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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、子宮頸癌治療および子宮頸癌からの保護に関して使用するための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む、組み換えリステリア株であって、該第1のペプチドが、(a)LLタンパク質N末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択される、組み換えリステリア株を提供する。本発明はまた、ヒト対象において抗E7CTL応答を低減するための方法、ならびにHPV介在性疾患、疾病、および症状を治療するための方法における、該組み換えリステリア株の使用も提供する。

概要

背景

世界中で、毎年約500,000の子宮頸癌の症例が診断されている。頸部の癌(子宮頸癌)は、頸部の粘膜発症する。正常な頸部細胞は、徐々に癌になる前癌病変を来たす。頸部上皮内腫瘍形成CIN)、扁平上皮病変(SIL)、および生体内新形成異形成を含む、いくつかの用語が、これらの前癌病変を説明するために使用される。

2つの主要なタイプの子宮頸癌である、扁平上皮癌および腺癌がある。子宮頸癌および子宮頸前癌は、顕微鏡像によって分類される。約80%〜90%の子宮頸癌は扁平上皮癌であり、これは、子宮頸内部の表面を覆う、扁平上皮細胞と呼ばれる平坦な薄い細胞に似た細胞で構成される。扁平上皮癌はほとんどの場合、子宮頸外部と子宮頸内部がつながる場所で発症する。

残りの10%〜20%の子宮頸癌は腺癌である。腺癌は、20から30歳の女性において、より一般的になってきている。子宮頸部腺癌は、子宮頸内部の粘液産生腺細胞から発達する。あまり一般的ではないが、子宮頸癌は、扁平上皮癌と腺癌の両方の特徴を有することがある。これらは、「腺扁平上皮癌」または「混合癌」と呼ばれる。

当該技術分野において子宮頸癌のための改善された治療法が緊急に必要とされている。

概要

本発明は、子宮頸癌の治療および子宮頸癌からの保護に関して使用するための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む、組み換えリステリア株であって、該第1のペプチドが、(a)LLタンパク質N末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択される、組み換えリステリア株を提供する。本発明はまた、ヒト対象において抗E7CTL応答を低減するための方法、ならびにHPV介在性疾患、疾病、および症状を治療するための方法における、該組み換えリステリア株の使用も提供する。

目的

本発明は、子宮頸癌の治療、および子宮頸癌からの保護に関して使用するための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えリステリア株であって、該第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択される、組み換えリステリア株を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
2件

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請求項1

ヒト対象において子宮頸癌治療するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用であって、前記第1のペプチドは、(a)LLタンパク質N末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択され、これによって、前記組み換えリステリア株は、前記E7抗原に対する免疫応答誘導し、前記組み換えリステリア株は、1×109〜3.31×109の生命体の用量で前記ヒト対象に投与される、使用。

請求項2

子宮頸癌からヒト対象を保護するための組成物の調製における、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用であって、前記第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択され、これによって、前記組み換えリステリア株は、前記E7抗原に対する免疫応答を誘導し、前記組み換えリステリア株は、1×109〜3.31×1010の生命体の用量で前記ヒト対象に投与される、使用。

請求項3

ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用であって、前記第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、およびPEST様配列含有ペプチドから選択され、前記組み換えリステリア株は、1×109〜3.31×1010の生命体の用量で前記ヒト対象に投与される、使用。

請求項4

ヒト対象において抗E7細胞傷害性T細胞応答を誘導するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用であって、前記第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択され、前記組み換えリステリア株は、1×109〜3.31×1010の生命体の用量で前記ヒト対象に投与される、使用。

請求項5

前記LLOタンパク質のN末端フラグメントは配列番号1を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。

請求項6

前記ActAタンパク質は配列番号2〜5を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。

請求項7

前記組み換えリステリア株は、1×109の生命体の用量で前記ヒト対象に投与される、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。

請求項8

前記組み換えリステリア株は、3.31×109の生命体の用量で前記ヒト対象に投与される、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。

請求項9

前記組み換えリステリア株は、組み換えリステリアモノサイトゲネス株である、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。

請求項10

前記組み換えリステリア株は、動物宿主継代されている、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。

請求項11

前記組み換えポリペプチドは、前記組み換えリステリア株によって発現される、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。

請求項12

前記組み換えリステリア株は、前記組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。

請求項13

前記プラスミドは、細菌転写因子をコード化する遺伝子を含む、請求項12に記載の使用。

請求項14

前記プラスミドは、代謝酵素をコード化する遺伝子を含む、請求項12に記載の使用。

請求項15

前記E7抗原を含む、または前記E7抗原の発現を誘導する第2の組成物が、前記組み換えリステリア株と併用される、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。

請求項16

前記組み換えリステリア株は、凍結または凍結乾燥された細胞バンク保管されていたものである、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。

請求項17

前記組み換えリステリア株は、解凍または再構成時に90%を上回る生存能力を呈する、請求項16のいずれかに記載の使用。

技術分野

0001

本発明は、子宮頸癌治療、および子宮頸癌からの保護に関して使用するための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えリステリア株であって、該第1のペプチドは、(a)LLタンパク質N末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択される、組み換えリステリア株を提供する。本発明はまた、ヒト対象において抗E7CTL応答誘導するための方法、ならびにHPV介在性疾患、疾病、および症状を治療するための方法における、組み換えリステリア株の使用を提供する。

先行技術

0002

PCT国際公開第WO2004/062597号号公報
PCT国際公開第WO2007/061848号公報
米国特許第5,723,335号明細書
米国特許第5,663,153号明細書
PCT国際公開第WO95/26204号公報
米国特許出願公開第2005/0118184号明細書

背景技術

0003

世界中で、毎年約500,000の子宮頸癌の症例が診断されている。頸部の癌(子宮頸癌)は、頸部の粘膜発症する。正常な頸部細胞は、徐々に癌になる前癌病変を来たす。頸部上皮内腫瘍形成CIN)、扁平上皮病変(SIL)、および生体内新形成異形成を含む、いくつかの用語が、これらの前癌病変を説明するために使用される。

0004

2つの主要なタイプの子宮頸癌である、扁平上皮癌および腺癌がある。子宮頸癌および子宮頸前癌は、顕微鏡像によって分類される。約80%〜90%の子宮頸癌は扁平上皮癌であり、これは、子宮頸内部の表面を覆う、扁平上皮細胞と呼ばれる平坦な薄い細胞に似た細胞で構成される。扁平上皮癌はほとんどの場合、子宮頸外部と子宮頸内部がつながる場所で発症する。

0005

残りの10%〜20%の子宮頸癌は腺癌である。腺癌は、20から30歳の女性において、より一般的になってきている。子宮頸部腺癌は、子宮頸内部の粘液産生腺細胞から発達する。あまり一般的ではないが、子宮頸癌は、扁平上皮癌と腺癌の両方の特徴を有することがある。これらは、「腺扁平上皮癌」または「混合癌」と呼ばれる。

0006

当該技術分野において子宮頸癌のための改善された治療法が緊急に必要とされている。

課題を解決するための手段

0007

本発明は、子宮頸癌の治療および子宮頸癌からの保護に関して使用するための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む、組み換えリステリア株であって、該第1のペプチドが、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択される、組み換えリステリア株を提供する。本発明はまた、ヒト対象において抗E7CTL応答を誘導するための方法、ならびにHPV介在性疾患、疾病、および症状を治療するための方法における、該組み換えリステリア株の使用も提供する。

0008

一実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌を治療するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用を本明細書に提供し、該第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択され、これによって、該組み換えリステリア株は、該E7抗原に対する免疫応答を誘導し、該組み換えリステリア株は、1×109〜3.31×109の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。

0009

一実施形態において、子宮頸癌からヒト対象を保護するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用を本明細書で提供し、該第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択され、これによって、該組み換えリステリア株は、該E7抗原に対する免疫応答を誘導し、該組み換えリステリア株は、1×109〜3.31×1010の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。

0010

別の実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用を本明細書で提供し、該第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、およびPEST様配列含有ペプチドから選択され、該組み換えリステリア株は、1×109〜3.31×1010の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。

0011

別の実施形態においてヒト対象において抗E7細胞傷害性T細胞応答を誘導するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用であって、該第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択され、該組み換えリステリア株は、1×109〜3.31×1010の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。

図面の簡単な説明

0012

Lm−E7およびLm−LLO−E7は、異なる発現系を使用して、E7を発現および分泌する。Lm−E7は、遺伝子カセットを、L.モノサイトゲネスゲノムのorfZドメインに導入することによって生成した。(A)hlyプロモータは、hlyシグナル配列、およびLLOの最初の5つのアミノ酸(AA)、その後HPV−16 E7の発現を促進する。(B)Lm−LLO−E7は、prfA株XFL−7を、プラスミドpGG−55で形質転換することによって生成した。pGG−55は、LLO−E7の非溶血性融合の発現を促進するhlyプロモータを有する。pGG−55はまた、生体内XFL−7によるプラスミドの保持を選択する、prfA遺伝子を含有する。
Lm−E7およびLm−LLO−E7はE7を分泌する。Lm−Gag(レーン1)、Lm−E7(レーン2)、Lm−LLO−NP(レーン3)、Lm−LLO−E7(レーン4)、XFL−7(レーン5)、および10403S(レーン6)を、Luria−Bertoniブロスで37℃で終夜増殖させた。吸光度600nmでODによって測定された同等の数の細菌をペレットし、18mlのそれぞれの上清をTCA沈殿させた。E7発現をWesternブロットによって分析した。ブロットを抗E7 mAb、その後HRP共役抗マウス(Amersham)でプローブし、次いでECL検出試薬を使用して現像した。
LLO−E7融合の腫瘍免疫療法の有効性腫瘍接種後7、14、21、28および56日目のマウスにおけるミリメートル単位の腫瘍の大きさを示す。未処理のマウス:白丸、Lm−LLO−E7:黒丸、Lm−E7:四角、Lm−Gag:白ひし形、およびLm−LLO−NP:黒三角
TC−1細胞に曝露した際に、Lm−LLO−E7で免疫化されたマウスからの脾細胞は増殖する。C57BL/6マウスを、Lm−LLO−E7、Lm−E7、または対照rLm株で免疫化および追加免疫した。追加免疫後6日目に脾細胞を採取し、示される割合で放射されたTC−1細胞とともにプレートした。細胞を3Hチミジンパルスし、採取した。Cpmは(実験cpm)−(無TC−1対照)として定義する。
Lm−ActA−E7がE7を分泌することを示すWesternブロット。レーン1:Lm−LLO−E7、レーン2:Lm−ActA−E7.001、レーン3:Lm−ActA−E7−2.5.3、レーン4:Lm−ActA−E7−2.5.4。
Lm−ActA−E7(四角)、Lm−E7(楕円)、Lm−LLO−E7(X)を投与したマウス、および未処理のマウス(ワクチン接種を受けていない、無地三角)の腫瘍の大きさ。
4LMワクチン作出するために使用されたプラスミド挿入物の略図。Lm−LLO−E7挿入物は、使用されたリステリア遺伝子のすべてを含有する。これは、hlyプロモータ、hly遺伝子の最初の1.3kb(タンパク質LLOをコード化する)、およびHPV−16 E7遺伝子を含有する。hlyの最初の1.3kbは、シグナル配列(ss)およびPEST領域を含む。Lm−PEST−E7は、hlyプロモータ、シグナル配列、ならびにPESTおよびE7配列を含むが、切断LLO遺伝子の残りは含まない。Lm−ΔPEST−E7は、PEST領域を含まないが、hlyプロモータ、シグナル配列、E7、および切断LLOの残りを含有する。Lm−E7epiは、hlyプロモータ、シグナル配列、およびE7のみを有する。
上部パネル:PEST領域を含有するリステリアコンストラクトは、腫瘍退縮を誘導する。下部パネル:2つの別個の実験における、腫瘍チャレンジ後28日目の腫瘍の大きさの平均。
PEST領域を含有するリステリアコンストラクトは、脾臓内においてより高い割合のE7特異的リンパ球を誘導する。3つの実験からのデータの平均および標準誤差を示す。
TC−1腫瘍細胞を投与し、その後Lm−E7、Lm−LLO−E7、Lm−ActA−E7を投与された、またはワクチン接種無し(未処置)のマウスにおける、脾臓内におけるE7特異的IFNガンマ分泌CD8+T細胞の誘導、ならびに腫瘍に浸入した数。
(A)に記載のマウスの脾臓および腫瘍における、E7特異的CD8+細胞の誘導および浸入。
PEST領域を含有するリステリアコンストラクトは、腫瘍内において、より高い割合のE7特異的リンパ球を誘導する。A.1つの実験からの代表的なデータ。B.3つすべての実験からのデータの平均および標準誤差。
E6/E7トランスジェニックマウスは、甲状腺において腫瘍を発達させ、ここでは、E7遺伝子が発現される。マウスを3ヶ月目に屠殺し、甲状腺を取り出し、薄片とし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。A.左パネル倍率20×での正常な甲状腺。卵胞は正常な大きさであり、豊富ピンク色の細胞質(矢印)を有する立方細胞で覆われている。右パネル:E6/E7トランスジェニックマウス甲状腺。コロイドの産生の増加により、大きく拡大した卵胞に留意されたい。卵胞を覆う立方細胞は、微小の細胞質により小さい。
E7メッセージは、E6/E7トランスジェニックマウスの甲状腺および髄質胸腺上皮細胞で発現する。(A)E7導入遺伝子組織特異的発現は、甲状腺のみで検出されるが、肝臓、脾臓、または全胸腺では検出されない。レーン1:肝臓、レーン2:脾臓、レーン3:甲状腺、レーン4:全胸腺。(B)髄質胸腺上皮細胞(mTECs)はE7を発現する。40サイクル負荷した同等量のcDNAに関するRTPCR結果を示す。レーン5:カテプシンS、レーン6:E7、レーン7:アクチン、レーン8:陰性対照
AHYNIVTFペプチドおよびCpGアジュバントは、E6/E7トランスジェニックマウスにおけるTC−1チャレンジに対して保護しない。2つの群のトランスジェニックマウスが、E7ペプチドおよびアジュバント、またはPBSのいずれかを受けた。第3の群の野生型C57Bl/6対照マウスは、E7ペプチドおよびアジュバントを受けた。マウスに7日あけて2回、腹腔内(i.p.)にワクチン接種し、TC−1細胞数5×104で7日後にチャレンジした。免疫化されていないマウスを屠殺する必要性があるまで、腫瘍を5日毎に測定した。エラーバー平均値からの標準偏差
本発明のワクチンは、野生型マウス、ならびにLM−LLO−E7で免疫化したトランスジェニックマウス、未処理のままのマウス、またはLM−NPで処置したマウス(対照)のうち、E6/E7トランスジェニックマウスにおいて固形腫瘍の退縮を誘導する。
本発明のワクチンは、野生型マウス、ならびにLM−ActA−E7で免疫化したトランスジェニックマウス、未処理のままのマウス、またはLM−NPで処置したマウス(対照)のうち、E6/E7トランスジェニックマウスにおいて固形腫瘍の退縮を誘導する。
LM−LLO−E7のIV免疫化は、マウス1匹あたり1×106のCFUと低い用量で、確立された腫瘍の退縮を誘導する上で有効である。
LM−LLO−E7臨床試験における2つのコホートに対する腫瘍負荷
組み換えリステリアワクチンベクターの細菌負荷(病原性)における継代の効果。上部パネル:Lm−Gag、下部パネル:Lm−LLO−E7。
脾臓内の組み換えLm−E7の細菌負荷における継代の効果。4匹のマウスからの脾臓ホモジネートミリリットルあたりの生細菌の平均CFUを示す。
継代されたLm−Gag対継代されていないLm−Gagの投与後の、HIV−GagおよびLLOに対する抗原特異的CD8+T細胞の誘導。マウスを、103(A、B、E、F)または105(C、D、G、H)CFUの継代されたリステリアワクチンベクターで免疫化し、抗原特異的T細胞を分析した。B、D、F、H:継代されていないリステリアワクチンベクター。A〜D:MHCクラスI HIV−Gagペプチドへの免疫応答。E〜H:LLOペプチドへの免疫応答。I:HPV E7からの対照ペプチド刺激した105のCFUの継代されたLm−Gagで免疫化されたマウスからの脾細胞。
LB安定性試験によるプラスミド単離。
TB安定性試験によるプラスミド単離。
TB安定性試験による定量化
LB内で増殖された細菌からの、存続能力のある細菌のクロラムフェニコールCAP耐性、およびCAP感受性コロニー形成単位(CFU)の数。暗色バー:CAP+、白色バー:CAP−。各時点に対する2つの暗色バーおよび2つの白色バーは、2通りの試料を表す。
TB内で増殖された細菌からの、存続能力のある細菌のCAP耐性、およびCAP感受性CFUの数。暗色バー:CAP+、白色バー:CAP−。各時点に対する2つの暗色バーおよび2つの白色バーは、2通りの試料を表す。
短期凍結保存後のL.モノサイトゲネスの増殖。
−70℃での保管後のLB RWCBの生存能力
−70℃での保管後のTB RWCBの生存能力。
Lm−LLO−E7の200mLのLBおよびTB培養物成長曲線
50mL段階で、AA、ビタミンおよび微量元素を含む、および含まない4つの規定培地におけるLm−LLO−E7の増殖。「AA+Vits+TE+」は、バル培地、必須成分、AA、ビタミンおよび微量元素を意味する。「AA+Vits+TE−」は、バルク培地、必須成分、AA、およびビタミンを意味する。「AA+Vits−TE−」は、バルク培地、必須成分、およびAAを意味する。「AA−Vits−TE−」は、バルク培地および必須成分を意味する。
200mL段階で、アミノ酸、ビタミンおよび微量元素を含む、および含まない4つの規定培地におけるLm−LLO−E7の増殖。群は、図23のように標識する。
無機窒素を含む、および含まない、異なる濃度の栄養補助剤を含む200mLの培養物の規定培地におけるLm−LLO−E7の増殖。
グルタミンおよび鉄を含む、ならびに含まない、異なる濃度の栄養補助剤で補助された200mLの培養物の規定培地におけるLm−LLO−E7の増殖。
TBおよび規定培地の5L発酵槽におけるLm−LLO−E7の成長曲線。
異なる密度のTBの5L発酵槽で増殖されたLm−LLO−E7の生存能力。
異なる密度の規定培地の5L発酵槽で増殖されたLm−LLO−E7の生存能力。
−20℃で3日間保管した後に残存する存続能力のある細胞の割合(%)。
−70℃で3日間保管した後に残存する存続能力のある細胞の割合(%)。
液体窒素での急速冷凍、および−70℃での3日間の保管後に残存する存続能力のある細胞の割合(%)。
いくつかの条件に対する生存能力研究の要約。
解凍後凍結保存された試料の成長動力学
規定培地で増殖されたリステリアワクチンベクターは、確立された腫瘍の増殖に対してマウスを効果的に保護する。「BHI培養」−ブレインハートインフュージョン培地で培養されたベクター。「テリフィックブロス培養」および「規定培地培養」−示される培地で培養されたベクター。

