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技術 微小管安定化剤を用いたアテローム性動脈硬化症または再狭窄症の治療方法

出願人 アメリカ合衆国
発明者 キンセラ,ジェームズ・エルソロット,スティーヴン・ジェイ
出願日 2010年6月1日 (10年1ヶ月経過) 出願番号 2010-125458
公開日 2010年8月26日 (9年10ヶ月経過) 公開番号 2010-184935
状態 特許登録済
技術分野 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 弾力層 固有運動 取り込み結果 レーザー剥離 ポリオレフィン容器 フィルター孔 微孔性フィルタ 形態変更
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重要な関連分野

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図面 (5)

課題

本発明はアテローム性動脈硬化症または再狭窄症を予防または軽減する方法、ならびにこれに使用する医薬調製物に関する。

解決手段

特に、本発明は、タキソール登録商標)または水溶性タキソール誘導体のような微小管安定化剤を低投与量用いて治療する動脈損傷後のアテローム性動脈硬化症または再狭窄症を予防または軽減する方法である。本発明で用いる低投与量は、医薬の好ましくない副作用を最小にしながら、動脈閉鎖を防止する。

概要

背景

血管系の疾患は、先進国において、特に老人を苦しめる主な死亡及び植物状態の原因である。合衆国のみにおいて、近年の減少傾向は励みとなるものだが、心臓血管系の疾患は未だに毎年ほぼ百万人もの死亡の原因となっており、これは全ての死因の半分以上である;心臓血管系の疾患で苦しむおよそ五百万人もの人が毎年入院している。苦しんでいる人及び物的資源の点から見ると、この疾患による犠牲はほとんど計り知れないほどである。

アテローム性動脈硬化症は血管系の疾患の最も一般的な形態であり、重要な身体の器官への血液の供給が不十分となり、結果として心臓発作、卒中、及び腎不全を招く。更に、アテローム性動脈硬化症は、喫煙者と同様、高血圧症糖尿病を患う人に主な合併症を引き起こす。アテローム性動脈硬化症は、通常血流を調整する血管の緊張力を調節する動脈壁の正常な血管平滑筋細胞(“VSMC”)のいくつかが、その性質を変えて“癌−様”の振舞いをするようになる慢性的血管損傷の型である。これらのVSMCは異常に増殖するようになり、これらが内側の血管内膜中に侵入して広がることを可能にする物質成長因子組織分解酵素及び他のタンパク質)を分泌し、血流を遮断し、そして異常に弱くなった血管を局所的な血液の凝塊によって完全に遮断し、その動脈につながる組織を死に到らしめる。

再狭窄症、すなわち矯正的な手術後の狭窄または動脈狭窄再発は、アテローム性動脈硬化症の加速された形態である。近年の証拠によって、冠静脈移植及び心臓同種移植によるアテローム性動脈硬化症に伴う冠動脈の再狭窄症は、自発的なアテローム性動脈硬化症に到る同じ発病過程が大きく加速された型を示すと考えることができる血管損傷の統合仮説が支持された(Ip,J.H.,et al.,(1990)J Am Coll Cardiol,15:1667−1687;Muller,D.W.M.,et al.,(1992)J Am Coll Cardiol,19:418−432)。再狭窄症は、血小板由来増殖因子(PDGF)及び塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む有力な成長−調節分子関与する血管損傷に対する一連の複雑な線維増殖的な応答であるため、アテローム性動脈硬化症の病変部位における後期の段階に共通しており、血管平滑筋細胞増殖、移動及び新生動脈内膜蓄積に到る。

再狭窄症は、冠動脈バイパス手術(CAB)、血管内膜切除術、及び心臓移植、そして特に心臓バルーン血管形成術、アセレクトミー(atherectomy)、レーザー剥離または脈管内テンチング(stenting)の後に生じ(これらのいずれも患者の三分の一において、6月以内に動脈遮断が再発する(再狭窄))、症状の再発(または死亡)に影響し、しばしば脈管再生手術を繰り返す必要がある。10年にわたる研究、及び血管形成術バイパス移植及び血管内膜切除術等のアテローム性動脈硬化症の種々の医学的及び外科的治療の最初の成功率の顕著な改善にも関わらず、後期の再狭窄による第二の失敗が患者の30−50%で発生し続けている(Ross,R.(1993)Nature,362:801−809)。

その結果、動脈遮断を減少または予防するために好結果を与える化学療法に対する必要性が存在している。合併症または死亡という大きな危険があり、時間及び費用消費し、かつ患者にとって不便である脈管再生手術の繰り返しとは対照的に、この疾患を予防する最も効果的な方法は、細胞ベルにおけるものである。

全ての真核生物の細胞に存在する細胞内小器官である微小管は、健康で、正常な細胞の活性のために必要である。これらは細胞分裂のために必要な有糸分裂紡錘体の必須成分であり、また、成長因子と細胞表面の受容体との相互作用、及び細胞間のシグナル伝達の調節と共に、細胞の形及び固有運動性、固定化、細胞内小器官間の輸送細胞外への分泌の過程のような他の細胞活性を維持するために必要である(Dustin,P.(1980)Sci.Am.,243:66−76)。更に、微小管は、有糸分裂の開始、チューブリンへの結合及びリン酸化を調節するc−mos癌遺伝子及びCDC−2−キナーゼの双方のように細胞の複製において重要な調節的な役割を果たしており(Verde,F.et al.(1990)Nature,343:233−238)、また腫瘍サプレッサー遺伝子p53の遺伝子産物、及びSV−40のT−抗原の双方は三元複合系においてチューブリンに結合する(Maxwell,S.A.et al.(1991)Cell Growth Differen.,2:115−127)。微小管は、その水溶性タンパク質サブユニット、α−及びβ−チューブリンヘテロダイマーと、静的ではなく、むしろ動的な平衡状態にある。生理的な条件下で集合するためには、補因子として、グアノシン−3−リン酸GTP)と、ある種の微小管に関与し、組織化するタンパク質を必要とする;他方、高カルシウム濃度と低温解重合を引き起こす。

従って、微小管とそのサブユニットとの間のこの正常な平衡状態による妨害のために、微小管に依存する他の活性と同様、細胞分裂と固有運動性が中断させられると予想される。この戦略はある種の悪性腫瘍治療に顕著な成果をもって利用されてきた。事実、コルヒチンビンカアルカロイドのような抗微小管剤は、最も重要な抗癌剤部類にある。微小管の分解を促進するこれらの抗微小管剤は、多くの他の癌の緩和的な治療においてと同様、急性リンパ球性白血病ホジキン及び非−ホジキン型のリンパ腫、及び生殖細胞腫瘍を含むほとんどの治療可能な新生物の化学療法において主要な役割を果たしている。

