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技術 生物学的サンプルろ過中の超音波、逆流洗浄、およびフィルタ運動によるフィルタ洗浄装置および方法

出願人 スミスアンドネフューピーエルシー
発明者 スティーヴン・カラン
出願日 2008年2月29日 (11年8ヶ月経過) 出願番号 2009-551270
公開日 2010年6月10日 (9年5ヶ月経過) 公開番号 2010-520446
状態 特許登録済
技術分野 サンプリング、試料調製 生物学的材料の調査,分析 特殊濾過機 微生物・酵素関連装置 体外人工臓器
主要キーワード 圧電型振動子 上段室 下段室 フィルタ保持具 可動保持具 PLCコントローラ 通常荷重 相互運動
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2010年6月10日)のものです。
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図面 (16)

課題・解決手段

本願は、多孔質フィルタ(2)による流体サンプルからの固体画分の分離、特に骨髄サンプルなどの生物学的サンプルから治療用細胞画分の分離を示す。多孔質フィルタ(2)は、ろ過装置(1)を細胞分離が必要な流体サンプル(4)を導入する上段前置ろ過室(3)と音響定在波伝播が可能な流体(6)を導入する下段後置ろ過室(5)とに分割する。音響素子(8)は、基材(7)と連結し、基材(7)は、下段室(5)内の基底に配置され、音波生成素子(8)に応じて共振し、サンプル(4)を撹拌するため二つの流体面およびフィルタを通じて定在波を発生する。同時に、真空引きの周期的なプロセスにより、サンプル(4)をフィルタ(2)を通じ下方へ移動させる。真空圧流体速度、および振動周波数は、適切なポンプバルブを収容した遠隔装置により制御される。

概要

背景

前駆細胞は、分化する際に多分化機能を有するため、潜在的に治療処置範囲の多様化に役立っている。病変、または損傷組織部位に運ばれる、これらの細胞濃縮画分加速された組織治癒を通じて最大の治療利益を有すると考えられている。前駆細胞は、いくつかの哺乳類細胞および体液内の非治療用細胞不均一混合物内に含まれる細胞において、通常大変まれな個体数である(Caplan2005)。

細胞を捕捉するための様々な技術と装置が文献にて公表されており、それらには沈降法(Takazawa&Tokashiki、1989)、遠心分離法(Apelman et al,1992;Jaeger,1992)、回転フィルタ(Himmerlflab et al,1969)、及びクロスフロー精密ろ過(Maiorella et al,1991)が含まれる。しかしこれらには、多くの不都合点がある。沈降プロセスは、細胞の低沈降速度、および遅い分離プロセスという難点がある。遠心分離法装置は、流体から細胞を外側に動かす半径方向の力に依存し、高い回収が迅速に行われたとしても、これらの装置は、通常装置に関し高い資本コストがかかる。さらに、高いせん断応力は、潜在的に細胞を損傷し、または例えば前駆細胞などに好ましくない変化を誘発させる場合がある。回転フィルタおよびクロスフローフィルタは、細胞懸濁液のろ過に膜を使用し、これらは付着物に影響されやすく、後に性能が損なわれる。これらのフィルタを使用する他のプロセスは、せん断制御ろ過(Vogel and Kroner,1999)、接線フローろ過(Radlett,1972)、およびダイナミックろ過を含む。分離の割合および効率は、付着物の程度に依存する。ダイナミックろ過は、フィルタを横切る流れと独立したせん断フローを発生させるための、膜とハウジングとの間の相互運動に依存する(Castilho&Medrohno,2002)。うず流ろ過、および回転円板フィルタは、ダイナミックろ過装置の一般的な二つのタイプである(Stromberg et al,1989)。Karumanchi et.al.(2002)は、所望の分離を達成するために電気磁気および音響現象を含む、細胞および生体高分子に対するフィールド支援分離技術の概要を提供した。誘電泳動は、不均一な電場により生じた偏極効果による非荷電粒子の横方向の動きである(Docoslis et al,1997,1999)。これは、非常に低い導電性媒体にのみ適用でき、他の場合には流体を過剰な加熱が起こる。磁気分離は、二つのタイプに分類される。一つ目は、分離される細胞が固有磁気特性を有するタイプ(例えば、赤血球走磁性細菌)であり、二つ目は、必要な混合物非磁性成分磁気応答性物質により磁化されるタイプである。両方の事例において、分離を達成するために、流体は磁場にさらされなければならない。磁気分離は、前駆細胞のための骨髄濃縮処理を含む、多数の細胞分離に広く用いられてきた(Roath et al,1990)。音響分離機は、微生物および細胞を分離するために広く用いられてきたが、一般的にほとんどは、超音波の使用に依存している。超音波細胞保持は、超音波が波の伝播と反対方向に反射する場合に形成される定在波により達成される。細胞は、定在波の波節面において捕捉される。Kilburn et al,(1989)およびWO95/001214は、懸濁液から細胞を分離する手段としてこれらの波の使用可能性を最初に報告し、その後この技術を利用した他の多数のレポートが報告されている(Coakley et al,1994;Dobelhoof-Dier,1994;Gaida et al,1996;Gorenflo et al,2003,2004)。超音波分離機は、慎重波長調整が必要であり、かつ通常荷重が制限されるため小容量の細胞しか回収できない。さらに、この技術は、流体相から細胞の均一集団を取り出すことに使用され、それゆえ均一混合物から特定の個体群を捕捉することができない。

概要

本願は、多孔質フィルタ(2)による流体サンプルからの固体画分の分離、特に骨髄サンプルなどの生物学的サンプルから治療用細胞画分の分離を示す。多孔質フィルタ(2)は、ろ過装置(1)を細胞分離が必要な流体サンプル(4)を導入する上段前置ろ過室(3)と音響定在波の伝播が可能な流体(6)を導入する下段後置ろ過室(5)とに分割する。音響素子(8)は、基材(7)と連結し、基材(7)は、下段室(5)内の基底に配置され、音波生成素子(8)に応じて共振し、サンプル(4)を撹拌するため二つの流体面およびフィルタを通じて定在波を発生する。同時に、真空引きの周期的なプロセスにより、サンプル(4)をフィルタ(2)を通じ下方へ移動させる。真空圧流体速度、および振動周波数は、適切なポンプバルブを収容した遠隔装置により制御される。

目的

音響素子は、素子自体の錐体よりさらに広い面積を有する基材材料が付加された場合、この素子が向上した共振を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
3件
牽制数
5件

この技術が所属する分野

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請求項1

流体サンプルから固体画分を分離する装置であって、前記装置は、ろ過装置を備え、前記ろ過装置は、音波生成素子と、前記装置を、前記流体サンプルを受け入れ前置ろ過室音波伝播可能な流体を受け入れる後置ろ過室とに分割する、少なくともひとつのフィルタと、前記後置ろ過室と関連するように構成された基材であり、音波の印加に対し共振可能な前記基材と、を備え、前記音波生成素子は、前記音波生成素子が前記基材の共振を引き起こし、前記後置ろ過室内の前記流体および前記前置ろ過室の前記流体サンプルの両者を通じ、次々定在波を伝播するように、前記基材と関連するように構成されている装置。

請求項2

前記音響素子が、前記基材に可逆的に連結している請求項1に記載の装置。

請求項3

前記前置ろ過室および前記後置ろ過室内の前記流体が、前記フィルタを順次横切り反対方向へ移動して、前記流体サンプルの正味の移動が、前記後置ろ過室へ行われる、請求項1または2に記載の装置。