実施例

0013

本発明は、子宮頸癌を治療、子宮頸癌から保護、子宮頸癌に対する免疫応答を誘導する方法を提供し、対象に、リスリオリシンO(LLO)フラグメントおよびE7抗原を含む融合ペプチドを含む組み換えリステリア株を投与するステップを含む。本発明はまた、ヒト対象において抗E7CTL応答を誘導し、組み換えリステリア株の投与を含む、HPV介在性疾患、疾病、および症状を治療するための方法も提供する。

0014

一実施形態において、本発明は、ヒト対象において、子宮頸癌を治療、阻害、抑制、または予防する方法を提供し、該対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、該組み換えリステリア株は、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、組み換えリステリア株は、E7抗原に対する免疫応答を誘導し、これによって、ヒト対象における子宮頸癌を治療する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、E7抗原を含む免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がE7抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0015

N末端LLOタンパク質フラグメントおよびHPVE7抗原は、別の実施形態において、互いに直接融合される。別の実施形態において、N末端LLOタンパク質フラグメントおよびHPV E7抗原をコード化する遺伝子は、互いに直接融合される。別の実施形態において、N末端LLOタンパク質フラグメントおよびHPV E7抗原は、リンカーペプチドを介して結合される。別の実施形態において、N末端LLOタンパク質フラグメントおよびHPV E7抗原は、異種ペプチドを介して結合される。別の実施形態において、N末端LLOタンパク質フラグメントは、HPV E7抗原に対してN末端側にある。別の実施形態において、N末端LLOタンパク質フラグメントは、融合タンパク質のN末端の大部分である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0016

別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、該組み換えリステリア株は、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、E7抗原を含む免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がE7抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0017

別の実施形態において、ヒト対象において抗E7細胞傷害性T細胞応答を誘導するための方法を本明細書において提供し、該対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において抗E7細胞傷害性T細胞応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、E7抗原を含む免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がE7抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0018

LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPVE7抗原は、別の実施形態において、互いに直接融合される。別の実施形態において、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPV E7抗原をコード化する遺伝子は、互いに直接融合される。別の実施形態において、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPV E7抗原は、リンカーペプチドを介して結合される。別の実施形態において、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPV E7抗原は、異種ペプチドを介して結合される。別の実施形態において、LLOタンパク質のN末端フラグメントは、HPV E7抗原に対してN末端側にある。別の実施形態において、LLOタンパク質のN末端フラグメントは、融合タンパク質のN末端の大部分である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0019

本明細書に提供する、LLO−抗原融合を発現する組み換えリステリア株は、抗腫瘍免疫を誘導し(実施例1)、抗原特異的T細胞増殖を惹起し(実施例2)、抗原特異的な腫瘍浸潤T細胞を生成し(実施例4)、E6およびE7等の抗原に対する中枢寛容および末梢寛容を解除する(実施例5〜9)。したがって、本発明のワクチンは、E7およびE6に対する免疫応答の誘導に有効である。さらに、組み換えリステリア株は安全であり、ヒト対象における疾患指標を改善する(実施例10)。

0020

別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌を治療、阻害、抑制、または予防する方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ActAタンパク質のN末端フラグメントおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、組み換えリステリア株は、E7抗原に対する免疫応答を誘導し、これによって、ヒト対象において子宮頸癌を治療する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0021

別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において、子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ActAタンパク質のN末端フラグメントおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0022

別の実施形態において、ヒト対象において抗E7細胞傷害性T細胞応答を誘導するための方法を本明細書に提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ActAタンパク質のN末端フラグメントおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において抗E7細胞傷害性T細胞応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、E7抗原を含む免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がE7抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0023

N末端ActAタンパク質フラグメントおよびHPVE7抗原は、別の実施形態において、互いに直接融合される。別の実施形態において、N末端ActAタンパク質フラグメントおよびHPV E7抗原をコード化する遺伝子は、互いに直接融合される。別の実施形態において、N末端ActAタンパク質フラグメントおよびHPV E7抗原は、リンカーペプチドを介して結合される。別の実施形態において、N末端ActAタンパク質フラグメントおよびHPV E7抗原は、異種ペプチドを介して結合される。別の実施形態において、N末端ActAタンパク質フラグメントは、HPV E7抗原に対してN末端側にある。別の実施形態において、N末端ActAタンパク質フラグメントは、融合タンパク質のN末端の大部分である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0024

本明細書で提供する、ActA抗原融合を発現する組み換えリステリア株は、抗腫瘍免疫を誘導し(実施例3)、抗原特異的な腫瘍浸潤T細胞を生成し(実施例4)、E6およびE7等の抗原に対する中枢寛容および末梢寛容を解除する(実施例5〜9)。さらに、本発明の組み換えリステリア株は安全であり、ヒト対象における疾患指標を改善する(実施例10)。

0025

別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌を治療、阻害、抑制、または予防する方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、PEST様配列含有ペプチドおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、組み換えリステリア株は、E7抗原に対する免疫応答を誘導し、これによって、ヒト対象において子宮頸癌を治療する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、E7抗原を含む免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がE7抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物で、ヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0026

別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、PEST様配列含有ペプチドおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0027

別の実施形態において、ヒト対象において抗E7細胞傷害性T細胞応答を誘導するための方法を本明細書において提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、PEST様配列含有ペプチドおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において抗E7細胞傷害性T細胞応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、E7抗原を含む免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がE7抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物で、ヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0028

PEST配列およびHPVE7抗原は、別の実施形態において、互いに直接融合される。別の実施形態において、PEST配列およびHPV E7抗原をコード化する遺伝子は、互いに直接融合される。別の実施形態において、PEST配列およびHPV E7抗原は、リンカーペプチドを介して結合される。別の実施形態において、PEST配列およびHPV E7抗原は、異種ペプチドを介して結合される。別の実施形態において、PEST配列は、HPV E7抗原に対してN末端側にある。別の実施形態において、PEST配列は、融合タンパク質のN末端の大部分である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0029

本明細書で提供する、PEST様配列抗原融合を発現する組み換えリステリア株は、抗腫瘍免疫(実施例3)を誘導し、抗原特異的な腫瘍浸潤T細胞を生成する(実施例4)。さらに、本発明の組み換えリステリア株は、安全であり、ヒト対象における疾患指標を改善する(実施例10)。

0030

別の実施形態において、ヒト対象において抗E7細胞傷害性T細胞応答を誘導するための方法を本明細書に提供し、該対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含む。別の実施形態において、該組み換えリステリア株は、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む。別の実施形態において、該第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択され、これによって、ヒト対象において抗E7細胞傷害性T細胞応答を誘導する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0031

本発明は、子宮頸癌の治療、および子宮頸癌からの保護に関して使用するための、組み換えリステリア株を提供し、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含み、該第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択される。本発明はまた、ヒト対象において抗E7CTL応答を誘導するための方法、およびHPV介在性疾患、疾病、および症状を治療するための方法における、組み換えリステリア株の使用を提供する。

0032

一実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌を治療するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む組み換えリステリア株の使用を本明細書で提供し、該第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択され、これによって、該組み換えリステリア株は、該E7抗原に対する免疫応答を誘導し、該組み換えリステリア株は、1×109〜3.31×109の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。

0033

一実施形態において、子宮頸癌からヒト対象を保護するための組成物を調製するための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む組み換えリステリア株の使用を本明細書で提供し、該第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択され、これによって、該組み換えリステリア株は、該E7抗原に対する免疫応答を誘導し、該組み換えリステリア株は、1×109〜3.31×109の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。

0034

別の実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための組成物を調製するための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用を本明細書で提供し、該第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、およびPEST様配列含有ペプチドから選択され、該組み換えリステリア株は、1×109〜3.31×1010の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。

0035

別の実施形態において、ヒト対象において抗E7細胞傷害性T細胞応答を誘導するための組成物を調製するための、ヒトパピローマウイルス(HPV)E7抗原に融合された第1のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用を本明細書で提供し、該第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択され、該組み換えリステリア株は、1×109〜3.31×1010の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。

0036

別の実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌を治療する方法を本明細書で提供し、対象に、弱毒化した栄養要求性リステリア株を投与するステップをふくむ。別の実施形態において、子宮頸癌からヒト対象を保護する方法を本明細書で提供し、対象に、弱毒化した栄養要求性リステリア株を投与するステップを含む。別の実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための方法を本明細書で提供し、対象に、弱毒化した栄養要求性リステリア株を投与するステップを含む。別の実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌を治療、阻害、予防、もしくは抑制する、またはヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導する方法を本明細書で提供し、対象に、弱毒化した栄養要求性リステリア・モノサイトゲネス株を投与するステップを含む。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、dal遺伝子に変異を含む。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、dat遺伝子に変異を含む。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、dalおよびdat遺伝子に変異を含む。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリアは、プレフェン酸デヒドラターゼに変異を含む。別の実施形態において、酵素プレフェン酸デヒドラターゼは、フェニルアラニン生合成経路において、後期に作用する酵素である。別の実施形態において、組み換えリステリアは、増殖のために、外因性フェニルアラニンを必要とする。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、増殖のために、外因性アラニンを必要とする。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、増殖のために、外因性Dアラニンを必要とする。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、増殖のために、外因性トレオニンを必要とする。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株リステリア株は、組み換えポリペプチドを含む。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、抗原を含む。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、PEST様配列含有ペプチドおよびHPVE7抗原を含む。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、E7抗原に対する免疫応答を誘導する。別の実施形態において、E7抗原に対して誘導された免疫応答は、ヒト対象において子宮頸癌を治療する。

