。

請求項111

前記アクセサリーポリペプチドが荷電したアミノ酸を含む、請求項86記載の組成物。

請求項112

前記アクセサリーポリペプチドが荷電したアミノ酸を含み、更に前記緩徐放出剤が荷電した重合体マトリックスを含む、請求項86記載の組成物。

請求項113

修飾ポリペプチドの生成方法であって、該方法は:(a)請求項86記載の修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程;(b)該修飾ポリペプチドを宿主細胞内で発現させることにより、該修飾ポリペプチドを生成する工程;を含む、方法。

請求項114

請求項86記載の修飾ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、遺伝子ベヒクル。

請求項115

請求項86記載の修飾ポリペプチドを発現する、宿主細胞。

請求項116

制御放出組成物の生成方法であって、該方法が、(a)請求項86記載の修飾ポリペプチドを提供する工程;(b)該修飾ポリペプチドを重合体マトリックスと混合する工程;を含む、方法。

請求項117

生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該アクセサリーポリペプチドは、(i)3つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン(A)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)及びチロシン(Y)からなる群より選択され;そして(b)10以上のアミノ酸を含む;ことを特徴とする、単離されたポリペプチド。

請求項118

前記アクセサリーポリペプチドが3つの型のアミノ酸よりなり、各型がD、E、G、K、P、R、S、及びTからなる群より選択される、請求項117記載の単離されたポリペプチド。

請求項119

前記アクセサリーポリペプチドが3つの型のアミノ酸よりなり、各型がE、S、G、R、及びAからなる群より選択される、請求項117記載の単離されたポリペプチド。

請求項120

前記生物学的に活性なポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項117記載の単離されたポリペプチド。

請求項121

前記アクセサリーポリペプチドが3つの型のアミノ酸よりなり、各型がE、G、及びSからなる群より選択される、請求項117記載の単離されたポリペプチド。

請求項122

生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該アクセサリーポリペプチドは、(i)2つの型のアミノ酸よりなり、その1つはグリシン(G)であり、そしてもう1つの型はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)、アラニン(A)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、バリン(V)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)、及びシステイン(C)からなる群より選択され;そして(ii)10以上のアミノ酸残基を含み、そのうち50%以下がグリシンである;ことを特徴とする、単離されたポリペプチド。

請求項123

生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該アクセサリーポリペプチドは、(i)10以上のアミノ酸を含み;(ii)2つの型のアミノ酸よりなり、総アミノ酸の50%以下がA、S、T、D、E、及びHからなる群より選択される;ことを特徴とする、単離されたポリペプチド。

請求項124

生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該アクセサリーポリペプチドは、(i)2つの型のアミノ酸よりなり、その1つはP、R、L、V、Y、W、M、F、I、K、及びCからなる群より選択され;(ii)10以上のアミノ酸を含む;ことを特徴とする、単離されたポリペプチド。

請求項125

生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該アクセサリーポリペプチドが少なくとも10アミノ酸長を含み、等しい数で示される2つの異なる型のアミノ酸よりなる、単離されたポリペプチド。

請求項126

2つの異なる型のアミノ酸が1:2の比で示される、請求項121、122、及び123の何れか1項に記載の単離されたポリペプチド。

請求項127

2つの異なる型のアミノ酸が2:3の比で示される、請求項121、122、及び123の何れか1項に記載の単離されたポリペプチド。

請求項128

2つの異なる型のアミノ酸が3:4の比で示される、請求項121、122、及び123の何れか1項に記載の単離されたポリペプチド。

請求項129

前記アクセサリーポリペプチドが4以上の反復モチーフを含み、各々は2〜500アミノ酸を含み、2つの異なる型のアミノ酸より構成される、請求項128記載の単離されたポリペプチド。

請求項130

前記反復モチーフが8を超えるアミノ酸を含む、請求項128記載の単離されたポリペプチド。

請求項131

前記4以上の反復モチーフが同一である、請求項128の何れか1項に記載の単離されたポリペプチド。

請求項132

前記4以上の反復モチーフが異なるアミノ酸配列を含む、請求項128の何れか1項に記載の単離されたポリペプチド。

請求項133

前記アクセサリーポリペプチドが少なくとも10の反復モチーフを含む、請求項128記載の単離されたポリペプチド。

請求項134

前記アクセサリーポリペプチドが二次構造を実質的に欠いている、請求項128記載の単離されたポリペプチド。

請求項135

前記単離されたポリペプチドの見かけの分子量が、前記アクセサリーポリペプチドを欠いた対応するポリペプチドの見かけの分子量よりも大きい、請求項128記載の単離されたポリペプチド。

請求項136

前記アクセサリーポリペプチドの見かけの分子量がその実際の分子量より少なくとも3倍大きい、請求項128記載の単離されたポリペプチド。

請求項137

前記アクセサリーポリペプチドを欠いた対応するポリペプチドと比較して2倍長い血清中半減期を示す、請求項128記載の単離されたポリペプチド。

請求項138

前記生物学的に活性なポリペプチド及び前記アクセサリーポリペプチドがペプチド結合を介して連結している、請求項128記載の単離されたポリペプチド。

請求項139

前記アクセサリーポリペプチドがアミノ酸配列(GGEGGS)nを含み、ここでnは3以上の整数である、請求項117の何れか1項に記載の単離されたポリペプチド。

請求項140

前記アクセサリーポリペプチドがアミノ酸配列(GES)nを含み、ここでG、E、及びSは何れかの順序であることができ、nは3以上の整数である、請求項117の何れか1項に記載の単離されたポリペプチド。

請求項141

前記アクセサリーポリペプチドがアミノ酸配列(GGSGGE)nを含み、ここでG、E、及びSは何れかの順序であることができ、nは3以上の整数である、請求項117の何れか1項に記載の単離されたポリペプチド。

請求項142

前記アクセサリーポリペプチドがアミノ酸配列(GGEGGEGGES)nを含み、ここでnは1以上の整数である、請求項117の何れか1項に記載の単離されたポリペプチド。

請求項143

単離されたポリペプチドの生成方法であって、a)請求項117、121、122、123、又は124の何れか1項に記載の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程;b)該ポリペプチドを宿主細胞内で発現させることにより、該ポリペプチドを生成する工程;を含む、方法。

請求項144

請求項117、121、122、123、又は124の何れか1項に記載の単離されたポリペプチドをコードする核酸配列を含む、遺伝子ベヒクル。

請求項145

請求項117、121、122、123、又は124の何れか1項に記載の単離されたポリペプチドを発現する、宿主細胞。

請求項146

請求項117、121、122、123、又は124の何れか1項に記載の単離されたポリペプチドのライブラリ

請求項147

ファージ粒子上にディスプレイされた、請求項145記載のライブラリ。

請求項148

a)緩徐放出剤、b)サイズ5kD超のPEG基に連結された生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドを含む修飾ポリペプチド;を含む、医薬組成物。

技術分野

0001

この出願は、係属中の2007年8月15日に出願された米国仮特許出願第60/956,109号、2007年10月18日に出願された同第60/981,073号および2007年11月8日に出願された同第60/986,569号(これらは、それらの全体が参考として本明細書に援用される)の優先権の利益を主張する。

背景技術

0002

組み換えタンパク質は新しい治療薬の開発のための極めて魅力的な候補となっている。しかしながら、タンパク質医薬品の生成は特定の生物学的に活性ポリペプチドの十分な収量を得るためには多大なプロセスの最適化を必要とする。エシェリシアコリ細胞質内の組み換えタンパク質の発現は、特に哺乳類組み換えタンパク質の場合、封入体として知られている不溶性凝集塊の形成をもたらす場合が多い。E.coliの封入体からの組み換えタンパク質の高い細胞密度発酵及び精製は、治療用タンパク質経費効果的な生成に関わる2つの主な障害である(非特許文献1)。同様に、数百のタンパク質を種々の活性に関してスクリーニングする必要がある研究目的のためには、可溶性で活性なタンパク質の発現が望ましく、これにより封入体を先ず精製して次に各々別個にタンパク質を変性して再折畳する必要がある工程を回避できる。

0003

E.coliの細胞質空間内で発現される場合に不溶性の封入体を形成する多くの薬学的に重要なタンパク質の例は、ヒト成長ホルモン(hGH)(非特許文献2;非特許文献3)、ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)(非特許文献4;非特許文献5)及びインターフェロンアルファ(IFNアルファ;非特許文献6)を包含する。更に又、抗体の免疫グロブリンドメイン及びそのフラグメント、例えばドメイン抗体フラグメント(dAb)、Fvフラグメント、単鎖Fvフラグメント(scFv)、FabフラグメントFab’2フラグメント及び多くの非抗体タンパク質(例えばFnIIIドメイン)は一般的に細菌宿主の細胞質内での発現の際には封入体を形成する(非特許文献7;非特許文献8;非特許文献9)。

0004

ヒトタンパク質は、典型的には多数の疎水性アミノ酸を含む疎水性コア部を用いて折り畳まれる。研究によればタンパク質は、特に、タンパク質のネイティブ結合相手不在であるために折り畳みの支援が得られず、そして疎水性パッチ露出しているような、ある生物に由来する遺伝子が別の発現宿主内で発現される場合に、凝集して封入体を形成することができることが分かっている。これは特に大きい進化的距離を横断する場合に当てはまり、例えば真核生物から単離したcDNAは、原核生物内の組み換え遺伝子として発現される場合に、凝集して封入体を形成する危険性が高くなる。cDNAは翻訳可能mRNAを適切にコードし得るが、生じるタンパク質は外来微小環境内に出現することになる。これは、濃度が十分高い場合には、一般的には凝集塊として蓄積する誤って折り畳まれた不活性のタンパク質をもたらす場合が多い。他のエフェクター、例えば原核生物細胞の内部の微小環境(pH、浸透圧)は遺伝子の本来の発生元のものとは異なり、そしてタンパク質の折り畳みに影響する場合がある。タンパク質を折り畳む機序は又、宿主依存性であり、そしてこのため非相同宿主内には非存在である場合があり、そして通常は疎水性コア部の一部として埋没したままとなる疎水性の残基がむしろ露出したままとなり、他のタンパク質上の疎水性の部位との相互作用のために使用可能となる。発現されたタンパク質の内部ポリペプチドの切断及び除去のためのプロセス系もまた細菌内には非存在である場合がある。更に又、タンパク質濃度を低く維持する場合がある精密な制御もまた原核生物細胞内では失われている場合があり、そして過剰発現は、適切に折り畳まれていてもその環境を飽和させることにより沈殿する場合があるタンパク質で細胞充填してしまう場合がある。

0005

封入体内に存在する凝集した状態からの生物学的に活性な生成物回収は典型的にはカオトロピック剤又は酸を用いた展開と、その後の最適化された再折り畳み用緩衝液中への希釈又は透析により達成される。しかしながら、多くのポリペプチド(特に構造的に複雑なオリゴマータンパク質及び多数のジスルフィド結合を含有するもの)は化学変性後に活性なコンフォメーションを容易には採らない。

0006

一次構造における小さい変化は、おそらくは折り畳みの経路改変することにより溶解性に影響する場合がある(Mitraki,A.ら、(1989)Bio/Technology 7,690;Baneyx,F,ら、2004 Nat Biotechnol,22,1399;Ventura,S.2005 Microb Cell Fact,4,11)。高密度の発酵の間における不溶性凝集塊の形成を低減するために、一部のグループは非相同の融合タンパク質を目的のタンパク質に連結させている。そのような融合配列の例はグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼPDI)、チオレドキシン(TRX)、マルトース結合タンパク質(MBP)、His6タグ,キチン結合ドメイン(CBD)及びセルロース結合ドメイン(CBD)である(Sahadev,S.ら、2007,Mol.Cell.Biochem.;Dysom,M.R.ら、2004,BMCBiotechnol,14,32)。総括すれば、これらの手順は、それらが全てのタンパク質に対して功を奏するわけではないため、タンパク質特異的であることが分かっている。

0007

種々の融合タンパク質が折り畳みを向上させるために設計されているが、タンパク質の化学的PEG化もまたタンパク質の溶解性を増強し、凝集を低減し、免疫原性を低減し、そしてタンパク質分解を低減することが報告されている。しかしなお過剰生成されたポリペプチドの適切な折り畳みは、凝集が濃度依存的な様式で起こる細胞質の高度に濃縮された粘稠な環境の内部においては問題であり続けている。細菌宿主内の哺乳類タンパク質の発現のための別の手順はリーダーペプチドを回避しており、そして宿主の細胞質内で直接活性なタンパク質を発現する。しかしながらこのプロセスは凝集及び封入体の形成をもたらす傾向がある。

0008

細菌内での活性形態の哺乳類タンパク質の発現のための1つの広範に使用されている手順は、典型的には分泌指向するシグナルペプチド又はリーダーペプチドを用いて、E.coliのような細菌宿主のペリプラズム空間の非還元環境内にタンパク質を指向させることである。ペリプラズム内への(稀には培地中への)分泌はタンパク質分泌、折り畳み及びジスルフィド形成のネイティブな真核生物のプロセスを模倣していると考えられ、そして頻繁には活性なタンパク質をもたらす。この手順は多くの深刻な難点を有している。ペリプラズムは低い収量を与える傾向があり;該プロセスは一般的にはより小型のタンパク質に限定され;該プロセスはタンパク質特異的である傾向があり;そしてまたペリプラズムタンパク質を抽出するための操作法は細胞質からの抽出ほどはロバストではなく、これが低収量に寄与している。このような理由のために、細菌のペリプラズム内のタンパク質の発現は大部分の医薬タンパク質には適用されず、これらは典型的には酵母又は哺乳類細胞系内で商業的に発現されている。

0009

封入体を形成することなく細菌の細胞質内で哺乳類タンパク質を発現させるために試みられている別の手順は、広範囲生物工学的な用途において役割を果たす分子シャペロンのような折り畳みヘルパータンパク質を過剰発現することである(Mogkら、2002 Chembiochem 3,807)。今日まで、数種の異なるファミリーシャペロンが報告されている。全ては、展開された、又は部分的に展開されたタンパク質に結合し、そして細菌の細胞質内に折り畳まれたタンパク質を正確に放出するその能力を特徴としている。十分特性化された例は熱ショックタンパク質のファミリー(Hsp)であり、これらはBuchner,J.,Faseb J.1996 10,10により、そしてBeissinger,M.及びBuchner,1998.J.Biol.Chem.379,245により記載される通り、それらの相対分子量に従って設計されている。多くの細菌及び真核生物のシャペロンがタンパク質の過剰発現を目的に細菌において、そして程度は低いが哺乳類細胞においても試みられているが、この手順は一般的に効果が殆ど又は全くなく、そして、発現最適化のための実施頻度は更に低い。

0010

従って、生物学的に活性なタンパク質の生成のため、そして原核生物のような宿主細胞を利用して大規模な生成を行うために、それらの溶解性を向上させるための方法及び組成物の必要性は多大である。

先行技術

0011

Panda,A.K、Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.(2003)85,43
Patra,A.K.ら、Protein Expr.Purif(2000)18,182
Khan,R.H,ら、Biotechnol.Prog.(1998)14,722
Zaveckas,M.ら、J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.(2007)852,409
Lee,A.Y.ら、Biotechnol Lett.(2003)25,205
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課題を解決するための手段

