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技術 エネルギー恒常性および細胞小器官代謝の調節に関与するMnkキナーゼ相同性タンパク質

出願人 ベーリンガーインゲルハイムインテルナツィオナールゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
発明者 アルントシュトイヤーナーゲルカルステンオイレンベルクギュンターブレンナートーマスチオゼックベッティーナルドルフドロテアルドルフフンミベルゴアシュテファンイェケルクリストフマイヤー
出願日 2010年3月12日 (10年9ヶ月経過) 出願番号 2010-056183
公開日 2010年6月3日 (10年7ヶ月経過) 公開番号 2010-119398
状態 特許登録済
技術分野 特有な方法による材料の調査、分析 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード 統合イベント 追加モデル Pライン 有限責任会社 背景放射 状態群 進歩状況 分子スペーサ
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2010年6月3日)のものです。
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図面 (20)

課題

本発明は、体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病高血圧冠動脈心疾患高コレステロール血症異脂肪血症骨関節炎胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および糖尿病、神経変性疾患、および癌、例えば生殖器官などの癌のような活性酸素防御に関連する障害の診断試験、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法に関するものである。

解決手段

本発明は、エネルギー恒常性中性脂肪の代謝を調節し、そして(または)膜安定性および(または)細胞小器官の機能(作用)に寄与するMnk相同性タンパク質、および本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドを開示する。

概要

背景

摂取熱量に対するエネルギー消費量がアンバランスというエネルギー不均衡に関連するヒトおよび動物代謝の疾患、例えば肥満症および激しい体重の減少がいくつか存在している。肥満症は世界に最も蔓延している代謝障害の1つである。この肥満症は、西側諸国にとってますます問題となっているヒトの疾病であり、その本質は依然としてほとんど理解されていない。肥満とは、理想的な体重の20%以上を超える体重として定義され、頻繁に著しい健康機能障害を結果としてもたらす。肥満は、心血管疾病高血圧糖尿病高脂血症リスクの増大および高い死亡率に関連する。肥満症に悩む個人は、病気にかかる深刻なリスクを抱えている上に、多くの場合、社会的孤立している。

肥満症は、遺伝的要因、代謝要因、生化学的要因、心理学的要因、および行動的要因によって影響される。このような事情から、肥満症は、持続的でポジティブ臨床結果を達成するために、さまざまな分野で取り組まなくてはならない複合障害である。肥満症は単一の障害として考慮されるべきではなく、(潜在的な)複数の原因を有する異種性状態群であると考慮されるべきであり、また、空腹時の血漿インスリンの上昇および経口グルコース摂取に対する過度インスリン反応も特徴とする(Koltermann、J.Clin.Invest 65、1980、1272−1284)。2型糖尿病における肥満症の明らかな介入は確認することができる(Kopelman、Nature 404、2000、635−643)。

食物摂取および体重のバランスを調節する分子因子は完全に理解されていない。たとえ、レプチンVCPI、VCPLまたはペルオキシソーム増殖活性受容体ガンマ活性化補助因子のような、体重/重量を調節する恒常性ステムに影響を及ぼすはずのいくつかの候補遺伝子記述されているとしても、肥満調節または体重/重量調節に影響を及ぼす特有分子機構および(または)分子は知られていない。加えて、マウスにおいて肥満症を結果としてもたらすいくつかの単一遺伝子突然変異が記載されており、肥満症の病因における遺伝的な因子を意味づけている(FriedmanおよびLeibel、1990、Cell 69:217−220)。肥満したマウスにおいては、単一遺伝子の突然変異(肥満)は、糖尿病を伴う深刻な肥満症を結果としてもたらす(Friedmanらの、1991、Genomics 11:1054−1062)。

概要

本発明は、体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患高コレステロール血症異脂肪血症骨関節炎胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および糖尿病、神経変性疾患、および癌、例えば生殖器官などの癌のような活性酸素防御に関連する障害の診断試験、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法に関するものである。本発明は、エネルギー恒常性、中性脂肪の代謝を調節し、そして(または)膜安定性および(または)細胞小器官の機能(作用)に寄与するMnk相同性タンパク質、および本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドを開示する。なし

目的

本発明の根底にある技術的問題は、熱産生体重調節および(または)エネルギー恒常性回路に影響を及ぼす(病理学的な)代謝条件の調節のための手段と方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