請求項4

少なくともひとつの前記フィルタが、分離工程中に揺り動かされる請求項1に記載の装置。

請求項5

前記フィルタが、前記フィルタを垂直方向、横方向、またはその組み合わせの方向に振動可能な保持具と結合している請求項3に記載の装置。

請求項6

前記流体サンプルは液体である請求項1〜5のいずれかに記載の装置。

請求項7

前記液体は生物学的サンプルである請求項6に記載の装置。

請求項8

前記生物学的サンプルが、血液サンプル浸出液尿サンプル精液骨髄穿刺液脊髄液組織からの細胞懸濁液、粘液、または唾液である請求項7に記載の装置。

請求項9

前記固体画分が細胞画分である、請求項1〜8のいずれかに記載の装置。

請求項10

前記細胞画分が白血球画分である、請求項9に記載の装置。

請求項11

前記細胞画分が、幹細胞または前駆細胞から選択された未分化細胞である、請求項10に記載の装置。

請求項12

前記フィルタが合成材料から製造された、請求項1〜11のいずれかに記載の装置。

請求項13

孔の直径が約2μm〜4μmである、請求項14に記載の装置。

請求項14

前記孔の直径が約3μmである、請求項15に記載の装置。

請求項15

前記装置が自動式である、請求項1〜14のいずれかに記載の装置。

請求項16

流体サンプルから固体画分を分離する方法であり、前記方法がi)請求項1の装置に流体サンプルを導入するステップと、ii)前記流体サンプルをろ過するステップと、iii)前記前置ろ過室から分離された前記画分を取り除くステップと、を備える方法。

請求項17

前記音波による前記前置ろ過室、および前記後置ろ過室内の前記流体の撹拌が、分離の全工程を通して連続的に行われる、請求項16に記載の方法。

請求項18

前記音波による前記前置ろ過室、および前記後置ろ過室内の前記流体の撹拌が、分離の全工程を通してパルス状である、請求項16に記載の方法。

請求項19

前記方法が、前記前置ろ過室、および前記後置ろ過室内の前記流体連続的にフィルタの反対方向へ移動するため、前記流体サンプルの正味の移動が、後置ろ過室へ入るステップをさらに備える請求項16〜18に記載の方法。

請求項20

前記方法が、分離工程中に前記フィルタを揺り動かすステップをさらに備える請求項16〜19に記載の方法。

請求項21

前記フィルタが、前記フィルタを垂直方向、横方向、またはその組み合わせの方向に振動可能な保持具と結合する請求項20に記載の方法。

請求項22

前記流体サンプルが液体である、請求項16〜21に記載の方法。

請求項23

前記液体が生物学的サンプルである、請求項22に記載の方法。

請求項24

前記生物学的サンプルが、血液サンプル、浸出液、尿サンプル、精液、骨髄穿刺液、脊髄液、組織からの細胞懸濁液、粘液、痰、または唾液である請求項23に記載の方法。

請求項25

前記固体画分が細胞画分である、請求項16〜24のいずれかに記載の装置。

請求項26

前記細胞画分が白血球画分である、請求項25に記載の装置。

請求項27

前記細胞画分が、幹細胞または前駆細胞から選択された未分化細胞である、請求項26に記載の装置。

技術分野

0001

関連する特許出願
本出願は、2007年3月2日出願の英国仮出願第0704180.9号、2007年11月15日出願の英国仮出願第0722448.8号、および2008年2月1日出願の英国仮出願第0801901.0号に対する優先権を主張し、これら出願のすべては、ここに組み込まれている。

0002

技術分野
本発明は、流体サンプルからの固体画分の分離に関する。特に本発明は、治療用細胞画分を骨髄サンプルなどの生物学的サンプルから分離する装置および方法に関する。

背景技術

0003

前駆細胞は、分化する際に多分化機能を有するため、潜在的に治療処置範囲の多様化に役立っている。病変、または損傷組織部位に運ばれる、これらの細胞濃縮画分加速された組織治癒を通じて最大の治療利益を有すると考えられている。前駆細胞は、いくつかの哺乳類細胞および体液内の非治療用細胞の不均一混合物内に含まれる細胞において、通常大変まれな個体数である(Caplan2005)。

0004

細胞を捕捉するための様々な技術と装置が文献にて公表されており、それらには沈降法(Takazawa&Tokashiki、1989)、遠心分離法(Apelman et al,1992;Jaeger,1992)、回転フィルタ(Himmerlflab et al,1969)、及びクロスフロー精密ろ過(Maiorella et al,1991)が含まれる。しかしこれらには、多くの不都合点がある。沈降プロセスは、細胞の低沈降速度、および遅い分離プロセスという難点がある。遠心分離法装置は、流体から細胞を外側に動かす半径方向の力に依存し、高い回収が迅速に行われたとしても、これらの装置は、通常装置に関し高い資本コストがかかる。さらに、高いせん断応力は、潜在的に細胞を損傷し、または例えば前駆細胞などに好ましくない変化を誘発させる場合がある。回転フィルタおよびクロスフローフィルタは、細胞懸濁液のろ過に膜を使用し、これらは付着物に影響されやすく、後に性能が損なわれる。これらのフィルタを使用する他のプロセスは、せん断制御ろ過(Vogel and Kroner,1999)、接線フローろ過(Radlett,1972)、およびダイナミックろ過を含む。分離の割合および効率は、付着物の程度に依存する。ダイナミックろ過は、フィルタを横切る流れと独立したせん断フローを発生させるための、膜とハウジングとの間の相互運動に依存する(Castilho&Medrohno,2002)。うず流ろ過、および回転円板フィルタは、ダイナミックろ過装置の一般的な二つのタイプである(Stromberg et al,1989)。Karumanchi et.al.(2002)は、所望の分離を達成するために電気磁気および音響現象を含む、細胞および生体高分子に対するフィールド支援分離技術の概要を提供した。誘電泳動は、不均一な電場により生じた偏極効果による非荷電粒子の横方向の動きである(Docoslis et al,1997,1999)。これは、非常に低い導電性媒体にのみ適用でき、他の場合には流体を過剰な加熱が起こる。磁気分離は、二つのタイプに分類される。一つ目は、分離される細胞が固有磁気特性を有するタイプ(例えば、赤血球走磁性細菌)であり、二つ目は、必要な混合物非磁性成分磁気応答性物質により磁化されるタイプである。両方の事例において、分離を達成するために、流体は磁場にさらされなければならない。磁気分離は、前駆細胞のための骨髄濃縮処理を含む、多数の細胞分離に広く用いられてきた(Roath et al,1990)。音響分離機は、微生物および細胞を分離するために広く用いられてきたが、一般的にほとんどは、超音波の使用に依存している。超音波細胞保持は、超音波が波の伝播と反対方向に反射する場合に形成される定在波により達成される。細胞は、定在波の波節面において捕捉される。Kilburn et al,(1989)およびWO95/001214は、懸濁液から細胞を分離する手段としてこれらの波の使用可能性を最初に報告し、その後この技術を利用した他の多数のレポートが報告されている(Coakley et al,1994;Dobelhoof-Dier,1994;Gaida et al,1996;Gorenflo et al,2003,2004)。超音波分離機は、慎重波長調整が必要であり、かつ通常荷重が制限されるため小容量の細胞しか回収できない。さらに、この技術は、流体相から細胞の均一集団を取り出すことに使用され、それゆえ均一混合物から特定の個体群を捕捉することができない。