0012

本発明は生物学的に活性なポリペプチドを生成する方法を提供する。該方法では、典型的には、a)宿主細胞における修飾ポリペプチドの発現が、生物学的に活性なポリペプチド自体(例えばアクセサリーポリペプチドから遊離したもの)の発現と比較した場合に、より高い量の可溶性型の生物学的に活性なポリペプチドをもたらすように、前記アクセサリーポリペプチドと連結された生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を提供する工程;及びb)修飾ポリペプチドを前記宿主細胞内で発現させることにより、生物学的に活性なポリペプチドを生成する工程、を行う。1つの実施形態において、可溶性活性形態の生物学的に活性なポリペプチドの発現は、そのタンパク質の総量の約1%、5%、25%、50%、75%、95%又は99%である。1つの実施形態において、宿主細胞内での修飾ポリペプチドの発現は生物学的に活性なポリペプチド自体の発現と比較した場合に少なくとも約2倍高い可溶性形態の生物学的に活性なポリペプチドを与える。別の実施形態においては、生物学的に活性なポリペプチドは、プロテイナーゼ切断部位を介してアクセサリーポリペプチドに連結している。所望により、切断部位はTEVプロテアーゼエンテロキナーゼ、第Xa因子トロンビン、PreScissionTMプロテアーゼ、3Cプロテアーゼ、ソルターゼ(sortase)A、及びグランザイム(granzyme)Bからなる群より選択できる。一部の実施形態においては、宿主細胞内の修飾ポリペプチドの発現は約2倍、5倍、10倍、30倍、又は100倍以上の可溶性形態の生物学的に活性なポリペプチドをもたらす。

0013

本発明は又、修飾ポリヌクレオチド配列を発現するための宿主細胞を提供する。宿主細胞は典型的には原核生物、限定しないが例えばE.coliであり、それは又、真核生物、例えば酵母細胞、更には哺乳類細胞(例えばCHO細胞)であってもよい。

0014

本発明は又アクセサリーポリペプチドに連結しているかしていない生物学的に活性なポリペプチドをコードする主題のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子ベヒクルを提供する。

0015

更に本発明により提供されるものは、アクセサリーポリペプチドに連結した可溶性形態の生物学的に活性なポリペプチドを含む組成物であって、前記アクセサリーポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドと連結されている場合には、連結された生物学的に活性なポリペプチドが発現される宿主細胞のサイトゾル画分中において生物学的に活性なポリペプチドの溶解性を増大させる、組成物である。所望により、生物学的に活性なポリペプチドは、アクセサリーポリペプチドにプロテアーゼ切断部位を介して連結している。切断部はTEVプロテアーゼ、エンテロキナーゼ、第Xa因子、トロンビン、PreScissionTMプロテアーゼ、3Cプロテアーゼ、ソルターゼA、及びグランザイムBからなる群より選択されることができる。

0016

主題の方法又は組成物において使用されるアクセサリーポリペプチドは全体として、又は部分的に、以下の通り特性化できる。1つの実施形態において、主題のアクセサリーポリペプチドはアミノ酸残基当たり約+0.025、+0.05、+0.075、+0.1、+0.2、+0.3、+0.4、+0.5、+0.6、+0.7、+0.8、+0.9又は更には+1.0の電荷の修飾された生物学的に活性なポリペプチドの平均実質正電荷密度を与える。別の実施形態においては、主題のアクセサリーポリペプチドはアミノ酸残基当たり約−0.25、−0.5、−0.075、−0.1、−0.2、−0.3、−0.4、−0.5、−0.6、−0.7、−0.8、−0.9又は更には−1.0の平均実質電荷の修飾された生物学的に活性なポリペプチドの平均実質負電荷密度を与える。1つの実施形態において、主題のアクセサリーポリペプチドは約+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+12、+14、+16、+18、+20、+25、+30、+35、+40、+50以上の修飾された生物学的に活性なポリペプチドの実質正電荷を与える。1つの実施形態において、主題のアクセサリーポリペプチドは約−3、−4、−5、−6、−7、−8、−9、−10、−12、−14、−16、−18、−20、−25、−30、−35、−40、−50以上の修飾された生物学的に活性なポリペプチドの実質負電荷を与える。

0017

更に別の実施形態において、本発明のアクセサリーポリペプチドは約10、30、50又は100超のアミノ酸を含んでよい。1つの実施形態において、アクセサリーポリペプチドは少なくとも40連続するアミノ酸を含み、血清タンパク質に非特異的に結合することは実質的にはできない。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン(G)、アスパルテート(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタメート(E)及びプロリン(P)及びリジン(K)の残基の合計は、アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約80%超を構成し;並びに/又は、アクセサリーポリペプチドの少なくとも50%のアミノ酸がChou−Fasmanアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている。関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは少なくとも40連続するアミノ酸を含み、アクセサリーポリペプチドは約4時間、5時間、10時間、15時間又は24時間超のインビトロ血清中半減期を有する。更に、(a)アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン(G)、アスパルテート(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタメート(E)及びプロリン(P)及びリジン(K)の残基の合計がアクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約80%超を構成し;並びに/又は、(b)アクセサリーポリペプチドの少なくとも50%のアミノ酸がChou−Fasmanアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている。一部の実施形態においては、総アミノ酸の80%(又は50、60、70又は90%)が選択されるアミノ酸のセットは、G/S/E/D、G/S/K/R、G/S/E/D/K/R、又はG/A/S/T/Qである。

0018

一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは少なくとも50%のグリシン残基を含む(即ち全残基の50%がグリシンである)。或いは、アクセサリーポリペプチドは50%未満のグリシン残基を含んでよい。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは少なくとも50%のセリン残基を含む。他の実施形態は少なくとも50%のセリン及びグリシン残基を含むアクセサリーポリペプチドを提供する。更なる実施形態は少なくとも5%のグルタミン酸、又は少なくとも10、20若しくは30%のグルタミン酸を含むアクセサリーポリペプチドを提供する。

0019

1つの実施形態において、アクセサリーポリペプチドは又、(a)3つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン(A)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)及びチロシン(Y)からなる群より選択され;(b)10、25、50、100以上のアミノ酸を含むことを特徴とする。関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは3つの型のアミノ酸よりなり、各型はD、E、G、K、P、R、S、及びTからなる群より選択される。アクセサリーポリペプチドは又3つの型のアミノ酸よりなり、各型がE、G、及びSからなる群より選択されてよい。

0020

本発明は又、(i)3つの型のアミノ酸よりなり、その2つはセリン(S)及びグリシン(G)であり、そしてもう1つの型はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、グリシン(G)、スレオニン(T)、アラニン(A)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、バリン(V)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)、及びシステイン(C)からなる群より選択され;(ii)10以上のアミノ酸残基を含み、そのうち50%以上がセリン又はグリシンであることを特徴とするアクセサリーポリペプチドを提供する。

0021

別の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは、(a)2つの型のアミノ酸よりなり、その1つはグリシン(G)であり、そしてもう1つの型はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)、アラニン(A)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、バリン(V)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)、及びシステイン(C)からなる群より選択され;(b)10以上のアミノ酸残基を含み、そのうち50%未満がグリシンであることを特徴とする。

0022

或いは、アクセサリーポリペプチドは2つの型のアミノ酸よりなり、総アミノ酸の50%以下がA、S、T、D、E、K及びHからなる群より選択される。

0023

なお別の実施形態において、アクセサリーポリペプチドは、(a)50以上のアミノ酸を含み;(b)2つの型のアミノ酸よりなり、(c)総アミノ酸の50%以下がA、S、T、D、E、K及びHからなる群より選択されることを特徴とする。

0024

アクセサリーポリペプチドは1、2、5又は10以上の反復モチーフを含んでよく、各々は2〜500アミノ酸を含んでよい。一部の場合においては、反復モチーフは2つ又は3つ以上の異なる型のアミノ酸よりなる。多数のアクセサリーポリペプチドを使用してよい。アクセサリーポリペプチドは又荷電したアミノ酸を含んでよい。
一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(GGEGGS)nを含み、ここでnは2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(GES)nを含み、ここでG、E,及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。或いは、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(GGSGGE)nを含み、ここでG、E,及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。更に別の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(GEGGGEGGE)nを含み、ここでnは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。 更に別の実施形態において、アクセサリー配列はより小さい酸の配列(GE)nを含み、ここでG及びEは何れかの順序であることができ、そしてnは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。
一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(S)nを含み、ここでnは10、15、20、50以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSSSSSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSSSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。更に他の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SESSSESSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSESSSSESSSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは3以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSSESSSSSESSSSE)nを含み、ここでE,及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは3以上の整数である。なお他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSSSESSSSSSESSSSSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは3以上の整数である。

0025

一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは3、4、5、6又は7アミノ酸のペプチドモチーフ反復単位を含まないか、又は何れかの単一のポリペプチドモチーフの反復単位を含まない。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは固定された長さの2、5、10、又は20超の異なる反復モチーフを含む。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは何れかの長さの2、5、10、又は20超の異なる反復モチーフを含む。

0026

更に又、本発明は(a)修飾ポリペプチドを提供する工程;(b)前記修飾ポリペプチドを重合体マトリックスと混合する工程を含む、医薬組成物生成方法を記載する。

0027

主題の方法により生成されるか、又は主題の組成物中に存在する生物学的に活性なポリペプチドは、ヒト成長ホルモン(hGH)、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、エキセナチドプラムリチド(pramlitide)、ウリカーゼ顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマインスリンインターロイキン受容体拮抗剤IL−1RA)、エリスロポエチン又は腫瘍壊死因子−アルファ(TFN−アルファ)であることができる。

0028

本発明は、(a)緩徐放出剤、及び(b)アクセサリーポリペプチドに連結した生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドを含む、医薬組成物に関する。修飾ポリペプチドが1より大きい見かけ分子ファクター(molecular weight factor)を与えてよい。見かけの分子量ファクターは、修飾ポリペプチドの予測された分子量に対する、サイズ排除クロマトグラフィーにより計測した修飾ポリペプチドの見かけの分子量として求めてよい。1つの実施形態において、修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターは3より大きい。別の実施形態においては、修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターは5より大きい。更に別の実施形態において、修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターは7より大きい。なお別の実施形態において、修飾ポリペプチドの見かけの分子量ファクターは9より大きい。

0029

アクセサリーポリペプチドは生物学的に活性なポリペプチドの血清中半減期を増大させることができる。或いは、アクセサリーポリペプチドは生物学的に活性なポリペプチドのプロテアーゼ耐性を増大させることができる。他の場合において、アクセサリーポリペプチドは生物学的に活性なポリペプチドの溶解性を増大させることができる。他の場合において、アクセサリーポリペプチドは生物学的に活性なポリペプチドの免疫原性を低下させることができる。本発明のアクセサリーポリペプチドは約10、30、50又は100超のアミノ酸を含んでよい。一部の実施形態においては、生物学的に活性なポリペプチドはヒト成長ホルモン(hGH)、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、エキセナチド、プラムリチド、ウリカーゼ、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、インスリン、インターロイキン1受容体拮抗剤(IL−1RA)、エリスロポエチン又は腫瘍壊死因子−アルファ(TNF−アルファ)であることができる。

0030

1つの実施形態において、アクセサリーポリペプチドは少なくとも40連続するアミノ酸を含み、血清タンパク質に非特異的に結合することは実質的にはできない。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン(G)、アスパルテート(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタメート(E)及びプロリン(P)残基の合計は、アクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約80%超を構成し;並びに/又は、アクセサリーポリペプチド中の少なくとも50%のアミノ酸がChou−Fasmanアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている。関連する実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは少なくとも40連続するアミノ酸を含み、そしてアクセサリーポリペプチドは約4時間、5時間、10時間、15時間又は24時間超のインビトロ血清中半減期を有する。更に、(a)アクセサリーポリペプチドに含有されるグリシン(G)、アスパルテート(D)、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、グルタメート(E)及びプロリン(P)残基の合計がアクセサリーポリペプチドの総アミノ酸の約80%超を構成し;並びに/又は、(b)アクセサリーポリペプチド中の少なくとも50%のアミノ酸がChou−Fasmanアルゴリズムにより測定した場合に二次構造を欠いている。

0031

一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは少なくとも50%のグリシン残基を含む(即ち全残基の50%がグリシンである)。或いは、アクセサリーポリペプチドは50%未満のグリシン残基を含んでよい。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは少なくとも50%のセリン残基を含む。他の実施形態は少なくとも50%のセリン及びグリシン残基を含むアクセサリーポリペプチドを提供する。更なる実施形態は少なくとも5%のグルタミン酸、又は少なくとも10、20若しくは30%のグルタミン酸を含むアクセサリーポリペプチドを提供する。

0032

1つの実施形態において、アクセサリーポリペプチドは又(a)3つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン(A)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)及びチロシン(Y)からなる群より選択され;(b)10、25、50、100以上のアミノ酸を含むことを特徴としてよい。関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは3つの型のアミノ酸よりなり、各型はD、E、G、K、P、R、S、及びTからなる群より選択される。アクセサリーポリペプチドは又3つの型のアミノ酸よりなり、各型はE、G、及びSからなる群より選択される。

0033

本発明は又(i)3つの型のアミノ酸よりなり、その2つはセリン(S)及びグリシン(G)であり、そしてもう1つの型はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、グリシン(G)、スレオニン(T)、アラニン(A)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、バリン(V)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)、及びシステイン(C)からなる群より選択され;(ii)10以上のアミノ酸残基を含み、その50%以上がセリン又はグリシンであることを特徴とするアクセサリーポリペプチドを提供する。

0034

別の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは(a)2つの型のアミノ酸よりなり、その1つはグリシン(G)であり、そしてもう1つの型はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)、アラニン(A)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、バリン(V)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)、及びシステイン(C)からなる群より選択され;(b)10以上のアミノ酸残基を含み、その50%以下がグリシンであることを特徴とする。

0035

或いは、アクセサリーポリペプチドは2つの型のアミノ酸よりなり、ここで総アミノ酸の50%以下はA、S、T、D、E、及びHからなる群より選択される。

0036

なお別の実施形態において、アクセサリーポリペプチドは、(a)50以上のアミノ酸を含み;(b)2つの型のアミノ酸よりなり、(c)総アミノ酸の50%以下がA、S、T、D、E、及びHからなる群より選択されることを特徴とする。

0037

アクセサリーポリペプチドは1、2、5又は10以上の反復モチーフを含んでよく、各々は2〜500アミノ酸を含んでよい。一部の場合においては、反復モチーフは2つ又は3つ以上の異なる型のアミノ酸よりなる。多数のアクセサリーポリペプチドを使用してよい。アクセサリーポリペプチドは又荷電したアミノ酸を含んでよい。

0038

一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(GGEGGS)nを含み、ここでnは2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(GES)nを含み、ここでG、E、及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。或いは、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(GGSGGE)nを含み、ここでG,E、及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。更に別の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(GEGGGEGGE)nを含み、ここでnは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。更に別の実施形態において、アクセサリー配列はより小さい酸の配列(GE)nを含み、ここでG及びEは何れかの順序であることができ、そしてnは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。

0039

一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(S)nを含み、ここでnは10,15、20、50以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSSSSSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSSSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。更に他の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SESSSESSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の整数である。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSESSSSESSSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは3以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSSESSSSSESSSSE)nを含み、ここでE、及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは3以上の整数である。なお他の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSSSESSSSSSESSSSSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは3以上の整数である。

0040

一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは3、4、5、6又は7アミノ酸のペプチドモチーフの反復単位を含まないか、又は何れかの単一のポリペプチドモチーフの反復単位を含まない。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは固定された長さの2、5、10、又は20超の異なる反復モチーフを含む。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは何れかの長さの2、5、10、又は20超の異なる反復モチーフを含む。

0041

緩徐放出剤は重合体マトリックスを包含してよい。一部の実施形態においては、重合体マトリックスは荷電している。特定の実施形態においては、重合体マトリックスはポリ−d,l−ラクチドPLA)、ポリ−(d,l−ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)、PLGA−PEG共重合体アルギネートデキストラン及び/又はキトサンであってよい。緩徐放出剤は又経皮パッチを包含するパッケージ品であってよい。

0042

本発明は又、修飾ポリペプチドの生成方法であって、a)修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程;b)前記修飾ポリペプチドを宿主細胞内で発現させることにより前記修飾ポリペプチドを生成する工程を含む、方法を提供する。修飾ポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子ベヒクル、並びに本発明の修飾ポリペプチドを発現する宿主細胞も提供される。

0043

更に又、本発明は医薬組成物の生成方法であって、(a)修飾ポリペプチドを提供する工程;(b)前記修飾ポリペプチドを重合体マトリックスと混合する工程を含む、方法を記載する。