0037

別の実施形態において、本発明は、HPVに対してヒト対象にワクチン接種するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPV E7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、HPVに対してヒト対象にワクチン接種する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0038

別の実施形態において、本発明は、HPVに対してヒト対象にワクチン接種するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ActAタンパク質のN末端フラグメントおよびHPV E7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、HPVに対してヒト対象にワクチン接種する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0039

別の実施形態において、本発明は、HPVに対してヒト対象にワクチン接種するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、PEST様配列含有ペプチドおよびHPV E7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、HPVに対してヒト対象にワクチン接種する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0040

本明細書に提供する、抗原の、LLO、ActA、またはPEST様配列含有ペプチドへの融合を発現する組み換えリステリア株は、抗E6およびE7免疫を誘導し(実施例3)、E6およびE7等の抗原に対する中枢寛容および末梢寛容を抑止する(実施例5〜9)。さらに、本発明の組み換えリステリア株は安全であり、ヒト対象における疾患指標を改善する(実施例10)。したがって、本発明のリステリア株は、HPVに対して対象にワクチン接種するために使用することができ、これによって、HPV介在性発癌を予防または阻害する。

0041

別の実施形態において、対象は、HPV介在性癌を発症するリスクがあり、一実施形態において、これは子宮頸癌である。一実施形態において、ヒトパピローマウイルスDNAは、90%以上の子宮頸癌の病変で検出され得る。別の実施形態において、対象は、HPV介在性癌を発症するリスクがあり、一実施形態において、これは非子宮頸部の肛門性器管癌であり、一実施形態において、これは肛門、外陰部、または内腫瘍である。一実施形態において、HPV介在性癌は、陰茎上皮内腫瘍であり、一実施形態において、子宮頸部上皮内腫瘍を有する女性の性交渉の相手に高い罹患率で見られる。一実施形態において、HPV介在性癌は、非子宮頸部の肛門性器上皮の癌である。別の実施形態において、対象は、HPV陽性である。別の実施形態において、対象の性交渉の相手は、HPV陽性である。別の実施形態において、対象は、子宮頸部上皮内腫瘍を呈する。別の実施形態において、対象は、扁平上皮内病変を呈する。別の実施形態において、対象は、子宮頸部に異形成を呈する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0042

本発明の方法の標的であるHPVは、別の実施形態において、HPV 16である。別の実施形態において、HPVはHPV−18である。別の実施形態において、HPVは、HPV−16およびHPV−18から選択される。別の実施形態において、HPVはHPV−31である。別の実施形態において、HPVはHPV−35である。別の実施形態において、HPVはHPV−39である。別の実施形態において、HPVはHPV−45である。別の実施形態において、HPVはHPV−51である。別の実施形態において、HPVはHPV−52である。別の実施形態において、HPVはHPV−58である。別の実施形態において、HPVは高リスクHPV型である。別の実施形態において、HPVは粘膜HPV型である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0043

別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌の退縮を誘導するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸癌の退縮を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0044

別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌の再発を低減するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸癌の再発の発生を低減する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0045

別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸部腫瘍の形成を抑制するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸部腫瘍の形成を抑制する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0046

別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌の寛解を誘導するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸癌の寛解を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0047

別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸部腫瘍の増殖を妨害するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸部腫瘍の増殖を妨害する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0048

別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸部腫瘍の大きさを低減するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸部腫瘍の大きさを低減する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0049

本発明の方法によって標的とされる子宮頸部腫瘍は、別の実施形態において、扁平上皮癌である。

0050

別の実施形態において、本発明の方法は、子宮頸部の進行性扁平上皮細胞癌を予防、治療、阻害、または抑制するために使用することができる。別の実施形態において、本発明の方法は、再発性の子宮頸部の扁平上皮細胞癌を予防、治療、阻害、または抑制するために使用することができる。別の実施形態において、本発明の方法は、進行した子宮頸部の扁平上皮細胞癌を予防、治療、阻害、または抑制するために使用することができる。別の実施形態において、本発明の方法は、当該技術分野で既知の、任意の他の形態または種類の子宮頸癌を予防、治療、阻害、または抑制するために使用することができる。

0051

別の実施形態において、子宮頸部腫瘍は、腺癌である。別の実施形態において、子宮頸部腫瘍は、腺扁平上皮癌である。別の実施形態において、子宮頸部腫瘍は、小細胞癌である。別の実施形態において、子宮頸部腫瘍は、当該技術分野で既知の任意の他の種類の子宮頸部腫瘍である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0052

別の実施形態において、子宮頸癌に対する免疫応答を治療、保護、または誘導するための本発明の方法では、E7抗原の代わりに、またはE7抗原に加えて、HPVE6抗原を用いる。

0053

別の実施形態において、子宮頸癌に対する免疫応答を治療、保護、または誘導するための本発明の方法では、LLOフラグメントの代わりに、またはLLOフラグメントに加えて、ActAタンパク質フラグメントを用いる。

0054

別の実施形態において、子宮頸癌に対する免疫応答を治療、保護、または誘導するための本発明の方法では、LLOフラグメントの代わりに、またはLLOフラグメントに加えて、PEST様配列含有タンパク質フラグメントを用いる。

0055

別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において抗E7細胞傷害性T細胞(CTL)応答を誘導するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPVE7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において抗E7CTL応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株で対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、E7抗原を含む免疫原性組成物で対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がE7抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物で、対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、CTL応答は、HPV介在性疾患、疾病、もしくは症状に対する、治療上の有効性がある。別の実施形態において、CTL応答は、HPV介在性疾患、疾病、もしくは症状に対する、予防上の有効性がある。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0056

別の実施形態において、本発明は、対象において、HPV介在性疾患、疾病、もしくは症状を治療、または寛解する方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、LLOタンパク質のN末端フラグメントおよびHPV E7抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、組み換えリステリア株は、E7抗原に対する免疫応答を誘導し、これによって、対象においてHPV介在性疾患、疾病、もしくは症状を治療または寛解する。別の実施形態において、対象はヒト対象である。別の実施形態において、対象は、当該技術分野で既知の、任意の他の種類の対象である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0057

疾患、疾病、もしくは症状を生じるHPVは、別の実施形態において、HPV 16である。別の実施形態において、HPVはHPV−18である。別の実施形態において、HPVはHPV−31である。別の実施形態において、HPVはHPV−35である。別の実施形態において、HPVはHPV−39である。別の実施形態において、HPVはHPV−45である。別の実施形態において、HPVはHPV−51である。別の実施形態において、HPVはHPV−52である。別の実施形態において、HPVはHPV−58である。別の実施形態において、HPVは高リスクHPV型である。別の実施形態において、HPVは粘膜HPV型である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0058

別の実施形態において、HPV介在性疾患、疾病、もしくは症状は、性器疣贅である。別の実施形態において、HPV介在性疾患、疾病、もしくは症状は、性器疣贅ではないものである。別の実施形態において、HPV介在性疾患、疾病、もしくは症状は、呼吸器乳頭腫である。別の実施形態において、HPV介在性疾患、疾病、もしくは症状は、当該技術分野で既知の、任意の他のHPV介在性疾患、疾病、もしくは症状である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0059

別の実施形態において、HPV介在性疾患、疾病、もしくは症状を治療または寛解するための本発明の方法では、E7抗原の代わりに、またはE7抗原に加えて、HPV E6抗原を用いる。

0060

別の実施形態において、HPV介在性疾患、疾病、もしくは症状を治療または寛解するための本発明の方法では、LLOフラグメントの代わりに、またはLLOフラグメントに加えて、ActAタンパク質フラグメントを用いる。

0061

別の実施形態において、HPV介在性疾患、疾病、もしくは症状を治療または寛解するための本発明の方法では、LLOフラグメントの代わりに、またはLLOフラグメントに加えて、PEST様配列含有タンパク質フラグメントを用いる。

0062

別の実施形態において、HPV介在性疾患、疾病、もしくは症状を治療または寛解するための本発明の方法では、E7抗原の代わりに、またはE7抗原に加えて、HPV E6抗原を用いる。

0063

本発明の方法および組成物の抗原は、別の実施形態において、HPVE7タンパク質である。別の実施形態において、抗原はHPV E6タンパク質である。別の実施形態において、抗原は当該技術分野で既知の任意の他のHPVタンパク質である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0064

「E7抗原」とは、別の実施形態において、E7タンパク質を指す。別の実施形態において、該用語は、E7フラグメントを指す。別の実施形態において、該用語は、E7ペプチドを指す。別の実施形態において、該用語は、当該技術分野で既知の、任意の他の種類のE7抗原を指す。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0065

本発明の方法および組成物のE7タンパク質は、別の実施形態において、HPV16 E7タンパク質である。別の実施形態において、E7タンパク質はHPV−18 E7タンパク質である。別の実施形態において、E7タンパク質はHPV−31 E7タンパク質である。別の実施形態において、E7タンパク質はHPV−35 E7タンパク質である。別の実施形態において、E7タンパク質はHPV−39 E7タンパク質である。別の実施形態において、E7タンパク質はHPV−45 E7タンパク質である。別の実施形態において、E7タンパク質はHPV−51 E7タンパク質である。別の実施形態において、E7タンパク質はHPV−52 E7タンパク質である。別の実施形態において、E7タンパク質はHPV−58 E7タンパク質である。別の実施形態において、E7タンパク質は、高リスクHPV型のE7タンパク質である。別の実施形態において、E7タンパク質は粘膜HPV型のE7タンパク質である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0066

「E6抗原」とは、別の実施形態において、E6タンパク質を指す。別の実施形態において、該用語は、E6フラグメントを指す。別の実施形態において、該用語は、E6ペプチドを指す。別の実施形態において、該用語は、当該技術分野で既知の、任意の他の種類のE6抗原を指す。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0067

本発明の方法および組成物のE6タンパク質は、別の実施形態において、HPV16 E6タンパク質である。別の実施形態において、E6タンパク質はHPV−18 E6タンパク質である。別の実施形態において、E6タンパク質はHPV−31 E6タンパク質である。別の実施形態において、E6タンパク質はHPV−35 E6タンパク質である。別の実施形態において、E6タンパク質はHPV−39 E6タンパク質である。別の実施形態において、E6タンパク質はHPV−45 E6タンパク質である。別の実施形態において、E6タンパク質はHPV−51 E6タンパク質である。別の実施形態において、E6タンパク質はHPV−52 E6タンパク質である。別の実施形態において、E6タンパク質はHPV−58 E6タンパク質である。別の実施形態において、E6タンパク質は、高リスクHPV型のE6タンパク質である。別の実施形態において、E6タンパク質は、粘膜HPV型のE6タンパク質である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0068

別の実施形態において、本発明は、関心対象となる抗原に対してヒト対象にワクチン接種する方法を提供し、該方法は、ヒト対象に、関心対象となる抗原を含む、または発現する組み換えリステリア株を静脈内投与するステップを含み、第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択され、これによって、関心対象となる抗原に対してヒト対象にワクチン接種する。

0069

別の実施形態において、本発明は、関心対象となる抗原に対してヒト対象にワクチン接種する方法を提供し、該方法は、ヒト対象に、第1のペプチドの関心対象となる抗原への融合を含む、免疫原性組成物を静脈内投与するステップを含み、第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、および(c)PEST様配列含有ペプチドから選択され、これによって、関心対象となる抗原に対してヒト対象にワクチン接種する。

0070

別の実施形態において、本発明は、関心対象となる抗原に対してヒト対象にワクチン接種する方法を提供し、該方法は、ヒト対象に、組み換えポリペプチドを含む組み換えリステリア株を静脈内投与するステップを含み、組み換えポリペプチドは、関心対象となる抗原に融合された第1のペプチドを含み、第1のペプチドは、(a)LLOタンパク質のN末端フラグメント、(b)ActAタンパク質、もしくはそのN末端フラグメント、(c)PEST様配列含有ペプチドから選択され、これによって、関心対象となる抗原に対してヒト対象にワクチン接種する。

0071

一実施形態において、本発明の方法で使用するための組成物は、静脈内投与される。別の実施形態において、ワクチンは経口投与されるが、別の実施形態において、ワクチンは非経口投与される(例えば、皮下投与筋肉内投与等)。

0072

さらに、別の実施形態において、組成物またはワクチンは、例えば、直腸坐薬または尿道坐薬といった坐薬として投与される。さらに、別の実施形態において、医薬組成物は、ペレットの皮下移植によって投与される。さらなる実施形態において、ペレットは、一定期間にわたる薬剤制御放出を提供する。さらに別の実施形態において、医薬組成物は、カプセル形態で投与される。

0073

一実施形態において、投与経路は、非経口であり得る。別の実施形態において、経路は、眼内、結膜局所経皮、皮内、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、膣内、直腸、腫瘍内、傍癌(parcanceral)、経粘膜、筋肉内、血管内、心室内、頭蓋内、吸入エアロゾル)、吸引スプレー)、鼻腔内(滴下)、下、経口、エアロゾル、もしくは坐薬、またはこれらの組み合わせであり得る。吸入による鼻腔内投与または適用に関しては、該化合物溶液または懸濁液を、適切な担体の存在下で、混合、およびエアロゾル化または噴霧する。かかるエアロゾルは、本明細書に記載のいかなる薬剤をも含み得る。一実施形態において、本明細書に記載される組成物は、頭蓋内投与に好適な形態であり得、これは、一実施形態において、髄腔内および脳室内投与である。一実施形態において、投与レジメンは、治療する状態の正確な特性、状態の重篤性、患者年齢および健康状態全般、体重、ならびに個々の患者の反応等の要因に基づき、熟練した臨床医によって決定されるであろう。