研究中の最も新しく、かつ最も有望な抗微小管剤はタキソールである。タキソールはTaxus brevifolia、西洋(太平洋)いちいの木の樹皮から単離された抗微小管剤である。微小管の分解を促進するコルヒチンやビンカアルカロイドの様な他の抗微小管剤と異なり、タキソールは異常に安定な微小管の形成を促進することによって、有糸分裂や細胞増殖に必要な微小管ネットワークの正常な動的再構成阻害するように働く(Schiff,P.B.,etal.(1979)Nature 277:665; Schiff,P.B.,et al.(1981)Biochemistry 20:3247)。タキソールの存在下、重合に必要なチューブリンの濃度は顕著に低下する;微小管の集合はGTPなしで、かつ低温で起こり、しかも形成した微小管は希釈カルシウム、冷却及び阻害剤による解重合に対してより安定である。タキソールは重合したチューブリンに可逆的に結合し、他のチューブリン結合性薬剤はタキソールの存在下においてもまだチューブリンに結合するだろう。

タキソールは最も広い抗新生物活性スペクトルを有するものの一つであり、微小管に対して働きかけ化学療法的な戦略において新たに大きな関心が持たれている(Rowinsky,E.K.,et al.(1990)Jrnl.of the Nat’l.Cancer Inst.,82:1247−1259)。近年の研究において、タキソールは、乳癌(Holmes,F.A.,et al.(1991)JNCI,83:1797−1805)、頭部及び頚部、及びの癌と同様、前進性で治療不応性卵巣癌(Einzig,A.I.,et al.(1992)J.Clin.Oncol.,10:1748)悪性メラノーマ(Einzig,A.I.(1991)Invest.New Drugs,9:59−64)で顕著な活性を示した。

タキソールは種々の投与スケジュールを用いた数種の臨床的な試みで、腫瘍の成長を抑える効果が研究された。タキソールの投与に続いて重篤アレルギー反応が観察された。しかしながら、アレルギー反応の発生及びその度合はタキソール注入の用量及び速度に影響されることが示された(Weiss,R.B.,et al.(1990)J.Clin.Oncol.8:1263)。

心臓の不整脈はタキソールの投与と関連し、アレルギー反応のように、その発生はタキソール投与の用量及び速度に影響される。洞徐脈及びモビッツ(Mobitz)II型の不整脈は、それぞれ患者のおよそ40%及び5%で起こり、タキソールの注入開始から4−6時間後に始まり、注入完了後4−8時間持続するだろう。ほとんどの患者において、異常なリズム一過性無症候性の、血液動力学的に安定なものであり、心臓への投薬及び電気的な整調は必要ではない。更に、重篤な心臓への影響が出る度合はタキソール単独投与の患者では低いことが観察された。従って、タキソールによる治療においては、毒性と薬剤に対するアレルギー反応の発生を抑えるために、注入時間を24時間までとして用いられた。

血管形成術の際、動脈内バルーンカテーテル膨張は、脱内皮化(deendothelialization)、内部の弾力層破壊、そして内側の平滑筋細胞の損傷を引き起こす。再狭窄症は、おそらくこれに続く炎症、血栓症、及び平滑筋細胞の蓄積の相互依存性の作用から生じる(Ferrell,M.,et al.(1992)Circ.,85:1630−1631)が、最終的な共通の経路は内側のVSMCの収縮性から分泌性表現型への脱分化の結果として展開する。このことは、主としてVSMCが、新生動脈内膜の線維増殖的な病変を形成しながら、周り基礎膜を分解する基質メタロプロテイナーゼを分泌し、増殖及び動脈内膜への走化性移動をし、及び大きな細胞外基質を分泌することを意味する。動脈損傷後のVSMC表現型の脱分化の多くは新生細胞のそれ(すなわち、異常増殖、成長−調節分子及びプロテアーゼの分泌、移動及び基礎膜への侵入)をまねたものである。

再狭窄症を予防するための抗微小管剤コルヒチンの利用についての他の研究があるが、逆の結論報告されている(Currier,etal.,“コルヒチンはアテローム性動脈硬化症ウサギにおける腸管の血管形成術後の再狭窄症を阻害する”(1989)Circ.,80:II−66;O’Keefe et al.,“冠状血管形成術後の再狭窄症の予防におけるコルヒチンの無効性”(1992)J.Am.Coll.Cardiol.,19:1597−1600参照)。この結果からは、この疾患を予防または軽減するためにタキソールのような微小管安定化剤の利用を示唆することができない。従って、本発明の方法はタキソールまたは水溶性タキソール誘導体のような微小管安定化剤を用いたアテローム性動脈硬化症及び再狭窄症の進行を予防または軽減するものである。アテローム性動脈硬化症または再狭窄症の予防におけるこの微小管安定化のメカニズムはタキソール、及び異なる基礎的メカニズムを介して比較し得る微小管効果を示す2H2O(酸化デューテリウム)を用いた細胞増殖及び移動に関する実験での類似の結果によって支持される。

従って、本発明の目的は、非常に安定化したチューブリン形成を促進する薬剤での治療によってアテローム性動脈硬化症または再狭窄症の進行を軽減または予防する方法を提供することである。

本発明の更に他の目的は、低用量のタキソールまたは水溶性タキソール誘導体を含有する製薬学的調製物を用いてアテローム性動脈硬化症または再狭窄症を予防または軽減する方法を提供することである。

引用文献は全て参考としてここに挿入する。

概要

本発明はアテローム性動脈硬化症または再狭窄症を予防または軽減する方法、ならびにこれに使用する医薬調製物に関する。特に、本発明は、タキソール(登録商標)または水溶性タキソール誘導体のような微小管安定化剤を低投与量用いて治療する動脈損傷後のアテローム性動脈硬化症または再狭窄症を予防または軽減する方法である。本発明で用いる低投与量は、医薬の好ましくない副作用を最小にしながら、動脈閉鎖を防止する。なし

目的

本発明の目的は、非常に安定化したチューブリン形成を促進する薬剤での治療によってアテローム性動脈硬化症または再狭窄症の進行を軽減または予防する方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

請求項2

前記水溶性パクリタキセル誘導体が、2’−サクシニル−パクリタキセル;2’−サクシニル−パクリタキセルトリエタノールアミン;2’−グルタリル−パクリタキセル;2’−グルタリル−パクリタキセルトリエタノールアミン塩;N−(ジメチルアミノエチルグルタミドとの2’−O−エステル;そしてN−(ジメチルアミノエチル)グルタミド塩酸塩との2’−O−エステルからなる群から選択される、請求項1の医薬組成物。

請求項3

前記予防しまたは軽減することが前記医薬組成物の全身性送達により達成される、請求項1の医薬組成物。

請求項4

前記予防しまたは軽減することが前記医薬組成物の局所送達により達成される、請求項1の医薬組成物。

請求項5

前記局所送達が局所的持続性放出送達システムを含む、請求項4の医薬組成物。

請求項6

前記局所的持続性放出送達がステントを含む、請求項5の医薬組成物。

請求項7

前記ステントが、ポリマー被覆した金属ステント生分解性薬物溶出ポリマーステント、および内皮細胞で被覆した金属ステントからなる群から選択される、請求項6の医薬組成物。

請求項8

前記予防しまたは軽減することが再狭窄症の進行を予防しまたは軽減することを含む、請求項1の医薬組成物。

請求項9

治療的に有効な量の酸化デューテリウム、パクリタキセルまたは水溶性パクリタキセル誘導体を局所的に送達して、患者における再狭窄症を予防しまたは軽減するための手段を含む、薬物送達システム

