図面 (/)

技術 PREQ1リボスイッチならびにPREQ1リボスイッチの使用のための、およびPREQ1リボスイッチを用いる使用のための方法および組成物

出願人 イェールユニバーシティー
発明者 ブレーカー,ロナルドアール.バリック,ジェフリーイー.ロス,アダムウィンクラー,ウェイド
出願日 2008年3月24日 (11年4ヶ月経過) 出願番号 2009-554792
公開日 2010年7月1日 (9年1ヶ月経過) 公開番号 2010-521978
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 窒素含有縮合複素環(3) 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 懸垂物 調整部位 都市用水 機能的要求 誘導構造 調節構造 ダンサ 構造調整
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2010年7月1日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (8)

課題・解決手段

preQ1リボスイッチは、抗生物質および他の小分子療法の標的である。preQ1リボスイッチおよびその一部を使用して、RNA分子ならびに他のエレメントおよび分子の発現または機能を調節することができる。preQ1リボスイッチおよびその一部を、例えば、化合物を同定または検出するための種々の他の方法で使用することができる。化合物を使用して、preQ1リボスイッチを刺激活性化、阻害、および/または不活化することができる。preQ1リボスイッチおよびその一部のみおよび他の核酸と組み合わせて、種々の構築物およびRNA分子で使用することができ、核酸によってコードすることができる。

概要

背景

発明の背景
細胞が種々の遺伝子発現パターンの変化による複数の生化学シグナルおよび環境信号応答しなければならないので、正確な遺伝子調節生物系の本質的特徴である。最も公知の遺伝子調節機構は、化学的または物理的な刺激感知し、その後に関連するDNAまたは伝令RNA配列との選択的相互作用によって遺伝子発現を調整するタンパク質因子の使用を含む。タンパク質は、複合体形状を採用することができ、生物系がその化学的および物理的環境を正確に感知することができる種々の機能を実行する。代謝産物に応答するタンパク質因子は、典型的には、DNAに結合することによって転写開始を調整するか(例えば、lacリプレッサータンパク質;非特許文献1)、RNAに結合することによって転写終結(例えば、PyrRタンパク質;非特許文献2)または翻訳(例えば、TRAPタンパク質;非特許文献3)のいずれかを調節するように作用する。タンパク質因子は、アロステリック調整または翻訳後改変などの種々の機構によって環境刺激に応答し、高応答性遺伝子スイッチとしての機能を果たすためにこれらの機能を活用するのに長けている(例えば、非特許文献4を参照のこと)。

遺伝子調節におけるタンパク質因子の広範な関与に加えて、RNAが遺伝子調節で積極的な役割を果たし得ることも公知である。最近の研究により、小さな非コードRNAが破壊のためのmRNA選択的ターゲティングで役割を果たし、それにより、遺伝子発現が下方制御されるという実質的役割が明らかにされ始めている(例えば、非特許文献5およびそのリファレンスを参照のこと)。このRNA干渉過程は、短いRNAがワトソンクリック塩基相補性を介して意図するmRNA標的を選択的に認識する能力を活用し、その後に結合したmRNAをタンパク質作用によって破壊する。新規であるが特異性の高いRNA結合部位を使用してタンパク質因子を生成するよりも進化過程によって新規の標的特異的RNA因子を生成することの方がはるかに容易であるので、RNAはこの系における理想的な分子認識のための作用因子である。

タンパク質が、酵素受容体、および構造機能についての、生物学が有するほとんどの要件を満たすにもかかわらず、RNAはこれらの能力でも役立ち得る。例えば、RNAは、相当な酵素力および正確な分子認識を示す多数のリボザイムドメイン(非特許文献6;非特許文献7)および受容体ドメイン(非特許文献8;非特許文献9)を形成するのに十分な構造可塑性を有する。さらに、これらの活性を組み合わせて、エフェクター分子によって選択的に調整されるアロステリックリボザイム(非特許文献10;非特許文献11)を作製することができる。

細菌リボスイッチRNAは、特定のmRNAの主なコード領域の5’非翻訳領域(5’−UTR)内に主に存在する遺伝子調節エレメントである。構造探索研究(以下でさらに考察)により、リボスイッチエレメントは一般に以下の2つのドメインから構成されることが明らかである:リガンド結合ドメインとしての機能を果たす天然アプタマー(T.Hermann,D.J.Patel,Science 2000,287,820;L.Gold,et al.,Annual Review of Biochemistry 1995,64,763)および遺伝子発現に関与するRNAエレメント(例えば、シャインダルガルノ(SD)エレメント;転写終結ステム)に結びつく発現プラットフォーム」。

概要

preQ1リボスイッチは、抗生物質および他の小分子療法の標的である。preQ1リボスイッチおよびその一部を使用して、RNA分子ならびに他のエレメントおよび分子の発現または機能を調節することができる。preQ1リボスイッチおよびその一部を、例えば、化合物を同定または検出するための種々の他の方法で使用することができる。化合物を使用して、preQ1リボスイッチを刺激、活性化、阻害、および/または不活化することができる。preQ1リボスイッチおよびその一部のみおよび他の核酸と組み合わせて、種々の構築物およびRNA分子で使用することができ、核酸によってコードすることができる。

目的

コンセンサスリボスイッチを使用して、どのリボスイッチ部分がin vitro選択および進化のために変化するかについての情報を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

コード領域に作動可能に連結されたpreQ1応答性リボスイッチを含むRNAをコードする核酸分子を含む調節可能な遺伝子発現構築物であって、該リボスイッチが該RNAの発現を調節し、該リボスイッチおよび該コード領域が非相同である、構築物。

請求項2

前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項1に記載の構築物。

請求項3

前記リボスイッチが2つ以上のアプタマードメインおよび1つの発現プラットフォームドメインを含み、少なくとも1つの該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項1に記載の構築物。

請求項4

少なくとも2つの前記アプタマードメインが協同的結合を示す、請求項3に記載の構築物。

請求項5

天然に存在するpreQ1応答性リボスイッチの非天然誘導体である、リボスイッチ。

請求項6

前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが非相同である、請求項5に記載のリボスイッチ。

請求項7

前記リボスイッチが1つまたは複数のさらなるアプタマードメインをさらに含む、請求項6に記載のリボスイッチ。

請求項8

少なくとも2つの前記アプタマードメインが協同的結合を示す、請求項7に記載のリボスイッチ。

請求項9

前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化され、該トリガー分子によって活性化された場合に該リボスイッチがシグナルを生成する、請求項5に記載のリボスイッチ。

請求項10

目的の化合物を検出する方法であって、サンプルをリボスイッチと接触させる工程を含み、該リボスイッチが該目的の化合物によって活性化され、該目的の化合物によって活性化された場合に該リボスイッチがシグナルを生成し、該サンプルが該目的の化合物を含む場合に該リボスイッチがシグナルを生成し、該リボスイッチがpreQ1応答性リボスイッチまたはpreQ1応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法。

請求項11

前記目的の化合物によって活性化された場合に前記リボスイッチが高次構造を変化させ、該高次構造の変化によって高次構造依存性標識を介してシグナルが生成される、請求項10に記載の方法。

請求項12

前記目的の化合物によって活性化された場合に前記リボスイッチが高次構造を変化させ、該高次構造の変化によって該リボスイッチに連結したRNAの発現が変化し、該発現の変化によってシグナルを生成する、請求項10に記載の方法。

請求項13

前記シグナルが、前記リボスイッチに連結した前記RNAから発現したレポータータンパク質によって生成される、請求項12に記載の方法。

請求項14

(a)リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験する工程であって、該阻害が該リボスイッチを介し、該リボスイッチがpreQ1応答性リボスイッチまたはpreQ1応答性リボスイッチの誘導体を含む、試験する工程、(b)工程(a)で遺伝子発現を阻害した化合物と細胞との接触によって遺伝子発現を阻害する工程であって、該細胞がリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、該化合物が該リボスイッチへの結合によって該遺伝子の発現を阻害する、阻害工程を含む、方法。

請求項15

preQ1応答性リボスイッチを同定する方法であって、該方法が、preQ1の存在下および非存在下でのRNA分子インライン自発切断(in−linespontaneouscleavage)を評価する工程であって、該RNA分子が該preQ1によって調節される遺伝子によってコードされ、該RNA分子のインライン自発切断パターンの変化が該preQ1応答性リボスイッチを示す、工程を含む、方法。

請求項16

遺伝子発現を阻害する方法であって、(a)化合物を細胞と接触させる工程を含み、(b)該化合物が式I:(式中、R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体である)の構造を有し、該細胞がpreQ1応答性リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、該化合物が、該preQ1応答性リボスイッチへの結合によって該遺伝子の発現を阻害する、方法。

請求項17

前記細胞が遺伝子発現の阻害が必要であると同定されている、請求項16に記載の方法。

請求項18

前記細胞が細菌細胞である、請求項16に記載の方法。

請求項19

前記化合物が前記細菌細胞を死滅させるか前記細菌細胞の増殖を阻害する、請求項18に記載の方法。

請求項20

前記化合物および前記細胞が被験体への該化合物の投与によって接触する、請求項16に記載の方法。

請求項21

前記細胞が前記被験体中の細菌細胞であり、前記化合物が該細菌細胞を死滅させるか該細菌細胞の増殖を阻害する、請求項20に記載の方法。

請求項22

前記被験体が細菌感染を有する、請求項21に記載の方法。

請求項23

前記細胞がpreQ1応答性リボスイッチを含む、請求項22に記載の方法。

請求項24

前記化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与する、請求項16に記載の方法。

請求項25

前記化合物がバイオフィルム中の細菌増殖を阻害する、請求項16に記載の方法。

請求項26

preQ1の産生方法であって、該方法は、(a)該preQ1を産生することができる変異細菌細胞を培養する工程であって、該変異細菌細胞が前記preQ1リボスイッチの変異を含み、該変異を持たない細胞と比較して、該変異が、該変異細菌細胞による該preQ1産生を増加させる、培養工程、(b)該細胞培養物から該preQ1を単離し、それにより、該preQ1を産生する工程、を含む、方法。

請求項27

前記preQ1リボスイッチの前記変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、前記preQ1産生量が少なくとも10%増加する、請求項26に記載の方法。

請求項28

前記preQ1リボスイッチの前記変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、前記preQ1産生量が少なくとも10%増加する、請求項26に記載の方法。

請求項29

前記preQ1リボスイッチの前記変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、前記preQ1産生量が少なくとも25%増加する、請求項26に記載の方法。

請求項30

前記preQ1リボスイッチの前記変異がノックアウト変異である、請求項26に記載の方法。

請求項31

preQ1リボスイッチの変異を含む細菌細胞であって、該変異を持たない細胞と比較した場合に、該変異が、該変異を含む細胞によるpreQ1産生を測定可能な程度に増加させる、細菌細胞。

請求項32

細菌細胞増殖を阻害する方法であって、該方法は、該細胞をpreQ1応答性リボスイッチに結合する化合物と接触させる工程であって、該細胞がpreQ1応答性リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、該化合物が該preQ1応答性リボスイッチへの結合によって該細菌細胞増殖を阻害し、それにより、preQ1産生が制限される、工程を含む方法。

請求項33

前記化合物と接触しない細胞と比較して、細菌細胞増殖が少なくとも10%減少する、請求項32に記載の方法。

請求項34

被験体への前記化合物の投与によって、該化合物および前記細胞を接触させる、請求項32に記載の方法。

請求項35

前記細胞が前記被験体中の細菌細胞であり、前記化合物が該細菌細胞を死滅させるか該細菌細胞の増殖を阻害する、請求項33に記載の方法。

請求項36

前記被験体が細菌感染を有する、請求項33に記載の方法。

請求項37

前記化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与する、請求項32に記載の方法。

請求項38

サンプル中のpreQ1を検出する方法であって、該方法は、a.preQ1応答性リボスイッチを該サンプルと接触させる工程、およびb.該preQ1と該preQ1応答性リボスイッチとの間の相互作用を検出する工程であって、該preQ1と該preQ1応答性リボスイッチとの間の相互作用が該preQ1の存在を示す、検出工程、を含む、方法。

請求項39

前記preQ1応答性リボスイッチを標識する、請求項38に記載の方法。

請求項40

遺伝子の遺伝子発現の阻害について化合物を試験することによって該遺伝子の該遺伝子発現を阻害する該化合物として同定された該化合物と細胞との接触によってリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子の遺伝子発現を阻害する工程を含む方法であって、該阻害が該リボスイッチを介し、該リボスイッチがpreQ1応答性リボスイッチまたはpreQ1応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法。

技術分野

0001

(関連する出願の相互参照
本出願は、2007年3月22日に出願された米国仮特許出願第60/919,410号の利益を主張する。2007年3月22日に出願された米国仮特許出願第60/919,410号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

0002

連邦政府の後援による研究に係る陳述)
本発明は、NIHによって授与された補助金番号R33DK07027およびGM068819、ならびにNSFによって授与された補助金番号EIA0323510のもと、政府の支持を受けなされた。政府は本発明に対し確実な権利を保有する。