0005

英国仮出願第0704180.9号
英国仮出願第0722448.8号
英国仮出願第0801901.0号
WO95/001214

先行技術

0006

Caplan Al, review: Mesenchymal stem cells: Cell Based Reconstructive Therapy in orthopaedics. Tissue Eng. 11 (7/8) 1198-1211 (2005)
Takazawa Y, Tokashiki M. Production of human-mouse chimeric antibody by high cell density perfusion culture. Cytotechnology 2 95-101 (1989)
Apelman S. Separation of animal cells in continuous cell culture systems. In Animal cell technology:basicand applied aspects. Kluwer Academic Publishers 149-54 (1992)
Jaeger V. High density perfusion culture of animal cells using a novel continuous flow centrifuge: In Animal cell technology: basic and applied aspects 209-348 (1992)
Himmerlfarb P, Thayer PS, et al. Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension. Science 164 555-7 (1969)
Maiorella B, Dorin G et al. Crossflow micro filtration of animal cells. Biotechnol. Bioeng. 37 121-6 (1991)
Vogel JH, Kroner KH, Controlled shear filtration: a novel technique for animal cell separation. Biotechnol. Bioeng. 63(6) 663-74 (1999)
Radlett PJ, The concentration of mammalian cells in a tangential flow filtration unit. J Appl. Chem Biotechnol. 22 495 (1972)
Castilho LR Medronho RA, Cell retention devices for suspended cell-perfusion cultures. Adv. Biochem Eng Biotechnol. 74 129-69 (2002)
StrombergRR, Friedman LI et al. Membrane technology applied to donor plasmapheresis. J Membrane Sci 44(1) 131-143 (1989)
Karumanchi RSMS, et al. Field assisted extraction of cells, particles and macromolecules. TrendsBiotechnol. 20 (2) 72-78 (2002)
Docoslis A, et al. A novel dielectrophoresis-based device for the selective retention of viable cells in culture media. Biotechnol. Bioeng. 54(3) 239-50 (1997)
Docoslis A et al. Dielectrophoretic forces can be safely used to retain viable cells in perfusion cultures of animal cells. Cytotechnology 30 133-42 (1999)
Roath S, Richards Smith A, et al. High gradient magnetic separation in blood and bone marrow processing. J Magnetism and Magnetic Mater. 85 (1-3) 285-90 (1990)
Kilburn DG, Clarke DJ et al. Enhanced sedimentation of mammalian cells following acoustic aggregation. Biotechnol. Bioeng. 34 559-62 (1989)
Coakley WT1 Whitworth G et al. Ultrasonic manipulation of particles and cells. Bioseparation. 4 73-83 (1994)
Doblhoff-Dier O, Gaider TH et al. A novel ultrasonic resonance field device for the retention of animal cells. Biotechnol. Prog. 10 428-432 (1994)
Gaida TH, et al. Selective retention of viable cells in ultrasonic resonance field devices. Biotechnol. Prog. 12 73-6 (1996)
Gorenflo VM, Smith L et al. Scale-up and optimisation of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of CHO cell culture. Biotechnol. Bioeng. 80 (4) 438-44 (2002)
GorenfloGM, Angepat S et al. Optimization of an acoustic cell filter with a novel air backflush system. Biotechnol. Prog. 19 30-6 (2003)

発明が解決しようとする課題

0007

本発明は、流体サンプルから固体画分を分離するための装置および方法を示す。本発明は特に、流体サンプル中の細胞均一混合物からの細胞画分の分離を示す。工程は、物理的手段のみを用いたサンプルの機械的ろ過に基づく、細胞分離の単一ステップ工程である。

課題を解決するための手段

0008

本発明の1つの見地によれば、流体サンプルから固体画分を分離する装置が提供され、装置はろ過装置を備え、ろ過装置は、
音波生成素子と、
装置を、流体サンプルを受け入れ前置ろ過室と音波の伝播が可能な流体を受け入れる後置ろ過室とに分割する、少なくともひとつのフィルタと、
後置ろ過室と関連するように構成された基材であり、音波の印加に対し共振可能な基材と、
を備え、
前記音波生成素子は、前記音波生成素子が前記基材の共振を引き起こし、前記後置ろ過室内の前記流体および前記前置ろ過室の前記流体サンプルの両者を通じ、次々に定在波を伝播するように、前記基材と関連するように構成されている装置。

0009

ろ過装置内の流体を通じる音響定在波の伝播により、分離工程中、連続的にまたはパルス状に流体が撹拌される。この撹拌の特定な利点は、フィルタの付着物と目詰まりとを最小限に抑えることである。

0010

流体サンプルから細胞画分を分離するために装置が利用される本発明の実施形態において、装置内の流体の撹拌は、フィルタを有する前置ろ過室内において細胞の接触時間または滞在時間を最小源に抑えるというさらなる利点を有する。細胞がフィルタの表面に接触、または十分近接している場合、周囲の流体の圧力により細胞が強制的に孔を通過させられる傾向があるため、この撹拌は好ましい。このような孔の通過は、細胞の変形によって行われるが、通過中、細胞はせん断応力のような細胞に対し悪影響を及ぼす、好ましくない応力にさらされる。特に、白血球機能は、せん断応力の重大な影響を受ける場合があるということが示されている(Carter et al, 2003)。したがって、対象となる細胞がフィルタを通過することを避けることが好ましい。この点において、対象となる細胞が前置ろ過室に保持されている間、フィルタは、流体および他の細胞画分の通過を許容するよう設計されている。音波生成素子は、電力信号に応じて音波場を生成可能な構造として形成されている。例えば単純なスピーカの場合、電力信号は、所定の振幅および周波数にて物理的に振動板を偏向させて音波を生成する。他の音響素子としては圧電型振動子が含まれ、圧電型振動子は、印加されたAC電圧に応じて振動エネルギーを生成し、物理的な振動は、音響の力として流体へ伝えられる。圧電型振動子の例としては、両面に金属被膜電極を有するセラミックディスクがあり、これらの薄い圧電型フィルムは通常酸化亜鉛である。

0011

音波生成素子と共振可能な基材との組み合わせは、音響素子単体での使用よりも多くの利点を有する。音響素子は、素子自体の錐体よりさらに広い面積を有する基材材料が付加された場合、この素子が向上した共振を提供するよう設計されているので、直接流体に接触しない。つまり、小型の音響素子を使用していたとしても、より大きなエネルギーを流体に供給することができる。これにより、全体としてエネルギー効率および装置占有面積が大幅に改善され、特に多量の流体を扱う場合に好都合である。適当な音響素子としては、モデル番号RM-ETN0033K19C-2K01がNXT Technology Limited(Hong Kong)より入手可能である。

0012

本発明の実施形態においては、音波生成素子は、周波数範囲が約300Hz〜700Hzの音響定在波を生成する。流体の量と必要な最適周波数との間には関連がある。したがって、本発明の特定の実施形態においては好都合に、使用者は流体サンプルの量を入力することができ、音響定在波の周波数が計算される。例えば、約5ml〜15mlの量を有するサンプルに対しては、音響定在波の最適周波数は約300Hz〜700Hzである。