0074

非経口適用に関しては、注射用滅菌溶液、好ましくは、油性溶液または水溶液、ならびに懸濁液、エマルション、またはインプラント(坐薬およびかん腸を含む)が特に好適である。アンプルは、好都合な単位用量である。かかる坐薬は、本明細書に記載のいかなる薬剤をも含み得る。

0075

例えば、リポソーム、または活性化合物が、例えば、マイクロカプセル化多層コーティング等によって、分解性が異なるコーティングによって保護されるものといった、持続放出または指向性放出組成物を製剤化することができる。かかる組成物は、即時放出または緩徐放出のために製剤化され得る。例えば、注射のための生成物を調製するために、新規化合物をフリーズドライし、得られた凍結乾燥物を使用することもまた可能である。

0076

液体製剤に関しては、薬学的に許容可能な担体は、水溶液もしくは非水溶液、懸濁液、エマルションまたは油であり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコールポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチル等の注射用有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール溶液/水溶液、エマルション、または生理食塩水および緩衝媒質を含む懸濁液が挙げられる。油の例は、石油動物油植物油、または合成起源の油であり、例えば、ピーナッツ油大豆油鉱油オリーブ油ヒマワリ油、および魚肝油である。

0077

一実施形態において、本発明の組成物は、薬学的に許容可能なものである。一実施形態において、「薬学的に許容可能な」という用語は、安全であり、かつ本発明において使用するための、有効量の少なくとも1つの化合物の所望の投与経路に適切な送達を提供するいかなる製剤をも指す。該用語は、緩衝製剤の使用も指し、ここで、pHは、化合物の安定性および投与経路に従い、pH4.0からpH9.0の範囲の特定の所望の値に維持される。

0078

一実施形態において、本発明の組成物または本発明の方法で使用される組成物は、単独で、またはある組成物とともに投与することができる。別の実施形態において、従来の賦形剤、すなわち、活性化合物と有害に反応しない、非経口、腸内(例えば、経口)、または局所適用に好適な薬学的に許容可能な有機または無機担体物質と混合した本発明の組成物を使用することができる。一実施形態において、好適な薬学的に許容可能な担体としては、水、食塩水アルコールアラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン炭水化物ラクトースアミロースまたはデンプン等)、ステアリン酸マグネシウムタルクケイ酸粘性パラフィン、白色パラフィン、グリセロールアルギン酸ヒアルロン酸コラーゲン香油脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリドペンタエリトリトール脂肪酸エステルヒドロキシメチルセルロースポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、医薬調製物滅菌することができ、所望に応じて、活性化合物と有害に反応しない、助剤(例えば、滑剤防腐剤、安定剤、湿潤剤乳化剤浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤着色物質香味物質および/または芳香物質等)と混合することができる。別の実施形態において、これらは、所望の場合、例えば、ビタミンといった他の活性薬剤と組み合わせることもできる。

0079

一実施形態において、本発明の方法で使用するための組成物は、担体/希釈剤とともに投与することができる。固体担体/希釈剤としては、ゴム、デンプン(例えば、トウモロコシデンプンアルファ化デンプン)、糖(例えば、ラクトース、マンニトールスクロースデキストロース)、セルロース系材料(例えば、微結晶性セルロース)、アクリレート(例えば、ポリメチルアクリレート)、炭酸カルシウム酸化マグネシウム、タルク、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

0080

一実施形態において、本発明の組成物は、本発明の組成物、および子宮頸癌の予防または治療に効果的な1つまたは複数の追加の化合物を含み得る。一部の実施形態において、追加の化合物は、化学療法に有用な化合物を含み得、これは、一実施形態において、シスプラチンである。別の実施形態において、イホスファミドフルオロウラシルもしくは5−FU、イリノテカンパクリタキセルタキソール)、ドセタキセルゲムシタビントポテカン、またはこれらの組み合わせを、本発明の方法で使用するために、本発明の組成物とともに投与することができる。別の実施形態において、アムサクリンブレオマイシンブスルファンカペシタビンカルボプラチンカルムスチンクロラムブシル、シスプラチン、クラドリビンクロファラビンクリサンスペースシクロホスファミドシタラビンダカルバジンダクチノマイシンダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシンエピルビシンエトポシドフルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、Gliadelインプラント、ヒドロキシカルバミドイダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリンリポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチンメルファランメルカプトプリンメスナメトトレキサートマイトマイシンミトキサントロンオキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセドペントスタチンプロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチンストレプトゾシンテガフールウラシルテモゾロミド、テニポシド、チオテパチオグアニン、トポテカン、トレオスルファンビンブラスチンビンクリスチンビンデシンビノレルビン、またはこれらの組み合わせを、本発明の方法で使用するために、本発明の組成物とともに投与することができる。

0081

別の実施形態において、本発明は、関心対象となる抗原に対してヒト対象におけるCTL応答を誘導する方法を提供し、該方法は、ヒト対象に、関心対象となる抗原を含む、または発現する組み換えリステリア株を投与するステップを含み、これによって、関心対象となる抗原に対してヒト対象におけるCTL応答を誘導する。別の実施形態において、投与するステップは、静脈内投与である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0082

本明細書に提供される、LLO−抗原融合を発現する組み換えリステリア株は、抗腫瘍免疫を誘導し(実施例1)、抗原特異的T細胞増殖を惹起し(実施例2)、抗原特異的な腫瘍浸潤T細胞を生成し(実施例4)、E6およびE7等の抗原に対する末梢寛容を抑止する(実施例5〜9)。したがって、本発明のワクチンは、E7およびE6に対する免疫応答の誘導に有効である。さらに、組み換えリステリア株は安全であり、ヒト対象における疾患指標を改善する(実施例10)。

0083

別の実施形態において、関心対象となる抗原は、HPV−E7である。別の実施形態において、抗原はHPV−E6である。別の実施形態において、抗原はHer−2である。別の実施形態において、抗原はNY−ESO−1である。別の実施形態において、抗原はテロメラーゼである。別の実施形態において、抗原はSCCEである。別の実施形態において、抗原はHMW−MAAである。別の実施形態において、抗原はWT−1である。別の実施形態において、抗原はHIV−1 Gagである。別の実施形態において、抗原はプロテイナーゼ3である。別の実施形態において、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質2である。別の実施形態において、抗原はPSA(前立腺特異抗原)である。別の実施形態において、抗原は、E7、E6、Her−2、NY−ESO−1、テロメラーゼ、SCCE、HMW−MAA、WT−1、HIV−1 Gag、プロテイナーゼ3、チロシナーゼ関連タンパク質2、Muc1、PSA(前立腺特異抗原)、またはこれらの組み合わせから選択される。

0084

別の実施形態において、抗原は、腫瘍関連抗原であり、これは一実施形態において、以下の腫瘍抗原のうちの1つである:MAGE(メラノーマ関連抗原E)タンパク質(例えば、MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、チロシナーゼ)、変異rasタンパク質、変異p53タンパク質、p97メラノーマ抗原、進行した癌に関連するrasペプチドもしくはp53ペプチド、子宮頸癌に関連するHPV16/18抗原、乳癌に関連するKLH抗原、結腸直腸癌に関連するCEA癌胎児性抗原)、gp100、メラノーマに関連するMART1抗原、または前立腺癌に関連するPSA抗原。別の実施形態において、本発明の組成物および方法のための抗原は、メラノーマ関連抗原であり、これは、一実施形態において、TRP−2、MAGE−1、MAGE−3、gp−100、チロシナーゼ、HSP−70、ベータHCG、またはこれらの組み合わせである。

0085

別の実施形態において、抗原は、感染性疾患抗原である。

0086

他の実施形態において、抗原は、病原真菌、細菌、寄生虫蠕虫、またはウイルスから派生する。他の実施形態において、抗原は、破傷風トキソイドインフルエンザウイルスからの血球凝集素分子ジフテリアトキソイド、HIVgp120、HIV gagタンパク質、IgAプロテアーゼインスリンペプチドB、ジャガイモ粉状そう病菌抗原、ビブリオ抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、ヘモフィルスインフルエンザ外膜タンパク質、ヘリコバクターピロリ菌ウレアーゼ髄膜炎菌ピリン淋菌ピリン、HPV−16、−18、−31、−33、−35もしくは−45型ヒトパピローマウイルスからのヒトパピローマウイルス抗原E1およびE2、またはこれらの組み合わせから選択される。

0087

他の実施形態において、抗原は、以下の疾患のうちの1つに関連する。コレラジフテリアヘモフィルスA型肝炎B型肝炎インフルエンザ麻疹髄膜炎流行性耳下腺炎百日咳(pertussis)、天然痘肺炎球菌性肺炎ポリオ狂犬病風疹破傷風結核腸チフス水痘帯状疱疹、百日咳(whoopingcough)3黄色熱、アジソン病からの免疫原および抗原、アレルギーアナフィラキシー、ブルトン症候群固形および血液感染性腫瘍を含む癌、湿疹、橋本甲状腺、多発性筋炎皮膚筋炎1型糖尿病後天性免疫不全症候群腎臓心臓膵臓、骨、および肝臓移植等の移植片拒絶グレーブス疾患、多内分泌腺自己免疫疾患肝炎顕微鏡多発性動脈炎結節性多発動脈炎天疱瘡原発性胆汁性肝硬変悪性貧血セリアック病、抗体介在性腎炎糸球体腎炎リウマチ性疾患全身性エリテマトーデス関節リウマチ血清反応陰性脊椎関節炎鼻炎シェーグレン症候群全身性硬化症硬化性胆管炎ヴェーゲナー肉芽腫症疱疹状皮膚炎乾癬白斑多発性硬化症脳脊髄炎ギランバレー症候群重症筋無力症ランバート・イートン症候群、強膜上強膜ブドウ膜炎慢性粘膜皮膚カンジダ症、じん麻疹、乳児一過性低ガンマグロブリン血骨髄腫X連鎖IgM症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症自己免疫溶血性貧血自己免疫性血小板減少症自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症アミロイドーシス慢性リンパ球性白血病非ホジキンリンパ腫マラリアサーカムスポロザイト(malarial circumsporozite)タンパク質、微生物抗原ウイルス抗原自己抗原、ならびにリステリア症

0088

それぞれの抗原が、本発明の別個の実施形態を表す。

0089

本発明の方法および組成物によって誘導される免疫応答は、別の実施形態において、T細胞応答である。別の実施形態において、免疫応答は、T細胞応答を含む。別の実施形態において、応答はCD8+T細胞応答である。別の実施形態において、応答は、CD8+T細胞応答を含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0090

本発明の方法および組成物のN末端LLOタンパク質フラグメントは、別の実施形態において、配列番号1を含む。別の実施形態において、フラグメントは、LLOシグナルペプチドを含む。別の実施形態において、フラグメントは、配列番号25を含む。別の実施形態において、フラグメントは、およそ配列番号25からなる。別の実施形態において、フラグメントは、本質的に、配列番号25からなる。別の実施形態において、フラグメントは、配列番号25に対応する。別の実施形態において、フラグメントは、配列番号25に相同する。別の実施形態において、フラグメントは、配列番号25のフラグメントに相同する。実施例のうちのいくつかで使用されるΔLLOは、416アミノ酸長(シグナル配列を除く)であったが、システイン484を含有する活性化ドメインを含む、アミノ末端からの88残基は切断残基であった。活性化ドメインを含まない、特にシステイン484を含まないいかなるΔLLOも、本発明の方法および組成物に好適であることは、当業者には明らかとなるであろう。別の実施形態において、E7またはE6抗原のPEST様AA配列、配列番号1を含む、いかなるΔLLOへの融合も、抗原の細胞性および抗腫瘍免疫を高める。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0091

本発明のワクチンを構築するために用いられるLLOタンパク質は、別の実施形態において、以下の配列を有する。
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHAEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVSFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIGTTLYPKYSNKVDNPIE(ジェンバンクアクセッション番号P13128、配列番号27、核酸配列はジェンバンクアクセッション番号X15127に記載)。この配列に対応する、前駆タンパク質の最初の25アミノ酸は、シグナル配列であり、細菌によって分泌される際、LLOから開裂する。したがって、本実施形態において、全長活性LLOタンパク質は、504残基長である。別の実施形態において、上記のLLOフラグメントは、本発明のワクチンに組み込まれるLLOフラグメントの源として使用される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0092

別の実施形態において、本発明の組成物および方法で用いられるLLOタンパク質のN末端フラグメントは、以下の配列を有する。
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD(配列番号25)。

0093

別の実施形態において、LLOフラグメントは、本明細書で用いるLLOタンパク質の約アミノ酸20〜442に対応する。

0094

別の実施形態において、LLOフラグメントは、以下の配列を有する。
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD(配列番号26)。

0095

別の実施形態において、「切断LLO」または「ΔLLO」とは、PEST様ドメインを含むLLOのフラグメントを指す。別の実施形態において、該用語は、PEST配列を含むLLOフラグメントを指す。

0096

別の実施形態において、該用語は、アミノ末端に活性化ドメインを含まない、およびシステイン484を含まない、LLOフラグメントを指す。別の実施形態において、該用語は、溶血性ではないLLOフラグメントを指す。別の実施形態において、LLOフラグメントは、活性化ドメインの欠失または変異によって、非溶血性となる。別の実施形態において、LLOフラグメントは、システイン484の欠失または変異によって、非溶血性となる。別の実施形態において、LLOフラグメントは、別の場所での欠失または変異によって、非溶血性となる。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0097

別の実施形態において、LLOフラグメントは、およそLLOタンパク質の最初の441アミノ酸からなる。別の実施形態において、LLOフラグメントは、およそLLOの最初の420アミノ酸からなる。別の実施形態において、LLOフラグメントは、LLOタンパク質の非溶血性形態である。

0098

別の実施形態において、LLOフラグメントは、上記のアミノ酸範囲のうちの1つに対応する相同LLOタンパク質の残基を含む。残基番号は、別の実施形態において、上に列挙した残基番号に正確に対応する必要はなく、例えば、相同LLOタンパク質が本明細書で用いるLLOタンパク質に対して、挿入または欠失を有する場合、残基番号は、適宜調節され得る。