0003

発明の分野
本開示の発明は、一般に、遺伝子発現分野、具体的には、遺伝子発現の調節領域に関する。

背景技術

0004

発明の背景
細胞が種々の遺伝子発現パターンの変化による複数の生化学シグナルおよび環境信号応答しなければならないので、正確な遺伝子調節生物系の本質的特徴である。最も公知の遺伝子調節機構は、化学的または物理的な刺激感知し、その後に関連するDNAまたは伝令RNA配列との選択的相互作用によって遺伝子発現を調整するタンパク質因子の使用を含む。タンパク質は、複合体形状を採用することができ、生物系がその化学的および物理的環境を正確に感知することができる種々の機能を実行する。代謝産物に応答するタンパク質因子は、典型的には、DNAに結合することによって転写開始を調整するか(例えば、lacリプレッサータンパク質;非特許文献1)、RNAに結合することによって転写終結(例えば、PyrRタンパク質;非特許文献2)または翻訳(例えば、TRAPタンパク質;非特許文献3)のいずれかを調節するように作用する。タンパク質因子は、アロステリック調整または翻訳後改変などの種々の機構によって環境刺激に応答し、高応答性遺伝子スイッチとしての機能を果たすためにこれらの機能を活用するのに長けている(例えば、非特許文献4を参照のこと)。

0005

遺伝子調節におけるタンパク質因子の広範な関与に加えて、RNAが遺伝子調節で積極的な役割を果たし得ることも公知である。最近の研究により、小さな非コードRNAが破壊のためのmRNA選択的ターゲティングで役割を果たし、それにより、遺伝子発現が下方制御されるという実質的役割が明らかにされ始めている(例えば、非特許文献5およびそのリファレンスを参照のこと)。このRNA干渉過程は、短いRNAがワトソンクリック塩基相補性を介して意図するmRNA標的を選択的に認識する能力を活用し、その後に結合したmRNAをタンパク質作用によって破壊する。新規であるが特異性の高いRNA結合部位を使用してタンパク質因子を生成するよりも進化過程によって新規の標的特異的RNA因子を生成することの方がはるかに容易であるので、RNAはこの系における理想的な分子認識のための作用因子である。

0006

タンパク質が、酵素受容体、および構造機能についての、生物学が有するほとんどの要件を満たすにもかかわらず、RNAはこれらの能力でも役立ち得る。例えば、RNAは、相当な酵素力および正確な分子認識を示す多数のリボザイムドメイン(非特許文献6;非特許文献7)および受容体ドメイン(非特許文献8;非特許文献9)を形成するのに十分な構造可塑性を有する。さらに、これらの活性を組み合わせて、エフェクター分子によって選択的に調整されるアロステリックリボザイム(非特許文献10;非特許文献11)を作製することができる。

0007

細菌リボスイッチRNAは、特定のmRNAの主なコード領域の5’非翻訳領域(5’−UTR)内に主に存在する遺伝子調節エレメントである。構造探索研究(以下でさらに考察)により、リボスイッチエレメントは一般に以下の2つのドメインから構成されることが明らかである:リガンド結合ドメインとしての機能を果たす天然アプタマー(T.Hermann,D.J.Patel,Science 2000,287,820;L.Gold,et al.,Annual Review of Biochemistry 1995,64,763)および遺伝子発現に関与するRNAエレメント(例えば、シャインダルガルノ(SD)エレメント;転写終結ステム)に結びつく発現プラットフォーム」。

先行技術

0008

Matthews,K.S.,and Nichols,J.C.,1998,Prog.Nucleic AcidsRes.Mol.Biol.58,127−164
Switzer,R.L.,et al.,1999,Prog.Nucleic Acids Res.Mol.Biol.62,329−367
Babitzke,P.,and Gollnick,P.,2001,J.Bacteriol.183,5795−5802
Ptashne,M.,and Gann,A.(2002).Genes and Signals.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY
Hannon,G.J.2002,Nature 418,244−251
The RNA World R.F.Gesteland,T.R.Cech,J.F.Atkins,eds.,pp.321−350(1998)のCech & Golden,Building a catalytic active site using only RNA.
Breaker,In vitro selection of catalytic polynucleotides.Chem.Rev.97,371−390(1997)
Osborne & Ellington,Nucleic acid selection and the challenge of combinatorial chemistry.Chem.Rev.97,349−370(1997)
Hermann & Patel,Adaptive recognition by nucleic acid aptamers.Science 287,820−825(2000)
Soukup & Breaker,Engineering precision RNA molecular switches.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,3584−3589(1999)
Seetharaman et al.,Immobilized riboswitches for the analysis of complex chemical and biological mixtures.Nature Biotechnol.19,336−341(2001)

発明が解決しようとする課題

0009

preQ1リボスイッチを調節するために使用することができる方法および組成物ならびに機能的preQ1リボスイッチが必要である。

課題を解決するための手段

0010

コード領域に作動可能に連結されたpreQ1応答性リボスイッチを含むRNAをコードする核酸分子を含む調節可能な遺伝子発現構築物であって、リボスイッチがRNAの発現を調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同である、構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。リボスイッチは2つ以上のアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、少なくとも1つのアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。少なくとも2つのアプタマードメインは協同的結合を示すことができる。

0011

天然に存在するpreQ1応答性リボスイッチの非天然誘導体であるリボスイッチも、本明細書中に開示する。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。リボスイッチは1つまたは複数のさらなるアプタマードメインをさらに含むことができる。少なくとも2つのアプタマードメインは協同的結合を示すことができる。リボスイッチをトリガー分子によって活性化することができ、トリガー分子によって活性化された場合にリボスイッチはシグナルを生成する。

0012

目的の化合物を検出する方法であって、サンプルをリボスイッチと接触させる工程を含み、リボスイッチが目的の化合物によって活性化され、目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチがシグナルを生成し、サンプルが目的の化合物を含む場合にリボスイッチがシグナルを生成し、リボスイッチがpreQ1応答性リボスイッチまたはpreQ1応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法をさらに開示する。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチは高次構造(conformation)を変化させることができ、高次構造の変化によって高次構造依存性標識を介してシグナルが生成される。目的の化合物によって活性化された場合にリボスイッチは高次構造を変化させることもでき、高次構造の変化によってリボスイッチに連結したRNAの発現が変化し、発現の変化によってシグナルを生成する。シグナルを、リボスイッチに連結したRNAから発現したレポータータンパク質によって生成することができる。

0013

(a)リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子の遺伝子発現阻害について化合物を試験する工程であって、阻害がリボスイッチを介し、リボスイッチがpreQ1応答性リボスイッチまたはpreQ1応答性リボスイッチの誘導体を含む、試験工程、(b)工程(a)で遺伝子発現を阻害した化合物と細胞との接触によって遺伝子発現を阻害する工程であって、細胞がリボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、化合物がリボスイッチへの結合によって遺伝子発現を阻害する、阻害工程を含む方法も開示する。

0014

preQ1応答性リボスイッチを同定する方法であって、preQ1の存在下および非存在下でのRNA分子インライン自発切断(in−line spontaneous cleavage)を評価する工程であって、RNA分子がpreQ1によって調節される遺伝子によってコードされ、RNA分子のインライン自発切断パターンの変化がpreQ1応答性リボスイッチを示す、評価工程を含む方法を開示する。

0015

遺伝子発現を阻害する方法であって、化合物を細胞と接触させる工程を含み、前記化合物が式I:

0016

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体である)
の構造を有し、細胞がpreQ1応答性リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、化合物が、preQ1応答性リボスイッチへの結合によって遺伝子発現を阻害する、方法も開示する。

0017

化合物は、式II:

0018

(式中、R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、C−水素結合供与体、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり得、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであり、
R2は存在せず、
R3はNH2であり、
R4は存在しない)の構造を有することができる。

0019

化合物は、式II:

0020

(式中、R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R3はNH2であり、
R4は存在しない)の構造を有することができる。

0021

化合物は、式II:

0022

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は存在せず、
R3は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R4は存在しない)の構造を有することができる。

0023

化合物は、式II:

0024

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は存在せず、
R3はNH2であり、
R4は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない)の構造を有することができる。

0025

化合物は、式II:

0026

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は存在せず、
R3は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R4は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない)の構造を有することができる。

0027

化合物は、式II:

0028

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R3はNH2であり、
R4は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない)の構造を有することができる。

0029

化合物は、式II:

0030

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R3は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R4は存在しない)の構造を有することができる。

0031

化合物は、式II:

0032

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R3は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R4は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない)の構造を有することができる。

0033

細胞を、遺伝子発現阻害に必要であると同定することができる。細胞は細菌細胞であり得る。化合物は、細菌細胞を死滅させるか細菌細胞の増殖を阻害することができる。化合物および細胞を、被験体への化合物の投与によって接触させることができる。細胞は被験体中の細菌細胞であり得、その中で化合物は細菌細胞を死滅させるか細菌細胞の増殖を阻害する。被験体は細菌感染を有し得る。細胞はpreQ1応答性リボスイッチを含むことができる。化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与することができる。化合物はバイオフィルム中の細菌増殖を阻害することができる。

0034

preQ1の産生方法であって、preQ1を産生することができる変異細菌細胞を培養する工程であって、変異細菌細胞がpreQ1リボスイッチの変異を含み、変異が変異を持たない細胞と比較して変異細菌細胞によってpreQ1産生を増加させる、培養工程、および細胞培養物からpreQ1を単離し、それにより、preQ1を産生する工程を含む、方法も開示する。
本方法により、preQ1リボスイッチの変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、preQ1産生を少なくとも10%増加させることができる。本方法により、preQ1リボスイッチの変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、preQ1産生を少なくとも10%増加させることができる。本方法により、preQ1リボスイッチの変異を含まない細菌細胞の培養と比較して、preQ1産生を少なくとも25%増加させることができる。preQ1リボスイッチの変異はノックアウト変異を含むことができる。

0035

preQ1リボスイッチの変異を含む細菌細胞であって、変異により、変異を持たない細胞と比較した場合にその細胞によるpreQ1産生が測定可能な程度に増加する、細菌細胞をさらに開示する。

0036

細菌細胞増殖を阻害する方法も開示するが該方法は、細胞をpreQ1応答性リボスイッチに結合する化合物と接触させる工程であって、細胞がpreQ1応答性リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、化合物がpreQ1応答性リボスイッチへの結合によって細菌細胞増殖を阻害し、それにより、preQ1産生が制限される、接触工程を含む方法である。本方法により、化合物と接触しない細胞と比較して、細菌細胞増殖を少なくとも10%減少させることができる。化合物および細胞を、被験体への化合物の投与によって接触させることができる。細胞が被験体中の細菌細胞であり得、その中で化合物が細菌細胞を死滅させるか細菌細胞の増殖を阻害する。被験体は細菌感染を有し得る。化合物を別の抗菌化合物と組み合わせて投与することができる。

0037

サンプル中のpreQ1を検出する方法を開示するが該方法は、preQ1応答性リボスイッチをサンプルと接触させる工程、およびpreQ1とpreQ1応答性リボスイッチとの間の相互作用を検出する工程を含み、該preQ1とpreQ1応答性リボスイッチとの間の相互作用がpreQ1の存在を示す、方法である。preQ1応答性リボスイッチを標識することができる。

0038

化合物(遺伝子における遺伝子発現の阻害のための化合物を試験することにより、遺伝子における遺伝子発現を阻害する化合物として同定された)と細胞とを接触させることによって遺伝子(リボスイッチを含むRNAをコードする)における遺伝子発現を阻害する工程を含む方法も開示するが、該方法は、該阻害がリボスイッチを介するものであって、該リボスイッチがpreQ1応答性リボスイッチまたはpreQ1応答性リボスイッチの誘導体を含む、方法である。

0039

開示の方法および組成物のさらなる利点を以下の記載に一部示し、この記載から利点が一部理解される。あるいは、利点を、開示の方法および組成物の実施によって知ることができる。開示の方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘した要素および組み合わせによって理解および達成される。上記の一般的記載および以下の詳細な記載の両方は例示および説明のみであり、特許請求の範囲に記載の本発明を制限するものではないと理解すべきである。

0040

本明細書中に組み込まれ、且つ本明細書の一部を構成する添付の図面は、開示の方法および組成物のいくつかの実施形態を例示し、記載と共に、開示の方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。