0013

本発明による特定の実施形態においては、音波生成素子は、出力0.4W、抵抗4Ω、振幅範囲波高値約4.2V〜7.36V、および周波数範囲が約300Hz〜700Hzのスピーカである。

0014

本発明の実施形態においては、基材は実質的にフィルタと平行に配置される。本発明の実施形態においては、基材は、ろ過装置の基底に配置される。

0015

基材は、音響生成素子による刺激に応じて共振可能である適当な材料のいずれかを用いて作ることができる。例えば、金属、セラミックまたはポリマーなどである。基材は、装置内にて使用される流体と接触する可能性があるため、基材は、好都合に医療グレードの材料から作られる。これは、有毒物質汚染の危険性を低減させる。

0016

本発明の実施形態においては、音波生成素子は基材と可逆的に連結している。この連結は、当業者にとって利用可能な多様な手段、例えば接着剤の使用などにより達成される。これは、音響素子が離脱でき、他の装置に再利用できるため、特にろ過装置が使い捨てできるよう設計されている場合に特に好都合である。

0017

フィルタを横切る流体の移動は、重力による受動運動を介して行うことができる。一方、流体サンプルは、正圧または負圧の印加により、活発にフィルタを横切って動くことができる。フィルタを横切る流体サンプルの流量は、一定または可変にできる。

0018

また、本発明の実施形態においては、後置ろ過室内に提供される音波の伝播が可能な流体は、洗浄液として振舞う。本実施形態においては、圧ポンプが設けられ、正圧ポンプが洗浄液を、後置ろ過室からフィルタを通り前置ろ過室へ押し込む。同時に、負圧ポンプは前置ろ過室から後置ろ過室へ流体を引き込む。したがって、流体サンプルおよび洗浄液は、順次フィルタを横切り反対方向へ移動させられるため、流体サンプルの正味の移動は、後置ろ過室へ行われ、分離された固体画分は前置ろ過室に留まる。

0019

流体サンプルおよび洗浄液のフィルタを横切る反対方向への連続的な移動は、フィルタの付着物と目詰まりを防ぎ、さらに分離工程の効率を向上させる。この連続的な移動は、周期的にすることができ、この周期の第一段階は、洗浄液を使用しフィルタの高速逆流洗浄を行い、周期の第二段階は、流体サンプルを下方へ強制的にフィルタを通じさせる。サンプル量を十分に減らすために、また一方で微粒子画分溶液に留まるように十分な流体の量をフィルタより上に留めるために、この周期的な工程は継続される。通常、サンプル量は約十分の一に減少する。

0020

本発明のさらなる実施形態においては、分離工程中にフィルタ自体が、振動している。この振動は、例えば、フィルタを可動保持具と結合することにより達成される。振動は、垂直方向、横方向またはその組み合わせとすることができる。本発明の他の実施形態においては、フィルタを回転させることができる。

0021

洗浄液および/または流体サンプルの追加的な振動のための他の手段は、回転素子(例えば、羽根車または流体への挿入物)の使用、室の壁の回転、または室の壁に邪魔板またはアクティブチップを設けた室の壁を回転させることを含んでいる。

0022

「流体サンプル」は、固体成分が分離できる流体ならば何でもよい。サンプルはどのような源からでもよく、例えば生命体源、同種または異種からなる生命体グループ源、水分または土のような環境源、食品源または工業的な源などがある。サンプルは、処理済みサンプル、または未処理サンプルとすることができる。サンプルは、気体または液体とすることができる。サンプルは、土または食品サンプルからの抽出液などの抽出物とすることができる。

0023

本装置は特に、フィルタ表面にフィルムまたは被膜形成することにより、フィルタに付着する傾向がより大きい、粘性を有する液体に適している。フィルタを通る洗浄液による逆流洗浄、および流体サンプルおよび/またはフィルタの任意の振動は、十分にフィルタの付着物を減少し、また粒子画分前置ろ過副室の溶液内に留まらせる。

0024

サンプルは、被検体から得ることができる。被検体は、動物または人間などの生命体とすることができる。動物は、野生動物または家畜などの動物を含むことができる。家畜は、例えばまたはなどの愛玩動物を含むことができる。

0025

サンプルは、血液サンプル浸出液尿サンプル精液骨髄穿刺液脊髄液組織からの細胞懸濁液、粘液、または唾液などの生物学的サンプルとすることができる。生物学的サンプルはどんな動物からも得ることができ、人間からの生物学的サンプルに限定されない。ここで使用される「血液サンプル」は、処理済みサンプル、もしくは臍帯血サンプル、骨髄液、内部血液または末梢血液などの未処理血液サンプルに関し、どのような量でもよく、かつ動物または人間などのどの被検体のものでもよい。好ましい被検体は、人間である。

0026

生物学的流体サンプルから分離される固体画分は、少なくともひとつの細胞画分を備えている。細胞画分は、治療用細胞を備えることが好ましく、これは治療効果または治癒効果を有する任意の細胞である。

0027

細胞画分は、少なくともひとつの白血球を備える、または少なくともひとつの白血球からなることができる。「白血球細胞」は、白血球もしくは、網赤血球または血小板ではない造血系細胞であり、動物または人間の血液内に見つけることができる。白血球は、ナチュラルキラー細胞(「NK細胞」)と、Bリンパ球(「B細胞」)またはTリンパ球(「T細胞」)などのリンパ球とを含むことができる。また白血球は、単球マクロファージおよび、好塩基球と、好酸球と、好中球とを含む顆粒球などの食細胞を含むことができる。また白血球は、肥満細胞を含むことができる。

0028

細胞画分は、少なくともひとつの赤血球を備える、または少なくともひとつの赤血球からなることができる。「赤血球細胞」は赤血球である。

0029

細胞画分は、少なくともひとつの新生細胞を備える、または少なくともひとつの新生細胞からなることができる。「新生細胞」は、制御不可能な細胞増殖性を有し、新成長誘起する刺激を止めた後も成長し続ける異常細胞に関する。新生細胞は、部分的な、または完全な組織構造欠損、および正常な組織との機能的協調を示す傾向があり、さらに新生細胞は、良性または悪性であり得る。

0030

細胞画分は、少なくともひとつの悪性細胞を備える、または少なくともひとつの悪性細胞からなることができる。「悪性細胞」は、局所的に侵入し、かつ破壊的に成長および転移する性質を有する細胞に関する。悪性細胞の例は、ただしこれに限らないが、血液、骨髄、腹水、尿、気管支洗浄液などの様々な体液内の、白血病細胞リンパ腫細胞固形腫瘍がん細胞、転移性固形腫瘍細胞(例えば、乳がん細胞前立腺がん細胞肺がん細胞大腸がん細胞など)を含んでいる。

0031

細胞画分は、少なくともひとつの癌性細胞を備える、または少なくともひとつの癌性細胞からなることができる。「癌性細胞」は、無秩序な成長を示し、ほとんどの場合、少なくともひとつの分化特性を失った細胞に関する。この分化特性は、限定はしないが、例えば特徴的形態、非転移性行動細胞間相互作用細胞シグナル伝達行動、およびたんぱく質発現および分泌パターンなどである。

0032

細胞画分は、少なくともひとつの幹細胞を備える、または少なくともひとつの幹細胞からなることができる。「幹細胞」は、一回または複数の細胞分裂周期を経て、少なくともひとつの分化細胞型を生じることのできる未分化細胞である。