請求項10

前記薬物送達システムがステントを含む、請求項9の薬物送達システム。

請求項11

前記ステントが、ポリマーで被覆した金属ステント、生分解性の薬物溶出ポリマーステント、および内皮細胞で被覆した金属ステントからなる群から選択される、請求項10の薬物送達システム。

請求項12

前記水溶性パクリタキセル誘導体が、2’−サクシニル−パクリタキセル;2’−サクシニル−パクリタキセルトリエタノールアミン;2’−グルタリル−パクリタキセル2’−グルタリル−パクリタキセルトリエタノールアミン塩;2’−(ジメチルアミノエチル)グルタミドとの2’−O−エステル;そしてN−(ジメチルアミノエチル)グルタミド塩酸塩との2’−O−エステルからなる群から選択される、請求項9の薬物送達システム。

請求項13

前記予防しまたは軽減することが再狭窄症の進行を予防しまたは軽減することを含む、請求項9の薬物送達システム。

請求項14

前記パクリタキセルの治療的に有効な量が2mg/kgに等しい、またはそれよりも少ない、請求項9の薬物送達システム。

請求項15

患者の再狭窄症の予防または軽減のための、活性成分として酸化デューテリウム、パクリタキセルまたは水溶性パクリタキセル誘導体を含む医薬組成物を製造する際の、酸化デューテリウム、パクリタキセルまたは水溶性パクリタキセル誘導体の使用方法

請求項16

前記水溶性パクリタキセル誘導体が、2’−サクシニル−パクリタキセル;2’−サクシニル−パクリタキセルトリエタノールアミン;2’−グルタリル−パクリタキセル;2’−グルタリル−パクリタキセルトリエタノールアミン塩;N−(ジメチルアミノエチル)グルタミドとの2’−O−エステル;そしてN−(ジメチルアミノエチル)グルタミド塩酸塩との2’−O−エステルからなる群から選択される、請求項15の方法。

請求項17

前記予防しまたは軽減することが前記医薬組成物の全身性送達によって達成される、請求項15の方法。

請求項18

前記予防しまたは軽減することが前記医薬組成物の局所送達によって達成される、請求項15の方法。

請求項19

前記局所送達が局所的持続性放出送達システムを含む、請求項18の方法。

請求項20

前記局所的持続性放出送達システムがステントを含む、請求項19の方法。

請求項21

前記ステントが、ポリマーで被覆した金属ステント、生分解性の薬物溶出ポリマーステント、および内皮細胞で被覆した金属ステントからなる群から選択される、請求項20の方法。

請求項22

前記予防しまたは軽減することが再狭窄症の進行を予防しまたは軽減することを含む、請求項15の方法。

請求項23

前記予防しまたは軽減することが、パクリタキセルを前記患者に2mg/kgに等しいかまたはそれよりも少ない量で投与することを含む、請求項15の方法。

技術分野

0001

本発明はアテローム性動脈硬化症または再狭窄症の進行の危険のある患者治療方法に関する。

0002

更に詳しくは、本発明はアテローム性動脈硬化症または再狭窄症の進行を防ぎ、または減ずるために低用量のタキソール登録商標溶液でこれらの患者を治療することに関する。

背景技術

0003

血管系の疾患は、先進国において、特に老人を苦しめる主な死亡及び植物状態の原因である。合衆国のみにおいて、近年の減少傾向は励みとなるものだが、心臓血管系の疾患は未だに毎年ほぼ百万人もの死亡の原因となっており、これは全ての死因の半分以上である;心臓血管系の疾患で苦しむおよそ五百万人もの人が毎年入院している。苦しんでいる人及び物的資源の点から見ると、この疾患による犠牲はほとんど計り知れないほどである。

0004

アテローム性動脈硬化症は血管系の疾患の最も一般的な形態であり、重要な身体の器官への血液の供給が不十分となり、結果として心臓発作、卒中、及び腎不全を招く。更に、アテローム性動脈硬化症は、喫煙者と同様、高血圧症糖尿病を患う人に主な合併症を引き起こす。アテローム性動脈硬化症は、通常血流を調整する血管の緊張力を調節する動脈壁の正常な血管平滑筋細胞(“VSMC”)のいくつかが、その性質を変えて“癌−様”の振舞いをするようになる慢性的血管損傷の型である。これらのVSMCは異常に増殖するようになり、これらが内側の血管内膜中に侵入して広がることを可能にする物質成長因子組織分解酵素及び他のタンパク質)を分泌し、血流を遮断し、そして異常に弱くなった血管を局所的な血液の凝塊によって完全に遮断し、その動脈につながる組織を死に到らしめる。

0005

再狭窄症、すなわち矯正的な手術後の狭窄または動脈狭窄再発は、アテローム性動脈硬化症の加速された形態である。近年の証拠によって、冠静脈移植及び心臓同種移植によるアテローム性動脈硬化症に伴う冠動脈の再狭窄症は、自発的なアテローム性動脈硬化症に到る同じ発病過程が大きく加速された型を示すと考えることができる血管損傷の統合仮説が支持された(Ip,J.H.,et al.,(1990)J Am Coll Cardiol,15:1667−1687;Muller,D.W.M.,et al.,(1992)J Am Coll Cardiol,19:418−432)。再狭窄症は、血小板由来増殖因子(PDGF)及び塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む有力な成長−調節分子関与する血管損傷に対する一連の複雑な線維増殖的な応答であるため、アテローム性動脈硬化症の病変部位における後期の段階に共通しており、血管平滑筋細胞増殖、移動及び新生動脈内膜蓄積に到る。

0006

再狭窄症は、冠動脈バイパス手術(CAB)、血管内膜切除術、及び心臓移植、そして特に心臓バルーン血管形成術、アセレクトミー(atherectomy)、レーザー剥離または脈管内テンチング(stenting)の後に生じ(これらのいずれも患者の三分の一において、6月以内に動脈遮断が再発する(再狭窄))、症状の再発(または死亡)に影響し、しばしば脈管再生手術を繰り返す必要がある。10年にわたる研究、及び血管形成術バイパス移植及び血管内膜切除術等のアテローム性動脈硬化症の種々の医学的及び外科的治療の最初の成功率の顕著な改善にも関わらず、後期の再狭窄による第二の失敗が患者の30−50%で発生し続けている(Ross,R.(1993)Nature,362:801−809)。

0007

その結果、動脈遮断を減少または予防するために好結果を与える化学療法に対する必要性が存在している。合併症または死亡という大きな危険があり、時間及び費用消費し、かつ患者にとって不便である脈管再生手術の繰り返しとは対照的に、この疾患を予防する最も効果的な方法は、細胞ベルにおけるものである。