図面の簡単な説明

0041

図1は、preQ1生合成に関与する真正細菌遺伝子の5’UTR中に存在する保存配列を示す(配列番号5〜42)。各型内で95%超(上の例)および80%超(下の例)保存されているヌクレオチドを、コンセンサス行(consensus row)中に示す(R=A、G;Y=C、U)。構造行中の角括弧で示した領域は、潜在的な二次構造エレメントP0(薄い影)およびP1(濃い影)に寄与する相補配列を示す。遺伝子を、元の配列ファイル由来遺伝子座タグによって示す。生物の略称:(Ban)Bacillus anthracis;(Bce)Bacillus cereus;(Bha)Bacillus halodurans;(Bsu)Bacillus subtilis;(Cac)Clostridium acetobutylicum;(Cpe)Clostridium perfringens;(Cte)Clostridium tetani;(Efa)Enterococcus faecalis;(Efm)Enterococcus faecium;(Exi)Exiguobacterium sp.;(Fnu)Fusobacterium nucleatum;(Gka)Geobacillus kaustophilus;(Hin)Haemophilus influenzae;(Lin)Listeria innocua;(Lme)Leuconostoc mesenteroides;(Lpl)Lactobacillus plantarum;(Nme1)Neisseria meningitidis MC58;(Nme2)Neisseria meningitidis Z2491;(Oih)Oceanobacillus iheyensis;(Pmu)Pasteurella multocida;(Sau)Staphylococcus aureus;(Sep)Staphylococcus epidermidis;(Sag)Streptococcus agalactiae;(Tte)Thermoanaerobacter tengcongensis;(Env)Environmental sequence IBEA_CTG_2157609。
図2は、真正細菌におけるキューシン(queuosine)生合成を示す。Q産生に関与することが公知の酵素を、各段階で必要な補因子括弧内)と共に示す。対応する特異的酵素が依然として同定されないままである転換物を疑問符で示す。
B.subtilis queCDEFmRNAの5’UTRは、preQ1に応答して構造調整を受ける。(a)preQ1生合成遺伝子に関連した各保存ドメイン型に対応する一次および二次構造のコンセンサスモデル(配列番号43、44、および45)。灰色および黒色のヌクレオチドは、図1中に示す例的配列の間でそれぞれ95%以上および80%以上保存されている。ヌクレオチド数がわずかに変化し得る保存性のより低い領域を、円または太線で示す。保存性のより低い位置(ステムエレメントと推定)を灰色で示す。RはAまたはGを示し、YはCまたはUを示す。(b)106 queC(予想されるアプタマーおよびターミネーター構造を含むB.subtilis queC 5’UTRの一部)の配列および二次構造モデル(配列番号45)。preQ1の存在に応答するかpreQ1の存在と無関係の自発的RNA切断部位をモデル上に重ねており、自発的RNA切断部位は、cの構造探索分析に由来するものである。ヌクレオチド106とAUG開始コドンとの間に106個のヌクレオチドが存在する。矢じり形(arrowhead)は、cで認められる最短の5’32P標識フラグメントに対応する切断部位を示す。5’末端グアノシル残基は非天然であり、T7RNAポリメラーゼを使用してin vitroでの転写を容易にするために導入した。配列番号45のヌクレオチド16〜27、31〜38、57、58、67、77〜81、83、および93〜95について一定の切断が認められた。配列番号45のヌクレオチド50〜53、59、60、70、71、および74〜76について切断の減少が認められた。配列番号45のヌクレオチド55および56に切断の増加が認められた。(c)106 queC RNAのインライン探索分析により、preQ1の存在下で誘導される鎖切断の増加および減少部位が明らかとなる(矢じり形)。1μMまたは10μM preQ1の非存在下(−)または存在下でのインキュベーション由来の自発的RNA切断産物を、変性10%PAGEによって分離した。(NR)反応なし;(T1)RNアーゼT1での部分消化物;(−OH)アルカリ部分消化物;(Pre)前駆体RNA。T1レーン中の選択されたバンドを、3’末端グアノシル残基の位置にしたがって示す。
図4は、B.subtilis queC 5’UTR由来のpreQ1結合RNAによる分子識別を示す。(a)106queCと比較して系統発生的に保存された配列および構造エレメントのみを含むように短縮された52 queCRNA構築物の二次構造モデル(配列番号46)。2つの5’末端グアノシンヌクレオチドは、T7 RNAポリメラーゼを使用してin vitroでの転写を容易にするために導入された非天然残基である。(b)preQ1およびpreQ0の化学構造ならびに52queCを使用して得たそれぞれの見かけのKd値。影付きの領域は、preQ1と比較した化学構造の相違するところを示す。preQ1構造上の選択した環原子に番号を付けている。(c)preQ1関連化合物の化学構造。対応する見かけのKd値は52queCを使用して得、2,6−ジアミノプリンおよびアデニンの場合はより長い構築物80queCを使用した(図6aを参照のこと)。白抜きの円は、表示よりも高い可能性が高い見かけのKdを示す(300μMを超える濃度は、本分析において日常的に試験しなかった)。(d)平衡透析実験で使用した装置は、5000ダルトン分子量カットオフ(MWCO)を有する透過性膜によって分けられる2つのチャンバを含んでいた。3H−グアニンおよび106queC RNAの各チャンバへの添加(上)により、RNAチャンバ中のその保持によって標識グアニン分布シフトする(右下)。対照的に、リガンド結合RNAが存在しないか、非標識競合リガンドが過剰に存在する場合に、2つのチャンバ間の3H−グアニンの均一な分布(左下)が予想される。(e)一定の関連するプリンは、モル過剰で添加した場合、106queC RNA結合に関し3H−グアニンと競合する。RNAチャンバ内における3H−グアニン隔離量を、この区画分配する総添加トリチウムに対する割合として示す。したがって、106queC RNAの非存在下または過剰な非標識競合物の存在下で起こるように、3H−グアニンが2チャンバ間に等しく分布している場合、0.5という値が予想される。逆に、非標識競合物の非存在下での平衡透析またはアッセイ条件下(100nM 3H−グアニン、20μM RNA、60μM非標識アナログ)で競合物として機能しない非標識プリンの存在下での平衡透析から得られるように、RNAチャンバ中で3H−グアニンが保持される場合、1.0に近ずく値が予想される。G、グアニン;preQ1、7−アミノメチル−7−デアザグアニン;A、アデニン;7dG、7−デアザグアニン。
図5は、preQ1の結合に必要な最小のアプタマー配列の決定を示す。(a)P0ステム−ループ欠失した36queC構築物の二次構造モデル(配列番号47)。円で囲んだヌクレオチドは、36queCおよび長さが順次より短くなった2つの派生的欠失構築物の3’末端を示す。輪郭で示した残基は、その後のパネルで分析したリガンド誘導構造調整部位を示す。(b)インライン探索分析により、36queCの3’末端付近の保存配列がpreQ1誘導構造調整に必要であることが明らかとなる。構築物を、10μM preQ1の非存在下(−)または存在下(+)でインキュベートした。他の詳細および注釈を、図3cの説明文に記載する。(c)漸増濃度のpreQ1の存在下での36queC RNAのインキュベーションにより、部位1における自発的切断ベルが減少し、部位2における自発的切断レベルが増加する。(d)preQ1濃度との関係において部位1および部位2において切断されたRNA(c中)の正規化した比を示すグラフ
図6は、preQ1とアプタマーの保存シチジル残基との間のワトソン−クリック対合相互作用の証明を示す。(a)80queCおよび2つの変異体M1およびM2 の二次構造モデル(配列番号48)。2つの5’末端グアノシンヌクレオチドは非天然であり、in vitroでの転写を容易にするために導入した。(b)80queC RNA(WT)、M1およびM2のインライン探索分析。各構築物を、エフェクターの非存在下(−)およびそれぞれ1μM preQ1(Q1)、200μMグアニン(G)、200μM 2,6−ジアミノプリン(D)、および200μMアデニン(A)と共にインキュベートした。他の詳細および注釈を、図3cの説明文に記載する。(c)80queCリガンド選択性の推定決定要因としてのpreQ1のC34とのワトソン−クリック塩基対合野生型80queCのC34とpreQ1との間(影付きのバックグラウンド)またはM1構築物のU34と各プリン化合物(b中で試験した)との間の提示した塩基対合相互作用を示す。
図7は、in vivoでの遺伝子調節に及ぼす改変preQ1リボスイッチの影響を示す。(a)レポーター遺伝子発現分アッセイで使用したpreQ1リボスイッチ構築物に対応する配列(配列番号49)。(b)B.subtilis queC由来の野生型リボスイッチおよび変異誘導体M3〜M9によるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子発現の調節。エラーバーは、3つの独立した分析の標準偏差である。
図8は、preQ1リボスイッチの位置および関連遺伝子を示す。GenBankレコードアクセッション番号およびヌクレオチドの位置は配列アラインメント中の各リボスイッチエレメントとして示す(図1)。各リボスイッチエレメントの下流の予想される遺伝子またはオペロンを、遺伝子座タグによって示し、一般的タンパク質機能のCOGデータベース割り当ても示す。preQ1レギュロン中のほとんどの遺伝子に対応する正確な分子機能は、現在知られていない。queCDEFオペロンの遺伝子は、Q生合成に関与しているが(Reader 2004;Gaur 2005;Van Lanen 2005)、QueFによって触媒される特異的な化学的工程が実験的に決定されている(Van Lanen 2005)。

0042

発明の詳細な説明
以下の特定の実施形態の詳細な記載およびそこに含まれる実施例、ならびに添付の図面および前および後の記載を参照して、開示の方法および組成物をより容易に理解することができる。

0043

伝令RNAは、典型的には、タンパク質または小さなRNA調節因子によって、および翻訳過程の間のリボゾームによって作用する遺伝子情報受動的キャリアと考えられている。一定のmRNAが天然のアプタマードメインを保有し、これらのRNAドメインへの特異的代謝産物の直接結合によって遺伝子発現が調整されることが発見された。天然リボスイッチは、典型的には天然RNAと関連しない2つの驚くべき機能を示す。第1に、mRNAエレメントは異なる構造状態を採用することができ、一方の構造は、その標的代謝産物の正確な結合ポケットとしての機能を果たす。第2に、構造状態間の代謝産物誘導性アロステリック相互交換により、いくつかの異なる機構のうちの1つによって遺伝子発現レベルが変化する。リボスイッチを、典型的には、以下の2つの個別のドメインに分けることができる:1つは標的に選択的に結合するドメイン(アプタマードメイン)および他方は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン(発現プラットフォーム)。これらの2ドメイン間の動的相互作用により遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節される。

0044

異なるクラスのリボスイッチが同定されており、活性化化合物(本明細書中でトリガー分子と呼ぶ)を選択的に認識することが示されている。例えば、補酵素B12、グリシンチアミンピロリン酸TPP)、およびフラビンモノヌクレオチドFMN)は、これらの化合物の代謝経路または輸送経路における重要な酵素をコードする遺伝子中に存在するリボスイッチを活性化する。各リボスイッチクラスのアプタマードメインは、高度に保存されたコンセンサス配列および構造に適合する。したがって、配列相同性検索を使用して、関連するリボスイッチドメインを同定することができる。リボスイッチドメインは、細菌、古細菌、および真核生物由来の種々の生物で発見されている。

0045

A.リボスイッチRNAの一般的構成
細菌リボスイッチRNAは、特定のmRNAの主なコード領域の5’非翻訳領域(5’−UTR)内に主に存在する遺伝子調節エレメントである。構造探索研究(以下でさらに考察)により、リボスイッチエレメントは一般に以下の2つのドメインから構成されることが明らかである:リガンド結合ドメインとしての機能を果たす天然のアプタマー(T.Hermann,D.J.Patel,Science 2000,287,820;L.Gold,et al.,Annual Review of Biochemistry 1995,64,763)および遺伝子発現に関与するRNAエレメント(例えば、シャイン−ダルガルノ(SD)エレメント;転写終結ステム)を妨害する「発現プラットフォーム」である。in vitroで合成したアプタマードメインが発現プラットフォームの非存在下で適切なリガンドに結合するという観察から、これらの結論を導いている(米国特許出願公開第2005−0053951号の実施例2、3、および6を参照のこと)。さらに、構造探索調査により、ほとんどのリボスイッチのアプタマードメインが個別に試験した場合に特定の二次構造および三次構造の折り畳みを採用し、全5’リーダーRNAの関係において試験した場合にアプタマー構造と本質的に同一であることが示唆される。これは、多くの場合、アプタマードメインが発現プラットフォームと無関係に折り畳まれるモジュラー単位であることを示す(米国特許出願公開第2005−0053951号の実施例2、3、および6を参照のこと)。

0046

最終的に、アプタマードメインのリガンド結合状態または非結合状態は発現プラットフォームを介して解釈され、それは遺伝子発現の際に影響を及ぼす。モジュラーエレメントとしてのリボスイッチの投影は、アプタマードメインが種々の生物の間(およびTPPリボスイッチについて認められるように、界の間でさえも)で高度に保存されるのに対して(N.Sudarsan,et al.,RNA 2003,9,644)、発現プラットフォームは、付加された読み取り枠(open reading flame)の発現が調節される配列、構造、および機構で変化するという事実によってさらに支持される。例えば、B.subtilisのtenAmRNAのTPPリボスイッチへのリガンド結合によって転写が終結する(A.S.Mironov,et al., Cell 2002,111,747)。この発現プラットフォームは、E.coli由来のthiM mRNA中のTPPリボスイッチの発現プラットフォームと比較して配列および構造が異なり、TPP結合はSD遮断機構によって翻訳を阻害する(米国特許出願公開第2005−0053951号の実施例2を参照のこと)。TPPアプタマードメインは容易に認識可能であり、これらの2つの転写単位の間で機能的特徴がほぼ同一であるが、これらを実施する遺伝子調節機構および発現プラットフォームは非常に異なる。