0033

細胞画分は、少なくともひとつの前駆細胞を備える、または少なくともひとつの前駆細胞からなる。「前駆細胞」は、一回または複数の細胞分裂周期を経て、少なくともひとつの分化細胞型を生じることのできる、未分化細胞ではない委任細胞である。通常幹細胞は、一回または複数の細胞分裂周期を経て、特定の刺激または複数の刺激に応じて前駆細胞を生じ、かつ前駆細胞は、特定の刺激または複数の刺激に応じ、ひとつまたは複数の分化細胞型を生じる。

0034

骨髄(bone marrow)(またはmedulla ossea)は、骨の中空内部に見つかる柔らかい組織である。骨髄には、赤色骨髄(または骨髄組織として知られている)および黄色骨髄の二種類がある。赤血球、血小板、およびほとんどの白血球は、赤色骨髄から発生し、白血球の一部は、黄色骨髄にて成長する。

0035

骨髄は、造血幹細胞、および間葉系幹細胞の二種類の幹細胞を含む。幹細胞は、多細胞生体に共通する初期の細胞であり、細胞分裂により自らを再生する能力を保持し、広い範囲の特殊化した細胞型に分化することができる。造血幹細胞は、血液循環中に見られる3クラスの血液細胞、つまり白血球(白血球)、赤血球(赤血球)および血小板(血小板)を生じる。間葉系幹細胞は、骨髄の中央洞部周辺整列して見られ、骨芽細胞軟骨細胞筋細胞、および他多数のタイプの細胞に分化する能力を有する。

0036

胚幹細胞は、分化全能性または多能性という点において、真の幹細胞であり、自己複製の能力を無限に示す一方、骨髄内の成長した幹細胞は、より適切には前駆細胞と名づけられ、はるかに限定されるが、幹細胞のように自己複製および分化の能力を有する。通常前駆細胞は、多能性というよりも、単能性または複能性である。

0037

通常骨髄より得られる間葉系幹細胞またはMSCは、多種の細胞型に分化可能な複能性幹細胞である。MSCが分化することが示された細胞型は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、および神経細胞を含んでいる。

0038

骨髄密度は、患者により変動する場合があり、実際に変動しておりかつ骨髄の粘性は均一ではない。若い患者は、空洞内のより小柱状の組織により、濃密かつ粘度の高い骨髄を有する場合が多い。この粘性骨髄は、分離装置のフィルタに付着する傾向がある。

0039

本発明の実施形態における流体サンプルは、骨髄穿刺液である。

0040

本発明のさらなる実施形態においては、流体サンプルは骨髄穿刺液であり、かつ固体画分は前駆細胞である。

0041

ここで使用される「組織」は、すべての動物に存在する基本の4タイプの組織を含み、それは、上皮組織結合組織筋組織、および神経組織である。

0042

結合組織の例は、皮膚、筋肉軟骨、骨、靭帯関節包、および脂肪組織を含んでいる。

0043

ここで使用される「脂肪組織」は、体内脂肪および他の微小血管組織源を意味することを意図する。脂肪組織は、脂肪細胞、周皮細胞線維芽細胞、マクロファージ、幹細胞、および微小血管細胞を含む多細胞タイプを包含する複合組織である。このような脂肪組織は、体内の前駆細胞の最も好都合な源のひとつである。

0044

ここで使用される「微小血管細胞」は、例えば内皮細胞平滑筋細胞および周皮細胞などの、微小血管系の構造を備える細胞を意味することを意図する。

0045

脂肪細胞は、体内に蓄積した脂肪から取り出すことができる。最適な蓄積場所は、精巣上体肩甲骨間脂肪パッド、または膝蓋下の脂肪パッド(ホッファ脂肪パッド)を含んでいる。代わりに、潜在的にさらに好都合なのは、脂肪組織は、脂肪吸引術方法により吸引脂肪として得ることができる。

0046

吸引脂肪は、本発明の装置に直接導入可能ではあるが、脂肪組織の断片は前処理が必要である。断片組織は、組織の細胞成分を解放するために粉砕され、および/または酵素により分解される。その後、この細胞成分を適切な担体に懸濁させ、装置に導入することができる。

0047

上述により得られた吸引脂肪、および/または細胞懸濁液は、装置への導入前にさらに処理を受ける場合があることが想定される。例えば、大きい脂肪小球および脂肪細胞を(幹細胞、内皮細胞、および周皮細胞を備える)間質画分から分離するために、重力沈降、および/または遠心分離法を使用する場合がある。

0048

生物学的サンプルがろ過される本発明の実施形態においては、流体を被験者から直接ろ過装置へ移動するために、ろ過装置を吸引装置に連結することができる。ろ過装置は、無菌環境において使用することができ、この配置により、患者からサンプルを取り、ろ過装置へ導入する間のサンプルの汚染の危険性を減少させる。

0049

本発明の代替実施形態においては、固体画分は、被験者に感染するバクテリア、菌、原生動物ウィルス寄生生物、またはプリオンなどの病因からなることができる。

0050

サンプルは、試験管内の細胞懸濁液とすることができる。

0051

金属箔とも呼べるフィルタは、本発明において示した方法による流体サンプルからの固体画分の分離に適した任意の材料から製造することができる。フィルタは、自然材料、合成材料またはそれらの組み合わせから製造することができる。適した材料は、金属に限定はしないが、金属合金、セラミック、または高分子材料を含んでいる。例としては、ポリカーボネートPLC)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリイミド(PI)、ニッケル、およびステンレス鋼を含んでいる。材料は、医療グレードの材料が好ましい。適当なトラックエッチドフィルタはit4ip(ベルギー)から入手可能である。適当なニッケル箔フィルタは、Tecan Limited (英国)から入手可能である。

0052

本発明の実施形態においては、フィルタは実質的に平面である。つまりフィルタは、フィルタ直径がフィルタ高さより大きい、二次元の形状を有する。このような形状は、フィルタが流体サンプルにさらされる潜在的面積を増加させ、それによりろ過率を増加させる。またこの形状は、固形物質がフィルタの目詰まりとなる可能性を最小にする。

0053

フィルタの適当な厚さの例は、11μm、23μm、および50μmである。フィルタが薄くなるほど、流体がフィルタを通って流れる速度は早くなる。

0054

フィルタは、同じ形状の等しい直径、または異なる直径の孔とともに提供される場合があることが想定される。あるいは、フィルタは異なる形状の等しい直径の孔とともに提供される場合がある。またあるいはフィルタは、異なる形状の異なる直径の孔とともに提供される場合がある。

0055

適当な孔の形状は、限定はしないが、横断面が円形楕円形正方形長方形、または三角形を含んでいる。

0056

孔は、テーパー状とすることができる。孔のテーパーは、真空下にて細胞の変形を容易にする。各テーパーの先端の孔の大きさ、およびテーパーの向きに依存し、大きさに基づいた優先的選択が行われる。本発明の好都合な実施形態において、テーパー孔の最も狭い点は、フィルタの上面に位置する。この配置は、大きな細胞はフィルタより上に留まるが、より小さな細胞は孔を通って流れることを許容する。逆に、洗浄液がフィルタを通る上向きの逆流洗浄中には、後置ろ過室内の細胞が孔を通って戻ることが、さらに困難となるようにみえる。孔の最も狭い点がフィルタの下面に位置する場合、細胞が孔に入り、最も狭い点に押し込むために歪む傾向を有するということがわかっている。