0044

本発明の医薬組成物はa)緩徐放出剤、b)サイズが5kD超のPEG基に連結した生物学的に活性なポリペプチドを含む修飾ポリペプチドを含んでよい。

0045

更に他の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは二次構造を実質的に欠いている。なお他の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアクセサリーポリペプチドを欠いた対応するポリペプチドと比較して2倍長い血清中半減期を示す。生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドはペプチド結合を介して連結してよい。

0046

一部の実施形態においては、修飾ポリペプチドは更に少なくとも1つのデポモジュールを含む。デポモジュールは少なくとも10アミノ酸長、好ましくは少なくとも100アミノ酸長である。正荷電のデポモジュール(例えばリジンリッチ又はアルギニンリッチのポリペプチド)は負荷電の重合体と組み合わせる場合に有用である。負荷電のデポモジュールは正荷電の重合体と組み合わせる場合に有用である。ポリHis配列を含むデポモジュールはキレート形成性ヒドロゲルと組み合わせて使用してよい。一部の場合においては、デポモジュールはプロテアーゼ感受性、例えば、そして限定しないが、血清中プロテアーゼ又は他のプロテアーゼに対して感受性であることができる。多数及び/又は異なるデポモジュールを使用してよい。デポモジュール、生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドの何れかの組み合わせは、除放性治療薬を生成するために使用可能である。特定の実施形態においては、緩徐放出剤は修飾ポリペプチドに連結したデポモジュールである。

0047

更に又、本発明のAPIをコードする核酸配列を含む遺伝子ベヒクルが提供される。別の実施形態においては、ポリペプチドを発現する宿主細胞を記載する。

0048

本発明は生物学的に活性なポリペプチドの特性を改質するために使用してよいアクセサリーポリペプチドに関する。1つの実施形態において、本発明は生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを提供し、ここでアクセサリーポリペプチドは(i)3つの型のアミノ酸よりなり、各型がアラニン(A)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)及びチロシン(Y)からなる群より選択され;(ii)10以上のアミノ酸を含むことを特徴とする。関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは3つの型のアミノ酸よりなり、各型はD、E、G、K、P、R、S、及びTからなる群より選択される。別の関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは3つの型のアミノ酸よりなり、各型はE、S、G、R、及びAからなる群より選択される。別の関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは3つの型のアミノ酸よりなり、各型はE、S、G、R、及びAからなる群より選択される。更に別の実施形態において、アクセサリーポリペプチドは3つの型のアミノ酸よりなり、各型はE、G、及びSからなる群より選択される。単離されたポリペプチドは治療用ポリペプチドであってよい。

0049

本発明は又、生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを提供し、ここでアクセサリーポリペプチドは(i)ポリセリンであり、(ii)10以上のアミノ酸を含むことを特徴とする。関連する実施形態において、単離されたポリペプチドは(i)2つの型のアミノ酸よりなり、その大多数はセリンであり、(ii)10以上のアミノ酸を含む。

0050

別の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは2つの型のアミノ酸よりなり、その1つはグリシン(G)であり、そしてもう1つの型はアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)、アラニン(A)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、バリン(V)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)、及びシステイン(C)からなる群より選択され;(ii)10以上のアミノ酸残基を含み、その50%以下がグリシンである。

0051

本発明は又、生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを提供し、ここでアクセサリーポリペプチドは(i)2つの型のアミノ酸よりなり、その1つはセリン(S)であり、そしてもう1つはアスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、リジン(K)、プロリン(P)、アルギニン(R)、グリシン(G)、スレオニン(T)、アラニン(A)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、チロシン(Y)、ロイシン(L)、バリン(V)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)、及びシステイン(C)からなる群より選択され;(ii)10以上のアミノ酸残基を含み、その50%以上がセリンであることを特徴とする。

0052

或いは、本発明は生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを記載し、ここでアクセサリーポリペプチドは(i)10以上のアミノ酸を含み;(ii)2つの型のアミノ酸よりなり、ここで総アミノ酸の50%以下がA、S、T、D、E、及びHからなる群より選択されることを特徴とする。

0053

更に別の実施形態において、本発明は生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを記載し、ここでアクセサリーポリペプチドは(i)10以上のアミノ酸を含み;(ii)2つの型のアミノ酸よりなり、総アミノ酸の50%以下がA、G、T、D、E、及びHからなる群より選択されることを特徴とする。

0054

一部の実施形態においては、生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドが提供され、ここでアクセサリーポリペプチドは(i)2つの型のアミノ酸よりなり、その1つはP、R、L、V、Y、W、M、F、I、K、及びCからなる群より選択され;(ii)10以上のアミノ酸を含むことを特徴とする。

0055

他の実施形態において、生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドを含む単離されたポリペプチドが提供され、ここでアクセサリーポリペプチドは少なくとも10アミノ酸長を含み、そして等しい数で示される2つの異なる型のアミノ酸よりなる。或いは、2つの異なる型のアミノ酸は1:2、2:3、又は3:4の比で示される。アクセサリーポリペプチドは更に4以上の反復モチーフを含んでよく、各々は2〜500アミノ酸を含み、2つの異なる型のアミノ酸より構成される。反復モチーフは8アミノ酸長を含んでよく、そして一部の実施形態においては、4以上の反復モチーフが同一である。4以上の反復モチーフは異なるアミノ酸配列を含んでよい。関連する実施形態において、アクセサリーポリペプチドは少なくとも10の反復モチーフを含む。

0056

更に他の実施形態は二次構造を実質的に欠いているアクセサリーポリペプチドで修飾された生物学的に活性なポリペプチドを提供する。或いは、単離されたポリペプチドの見かけの分子量はアクセサリーポリペプチドを欠いた対応するポリペプチドの見かけの分子量より大きい。特定の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドの見かけの分子量はその実際の分子量より少なくとも3倍大きい。なお他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアクセサリーポリペプチドを欠いた対応するポリペプチドと比較して2倍長い血清中半減期を示す。生物学的に活性なポリペプチド及びアクセサリーポリペプチドはペプチド結合を介して連結していてよい。

0057

一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(GGEGGS)nを含み、ここでnは3以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(GES)nを含み、ここでG、E、及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは3以上の整数である。或いは、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(GGSGGE)nを含み、ここでG、E、及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは3以上の整数である。更に別の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(GGEGGEGGES)nを含み、ここでnは1以上の整数である。更に別の実施形態において、アクセサリー配列はアミノ酸配列(GE)nを含み、ここでG及びEは何れかの順序であることができる。

0058

一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(S)nを含み、ここでnは10以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSSSSSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは2以上である。更に他の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SESSSESSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは3以上の整数である。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSESSSSESSSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは3以上の整数である。他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSSESSSSSESSSSE)nを含み、ここでE、及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは3以上の整数である。なお他の実施形態において、アクセサリーポリペプチドはアミノ酸配列(SSSSESSSSSSESSSSSE)nを含み、ここでE及びSは何れかの順序であることができ、そしてnは3以上の整数である。

0059

本発明は又、単離されたポリペプチドの生成方法であって、a)請求項1、6、7、8、又は9の何れか1項の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程;b)前記ポリペプチドを宿主細胞内で発現させることにより、前記ポリペプチドを生成する工程を含む、方法を提供する。

0060

更に又、本発明の単離されたポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子ベヒクルが提供される。別の実施形態においては、主題のポリペプチドを発現する宿主細胞を記載する。主題のポリペプチドのライブラリも又、想定される。特定の実施形態においては、ペプチドのライブラリはファージ粒子上にディスプレイされる。

0061

(参照による援用)
本明細書において言及する全ての公開物及び特許出願は、各々の個々の公開物又は特許出願が具体的及び個別に参照により本明細書に援用される場合と同じ程度まで、参照により本明細書に援用される。

0062

本発明の新しい特徴は添付の特許請求の範囲において特に記載する。本発明の特徴及び利点の良好な理解は、本発明の原理を利用している説明上の実施形態を記載した以下の詳細な説明及び以下の添付図面を参照することにより可能となる。