0047

リボスイッチRNAのアプタマードメインは、典型的には、約70〜170nt長の範囲である(米国特許出願公開第2005−0053951号の図11)。in vitro進化実験でかなりより短く構造が複雑である多種多様な小分子結合アプタマーが同定されたことを考慮すると、この観察はいくらか予想外であった(T.Hermann,D.J.Patel,Science 2000,287,820;L.Gold,et al.,Annual Review of Biochemistry 1995,64,763;M.Famulok,Current Opinion in Structural Biology 1999,9,324)。人工アプタマーと比較した天然アプタマー配列の複雑さおよび情報量の実質的増加についての理由が依然として証明されていないにもかかわらず、この複雑さは、高い親和性および選択性で機能するRNA受容体を形成するのに必要であるとみられる。リガンド−リボスイッチ複合体の見かけ上のKD値は、低ナノモル(nanomolar)から低マイクロモル(micromolar)までの範囲である。いくつかのアプタマードメインは、追加発現プラットフォームから単離した場合、インタクトなリボスイッチよりも改良された標的リガンドに対する親和性を示す(約10〜100倍)ことも注目に値する(米国特許出願公開第2005−0053951号の実施例2を参照のこと)。おそらく、完全にインタクトなリボスイッチRNAによって必要とされる複数の異なるRNA高次構造のサンプリングにはエネルギーコストがかかり、リガンド親和性喪失が反映される。アプタマードメインは分子スイッチとしての機能を果たさなければならないので、これは、天然のアプタマーに対する機能的要求を付加することもでき、この付加は、そのより精巧な構造を合理化するのに役立ち得る。

0048

B.preQ1リボスイッチ
リボスイッチについてのバイオインフォマテクスベースの研究により、真正細菌中のいくつかの候補モチーフが得られた。これらのモチーフのうちの1つは、一般に、キューオシン(Q)(一定のtRNAアンチコドンゆらぎ位置を占める高改変ヌクレオシド)の生合成に関与する遺伝子の5’非翻訳領域中に存在する。この構造化RNAが7−アミノメチル−7−デアザグアニン(preQ1)(Q生合成の中間体)に選択的なリボスイッチの一部であることを本明細書中に示す。他の天然代謝産物結合RNAと比較して、preQ1アプタマーは、わずか34ヌクレオチドから共に形成される1つのステム−ループおよび短いテール配列からなる簡単な構造を有するものとして現れる。その小さなサイズにもかかわらず、このアプタマーは、in vitroでその同族リガンドに高い選択性を示し、低ナノモル(low nanomolar)範囲でpreQ1に親和性を示す。したがって、比較的小型のRNA構造は、遺伝子発現を調節するための代謝産物受容体として有効に機能を果たすことができる。

0049

典型的には、特定のリボスイッチ候補の小分子標的同一性を、その関連遺伝子の注釈付き機能から推測した。しかし、候補が未知の機能の遺伝子に関連する場合、推定リガンドの評価は容易ではない。この課題を例示する1つの候補(ykvJ)を、91種の微生物ゲノム由来の非コード領域のバイオインフォマティクス調査で同定した(Barrick 2004)。このエレメントはいくつかのFirmicute種で発見され、最も一般的には、B.subtilis ykvJKLMオペロンのホモログに関連し、そのタンパク質産物特徴づけられなかった。さらに、ykvJモチーフの保存された一次および二次構造の特徴はヌクレオチドの異常に短いスパンに制限される一方で、既知のリボスイッチはより広い配列保存およびより精巧な構造を示す。

0050

その後、ykvJKLMオペロンに例される遺伝子ファミリーは、Q(真核生物および細菌中で見出され、Asn、Asp、His、およびTyrに特異的なtRNAのアンチコドンゆらぎ位置を占める高改変ヌクレオチド(Harada 1972))の生合成に関与することが示された(Reader 2004)。このオペロン中の一定の遺伝子(queC,−D,−E,および−Fと改名されている)は、Q前駆体preQ1の産生に特異的に関与する(Van Lanen 2005;Gaur 2005)。次いで、細菌では、preQ1はtRNA−グアニントランスグリコシラーゼTGT)(Okada 1979)によって適切なtRNAに輸送され、in situでさらに改変されて、Q(Reuter 1991)またはアミノアシル化誘導体(Salazar 2004;Blaise 2004)が得られる。queCDEFオペロンの機能を考慮すると、preQ1または関連中間体は、ykvJ(以後queCと呼ぶ)リボスイッチ候補の潜在的リガンドと見なされた。

0051

B.subtilis queCDEFオペロンの5’UTRがin vitroでpreQ1に選択的に結合し、in vivoでレポーター遺伝子の発現を調節することを本明細書中(実施例1)で証明する。他の天然リボスイッチアプタマーと比較してのその異常に小さなサイズにもかかわらず、queCリボスイッチのリガンド結合ドメインはナノモル範囲のpreQ1に対する解離定数(Kd)を示す。また、微生物ゲノムデータベースの検索により、queCモチーフの多数のさらなる例が見出され、これらの例は、この重要な改変核酸塩基の細胞内濃度に応答してその発現を調整することができる広範囲に及ぶレギュロンを定義する。

0052

C.細菌における転写終結のリボスイッチ調節
細菌は、主に、2つの転写終結方法を使用する。一定の遺伝子は、Rhoタンパク質に依存する終結シグナルを組み込む一方で(J.P.Richardson,Biochimica et Biophysica Acta 2002,1577,251)、他の遺伝子は転写延長複合体を脱安定化するためのRho非依存性ターミネーター(内因性ターミネーター)を使用する(I.Gusarov,E.Nudler,Molecular Cell 1999,3,495;E.Nudler,M.E.Gottesman,Genes to Cells 2002,7,755)。後者のRNAエレメントは、GCリッチなステム−ループ、その後の6〜9個のウリジル残基のストレッチから構成される。内因性ターミネーターは、細菌ゲノム全体に広く存在しており(F.Lillo,et al.,2002,18,971)、典型的には、遺伝子またはオペロンの3’末端に存在する。興味深いことに、5’−UTR内に存在する内因性ターミネーターについて多数の例が認められている。

0053

細菌によって使用される広範な種々の遺伝子調節ストラテジーのうち、RNAポリメラーゼが調節様式で5’−UTR内の終結シグナルに応答するクラスの例が多数存在する(T.M.Henkin,Current Opinion in Microbiology 2000,3,149)。一定の条件中に、RNAポリメラーゼ複合体は、外部シグナルによって終結シグナルを認識するか無視するように指示される。転写開始は調節なしで起こり得るにもかかわらず、mRNA合成に対する(および遺伝子発現の)調節は、内因性ターミネーターの調節によって最終的に指図される。推定上、少なくとも2つの相互に排他的なmRNA高次構造の1つにより、転写終結をシグナル伝達するRNA構造が形成または破壊される。トランス活性化因子(いくつかの例ではRNAであり(F.J.Grundy,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2002,99,11121;T.M.Henkin,C.Yanofsky,Bioessays 2002,24,700)、他の例ではタンパク質である(J.Stulke,Archives of Microbiology 2002,177,433))は、一般に、特定の細胞内シグナルの受容およびその後のRNA高次構造の1つの安定化に必要である。リボスイッチは、RNA構造の調整と代謝産物シグナル(遺伝子調節機構によって読みとられる)との間を直接結びつける。

0054

ほとんどの臨床抗菌化合物は、たった4つの細胞過程の1つを標的とする(Wolfson 2006)。細菌は、これらの過程を保護するための十分に発達した耐性機構を有するので(D’Costa 2006)、薬物介入脆弱な新規の標的を発見することが有用である。脆弱な過程の1つの型は、リボスイッチによる遺伝子発現の調節である(Winkler 2005)。一定の細菌mRNAの5’−UTR中に典型的に見出されるので、各公知のリボスイッチクラスのメンバーは、特異的な基本的代謝産物に結合するように進化した構造化された受容体(または「アプタマー」)(Mandal 2004)を形成する。ほとんどの場合、リガンド結合は、結合した代謝産物の合成または輸送に関与する遺伝子または遺伝子群の発現を調節する。リボスイッチによって調節される生化学経路がしばしば細菌生存に不可欠であるので、リボスイッチターゲティングによるこれらの経路の抑制は致命的であり得る。

0055

いくつかの抗菌代謝産物アナログは、リボスイッチのターゲティングによって機能する(Sudarsan 2003;Sudarsan 2005;Woolley 1943)。例えば、抗菌チアミンアナログであるピリチアミン(Woolley 1943)は、チアミンピロリン酸結合リボスイッチのターゲティングによって機能する可能性が最も高い(Sudarsan 2005)。同様に、抗菌リジンアナログであるL−アミノエチルシステイン(Shiota 1958)(AEC、図1b)は、B.subtilis由来のlysCリボスイッチに結合し、lysC調節レポーター遺伝子の発現を抑制する(Sudarsan 2006)。さらに、lysCリボスイッチは、B.subtilis株(Lu 1991)およびEscherichia coli(Patte 1998)株で変異しAEC耐性を示す。

0056

他で特定しない限り、開示の方法および組成物は、特定の合成方法、特定の分析技術、または特定の試薬に制限されず、それ自体、変化することができると理解するべきである。本明細書中で使用した専門用語は特定の実施形態のみを記載することを目的とし、制限することを意図しないとも理解するべきである。

0057

材料
開示の方法および組成物のために使用することができるか、これらと併せて使用することができるか、これらの調製で使用することができるか、または、これらの生成物である、材料、組成物、および成分を開示する。これらおよび他の材料を本明細書中に開示し、特にこれらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などを開示する場合、これらの化合物の種々の個々および集合的組み合わせおよび順列(permutation)のそれぞれに関する特別な言及は明確に開示できず、それぞれ、本明細書中で具体的に意図および記載されると理解される。例えば、リボスイッチまたはアプタマードメインを開示および考察し、多数の分子(リボスイッチまたはアプタマードメインが含まれる)に作製することができる多数の改変物を考察する場合、それとは反対であると具体的に示されない限り、リボスイッチまたはアプタマードメインおよび可能な改変物の各々および全ての組み合わせおよび順列を特に意図する。したがって、分子A、B、およびCのクラスを開示し、ならびに分子D、E、およびFのクラス、および組み合わせ分子の例(A−D)も開示する場合、各々を個別に引用しない場合でさえも、各々を個別または集合的に意図する。したがって、この例では、A−E、A−F、B−D、B−E、B−F、C−D、C−E、およびC−Fの各組み合わせを特に意図し、A、B、およびC;D、E、およびF;ならびに組み合わせ例A−Dの開示から開示されると見なすべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも特に意図および開示される。したがって、例えば、A−E、B−F、およびC−Eの下位集団(sub−group)を特に意図し、A、B、およびC;D、E、およびF;および組み合わせ例A−Dの開示から開示されると見なすべきである。この概念を、本出願の全局面(開示の組成物を作製および使用する方法における工程が含まれるが、これらに限定されない)に適用する。したがって、実施することができる種々のさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程の各々を開示の方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを使用して実施することができ、それぞれのかかる組み合わせが特に意図され、開示されると見なすべきであると理解される。

0058

A.リボスイッチ
リボスイッチは、発現するRNA分子の一部であり、トリガー分子によって結合した場合に状態が変化する発現調節エレメントである。リボスイッチを、典型的には、以下の2つの個別のドメインに分けることができる:1つは標的に選択的に結合するドメイン(アプタマードメイン)および他は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン(発現プラットフォームドメイン)である。遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節されるこれらの2ドメイン間の動的相互作用がもたらされる。単離および組換えリボスイッチ、かかるリボスイッチを含む組換え構築物、かかるリボスイッチに作動可能に連結された非相同配列、かかるリボスイッチを保有する細胞およびトランスジェニック生物、リボスイッチ組換え構築物、ならびに非相同配列に作動可能に連結されたリボスイッチを開示する。非相同配列は、例えば、目的のタンパク質またはペプチド(レポータータンパク質またはペプチドが含まれる)をコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは、天然に存在するリボスイッチ(天然に存在するpreQ1リボスイッチなど)であるか、天然に存在するリボスイッチに由来する。リボスイッチは、人工アプタマーを含むか、任意選択的に排除することができる。例えば、人工アプタマーには、in vitro進化および/またはin vitro選択を介してデザインまたは選択されるアプタマーが含まれる。リボスイッチは、天然に存在するリボスイッチのコンセンサス配列(preQ1リボスイッチのコンセンサス配列など)を含むことができる。preQ1リボスイッチのコンセンサス配列を、図1および図3aに示す。