0099

別の実施形態において、LLOフラグメントは、当該技術分野で既知の任意の他のLLOフラグメントである。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0100

別の実施形態において、本発明は、対象においてHSV感染の発生を治療、抑制、阻害、または低減する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。一実施形態において、HSV感染はHSV−1感染である。一実施形態において、HSV感染はHSV−2感染である。一実施形態において、HSV感染は一次HSV感染である。一実施形態において、HSV感染は、一次HSV感染後の炎症、再発、または口唇HSVである。一実施形態において、HSV感染はHSV脳炎である。一実施形態において、HSV感染はHSV新生児感染である。一実施形態において、対象はHIVに感染している。

0101

別の実施形態において、本発明は、対象において一次HSV感染後の口唇HSVを阻害する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。

0102

別の実施形態において、本発明は、HSV感染の再発を予防する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、HSV感染の再発の重篤性を減退させる方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、HSV感染の再発の頻度を低減する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。一実施形態において、本発明は、HIVに感染した対象において、記載される方法のいずれかを提供する。

0103

「HSV−2」とは、別の実施形態において、単純ヘルペスウイルス2を指す。別の実施形態において、該用語はHSV−2 333株を指す。別の実施形態において、該用語は2.12株を指す。別の実施形態において、該用語はHG52株を指す。別の実施形態において、該用語はMS株を指す。別の実施形態において、該用語はG株を指す。別の実施形態において、該用語は186株を指す。別の実施形態において、該用語は当該技術分野で既知の任意の他のHSV−2株を指す。

0104

別の実施形態において、本発明は、HSV感染に対して、対象にワクチン接種する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、対象においてHSV感染を抑制する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、対象においてHSV感染を妨害する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、対象において一次HSV感染を妨害する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、対象においてニューロンHSVの拡大を妨害する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。

0105

一実施形態において、感染を妨害する(例えば、一実施形態においては、「HSV感染を妨害する」または「一次HSV感染を妨害する」)という用語は、感染性ウイルス力価を90%減少させることを指す。別の実施形態において、力価は50%減少する。別の実施形態において、力価は55%減少する。別の実施形態において、力価は60%減少する。別の実施形態において、力価は65%減少する。別の実施形態において、力価は70%減少する。別の実施形態において、力価は75%減少する。別の実施形態において、力価は80%減少する。別の実施形態において、力価は85%減少する。別の実施形態において、力価は92%減少する。別の実施形態において、力価は95%減少する。別の実施形態において、力価は96%減少する。別の実施形態において、力価は97%減少する。別の実施形態において、力価は98%減少する。別の実施形態において、力価は99%減少する。別の実施形態において、力価は99%以上減少する。

0106

別の実施形態において、該用語は、ウイルス複製の程度を90%減少させることを指す。別の実施形態において、複製は50%低減される。別の実施形態において、複製は55%低減される。別の実施形態において、複製は60%低減される。別の実施形態において、複製は65%低減される。別の実施形態において、複製は70%低減される。別の実施形態において、複製は75%低減される。別の実施形態において、複製は80%低減される。別の実施形態において、複製は85%低減される。別の実施形態において、複製は92%低減される。別の実施形態において、複製は95%低減される。別の実施形態において、複製は96%低減される。別の実施形態において、複製は97%低減される。別の実施形態において、複製は98%低減される。別の実施形態において、複製は99%低減される。別の実施形態において、複製は99%以上低減される。

0107

HSV複製およびHSV感染の程度を判定する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Lambiase Aら(Topical treatment with nerve growth factor in an animal model of herpetic keratitis. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2007 May 4)、Ramaswamy Mら(Interactions and management issues in HSV andHIVcoinfection. Expert Rev Anti Infect Ther. 2007 Apr;5(2):231-43)、およびJiang Cら(Mutations that decrease DNA binding of the processivity factor of the herpes simplex virus DNA polymerase reduce viral yield, alter the kinetics of viral DNA replication, and decrease the fidelity of DNA replication. J Virol. 2007 Apr;81(7):3495-502)に説明される。それぞれの方法が、本発明の個別の実施形態を表す。

0108

別の実施形態において、本発明は、対象において単純ヘルペスウイルス(HSV)感染を治療する、その病原を低減する、その症状を寛解する、その二次症状を寛解する、その発生を低減する、その再発までの潜伏期延長する方法を提供し、対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。本発明の方法および組成物によって治療または寛解するHSV感染は、別の実施形態において、性器のHSV感染である。

0109

本発明の方法を使用して、HSV感染、または対象がHSVに曝露した後のかかる感染に関連する一次もしくは二次症状の治療、阻害、抑制等を行えることを理解されたい。別の実施形態において、対象は、ワクチン接種前に、HSVに感染している。別の実施形態において、対象は、HSV感染のリスクがある。別の実施形態において、対象が、ワクチン接種時に、HSVに感染しているかどうかに関わらず、本発明の方法によるワクチン接種は、HSV感染、またはかかる感染に関連する一次もしくは二次症状の治療、阻害、抑制等に有効である。

0110

一実施形態において、症状は一次症状であるが、別の実施形態において、症状は二次症状である。一実施形態において、「一次」とは、対象のウイルス感染の直接的な結果である症状を指す一方、一実施形態において、「二次」とは、一次原因由来するか、または一次原因の結果として生じる症状を指す。一実施形態において、本発明において使用するための組成物および株は、一次もしくは二次症状、またはHSV感染に関連する二次的合併症を治療する。

0111

別の実施形態において、組み換えリステリア株は、1×109〜3.31×1010CFUの用量でヒト対象に投与される。別の実施形態において、用量は5〜500×108CFUである。別の実施形態において、用量は7〜500×108CFUである。別の実施形態において、用量は10〜500×108CFUである。別の実施形態において、用量は20〜500×108CFUである。別の実施形態において、用量は30〜500×108CFUである。別の実施形態において、用量は50〜500×108CFUである。別の実施形態において、用量は70〜500×108CFUである。別の実施形態において、用量は100〜500×108CFUである。別の実施形態において、用量は150〜500×108CFUである。別の実施形態において、用量は5〜300×108CFUである。別の実施形態において、用量は5〜200×108CFUである。別の実施形態において、用量は5〜150×108CFUである。別の実施形態において、用量は5〜100×108CFUである。別の実施形態において、用量は5〜70×108CFUである。別の実施形態において、用量は5〜50×108CFUである。別の実施形態において、用量は5〜30×108CFUである。別の実施形態において、用量は5〜20×108CFUである。別の実施形態において、用量は1〜30×109CFUである。別の実施形態において、用量は1〜20×109CFUである。別の実施形態において、用量は2〜30×109CFUである。別の実施形態において、用量は1〜10×109CFUである。別の実施形態において、用量は2〜10×109CFUである。別の実施形態において、用量は3〜10×109CFUである。別の実施形態において、用量は2〜7×109CFUである。別の実施形態において、用量は2〜5×109CFUである。別の実施形態において、用量は3〜5×109CFUである。

0112

別の実施形態において、用量は1×109〜3.31×109の生命体であり、これは、前臨床データを考慮すると予想外に低用量の組み換えリステリアである。

0113

別の実施形態において、用量は1.5×109の生命体である。別の実施形態において、用量は2×109の生命体である。別の実施形態において、用量は3×109の生命体である。別の実施形態において、用量は4×109の生命体である。別の実施形態において、用量は5×109の生命体である。別の実施形態において、用量は6×109の生命体である。別の実施形態において、用量は7×109の生命体である。別の実施形態において、用量は8×109の生命体である。別の実施形態において、用量は10×109の生命体である。別の実施形態において、用量は1.5×1010の生命体である。別の実施形態において、用量は2×1010の生命体である。別の実施形態において、用量は2.5×1010の生命体である。別の実施形態において、用量は3×1010の生命体である。別の実施形態において、用量は3.3×1010の生命体である。別の実施形態において、用量は4×1010の生命体である。別の実施形態において、用量は5×1010の生命体である。

0114

それぞれの用量および用量範囲が、本発明の個別の実施形態を表す。

0115

別の実施形態において、本発明の方法の組み換えポリペプチドは、組み換えリステリア株によって発現する。別の実施形態において、発現は組み換えリステリア株によって担持されるヌクレオチド分子により介在される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0116

別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドによって、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、プラスミドは、細菌転写因子をコード化する遺伝子を含む。別の実施形態において、プラスミドは、リステリア転写因子をコード化する。別の実施形態において、転写因子はprfAである。別の実施形態において、転写因子は当該技術分野で既知の任意の他の転写因子である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0117

別の実施形態において、プラスミドは、代謝酵素をコード化する遺伝子を含む。別の実施形態において、代謝酵素は細菌代謝酵素である。別の実施形態において、代謝酵素はリステリア代謝酵素である。別の実施形態において、代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態において、アミノ酸代謝遺伝子は、細胞壁合成経路に関与する。別の実施形態において、代謝酵素は、Dアミノ酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(dat)産物である。別の実施形態において、代謝酵素は、アラニンラセマーゼ遺伝子(dal)産物である。別の実施形態において、代謝酵素は当該技術分野で既知の任意の他の代謝酵素である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0118

別の実施形態において、本発明の方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、追加免疫接種に使用する組み換えリステリア株は、初回プライミング」接種に使用する株と同一である。別の実施形態において、追加免疫株は、プライミング株とは異なる。別の実施形態において、同一の用量がプライミングおよび追加免疫接種に使用される。別の実施形態において、より高い用量が追加免疫に使用される。別の実施形態において、より低い用量が追加免疫に使用される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0119

別の実施形態において、本発明の方法は、ヒト対象に、E7抗原を含む免疫原性組成物を接種するステップをさらに含む。別の実施形態において、免疫原性組成物は、組み換えE7タンパク質またはそのフラグメントを含む。別の実施形態において、免疫原性組成物は、組み換えE7タンパク質またはそのフラグメントを発現するヌクレオチド分子を含む。別の実施形態において、非リステリア接種はリステリア接種後に行われる。別の実施形態において、非リステリア接種はリステリア接種の前に行われる。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0120

「追加免疫」とは、別の実施形態において、追加のワクチン用量の対象への投与を指す。本発明の方法の別の実施形態において、2回の追加免疫(または合計3回の接種)が行われる。別の実施形態において、3回の追加免疫が行われる。別の実施形態において、4回の追加免疫が行われる。別の実施形態において、5回の追加免疫が行われる。別の実施形態において、6回の追加免疫が行われる。別の実施形態において、7回以上の追加免疫が行われる。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0121

一実施形態において、ワクチンの追加免疫は、初回ワクチン接種の21日後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の7日後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の14日後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の28日後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の10日後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の25日後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の1ヵ月後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の6週間後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の2ヵ月後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の3ヵ月後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の4ヶ月後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の5ヶ月後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の6ヶ月後に提供される。一実施形態において、追加免疫は、以上に説明した期間のいかなる組み合わせでも提供される。

0122

本発明の方法および組成物の組み換えリステリア株は、別の実施形態において、組み換えリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)株である。別の実施形態において、リステリア株は、組み換えリステリア・シーリゲリ(Listeria seeligeri)株である。別の実施形態において、リステリア株は、組み換えリステリア・グレイ(Listeria grayi)株である。別の実施形態において、リステリア株は、組み換えリステリア・イバノヴィ(Listeria ivanovii)株である。別の実施形態において、リステリア株は、組み換えリステリア・ムレイ(Listeria murrayi)株である。別の実施形態において、リステリア株は、組み換えリステリア・ウエルシュメリ(Listeria welshimeri)株である。別の実施形態において、リステリア株は、当該技術分野で既知の、任意の他のリステリア種の組み換え株である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0123

別の実施形態において、本発明の組み換えリステリア株は、動物宿主を介して継代されている。一実施形態において、該継代は、組み換えリステリア株を投与するステップの前に行われる。別の実施形態において、継代は、ワクチンベクターとしての、該株の有効性を最大限にする。別の実施形態において、継代は、リステリア株の免疫原性を安定化させる。別の実施形態において、継代は、リステリア株の病原性を安定化させる。別の実施形態において、継代は、リステリア株の免疫原性を増加させる。別の実施形態において、継代は、リステリア株の病原性を増加させる。別の実施形態において、継代は、リステリア株の不安定な亜株を除去する。別の実施形態において、継代は、リステリア株の不安定な亜株の罹患率を低減する。別の実施形態において、リステリア株は、抗原含有組み換えペプチドをコード化する遺伝子のゲノム挿入を含有する。別の実施形態において、リステリア株は、抗原含有組み換えペプチドをコード化する遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態において、継代は、本明細書に説明するとおり(例えば、実施例12)、または特許文献1(参照することにより、本明細書に組み込む)に説明されるとおりに行われる。別の実施形態において、継代は、当該技術分野で既知の、任意の他の方法によって行われる。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0124

別の実施形態において、本発明の方法で用いる組み換えリステリア株は、冷凍された細胞バンクに保管されている。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、凍結乾燥された細胞バンクに保管されている。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。一実施形態において、細胞バンクは、特許文献2(参照することにより、本明細書に組み込む)に説明されるとおりである。

0125

一実施形態において、リステリア株の凍結保存および凍結乾燥のための方法、リステリア株の細胞バンクまたは1組のワクチン用量を産生するための方法、それを特性評価する方法、および本発明の方法に有用な規定の微生物培地は、特許文献2(参照することにより、その全体を本明細書に組み込む)に説明されるとおりである。

0126

別の実施形態において、本発明の方法および組成物の細胞バンクは、マスター細胞バンクである。別の実施形態において、細胞バンクは、作業細胞バンクである。別の実施形態において、細胞バンクは、医薬適正製造基準GMP)の細胞バンクである。別の実施形態において、細胞バンクは、臨床用材料の生産のためのものである。別の実施形態において、細胞バンクは、ヒトでの使用のための規制実施に適合する。別の実施形態において、細胞バンクは、当該技術分野で既知の任意の他の種類の細胞バンクである。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0127