図面の簡単な説明

0063

図1は生物学的に活性なタンパク質を修飾しているアクセサリーポリペプチドの説明図である。
図2は本発明の修飾ポリペプチド内への封入のための可能なモジュール:アクセサリーポリペプチド、生物学的に活性なポリペプチド、任意のデポモジュール及び任意の重合体マトリックスを示す。
図3は本発明の修飾ポリペプチド内への封入のための可能なモジュール:アクセサリーポリペプチド、生物学的に活性なポリペプチド、任意のデポモジュール及び任意の重合体マトリックスを示す。
図4は種々の生成物の配置の例を示す。モジュールは例えばその標的に対する生物学的に活性なタンパク質の親和性を増大させるため、rPEGモジュール延長することにより半減期を延長するため、又は、デポ製剤の特性を改質するために、同じ生成物中で数回使用してよい。
図5は部位特異的ビオチニル化を可能にするデポモジュールを含む4量体の修飾ポリペプチドの特定の例を提示する。ストレプトアビジンの添加は高度に安定であるが、なお非共有結合性である修飾ポリペプチド4量体の形成を誘導する。多価のポリペプチドも又、多数のモジュールを単一のタンパク質鎖中に組み込まれることによるか、又は特定のモジュールを含有する多数のタンパク質鎖を化学的に連結することにより、形成することができる。
図6はアルギネートマイクロスフェアの重合体マトリックス内に取り込んでよいリジンリッチ又はアルギニンリッチのデポモジュール(長方形で示す)を示す。マトリックスモジュールはより大きい円で示す。リジンリッチ又はアルギニンリッチのデポは生理学的なpHにおいて実質正電荷を帯びており、この特性は負荷電のアルギネート重合体に修飾ポリペプチドを結合させるために利用できる。結合は多価の条件において起こってよい。
図7は重合体に結合した2価のカチオンCu2+により例示される2価カチオンキレート形成ヒドロゲル(マトリックスモジュール)を示す。ポリヒスチジンデポモジュール(長方形モジュール)は高い親和性でCu2+カチオンに結合する。
図8はプロテアーゼ感受性の多量体修飾ポリペプチドを示す。デポモジュール(長方形で示す)は延伸した重合体中で個々の修飾ポリペプチド単位を連結する。デポモジュールは血清プロテアーゼに対して特異的に感受性であるように設計する。デポモジュールのプロテアーゼ切断により個々の活性な修飾ポリペプチドが放出される。
図9発現ベクターpCW0150の設計を示す。
図10はGFPに融合したアクセサリーポリペプチドrPEG(L288)の設計及び構築を示す。
図11はrPEG_L288ポリペプチドのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
図12はhGH−rPEG(L288)及びGLP−1−rPEG(L288)構築物の設計を示す。
図13はアクセサリーポリペプチドにコンジュゲートした生物学的に活性なタンパク質の例を示す。
図14はアクセサリーポリペプチドの配列最適化に関する例示される指針を説明する。
図15はアクセサリーポリペプチドの配列最適化に関する例示される指針を説明する。
図16はGFPに融合したrPEG_J288アクセサリーポリペプチド配列を含むベクターの構築を説明する。
図17はrPEG_J288ポリペプチドのアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
図18は本発明における使用に適したスタッファーベクターの設計を示す。
図19はrPEG_J288修飾GFPの精製を示す。
図20はrPEG_J288修飾GFPの血清中安定性の測定を示す。
図21は細胞標的とのアクセサリー修飾ポリペプチドの相互作用を示す。
図22架橋アクセサリーポリペプチドの概念を説明する。
図23架橋成分の例を説明する。
図24は架橋アクセサリーポリペプチドの数種の例を列挙する。
図25リンカーとしてストレプトアビジンを使用する例を示す。
図26は架橋アクセサリーポリペプチドを構築する異なる様式を説明する。
図27は架橋アクセサリーポリペプチドの数種の可能なフォーマットを説明する。
図28結合ドメイン又は他の基で追加的に修飾したアクセサリーポリペプチドを説明する。
図29は緩徐放出アクセサリーポリペプチドの概念を説明する。
図30ユニバーサルアクセサリーポリペプチドを示す。
図31はヒトIgG1由来の抗体Fcフラグメントを示すが、これは又、IgG2、IgG3、IgG4、IgAIgD又はIgE由来であることもできる。このFcはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD又はIgE由来のネイティブのヒンジを有することができる。ヒンジジスルフィドの数には天然多様性があるが、これは又、ヒンジ、特にシステイン残基突然変異欠失、又はトランケーションによって作成することもできる。有用な変異体は3ジスルフィド(図示せず)、2ジスルフィド、1ジスルフィド(IgG1の第1番目のもの、又は第2番目の天然のものの選択)又は無ジスルフィドの何れかを有する。
図32アフィニティータグ、溶解性タグ及び/又はプロテアーゼ切断部位を含む修飾ポリペプチドの種々の配置を説明する。
図33は特定のアクセサリーポリペプチドを使用した修飾ポリペプチドの向上した発現レベルを説明する。
図34は未修飾hGHと比較したアクセサリー修飾hGHポリペプチドの活性を示す。
図35アニオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーによるアクセサリー修飾ポリペプチドの精製を示す。
図36はSDS−PAGEにより確認した場合のrPEG修飾GFPの精製により得られた純粋な生成物を示す。
図37分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより解明した場合のrPEG連結GLP1の純度を示す。
図38は分析用逆相HPLCにより観察した場合のrPEG_L288−GFP修飾ポリペプチドの純度を示す。
図39はrPEG_J288−GFPの質量スペクトルである。
図40は修飾ポリペプチドと血清タンパク質の間に殆ど非特異的結合が観察されないことを説明する。
図41はアクセサリーポリペプチドに生物学的に活性なポリペプチドを連結する際に観察される見かけの分子量の増大を説明する。
図42ラット及びヒトの血清中の修飾ポリペプチドの安定性を示す。
図43ラット血清中のrPEG_K288−GFPポリペプチドのPKプロファイルを説明する。
図44はrPEG_J288−GFP、rPEG_K288−GFP及びrPEG_L288−GFPに関する動物実験において測定した場合のrPEGポリペプチドの免疫原性の相対的欠如を説明する。
図45はアクセサリーポリペプチドに連結した生物学的に活性なポリペプチドを発現することの利点を説明する。
図46はアクセサリー修飾ポリペプチドの除放性を説明する。
図47はサイズ排除クロマトグラフィー(1操作当たり多数回注入)で測定した場合のrPEG_J288−GLP1ポリペプチドの純度を示す。
図48はサイズ排除クロマトグラフィー(1操作当たり多数回注入)で測定した場合のrPEG_K288−GLP1ポリペプチドの純度を示す。
図49はrPEG_J288、rPEG_K288、及びrPEG_L288アクセサリーポリペプチドに生物学的に活性なポリペプチド(GLP1)を連結する際に観察される見かけの分子量の増大を説明する。
図50は生物学的に活性なポリペプチド(rPEG_K288−hGH)としてのアフィニティータグ、アクセサリーポリペプチド及びhGHを含むポリペプチドのプロテアーゼ切断を介して得られた生成物を示す。プロテアーゼはTagを除去しつつ、rPEG_K288アクセサリーポリペプチドに連結したhGHである最終生成物は残存させる。
図51はプロテアーゼ切断と更なる精製の後のrPEG_K288−hGHの純度を示す。
図52は完全なIgG1の構造を示すが、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgD、IgA及びIgM出発点として同様に使用できる。dAb−dAb−Fc融合タンパク質も又、それが4価であるために使用できるが、これは図示しない。
図53は、Fc及び抗原結合ドメインを分離するrPEG及びC末端のFcを有する構築物:(dAb/scFv)−rPEG−Fc及び(dAb/scFv)−(dAb/scFv)−rPEG−Fcを示す。しかしながら同じ要素の異なる順序を有するフォーマットも有用であり、例えばrPEG−Fc−(dAb/scFv)、rPEG−Fc−(dAb/scFv)−(dAb/scFv)、Fc−rPEG−(dAb/scFv)、Fc−rPEG−(dAb/scFv)−(dAb/scFv)、Fc−(dAb/scFv)−rPEG、Fc−(dAb/scFv)−(dAb/scFv)−rPEG、dAb/scFv)−Fc−rPEG,及び(dAb/scFv)−(dAb/scFv)−Fc−rPEGを挙げることができる。更に又、scFv及びdAbsを混合することもでき、例えばdAb−scFv若しくはscFv−dAbとするか、又は異なる標的特異性の2つのscFvs若しくは2つのdAbsを組み合わせてscFv1−scFv2又はdAb1−dAb2とすることもできる。図53aはscFv−Fc融合タンパク質を示す。図53bはdAb−Fc融合タンパク質を示す。図53cはscFv−scFv−Fc融合タンパク質を示し、これは4価である。
図54scFvフラグメントの2量体を示す。ヘテロ2量体及びホモ2量体の両方を構築できる。
図55は単鎖ダイアボディーである。
図56は単鎖Fcフラグメントの例を示す。場合により生物学的に活性なタンパク質をこの構築物の何れかの末端に融合することができる。
図57はタンパク質鎖の単一コピーよりなる生成物である。
図58AFBTの構造。58a:1価AFBT;58b:二重特異性AFBTの構造。
図59標的抗原へのAFBTの多価結合
図60a:2つの親抗体から誘導された抗体フラグメントを含有する多価AFBT。図60b:ダイアボディー及びペイロードを含むAFBTの構造。
図61半合成AFBTの生成。
図62:rPEG50に融合した抗Her−2scFvの精製、特性化及び結合活性図62a:結合活性。黒菱形コーティングされたHer−2への結合;白菱形:コーティングされたIgGへの結合。図62b:サイズ排除クロマトグラフィー;図62c:遊離SH基の検出。
図63:抗Her−2ダイアボディー、aHer203−rPEG50の精製、特性化及び結合活性。63a:結合活性。黒菱形:コーティングされたHer−2への結合;白菱形:コーティングされたIgGへの結合。63b:ダイアボディーaHer203−rPEG50及びscFv aHer203−rPEG50のサイズ排除クロマトグラフィー;63c:経時的なaHer203−rPEG50のSECはより高次の多量体の増大がないことを示す。
図64:scFv−rPEG50融合タンパク質の構築、配列及び発現。64a:タンパク質構造の図;64b:Her−2に対する特異性を有するAFBTの配列;64c:scFv−rPEG50融合タンパク質の発現を示すSDS/PAGE;7d:EGFRに対する特異性を有するAFBTの配列。
図65:ダイアボディーrPEG50融合タンパク質、aHer203−rPEGの構築、配列及び発現。65a:タンパク質構造の図;65b:タンパク質配列;65c:E.coliのサイトゾル中の融合タンパク質の発現を示すSDS/PAGE。
図66:細菌発現のためのFcドメインコドン最適化:66a:プロセス及びオリゴヌクレオチド設計の説明。ヒトFcをコードする配列を半ランダムオリゴヌクレオチドから組み立て、そして報告された通り作用するrPEG25及びGFPの前にクローニングした。66b:ライブラリから選択されたクローンのSDS/PAGE。矢印は所望の融合タンパク質のバンドを示す。66c:最適化されたヒトFc遺伝子のアミノ酸及びヌクレオチド配列。
図67:Fab−rPEG融合タンパク質に関する発現構築物を説明する図。
図68抗血清由来のAFBTに関する発見プロセスフローチャート
図69:GFP−rPEG50のアミノ酸配列。GFPの配列は下線
図70カニクイザルにおけるGFP−rPEG50及びEx4−rPEG50の薬物動態
図71a:CDB−Ex4−rPEG50融合タンパク質のアミノ酸配列。図71b:図14aに示す融合配列由来のEx4−rPEG50を遊離させるために使用するプロセスの説明。
図72マウスにおけるEx4−rPEG50の免疫原性。図72aは注入及び血液試料分析の時間経過を説明する。図72bは1:500希釈時の血液試料ELISA分析を示す。図72cは1:12,500希釈時の血液試料のELISA分析を示す。
図73:GFP−rPEG25及びGFP−rPEG50のサイズ排除クロマトグラフィー。グレーの線は球状タンパク質を用いた分子量標準を示す。
図74B細胞との反復URP及び非反復URPの相互作用の比較。図74aは多数の同一配列反復から構成される反復URPを示す。このような反復URPは、反復配列を認識するB細胞との多価の接触を形成することができ、これがB細胞の増殖の要因となり得る。図74bは多数の異なるサブ配列から構成される非反復URPを示す。各サブ配列は同族特異性を有するB細胞の特定のサブセットにより認識され得る。しかしながら、非反復URPの個々の分子は何れかの特定のB細胞との1種又は数種の相互作用のみ生じさせることができ、これが増殖の要因となる可能性は低い。
図75:アミノ酸配列の反復性を評価するためのアルゴリズム。
図76:極めて低い反復性を有するnrURPを設計するためのコンピューターアルゴリズム。
図77:URPセグメントのライブラリに由来するnrURPの構築。
図78:rPEG_Yを構築するために使用されたアミノ酸配列。図は又、セグメントライブラリを構築するために使用されたオリゴヌクレオチドの相対的濃度を示す。
図79合成オリゴヌクレオチド由来のURPセグメントの組み立て。図79aはライゲーション反応を示す。反復セグメントホスホリル化した部分的重複オリゴヌクレオチドによりコードされる。アニーリングしたオリゴヌクレオチドの第2の対を添加することにより鎖伸長を終了する。これらのキャッピングオリゴヌクレオチドの1つはホスホリル化されず、これにより一端におけるライゲーションが防止される。図79bはライゲーション反応のアガロースゲルを示す。
図80:URP_Y144配列の例。
図81プラスミドpCW0279によりコードされるアミノ酸配列。オープンリーディングフレームはFlag−URP_Y576−GFPの融合タンパク質をコードする。URP_Y576のアミノ酸配列に下線を引く。
図82は「rPEG連結結合対」を作成する一般的方法を示し、これは初期活性がないこと、そしてこれによりバースト放出作用が無いこと(毒性を生じさせることなく投与できる用量を増大させること)、及び低減した初期受容体媒介クリアランスの利点を有する。一般的な結合対は受容体−リガンド、抗体−リガンド、又は一般的には結合タンパク質1−結合タンパク質2であることができる。構築物は切断部位を有することができ、これは注入前、注入後(プロテアーゼにより血清中で)に切断することができ、そしてリガンド、受容体又は抗体の何れかであることができる治療生成物末端(活性タンパク質)と共にrPEGが存在できるように位置づけることができる。
図83aはヒンジを包含する、抗体Fcフラグメントに融合したrPEGが後続するN末端における薬物モジュールを有する構築物を示す。Fcフラグメントは長い半減期をもたらし、そして、rPEGによりFcフラグメントが可溶性及び活性な形態においてE.coliの細胞質中で発現される。図83bはヒンジを有さないが、抗体Fcフラグメントに融合したrPEGが後続するN末端における薬物モジュールを有する構築物を示す。Fcフラグメントは長い半減期をもたらし、そして、rPEGによりFcフラグメントが可溶性及び活性な形態においてE.coliの細胞質中で発現される。
図84aでは、VH及びVLドメインの間の単鎖リンカーが約10〜20AAより短い場合にダイアボディーを形成することにより、単鎖Fvフラグメントの形成を防止する。ダイアボディーは2つのタンパク質鎖を有し、そして、C末端の一方若しくは両方及び/又はN末端の一方若しくは両方にrPEGを有することができる。ダイアボディーは2つの結合部位を有し、そのうち、0、1又は2つは医薬標的に、又は半減期標的(即ちHSA、IgG、赤血球コラーゲン等)に結合してよく、又は標的に結合しなくてよい。図84bでは、ダイアボディーはタンパク質鎖0、1又は両方のN末端又はC末端に位置する0又は1つ以上の薬物モジュールを含有してよい。
図85aは単鎖Fvフラグメントを示し、これには薬物モジュール(例えばIFNa、hGH等)がN及び/又はC末端の一方又は両方において融合することができる。scFvは1つの結合部位を有しており、これは医薬標的に、又は半減期標的(即ちHSA(図85b参照)、IgG、赤血球等)に結合してもしなくてもよい。
図86は同じ複合体に属する2つのタンパク質を会合させるためのrPEGの使用を示す。そのようなタンパク質間の親和性はそれらを会合させるためには不十分である場合が多いが、rPEGの添加によりそれらの相互作用を安定化させ、そしてそれらが重合体を形成する傾向を低減させることができる。
図87細胞表面標的に結合したFabフラグメントを示し;H鎖はFcに(全抗体の場合等)、又は広範な種類の他のタンパク質、ドメイン及びペプチドに融合してよい。VHとCHドメインの間、及びVLとCLドメインの間の、通常は2〜6アミノ酸から4、5、6、7、8、9、10、11、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、100以上のアミノ酸の天然のリンカーの長さの伸長は、ドメイン交換により1つのFabが別のFabに架橋する能力を増大させ、これにより高次の価数を有する結合複合体が形成され、より高度な見かけの親和性(アビディティ)がもたらされる。リンカーはrPEG又は異なる組成物であってよい。この「伸長したリンカー」のフォーマットにより腫瘍細胞上の(部分的)腫瘍特異的抗原のような標的のより高い密度を有する部位において特異的に増大した親和性を有する結合が可能になる。
図88逆平行の方向で同じ配列の別のコピーに結合するSKILF(E)又はRARADADAのような会合ペプチドをプロドラッグの形成のために使用する方法を示す。この場合、薬物は最終生成工程においてプロテアーゼ切断されるが、2つの鎖がなお会合ペプチドにより会合するため、切断により薬物が不活性化されることはない。薬物が血中に注入され、そして濃度がかなり低減された後にのみ、小型の非rPEG含有タンパク質鎖が複合体を離れることになり(親和性に依存した速度、特にオフレートにおいて)、そして腎臓を介してクリアランスに付されると考えられ、これによりr−PEG含有薬物モジュールが活性化される。
図89は生成された単鎖タンパク質を2つのタンパク質鎖の複合体に変換するタンパク質分解切断を示す。この切断は最終生成工程(注入前)として起こることができるか、又は注入後に患者の血液中のプロテアーゼにより起こることができる。
図90aは(場合により)一端で薬物モジュール(例えばIFNa、hGH等)に融合し、そして(場合により)もう一端でrPEGに融合している、ヒンジ領域を有する抗体Fcフラグメントを示す。CH2とCH3の間の配列は、その機能が突然変異により除去されない限り、FcRn、新生児Fc受容体への結合を媒介する。図90bは同様の構築物であるがヒンジ領域を有さないものを示す。
図91aはCH3ドメインの対形成した対を含むタンパク質構築物を示し;これらの鎖の0、1又は両方がN末端及び/又はC末端においてrPEGに、そしてもう一端において薬物モジュール0又は1つ以上に融合してよい。FcRn結合配列は保持されるか、又は欠失するかの何れであってもよく、保持されればより長い血清中半減期がもたらされるはずである。図91bは同様のタンパク質を示すが、FcRn受容体へのFcの結合がもはや機能性ではないようにCH2が完全に除去されており、半減期が低減する。
図92aはC末端に薬物/ファーマコフォアを有する、rPEGにC末端で融合するヒンジ、CH2及びCH3ドメインを包含する完全なFcであるタンパク質を示す。図92bは完全なFcであるが、rPEGにC末端において融合するヒンジを有しておらず、C末端に位置する薬物/ファーマコフォアを有しており;これらの分子は鎖交換を起こすことができ、潜在的にヘテロ2量体を生じる。
図93aは部分的Fcを示しており、ヒンジを有しておらず、トランケーションされたがFcRn結合を保持するCH2を有しており、そしてC末端に位置する薬物/ファーマコフォアを有する。図93bは部分的Fcを示しており、ヒンジ及びCH2を有していないが、CH3は保持しており、そしてC末端に位置する薬物/ファーマコフォアを有する。これはFcRnに結合しないが、CH3ドメインを介して2量体化できる。
図94aは同一の受容体ドメイン(又は同じ結合機能を有するドメイン、又は同じ標的に同時に結合できるドメイン)によりフランキングされたrPEGを示す。両方の受容体が同時に標的に結合できる場合、一方の受容体の結合は第2の受容体の結合を安定化させ、そして有効/見かけの親和性/アビディティが、典型的には10〜100倍、ただし少なくとも3倍は増大する。rPEGは血清中半減期をもたらす。1つの選択肢はリガンドで生成物を予備負荷することである。その場合、注入された生成物はそれがリガンドに結合した状態で残存する限り不活性である。この手順は最高用量毒性を低減し、そして又、受容体媒介クリアランスを低減し、このためそれが重要である用途においては有用となる場合がある。図94bはリガンドに同時に結合できる2つの異なる受容体によりフランキングされたrPEGを有する生成物を示しており、これは複合体の相互安定化及び増大した見かけの親和性(アビディティ)をもたらし、この場合rPEGは受容体の有効濃度を増大させる原子価架橋部として作用する。図94cでは、1つの選択肢はリガンドで生成物を予備負荷することである。その場合,注入された生成物はそれがリガンドに結合した状態で残存する限り不活性である。リガンドが未結合となるとき、それは腎臓を介して急速にクリアランスに付され、生成物の活性化をもたらし、これはrPEGのテール部のために長い半減期を有する。この手順は最高用量毒性を低減し、そして又、受容体媒介クリアランスを低減し、このためそれが重要である用途においては有用となる場合がある。図94に示す通り、一部のプロドラッグフォーマットは切断又は他の活性化部位を必要としない。単一のタンパク質鎖はrPEGにより分離された2つ(又はそれより多い)薬物モジュールを含有することができ;これらのモジュールは同じ(単一の型のもの)であるか、又は2つ以上の異なる型のものであることができる。全ての薬物モジュールは受容体であるか、全てはリガンドである。このrPEG含有生成物が第2の相補タンパク質と複合体化することにより受容体−リガンド−受容体相互作用を生じさせる。このフォーマットにおいて、リガンドは2量体又は多量体であると考えられるが、特に2つの薬物モジュールが異なっている場合には単量体であることもできる。両方のモジュールが第3のタンパク質に結合する。X及びYは同じか又は異なっていることができ、そしてX及びYは薬物モジュールであるか、薬物モジュールに結合することができる。図94における各々の場合において、X及びY(及びrPEG)は1つのタンパク質鎖を含み、そしてそれらが結合する分子は別個の分子、典型的にはタンパク質又は小分子である。単一のタンパク質鎖中に組み込まれた2つより多い結合タンパク質を有することが可能である。考え方としては、大型のrPEG含有タンパク質及び非rPEG含有タンパク質の複合体は注入時には不活性であるが、2〜24時間に渡って、より小型の非rPEG含有タンパク質が複合体を離れ、そして腎臓を介して排出されることにより、薬物モジュールを活性化する。このフォーマットの利益は、薬物濃度初期スパイクとそれに伴う安全性の問題点が低減又は除去されること、及び、複合体はそれが複合体化する場合には受容体媒介クリアランスを最小限とすることにより血清中分泌半減期を延長することである。
図95VEGF受容体により両側をフランキングされたrPEGを示す。VEGFは2量体であるため、これはrPEGの両側の同じ受容体、又は異なる受容体であることができる(好ましくはVEGF−R1及びVEGF−R2であるが、VEGFR3も使用できる)。
図96は不活性のプロドラッグとして生成される(注入前に切断される)か、又は投与される(注入後血中で切断される)生成物を示す。薬物の不活性化は、3モジュール全てが単一のタンパク質鎖として生成されるように、rPEGにより薬物に連結された結合タンパク質により媒介される。薬物が受容体である場合は、結合タンパク質はその受容体のリガンド(ペプチド又はタンパク質)であり;薬物が抗体フラグメントである場合は、結合部位はペプチド又はタンパク質リガンドである。これらの例において薬物はX及びYと称される2つの結合ドメインの間の部位のプロテアーゼ切断により活性化される。タンパク質Yが活性な生成物である場合、YはrPEGを保持しなければならず、そしてプロテアーゼ切断部位は(XとYの間であるが、ただし)Xに近接していなければならない。タンパク質Xが活性な生成物である場合は、XはrPEGを保持しなければならず、そして切断部位はYに近接していなければならない。青色のクロスバーで示す通り1つ又は多数の切断部位が存在できる。薬物モジュールは受容体、リガンド、1つ以上のIgドメイン、抗体フラグメント、ペプチド、微小タンパク質、抗体に対するエピトープであることができる。薬物モジュールに結合するタンパク質は結合タンパク質、受容体、リガンド、1つ以上のIgドメイン、抗体フラグメント、ペプチド、微小タンパク質、抗体に対するエピトープであることができる。
図97は薬物モジュールへの結合タンパク質の添加により不活性のプロドラッグを作成することができる方法を示す。ペプチドは薬物の標的結合能力を中和しなければならず、そしてペプチドはrPEG含有薬物よりも速い速度において、血中から徐々に浄化される。そのようなペプチドは天然物であることができるが、より典型的にはそれは薬物モジュールに対するランダムペプチドライブラリファージパニングにより得られる。ペプチドは好ましくは合成により生成されるが、組み換えであることもできる。
図98はrPEGの同じ末端又はrPEGの反対側の末端にあることができる、多数の生物活性なペプチドを含有する単鎖タンパク質を示す。これらのペプチドは同じ活性又は異なる活性を有することができる。単鎖内に多数のペプチドを有することの目的は、生成を複雑化することなく、結合アビディティを介してそれらの効力を増大させることである。
図99は受容体媒介クリアランスを回避することによりプロドラッグ−rPEGが血清中半減期を増大させることができる方法を示す。
図100はIV注入後薬物濃度がどのように経時変化するかを示す。典型的な治療の目標治療用量よりも高いが、毒性用量よりも低い濃度に薬物を維持することである。短い半減期を有する薬物の典型的なボーラス注射(IV、IM、SC、IP又は同等)は毒性用量より遙かに高い最高濃度、そしてその後は薬物濃度を治療用量未満まで急速に低下させる排除期をもたらす。このPKプロファイルは毒性及び長期間の無効治療をもたらす傾向があるが、薬物は短期間のみ治療濃度において存在する(青線)。rPEGの薬物への添加は最高濃度を低下させ、そしてこれにより毒性を低下させ、そして薬物が治療性の非毒性用量において存在する期間を増大させる。rPEGと薬物結合タンパク質の添加によるプロドラッグの形成は、薬物が数時間かけてのみ徐々に活性化され、そして毒性用量と治療用量の間の時間の長さが他のフォーマットと比較して増大するため、「バースト放出」、又は毒性最高用量(赤線)を回避することができる。
図101はN末端の薬物モジュールとその後のrPEG及びC末端Fcフラグメント(ヒンジあり)を示す。これはE.coliの細胞質内でなお生成することができる薬物モジュールの半減期延長のための有用なフォーマットである。
図102aはFcフラグメントを含有するプロドラッグに関する代替のフォーマットを示す。該フォーマットは図101に記載するものと同様であるが、薬物配列(赤)に結合して阻害する阻害配列(青)が(N末端において)追加されている。前回同様、薬物は切断部位により阻害配列から分離される。N末端阻害結合配列には切断部位が後続し、それに薬物配列(赤)が後続する。切断前に、薬物が阻害配列に結合し、そしてこれにより不活性となる(プロドラッグ)。切断後は阻害結合配列(青)が徐々に放出され、クリアランスに付され、薬物(赤)が活性である時間の量を徐々に増大させる。図102bはFcフラグメントを含有する代替のプロドラッグフォーマットである。フォーマットは図101に記載するフォーマットと同様であるが、ここでも切断部位により薬物(青で表示される)から分離される阻害結合配列(ペプチド又はドメイン、赤で表示、典型的にはrPEG又はその近傍に位置する)が追加される。切断前に、薬物が阻害配列に結合し、そしてこれにより不活性となる(プロドラッグ)。切断後は阻害結合配列(青)が徐々に放出され、クリアランスに付され、薬物(青)が活性である時間の量を徐々に増大させる。
図103a〜dは未損傷の全抗体(例えばIgG1、2、3、4、IgE、IgA、IgD、IgM)に対するrPEGに関する好ましい融合部位を示す。示されたこれらの部位はそれらがドメイン、ヒンジ等のような構造付与された配列の境界において、これらの機能的ドメインの折り畳みを攪乱させることなく存在するので好ましい。即ちrPEGは抗体に対して1、2、3、4、5、6、7又は更には8つの(そしてIgM及びIgG3の場合は8つより多い)異なる位置において追加することができ、そして単一の抗体は多様な位置において、そして図示した8つの位置のいずれかの組み合わせにおいて1、2、3、4、5、6、7、8以上のrPEGを有することができる。図103eは抗体(IgG1、2、3、4、IgE、IgA、IgD、IgM)のドメイン及びフラグメントに対するrPEGに関する好ましい融合部位を示す。rPEGのN末端及び/又はC末端付加に関する融合部位は赤矢印又は赤線で示す。
図104はFcフラグメントの正しい折り畳みに関する試験を示す。
図105は血清中、又は注入前の何れかにおける、部位特異的プロテアーゼによる不活性タンパク質の活性タンパク質への転換を示す。この例においては赤色の配列は活性な治療薬である。
図106は部位特異的プロテアーゼによる不活性な薬物の活性な薬物への転換を示す。この例において、青色のドメイン(dAb、scFv、その他)が治療薬実体である。