0059

天然に存在するpreQ1応答性リボスイッチの非天然誘導体であるリボスイッチを開示する。開示のリボスイッチ(その誘導体および組換え形態が含まれる)は、一般に、任意の供給源(天然に存在するリボスイッチおよびde novoでデザインしたリボスイッチが含まれる)に由来し得る。任意のかかるリボスイッチは、開示の方法で使用するか開示の方法と共に使用することができる。しかし、異なるリボスイッチ型を定義することができ、いくつかのかかるサブタイプは、特定の方法で有用であるか、特定の方法と共に有用であり得る(一般に、本明細書中の他所に記載)。リボスイッチ型には、例えば、天然に存在するリボスイッチ、天然に存在するリボスイッチの誘導体および改変形態キメラリボスイッチ、および組換えリボスイッチが含まれる。天然に存在するリボスイッチは、天然で見出されるリボスイッチの配列を有するリボスイッチである。かかる天然に存在するリボスイッチは、天然で起こる天然に存在するリボスイッチの単離形態または組換え形態であり得る。すなわち、リボスイッチは、同一の一次構造を有するが、新規の遺伝子または核酸状況で単離または操作されている。キメラリボスイッチを、例えば、任意のリボスイッチのまたは特定のクラスもしくは型のリボスイッチのリボスイッチの一部および同一のリボスイッチのまたは任意の異なるクラスもしくは型のリボスイッチの異なるリボスイッチの一部;任意のリボスイッチのまたは特定のクラスもしくは型のリボスイッチのリボスイッチの一部および任意の非リボスイッチ配列または成分で構成することができる。組換えリボスイッチは、新規の遺伝子または核酸状況で単離または操作されているリボスイッチである。

0060

リボスイッチは、1つまたは複数のアプタマードメインを有することができる。複数のアプタマードメインを有するリボスイッチ中のアプタマードメインは、トリガー分子の協同的結合を示すことができるか、トリガー分子の協同的結合を示すことができない(すなわち、アプタマーは協同的結合を示す必要がない)。後者の場合、アプタマードメインは、非依存性結合剤であるということができる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、1つまたは複数の発現プラットフォームドメインを有することができる。例えば、トリガー分子の協同的結合を示す2つのアプタマードメインを有するリボスイッチを、両方のアプタマードメインによって調節される1つの発現プラットフォームドメインに連結することができる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、リンカーを介して結合した1つまたは複数のアプタマーを有することができる。かかるアプタマーがトリガー分子の協同的結合を示す場合、リンカーは協同的リンカーであり得る。

0061

xとx−1との間のヒル係数nを有する場合(xは、協同的結合について分析されるアプタマードメイン数(またはアプタマードメイン上の結合部位数)である)、アプタマードメインは協同的結合を示すということができる。したがって、例えば、リボスイッチが2と1との間のヒル係数を有する場合、2つのアプタマードメインを有するリボスイッチ(グリシン応答性リボスイッチなど)は協同的結合を示すということができる。使用した値xが協同的結合について分析したアプタマードメイン数(必ずしもリボスイッチ中のアプタマードメインの存在数ではない)に依存すると理解すべきである。一部のみしか協同的結合を示さない場合にリボスイッチが複数のアプタマードメインを有することができるので、これは理解される。

0062

非相同アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むキメラリボスイッチを開示する。すなわち、キメラリボスイッチは、ある供給源由来のアプタマードメインおよび別の供給源由来の発現プラットフォームドメインから構成される。非相同供給源は、例えば、異なる特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。非相同アプタマーは、非リボスイッチアプタマーにも由来し得る。非相同発現プラットフォームドメインは、非リボスイッチ供給源にも由来し得る。

0063

改変リボスイッチまたは誘導体リボスイッチを、in vitro選択および進化技術を使用して産生することができる。一般に、リボスイッチに適用されるin vitro進化技術は、リボスイッチ配列の一部が変化している一方で、リボスイッチの他の部分が一定に保持されている改変(variant)リボスイッチ組の産生を含む。次いで、改変リボスイッチ組の活性化、非活性化、または遮断(または他の機能的もしくは構造的基準)を評価することができ、目的の基準を満たす改変リボスイッチを使用またはさらなる進化ラウンドのために選択する。改変体生成に有用な基盤リボスイッチは、本明細書中に開示の特異的およびコンセンサスリボスイッチである。コンセンサスリボスイッチを使用して、どのリボスイッチ部分がin vitro選択および進化のために変化するかについての情報を提供することができる。

0064

調節が変化した改変リボスイッチも開示する。リボスイッチの調節を、リボスイッチ(キメラリボスイッチである)の発現プラットフォームドメインへのアプタマードメインの作動可能な連結によって変化させることができる。次いで、アプタマードメインは、例えば、アプタマードメインのためのトリガー分子の作用によってリボスイッチの調節を媒介することができる。アプタマードメインを、任意の適切な様式で(例えば、リボスイッチの通常または天然のアプタマードメインの新規のアプタマードメインとの置換によるものが含まれる)、リボスイッチの発現プラットフォームドメインに作動可能に連結することができる。一般に、アプタマードメインが由来するリボスイッチを活性化、誘導体化、または遮断することができる任意の化合物または条件を使用して、キメラリボスイッチを活性化、誘導体化、または遮断することができる。

0065

不活化リボスイッチも開示する。リボスイッチの共有結合の変化(例えば、リボスイッチの一部の架橋または化合物のリボスイッチへのカップリング)によってリボスイッチを不活化することができる。この様式でのリボスイッチの不活化は、例えば、リボスイッチに対しトリガー分子の結合を防止するか、トリガー分子の結合の際にリボスイッチの状態の変化を防止するか、リボスイッチの発現プラットフォームドメインがトリガー分子の結合の際に発現に影響を及ぼすのを防止する変化に起因し得る。

0066

バイオセンサーリボスイッチも開示する。バイオセンサーリボスイッチは、その同系のトリガー分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する操作リボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチを、閾値レベルまたは閾値レベルを超えるトリガー分子で誘発することができる。バイオセンサーリボスイッチを、in vivoまたはin vitroでの使用のためにデザインすることができる。例えば、シグナルとしての機能を果たすかシグナル産生に関与するタンパク質をコードするレポーターRNAに作動可能に連結されたバイオセンサーリボスイッチを、細胞または生物にリボスイッチ/レポーターRNAをコードする核酸構築物を保有させるように操作することによってin vivoで使用することができる。in vitroで使用するバイオセンサーリボスイッチの例は、高次構造依存性標識(リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル)を含むリボスイッチである。かかるバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチからの或いはそれに由来するアプタマードメインを使用する。バイオセンサーリボスイッチを、種々の状況およびプラットフォームで使用することができる。例えば、バイオセンサーリボスイッチを、固体支持体プレートチップストリップ、およびウェルなど)と共に使用することができる。

0067

新規のトリガー分子を認識する改変リボスイッチまたは誘導体リボスイッチも開示する。新規のトリガー分子を認識する新規のリボスイッチおよび/または新規のアプタマーを、公知のリボスイッチのために選択するか、公知のリボスイッチからデザインするか、公知のリボスイッチから誘導することができる。例えば、リボスイッチ中のアプタマー改変体組を産生する工程、目的の化合物の存在下での改変リボスイッチの活性化を評価する工程、活性化された改変リボスイッチ(または、例えば、最高にまたは最も選択的に活性化されたリボスイッチ)の選択、および所望の活性、特異性、活性と特異性との組み合わせ、または特性の他の組み合わせの改変リボスイッチが得られるまでこれらの工程を繰り返すことによってこれを行うことができる。

0068

一般に、発現プラットフォームドメイン中の調節された鎖をアプタマードメインの調節鎖に相補的であるようにデザインまたは適合させることによって、任意のアプタマードメインを任意の発現プラットフォームドメインと共に使用するために適合させることができる。あるいは、調節鎖が発現プラットフォーム中の機能的に重要な配列に相補的であるように、アプタマーの配列およびアプタマードメインの調節鎖を適合させることができる。例えば、調節鎖とシャインーダルカルノ配列との間のステム構造の形成の際に、SD配列リボソーム利用不可能になり、それにより、翻訳開始が減少または防止されるように、調節鎖をRNAのSD配列に相補的であるように適応させることができる。アプタマー鎖がアプタマードメイン中のP1ステムを形成可能なように配列内に対応する変化を有することに留意のこと。協同的結合を示す複数のアプタマーを有するリボスイッチの場合、活性化アプタマー(発現プラットフォームドメインと相互作用するアプタマー)のP1ステムの1つは、SD配列とステム構造を形成するようにデザインされる必要がある。

0069

別の例として、転写ターミネーターを、RNA分子(RNAの非翻訳領域が最も都合が良い)に付加することができる。ここで、転写ターミネーター配列の一部は、アプタマードメインの調節鎖に相補的である(その配列は調節された鎖である)。これにより、アプタマードメインの調節配列は、アプタマー鎖および調節された鎖と別のステム構造を形成することが可能であり、それにより、リボスイッチの活性化または非活性化の際に転写ターミネーターステムが形成されるか破壊される。任意の他の発現エレメントを、別のステム構造の類似のデザインによってリボスイッチの調節下におくことができる。

0070

リボスイッチによって調節される転写ターミネーターについて、リボスイッチおよび発現プラットフォームエレメントの転写およびスペーシングの速度は、適切な調節に重要であり得る。転写速度を、例えば、ポリメラーゼ休止エレメント(polymerase pausing element)(例えば、一連ウリジン残基)を含めて転写を休止させ、リボスイッチがトリガー分子の形成および感知を可能とすることによって調整することができる。

0071

コード領域に作動可能に連結されたpreQ1応答性リボスイッチを含むRNAをコードする核酸分子を含む調節可能な遺伝子発現構築物であって、リボスイッチがRNAの発現を調節し、リボスイッチおよびコード領域が非相同である、構築物を開示する。リボスイッチはアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは非相同である。リボスイッチは2つ以上のアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインの少なくとも1つは非相同である。少なくとも2つのアプタマードメインは協同的結合を示すことができる。

0072

非相同リボスイッチおよびコード領域を含むRNA分子を開示する。すなわち、かかるRNA分子は、ある供給源由来のリボスイッチおよび別の供給源由来のコード領域から構成される。非相同供給源は、例えば、異なるRNA分子、異なる転写物、異なる遺伝子由来のRNAまたは転写物、異なる細胞由来のRNAまたは転写物、異なる生物由来のRNAまたは転写物、異なる種由来のRNAまたは転写物、天然の配列および人工または操作された配列、特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。

0073

本明細書中に開示する場合、用語「コード領域」は、アミノ酸をコードする核酸の任意の領域をいう。これは、コドンまたはコドンのテンプレートを含む核酸鎖および二本鎖核酸分子の場合のかかる核酸鎖の相補物の両方を含むことができる。コード領域でない核酸領域を、非コード領域ということができる。転写される伝令RNA分子は、典型的には、5’末端および3’末端の両方に非コード領域を含む。真核生物mRNA分子は、イントロンなどの内部非コード領域も含むことができる。いくつかのRNA分子型は、tRNA分子およびrRNA分子などの機能的コード領域を含まない。非コードRNA分子と呼ぶことができる機能的コード領域を含まないRNA分子の発現を、開示のリボスイッチによって調節または影響を及ぼすこともできる。したがって、開示のリボスイッチを、コード領域へのリボスイッチの作動可能な連結について本明細書中に開示の任意の様式で非コードRNA分子に作動可能に連結することができる。コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むRNAの調節について本明細書中に開示のように、リボスイッチはかかるRNAの発現を調節することができる。任意の核酸分子の機能を、開示のリボスイッチによって調節または影響を及ぼすこともできる。例には、RNA、DNA、人工核酸ペプチド核酸(PNA)、モルホリノおよびロックド核酸(LNA)、ならびにグリコール核酸(GNA)およびトレオース核酸(TNA)が含まれる)が含まれるが、これらに限定されない。開示の方法では、リボスイッチは、例えば、コード領域の発現、コードされたタンパク質の発現、非コードRNA分子の発現、RNAまたはコード領域の転写、またはコードされたタンパク質の翻訳を調節することができる。

0074

1.アプタマードメイン
アプタマーは、特定の化合物および化合物クラスに選択的に結合することができる核酸セグメントおよび構造である。リボスイッチは、トリガー分子の結合の際にリボスイッチの状態または構造が変化するアプタマードメインを有する。機能的リボスイッチでは、アプタマードメインに連結した発現プラットフォームドメインの状態または構造は、トリガー分子がアプタマードメインに結合した場合に変化する。リボスイッチのアプタマードメインは、任意の供給源(例えば、天然リボスイッチのアプタマードメイン、人工アプタマー、操作された、選択された、進化した、または誘導されたアプタマーまたはアプタマードメインが含まれる)に由来し得る。リボスイッチ中のアプタマーは、一般に、ステム構造の形成などによって連結した発現プラットフォームドメイン部分と相互作用することができる少なくとも1つの部分を有する。このステム構造は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。