0057

本発明の特定の実施形態においては、孔の直径は、1μm〜12μmの範囲である。

0058

本発明のさらなる実施形態においては、孔は円柱形状とすることができる。

0059

骨髄穿刺液から前駆細胞を分離する、本発明のさらなる実施形態においては、適当なフィルタはPETから作られ、フィルタは厚さ23μm、孔直径3μm、および孔密度400,000個/cm2である。フィルタを通して流体を効率的に「引っぱる」ために、真空ポンプにより発生させる最適な負圧の範囲は、約−0.1psi〜−0.5psi、特に−0.2psi〜−0.3psiである。あるいは、フィルタを通して流体を効率的に「押す」ために、正圧を発生させてもよい。このようなポンプにて発生させる最適な正圧の範囲は、約+0.1psi〜+0.5psi、特に+0.2psi〜+0.3psiである。

0060

ろ過装置の設計は、流体サンプル用前置ろ過室の縦横比を減少させるような改良が可能であり、それにより単位体積あたりより大きなろ過面積を設けることができる。

0061

本発明のさらなる実施形態においては、ろ過装置の前置ろ過室は、ウェルプレートフォーマットとも呼ばれる、一回分の流体サンプルを受け入れるために使用することができる複数の室に分けられる。

0062

ろ過に続き、分離(精製、濃縮、または濃厚とも言われる)固体画分を備える残留流体サンプルは、例えばピペットを使用し、吸引によりろ過装置の上段室から取り出され、貯蔵または使用される。本発明の他の実施形態において、特に残留流体サンプルが治療用細胞画分を備える実施形態においては、残留流体サンプルは、例えばヒドロゲルまたは骨セメントと混合することができる。これらの実施形態においては、ヒドロゲルまたは骨セメントは、細胞の保管場所として機能する。

0063

本発明の態様によると、流体サンプルから固体画分を分離する方法が提供され、前記方法は、
i) 流体サンプルを本発明による装置内に導入するステップと、
ii) 流体サンプルをろ過するステップと、
iii)分離された画分を前置ろ過室から取り出すステップと、
を備える。

0064

本発明のさらなる態様によると、本発明の装置を使用し、流体サンプルから治療用細胞を隔離、または分離する方法が提供される。

0065

本発明の実施形態において、流体サンプルは、血液サンプル、浸出液、尿サンプル、精液、骨髄穿刺液、脊髄液、組織からの細胞懸濁液、粘液、痰、または唾液などの生物学的サンプルとすることができる。

0066

本発明の実施形態において、治療用細胞は、前駆細胞である。

0067

本発明のさらなる態様によると、本発明の装置を使用し、骨髄穿刺液から治療用細胞を隔離、または分離する方法が提供される。

0068

本発明の実施形態において、治療用細胞は、前駆細胞である。

0069

このシステムは、手動で操作することができる。しかし、分離工程の全体としての効率と正確性を向上させるために、特に医療スタッフにより手術室にて装置が使用される場合、装置は好都合に自動化される。プログラマブルロジックコントローラ(PLC)は、時限付きシーケンスにより、周期的に交互に、真空ポンプおよび逆流洗浄ポンプのオンオフとを切り替えるようプログラムできる。真空ポンプは、負圧下にて流体サンプルがフィルタを通り下へ向かうよう引き寄せる。逆流洗浄ポンプは、洗浄液がフィルタを通り上へ向かうよう押し上げる。

0070

ろ過室および/またはフィルタは、使い捨て可能である。制御装置は、使い捨て可能、または独立型専用装置とすることができる。

0071

本発明のさらなる態様において、隔離された単体または複数の治療用細胞は、懸濁液としてそれを必要とする環境の中に直接投与される。あるいは、細胞は、例えばゲルペーストセメントグルースカフォード、フィルム、インプラントまたはドレッシングなどの適切な担体物質と組み合わせる、または結合させることができる。

0072

隔離された治療用細胞は、人間および/または人間以外の動物を治療、再生、および/または組織機能を増強するために、医療の適用範囲内で利用されることが想定される。

0073

医療の適用例は、整形外科神経科心臓血管科、皮膚科美容外科、および歯科を含んでいる。

0074

本発明の特定の実施形態において、隔離された治療用細胞は、間葉系幹細胞を備えることが想定される。これらの細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、および脂肪細胞に分化可能である。間葉系幹細胞を備える治療用画分は、病気または怪我がもたらした整形外科の適応症、例えば、軟骨治療、骨治療(骨折治療を含む)、脊椎固定変性椎間板治療(環部の治療、髄核密度増強、椎間板増強を含む)などに使用することができる。

0075

機能的な内皮前駆細胞(EPC)は、血管形成および血管新生の中心となる。EPCは、成体動物の骨髄単核球細胞から発達することが示されている。したがって、本発明の特定の実施形態において、隔離された治療用細胞はEPCを備え、この治療用画分は、末梢血管疾患のように、損傷を受けた、または虚血の組織を治療、再生または血管形成する必要のある適応症に使用することができることが想定される。

0076

したがって、i)被験者の組織内の新しい血管を形成する、ii)被験者の組織内の血流を増加させる、iii)被験者の患部組織を治療する、iv)患部組織の血管新生を増加させる、またはv)被験者の心臓麻痺を防ぐための方法が提供され、すべての前記方法は、
a)本発明による装置を使用し骨単核球細胞を隔離するステップと、
b)組織内で新しい血管を形成させるために、有効な量の骨髄単核球細胞を組織に局所的に移植するステップと、
を備える。

0077

本発明の実施形態において、骨髄単核球細胞は、自家移植性である。

0078

骨髄単核球細胞が移植される組織は、病気の、または損傷を受けた組織、および治療または再生が必要な組織を含んでいる。この治療または再生が必要な組織は、灌流の悪い組織に限らず、例えば慢性虚血、さらに心筋組織骨格筋組織、例えば脳卒中または動静脈奇形に冒された脳組織冠状血管腎臓肝臓消化管臓器神経学に基づいた筋肉萎縮を含む萎縮に悩まされる筋肉組織にみられる組織を含んでいる。

0079

本発明の実施形態における、新しい血管は、毛血管および/または側副血管である。

0080

添付図を参照して、本発明を下記に説明する。

図面の簡単な説明

0081

本発明の装置の一般的な動作原理を示した概略図である。
前置ろ過室および後置ろ過室内の流体がフィルタを横切り順次移動する本発明の装置の実施形態を示した概略図である。
制御装置の写真である。
ろ過装置の写真である。
制御装置に接続されたろ過装置の写真である。
音波生成素子の写真である。
ろ過装置内にて使用する振動フィルタ保持具である。
本発明の装置内の、所定の平均サイズの孔のフィルタを使用した、ブタ全血からの単核球(MNC)の平均濃縮度を示す(n=6)。
本発明の装置内の、平均2.9μmの大きさの孔のフィルタを使用した、ブタの全血からのMNCを濃縮する工程時間を示す(n=3)。
本発明の装置を使用し、運用条件を変化させ、8分を越えた場合のブタの骨髄の体積減少を示す。この装置は、平均約3μmの大きさの孔のフィルタを使用し、流速は6drops/分である。
直列ニードルバルブを用いた減圧制限によるフィルタを横切る最適な流速を示す。
本発明の装置を使用した白血球および赤血球の増加倍率を示す。
本発明の装置を使用したろ過前後の、ブタの全血サンプル内の白血球の赤血球に対する割合を示す。
分離装置を使用し、10分の1までおよび10分の1を越える体積減少により、90%を越える単核球の回収が達成されたことを示すデータである。体積減少および単核球の濃縮度は、線形的に相関する。通常の工程時間は、10分以下である。
単核球をブタのBMAから分離するPETフィルタの孔の大きさ分布の代表的な分析表を示す。