0064

本発明はアクセサリーポリペプチドにより修飾された生物学的に活性なポリペプチドは、そのような修飾を有さない生物学的に活性なポリペプチドが凝集して封入体を形成する条件において、細胞質内で可溶性のまま残存し、その活性な形態に折り畳まれる性質を有する場合があるという意外な発見を使用する。本発明の方法は種々の用途のうちで特に、設計段階におけるタンパク質のハイスループットスクリーニング、現在のところペリプラズム発現を必要としているタンパク質の製造のため、そして封入体のような凝集塊から再折り畳みが困難であるタンパク質の製造のために有用である場合がある。本発明はアクセサリータンパク質配列を設計する方法、修飾ポリペプチドをコードする組み換えDNA分子、そのようなポリペプチドのための発現ベクター、そのようなポリペプチドの発現のための宿主細胞及び精製プロセスを開示する。例えばペプチド、タンパク質、抗体、及びワクチンを包含してよく、そして真核生物又は哺乳類のタンパク質であってよいタンパク質への長鎖親水性ポリペプチド配列の融合は、活性型において細胞質内で向上した折り畳みを示す可溶性融合タンパク質をもたらす。

0065

本発明のアクセサリーポリペプチドはGCSF成長ホルモン、インターフェロンアルファ及び抗体フラグメントを包含する医薬品タンパク質に連結してよい。これらの4種のタンパク質又はタンパク質のクラスは典型的には、E.coliの細胞質内で発現した場合には封入体を形成する。しかしながら長鎖親水性アクセサリーポリペプチド配列に連結されれば、生物学的に活性なポリペプチドの折り畳み特性は大きく向上する場合があり、アクセサリータンパク質の非存在下において真核生物のタンパク質では典型的に生じる即座不可逆の凝集による封入体形成とは逆に、細胞内部で活性なタンパク質に正確に折り畳みできる大きく増大した画分をもたらす。アクセサリーポリペプチドは、単独で、又はキチン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、MBP、GST又はHisタグのような他の知られた精製タグと組み合わせて、イオン交換によるタンパク質精製のためのアフィニティータグを追加的に含んでよい。

0066

このこと、及び本発明の他の態様は以下において更に詳細に説明する。

0067

一般的手法
本発明の実施は、特段の記載が無い限り、当業者の知る免疫学生化学化学分子生物学微生物学細胞生物学ゲノム及び組み換えDNAの従来の手法を使用する。
Sambrook,Fritsch and Maniatis,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,第2版(1989);CURRNTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubelら編、(1987));METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.)シリーズPCR2:A PRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor編、(1995)),Harlow and Lane,編、(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,及びANIMAL CELLCULTURE(R.I.Freshney,編、(1987))を参照。

0068

定義:
本明細書及び請求項においては、文脈において別様に明示されない限り、単数は複数を包含する。例えば「細胞」という用語はそれらの混合物を包含する複数の細胞を包含する。

0069

「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」及び「タンパク質」という用語は何れかの長さのアミノ酸の重合体を指すために本明細書においては互換的に使用される。重合体は直鎖又は分枝鎖であってよく、それは修飾アミノ酸を含んでよく、そしてそれは非アミノ酸により中断されていてもよい。用語は又、例えばジスルフィド結合形成グリコシル化、脂質化、アセチル化、ホスホリル化、又は何れかの他の操作法、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより修飾されているアミノ酸重合体を包含する。本明細書においては、「アミノ酸」という用語は、例えば限定しないが、グリシン及びD又はL型光学異性体、及びアミノ酸の類縁体及びペプチドミメティックを包含する天然及び/又は非天然又は合成のアミノ酸の何れかを指す。アミノ酸を標記するために標準的な1文字又は3文字のコードを使用する。

0070

「生物学的に活性なポリペプチド」という用語は、例えば細胞−、組織−又は臓器標的化のための治療薬標的及び/又はアクセサリー標的であることができる、所定の標的に対して結合特異性を示す何れかの長さのポリペプチドを指す。或いは、又は追加的に、それはインビトロ又はインビボで使用した場合に所望の生物学的特性を示すポリペプチドを指す。例示すれば、生物学的に活性なポリペプチドは、治療上又は診断上の標的に結合する機能的治療薬又はインビボの診断用タンパク質を包含する。「生物学的に活性なポリペプチド」及び「結合モジュール」又は「BM」という用語は本明細書においては互換的に使用される。生物学的に活性なポリペプチドは、例えば限定しないが、直鎖又は環状のペプチド、システイン拘束ペプチド、微小タンパク質、スカホールドタンパク質、例えばフィブロネクチンアンキリンクリスタリン、ストレプトアビジン、抗体フラグメント、ドメイン抗体、ペプチド性ホルモン成長因子サイトカイン、又は何れかの型のタンパク質ドメインであって、ヒト又は非ヒト、天然又は非天然のものであることができ、そしてそれらがは天然のスカホールドに基づくか、天然のスカホールドに基づかなくてよく(即ち操作又は選択されたもの)、或いは上記何れかの組み合わせ又はフラグメントに基づくものであってよい。或いは、生物学的に活性なポリペプチドは、その結合特性、その安定性、又は他の所望の特性を増強するために、1つ又は多数のアミノ酸を付加、除去又は置き換えることにより操作できる。結合モジュールは天然のタンパク質から、設計により、又はファージディスプレイ、細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイ又は他のディスプレイ方法を包含する遺伝子パッケージディスプレイにより、天然タンパク質から得ることができる。結合モジュールは同じ標的の同じコピーに結合してよく、これはアビディティをもたらし、或いは、それらは同じ標的の異なるコピーに結合してよく(これはこれらのコピーが例えば細胞膜など何らかにより接続又は連結されている場合はアビディティをもたらすことができる)、或いはそれらは2つの未関連の標的に結合していてよい(これはこれらの標的が例えば膜など何らかにより連結されている場合はアビディティをもたらす)。結合モジュールはペプチド又はタンパク質のランダムライブラリをスクリーニング又は別様に分析することにより識別できる。

0071

「組み換えPEG」、「rPEG」又は「rPEGポリペプチド」又は「組み換えPK増強基」とは、生物学的に活性なポリペプチドを修飾するために使用できるポリペプチドのクラスを包含する一般的用語であり、この場合、修飾により生物学的特性、例えば血清中半減期又はインビボのクリアランスに所望の変化がもたらされる。一般的にrPEGポリペプチドは生物学的に活性なポリペプチドにより結合された同じ所定の標的に対する結合物特異性を欠いている。一部の態様においては、rPEGはPEGのよく知られた特性の必ずしも全てではないが一部を模倣していてよいPEGの機能的類縁体である。後述においてより詳細に説明するそのような特性は、流体力学的半径を増大させる増強された能力、プロテアーゼに対する増大した耐性、低下した免疫原性及び低下した特異的活性を包含する。rPEG分子は線状性又は三次構造の欠如のような広範な構造的及び機能的特徴をPEGと共有しているが、PEGとの厳密な化学的同様性はrPEGに必須な特徴ではない。

0072

「アクセサリーポリペプチド」又は「アクセサリータンパク質」とは例えば生物学的に活性なポリペプチドへの連結による生物学的に活性なポリペプチドとのコンジュゲーションにおいて使用した場合に全体としての連結されたポリペプチドの生物学的特性に所望の変化を与えるポリペプチドを指す。アクセサリーポリペプチドの非限定的な例はrPEG及び流体力学的半径を増大し、血清中半減期を延長し、及び/又はインビボのクリアランス速度を変更することができる何れかの他のポリペプチドを包含する。所望により、アクセサリーポリペプチドは予測された分子量の小さい増大であるが、見かけの分子量のはるかに大きい増大をもたらす。異なる名称は異なる特徴を強調するが、それらは同じモジュールを指しており、そして互換的に使用できる。

0073

「修飾ポリペプチド」及び「アクセサリー修飾ポリペプチド」という用語は本発明のアクセサリーポリペプチドで修飾されている生物学的に活性なポリペプチドを指すために互換的に使用される。これらの用語は本発明のアクセサリーポリペプチドで修飾された生物学的に活性なポリペプチドを含む緩徐放出又は他の型又は製剤も指す場合がある。

0074

「反復配列」又は「反復モチーフ」とは本明細書においては互換的に使用され、そして多数の配列のモチーフの正方向のリピート、又は反転したリピート、又は交互するリピートを形成する、反復ペプチド配列(「リピート」)のオリゴマーとして説明することができるアミノ酸配列を指す。これらの反復オリゴマー配列は相互に同一又は相同であることができるが、それらは多数の反復されたモチーフであることもできる。反復配列は極めて低い情報含有量を特徴とする。反復配列はアクセサリーポリペプチドの必要な特徴ではなく、そして一部の場合においては、非反復配列が実際は好ましいものとなる。

0075

アミノ酸はそれらの疎水性に基づいて特徴付けることができる。多くの尺度が開発されている。一例としてはLevitt,Mら(Levitt,M(1976)J Mol Biol 104,59,#3233参照、これはHopp,TPら(1981)Proc Natl Acad Sci USA 78,3824,#3232に列挙されている)により開発された尺度である。「親水性アミノ酸」の例はアルギニン、リジン、スレオニン、アラニン、アスパラギン、及びグルタミンである。特に興味深いものは親水性アミノ酸アスパルテート、グルタメート、及びセリン、及びグリシンである。「疎水性アミノ酸」の例はトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、及びバリンである。

0076

本明細書においては、「細胞表面タンパク質」という用語は細胞の原形質膜成分を指す。それは内在性及び周辺性膜タンパク質糖タンパク質多糖類及び脂質であって原形質膜を構成するものを包含する。内在性の膜タンパク質は細胞の原形質膜の脂質2層を通過して伸長する膜貫通タンパク質である。典型的な内在性膜タンパク質疎水性アミノ酸残基を一般的に含む少なくとも1つの膜スパニングセグメントよりなる。周辺性の膜タンパク質は脂質2層の疎水性の内部へは伸長せず、そしてそれらは、直接又は他の膜成分により間接的に、共有結合又は非共有結合の相互作用を介して膜表面に結合している。

0077

「膜」、「サイトゾル性」、「核の」又は「分泌された」という用語は、細胞タンパク質に適用される場合、細胞タンパク質が最も、優勢に、又は優先的に局在している細胞外及び/又は細胞下の位置を特定する。

0078

細胞表面受容体」とはその対応するリガンドに結合できる膜タンパク質のサブセットを示す。細胞表面受容体は細胞の原形質膜の上に係留されているか、又はその内部に挿入されている分子である。それらはタンパク質、糖タンパク質、多糖類及び脂質の大型のファミリーを構成し、これらは原形質膜の構造的構成要素としてのみならず、種々の生物学的機能を統括する調節エレメントとして作用している。