0075

種々の天然リボスイッチのコンセンサスアプタマードメインを、米国特許出願公開第2005−0053951号の図11および本明細書中の他所に示す。preQ1リボスイッチのコンセンサス配列および構造を図3見出すことができる。これらのアプタマードメイン(本明細書中に具体化された全てのダイレクト改変体(direct variant)が含まれる)を、リボスイッチ中で使用することができる。コンセンサス配列および構造は、配列および構造の変形を示す。示した変形内のアプタマードメインを本明細書中でダイレクト改変体という。これらのアプタマードメインを、改変(modified)または改変(variant)アプタマードメインが産生されるように改変することができる。保存的改変には、対の中のヌクレオチドが相補性を維持するような塩基対合ヌクレオチドの任意の変化が含まれる。中等度の改変には、示した長さ範囲の20%以下のまたは等しい(長さまたは長さの範囲を示す)ステムまたはループの長さの変化が含まれる。コンセンサス構造が特定の長さのステムまたはループを示す場合、または、長さの範囲が列挙または表示される場合、ループおよびステムの長さを、「示す」と見なす。中等度の改変には、示した長さ範囲の40%以下のまたは等しい(長さまたは長さの範囲を示さない)ステムまたはループの長さの変化が含まれる。中等度の改変には、アプタマードメインの非特定部分機能的改変体も含まれる。

0076

開示のリボスイッチのアプタマードメインを、任意の他の目的、および任意の他の状況のためにアプタマーとして使用することもできる。例えば、アプタマーを使用して、リボザイム、他の分子スイッチ、および構造の変化がRNAの機能に影響を及ぼし得る任意のRNA分子を調節することができる。

0077

2.発現プラットフォームドメイン
発現プラットフォームドメインは、リボスイッチを含むRNA分子の発現に影響を及ぼすリボスイッチの一部である。発現プラットフォームドメインは、一般に、ステム構造の形成などによって連結したアプタマードメインの一部と相互作用することができる少なくとも1つの部分を有する。このステム構想は、トリガー分子の結合の際に形成されるか破壊されるかのいずれかである。ステム構造は、一般に、発現調節構造を形成するか、これの形成を防止するかのいずれかである。発現調節構造は、構造を含むRNA分子の発現を許容するか、防止するか、増強するか、阻害する構造である。例には、シャイン−ダルガルノ配列、開始コドン、転写ターミネーター、安定性シグナル、ならびにプロセシングシグナル(RNAスプライシングジャンクションおよび調節エレメントなど)が含まれる。

0078

B.トリガー分子
トリガー分子は、リボスイッチを活性化することができる分子および化合物である。これには、リボスイッチの天然または通常のトリガー分子およびリボスイッチを活性化することができる他の化合物が含まれる。天然または通常のトリガー分子は、所与の天然のリボスイッチのためのトリガー分子であるかまたはいくつかの非天然リボスイッチの場合、リボスイッチがデザインされるためのトリガー分子か、それと共にリボスイッチが選択される(例えば、in vitro選択技術またはin vitro進化技術など)トリガー分子である。

0079

C.化合物
リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる化合物およびかかる化合物を含む組成物も開示する。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。化合物を使用して、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することができる。リボスイッチのトリガー分子(ならびに他の活性化化合物)を使用して、リボスイッチを活性化することができる。トリガー分子以外の化合物を使用して、一般に、リボスイッチを非活性化または遮断することができる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチの存在からのトリガー分子の除去によって非活性化することもできる。リボスイッチを、例えば、リボスイッチを活性化しないトリガー分子のアナログの結合によって遮断することができる。

0080

RNA分子がリボスイッチを含む、RNA分子またはRNA分子をコードする遺伝子の発現を変化させるための化合物も開示する。化合物のRNA分子との接触によってこれを行うことができる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を調節するように機能する。したがって、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する条件に応じたリボスイッチを含む目的のRNA分子を供して、RNAの発現を変化させるために使用することができる。例えば、転写の終結またはRNAへのリボゾーム結合遮断の結果として発現を変化させることができる。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質に応じて、RNA分子の発現を減少または防止することができるか、RNA分子の発現を促進または増加することができる。RNA分子またはRNA分子をコードする遺伝子の発現を調節するための化合物も開示する。リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む天然に存在する遺伝子またはRNAの発現を調節するための化合物も開示する。遺伝子がこの遺伝子を保有する細胞または生物の生存に不可欠である場合、リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断により、細胞または生物が死滅、静止、または衰弱し得る。

0081

リボスイッチの活性化、非活性化、または遮断によってリボスイッチを含む単離遺伝子、操作遺伝子、もしくは組換え遺伝子またはRNAの発現を調節するための化合物も開示する。遺伝子が所望の発現産物をコードする場合、リボスイッチの活性化および非活性化を使用して、遺伝子発現を誘導し、それにより、発現産物を産生させることができる。遺伝子が遺伝子発現のインデューサーまたはリプレッサーあるいは別の細胞過程のインデューサーまたはリプレッサーをコードする場合、リボスイッチの活性化、非活性化、またはブロッキングにより、他の調節された遺伝子または細胞過程を誘導、抑制、または脱抑制することができる。多数のかかる二次調節効果は公知であり、リボスイッチと共に使用するために適応させることができる。かかる調節(regulation)の一次調節(control)としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチトリガー分子が小さな非抗原性分子であり得ることである。

0082

リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物を同定する方法も開示する。例えば、リボスイッチを活性化する化合物を、試験化合物とリボスイッチとの接触させる工程およびリボスイッチの活性化を評価する工程によって同定することができる。リボスイッチが活性化される場合、試験化合物を、リボスイッチを活性化する化合物と同定する。リボスイッチの活性化を、任意の適切な様式で評価することができる。例えば、リボスイッチをレポーターRNAに連結することができ、レポーターRNAの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、高次構造依存性標識(リボスイッチの活性化状態に応じて変化するシグナル)を含むことができる。かかるリボスイッチは、好ましくは、天然に存在するリボスイッチに由来するか、これから誘導するアプタマードメインを使用する。認められるように、調節アッセイまたは測定を使用するか調節アッセイまたは測定を使用しないで、リボスイッチの活性化を評価することができる。リボスイッチを非活性化する化合物の同定方法を、類似の方法で行うことができる。リボスイッチを遮断する化合物の同定を、任意の適切な様式で行うことができる。例えば、リボスイッチを活性化または非活性化することが公知の化合物の存在下および試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化または非活性化を評価するためのアッセイを行うことができる。試験化合物の非存在下で観察されるように活性化または非活性化が認められない場合、試験化合物を、リボスイッチの活性化または非活性化を遮断する化合物と同定する。

0083

preQ1リボスイッチと相互作用するアナログを本明細書中に開示する。具体的には、これらの化合物のさらに改変されたバージョンは、RNA構造中の他の官能基への新規の接触によってpreQ1リボスイッチへの改良された結合を有することができる。さらに、リボスイッチの構造モデルがこれらの部位で可能な多数の改変を示すので、生物学的利用能、毒性、および合成の容易さ(他の特徴のうち)の調整を、これらの2つの足場領域における改変によって調節可能とすることができる。

0084

ハイスループットスクリーニングを使用して、標準的または非標準的な分子認識様式のいずれかを使用してリボスイッチRNAにも結合する全く新しい化学足場を完全に明らかにすることもできる。リボスイッチは、発見される天然代謝産物結合RNAの最初の主要な形態なので、ハイスループットスクリーニングのために適応させることができる結合アッセイを作製するための事前努力はほとんど必要ない。複数の異なるアプローチを使用して、代謝産物結合RNAを検出することができ、このアプローチには、ゲルベースおよびチップベース検出方法を使用したアロステリックリボザイムアッセイおよびインライン探索アッセイが含まれる。リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の同定および同定された化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物同定方法と同定された化合物の製造方法との組み合わせにより、これを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触、リボスイッチの活性化の評価、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造によって化合物を作製することができる。

0085

化合物によるリボスイッチの活性化、非活性化、または遮断のチェックおよびチェックした化合物の製造によって作製された化合物も開示する。例えば、本明細書中の他所に開示の化合物の活性化、非活性化、または遮断評価方法とチェックした化合物の製造方法との組み合わせによってこれを行うことができる。例えば、試験化合物とリボスイッチとの接触、リボスイッチの活性化の評価、および試験化合物によってリボスイッチが活性化された場合の化合物としてのリボスイッチを活性化する試験化合物の製造によって化合物を作製することができる。化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する能力についての化合物のチェックは、リボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することを以前には知られていない化合物の同定および化合物がリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断することが既に知られていた場合のリボスイッチを活性化、非活性化、または遮断する化合物の能力の評価の両方をいう。

0086

本明細書中で使用する場合、用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容される置換基を含むことが意図される。広範な態様では、許容される置換基には、非環式および環式分岐および非分岐、炭素環式および複素環式、ならびに芳香族および非芳香族の有機化合物の置換基が含まれる。例示的な置換基には、例えば、下記の置換基が含まれる。許容される置換基は、適切な有機化合物と1つまたは複数が同一または異なり得る。本開示の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の原子価を満たす本明細書中に記載の有機化合物の水素置換基および/または任意の許容される置換基を有することができる。本開示は、いかなる様式においても有機化合物の許容される置換基によって制限されることを意図しない。また、用語「置換」または「〜と置換された」には、かかる置換が置換された原子および置換基の許容される原子価に従い、置換によって安定な化合物(例えば、転位環化、脱離などによって自発的に変換されない化合物)が得られるという暗黙の条件が含まれる。

0087

「A1」、「A2」、「A3」、および「A4」を、本明細書中で、種々の特異的置換基を示すための一般的記号として使用する。これらの記号は、本明細書中に開示の置換基に制限されない任意の置換基であってよく、置換基が一例にて一定の置換基であると定義される場合であっても、別の例にていくつかの他の置換基と定義することができる。

0088

用語「アルキル」は、本明細書中で使用する場合、1〜24個の炭素原子の分岐または非分岐の飽和炭化水素基(メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピルn−ブチルイソブチル、t−ブチル、ペンチル、ヘキシルヘプチルオクチル、ノニルデシルドデシルテトラデシルヘキサデシルエイコシル、およびテトラコシルなど)である。アルキル基は、置換または非置換であってもよい。アルキル基を1つまたは複数の基(下記のアルキル、ハロゲン化アルキルアルコキシアルケニルアルキニルアリールヘテロアリールアルデヒド、アミノ、カルボン酸エステルエーテルハライド、ヒドロキシ、ケトンスルホオキソスルホニルスルホンスルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない)と置換することができる。用語「低級アルキル」は、6個以下の炭素原子を有するアルキル基である(例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ペンチル、およびヘキシルなど)。

0089

本明細書を通して、「アルキル」を、一般に、非置換アルキル基および置換アルキル基の両方をいうために使用するが、置換アルキル基はまた、特に、本明細書中で、同定によるアルキル基上の特定の置換基をいう。例えば、用語「ハロゲン化アルキル」は、特に、1つまたは複数のハライド(例えば、フッ素塩素臭素、またはヨウ素)と置換されたアルキル基をいう。用語「アルコキシアルキル」は、特に、1つまたは複数の下記のアルコキシ基と置換されたアルキル基をいう。用語「アルキルアミノ」は、特に、1つまたは複数の下記のアミノ基などと置換されたアルキル基をいう。ある例で「アルキル」を使用し、「ハロゲン化アルキル」などの特定の用語を別の例で使用する場合、用語「アルキル」には「ハロゲン化アルキル」などの特定の用語が含まれないことを意味するように意図するものではない。

0090

このプラクティスを、本明細書中に記載の他の基にも使用する。すなわち、「シクロアルキル」などの用語が非置換および置換シクロアルキル部分の両方をいう一方で、置換部分を、さらに、本明細書中で特に同定することができる。例えば、特定の置換シクロアルキルは、例えば、「アルキルシクロアルキル」をいうことができる。同様に、置換アルコキシを、特に、例えば、「ハロゲン化アルコキシ」ということができ、特に置換されたアルケニルは、例えば、「アルケニルアルコール」などであり得る。さらに、「シクロアルキル」などの一般用語および「アルキルシクロアルキル」などの特定の用語を使用するプラクティスは、一般用語が特定の用語を含まないことを意味するように意図するものではない。

0091

用語「アルコキシ」は、本明細書中で使用する場合、1つの末端エーテル結合によって結合したアルキル基である。すなわち、「アルコキシ」基を、−OA1(式中、A2は上記定義のアルキルである)と定義することができる。

0092

用語「アルケニル」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも1つの炭素炭素二重結合を含む構造式を有する2〜24個の炭素原子の炭化水素基である。(A1A2)C=C(A3A4)などの非対称構造は、E異性体およびZ異性体の両方を含むことを意図する。これを非対称アルケンが存在する本明細書中の構造式中で推定することができるか、結合記号C=Cによって明確に示すことができる。アルケニル基を、1つまたは複数の基(下記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない)と置換することができる。