実施例

0082

図1:本発明の装置の一般的な動作原理を示した概略図であり、図中の下記の符号は以下を示す。
1.ろ過装置
2.多孔質フィルタ
3.流体サンプルを受け入れる、上段(前置ろ過)室
4.流体サンプル
5.逆流洗浄液を受け入れる、下段後置ろ過)室
6.後置ろ過室に提供された流体
7.共振基材
8.音波生成素子
9.真空引き(オプション

0083

多孔質フィルタ2は、ろ過装置1を、細胞分離を必要とする流体サンプル4が導入される上段(前置ろ過)室3と、音響定在波を伝播可能な流体6が導入される下段(後置ろ過)室5との二つの室に分ける。音響素子8は基材7と結合しており、この基材7は、下段室内の底に位置し、音波生成素子に応じて共振し、二つの流体面およびフィルタを通じて定在波を生成してサンプルを撹拌する。同時に、周期的な真空引き9プロセスにより、サンプルはフィルタを通り下方へ移動する。真空圧流体速度、および振動周波数は、適切なポンプとバルブを収容した遠隔装置により制御される。より小さい細胞がフィルタを通り廃棄容器(図示せず)へ向かう一方、所望の大きい細胞が濃縮された画分は、フィルタ上方に保持される。

0084

本発明の特定の実施形態においては、音響素子は、出力0.4W、抵抗40Ω、振幅範囲の波高値が約4.2V〜7.36V、および周波数範囲約300Hz〜700Hzのスピーカである。

0085

図2:前置ろ過室および後置ろ過室内の流体がフィルタを横切り順次移動する本発明の装置の実施形態を示した概略図であり、図中の下記の符号は以下を示す。
10.ろ過装置
11.多孔質フィルタ
12.ろ過装置から排出液を受け入れる容器
13.逆流洗浄液を受け入れる容器
14.逆流洗浄ポンプ
15.真空ポンプ
16.音波生成素子/共振基材
17.ソレノイドバルブ(逆流洗浄ライン
18.ソレノイドバルブ(真空ライン
19.PLCデジタル制御装置およびディスプレイ
20.ニードルバルブ

0086

この図は、(図1に示した)本発明のろ過装置および制御装置を備える装置を示す。制御装置19内のPLCコントローラ(三菱AL2-24MR-04)は、真空ポンプ15および逆流洗浄ポンプ14(両ポンプともに、Koge KPV14A-6A)のオンとオフとを切り替えるようプログラムできる。また、このコントローラはソレノイドバルブ(Cole Parmer 98302-02)17および18の始動を制御するためにも使用される。これは、バルブおよびポンプを時限付きシーケンスにより動作させる、またはポンプを手動で制御するようプログラムできる。制御装置に組み込まれた増幅器および信号生成チップは、PLCを介して音響素子18の周波数および振幅を設定することができる。装置からの排出液を収集する容器12および逆流洗浄液を供給する容器13は、ろ過装置および制御装置に適切な流管にて接続されている。

0087

図3:制御装置の写真であり、図中の下記の符号は以下を示す。
21.制御ボックスに収容されたPLC装置
22.制御キーボード
23.装置オン/オフ
24.真空ラインソレノイド制御
25.音響素子オン/オフ
26.真空手動切り替え
27.逆流洗浄手動切り替え
28.音響周波数制御
29.音響素子振幅制御
30.音響素子周波数表示
31.滴下現象表示LE

0088

図4:本発明のろ過装置の構成品の組み立てを示す写真であり、図中の下記の符号は以下を示す。
32.上段室
33.中段
34.上段室および下段室を固定するクランプ
35.膜フィルタ
36.上段室および中段室が共に固定された場合のフィルタを密封するOリング
37.中段室内の組織サンプル用上段タンク
38.フィルタ下方の生理食塩水タンクへの入口
39.下段室
40.音響素子
41.音響素子を密封するOリング
42.音響素子の電気接続用出口

0089

図5:制御装置に接続したろ過装置の写真であり、図中の下記の符号は以下を示す。
43.ろ過装置
44.ろ過装置から真空ポンプへの真空ライン
45.真空ポンプ
46.真空ソレノイド
47.廃棄室への真空ライン
48.廃棄室
49.ろ過装置への逆流洗浄ライン
50.逆流洗浄ポンプ
51.逆流洗浄ソレノイド
52.逆流洗浄生理食塩水タンク
53.滴下現象センサ

0090

図6:音波生成素子の写真である。54は可動コイルNXT励起子を示す。

0091

下記の説明は、流体が順次フィルタを横切り移動する本発明の実施形態に関する。

0092

通常の運転において、ろ過装置には流体はない。ろ過装置(10)の下段室に流体を供給するために、流体がフィルタ(11)を通じて上段(前置ろ過)室に入るまで、逆流洗浄ポンプのスイッチがオンにされる。音響素子は、振幅の波高値が4.2V〜7.36Vの範囲、周波数範囲が300Hz〜700Hzである。素子は、流体を通じて定在波を起こすよう設置され、流体が一定の撹拌状態にある様子が観察される。液面を、ちょうどフィルタを横切り通過するポイント引き下げるために、真空ポンプのスイッチを入れる。フィルタを横切る流速は、ニードルバルブ20により適宜調節される。サンプル流体は、上段(前置ろ過)室へ供給され、一定の攪拌状態にある様子が観察される。サンプル量をゆっくり減少させるために、PLCにより急速な逆流洗浄および真空引きの周期的な工程を開始する。サンプル量が、通常10分の1まで減少し、PLCによりこの工程が停止される。サンプルは、上段(前置ろ過)室から取り除かれる。

0093

図7は、本発明の装置において使用するフィルタ保持具を示す。フィルタ保持具の設計は、フィルタが横方向、垂直方向またはその組み合わせの方向への移動を許容する。保持具55は、実質的に円形である。型またはU型の開口部56は、保持具を外側環状部57および中央円形島58の二つの部分に分ける。57によって示された部分は、架橋素子59aおよび59bにより58によって示された部分に接続されている。部分58には、複数の孔が設けられている。これら孔は、均一のパターンとして配置されている。孔は実質的に直径約3μmの円形である。ピン素子60が、架橋素子59bの方向に沿って57の外面に設けられている。このピン素子60は、装置外部のモータおよびカム(図示せず)により機械的に駆動される。

0094

フィルタ保持具とフィルタとの組み合わせは、単体のプラスチックユニットとして製造されている。

0095

流体サンプルからの固体画分の分離例
1.ヒト骨髄穿刺液サンプル
ヒト骨髄穿刺液は、Cambrexより購入し、使用前に70μm細胞ろ過器に通し、脂肪細胞および大きな細胞集団を除去した。白血球(WBC)および赤血球(RBC)を、コールターカウンターにて計数した。約〜3μmの孔を有するフィルタとして作用する電気メッキ蝕刻された網を装填した装置に、2mlの細胞懸濁液を加えた。分離工程は、装置の制御装置を使用して開始され、装置の上段室のフィルタより上流に約200μlの濃縮流体画分が残留するまで継続された。工程後、100μlの濃縮液が装置のフィルタ上方より取り出され、各実験前に毎日基準標準校正されたコールター・カウンターに通された。サンプルにおけるWBCおよびRBCの計数結果が得られた。