「医薬品適正製造基準」は、別の実施形態において、米国連規則集の(21 CFR 210?211)によって、定義される。別の実施形態において、「医薬品適正製造基準」は、臨床用材料の生産、または食用のための他の基準(例えば、米国以外の国の基準)によって定義される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0128

別の実施形態において、本発明の方法で用いる組み換えリステリア株は、1組のワクチン用量からのものである。

0129

別の実施形態において、本発明の方法で用いる組み換えリステリア株は、本明細書に説明される方法によって産生される冷凍貯蔵物からのものである。

0130

別の実施形態において、本発明の方法で用いる組み換えリステリア株は、本明細書に説明される方法によって産生される凍結乾燥された貯蔵物からのものである。

0131

別の実施形態において、本発明の細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、解凍時に、90%を上回る生存能力を呈する。別の実施形態において、解凍は、凍結保存のための保管、または24時間の冷凍保管後に行う。別の実施形態において、保管は2日間である。別の実施形態において、保管は3日間である。別の実施形態において、保管は4日間である。別の実施形態において、保管は1週間である。別の実施形態において、保管は2週間である。別の実施形態において、保管は3週間である。別の実施形態において、保管は1ヶ月間である。別の実施形態において、保管は2ヶ月間である。別の実施形態において、保管は3ヶ月間である。別の実施形態において、保管は5ヶ月間である。別の実施形態において、保管は6ヶ月間である。別の実施形態において、保管は9ヶ月間である。別の実施形態において、保管は1年間である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0132

別の実施形態において、本発明の細胞バンク、冷凍貯蔵物、一回分のワクチン用量は、栄養培地でリステリア株の培養物を増殖させるステップと、グリセロールを含む溶液で培養物を凍結するステップと、摂氏−20度未満でリステリア株を保存するステップと、を含む方法によって凍結保存される。別の実施形態において、温度は摂氏約−70度である。別の実施形態において、温度は摂氏約−70〜−80度である。

0133

別の実施形態において、本発明の細胞バンク、冷凍貯蔵物、一回分のワクチン用量は、本発明の規定培地(以下に説明)でリステリア株の培養物を増殖させるステップと、グリセロールを含む溶液で培養物を凍結するステップと、摂氏−20度未満でリステリア株を保存するステップと、を含む方法によって凍結保存される。別の実施形態において、温度は摂氏約−70である。別の実施形態において、温度は摂氏約−70〜−80である。別の実施形態において、本発明のいかなる規定微生物培地も、本方法において使用することができる。それぞれの規定微生物培地が、本発明の個別の実施形態を表す。

0134

本発明の方法および組成物の別の実施形態において、培養物(例えば、1回分のリステリアワクチン用量を産生するために使用されるリステリアワクチン株の培養物)は、細胞バンクからインキュベートされる。別の実施形態において、培養物は冷凍貯蔵物から播種される。別の実施形態において、培養物は開始培養物から播種される。別の実施形態において、培養物はコロニーから播種される。別の実施形態において、培養物は、中間対数増殖期で播種される。別の実施形態において、培養物は、およそ中間対数増殖期で播種される。別の実施形態において、培養物は、別の増殖期で播種される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0135

本発明の方法および組成物の別の実施形態において、凍結のために使用される溶液は、グリセロールを2〜20%の量で含有する。別の実施形態において、量は2%である。別の実施形態において、量は20%である。別の実施形態において、量は1%である。別の実施形態において、量は1.5%である。別の実施形態において、量は3%である。別の実施形態において、量は4%である。別の実施形態において、量は5%である。別の実施形態において、量は2%である。別の実施形態において、量は2%である。別の実施形態において、量は7%である。別の実施形態において、量は9%である。別の実施形態において、量は10%である。別の実施形態において、量は12%である。別の実施形態において、量は14%である。別の実施形態において、量は16%である。別の実施形態において、量は18%である。別の実施形態において、量は222%である。別の実施形態において、量は25%である。別の実施形態において、量は30%である。別の実施形態において、量は35%である。別の実施形態において、量は40%である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0136

別の実施形態において、凍結のために使用される溶液は、グリセロールの代わりに、別の束一性添加剤または不凍特性を有する添加剤を含有する。別の実施形態において、凍結のために使用される溶液は、グリセロールに加えて、別の束一性添加剤または不凍特性を有する添加剤を含有する。別の実施形態において、添加剤はマンニトールである。別の実施形態において、添加剤はDMSOである。別の実施形態において、添加剤はスクロースである。別の実施形態において、添加剤は当該技術分野で既知である、任意の他の束一性添加剤または不凍特性を有する添加剤である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0137

別の実施形態において、リステリア株の培養物を増殖させるために用いる栄養培地は、LBである。別の実施形態において、栄養培地はTBである。別の実施形態において、栄養培地は規定培地である。別の実施形態において、栄養培地は本発明の規定培地である。別の実施形態において、栄養培地は、当該技術分野で既知の任意の他の種類の栄養培地である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0138

本発明の方法および組成物の別の実施形態において、増殖させるステップは、振盪フラスコで行われる。別の実施形態において、フラスコバッフル付き振盪フラスコである。別の実施形態において、増殖は、バッチ発酵槽で行われる。別の実施形態において、増殖は、撹拌槽またはフラスコで行われる。別の実施形態において、増殖は、エアリフト発酵槽で行われる。別の実施形態において、増殖は、フェッドバッチで行われる。別の実施形態において、増殖は、連続細胞反応器で行われる。別の実施形態において、増殖は、固定化細胞反応器で行われる。別の実施形態において、増殖は、当該技術分野で既知である、任意の他の細菌増殖手段で行われる。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0139

別の実施形態において、一定pHが、培養物の増殖中維持される(例えば、バッチ発酵槽において)。別の実施形態において、pHは約7.0に維持される。別の実施形態において、pHは約6である。別の実施形態において、pHは約6.5である。別の実施形態において、pHは約7.5である。別の実施形態において、pHは約8である。別の実施形態において、pHは6.5〜7.5である。別の実施形態において、pHは6〜8である。別の実施形態において、pHは6〜7である。別の実施形態において、pHは7〜8である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0140

別の実施形態において、一定温度が、培養物の増殖中維持される。別の実施形態において、温度は約37℃に維持される。別の実施形態において、温度は37℃である。別の実施形態において、温度は25℃である。別の実施形態において、温度は27℃である。別の実施形態において、温度は28℃である。別の実施形態において、温度は30℃である。別の実施形態において、温度は32℃である。別の実施形態において、温度は34℃である。別の実施形態において、温度は35℃である。別の実施形態において、温度は36℃である。別の実施形態において、温度は38℃である。別の実施形態において、温度は39℃である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0141

別の実施形態において、一定の溶存酸素濃度が培養物の増殖中維持される。別の実施形態において、溶存酸素濃度は、飽和の20%に維持される。別の実施形態において、濃度は飽和の15%である。別の実施形態において、濃度は飽和の16%である。別の実施形態において、濃度は飽和の18%である。別の実施形態において、濃度は飽和の22%である。別の実施形態において、濃度は飽和の25%である。別の実施形態において、濃度は飽和の30%である。別の実施形態において、濃度は飽和の35%である。別の実施形態において、濃度は飽和の40%である。別の実施形態において、濃度は飽和の45%である。別の実施形態において、濃度は飽和の50%である。別の実施形態において、濃度は飽和の55%である。別の実施形態において、濃度は飽和の60%である。別の実施形態において、濃度は飽和の65%である。別の実施形態において、濃度は飽和の70%である。別の実施形態において、濃度は飽和の75%である。別の実施形態において、濃度は飽和の80%である。別の実施形態において、濃度は飽和の85%である。別の実施形態において、濃度は飽和の90%である。別の実施形態において、濃度は飽和の95%である。別の実施形態において、濃度は飽和の100%である。別の実施形態において、濃度は飽和のほぼ100%である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0142

本発明の方法および組成物の別の実施形態において、培養物は、1つの容器あたり最大容積リットル(L)を有する培地で増殖される。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最大容積200mlを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最大容積300mlを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最大容積500mlを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最大容積750mlを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最大容積1Lを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最大容積1.5Lを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最大容積2.5Lを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最大容積3Lを有する。

0143

別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最小容積2Lを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最小容積500mlを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最小容積750mlを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最小容積1Lを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最小容積1.5Lを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最小容積2.5Lを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最小容積3Lを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最小容積4Lを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最小容積5Lを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最小容積6Lを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最小容積8Lを有する。別の実施形態において、培地は、1つの容器あたり最小容積10Lを有する。

0144

それぞれの容積が、本発明の個別の実施形態を表す。

0145

本発明の方法および組成物の別の実施形態において、凍結または凍結乾燥するステップは、培養物が0.7単位のOD600を有するときに行われる。別の実施形態において、培養物は、0.8単位のOD600を有する。別の実施形態において、OD600は約0.7単位である。別の実施形態において、OD600は約0.8単位である。別の実施形態において、OD600は0.6単位である。別の実施形態において、OD600は0.65単位である。別の実施形態において、OD600は0.75単位である。別の実施形態において、OD600は0.85単位である。別の実施形態において、OD600は0.9単位である。別の実施形態において、OD600は1単位である。別の実施形態において、OD600は0.6〜0.9単位である。別の実施形態において、OD600は0.65〜0.9単位である。別の実施形態において、OD600は0.7〜0.9単位である。別の実施形態において、OD600は0.75〜0.9単位である。別の実施形態において、OD600は0.8〜0.9単位である。別の実施形態において、OD600は0.75〜1単位である。別の実施形態において、OD600は0.9〜1単位である。別の実施形態において、OD600は1単位を上回る。

0146

別の実施形態において、OD600は1単位を大幅に上回る(例えば、培養物がバッチ発酵槽で産生されるとき)。別の実施形態において、OD600は7.5〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は1.2単位である。別の実施形態において、OD600は1.5単位である。別の実施形態において、OD600は2単位である。別の実施形態において、OD600は2.5単位である。別の実施形態において、OD600は3単位である。別の実施形態において、OD600は3.5単位である。別の実施形態において、OD600は4単位である。別の実施形態において、OD600は4.5単位である。別の実施形態において、OD600は5単位である。別の実施形態において、OD600は5.5単位である。別の実施形態において、OD600は6単位である。別の実施形態において、OD600は6.5単位である。別の実施形態において、OD600は7単位である。別の実施形態において、OD600は7.5単位である。別の実施形態において、OD600は8単位である。別の実施形態において、OD600は8.5単位である。別の実施形態において、OD600は9単位である。別の実施形態において、OD600は9.5単位である。別の実施形態において、OD600は10単位である。別の実施形態において、OD600は10単位よりも大きい。

0147

別の実施形態において、OD600は1〜2単位である。別の実施形態において、OD600は1.5〜2.5単位である。別の実施形態において、OD600は2〜3単位である。別の実施形態において、OD600は2.5〜3.5単位である。別の実施形態において、OD600は3〜4単位である。別の実施形態において、OD600は3.5〜4.5単位である。別の実施形態において、OD600は4〜5単位である。別の実施形態において、OD600は4.5〜5.5単位である。別の実施形態において、OD600は5〜6単位である。別の実施形態において、OD600は5.5〜6.5単位である。別の実施形態において、OD600は1〜3単位である。別の実施形態において、OD600は1.5〜3.5単位である。別の実施形態において、OD600は2〜4単位である。別の実施形態において、OD600は2.5〜4.5単位である。別の実施形態において、OD600は3〜5単位である。別の実施形態において、OD600は4〜6単位である。別の実施形態において、OD600は5〜7単位である。別の実施形態において、OD600は2〜5単位である。別の実施形態において、OD600は3〜6単位である。別の実施形態において、OD600は4〜7単位である。別の実施形態において、OD600は5〜8単位である。別の実施形態において、OD600は1.2〜7.5単位である。別の実施形態において、OD600は1.5〜7.5単位である。別の実施形態において、OD600は2〜7.5単位である。別の実施形態において、OD600は2.5〜7.5単位である。別の実施形態において、OD600は3〜7.5単位である。別の実施形態において、OD600は3.5〜7.5単位である。別の実施形態において、OD600は4〜7.5単位である。別の実施形態において、OD600は4.5〜7.5単位である。別の実施形態において、OD600は5〜7.5単位である。別の実施形態において、OD600は5.5〜7.5単位である。別の実施形態において、OD600は6〜7.5単位である。別の実施形態において、OD600は6.5〜7.5単位である。別の実施形態において、OD600は7〜7.5単位である。別の実施形態において、OD600は10単位よりも大きい。別の実施形態において、OD600は1.2〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は1.5〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は2〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は2.5〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は3〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は3.5〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は4〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は4.5〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は5〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は5.5〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は6〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は6.5〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は7〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は7.5〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は8〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は9.5〜8.5単位である。別の実施形態において、OD600は10単位である。

0148

別の実施形態において、冷凍もしくは凍結乾燥するステップは、培養物が、1×109コロニー形成単位(CFU)/mlのバイオマスを有している際に行われる。別の実施形態において、バイオマスは1.5×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは1.5×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは2×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは3×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは4×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは5×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは7×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは9×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは10×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは12×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは15×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは20×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは25×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは30×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは33×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは40×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは50×109CFR/mlである。別の実施形態において、バイオマスは50×109CFR/mlを上回る。

0149

OD600測定値および培養物のバイオマス測定値の各数および範囲が、本発明の個別の実施形態を表す。

0150

本発明の方法および組成物の別の実施形態において、リステリア培養物を液体窒素でフラッシュ凍結し、その後、最終冷凍温度で保管する。別の実施形態において、培養物をより段階的に冷凍する(例えば、最終保管温度の培養物のバイアルに配置することによって)。別の実施形態において、培養物を細菌培養物を冷凍するための、当該技術分野で既知の任意の他の方法によって冷凍する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0151