0093

用語「アルキニル」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を含む構造式を有する2〜24個の炭素原子の炭化水素基である。アルキニル基を、1つまたは複数の基(下記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない)と置換することができる。

0094

用語「アリール」は、本明細書中で使用する場合、任意の炭素ベース芳香基を含む基(ベンゼンナフタレンフェニルビフェニル、およびフェノキシベンゼン等が含まれるが、これらに限定されない)である。用語「アリール」には、芳香基の環内に組み込まれた少なくとも1つのヘテロ原子を有する芳香基を含む基と定義される「ヘテロアリール」も含まれる。ヘテロ原子の例には、窒素、酸素硫黄、およびリンが含まれるが、これらに限定されない。同様に、用語「アリール」にも含まれる用語「非ヘテロアリール」は、ヘテロ原子を含まない芳香基を含む基を定義する。アリール基は、置換または非置換であり得る。アリール基を、1つまたは複数の基(本明細書中に記載のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない)と置換することができる。用語「ビアリール」は、アリール基の特定の型であり、アリールの定義に含まれる。ビアリールは、ナフタレンなどのように融合環構造を介して互いに結合しているか、ビフェニルなどのように1つまたは複数の炭素−炭素結合を介して結合している2つのアリール基をいう。

0095

用語「シクロアルキル」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも3つの炭素原子から構成される非芳香族炭素ベースの環である。シクロアルキル基の例には、シクロプロピルシクロブチルシクロペンチルシクロヘキシルなどが含まれるが、これらに限定されない。用語「ヘテロシクロアルキル」は、環の少なくとも1つの炭素原子がヘテロ原子(窒素、酸素、硫黄、またはリンなどであるがこれらに限定されない)と置換される上記定義のシクロアルキル基である。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、置換または非置換であり得る。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基を、1つまたは複数の基(本明細書に記載のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない)と置換することができる。

0096

用語「シクロアルケニル」は、本明細書中で使用する場合、少なくとも3つの炭素原子から構成され、且つ少なくとも1つの二重結合(すなわち、C=C)を含む非芳香族炭素ベースの環である。シクロアルケニル基の例には、シクロプロペニルシクロブテニルシクロペンテニルシクロペンタジエニルシクロヘキセニル、およびシクロヘキサジエニルなどが含まれるが、これらに限定されない。用語「ヘテロシクロアルケニル」は、上記定義のシクロアルケニル基型であり、環の少なくとも1つの炭素原子が、ヘテロ原子(窒素、酸素、硫黄、またはリンなどであるがこれらに限定されない)と置換される用語「シクロアルケニル」の意味の範囲内に含まれる。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、置換または非置換であり得る。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基を、1つまたは複数の基(本明細書中に記載のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールが含まれるが、これらに限定されない)と置換することができる。

0097

用語「環状基」は、本明細書中で、アリール基、非アリール基(すなわち、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニル基)のいずれか、またはその両方をいう。環状基は、置換または非置換であり得る1つまたは複数の環系を有する。環状基は、1つまたは複数のアリール基、1つまたは複数の非アリール基、または1つまたは複数のアリール基および1つまたは複数の非アリール基を含むことができる。

0098

用語「アルデヒド」は、本明細書中で使用する場合、式−C(O)Hによって示される。本明細書を通して、「C(O)」は、C=Oの略語である。

0099

用語「アミン」または「アミノ」は、本明細書中で使用する場合、式NA1A2A3(式中、A1、A2、およびA3は、独立して、上記の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る)によって示される。

0100

用語「カルボン酸」は、本明細書中で使用する場合、式−C(O)OHによって示される。「カルボキシラート」は、本明細書中で使用する場合、式−C(O)O−によって示される。

0101

用語「エステル」は、本明細書中で使用する場合、式−OC(O)A1または−C(O)OA1(式中、A1は、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る)によって示される。

0102

用語「エーテル」は、本明細書中で使用する場合、式A1OA2(式中、A1およびA2は、独立して、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る)によって示される。

0103

用語「ケトン」は、本明細書中で使用する場合、式A1C(O)A2(式中、A1およびA2は、独立して、上記のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る)によって示される。

0104

用語「ハライド」は、本明細書中で使用する場合、ハロゲンであるフッ素、塩素、臭素、およびヨウ素をいう。

0105

用語「ヒドロキシル」は、本明細書中で使用する場合、式−OHによって示される。

0106

用語「スルホ−オキソ」は、本明細書中で使用する場合、式−S(O)A1(すなわち、「スルホニル」)、A1S(O)A2(すなわち、「スルホキシド」)、−S(O)2A1、A1SO2A2(すなわち、「スルホン」)、−OS(O)2A1、または−OS(O)2OA1(式中、A1およびA2は、上記の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であり得る)によって示される。本明細書を通して、「S(O)」は、S=Oの略語である。

0107

用語「スルホニルアミノ」または「スルホンアミド」は、本明細書中で使用する場合、式−S(O)2NH−によって示される。

0108

用語「チオール」は、本明細書中で使用する場合、式−SHによって示される。

0109

本明細書中で使用する場合、「Rn」(式中、nはいくつかの整数である)は、独立して、上記列挙の1つまたは複数の基を有することができる。選択される基に応じて、第1の基を第2の基内に組み込むことができるか、あるいは、第1の基は第2の基に対する懸垂物(すなわち、結合物)であり得る。例えば、「アミノ基を含むアルキル基」では、アミノ基をアルキル基骨格内に組み込むことができる。あるいは、アミノ基を、アルキル基骨格に結合することができる。選択される基の性質は、第1の基が第2の基に埋め込まれるか結合するかどうかを決定する。

0110

逆に記述されない限り、実線のみで示され、楔形破線として示されない化学結合を有する式は、それぞれ可能な異性体(例えば、それぞれの鏡像異性体およびジアステレオマー、ならびに異性体の混合物ラセミ混合物またはスケールミック混合物(scalemic mixture))を意図する。

0111

本明細書中に開示の一定の材料、化合物、組成物、および成分を購入することができるか、当業者に一般的に公知の技術を使用して容易に合成することができる。例えば、開示の化合物および組成物の調製で使用される出発材料および試薬を、供給業者(Aldrich Chemical Co.,(Milwaukee,Wis.)、Acros Organics(Morris Plains,N.J.)、Fisher Scientific(Pittsburgh,Pa.)、またはSigma(St.Louis,Mo.)から入手可能であるか、Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis,第1−17巻(John Wiley and Sons,1991);Rodd’s Chemistry of Carbon Compounds,第1−5巻およびSupplementals(Elsevier Science Publishers,1989);Organic Reactions,第1−40巻(John Wiley and Sons,1991);March’s Advanced Organic Chemistry,(John Wiley and Sons,4th Edition);およびLarock’s Comprehensive Organic Transformations(VCH Publishers Inc.,1989)などのリファレンスに記載の手順にしたがった当業者に公知の方法によって調製する。

0112

preQ1応答性リボスイッチ(およびpreQ1応答性リボスイッチ由来のリボスイッチ)に有用な化合物には、式I:

0113

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体である)によって示される化合物が含まれ、
細胞はpreQ1応答性リボスイッチを含むRNAをコードする遺伝子を含み、化合物はpreQ1応答性リボスイッチへの結合によって遺伝子発現を阻害する。

0114

化合物は、式II:

0115

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、C−水素結合供与体、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり得、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであり、
R2は存在せず、
R3はNH2であり、
R4は存在しない)の構造を有することができる。

0116

化合物は、式II:

0117

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R3はNH2であり、
R4は存在しない)の構造を有することができる。

0118

化合物は、式II:

0119

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は存在せず、
R3は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R4は存在しない)の構造を有することができる。

0120

化合物は、式II:

0121

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は存在せず、
R3はNH2であり、
R4は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない)の構造を有することができる。

0122

化合物は、式II:

0123

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は存在せず、
R3は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R4は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない)の構造を有することができる。

0124

化合物は、式II:

0125

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R3はNH2であり、
R4は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない)の構造を有することができる。

0126

化合物は、式II:

0127

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R3は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R4は存在しない)の構造を有することができる。

0128

化合物は、式II:

0129

(式中、
R1は、CH、N、C−NH2、C−CH2−NH2、C−CN、C−C(O)NH2、C−CH=NH、C−CH2−N(CH3)2、またはC−水素結合供与体であり、
R2は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R3は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在せず、
R4は、N、NH、NH2+、NH3+、O、OH、S、SH、C−R5、CH−R5、N−R5、NH−R5、O−R5、またはS−R5であり、R5は、NH2+、NH3+、CO2H、B(OH)2、CH(NH2)2、C(NH2)2+、CNH2NH3+、C(NH3+)3、ヒドロキシメチル、1−ヒドロキシエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジヒドロキシエチル、2−ヒドロキシ−1−メチルエチル、1−ヒドロキシプロピル、2−ヒドロキシプロピル、3−ヒドロキシプロピル、1,3−ジヒドロキシプロピル、2,3−ジヒドロキシプロピル、1−ヒドロキシブチル、2−ヒドロキシブチル、3−ヒドロキシブチル、4−ヒドロキシブチル、1,4ジヒドロキシブチル、2,4−ジヒドロキシブチル、1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、2−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、3−ヒドロキシ−2−メチルプロピル、1−ヒドロキシメチル−1−メチルエチル、トリスヒドロキシメチルメチル、チオールメチル、1−チオールエチル、2−チオールエチル、1,2−ジチオールエチル、2−チオール−1−メチルエチル、1−チオールプロピル、2−チオールプロピル、3−チオールプロピル、1,3−ジチオールプロピル、2,3−ジチオールプロピル、1−チオールブチル、2−チオールブチル、3−チオールブチル、4−チオールブチル、1,4ジチオールブチル、2,4−ジチオールブチル、1−チオール−2−メチルプロピル、2−チオール−2−メチルプロピル、3−チオール−2−メチルプロピル、1−チオールメチル−1−メチルエチル、トリスチオールメチルメチル、アミノメチル、1−アミノエチル、2−アミノエチル、1,2−ジアミノエチル、2−アミノ−1−メチルエチル、1−アミノプロピル、2−アミノプロピル、3−アミノプロピル、1,3−ジアミノプロピル、2,3−ジアミノプロピル、1−アミノブチル、2−アミノブチル、3−アミノブチル、4−アミノブチル、1,4ジアミノブチル、2,4−ジアミノブチル、1−アミノ−2−メチルプロピル、2−アミノ−2−メチルプロピル、3−アミノ−2−メチルプロピル、1−アミノメチル−1−メチルエチル、トリスアミノメチルメチルであるか、存在しない)の構造を有することができる。

0130

特定の部分または基を本明細書中で水素結合供与体または水素結合受容体ということができる一方、この用語を各言及について種々の置換基を分類するためだけに使用すると理解すべきである。かかる専門用語は、特定の部分がリボスイッチまたはいくつかの他の化合物との水素結合に実際に関与することを意味すると解釈すべきではない。例えば、本明細書中で水素結合受容体(または供与体)と呼ばれる部分が、リボスイッチまたは他の化合物との疎水性相互作用イオン性相互作用ファンデルワールス相互作用、または他の型の相互作用に唯一または付加的に関与し得る可能性がある。

0131

本明細書中に開示の一定の基を本明細書中で水素結合受容体および水素結合供与体の両方としていうことができることもまた理解される。例えば、−OHは水素原子供与による水素結合供与体であり得る。−OHは、酸素原子上の1つまたは複数の非結合電子対による水素結合受容体でもあり得る。したがって、本明細書を通して、種々の部分は水素結合供与体および水素結合受容体であり得、そのように言及することができる。

0132

上記定義内のあらゆる化合物は、本明細書中に具体的に開示されていることを意図するか、見なされるべきである。さらに、上記定義内で同定することができるあらゆる下位集団は、本明細書中に具体的に開示されていることを意図するか、見なされるべきである。結果として、任意の化合物または化合物の下位集団が特に使用のために含まれるか使用から排除されるか、化合物リスト中に含まれるか化合物リストから排除されることを特に意図する。例として、各化合物が上記定義の通りであり、且つpreQ1応答性リボスイッチを活性化することができる化合物群が意図される。

0133

リボスイッチと相互作用する化合物についての本明細書中に記載の特定の接触および相互作用(水素結合供与または水素結合受容など)が好ましいが、化合物のリボスイッチとの相互作用に不可欠ではないと理解すべきである。例えば、化合物は、開示の接触および相互作用を有する化合物よりも低い親和性および/または特異性でリボスイッチと相互作用することができる。さらに、化合物上の異なる官能基または追加の官能基が、リボスイッチとの、新規の接触、異なる接触、そして/または代償の接触をもたらすことができる。例えば、preQ1リボスイッチについて、大きな官能基を使用することができる。かかる官能基は、リボスイッチの他の部分と接触または相互作用することができ、および接触または相互作用するようにデザインすることができる。かかる接触および相互作用は、トリガー分子およびコア構造の接触および相互作用を補うことができる。