0096

2.ブタ骨髄液サンプル
ブタ細胞の個体数の隔離および培養拡大
新鮮なブタ後肢屠殺場から集めた。骨髄小柱(trabeculum)は、各肢の大腿骨頭から抽出され、PBSを含むポットに収集された。はさみを使用し骨髄をよく細分し、得られた懸濁液を、37℃/5%CO2でオービタルシェーカーにて撹拌するために残し、その後、上澄み液を70μm細胞ろ過器に通し、個別の管に入れた。さらに管を1500rpmで5分間回転させ、上澄み液は廃棄され、得られた沈殿物を10mlのα−MEM+15%FCS媒体に再び懸濁した。

0097

骨髄は、上述のように分離かつ処理され、さらに100μlの骨髄懸濁液は、各実験前に毎日、基準標準に校正されたコールター・カウンターに通された。得られたWBCおよびRBCの計数結果は、骨髄のWBC抽出液をブタの血漿の抽出液により希釈して1mlあたり細胞数を1×107にするために、使用された。この流体2mlは、ろ過のために装置に追加された。

0098

ブタ血漿の準備
新鮮なブタの血液は、屠殺場から4%(w/v)のクエン酸ナトリウム塩基性溶液(sigma)を含む貯蔵ビンに、1:9の割合(クエン酸対血液)で集められた。血液は、50mlファルコンチューブに等分され、2500rpmで30分回転され、上澄み液は慎重に別のファルコンチューブに移された。上澄み液は、再度2500rpmで30分回転され、その上澄み液は、新しい50mlファルコンチューブに移され、使用されるまで−20℃にて貯蔵された。

0099

ブタ骨髄穿刺液のフィコール分離
前に説明したように、骨髄は新鮮なブタ後肢より抽出され、最終の細胞沈殿物は、25mlのα-MEM+15%FCS媒体に再び懸濁された。

0100

新鮮なブタ血液を、リン酸緩衝生理食塩水により希釈し、RBCの数を、1mlあたりの細胞約3.5×109に減少させた。一旦これが実施されると、前に得られた骨髄を加えることによりWBCの数は1mlあたりの細胞約2.5×107に増加した。その後、血液は、2:1(平衡塩類溶液:血液)に希釈され、この希釈血液35mlを、15mlのFicoll(Amersham biosciences)の上に重ねた。その後チューブを、ブレーキのスイッチを切った状態において、1800rpmで30分回転させた(Megafuge 1.0R SOP/CB/021)。WBC層は、抽出され、沈殿され、低グルコースDMEM媒体にて再び懸濁され、RBCおよびWBC両方の生成物の計数が行われた。

0101

3.ブタ血液サンプル
新鮮なブタの血液は屠殺場から、4%(w/v)のクエン酸ナトリウム三塩基性溶液を含む貯蔵ビンに、1:9の割合(クエン酸対血液)で集められた。通常、等分された20mlのこの液は、70μm細胞ろ過器に通され、収集管に入れられる。毎回新しいろ過器を使用して、この工程は3回繰り返された。ろ過された最終のサンプル2mlは、ろ過のために装置に追加された。

0102

結果
図8:ブタの全血からMNCを回収するには、約3μmの大きさの孔を持つフィルタが最適(p<0.05)であることが実証された。利用された統計検査は、Tukey事後解析による一元配置分散分析法であり、信頼区間は95%である。

0103

図9は、約3μmの大きさの孔のフィルタを使用した場合、ブタの全血からのMNCは、6分以内に6倍以上に濃縮されることを示す。

0104

図10は、以下の装置の組み合わせの運用条件にて、ブタ骨髄組織の体積が約10分の1に減少できることを示す。(i)流体サンプルがフィルタを通り下へ行くようにする真空引き、(ii)洗浄液がフィルタを通り上へ行くようにする逆流洗浄、および(iii)洗浄液およびサンプル液を介し上へ向かう定在波を生成および伝播する音響素子

0105

図11フィルタを通る流体の最適な流速が決定された。流体サンプルは、ブタの骨髄から抽出した。ろ過前の流体サンプルの体積は2mlであった。ろ過後の流体サンプルの体積は200μlであった。この流体サンプルの体積減少を達成するための時間は、6drops/分にて8分、12drops/分にて4分、25drops/分にて2分であり、すべてにおいて3μmのメッシュフィルタを使用した。流速が12drops/分または25drops/分の場合に比べ、濃縮流体サンプルにおいて、MNCsの濃縮率が向上したので、最適な流速は、6drops/分であることが判明した。

0106

図12は、ろ過後の流体サンプル内の、RBCと比べたWBCの濃縮度を示す。1未満のグラフは、RBCがフィルタを通過したことを示す。

0107

図13は、ブタの全血サンプルにおいて、ろ過前およびろ過後のRBC対WBCの比を示す。ろ過前のRBC対WBCの比は、約375:1である。ろ過後のRBC対WBCの比は、約50:1である。

0108

図14は、骨髄有核細胞濃縮倍率およびヒト骨髄の骨髄有核細胞残留%を示し、厚さ23μm、孔の密度400kおよび孔の大きさ3.5μmのPETフィルタを使用した。

0109

図15は、孔の密度が400,000であるPETフィルタ上の孔の大きさの分布を示す。さらに図は、骨髄穿刺液からの処理細胞の場合の、このフィルタの効率を示す。

0110

1ろ過装置
2多孔質フィルタ
3流体サンプルを受け入れる、上段(前置ろ過)室
4 流体サンプル
5逆流洗浄液を受け入れる、下段(後置ろ過)室
6後置ろ過室に提供された流体
7共振基材
8音波生成素子
9真空引き(オプション)
10 ろ過装置
11 多孔質フィルタ
12 ろ過装置から排出液を受け入れる容器
13 逆流洗浄液を受け入れる容器
14逆流洗浄ポンプ
15真空ポンプ
16 音波生成素子/共振基材
17ソレノイドバルブ(逆流洗浄ライン)
18 ソレノイドバルブ(真空ライン)
19PLCデジタル制御装置およびディスプレイ
20ニードルバルブ
21制御ボックスに収容されたPLC装置
22制御キーボード
23 装置オン/オフ
24 真空ラインソレノイド制御
25音響素子オン/オフ
26 真空手動切り替え
27 逆流洗浄手動切り替え
28音響周波数制御
29 音響素子振幅制御
30 音響素子周波数表示器
31滴下現象表示LED
32上段室
33中段室
34 上段室および下段室を固定するクランプ
35膜フィルタ
36 上段室および中段室が共に固定された場合のフィルタを密封するOリング
37 中段室内の組織サンプル用上段タンク
38 フィルタ下方の生理食塩水タンクへの入口
39 下段室
40 音響素子
41 音響素子を密封するOリング
42 音響素子の電気接続用出口
43 ろ過装置
44 ろ過装置から真空ポンプへの真空ライン
45 真空ポンプ
46 真空ソレノイド
47廃棄室への真空ライン
48 廃棄室
49 ろ過装置への逆流洗浄ライン
50 逆流洗浄ポンプ
51 逆流洗浄ソレノイド
52 逆流洗浄生理食塩水タンク
53 滴下現象センサ

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