本発明の方法および組成物の別の実施形態において、培養物の保管温度は、摂氏−20〜−80度(℃)である。別の実施形態において、温度は−20℃を大幅に下回る。別の実施形態において、温度は−70℃よりも高くない。別の実施形態において、温度は−70℃である。別の実施形態において、温度は約−70℃である。別の実施形態において、温度は−20℃である。別の実施形態において、温度は約−20℃である。別の実施形態において、温度は−30℃である。別の実施形態において、温度は−40℃である。別の実施形態において、温度は−50℃である。別の実施形態において、温度は−60℃である。別の実施形態において、温度は−80℃である。別の実施形態において、温度は−30〜−70℃である。別の実施形態において、温度は−40〜−70℃である。別の実施形態において、温度は−50〜−70℃である。別の実施形態において、温度は−60〜−70℃である。別の実施形態において、温度は−30〜−80℃である。別の実施形態において、温度は−40〜−80℃である。別の実施形態において、温度は−50〜−80℃である。別の実施形態において、温度は−60〜−80℃である。別の実施形態において、温度は−70〜−80℃である。別の実施形態において、温度は−70℃よりも低温である。別の実施形態において、温度は−80℃よりも低温である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0152

本発明の方法および組成物の別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、もしくは凍結乾燥は、最大24時間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大2日間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大3日間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大4日間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大1週間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大2週間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大3週間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大1ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大2ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大3ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大5ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大6ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大9ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大1年間である。

0153

別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低1週間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低2週間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低3週間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低1ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低2ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低3ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低5ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低6ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低9ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低1年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低1.5年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低2年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低3年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低5年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低7年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低10年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、10年間よりも長い。

0154

それぞれの凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥期間が、本発明の個別の実施形態を表す。

0155

本発明の方法および組成物の別の実施形態において、リステリア細菌は、長期間の凍結保存もしくは冷凍保管後の解凍後、本質的に直ちに対数増殖を呈する(実施例14)。別の実施形態において、リステリア細菌は、長期間の凍結乾燥後再構成後、本質的に直ちに対数増殖を呈する。別の実施形態において、「本質的に直ちに」とは、細胞バンクまたは開始培養物からの細胞で、新しい培地を播種してから約1時間以内を指す。別の実施形態において、細菌は、凍結保存もしくは保管期間後の解凍後、間もなく(例えば、種々の実施形態において、10分後、20分後、30分後、40分後、50分後、1時間後、75分後、90分後、105分後、または2時間後)、対数増殖を呈する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0156

「長期間」の凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、別の実施形態において、1ヶ月である。別の実施形態において、該期間は、2ヶ月である。別の実施形態において、該期間は、3ヶ月である。別の実施形態において、該期間は、5ヶ月である。別の実施形態において、該期間は、6ヶ月である。別の実施形態において、該期間は、9ヶ月である。別の実施形態において、該期間は、1年である。別の実施形態において、該期間は、1.5年である。別の実施形態において、該期間は、2年である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0157

別の実施形態において、「対数増殖」とは、培養物が増殖する条件(例えば、培地の種類、温度等)に対して観察される最大値に近い倍加時間を指す。別の実施形態において、「対数増殖」とは、培養物の希釈の適度に一定の数時間(例えば、1時間、1.5時間、2時間、または2.5時間)後(任意に、短い回復期間後)の倍加時間を指す。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0158

別の実施形態において、本発明の方法および組成物のリステリアワクチン株は、凍結保存の14日後の解凍後、90%以上の生存能力を保持する(実施例14)。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、凍結保存期間後、100%に近い。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、約90%である。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、90%に近い。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、少なくとも90%である。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、80%以上である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0159

別の実施形態において、本発明の方法および組成物のリステリアワクチン株は、凍結乾燥後の再構成後、90%以上の生存能力を保持する。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、凍結乾燥期間後、100%に近い。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、約90%である。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、90%に近い。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、少なくとも90%である。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、80%以上である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0160

別の実施形態において、本発明の細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)約0.3〜約0.6g/Lのメチオニン、ならびに(2)有効量の(a)システイン、(b)pH緩衝剤、(c)炭水化物、(d)二価カチオン、(e)第二鉄もしくは第一鉄イオン、(f)グルタミンもしくは別の窒素源、(g)リボフラビン、(h)チオクト酸リポ酸としても知られる)、(i)ロイシンイソロイシンバリンアルギニンヒスチジントリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される別の成分、またはさらなる成分、(j)アデニンビオチンチアミンピリドキサールパラアミノ安息香酸パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(k)コバルト、銅、ホウ素、マンガンモリブデン亜鉛カルシウム、およびクエン酸塩より選択される1つまたは複数の成分。

0161

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)約0.3〜約0.6g/Lのシステイン、ならびに(2)有効量の(a)メチオニン、(b)pH緩衝剤、(c)炭水化物、(d)二価カチオン、(e)第二鉄もしくは第一鉄イオン、(f)グルタミンもしくは別の窒素源、(g)リボフラビン、(h)チオクト酸、(i)ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される1つまたは複数の成分、(j)アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(k)コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸より選択される1つまたは複数の成分。

0162

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)1リットルあたり約0.00123〜0.00246モルの第二鉄もしくは第一鉄イオン、ならびに(2)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、(c)二価カチオン、(d)メチオニン、(e)システイン、(f)グルタミンもしくは別の窒素源、(g)リボフラビン、(h)チオクト酸、(i)ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される1つまたは複数の成分、(j)アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(k)コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸より選択される1つまたは複数の成分。

0163

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)約1.8〜3.6g/Lのグルタミンもしくは別の窒素源、ならびに(2)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、(c)二価カチオン、(d)メチオニン、(e)システイン、(f)第二鉄もしくは第一鉄イオン、(g)リボフラビン、(h)チオクト酸、(i)ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される1つまたは複数の成分、(j)アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(k)コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸より選択される1つまたは複数の成分。

0164

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)約15〜約30mg/Lのリボフラビン、ならびに(2)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、(c)二価カチオン、(d)メチオニン、(e)システイン、(f)第二鉄もしくは第一鉄イオン、(g)グルタミンもしくは別の窒素源、(h)チオクト酸、(i)ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される1つまたは複数の成分、(j)アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(k)コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される1つまたは複数の成分。

0165

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)約0.3〜約0.6g/Lのチオクト酸、ならびに(2)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、(c)二価カチオン、(d)メチオニン、(e)システイン、(f)第二鉄もしくは第一鉄イオン、(g)グルタミンもしくは別の窒素源、(h)リボフラビン、(i)ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される1つまたは複数の成分、(j)アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(k)コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される1つまたは複数の成分。

0166

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)それぞれ約0.3〜約0.6g/Lのメチオニンおよびシステイン、(2)1リットルあたり約0.00123〜0.00246モルの第二鉄もしくは第一鉄イオン、(3)約1.8〜約3.6g/Lのグルタミンもしくは別の窒素源、(4)約0.3〜約0.6g/Lのチオクト酸、(5)約15〜約30mg/Lのリボフラビン、ならびに(6)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、(c)二価カチオン、(d)ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される1つまたは複数の成分、(e)アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(f)コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される1つまたは複数の成分。

0167

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)それぞれ約0.3〜約0.6g/Lのメチオニンおよびシステイン、(2)1リットルあたり約0.00123〜0.00246モルの第二鉄もしくは第一鉄イオン、(3)約1.8〜約3.6g/Lのグルタミンもしくは別の窒素源、(4)約0.3〜約0.6g/Lのチオクト酸、(5)約15〜約30mg/Lのリボフラビン、ならびに(6)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、(c)二価カチオン、(d)ロイシン、(e)イソロイシン、(f)バリン、(g)アルギニン、(h)ヒスチジン、(i)トリプトファン、(j)フェニルアラニン、(k)アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(l)コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される1つまたは複数の成分。

0168

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される、それぞれ約0.3〜約0.6g/Lの1つまたは複数の成分、ならびに(2)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、(c)二価カチオン、(d)メチオニン、(e)システイン、(f)第二鉄もしくは第一鉄イオン、(g)グルタミンもしくは別の窒素源、(h)リボフラビン、(i)チオクト酸、(j)アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(k)コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩から選択される1つまたは複数の成分。

0169

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)それぞれ約0.3〜約0.6g/Lのロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニン、ならびに(2)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、(c)二価カチオン、(d)メチオニン、(e)システイン、(f)第二鉄もしくは第一鉄イオン、(g)グルタミンもしくは別の窒素源、(h)リボフラビン、(i)チオクト酸、(j)アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(k)コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される1つまたは複数の成分。

0170

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)約0.2〜約0.75の、ビオチンおよびアデニンより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(2)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、(c)二価カチオン、(d)メチオニン、(e)システイン、(f)第二鉄もしくは第一鉄イオン、(g)グルタミンもしくは別の窒素源、(h)リボフラビン、(i)チオクト酸、(j)ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される1つまたは複数の成分、(k)チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(l)コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される1つまたは複数の成分。

0171

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)それぞれ約3〜約6mg/Lの、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(2)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、(c)二価カチオン、(d)メチオニン、(e)システイン、(f)第二鉄もしくは第一鉄イオン、(g)グルタミンもしくは別の窒素源、(h)リボフラビン、(i)チオクト酸、(j)ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される1つまたは複数の成分、(k)ビオチン、(l)アデニン、ならびに(l)コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される1つまたは複数の成分。

0172

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)それぞれ約0.2〜約0.75mg/Lの、ビオチンおよびアデニンより選択される1つまたは複数の成分、(2)それぞれ約3〜約6mg/Lの、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(3)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、(c)二価カチオン、(d)メチオニン、(e)システイン、(f)第二鉄もしくは第一鉄イオン、(g)グルタミンもしくは別の窒素源、(h)リボフラビン、(i)チオクト酸、(j)ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(k)コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される1つまたは複数の成分。

0173

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)それぞれ約0.005〜約0.02g/Lの、コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、およびカルシウムより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(2)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、(c)二価カチオン、(d)メチオニン、(e)システイン、(f)第二鉄もしくは第一鉄イオン、(g)グルタミンもしくは別の窒素源、(h)リボフラビン、(i)チオクト酸、(j)ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(k)アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分。

0174

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)約0.4〜約1g/Lのクエン酸塩、ならびに(2)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、(c)二価カチオン、(d)メチオニン、(e)システイン、(f)第二鉄もしくは第一鉄イオン、(g)グルタミンもしくは別の窒素源、(h)リボフラビン、(i)チオクト酸、(j)ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される1つまたは複数の成分、(k)コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、およびカルシウムより選択される1つまたは複数の成分、ならびに(l)アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分。

0175

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)それぞれ約0.3〜約0.6g/Lのメチオニンおよびシステイン、(2)1リットルあたり約0.00123〜0.00246モルの第二鉄もしくは第一鉄イオン、(3)約1.8〜約3.6g/Lのグルタミンもしくは別の窒素源、(4)約0.3〜約0.6g/Lのチオクト酸、(5)約15〜約30mg/Lのリボフラビン、(6)それぞれ約0.3〜約0.6g/Lの、ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される1つまたは複数の成分、(7)それぞれ約0.2〜約0.75mg/Lの、ビオチンおよびアデニンより選択される1つまたは複数の成分、(8)それぞれ約3〜約6mg/Lの、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、(9)それぞれ約0.005〜約0.02g/Lの、コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、およびカルシウムより選択される1つまたは複数の成分、(10)約0.4〜約1g/Lのクエン酸塩、ならびに(11)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、および(c)二価カチオン。

0176

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)それぞれ約0.3〜約0.6g/Lのメチオニンおよびシステイン、(2)1リットルあたり約0.00123〜0.00246モルの第二鉄もしくは第一鉄イオン、(3)約1.8〜約3.6g/Lのグルタミンもしくは別の窒素源、(4)約0.3〜約0.6g/Lのチオクト酸、(5)約15〜約30mg/Lのリボフラビン、(6)それぞれ約0.3〜約0.6g/Lのロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニン、(7)それぞれ約0.2〜約0.75mg/Lの、ビオチンおよびアデニンより選択される1つまたは複数の成分、(8)それぞれ約3〜約6mg/Lの、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される1つまたは複数の成分、(9)それぞれ約0.005〜約0.02g/Lの、コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、およびカルシウムより選択される1つまたは複数の成分、(10)約0.4〜約1g/Lのクエン酸塩、ならびに(11)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、および(c)二価カチオン。

0177

別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または1組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。(1)それぞれ約0.3〜約0.6g/Lのメチオニンおよびシステイン、(2)1リットルあたり約0.00123〜0.00246モルの第二鉄もしくは第一鉄イオン、(3)約1.8〜約3.6g/Lのグルタミンもしくは別の窒素源、(4)約0.3〜約0.6g/Lのチオクト酸、(5)約15〜約30mg/Lのリボフラビン、(6)それぞれ約0.3〜約0.6g/Lのロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニン、(7)それぞれ約0.2〜約0.75mg/Lのビオチンおよびアデニン、(8)それぞれ約3〜約6mg/Lのチアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミド、(9)それぞれ約0.005〜約0.02g/Lの、コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、およびカルシウムより選択される1つまたは複数の成分、(10)約0.4〜約1g/Lのクエン酸塩、ならびに(11)有効量の(a)pH緩衝剤、(b)炭水化物、および(c)二価カチオン。

0178

別の実施形態において、本発明の規定微生物培地は、水性溶媒をさらに含む。別の実施形態において、水性溶媒は水である。別の実施形態において、水性溶媒は、当該技術分野で既知の任意の他の水性溶媒である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0179

本発明の方法および組成物で用いられる炭水化物は、別の実施形態において、グルコースである。別の実施形態において、炭水化物はラクトースある。別の実施形態において、炭水化物はフルクトースある。別の実施形態において、炭水化物はマンノースある。別の実施形態において、炭水化物はセロビオースある。別の実施形態において、炭水化物はトレハロースある。別の実施形態において、炭水化物はマルトースある。別の実施形態において、炭水化物はグリセロールある。別の実施形態において、炭水化物はグルコサミンある。別の実施形態において、炭水化物はN−アセチルグルコサミンある。別の実施形態において、炭水化物はN−アセチルムラミン酸ある。別の実施形態において、炭水化物は、リステリアによって用いることができる任意の他の炭水化物である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0180