0008

全ての真核生物の細胞に存在する細胞内小器官である微小管は、健康で、正常な細胞の活性のために必要である。これらは細胞分裂のために必要な有糸分裂紡錘体の必須成分であり、また、成長因子と細胞表面の受容体との相互作用、及び細胞間のシグナル伝達の調節と共に、細胞の形及び固有運動性、固定化、細胞内小器官間の輸送細胞外への分泌の過程のような他の細胞活性を維持するために必要である(Dustin,P.(1980)Sci.Am.,243:66−76)。更に、微小管は、有糸分裂の開始、チューブリンへの結合及びリン酸化を調節するc−mos癌遺伝子及びCDC−2−キナーゼの双方のように細胞の複製において重要な調節的な役割を果たしており(Verde,F.et al.(1990)Nature,343:233−238)、また腫瘍サプレッサー遺伝子p53の遺伝子産物、及びSV−40のT−抗原の双方は三元複合系においてチューブリンに結合する(Maxwell,S.A.et al.(1991)Cell Growth Differen.,2:115−127)。微小管は、その水溶性タンパク質サブユニット、α−及びβ−チューブリンヘテロダイマーと、静的ではなく、むしろ動的な平衡状態にある。生理的な条件下で集合するためには、補因子として、グアノシン−3−リン酸GTP)と、ある種の微小管に関与し、組織化するタンパク質を必要とする;他方、高カルシウム濃度と低温解重合を引き起こす。

0009

従って、微小管とそのサブユニットとの間のこの正常な平衡状態による妨害のために、微小管に依存する他の活性と同様、細胞分裂と固有運動性が中断させられると予想される。この戦略はある種の悪性腫瘍の治療に顕著な成果をもって利用されてきた。事実、コルヒチンビンカアルカロイドのような抗微小管剤は、最も重要な抗癌剤部類にある。微小管の分解を促進するこれらの抗微小管剤は、多くの他の癌の緩和的な治療においてと同様、急性リンパ球性白血病ホジキン及び非−ホジキン型のリンパ腫、及び生殖細胞腫瘍を含むほとんどの治療可能な新生物の化学療法において主要な役割を果たしている。

0010

研究中の最も新しく、かつ最も有望な抗微小管剤はタキソールである。タキソールはTaxus brevifolia、西洋(太平洋)いちいの木の樹皮から単離された抗微小管剤である。微小管の分解を促進するコルヒチンやビンカアルカロイドの様な他の抗微小管剤と異なり、タキソールは異常に安定な微小管の形成を促進することによって、有糸分裂や細胞増殖に必要な微小管ネットワークの正常な動的再構成阻害するように働く(Schiff,P.B.,etal.(1979)Nature 277:665; Schiff,P.B.,et al.(1981)Biochemistry 20:3247)。タキソールの存在下、重合に必要なチューブリンの濃度は顕著に低下する;微小管の集合はGTPなしで、かつ低温で起こり、しかも形成した微小管は希釈カルシウム、冷却及び阻害剤による解重合に対してより安定である。タキソールは重合したチューブリンに可逆的に結合し、他のチューブリン結合性薬剤はタキソールの存在下においてもまだチューブリンに結合するだろう。

0011

タキソールは最も広い抗新生物活性スペクトルを有するものの一つであり、微小管に対して働きかけ化学療法的な戦略において新たに大きな関心が持たれている(Rowinsky,E.K.,et al.(1990)Jrnl.of the Nat’l.Cancer Inst.,82:1247−1259)。近年の研究において、タキソールは、乳癌(Holmes,F.A.,et al.(1991)JNCI,83:1797−1805)、頭部及び頚部、及びの癌と同様、前進性で治療不応性卵巣癌(Einzig,A.I.,et al.(1992)J.Clin.Oncol.,10:1748)悪性メラノーマ(Einzig,A.I.(1991)Invest.New Drugs,9:59−64)で顕著な活性を示した。

0012

タキソールは種々の投与スケジュールを用いた数種の臨床的な試みで、腫瘍の成長を抑える効果が研究された。タキソールの投与に続いて重篤アレルギー反応が観察された。しかしながら、アレルギー反応の発生及びその度合はタキソール注入の用量及び速度に影響されることが示された(Weiss,R.B.,et al.(1990)J.Clin.Oncol.8:1263)。

0013

心臓の不整脈はタキソールの投与と関連し、アレルギー反応のように、その発生はタキソール投与の用量及び速度に影響される。洞徐脈及びモビッツ(Mobitz)II型の不整脈は、それぞれ患者のおよそ40%及び5%で起こり、タキソールの注入開始から4−6時間後に始まり、注入完了後4−8時間持続するだろう。ほとんどの患者において、異常なリズム一過性無症候性の、血液動力学的に安定なものであり、心臓への投薬及び電気的な整調は必要ではない。更に、重篤な心臓への影響が出る度合はタキソール単独投与の患者では低いことが観察された。従って、タキソールによる治療においては、毒性と薬剤に対するアレルギー反応の発生を抑えるために、注入時間を24時間までとして用いられた。

0014

血管形成術の際、動脈内バルーンカテーテル膨張は、脱内皮化(deendothelialization)、内部の弾力層破壊、そして内側の平滑筋細胞の損傷を引き起こす。再狭窄症は、おそらくこれに続く炎症、血栓症、及び平滑筋細胞の蓄積の相互依存性の作用から生じる(Ferrell,M.,et al.(1992)Circ.,85:1630−1631)が、最終的な共通の経路は内側のVSMCの収縮性から分泌性表現型への脱分化の結果として展開する。このことは、主としてVSMCが、新生動脈内膜の線維増殖的な病変を形成しながら、周り基礎膜を分解する基質メタロプロテイナーゼを分泌し、増殖及び動脈内膜への走化性移動をし、及び大きな細胞外基質を分泌することを意味する。動脈損傷後のVSMC表現型の脱分化の多くは新生細胞のそれ(すなわち、異常増殖、成長−調節分子及びプロテアーゼの分泌、移動及び基礎膜への侵入)をまねたものである。

0015

再狭窄症を予防するための抗微小管剤コルヒチンの利用についての他の研究があるが、逆の結論報告されている(Currier,etal.,“コルヒチンはアテローム性動脈硬化症ウサギにおける腸管の血管形成術後の再狭窄症を阻害する”(1989)Circ.,80:II−66;O’Keefe et al.,“冠状血管形成術後の再狭窄症の予防におけるコルヒチンの無効性”(1992)J.Am.Coll.Cardiol.,19:1597−1600参照)。この結果からは、この疾患を予防または軽減するためにタキソールのような微小管安定化剤の利用を示唆することができない。従って、本発明の方法はタキソールまたは水溶性タキソール誘導体のような微小管安定化剤を用いたアテローム性動脈硬化症及び再狭窄症の進行を予防または軽減するものである。アテローム性動脈硬化症または再狭窄症の予防におけるこの微小管安定化のメカニズムはタキソール、及び異なる基礎的メカニズムを介して比較し得る微小管効果を示す2H2O(酸化デューテリウム)を用いた細胞増殖及び移動に関する実験での類似の結果によって支持される。

0016

従って、本発明の目的は、非常に安定化したチューブリン形成を促進する薬剤での治療によってアテローム性動脈硬化症または再狭窄症の進行を軽減または予防する方法を提供することである。

0017

本発明の更に他の目的は、低用量のタキソールまたは水溶性タキソール誘導体を含有する製薬学的調製物を用いてアテローム性動脈硬化症または再狭窄症を予防または軽減する方法を提供することである。