0079

「天然に存在しない」とは、タンパク質に適用される場合は、タンパク質が、相当する野生型又はネイティブのタンパク質とは異なるアミノ酸を少なくとも1つ含有していることを意味する。非天然の配列は、例えば比較ウインドウを目的の(クエリされた)配列の長さとする最低最少合計確率を用いながらBLAST検索を実施することにより、そしてBLAST2.0を用いたGenbankの非縮重(「nr」)データベースと比較した場合に、求めることができる。BLAST2.0アルゴリズムはAltschulら(1990)J.Mol.Biol.215:403−410においてそれぞれ説明されている。BLAST分析を実施するためのソフトウエアはNational Center for Biotechnology Informationを介して公的に入手される。

0080

「宿主細胞」は主題のベクターのためのレシピエントとなることができるか、又はレシピエントであった、個々の細胞又は細胞培養物を包含する。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を包含する。子孫は天然の、偶然による、或いは意図的な突然変異により元の親細胞と完全に同一ではなくともよい(形態学的に、又は総DNA相補物のゲノムにおいて)。宿主細胞は本発明のベクターによりインビボでトランスフェクトされた細胞を包含する。

0081

本明細書においては、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はそのフラグメントが天然界においては通常会合している、細胞性又はその他の構成成分から分離されていることを意味する。当該分野で知られる通り、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はそのフラグメントは、その天然に存在する対応物からそれを区別するために「単離」を必要としない。更に又、「濃縮された」、「分離された」又は「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はそのフラグメントは、濃度又は体積当たり分子数が、その天然に存在する対応物のものよりも、「濃縮されている」状態を超えて高値であるか、「分離されている」状態未満に低値である点において、その天然に存在する対応物から区別可能である。一般的に、組み換え手段により製造され、そして宿主細胞内で発現されたポリペプチドは「単離された」とみなされる。

0082

「コンジュゲートした」、「連結した」及び「融合した」又は「融合」とは本明細書においては互換的に使用される。これらの用語は化学的コンジュゲーション又は組み換え手段を包含する何らかの手段による、2つより多い化学的エレメント又は成分の連合状態を指す。「インフレーム融合」とは元のオープンリーディングフレーム(ORF)の正しい読み枠を維持する態様において連続したより長いORFを形成するような2つ以上のORFの連合状態を指す。即ち、結果として生じる組み換え融合タンパク質は、元のORFによりコードされるポリペプチドに相当するセグメント2つ以上を含有する単一のタンパク質である(このセグメントは天然界では通常はそのように連合していない)。

0083

ポリペプチドの文脈においては、「線状配列」又は「配列」とはアミノからカルボキシ末端の方向におけるポリペプチド内のアミノ酸の順序であり、配列内で相互に近隣である残基がポリペプチドの一次構造内で近接している。「部分配列」とは、一方又は両方の方向において追加的な残基を含むことが知られているポリペプチドの部分の線状の配列である。

0084

「非相同」とは自身が比較されている実体の残余から遺伝子型的に区別可能である実体から誘導されることを意味する。例えば、自身のネイティブのコーディング配列から除去され、そしてネイティブ配列ではないコーディング配列に作動可能に連結されているグリシンリッチの配列は非相同のグリシンリッチ配列である。「非相同」という用語はポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される場合は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、自身が比較される実体の残余のものとは遺伝子型的に区別可能である実体から誘導されていることを意味する。

0085

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用される。それらは何れかの長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はそれらの類縁体の何れかの重合体形態を指す。ポリヌクレオチドは何れかの三次元構造を有してよく、そして既知又は未知の何れかの機能を果たしてよい。以下のものは非限定的なポリヌクレオチドの例である:遺伝子又は遺伝子フラグメントコーディング又は非コーディング領域連鎖分析から定義される遺伝子座エクソンイントロンメッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNAリボソームRNAリボザイム、cDNA、組み換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、何れかの配列の単離されたDNA、何れかの配列の単離されたRNA、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは修飾ヌクレオチド、例えばメチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチドの類縁体を含んでよい。ヌクレオチド構造に対して修飾を行う場合は、それは重合体の組み立ての前又は後に付与してよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていてよい。ポリヌクレオチドは重合の後に、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより更に修飾されてよい。

0086

組み換え体」とは、ポリヌクレオチドに適用する場合、ポリヌクレオチドがクローニング、制限及び/又はライゲーションの工程、及び宿主細胞で潜在的に発現することができる構築物をもたらす他の操作法の種々の組み合わせの産物であることを意味する。

0087

「遺伝子」又は「遺伝子フラグメント」という用語は本明細書においては互換的に使用される。それらは転写及び翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができるオープンリーディングフレーム少なくとも1つを含有するポリヌクレオチドを指す。遺伝子又は遺伝子フラグメントは、ポリヌクレオチドが、全コーディング領域又はそのセグメントを包含してよい少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含有する限り、ゲノム性又はcDNAであってよい。「融合遺伝子」とは共に連結されている非相同のポリヌクレオチドを少なくとも2つ含む遺伝子である。

0088

「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞内及び/又は宿主細胞間に転移させる、好ましくは自己複製性の核酸分子である。この用語は、細胞へのDNA又はRNAの挿入のために主に機能するベクター、DNA又はRNAの複製のために主に機能する複製ベクター、及びDNA又はRNAの転写及び/又は翻訳のために機能する発現ベクターを包含する。同様に包含されるものは上記機能の1つより多くをもたらすベクターである。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞内に導入された場合にポリペプチドに転写及び翻訳されることができるポリヌクレオチドである。「発現系」とは通常は、所望の発現産物をもたらすために機能できる発現ベクターを含む適当な宿主細胞を意味する。

0089

「標的」とは、アクセサリーポリペプチドの文脈において使用する場合、生物学的に活性なポリペプチドが結合することができ、そして結合事象が所望の生物学的活性をもたらすような生化学的な分子又は構造である。標的は、タンパク質により阻害、活性化又は別様に作用を受ける、タンパク質のリガンド又は受容体であることができる。標的の例は、ホルモン、サイトカイン、抗体又は抗体フラグメント、細胞表面受容体、キナーゼ、成長因子及び生物学的活性を有する他の生化学的構造である。

0090

「血清中分解耐性」−タンパク質は血液中の分解により排除されることができ、これには典型的には血清又は血漿中のプロテアーゼが関与している。血清分解耐性は典型的には37℃において数日程度の間(即ち0.25、0.5、1、2、4、8、16日間)、ヒト(又は適宜マウス、ラット、サルの)血清又は血漿にタンパク質を混合することにより計測される。次にこれらの時点に対する試料ウエスタン試験上で泳動させ、そしてタンパク質を抗体で検出する。抗体はタンパク質中でタグに対することができる。タンパク質がウエスタン上で単一のバンドを示せば、タンパク質の大きさが注入したタンパク質のものと同一であり、その場合は分解は起こっていない。ウエスタンブロット又は同等の手法により判断した場合にタンパク質の50%が分解する時点が、タンパク質の血清中分解半減期又は「血清中半減期」である。

0091

「見かけの分子量ファクター」又は「見かけの分子量」は特定のアミノ酸配列により示される見かけの分子量における相対的な増大又は減少の尺度を指す相対的な用語である。見かけの分子量は球状タンパク質を用いてカリブレーションすることができるサイズ排除カラムを用いながら測定され、そして「見かけのkD」単位で計測される。見かけの分子量ファクターは球状タンパク質を用いてキャリブレーションされたサイズ排除カラム上で測定された見かけの分子量と実際の分子量(即ちアミノ酸組成物中のアミノ酸の各々の型の計算された分子量をアミノ酸組成に基づいて加算することにより予測される)との間の比として計測される。例えば20kDのポリグリシン配列はサイズ排除クロマトグラフィーによる200kDの見かけの分子量を有し、10Xの見かけの分子量ファクターに相当する。「特異的流体力学的半径」とは単位分子量(kD)当たりの流体力学的半径であり、半減期延長物質の性能の尺度であり、これは単位質量あたりの血清中分泌半減期として計測される(kD当たりの時間)。これらの計測値の両方がより直観的な尺度である「見かけの分子量ファクター」と相関している。

0092

タンパク質の「流体力学的半径」は水溶液中のその拡散速度並びに巨大分子ゲル中で遊走するその能力に影響する。タンパク質の流体力学的半径はその分子量、並びに形状及び緻密度を包含するその構造により決定される。大部分のタンパク質は、最小の流体力学的半径でタンパク質が有することができる最も緻密な三次元構造である球状構造を有する。一部のタンパク質はランダムで解放された、構造を有さない、又は「線状の」コンホーメーションを採用しており、そしてその結果、同様の分子量の典型的な球状タンパク質と比較して遙かに大きい流体力学的な半径を有している。

0093

生理学的条件」とは、温度、塩濃度、pHを包含する、生体対象の条件のものを模倣した条件のセットを指す。インビトロ試験における使用のための生理学的に該当する条件の宿主が樹立されている。一般的に、生理学的緩衝液は生理学的濃度の塩を含有し、そして約6.5〜約7.8、好ましくは約7.0〜約7.5の範囲の中性のpHに調節されている。種々の生理学的緩衝液は上記したSambrookら(1989)に列挙されており、従って本明細書においては詳述しない。生理学的に該当する温度は約25℃〜約38℃、好ましくは約30℃〜約37℃の範囲である。

0094

反応性の基」とは第2の反応性の基に結合することができる化学構造である。反応性の基の例はアミノ基、カルボキシル基スルヒドリル基ヒドロキシル基アルデヒド基アジド基である。一部の反応性の基は第2の反応性の基とのカップリングを促進するために活性化することができる。活性化の例はカルボジイミドとのカルボキシル基の反応、カルボキシル基から活性化エステルへの変換、又はカルボキシル基からアジド官能基への変換である。

0095

「架橋成分」とは1つ以上の反応性の基を含む化学構造を包含する。これらの反応性の基はそれらの化学構造において同一であることができ、これにより架橋したアクセサリーポリペプチドの直接の構築を可能とする。架橋成分は保護基によりブロックされている反応性の基を含有できる。これにより制御された連続反応において1つの架橋成分に数種の異なる非架橋成分をコンジュゲートできる。架橋成分は、その構造において異なり、そして異なる非架橋成分に選択的にコンジュゲートできる、多数の反応性の基を含有できる。多数の高親和性の結合部位を含有するタンパク質もまた架橋剤として機能できる。例としてはビオチニル化された非架橋成分の分子4つまでと結合できるストレプトアビジンが挙げられる。分枝鎖の多官能性ポリエチレングリコール(PEG)分子は架橋成分として機能できる。2〜8個の官能基及び種々の長さのPEG並びに種々の反応性の基を有する種々の試薬が市販されている。入手元にはNOF America Corporation及びSunBioが包含される。

0096

「非架橋成分」は架橋成分へのコンジュゲーションを可能にする反応性の基を含む化学構造を包含する。非架橋成分は種々のモジュール、例えば1つ以上の生物学的に活性なポリペプチド及び/又は1つ以上のアクセサリーポリペプチドを含有できる。更に又、非架橋成分は精製及び/又は検出を促進するアフィニティータグ、例えばFlag−タグ、E−タグ、Myc−タグ、HA−タグ、His6−タグ、緑色蛍光タンパク質等を含有できる。

0097

「架橋したrPEGポリペプチド」、「架橋したアクセサリーポリペプチド」、「架橋したrPEG」、「CL−rPEGポリペプチド」、「CL−rPEG」とは、架橋成分との非架橋成分1つ以上のコンジュゲーションを指す用語である。

0098

制御放出剤」、「緩徐放出剤」、「デポ製剤」又は「除放剤」とは、その剤の非存在下に修飾ポリペプチドを投与した場合の放出の持続時間と比較した場合に本発明の修飾ポリペプチドの放出の持続時間を延長することができる剤を指すために互換的に使用される。本発明の異なる実施形態は異なる放出速度を有する場合があり、このため、異なる治療薬量をもたらす。

0099

「vLドメイン」とは抗体の軽鎖可変ドメインを指す。

0100

「vHドメイン」とは抗体の重鎖の可変ドメインを指す。

0101

可変フラグメント」(Fv)とは2つの非共有結合的に会合したVL及びVHドメインを含む抗体の一部分を指す。

0102

単鎖可変フラグメント」(scFv)とは単鎖として1つのvLドメインに非天然ペプチドリンカーを介して連結している1つのvHを含む抗体の一部分を指す。scFvはvH−リンカー−vL又はvL−リンカー−vHという構造を有することができ、ここでリンカーは種々の数量のアミノ酸を含む何れかのペプチド配列であることができる。scFvは好ましくは12超のアミノ酸のペプチドリンカーを必要とする単量体構造として生理学的条件下では優勢に存在する。

0103

抗体のジスルフィド安定化Fvフラグメント(dFv)とは相補性決定領域(CDR)から隔たった構造的に保存されたフレームワーク位置の間に作成された鎖間ジスルフィド結合によりVH−VLヘテロ2量体が安定化されている分子を指す。この安定化方法は多くの抗体Fvの安定化のために適用される。

0104

「可変ドメイン」とは抗体の抗原結合部位を形成するドメインを指す。可変ドメインはvH又はvLであることができ;可変ドメインの間の相違点超可変領域HV−1、HV−2及びHV−3)として知られている3つのループ上、即ちCDR1、CDR2及びCDR3に位置する。CDRは保存されたフレームワーク領域により可変ドメイン内に支持されている。

0105

「ドメイン抗体」(dAb)とは単量体としての標的に結合できる抗体の一部分を指す。ドメイン抗体は抗体の重鎖(VH)又は軽鎖(VL)の何れかの可変領域に相当する。dAbは一般的には標的結合のために第2の可変ドメイン(vH又はvL)を必要としない。dAbはファージディスプレイ又は他のインビトロの方法により形成できる。或いは、dAbドメインは免疫化されたラクダ類又はサメ類又は軽鎖を欠失している抗体を形成する他の種から得ることができる。

0106

「ダイアボディー」とは2つのFvヘッド部を有する組み換え抗体を指し、各々はあるポリペプチドに由来するVHドメインを別のポリペプチドに由来するVIドメインと対にしたものよりなる。ダイアボディーは典型的には2つのvH−vL(又はvL−vH)鎖を含有する。ダイアボディーはペプチドリンカーにより抗体のvL及びvHドメインを連結することにより構築できる。ペプチドリンカーの長さは種々の数量のアミノ酸、好ましくは2〜12アミノ酸を含む。ダイアボディーは一重特異性又は二重特異性であることができる。

0107

トリアボディー」とは3つのFvヘッド部を有する組み換え抗体を指し、各々はあるポリペプチドに由来するVHドメインを隣接するポリペプチドに由来するVLドメインと対にしたものよりなる。トリアボディーは3つのvH−vL(又はvL−vH)鎖を含有する。トリアボディーはペプチドリンカーにより抗体のvL及びvHドメインを連結することにより構築できる。ペプチドリンカーの長さは種々の数量のアミノ酸、好ましくは0〜2アミノ酸を含む。トリアボディーは一重特異性、二重特異性、又は三重特異性であることができる。

0108

テトラボディー」は4つのvH−vL(又はvL−vH)鎖を含有する。テトラボディーはペプチドリンカーにより抗体のvL及びvHドメインを連結することにより構築できる。ペプチドリンカーの長さは種々の数量のアミノ酸、好ましくは0〜2アミノ酸を含む。テトラボディーはvL及びvHドメインの連結された末端から、種々の数量のアミノ酸、好ましくは1〜10アミノ酸をトランケーションすることにより得ることができる。