別の実施形態において、本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する炭水化物の量は、約12〜18グラム/リットル(g/L)である。別の実施形態において、該量は、15g/Lである。別の実施形態において、該量は、10g/Lである。別の実施形態において、該量は、9g/Lである。別の実施形態において、該量は、11g/Lである。別の実施形態において、該量は、12g/Lである。別の実施形態において、該量は、13g/Lである。別の実施形態において、該量は、14g/Lである。別の実施形態において、該量は、16g/Lである。別の実施形態において、該量は、17g/Lである。別の実施形態において、該量は、18g/Lである。別の実施形態において、該量は、19g/Lである。別の実施形態において、該量は、20g/Lである。別の実施形態において、該量は、20g/Lを上回る。

0181

別の実施形態において、該量は、9〜15g/Lである。別の実施形態において、該量は、10〜15g/Lである。別の実施形態において、該量は、11〜15g/Lである。別の実施形態において、該量は、12〜16g/Lである。別の実施形態において、該量は、13〜17g/Lである。別の実施形態において、該量は、14〜18g/Lである。別の実施形態において、該量は、16〜19g/Lである。別の実施形態において、該量は、17〜20g/Lである。別の実施形態において、該量は、10〜20g/Lである。別の実施形態において、該量は、12〜20g/Lである。別の実施形態において、該量は、15〜20g/Lである。

0182

別の実施形態において、培地内の炭水化物の総量は、上記の量のうちの1つである。別の実施形態において、培地内の炭水化物うちのの1つの量は、上記の量のうちの1つである。別の実施形態において、培地内の炭水化物のそれぞれの量は、上記の量のうちの1つである。

0183

炭水化物の上記の量のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0184

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するコバルトは、別の実施形態において、コバルトイオンとして存在する。別の実施形態において、コバルトは、コバルト塩として存在する。別の実施形態において、塩は塩化コバルトである。別の実施形態において、塩は当該技術分野で既知の任意の他のコバルト塩である。別の実施形態において、コバルトは、当該技術分野で既知の任意の他の形態のコバルトとして存在する。

0185

別の実施形態において、コバルト塩は水和物(例えば、塩化コバルト六水和物)である。別の実施形態において、コバルト塩は無水である。別の実施形態において、コバルト塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のコバルト塩である。上記の形態のコバルトのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0186

本発明の方法および組成物の規定培地の成分の水和物は、別の実施形態において、一水和物である。別の実施形態において、水和物は二水和物である。別の実施形態において、水和物は三水和物である。別の実施形態において、水和物は四水和物である。別の実施形態において、水和物は五水和物である。別の実施形態において、水和物は六水和物である。別の実施形態において、水和物は七水和物である。別の実施形態において、水和物は、当該技術分野で既知の任意の他の水和物である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。

0187

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する銅は、別の実施形態において、銅イオンとして存在する。別の実施形態において、銅イオンは銅(I)イオンである。別の実施形態において、銅イオンは銅(II)イオンである。別の実施形態において、銅イオンは銅(III)イオンである。

0188

別の実施形態において、銅は、銅塩として存在する。別の実施形態において、塩は塩化銅である。別の実施形態において、塩は当該技術分野で既知の任意の他の銅塩である。別の実施形態において、銅は当該技術分野で既知の任意の他の形態の銅として存在する。

0189

別の実施形態において、銅塩は水和物(例えば、塩化銅二水和物)である。別の実施形態において、銅塩は無水である。別の実施形態において、銅塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態の銅塩である。上記の形態の銅のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0190

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するホウ素は、別の実施形態において、ホウ酸イオンとして存在する。別の実施形態において、ホウ素は、ホウ酸(borate acid)(例えば、ホウ素性酸、H3BO3)として存在する。別の実施形態において、ホウ素は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のホウ素として存在する。

0191

別の実施形態において、ホウ酸塩またはホウ酸は、水和物である。別の実施形態において、ホウ酸塩またはホウ酸は、無水である。別の実施形態において、ホウ酸塩またはホウ酸は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のホウ酸塩またはホウ酸である。上記の形態のホウ素のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0192

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するマンガンは、別の実施形態において、マンガンイオンとして存在する。別の実施形態において、マンガンは、マンガン塩として存在する。別の実施形態において、塩は硫酸マンガンである。別の実施形態において、塩は、当該技術分野で既知の任意の他のマンガン塩である。別の実施形態において、マンガンは、当該技術分野で既知の任意の他の形態のマンガンとして存在する。

0193

別の実施形態において、マンガン塩は水和物(例えば、硫酸マンガン一水和物)である。別の実施形態において、マンガン塩は無水である。別の実施形態において、マンガン塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のマンガン塩である。上記の形態のマンガンのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0194

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するモリブデンは、別の実施形態において、モリブデン酸イオンとして存在する。別の実施形態において、モリブデンはモリブデン塩として存在する。別の実施形態において、塩はモリブデン酸ナトリウムである。別の実施形態において、塩は、当該技術分野で既知の任意の他のモリブデン塩である。別の実施形態において、モリブデンは、当該技術分野で既知の任意の他の形態のモリブデンとして存在する。

0195

別の実施形態において、モリブデン塩は水和物(例えば、モリブデン酸ナトリウム二水和物)である。別の実施形態において、モリブデン塩は無水である。別の実施形態において、モリブデン塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のモリブデン塩である。上記の形態のモリブデンのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0196

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する亜鉛は、別の実施形態において、亜鉛イオンとして存在する。別の実施形態において、亜鉛は、亜鉛塩として存在する。別の実施形態において、塩は塩化亜鉛である。別の実施形態において、塩は、当該技術分野で既知の任意の他の亜鉛塩である。別の実施形態において、亜鉛は、当該技術分野で既知の任意の他の形態の亜鉛として存在する。

0197

別の実施形態において、亜鉛塩は水和物(例えば、塩化亜鉛七水和物)である。別の実施形態において、亜鉛塩は無水である。別の実施形態において、亜鉛塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態の亜鉛塩である。上記の形態の亜鉛のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0198

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する鉄は、別の実施形態において、第二鉄イオンとして存在する。別の実施形態において、鉄は第一鉄イオンとして存在する。別の実施形態において、鉄は第二鉄塩として存在する。別の実施形態において、鉄は第一鉄塩として存在する。別の実施形態において、塩は硫酸第二鉄である。別の実施形態において、塩はクエン酸第二鉄である。別の実施形態において、塩は、当該技術分野で既知の任意の他の第二鉄塩である。別の実施形態において、塩は、当該技術分野で既知の任意の他の第一鉄塩である。別の実施形態において、鉄は、当該技術分野で既知の任意の他の形態の鉄として存在する。

0199

別の実施形態において、第二鉄または第一鉄塩は水和物(例えば、硫酸第二鉄一水和物)である。別の実施形態において、第二鉄または第一鉄塩は無水である。別の実施形態において、第二鉄または第一鉄塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態の第二鉄または第一鉄塩である。上記の形態の鉄のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0200

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するカルシウムは、別の実施形態において、カルシウムイオンとして存在する。別の実施形態において、カルシウムは、カルシウム塩として存在する。別の実施形態において、塩は塩化カルシウムである。別の実施形態において、塩は、当該技術分野で既知の任意の他のカルシウム塩である。別の実施形態において、カルシウムは、当該技術分野で既知の任意の他の形態のカルシウムとして存在する。

0201

別の実施形態において、カルシウム塩は水和物(例えば、塩化カルシウム二水和物)である。別の実施形態において、カルシウム塩は無水である。別の実施形態において、カルシウム塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のカルシウム塩である。上記の形態のカルシウムのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0202

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するクエン酸塩は、別の実施形態において、クエン酸イオンとして存在する。別の実施形態において、クエン酸塩は、クエン酸塩として存在する。別の実施形態において、クエン酸塩は、クエン性酸(例えば、クエン酸)として存在する。別の実施形態において、クエン酸塩は、クエン酸第二鉄およびクエン酸の両方として存在する(実施例15〜16)。別の実施形態において、クエン酸塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のクエン酸塩として存在する。

0203

別の実施形態において、クエン酸塩またはクエン酸は、水和物である。別の実施形態において、クエン酸塩またはクエン酸は無水である。別の実施形態において、クエン酸塩またはクエン酸は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のクエン酸塩またはクエン酸である。上記の形態のクエン酸塩のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0204

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するコバルトは、別の実施形態において、0.02g/Lの量で存在する(実施例15〜16)。別の実施形態において、該量は、約0.02g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.003g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.005g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.007g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.01g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.015g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.025g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.03g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.003〜0.006g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.005〜0.01g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.01〜0.02g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.02〜0.04g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.03〜0.06g/Lである。

0205

別の実施形態において、コバルトは、0.02g/Lの塩化コバルト六水和物のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在するコバルトの量は、約0.02g/Lの塩化コバルト六水和物のモル当量である。別の実施形態において、存在するコバルトの量は、上記の量または範囲の塩化コバルト六水和物の別のモル当量である。上記の量または範囲のコバルトのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0206

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する銅は、別の実施形態において、0.019g/Lの量で存在する(実施例15〜16)。別の実施形態において、該量は、約0.019g/Lである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。

0207

別の実施形態において、銅は、0.019g/Lの塩化銅二水和物のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在する銅の量は、約0.019g/Lの塩化銅二水和物のモル当量である。別の実施形態において、存在する銅の量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、塩化銅二水和物のモル当量である。上記の量または範囲の銅のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0208

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するホウ酸塩系は、別の実施形態において、0.016g/Lの量で存在する(実施例15〜16)。別の実施形態において、該量は、約0.016g/Lである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。

0209

別の実施形態において、ホウ酸塩系は、0.016g/Lのホウ酸のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在するホウ酸塩系の量は、約0.016g/Lのホウ酸のモル当量である。別の実施形態において、存在するホウ酸塩系の量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、ホウ酸のモル当量である。上記の量または範囲のホウ酸塩系のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0210

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するマンガンは、別の実施形態において、0.016g/Lの量で存在する(実施例15〜16)。別の実施形態において、該量は、約0.016g/Lである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。

0211

別の実施形態において、マンガンは、0.016g/Lの硫酸マンガン一水和物のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在するマンガンの量は、約0.016g/Lの硫酸マンガン一水和物のモル当量である。別の実施形態において、存在するマンガンの量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、硫酸マンガン一水和物のモル当量である。上記の量または範囲のマンガンのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0212

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するモリブデンは、別の実施形態において、0.02g/Lの量で存在する(実施例15〜16)。別の実施形態において、該量は、約0.02g/Lである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。

0213

別の実施形態において、モリブデンは、0.2g/Lのモリブデン酸ナトリウム二水和物のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在するモリブデンの量は、約0.02g/Lのモリブデン酸ナトリウム二水和物のモル当量である。別の実施形態において、存在するモリブデンの量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、モリブデン酸ナトリウム二水和物のモル当量である。上記の量または範囲のモリブデンのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0214

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する亜鉛は、別の実施形態において、0.02g/Lの量で存在する(実施例15〜16)。別の実施形態において、該量は、約0.02g/Lである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。

0215

別の実施形態において、亜鉛は、0.02g/Lの塩化亜鉛七水和物のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在する亜鉛の量は、約0.02g/Lの塩化亜鉛七水和物のモル当量である。別の実施形態において、存在する亜鉛の量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、塩化亜鉛七水和物のモル当量である。上記の量または範囲の亜鉛のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0216

別の実施形態において、硫酸第二鉄または関連化合物は、本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する。別の実施形態において、硫酸第二鉄または関連化合物は、0.01g/Lの量で存在する(実施例15〜16)。別の実施形態において、該量は、約0.01g/Lである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。

0217

別の実施形態において、鉄は、0.01g/Lの硫酸第二鉄のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在する鉄の量は、約0.01g/Lの硫酸第二鉄のモル当量である。別の実施形態において、存在する鉄の量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、硫酸第二鉄のモル当量である。上記の量または範囲の鉄のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0218

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するカルシウムは、別の実施形態において、0.01g/Lの量で存在する(実施例15〜16)。別の実施形態において、該量は、約0.01g/Lである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。

0219

別の実施形態において、カルシウムは、0.01g/Lの塩化カルシウム二水和物のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在するカルシウムの量は、約0.01g/Lの塩化カルシウム二水和物のモル当量である。別の実施形態において、存在するカルシウムの量は、バルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、塩化カルシウム二水和物のモル当量である。上記の量または範囲のカルシウムのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

0220

本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するクエン酸塩は、別の実施形態において、0.9g/Lの量で存在する(実施例15〜16)。別の実施形態において、該量は、クエン酸の形態で、0.6g/Lである(実施例15〜16)。別の実施形態において、該量は、クエン酸第二鉄の形態で、0.4g/Lである(実施例15〜16)。別の実施形態において、該量は、クエン酸の形態で0.6g/L、およびクエン酸第二鉄の形態で0.4g/Lである(実施例15〜16)。別の実施形態において、該量は約0.6g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.1g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.2g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.3g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.4g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.5g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.7g/Lである。別の実施形態において、該量は、0.8g/Lである。別の実施形態において、該量は、1g/Lである。別の実施形態において、該量は、1g/Lを上回る。

0221

別の実施形態において、クエン酸塩は、0.6g/Lのクエン性酸のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在するクエン酸塩の量は、約0.6g/Lのクエン性酸のモル当量である。別の実施形態において、存在するクエン酸塩の量は、約0.4g/Lのクエン酸第二鉄のモル当量である。別の実施形態において、存在するクエン酸塩の量は、0.4g/Lのクエン酸第二鉄のモル当量である。別の実施形態において、存在するクエン酸塩の量は、0.6g/Lのクエン性酸、および0.4g/Lのクエン酸第二鉄のモル当量である。別の実施形態において、存在するクエン酸塩の量は、0.6g/Lのクエン性酸、および0.4g/Lのクエン酸第二鉄の約モル当量である。別の実施形態において、存在するクエン酸塩の量は、クエン酸塩に関して上に記載される量または範囲のいずれかのクエン性酸のモル当量である。上記の量または範囲のクエン酸塩のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。

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