0018

引用文献は全て参考としてここに挿入する。

先行技術

0019

Ip,J.H.,et al.,(1990)J Am Coll Cardiol,15:1667−1687
Muller,D.W.M.,et al.,(1992)J Am Coll Cardiol,19:418−432
Ross,R.(1993)Nature,362:801−809
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Verde,F.et al.(1990)Nature,343:233−238
Maxwell,S.A.et al.(1991)Cell Growth Differen.,2:115−127
Schiff,P.B.,etal.(1979)Nature 277:665
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Rowinsky,E.K.,et al.(1990)Jrnl.of the Nat’l.Cancer Inst.,82:1247−1259
Holmes,F.A.,et al.(1991)JNCI,83:1797−1805
Einzig,A.I.,et al.(1992)J.Clin.Oncol.,10:1748
Einzig,A.I.(1991)Invest.New Drugs,9:59−64
Weiss,R.B.,et al.(1990)J.Clin.Oncol.8:1263
Ferrell,M.,et al.(1992)Circ.,85:1630−1631
Currier,etal.,“コルヒチンはアテローム性動脈硬化症ウサギにおける腸管の血管形成術後の再狭窄症を阻害する”(1989)Circ.,80:II−66
O’Keefe et al.,“冠状血管形成術後の再狭窄症の予防におけるコルヒチンの無効性”(1992)J.Am.Coll.Cardiol.,19:1597−1600

発明が解決しようとする課題

0020

発明の概要
本発明のこれら及び他の目的に従って、タキソールたは水溶性タキソール誘導体のような微小管安定化剤の治療的に有効な量で治療することからなる、アテローム性動脈硬化症または再狭窄症を予防または軽減する方法を提供する。薬剤の治療的に有効な量とは、アテローム性動脈硬化症または再狭窄症の進行を予防または軽減するために十分な量である。

0021

この方法によって、アテローム性動脈硬化症または再狭窄症にり患している患者においてこれらの疾患の進行を予防または軽減する効果的な方法が提供される。更に、用いる化学療法剤が低用量であるために、患者に副作用が現れる可能性は減少する。

課題を解決するための手段

0022

発明の詳細な説明
本発明の具体例の実施は、腹腔内または皮下注射、持続的な静脈内注入、経口的な摂取または局所的な(直接)投与、あるいはこれら2種以上の組み合せのような、数種の選択的な薬剤輸送経路を介して達成することができる。注射または持続注入のための溶液を処方する場合、最初にタキソール溶液を調製しなければならない。タキソールは、ポリオキシエチレンヒマシ油(CremophorEL)50%及び脱水アルコール、USP(50%)の担体中6mg/mlの濃縮溶液として、5mlのバイアル(30mg/バイアル)で、CTEP、DCT、NCI(IND#22850)を通じて供給されている。そのままのバイアルで冷凍保存し、使用に先立って希釈すべきである。5%のブドウ糖注射液あるいは0.9%の塩化ナトリウムで希釈する場合、0.3−1.2mg/mlのタキソール濃度のものが、室温で少なくとも12時間物理的及び化学的に安定である。(NCI研究薬;製薬学的データ(NCI Investigation Drugs;Pharmaceutical Data)(1990))。ポリオレフィン容器で調製した、D5WまたはNS希釈のタキソール濃度0.6mg/mlのもの、及びNS希釈の1.2mg/mlのものは、環境温度(20−23℃)で少なくとも25時間安定であることも報告された。(Waugh,et al.(1990)Am.J.Hosp.Pharm.48,1520)。これらの濃度で上記の時間の安定性が示されたが、これはタキソールのいずれの濃度を用いても良い本発明の実施を制限することを意味するものではない。

0023

タキソールの溶液全てにおいて、薬剤濃度及び調製後の時間の経過に直接比例して、わずかなもやが生じる。タキソール注入用溶液の調製後、(LVPのためのUSP粒子状物質試験(USP Particulate Matter Test)によって確立された許容限界内で)溶液中に小数の繊維の形成が観察された。粒子の形成は薬剤の効力損失を示すものではないが、過剰な粒子状物質の生成を示す溶液は用いるべきではない。従って、持続注入によって投与する場合、ライン濾過が必要かも知れず、これは親水性で、孔のサイズが0.22ミクロン以下の微孔性フィルター(IVEX−HP In Line Filter Set−SL,15”,Abbottmodel # 4525また
はこれと同等なもの)を、注入ポンプに到る末端流体の経路内に導入することによって達成することができる。

0024

タキソールは塩化ポリビニルPVC)バッグ及び静脈内チューブからのジエチルヘキシルフタレート(DEHP可塑剤浸出のため、非−可塑化溶液容器(例えばガラスポリオレフィン、またはポリプロピレン)で調製しなければならない。タキソールはPVC静脈内投与用または注射用セットで投与してはならない。従って、IVニトログリセリンセット(またはこれと同等なもの)のようなポリオレフィン−、またはポリエチレン系列のセットを、(持続注入のためのタキソール溶液を含有する)瓶またはバッグをIVポンプにつないで用いるべきであり、次に0.22ミクロンのフィルターIVセットに付け、次いでこれを患者の中央接触装置に直接つなげても良い。必要であれば、ポリオレフィン−系列の延長セット(PolyfinTM Extension Set,MiniMed Technologies,Model#126)をIVポンプと患者の中央接触装置の間の距離を埋めるために用いることができる。

0025

タキソール利用の1つのカテゴリーは、冠動脈または末梢動脈の治療的な血管形成術またはatherectomyの後、冠動脈のバイパス移植またはステント手術の後、あるいは末梢血管の手術の後(例えば頚動脈または他の末梢血管の血管内膜切除術、血管のバイパス、ステントまたは補充的移植術)の狭窄の再発(再狭窄症)の予防を包含するものであろう。ヒトにおける投与スケジュールは、血管の施術に先立って約0.5−2mg/kg(20−80mg/m2)までによる24時間の持続性IV前処理、施術後24時間の約0.25−2mg/kg(10−80mg/m2)の持続性IV注入、次いで21日毎に1から6サイクルで24時間の約0.25−2mg/kg(10−80mg/m2)の持続性IV注入からなるようにすることができる(が、これに限定されるものではない)。このような投与量は、ヒトの癌の治療に用いる量(およそ4−6mg/kg)より顕著に少ない。

0026

タキソール利用のもう1つのカテゴリーは、血管系疾患(アテローム性動脈硬化症)の進行の一次的な予防または軽減を包含するものであろう。こうした応用のいくつか(こうしたものの例としては、心臓の同種移植(組織移植)のアテローム性動脈硬化症、真性糖尿病血管合併症から生じる多臓器系の不全または気の毒な手術の対象者である患者で加速された、医学的−治療不応性のアテローム性動脈硬化症の予防がある)では、5−7日間にわたる持続性の低用量(1−5mg/m2/日)IV注入の予後治療サイクルが必要かも知れない。アレルギー反応が生じる可能性を最小限にするために、タキソールによる治療のいずれにおいても、タキソール投与の14及び7時間前にデキサメタゾン20mgの経口的な前投与、タキソール投与の30分前にジフェンヒドラミン50mmgのIV注入、シメチジン300mgのIV注入が一般に必要である。外科手術に関連しない更に他の応用としては、血管線筋性異形成結節性多発動脈炎、及びタカヤス動脈炎の治療がある。前述の応用のそれぞれは、全身毒性がわずかしかない高用量の局所的な薬剤投与を可能にするタキソール(または他の微小管安定化剤)の持続性放出製剤の選択的、局所的な応用に用いても良い。