0109

「Fabフラグメント」とは抗原に結合する抗体上の領域を指す。Fabフラグメントは重鎖及び軽鎖の各々の定常ドメイン1つ及び可変ドメイン1つを含む。これらのドメインは単量体のアミノ末端パラトープ、即ち抗原結合部位を形状化する。2つの可変ドメインはそれらの特異的抗原上のエピトープに結合する。FabフラグメントはC末端においてジスルフィド結合により連結できる。Fabフラグメントはインビトロで形成できる。酵素パパインを用いて免疫グロブリン単量体を切断して2つのFabフラグメントと1つのFcフラグメントとすることができる。酵素ペプシンはヒンジ領域の下部で切断し、これによりF(ab’)2フラグメント及びFcフラグメントが形成される。重鎖及び軽鎖の可変領域を共に融合することにより単鎖可変フラグメント(scFv)を形成することができ、これは親免疫グロブリンの元の特異性を保持している。

0110

「抗体フラグメント」という用語は本明細書においては、何れかの型のdAb、Fv、Fab、及びFcのような後に詳述する通り定義される何れかの抗原結合単位を包含する本発明に記載するフラグメントのすべてを包含するように使用される。抗体フラグメントは抗体の追加的ドメインを含むことができる。抗体フラグメントは又、完全又は全体の抗体を包含する。

0111

「親抗体」という用語は本明細書においては、抗体フラグメントの構築の基本となる抗体を指す。

0112

「抗体フラグメント系治療薬」(AFBT)とは本明細書に記載した抗体フラグメントに基づく何れかの治療薬又は医薬組成物を指す。AFBTは多数の異なる親抗体から誘導できる多数の抗体フラグメントを含むことができる。多重特異性AFBTは多数の異なるエピトープに対する特異性を有する多数の抗体フラグメントを含んでよい。これらのエピトープは同じ標的抗原又は多数の異なる標的抗原の部分であることができる。二重特異性AFBTは2つの異なる結合特異性を有する結合部位(一般的には2つ以上であるが1つであってもよい)を含んでよい。

0113

「抗原」、「標的抗原」又は「免疫原」という用語は抗体フラグメント又は抗体フラグメント系治療薬が結合するか、それに対する特異性を有する構造又は結合決定基を指すために本発明においては互換的に使用される。

0114

「ドメイン再アソートメント」及び「ドメイン交換」という用語は抗体フラグメント又は抗体フラグメント系の治療薬の価数を変化させるプロセスを指すために本明細書において互換的に使用される。例えば、単鎖可変フラグメント(scFv)は再アソートすることができ、これにより2量体、3量体等、並びにダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー等を形成する。Fabは他のFabと全鎖を、或いは全抗体さえも交換することができ、潜在的にミスマッチのある鎖を生じ、これにより結合活性の一方又は両方の消失がもたらされる。Bence−Jonesタンパク質と称される軽鎖2量体の形成も別の例となる。再アソートメントのもう1つの例は、二重特異性のIgG4抗体をもたらす場合がある、上記交換を防止するジスルフィド結合したヒンジを有さない、IgG4抗体間の重鎖の再アソートメントである。ドメインの再アソートメントの比率は塩濃度、pH、温度、及び標的抗原の存在のような反応条件に応じたものとなる。

0115

「ペイロード」という用語は本明細書においては、小分子のファーマコフォアと等価である生物学的又は治療上の活性を有するタンパク質又はペプチド配列を指す。ペイロードの例は限定しないが、サイトカイン、酵素及び成長因子を包含する。ペイロードは遺伝子的に融合した、又は化学的にコンジュゲートされた部分を含むことができる。そのような化学的にコンジュゲートされた部分の例は限定しないが、化学療法剤、抗ウィルス化合物、又は造影剤を包含する。これらのコンジュゲートされた部分は切断可能又は非切断可能であってよいリンカーを介してAFBTの残余に連結できる。

0116

コラーゲン結合ドメイン」(CBD)とはコラーゲンに結合するか、それに対する特異性を有するタンパク質ドメインを指す。CBDはコラーゲンIのようなコラーゲンの何れかの特定の型に対して特異的であることができる。或いは、CBDは種々のコラーゲン型に結合してよい。一例としては4つのタンパク質ドメインがコラーゲン結合のために十分であるフィブロネクチンである。

0117

「反復性」という用語は、ポリペプチド、例えばアクセサリーポリペプチドPEGの文脈において使用する場合、ペプチド配列における内部の相同性の程度を指す。反復配列はアミノ酸配列の多数の同一又は相同なコピーを含有してよい。反復性は同一のサブ配列の頻度を分析することにより計測できる。例えば、目的のポリペプチド配列をn量体のサブ配列に分割してよく、そして同一のサブ配列の数を計算することができる。高度に反復性の配列は同一のサブ配列の大型の画分を含有する。

0118

「総電荷密度」とは、本明細書においては、正荷電したアミノ酸の数に負荷電したアミノ酸の数を加算し、そして、合計をポリペプチド中のアミノ酸の総数で割ることにより計算される。例えば:hIgG1Fc配列:(MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTIPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL)負荷電残基数:24;正荷電残基数:22;残基総数:224;Fc単独の総電荷密度:(22+24)/224=46/224=20.5%
「実質電荷密度」とは、本明細書においては、正荷電したアミノ酸の数を負荷電したアミノ酸の数から差し引き、そして、その差をポリペプチド中のアミノ酸の総数で割ることにより計算される。例えば:hIgG1Fc配列:(MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTIPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL)負荷電残基数:24;正荷電残基数:22;残基総数:224;Fc単独の実質電荷密度:(24−22)/224=2/224=0.9%.
「予測された溶解性」とは、本明細書においては、折り畳まれたタンパク質の実質電荷を未構造化タンパク質(例えばrPEG)の総電荷に加算し、そして合計をタンパク質中のアミノ酸の総数で割ることにより計算される。例えばFc−rPEG50の予測された溶解性は(−2+192)/(224+576)=190/800=23.75%である。

0119

生物学的に活性なポリペプチドの発現の間の溶解性を向上させるためのアクセサリーポリペプチドの設計
可溶性の修飾された生物学的に活性なポリペプチドの発現は、修飾ポリペプチドの実質電荷密度を変更することにより最適化してよい。一部の場合においては、実質電荷密度は+0.1超又は−0.1未満の電荷/残基である。他の例においては電荷密度は残基当たり+0.2超又は−0.2未満の電荷である。電荷密度は生物学的に活性なポリペプチドに連結したアクセサリーポリペプチド内のアルギニン、リジン、グルタミン酸及びアスパラギン酸のような荷電したアミノ酸の含有量を変更することにより制御してよい。所望によりアクセサリーポリペプチドは荷電した残基の短いストレッチのみを含んでよい。或いは、アクセサリーポリペプチドはセリン又はグリシンのような他の残基により分離された荷電した残基を含んでよく、これは良好な発現又は精製の挙動をもたらす場合がある。より高度な発現を行ってよい。セリンの使用はより高度な発現レベルをもたらす場合がある。

0120

細胞質中で融合タンパク質を可溶性とし、折り畳み可能とするためにアクセサリータンパク質に必要とされる実質電荷は生物学的に活性なポリペプチド、特にその大きさ及び実質電荷に依存している。修飾ポリペプチドの実質電荷は正又は負であってよい。一部の用途においては、グルタミン酸又はアスパラギン酸のような負のアミノ酸がリッチであるアクセサリーポリペプチド配列が望ましい場合がある。他の用途においては、リジン又はアルギニンのような正のアミノ酸がリッチであるアクセサリーポリペプチド配列が好ましい場合がある。正及び負荷電のアミノ酸の両方の使用は電荷の中和をもたらす場合があり、これは潜在的には本発明の利点を中和する場合がある。例えば16%、25%又は33%の負荷電残基を有する288アミノ酸のアクセサリータンパク質は、96までの総電荷を与える場合があり、これはアミノ酸960個以下の中性融合タンパク質、又はアミノ酸672個の非融合タンパク質に関して0.1の電荷密度を達成するために十分である。1つの特定の例において、33%のグルタミン酸残基を含むアクセサリーポリペプチドを使用することにより、極めて大型で発現しにくいタンパク質を可溶性とすることができる。

0121

結合タンパク質に溶解性を付与するためには、アクセサリーポリペプチドの実質正電荷又は負電荷は5、10、15又は20超であるか、又更には30、40、50、60、70、80、90又は100超であってよい。電荷は5、10、15、20、25、30、40、50アミノ酸の短い配列中に濃縮されることができ、或いは、60、80、100、150、200、250、300、400、又は500以上のアミノ酸のより長い配列に渡って散在することもできる。負のアクセサリーポリペプチドの配列は5、10、15、25、30、40、50、60、70、80、90又は100パーセント超のグルタミン又はアスパラギン酸を含有してよく、そして正のアクセサリーポリペプチドは5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90又は100パーセント超のアルギニン又はリジンを含有してよい。相対的に親水性の残基であるセリン及びグリシンのような非荷電残基を使用してよい。

0122

アクセサリーポリペプチドの設計における追加的な検討事項
本発明の1つの態様は、生物学的に活性なポリペプチドの修飾のためのアクセサリーポリペプチド、例えばrPEGアクセサリーポリペプチド等の設計である(図1)。アクセサリーポリペプチドは治療上及び/又は診断上の価値を有する組み換えタンパク質を形成する場合に特に有用である。

0123

種々のアクセサリーポリペプチド配列を設計することができ、そしてこれらはグリシン及び/又はセリン、並びに他のアミノ酸、例えばグルタメート、アスパルテート、アラニン又はプロリンがリッチであってよい。アクセサリーポリペプチド配列は親水性アミノ酸がリッチであり、そして低いパーセンテージの疎水性又は芳香族のアミノ酸を含有してよい。アクセサリーポリペプチド配列は少なくとも30、40、50、60、70、80、90又は100%のグリシン及び/又はセリン残基を有するように設計できる。一部の場合においては、アクセサリーポリペプチド配列は少なくとも50、55、60、65%のグリシン及び/又はセリンを含有する。他の場合においては、アクセサリーポリペプチド配列は少なくとも70、75、80、85、90%のグリシン及び/又はセリン残基を含有してよい。

0124

本発明の組成物は典型的には少なくとも合計40アミノ酸よりなるアクセサリーポリペプチド配列を含有することになる。しかしながら、生成物は多数のアクセサリーポリペプチド配列を含有することができ、そして、これらの個々のアクセサリーポリペプチド配列の一部又は全ては、生成物の全てのアクセサリーポリペプチド配列の合計長が少なくとも40アミノ酸である限り、40アミノ酸より短いものであってよい。一部の実施形態においては、タンパク質に結合しているアクセサリーポリペプチド配列の合計長は20、25、35、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900又は1000又は2000超のアミノ酸であることができる。一部の修飾された生物学的に活性なポリペプチドにおいては、アクセサリーポリペプチド配列の合わせた長さは60、70、80、90以上のアミノ酸を超える。他の修飾ポリペプチドにおいてはアクセサリーポリペプチド配列の合わせた長さは100、120、140、160又は180アミノ酸、そして更には200、250、300、350、400、5000、600、700、800又は更には1000超のアミノ酸を超える。

0125

1種又は数種のアクセサリーポリペプチド配列は、生物学的に活性なポリペプチドに、例えば生物学的に活性なポリペプチドのN又はC末端に融合することができ、或いは、目的のポリペプチドのループ内に挿入することにより、結果として生じる修飾ポリペプチドに、未修飾ポリペプチドと比較して、向上した特性を付与することができる。(治療用)タンパク質へのアクセサリー配列の融合は未修飾のタンパク質と比較して結果として生じる融合タンパク質の流体力学的半径を優位に増大させ、これは例えば超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、又は光散乱等により検出できる。

0126

アクセサリーポリペプチド配列は所望の特性が得られるようにアミノ酸の1種以上の型を回避するように設計することができる。例えば以下のアミノ酸、即ちシステイン(ジスルフィド形成及び酸化を回避するため)、メチオニン(酸化を回避するため)、アスパラギン及びグルタミン(デスアミド化を回避するため)及びアスパルテートを殆ど、又は全く含有しないようにアクセサリーポリペプチド配列を設計できる。アクセサリーポリペプチド配列はタンパク質分解に対する感受性を低減する傾向のあるプロリン残基を含有するように設計できる。

0127

アクセサリーポリペプチド配列はタンパク質の生産を最適化する等のために設計できる。これはコードしているDNAの反復性を回避又は最小限化することにより達成できる。アクセサリーポリペプチド配列、例えばポリグリシン又はポリセリンは極めて望ましい医薬品特性を有する場合があるが、それらの製造は、ポリグリシンに関してコードしているDNA配列の高GC含有量のため、及び、組み換えをもたらす場合がある反復DNA配列の存在のために困難である場合がある。

0128

G、S及びEがリッチである配列がリッチである短い反復モチーフを含む単純な配列を包含するアクセサリーポリペプチドはこれらの配列にT細胞エピトープが非存在であるにもかかわらず、多数の種において>1,000の相対的に高い抗体価をもたらす場合がある。これは、タンパク質凝集塊、架橋した免疫原及び反復炭化物を包含する反復エピトープを有する免疫原が高度に免疫原性であることが分かっていることから、アクセサリーポリペプチドの反復性により生じる場合がある。(Johansson,J.ら(2007)Vaccine,25:1676−82,Yankai,Z.ら(2006)Biochem Biophys Res Commun,345:1365−71,Hsu,C.T.ら(2000)Cancer Res,60:3701−5)。5価のIgM分子をディスプレイするB細胞は、IgMに対する免疫原の一価結合親和性が例えばマイクロモル濃度のように極めて低値であっても反復免疫原により刺激される(図74)。同じ分子上又は同じ細胞上に位置する多数の連結IgMドメインに連結リピートが同時に結合することは、B細胞を刺激する場合がある相互作用の見かけの(有効な)親和性の大きな(千、百万又はおそらくは一千万倍)増大をもたらす場合がある。この型の作用を回避するためには、アクセサリーポリペプチドは多数の種の動物(例えばラット、ウサギ、マウス、又はモルモット)において、免疫原性に関して(並びに半減期及び他の特性に対する作用に関して)スクリーニングしてよい(多数回の注入を実施し、免疫化の前及び後に同じ動物において薬物動態の特性を計測する)。更に又、アクセサリーポリペプチド配列は、非反復性(各配列モチーフの1つの同一コピーのみを含む)となるように、又は各配列モチーフの最小数のコピーを有するように設計してよい。低い反復性のアクセサリーポリペプチド配列は異なるIgMに対する結合部位を含んでよいが、各B細胞は一般的に1つの型のみのIgMを分泌し、そして各IgMは典型的には1つの型の結合部位のみを有するため、それらが同じIgM分子に、又は同じB細胞に多価性に結合する能力は低くなる場合がある。この機序は図74a及びbに説明する。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドはアクセサリーポリペプチド当たり1、2、3、4、5程度のコピーにおいて存在する配列のみを含有してよい。より少数のリピートを有するポリペプチドはより低い期待アビディティを有する場合があり、実質的な免疫応答を誘導する可能性は低いと考えられる。そのような配列は多数の型のアミノ酸、例えば2つの型(例えばG及びE又はS及びE)、3つの型のアミノ酸(例えばG、E及びS)又は4つ以上を含んでよい。そのようなアクセサリーポリペプチドは又、総アミノ酸組成の30〜80%のグリシン、10〜40%のセリン及び15〜50%のグルタメートを含んでよい。そのような配列は発現レベル、血清及びE.coliのプロテアーゼ耐性、溶解性、凝集性、及び免疫原性のような所望の特性の最適なバランスをもたらす場合がある。

0129

図74は反復(74a)及び非反復(74b)のアクセサリーポリペプチド配列の該配列中のエピトープを認識するB細胞との相互作用を比較している。反復配列は、それが相対的に少数の異なるエピトープを含有するため、ある生物において、僅かなB細胞によって認識されることになる。しかしながら、反復配列はこれらの僅かなB細胞と多価の接点を形成することができ、そしてその結果、それは図74aにおいて説明する通りそれらの増殖を刺激することができる。非反復配列は、それが多くの異なるエピトープを含有するため、多くの異なるB細胞との接点を形成できる。しかしながら、各々個々のB細胞は、図74bにおいて説明する通り反復性の欠如により、個々の非反復アクセサリーポリペプチド(「nrURP」)とは1つ又は少数の接点を形成できるのみである。その結果、非反復アクセサリーポリペプチドがB細胞の増殖、そしてそれによる免疫応答を刺激する傾向は、遙かに低値となる場合がある。