0134

D.構築物、ベクター、および発現系
開示のpreQ1リボスイッチを、任意の適当な発現系と共に使用することができる。組換え発現を、通常、プラスミドなどのベクターを使用して行う。ベクターは、リボスイッチコード配列および発現するRNA(例えば、タンパク質をコードするRNA)に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ベクターはまた、転写および翻訳に必要な他のエレメントを含むことができる。本明細書中で使用する場合、ベクターは、外因性DNAを含む任意のキャリアをいう。したがって、ベクターは、分解することなく細胞に外因性核酸を輸送する作用物質(agent)であり、送達された細胞中で核酸を発現させるプロモーターを含む。ベクターには、プラスミド、ウイルス核酸ウイルスファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。リボスイッチ調節構築物の輸送に適切な種々の原核生物および真核生物発現ベクターを産生することができる。かかる発現ベクターには、例えば、pET、pET3d、pCR2.1、pBAD、pUC、および酵母ベクターが含まれる。ベクターを、例えば、種々のin vivoおよびin vitro状況で使用することができる。

0135

ウイルスベクターには、アデノウイルスアデノ随伴ウイルスヘルペスウイルスワクシニアウイルスポリオウイルスAIDSウイルス、神経向性ウイルス(neuronal trophic virus)、シンドビスウイルスおよび他のRNAウイルスHIVバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる)が含まれる。ベクターとしての使用が適切となるこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも有用である。Verma(1985)に記載のレトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルス(Murine Maloney Leukemia virus)(MMLV)、およびベクターとしてMMLVの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、RNAポリメラーゼIII転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作する場合、ウイルスは、典型的には、1つまたは複数の初期遺伝子を除去し、除去したウイルスDNAの代わりに遺伝子または遺伝子/プロモーターカセットをウイルスゲノム中に挿入する。

0136

「プロモーター」は、一般に、転写開始部位に対して比較的固定した位置に存在する場合に機能するDNA配列である。「プロモーター」は、RNAポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。

0137

エンハンサー」は、一般に、転写開始部位から固定していない距離で機能し、転写単位に対して5’側(Laimins,1981)または3’側(Lusky et al.,1983)であり得るDNA配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン内に存在することができ(Banerji et al.,1983)、コード配列自体の内部にも存在することができる(Osborne et al.,1984)。これらは、通常、10bp長と300bp長との間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、プロモーターと同様に、転写調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。エンハンサーは、しばしば、発現調節を決定する。

0138

真核生物宿主細胞(酵母細胞真菌細胞昆虫細胞植物細胞動物細胞ヒト細胞、または有核細胞)で使用される発現ベクターはまた、mRNA発現に影響を及ぼし得る転写終結に必要な配列を含むことができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするmRNAの非翻訳部分中でポリアデニル化セグメントとして転写される。3’非翻訳領域は、転写終結部位も含む。転写単位がポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の利点の1つは、転写単位がmRNAのようにプロセシングおよび輸送される可能性が増加することである。発現構築物中でのポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを導入遺伝子構築物中で使用することが好ましい。

0139

ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含む。このマーカー産物を使用して、遺伝子が細胞に送達されたかどうか、および一旦送達されると発現するかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするE.Coli lacZ遺伝子である。

0140

いくつかの実施形態では、マーカーは選択可能なマーカーであり得る。かかる選択可能なマーカーが宿主細胞に首尾よく導入された場合、形質転換された宿主細胞は選択圧下においた場合に生存することができる。2つの広く使用されている異なるカテゴリーの選択レジメが存在する。第1のカテゴリーは、細胞の代謝および補充培地と無関係に増殖する能力を欠く変異細胞の使用に基づく。第2のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームをいい、変異細胞系統の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を使用する。新規の遺伝子を有するそれらの細胞は、薬物耐性を伝達するタンパク質を発現し、選択を生き抜く。かかる優性選択の例は、薬物であるネオマイシン(Southern and Berg,1982)、ミコフェノール酸(Mulligan and Berg,1980)、またはハイグロマイシン(Sugden et al.,1985)を使用する。

0141

遺伝子材料(プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体であるが、これらに限定されない)の直接移入の使用またはカチオニックリポソームなどの細胞またはキャリア中の遺伝子材料の移入を介して、遺伝子を移入することができる。かかる方法は当該分野で周知であり、本明細書中に記載の方法での使用に容易に適応することができる。移入ベクターは、細胞に遺伝子を送達させるために使用される任意のヌクレオチド構築物(例えば、プラスミド)または一般的な遺伝子送達ストラテジーの一部(例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部)(Ram et al.Cancer Res.53:83−88,(1993))であり得る。適切なトランスフェクション手段(ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、または物理的機械的方法エレクトロポレーションおよびDNAの直接拡散など)が含まれる)は、例えば、Wolff,J.A.,et al.,Science,247,1465−1468,(1990);and Wolff,J.A.Nature,352,815−818,(1991)に記載されている。

0142

1.ウイルスベクター
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、AIDSウイルス、神経向性ウイルス、シンドビスウイルスおよび他のRNAウイルス(HIVバックボーンを有するこれらのウイルスが含まれる)である。ベクターとしての使用が適切となるこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーも好ましい。好ましいレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)、およびベクターとしてMMLVの所望の性質を発現するレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより高い遺伝子負荷量(すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子)を輸送することができ、この理由のために、一般的に使用されるベクターである。しかし、これらは、非増殖細胞で有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、作業が容易であり、高力価を有し、エアゾール処方物中で送達させることができ、非分裂細胞トランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは、巨大であり、いくつかの遺伝子挿入部位を有し、熱安定性を示し、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される宿主生物免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターである。この型の好ましいベクターは、インターロイキン8または10のコード領域を保有する。

0143

ウイルスベクターは、細胞に遺伝子を導入するためのほとんどの化学的方法または物理的方法よりも高い処理能力遺伝子導入能力)を有する。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、RNAポリメラーゼIII転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を調節するためのプロモーターを含む。ベクターとして操作する場合、ウイルスは、典型的には、1つまたは複数の初期遺伝子を除去し、除去したウイルスDNAの代わりに遺伝子または遺伝子/プロモーターカセットをウイルスゲノム中に挿入する。この構築物型は、約8kbまでの外来遺伝子材料を保有することができる。除去された初期遺伝子の必要な機能を、典型的には、トランスで初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように操作された細胞系統によって供給される。

0144

i.レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、レトロウイルス科のウイルスファミリー(任意の型、亜科、属、向性が含まれる)に属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般に、Verma,I.M.,Retroviral vectors for gene transfer.In Microbiology−1985,American Society for Microbiology,pp.229−232,Washington,(1985)(本明細書中で参考として援用される)に記載されている。遺伝子治療のためのレトロウイルスベクターの使用方法の例は、米国特許第4,868,116号および同第4,980,286号;PCT出願国際公開第90/02806号および国際公開第89/07136号;およびMulligan,(Science 260:926−932(1993))(その教示が本明細書中で参考として援用される)に記載されている。

0145

レトロウイルスは、本質的に、核酸カーゴ(nucleic acid cargo)に詰められたパッケージである。核酸カーゴは、パッケージングシグナルを保有し、これらのパッケージングシグナルは、複製された分子がパッケージコート内に効率的に詰められることを確実にする。パッケージシグナルに加えて、複製および複製されたウイルスのパッケージングのためにシスで必要な多数の分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するgag、pol、およびenv遺伝子を含む。これは、典型的には標的細胞に移入される外来DNAと置換されるgag、pol、およびenv遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的には、パッケージコートへの組み込みのためのパッケージングシグナル、gag転写単位の開始をシグナル伝達する配列、逆転写に必要なエレメント(逆転写のtRNAプライマーに結合するプライマー結合部位が含まれる)、DNA合成中にRNA鎖のスイッチを導く末端反復配列、第2のDNA合成鎖の合成のためのプライミング部位としての機能を果たすプリンリッチ配列である5’→3’LTR、および宿主ゲノムに挿入するためのレトロウイルスのDNA状態を挿入することができるLTRの末端付近の特異的配列を含む。gag、pol、およびenv遺伝子の除去により、約8kbの外来配列がウイルスゲノムに挿入され、逆転写するようになり、複製の際に新規のレトロウイルス粒子に詰められる。この核酸量は、各転写物のサイズに応じて、1つから多数の遺伝子の送達に十分である。挿入物中に他の遺伝子と共に正または負の選択マーカーのいずれかを含めることが好ましい。

0146

ほとんどのレトロウイルスベクター中の複製機構およびパッケージングタンパク質が除去されているので(gag、pol、およびenv)、典型的には、パッケージング細胞系統へのこれらの配置によってベクターを生成する。パッケージング細胞系統は、複製およびパッケージング機構を含むが、いかなるパッケージングシグナルも欠くレトロウイルスを使用してトランスフェクションまたは形質転換した細胞系統である。選択のDNAを保有するベクターをこれらの細胞系統にトランスフェクションする場合、目的の遺伝子を含むベクターを複製し、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構によって新規のレトロウイルス粒子にパッケージングする。必要なシグナルを欠くので、この機構のゲノムはパッケージされない。

0147

ii.アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築は記載されている(Berkner et al., J.Virology 61:1213−1220(1987);Massie et al., Mol.Cell.Biol.6:2872−2883(1986);Haj−Ahmad et al., J.Virology 57:267−274(1986);Davidson et al., J.Virology 61:1226−1239(1987);Zhang ”Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome−mediated transfection andPCRanalysis” BioTechniques 15:868−872(1993))。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利点は、これらのウイルスが最初の感染細胞内で複製することができるが新規の感染ウイルス粒子を形成できないので、他の細胞型に拡大することができる範囲が制限されていることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮肝細胞血管内皮CNS実質、および多数の他の組織部位への直接的なin vivo送達後に高効率の遺伝子移入を達成することが示されている(Morsy, J.Clin.Invest.92:1580−1586(1993);Kirshenbaum, J.Clin.Invest.92:381−387(1993);Roessler, J.Clin.Invest.92:1085−1092(1993);Moullier, Nature Genetics 4:154−159(1993);La Salle, Science 259:988−990(1993);Gomez−Foix, J.Biol.Chem.267:25129−25134(1992);Rich, Human Gene Therapy 4:461−476(1993);Zabner, Nature Genetics 6:75−83(1994);Guzman,Circulation Research 73:1201−1207(1993);Bout, Human Gene Therapy 5:3−10(1994);Zabner, Cell 75:207−216(1993);Caillaud, Eur.J.Neuroscience 5:1287−1291(1993);and Ragot, J.Gen.Virology 74:501−507(1993))。組換えアデノウイルスは、特異的細胞表面受容体への結合によって遺伝子形質導入を達成し、その後、野生型または複製欠損アデノウイルスと同一の様式で、受容体媒介エンドサイトーシスによってウイルスを内在化する (Chardonnet and Dales, Virology 40:462−477(1970);Brown and Burlingham,J.Virology 12:386−396(1973);Svensson and Persson, J.Virology 55:442−449(1985);Seth,et al., J.Virol. 51:650−655(1984);Seth,et al.,Mol.Cell.Biol. 4:1528−1533(1984);Varga et al., J.Virology 65:6061−6070(1991);Wickham et al., Cell 73:309−319(1993))。

0148

好ましいウイルスベクターは、E1遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づいたウイルスベクターであり、これらのヴィロン(viron)をヒト293細胞系統などの細胞系統中で生成する。別の好ましい実施形態では、E1およびE3遺伝子の両方をアデノウイルスゲノムから除去する。

0149

別のウイルスベクター型は、アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づく。この欠損パルボウイルスは、多数の細胞型に感染することができ、ヒトに非病原性を示すので、好ましいベクターである。AAV型ベクターは、約4〜5kbを輸送することができ、野生型AAVは、第19染色体に安定に挿入されることが公知である。この部位特異的組み込み特性を含むベクターが好ましい。このベクター型の特に好ましい実施形態は、Avigen,San Francisco,CA製のP4.1 Cベクターである。これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、HSV−tk、および/またはマーカー遺伝子(緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子など)を含むことができる。

0150

ウイルスおよびレトロウイルス中の挿入遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の調節を補助するためのプロモーターおよび/またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定した位置に存在する場合に機能する配列またはDNA配列である。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含むことができる。

0151

2.ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を調節する好ましいプロモーターを、種々の供給源(例えば、ポリオーマシミアンウイルス40SV40)、アデノウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスゲノム)、または非相同哺乳動物プロモーター(例えば、βアクチンプロモーター)から得ることができる。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターを、SV40ウイルス複製起点も含むSV40制限フラグメントとして得ることが都合が良い(Fiers et al.,Nature,273: 113(1978))。ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターを、HindIII E制限フラグメントとして得ることが都合が良い(Greenway,P.J.et al.,Gene 18: 355−360(1982))。勿論、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書中で有用である。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