0027

更に、タキソールの水溶性誘導体も本発明で用いることができる。タキソールの水溶性誘導体としては、Haugwitzらの米国特許No.5,157,049号(参考のためにここに挿入した)に記載したように、2’−サクシニル−タキソール;2’−サクシニル−タキソールトリエタノールアミン;2’−グルタリル−タキソール;2’−グルタリル−タキソールトリエタノールアミン塩;N−(ジメチルアミノエチルグルタミドとの2’−O−エステル;N−(ジメチルアミノエチル)グルタミド塩酸塩との2’−O−エステルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの水溶性タキソール誘導体は、これらの薬剤の薬物動態学解明途上で適当な修正をしながら、タキソールで先に挙げたものと類似の投与スケジュールで投与することができる。

0028

活性成分としてタキソールの水溶性誘導体の有効量を含有する製薬学的組成物は、必要であれば製薬学的に許容し得る非毒性の無菌の担体と共に、この分野で良く知られる標準的な方法で容易に調製することができる。このような調製物は、アテローム性動脈硬化症にり患またはこれが進行する危険のある患者に対し、疾患の進行の予防または軽減のために経口的に、または注射可能な形態で、あるいは患部に直接投与することができる。

0029

以下の実施例は、血管平滑筋細胞の増殖及び移動を阻害する点におけるタキソール(またはタキソールの水溶性誘導体を含むが、これに限定されない他の微小管安定化剤)の有効性を説明するものであり、本発明の範囲を制限するために用いるべきではない。

図面の簡単な説明

0030

図1はVSMCの基礎膜タンパク質で被覆したフィルターへの侵入性のタキソール誘導性損傷、及びタキソールによる培養VSMC[3H]−チミジンの取り込みの阻害を示す。
図2A−2Cはラット頚動脈バルーンカテーテル損傷後の平滑筋細胞新生動脈内膜蓄積のタキソールによる阻害を示す。タキソールはラット頚動脈のバルーンカテーテル損傷から11日後の動脈内膜平滑筋細胞の蓄積を阻害する。図2A−2Cは、施術11日経過後のバルーンカテーテルを入れたラットの通常の冠動脈のヘマトキシリン−及び−エオシン染色横断面である。(2A)非損傷;(2B)損傷及び担体、及び(2C)損傷及びタキソール。
図3は、酸化デューテリウム用量依存的なVSMCの化学的侵入の阻害、及び培養VSMCのブロモデオキシウリジン(BrDU)の取り込みの酸化デューテリウムによる阻害を示す。
図4A−4Cはプラスチック上で培養したVSMCにおいて用量依存的な微小管の束化を引き起こすタキソール濃度を示す。
図5A−5Bは培養VSMCにおける酸化デューテリウム誘導性の微小管の束化を示す。(5A)対照、VSMC非−血清飢餓条件 抗チューブリン抗体(α−チューブリン)。(5B)75%酸化デューテリウムVSMC 非−血清 飢餓条件抗チューブリン抗体(α−チューブリン)。

0031

実施例1
種々のタキソール濃度で前処理した培養VSMCの、再構成基底膜タンパク質で被覆されたフィルターに侵入するインビトロ能力を試験して、タキソール誘導された微小管束状化(bundling)がインビボでの新生動脈内膜形成に必要な細胞プロセスを損傷するかを評価した。

0032

6カ月齢のウイスター(Wistar)ラットから得たラット大動脈内層コラゲナーゼエラスターゼ酵素処理することによって血管平滑筋細胞(VSMC)を単離した。細胞を10%ウシ胎児血清高グルコースDMEMおよびアミノ酸補充した培地で維持した。細胞培養物は5%CO2中、37℃で維持した。

0033

培養中、タキソール前処理の18時間後に、細胞を3.7%ホルマリンで固定し、1%Triton X−100で透過性にし、そして重合チューブリンマウス抗−δ−チューブリン抗体(重合δ−チューブリンに対するSMI62モノクローナル抗体、Paragon Biotec,Inc.Baltimore,MD)で標識した。二次標識は銀増強した1nm金結合ウサギ抗−マウス抗体(Goldmark Biologicals,Phillipsburg,NJ)で行った。(4A)対照、(4B)0.1nMタキソール、(4C)1nMタキソール、および(4D)10nMタキソールで処理したVSMCの代表的光学顕微鏡写真図4A−4Dに示す。

0034

上部チャンバー多孔性PVPFフィルターで下部チャンバーから分離されている修飾ボイデン(Boyden)チャンバー(Albini,etal.,Cancer Res.47:3239−3245,1987)を用いて、化学侵入(chemoinvasion)(ボイデンチャンバー)アッセイを行った。PVPFフィルター(孔直径8μm、Nucleopore Filters,Pleasonton,CA)を被覆し、100μg/mlタイプIコラーゲン、5μg/mlフィブロネクチン、および5μg再構成基底膜(Englebreth−Holm−Swarm腫瘍から調製(Kleinman,et al.,Biochemistry,25:312−318,1986)を含む溶液で順次風乾して、マトリックス物質の連続的10μm厚さの被覆を製造した。下部(化学誘引物質)チャンバーにDMEM中の10ng/mlPDGFBBを加えることによってボイデンチャンバーを組み立てた。次に0.1%BSAを含むDMEM中に懸濁した細胞(約200,000)を上部チャンバーに加えた。このアッセイに用いる細胞のいくつかは培養中にタキソール(30pM〜100nM濃度)で18時間前処理した。タキソール処理群では、前処理に用いたのと同じ濃度で上部および下部チャンバーにタキソールを加えた。次にチャンバーを5%CO2雰囲気中、37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション期間終わりに、細胞を固定し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。上部表面(非侵入者)上の細胞を機械的に除去し、フィルターの下側(侵入者)にある細胞を400倍の顕微鏡計数した(1フィルターにつき4つの視野を無差別に計数し、すべての実験は3回行い、異なるVSMC調製物を用いる個別の場合につきこの各3回のアッセイを少なくとも3回繰り返した)。再構成基底膜を除く以外は上述のボイデンチャンバーと類似の方法で走化性をアッセイした。この化学侵入アッセイは、インビトロでの侵入性とインビボでの細胞挙動との高い相関を示すものとして当業者受け入れられているものである(Iwamoto Y,et al.,Advances In Experimental Medicine & Biology,324:141−9,1992)。