0130

反復アクセサリーポリペプチドと比較した場合の非反復アクセサリーポリペプチドの追加的利点は、非反復アクセサリーポリペプチドが反復アクセサリーポリペプチドと比較して抗体とより弱い接点を形成することである。抗体は多価分子である。例えば、IgGは2つの同一の結合部位を有しており、そしてIgMは10の同一の結合部位を含有する。即ち、反復配列に対する抗体は高いアビディティでそのような反復配列との多価の接点を形成することができ、これはそのような反復配列の力価及び/又は排出に影響する場合がある。これとは対照的に、非反復アクセサリーポリペプチドに対する抗体は、該非反復アクセサリーポリペプチドが各エピトープの僅かなリピートを含有していることから、抗体とは殆どが1価の相互作用を生じる傾向がある。

0131

反復性はペプチド配列における内部相同性の程度を説明するものである。極端な例においては、反復配列はアミノ酸配列の多数の同一のコピーを含有できる。反復性は同一のサブ配列の頻度を分析することにより計測される。例えば目的の配列をn量体に分割し、そして同一又は相同な配列の数を計数できる。高度の反復性の配列は同一又は相同なサブ配列の大型の画分を含有することになる。

0132

遺伝子の反復性はコンピュータアルゴリズムにより計測できる。例は図75において説明する。クエリ配列に基づいて、特定の長さのサブ配列全てのペアワイズな比較を実施できる。これらのサブ配列は同一性又は相同性に関して比較できる。図75に示す例は、同一性に関して4アミノ酸のサブ配列を比較している。例においては、大部分の4量体サブ配列はクエリ配列中に1回のみ生じており、そして34量体サブ配列は2回生じている。遺伝子内の反復性を平均することができる。サブ配列の長さは調節できる。所望により、サブ配列の長さは免疫系により認識されることができる配列エピトープの長さを反映する場合がある。即ち、4〜15アミノ酸のサブ配列の分析を実施できる。非反復アクセサリーポリペプチドをコードする遺伝子を遺伝子合成の標準的手法を用いながらオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。遺伝子設計はコドンの使用及びアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用しながら実施できる。更に又、プロテアーゼ感受性であるか、又はヒトの免疫系により容易に認識されることができるエピトープであることが知られているアミノ酸配列を回避することができる。コンピュータアルゴリズムは結果として生じるアミノ酸配列反復を最小限にするように配列設計中に適用することができる。アミノ酸組成、コドンの使用、プロテアーゼ感受性サブ配列の回避、エピトープの回避のようなプリセットされた基準にマッチする遺伝子設計の多数の反復性を評価することができ、合成及びその後の評価のために最低反復性の配列を選択する。

0133

非反復アクセサリーポリペプチド遺伝子の設計のための代替の手順は、高レベルの発現、低凝集傾向、高い溶解性、及び良好なプロテアーゼ耐性を示す非反復アクセサリーポリペプチドの既存のコレクションの配列を分析することである。コンピュータアルゴリズムは配列フラグメントの再組立によりそのような既存の非反復アクセサリーポリペプチド配列に基づいて非反復アクセサリーポリペプチド配列を設計できる。アルゴリズムはこれらの非反復アクセサリーポリペプチド配列からサブ配列のコレクションを形成し、そしてそのようなサブ配列から非反復アクセサリーポリペプチド配列を組み立てる多数の方法を評価する。これらの組み立てられた配列は、あらかじめ識別された非反復アクセサリーポリペプチドのサブ配列のみを含む非反復アクセサリーポリペプチド配列を識別するために反復性を評価することができる。

0134

非反復アクセサリーポリペプチドをコードする遺伝子は図77において説明する通り短いアクセサリーポリペプチドセグメントのライブラリから組み立てることができる。先ずアクセサリーポリペプチドセグメントの大型のライブラリを形成することができる。そのようなライブラリは部分ランダム化オリゴヌクレオチドから組み立てることができる。ランダム化スキームは各位置に関するアミノ酸の選択並びにコドン使用を制御するために最適化できる。アクセサリーポリペプチドセグメントのライブラリを発現ベクター内にクローニングしてよい。或いは、GFPのようなインジケーター遺伝子に融合した発現ベクター内にアクセサリーポリペプチドセグメントのライブラリをクローニングしてよい。その後、発現のレベル、プロテアーゼ安定性、抗血清への結合のような多くの特性に関してライブラリのメンバーをスクリーニングできる。特に望ましいアミノ酸組成、セグメント長を有するセグメントを識別するため、又は内部リピートが低頻度であるセグメントを識別するために、ライブラリのメンバーのアミノ酸配列を決定することができる。その後、ランダム2量体化又は多量体化によりアクセサリーポリペプチドセグメントのコレクションから非反復アクセサリーポリペプチド配列を組み立てることができる。2量体化又は多量体化はライゲーション又はPCR組み立てにより達成できる。このプロセスは、最良の特性を有する非反復アクセサリーポリペプチド配列を識別するために多くの特性に関して評価できるライブラリ非反復アクセサリーポリペプチド配列をもたらす。2量体化又は多量体化のプロセスを反復することにより非反復アクセサリーポリペプチド配列の長さを更に増大することができる。

0135

特定の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは以下の8アミノ酸モチーフ:GEGSGEGSE、GEGGSEGSE、GEGSEGSGE、GEGSEGGSE、GEGSGEGGE、GEGGSEGGE、GEGGGEGSE、GEGGEGSGE、GEGGEGGSE、又はGEGSEGGGEの混合物を含む。この設計は相互に相対的なモチーフ数の比に応じて平均で33%E及び11〜22%セリン含有量を有する。別の特定の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドは以下の12アミノ酸モチーフ:GXEGSGEGXGXE、GXEGGSEGXGXE、GXEGSGEGGSGE、GXEGGSEGGSGE、GSGEGXEGXGXE、GGSEGXEGXGXE、GSGEGXEGGSGE又はGGSEGXEGGSGEの混合物を含み、ここでXは等しい尤度においてS又はEの何れかを示す。この設計は選択された特定の比に応じて平均で25%E及び約1%Sを有する。適当な特定の比は1:1:1:1:1:1:1:1比又は他の何れかの比であってよく、そして組成を微調整するものであってよい。

0136

アクセサリーポリペプチド配列はアミノ酸レベルにおいて高度に反復性、低い反復性又は非反復性であるように設計することができる。例えば、高度に反復性のアクセサリーポリペプチド配列は重複する9量体のペプチド配列少数のみを含有してよく、これにより免疫反応を誘発する危険性は低減される。

0137

単一アミノ酸型のアクセサリーポリペプチド配列の例は:ポリグリシン、ポリグルタミン酸ポリアスパラギン酸、ポリセリン、ポリスレオニンであり、ここで長さは少なくとも20残基である。2つの型のアミノ酸を有するアクセサリーポリペプチドの例は
(GX)n、(SX)nであり、ここでGはグリシンであり、そしてSはセリンであり、そしてXはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、そしてnは少なくとも10である。別の例は(GGX)n又は(SSX)nであり、ここでXはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、そしてnは少なくとも7である。別の例は(GGGX)n又は(SSSX)nであり、ここでXはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、そしてnは少なくとも5である。別の例は(GGGGX)n又は(SSSSX)nであり、ここでXはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、そしてnは少なくとも4である。他の例は(GzX)n、及び(SzX)nであり、そしてここでXはアスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、又はプロリンであり、nは少なくとも10であり、そしてzは1〜20である。

0138

これらのリピートの数は5〜300以上の何れかの数であることができる。本発明の生成物は半ランダム配列であるアクセサリーポリペプチド配列を含有してよい。例としては少なくとも30、40、50、60又は70%グリシンを含有する半ランダム配列であり、この場合、グリシンは十分分散しており、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの総濃度は合わせて70、60、50、40、30、20、又は10%未満である。好ましい半ランダムアクセサリーポリペプチド配列は少なくとも40%グリシンを含有し、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの総濃度は10%未満である。より好ましいランダムアクセサリーポリペプチド配列は少なくとも50%グリシンを含有し、そしてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの総濃度は5%未満である。アクセサリーポリペプチド配列は2つ以上のより短いアクセサリーポリペプチド配列又はアクセサリーポリペプチド配列のフラグメントの配列を組み合わせることにより設計できる。そのような組み合わせは、アクセサリーポリペプチド配列を含有する生成物の医薬品特性を良好に調整できるようにし、そしてそれはアクセサリーポリペプチド配列をコードするDNA配列の反復性を低減できるようにし、これはアクセサリーポリペプチド配列をコードする配列の発現を向上させ、組み換えを低減することができる。

0139

高レベルの溶解性が望まれる場合は、高画分の荷電した残基、好ましくは>25%グルタメート(E)とし、そして残余はほとんどグリシン又はセリンとしたものを使用してよい。高レベルの発現は10〜50%セリン(E)を好ましく使用するが、その理由はセリンが6コドンを有しており、これは一般的にグリシン(4コドン)よりも遙かに高値の発現レベルをもたらすためである。これは一般的に、配列における高いグルタメート含有量を利用した場合の溶解性及び急速なクリアランスを引き換えにしている。所望により50%未満、30%未満のグルタメート含有量を使用することにより、所望の溶解性をもたらし、そして動物における急速なクリアランスを回避する。

0140

非グリシン残基は特性を最適化するために選択できる
特に興味深いものは、グリシン及び/又はセリンリッチであるアクセサリーポリペプチド配列である。これらのglyリッチ又はserリッチの配列における非gly、非ser残基の配列はタンパク質の特性を最適化するために選択できる。例えば、特定の組織に対する生物学的に活性なポリペプチドの選択性を増強するためにアクセサリーポリペプチドの配列を最適化できる。そのような組織選択的なアクセサリーポリペプチド配列はランダム又は半ランダムなアクセサリーポリペプチド配列のライブラリを作成し、それらを動物又は患者に注入し、そして、組織試料中の所望の組織選択性を有する配列を決定することにより得ることができる。配列の決定は質量スペクトル分析により実施できる。同様の方法を用いながら、経口、口内、腸内、内、髄腔内、腹腔内、肺内直腸内、又は皮膚による取り込みを促進するアクセサリーポリペプチド配列を選択できる。特に興味深いものは膜を経由した細胞取り込み又は輸送好都合正荷電アミノ酸であるアルギニン又はリジンが相対的にリッチである領域を含有するアクセサリーポリペプチド配列であり;そのようなアクセサリーポリペプチドはタンパク質の細胞内送達のために有用である場合がある。

0141

後述においてより詳細に説明する通り、アクセサリーポリペプチド配列はプロテアーゼ感受性配列1つ又は数個を含有するように設計できる。そのようなアクセサリーポリペプチド配列は、本発明の生成物がその標的の位置に到達すれば切断されることができる。この切断は薬学的に活性なドメインの力価の増大をトリガーする(プロドラッグ活性化)か、又はそれは受容体への切断産物の結合を増強する場合がある。これは現在では抗体に対しては可能ではない。しかしながら、PEG化された又はアクセサリータンパク質で修飾された生物学的に活性なポリペプチドの場合は、トマトエッチウィルスプロテアーゼ又は同様の部位特異的非ヒトプロテアーゼのような外来性プロテアーゼに対する切断部位を与えることができる。プロテアーゼ部位がアクセサリータンパク質と治療用タンパク質の間、又は治療用タンパク質に近接してある場合は、プロテアーゼの注入は薬物からアクセサリータンパク質テール部を除去することになり、これにより、より短い半減期及び患者の系からの除去がもたらされる。血清中の薬物の濃度は10〜100倍低下することになり、治療を効果的に終了する。これは例えばTNF阻害ミクロタンパク質(例えばTNFa受容体rPEG)を用いた治療の間の感染により治療を急に中止する必要が生じた場合等に望ましいものとなる。一例としては、アクセサリータンパク質を切断除去するプロテアーゼを治療計画に追加することにより、タンパク質の活性なTNF阻害部分の半減期を急激に減少させることができ、これが次に急速なクリアランスに付される。この手順によれば感染症が抑制できることになる。

0142

アクセサリーポリペプチド配列は又、アスパラギン酸、又はグルタミン酸の残基を導入することにより過剰な負電荷を担持するように設計できる。特に興味深いものは、8、10、15、20、25、30、40又更には50%のグルタミン酸及び2%未満のリジン又はアルギニンを含有するアクセサリーポリペプチドである。そのようなアクセサリーポリペプチドは高い実質負電荷を担持し、そしてその結果として、それらはペプチドの個々の負電荷の間の静電気的反発力のために開放型のコンホーメーションを採用する傾向を有する。そのような実質負電荷はそれらの流体力学的半径の効果的な増大をもたらし、そしてその結果として、それはそのような分子の低減された腎クリアランスをもたらす場合がある。即ち、アクセサリーポリペプチド配列中の負荷電のアミノ酸の頻度及び分布を制御することによりアクセサリーポリペプチド配列の有効実質電荷及び流体力学的半径を調整することができる。ヒト又は動物の大部分の組織及び表面は実質負電荷を有している。実質負電荷を有するようにアクセサリーポリペプチド配列を設計することにより、アクセサリーポリペプチド−治療用タンパク質と種々の表面、例えば血管、健常な組織、又は種々の受容体との間の非特異的相互作用を最小限にすることができる。

0143

本発明で有用な他のアクセサリーポリペプチドは以下の特徴の1つ以上を呈する。

0144

アクセサリーポリペプチドは増強された流体力学的半径を特徴とすることができるが、アクセサリーポリペプチドはそれが連結している生物学的に活性なポリペプチドの見かけの分子量ファクターを増大させる。見かけの分子量ファクターは血清中の分泌半減期の予測材料(予測された分子量が一定であると仮定)であるため、より高値の見かけの分子量ファクターを有するアクセサリーポリペプチドはより長い血清中半減期を示すことが期待される。一部の実施形態においては、アクセサリーポリペプチドに関する見かけの分子量ファクターは3、5、7又更には9超であることができる。見かけの分子量ファクターは種々の方法、限定しないが例えばコントロールされた孔径を有するメンブレンを通した限外濾過によるか、又はサイズ排除ゲル濾過(SEC)により計測できる。見かけの分子量ファクターは塩及び他の溶質の濃度により影響される場合がある。それは一般的には血液又は生理食塩水のような生理学的条件と同様の条件下で計測しなければならない。

0145

アクセサリーポリペプチドは又、生物学的に活性なポリペプチド内へのその配合時に生物学的に活性なポリペプチドがアクセサリーポリペプチドを欠いている相当するタンパク質と比較してより長い半減期を呈する作用を特徴とする場合がある。血清中半減期を確認する方法は当該分野で知られている(例えばAlvarez、P.ら(2004)J Biol Chem、279:3375−81参照)。結果として生じるタンパク質が未修飾のタンパク質と比較してより長い血清中半減期を有するかどうかは、当業者の知る、又は本明細書において例示する何れかの方法を実施することにより容易に調べることができる。

0146

アクセサリーポリペプチドポリペプチドは又、それが結合しているタンパク質の溶解性を増大させることができる。例えばヒトインターフェロン−アルファ、ヒト成長ホルモン及びヒトG−CSFは典型的にはE.coliの細胞質中で発現されれば封入体を形成するが、アクセサリーポリペプチド(例えば(SSGSSE)48又は(SSESSSSESSSE)24、(GEGGGEGGE)36又はその他)の結合により発現されたポリペプチドの溶解性が増大し、これによりそれはもはや封入体を形成しないが、なお原形質中で可溶であり、そこから活性型及び高い発現レベル及び効率において容易に精製することができ、封入体からの再折り畳みの必要性が回避できるのである。

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