0035

誘引物質としてPDGF−BBを用ると、タキソールは0.5nMの半値幅(half−maximal)阻害濃度でVSMC侵入を阻害した。タキソールは100nMで実質的に完全に阻害し、30pM(使用したうちで最低投与量)でも有意な阻害が観察された(図1)。誘引物質としてPDGF−BBを用いる走化性アッセイ(フィルター孔を閉じる基底膜タンパク質を用いずに、フィブロネクチンとコラーゲンIのみで被覆したフィルター)を類似の方法で行ったところ、同様の結果が得られた。これらの結果は、少なくとも薬剤ナノモルレベルでのタキソールが、このアッセイでVSMCが基底膜タンパク質を貫通するのに必要であることが知られているコラゲナーゼおよびメタロプロテイナーゼの細胞分泌を阻害するというよりは、むしろ主として移動および/または形態変化の阻害によってVSMC侵入を阻害することを示している。

0036

上述のボイデンアッセイの終結4時間後に除去した上清についてゼラチナーゼザイモグラフィーを行った。VSMCによって培地中に分泌されたゼラチン分解性プロテイナーゼを、0.1%(w/v)ゼラチンを含む10%ポリアクリルアミドゲル中の非還元性ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析した。電気泳動後、ゲルを2.5%(v/v)TritonX−100中23℃で30分インキュベートし、次いで0.2M NaCl、5mM CaCl2、0.02% Brij35(w/v)、50mMTris−HCl(pH7.6)中、37℃で18時間インキュベートすることによってゼラチナーゼを変性した。ゲルを0.5%クマシーブリリアンブルーG−250で90分染色し、10%酢酸、40%メタノール脱染色した。青色染色されたゼラチンのバックグランドに対する透明のバンドによってゼラチン分解活性が示された。

0037

これらのボイデンチャンバー侵入実験からのゼラチナーゼザイモグラフィーアッセイは、VSMCコラゲナーゼ分泌レベルは、対照と比較して30pMから100nMのタキソール範囲で有意な変化がなかったことを確認する(図1、挿入図)。

0038

実施例2
微小管の安定化と超重合がVSMC侵入のタキソール阻害に関与する決定的かつ十分な要因であることを確認するために、酸化デューテリウム(重水、2H2O)を用いて化学侵入(ボイデンチャンバー)アッセイを行った。酸化デューテリウムはタキソールとは異なるメカニズムで微小管/チューブリン重合を増強する。増強されたチューブリンの疎水性相互作用によってαβ−チューブリンヘテロダイマーの重合に決定的な濃度を減少すること(Itoh,T.J.,et al.,Biochim.Biophys.Acta.,800:21−27,1984)と、非重合チューブリン集団を重合形に変換すること(Takahashi,T.C.,et al.,Cell Struct.Funct.,9:45−52,1984)の両方によって、酸化デューテリウムのアイソトープ溶媒効果の組み合わせが、微小管の重合を可逆的に増加する。

0039

6カ月齢のウイスターラットから得たラット大動脈の内層のコラゲナーゼ/エラスターゼ酵素消化によってVSMCを単離した。細胞を10%ウシ胎児血清、高グルコースDMEMおよびアミノ酸補充した培地で維持した。細胞培養物は5%CO2中、37℃で維持した。

0040

酸化デューテリウム処理した細胞において、濃縮ストックからDMEMを調製するときに2H2O(v/v)で水(H2O)を置換した。培養中、酸化デューテリウム前処理の18時間後に、細胞を3.7%ホルマリンで固定し、1%Triton X−100で透過性にし、そして重合チューブリンをマウス抗−δ−チューブリン抗体(重合δ−チューブリンに対するSMI62モノクローナル抗体、Paragon Biotec,Inc.Baltimore,MD)で標識した。二次標識は銀増強した1nm金結合ウサギ抗−マウス抗体(Goldmark Biologicals,Phillipsburg,NJ)で行った。(5A)対照、および(5B)75%酸化デューテリウム処理したVSMCの代表的光学顕微鏡写真を図5A−5Bに示す。

0041

上部チャンバーが多孔性PVPFフィルターで下部チャンバーから分離されている修飾ボイデンチャンバーを用いて、化学侵入(ボイデンチャンバー)アッセイを行った。PVPFフィルター(孔直径8μm、Nucleopore Filters,Pleasonton,CA)を被覆し、100μg/mlタイプIコラーゲン、5μg/mlフィブロネクチン、および5μg再構成基底膜(Englebreth−Holm−Swarm腫瘍から調製)を含む溶液で順次風乾して、マトリックス物質の連続的10μm厚さの被覆を製造した。下部(化学誘引物質)チャンバーにDMEM中の10ng/m PDGF−BBを加えることによってボイデンチャンバーを組み立てた。次に0.1%BSAを含むDMEM中に懸濁した細胞(約200,000)を上部チャンバーに加えた。このアッセイに用いる細胞のいくつかは培養中に酸化デューテリウム(H2Oに代えて25%、50%、または75%v/v)で18時間前処理した。酸化デューテリウム処理群では、前処理に用いたのと同じ濃度で上部および下部チャンバーに2H2O置換DMEM(v/v)を加えた。次にチャンバーを湿潤5%CO2雰囲気中、37℃で4時間インキュベートした。実験の終わりに、フィルターを除去し、細胞を固定し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。上部表面(非侵入者)上の細胞を機械的に除去し、フィルターの下側(侵入者)にある細胞を400倍の顕微鏡で計数した(1フィルターにつき4つの視野を無差別に計数し、すべての実験は3回行った)。

0042

25%、50%または75%酸化デューテリウムで18時間前処理したVSMCは、タキソールで観察されたのと同様の用量依存性の微小管超重合を引き起こした。この処理は用量依存的にPDGF媒介性のVSMCボイデンチャンバー侵入を同様に阻害し、25%2H2Oで半値幅阻害を、そして75%2H2Oでほぼ完全な阻害を達成した(図3)。

0043

実施例3
細胞補充(recruitment)と移動に加えて、PDGFやbFGFなどの動脈損傷後に精巧に産生される各種の成長制御分子分裂促進と細胞増殖に関係している。VSMCDNA合成に対するタキソールの効果を測定するために、[3H]チミジン取り込みを測定した。VSMCを24ウエルプレートに4.5x104でプレートした。10%FCS+DMEM中で5時間インキュベーとした後に、0.5mCi[3H]チミジンを添加し、さらに16時間インキュベーションを続けた。細胞をリン酸緩衝塩液で2回洗浄し、上で2時間10%TCAを用いて抽出し、次に2,000gで10分遠心した。上清を捨てて、ペレットを1N NaOH 0.5ml中に溶解した。1N HCl 0.5mlで中和した後、[3H]チミジンの取り込みをベックマン液体シンチレーションカウンターで測定した。チミジン添加18時間前とチミジン取り込み時の両方で、VSMCを種々の濃度のタキソールで処理した。これらの実験の各条件を3回実施した。

0044

タキソールは細胞分裂のインデックスである培養、VSMC[3H]チミジン取り込みを用量依存的に阻害し、半値幅阻害濃度は5nMであった。タキソールは100nMで実質的に完全な阻害を引き起こし、有意な阻害が1nMで観察された(図1)。この阻害プロフィルが侵入および走化性のプロフィルとは幾分異なるということ、すなわち1log濃度単位感が低いが、より急勾配濃度依存性を示すということは、これらのプロセスの
間の微小管の果たす役割がかなり異なるために起こったと思われる。タキソールはまた、この培養VSMCモデルにおいてPDGF−BB刺激したc−fosmRNA発現を用量依存的に阻害し、半値幅は1nMであり、20nMで実質的に完全に阻害した。したがって、即時初期遺伝子誘導の阻害が、タキソールがVSMCにおける成長因子刺激をブロックするための別の重要なメカニズムであり、チミジン取り込み結果の少なくとも一部の原因である。

0045

したがって、タキソールは、微小管機能を妨害し、移動および形態変更能を破壊し、また成長因子で剌激される初期遺伝子の発現と細胞増殖によって、ヒト腫瘍の治療に用いられているよりも100〜1000倍低い濃度で、培養VSMCのインビトロでの侵入と増殖を有意に阻害する。

0046

実施例4
VSMCDNA合成に及ぼす酸化デューテリウムの効果を決定するために、チミジン類似体であるブロモデオキシウリジン(BrDU)の取り込みを測定した。VSMCを24ウエルプレートに4.5x104でプレートした。種々の2H2O濃度で10%FCS+DMEM中、20時間インキュベートした後、10μM BrDUを加えてさらに4時間インキュベーションを続けた。細胞をリン酸緩衝塩液(PBS)で2回洗浄し、100%メタノール(−20℃)で10分固定した。細胞を1N HClで2時間インキュベートしてDNAを変性し、次いでPBSで4回洗浄した。2%BSA−PBS中のマウスモノクローナルBrDU抗体(Boehringer Mannheim)を細胞と一緒に1時間インキュベートした。PBSで洗浄後、アルカリホスファターゼと結合させたヤギ抗−マウス抗体を加えた。チミジンに代えたBrDUを含む細胞核はアルカリホスファターゼ基質で赤色に染色され、その他のすべての核は青色に染色される。BrDU−ポジティブな核の割合を、対照(100%として定義)と酸化デューテリウム処理群との間で比較した。

0047

その結果は、酸化デューテリウムがタキソールと同様に用量依存的に培養VSMC増殖とDNA合成を阻害することを示唆しており、これはVSMC増殖における微小管の動力学の決定的バランスと一致する。

0048

タキソールと酸化デューテリウムは多くの細胞内効果をもつと考えられるが、微小管(作用メカニズムは異なるが)および多くのレベルでのVSMC機能に及ぼす効果に共通点が存在することは、共通の微小管安定化メカニズム作用が観察される機能変化の原因であることを示唆する。したがって、タキソールと酸化デューテリウムを用いる実験の結果に基づいて、動脈損傷後のアテローム性動脈硬化症および再狭窄症の進展に関与する多くの形質転換をVSMCが受けるのに必要な最も重要且つ感受性な細胞内メカニズムに微小管が関与していることは明らかであり、微小管がこれらの結果に影響する戦略上の標的となりうる。

0049

実施例5
加齢動物保護および使用委員会に関する国立研究所(National Institute on Aging Animal Care and Use Committee)で認められたプロトコルに従い、GRCコロニーから得た6カ月齢のウイスターラットを20mg/kg体重ペンタバルビタール、2mg/kg体重ケタミン、および4mg/kg体重キシラジンで腹腔内麻酔した。左外側頸動脈に2−フレンチフォガーティ(2−French Fogarty)塞栓切除術カテーテルでカニューレ挿入し、食塩水で膨張させ、頸動脈を3回上下して通過させて膨張させた脱内皮化(deendothelializing)損傷を作出した。動物を2mg/kg体重のタキソール溶液で処理し、対照動物賦形剤のみ(1日当たり13.4ml/kg体重の1:2:2:165のDMSO:クレモフォールEL:脱水エタノール:リン酸緩衝塩液)を損傷2時間後から始めて腹腔内注射した。タキソール溶液または賦形剤のみは次の4日間腹腔内注射として投与した。11日後に動物(タキソール処理8匹と賦形剤処理10匹)を上述のように麻酔し、頸動脈を単離して10%緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィン中に保持した。頸動脈の断面切片顕微鏡スライドに乗せてヘマトキシリンとエオシンで染色した。頸動脈の画像をディジタイジングボードに投影して動脈内膜(intima)と中膜(media)の断面席を測定した。結果を図2A〜2Cに示す。先行技術(Ferns,G.A.A.et al.,Science,253:1129−1132,1991)に示すように、再狭窄症のラット頸動脈損傷モデルはヒト再狭窄症研究に有用であり、ヒトの治療効果の可能性を示唆する。

0050

損傷頸動脈断面の定量分析によるとタキソール処理は賦形剤処理動物と比較して新生動脈内膜面積を70%減少した(表I)(*P<0.001;†P=NS;‡P<0.001)。タキソール処理動物の幾つかには実際上新生動脈内膜が全く認められなかった(損傷をもたらす化内皮は存在するが)が、一方賦形剤処理動物はすべて少なくとも中程度の新生動物内膜の厚みが観察された。

0051

これらの実験に用いられたタキソールのインビボ全身投与量(2mg/kg)は、ヒトの癌治療に元々用いられた投与量(3−6mg/kg)よりも有意に低く、前処理療法と最適の治療期間とを組み合わせて劇的に低い全身投与量で同等またはそれ以上の効果が得られる。さらに、治療の最終目的は「活性化」VSMCを抑制すること、あるいは好ましくは成長と移動のための刺激が分散するまでの間、(細胞死をもたらす細胞毒性を引き起こすことなく)まず活性化を防止することにあるのであるから、毒性の少ない短期間治療という最終目的がヒトについてもありうる。最終的には、局所的徐放性送達ステムが血管形成術後の再狭窄症を防ぐ最良の解決策を与えるものであり、これによって送達医薬の局所的な高濃度が得られ全身的毒性の問題を本質的に排除できるであろう。医薬を含浸したポリマーで被覆した金属ステント生分解性の医薬溶出性ポリマーステント、および金属ステントを被覆するための遺伝的にプライムされた内皮細胞などを含む医薬送達システムが有用であり、あるいは局所的に内皮細胞を被覆するものとして送達される(Muller,D.W.M.et al.,JACC17:126b−131b,1991)。これらのシステムは全身性の副作用なしに化学治療剤を安全に使用することを可能にする。あるいは、治療には治療前(すなわち血管手術前)に一定期間持続静脈注入し、次いで別の治療時期(局所的、直接送達)または手術後(経口、注射)に行うことも含むことができる。

0052

上記の実施例は、タキソール(またはタキソールの水溶性誘導体を含む、ただしそれに限定されないその他の微小管安定化剤)が、動脈閉鎖を防止し、それによって心臓発作、発作(stroke)、腎不全や腎臓透析失明四肢切断、神経失調治療用血管手術/血管形成術または臓器移植の必要性、および慢性的入院を要する未熟と恒久的障害の可能性を減少し、あるいはこれを防止するのに使用できることを教示する。本発明を詳細に記載したが、本発明は別の態様も可能であることを理解できるであろう。本発明の思想と範囲内で変更や修飾がなしうることが当業者には自明である。したがって、前述の開示は例示の目的のみのためになされたものであり、いかなる意味でも本発明を限定するものでなく、本発明は請求の範囲によってのみ定義される。

0053

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