Mnk2の機能的等価物であり、配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるMnk2相同性ポリペプチド又はMnk2の機能的等価物であるその断片の酵素活性を増加または減少させる物質スクリーニング方法であって、以下の工程(a)下記の混合物インキュベートする工程および(aa)酵素的活性なMnk2の機能的等価物であり、配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるMnk2相同性ポリペプチド又はMnk2の機能的等価物であるその断片(ab)蛍光体でラベルされているキナーゼ基質;および(ac)候補物質(ad)適切な反応バッファー(b)キナーゼ基質のいかなるリン酸化を検出する工程、その際、上記候補物質が溶液中で上記蛍光体ラベルされたキナーゼ基質と結合し、その際、蛍光性偏りが、上記Mnk2の機能的等価物であり、配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるMnk2相同性ポリペプチド又はMnk2の機能的等価物であるその断片の酵素活性における増加または減少を検証するのに用いられる、を含む、Mnk2の機能的等価物であり、配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるMnk2相同性ポリペプチド又はMnk2の機能的等価物であるその断片の酵素活性を増加または減少させる物質のスクリーニング方法。

請求項2

上記キナーゼ基質が、基質上に固定化される請求項1記載の方法。

請求項3

上記キナーゼ基質が、立体障害をさけるために分子スペーサー腕によって上記特徴と関連する請求項1に記載の方法。

請求項4

候補物質のために、キナーゼ基質と競争する蛍光性のトレーサー分子をさらに含み、その際、間接的な蛍光性の偏りが、上記Mnk2の機能的等価物であり、配列番号2又は4で示されるアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるMnk2相同性ポリペプチド又はMnk2の機能的等価物であるその断片の酵素活性における増加または減少を検証するために使用される請求項1に記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、MAPキナーゼ結合キナーゼ(Mnk)遺伝子ファミリー核酸配列およびそれによってコードされたアミノ酸配列使用法、および体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病高血圧冠動脈心疾患高コレステロール血症異脂肪血症骨関節炎胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および活性酸素防御、糖尿病、神経変性疾患、および癌、例えば生殖器官の癌のような障害に関連する疾患および障害の診断試験、予防、および治療におけるこれらの配列またはMnk核酸またはポリペプチドエフェクター、特にMnkキナーゼ阻害剤および活性化剤の使用法に関するものである。

背景技術

0002

摂取熱量に対するエネルギー消費量がアンバランスというエネルギー不均衡に関連するヒトおよび動物代謝の疾患、例えば肥満症および激しい体重の減少がいくつか存在している。肥満症は世界に最も蔓延している代謝障害の1つである。この肥満症は、西側諸国にとってますます問題となっているヒトの疾病であり、その本質は依然としてほとんど理解されていない。肥満とは、理想的な体重の20%以上を超える体重として定義され、頻繁に著しい健康機能障害を結果としてもたらす。肥満は、心血管疾病、高血圧、糖尿病、高脂血症リスクの増大および高い死亡率に関連する。肥満症に悩む個人は、病気にかかる深刻なリスクを抱えている上に、多くの場合、社会的孤立している。

0003

肥満症は、遺伝的要因、代謝要因、生化学的要因、心理学的要因、および行動的要因によって影響される。このような事情から、肥満症は、持続的でポジティブ臨床結果を達成するために、さまざまな分野で取り組まなくてはならない複合障害である。肥満症は単一の障害として考慮されるべきではなく、(潜在的な)複数の原因を有する異種性状態群であると考慮されるべきであり、また、空腹時の血漿インスリンの上昇および経口グルコース摂取に対する過度インスリン反応も特徴とする(Koltermann、J.Clin.Invest 65、1980、1272−1284)。2型糖尿病における肥満症の明らかな介入は確認することができる(Kopelman、Nature 404、2000、635−643)。

0004

食物摂取および体重のバランスを調節する分子因子は完全に理解されていない。たとえ、レプチンVCPI、VCPLまたはペルオキシソーム増殖活性受容体ガンマ活性化補助因子のような、体重/重量を調節する恒常性ステムに影響を及ぼすはずのいくつかの候補遺伝子記述されているとしても、肥満調節または体重/重量調節に影響を及ぼす特有分子機構および(または)分子は知られていない。加えて、マウスにおいて肥満症を結果としてもたらすいくつかの単一遺伝子突然変異が記載されており、肥満症の病因における遺伝的な因子を意味づけている(FriedmanおよびLeibel、1990、Cell 69:217−220)。肥満したマウスにおいては、単一遺伝子の突然変異(肥満)は、糖尿病を伴う深刻な肥満症を結果としてもたらす(Friedmanらの、1991、Genomics 11:1054−1062)。

先行技術

0005

Koltermann、J.Clin.Invest 65、1980、1272−1284
Kopelman、Nature 404、2000、635−643
FriedmanおよびLeibel、1990、Cell 69:217−220
Friedmanらの、1991、Genomics 11:1054−1062

発明が解決しようとする課題

0006

以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、熱産生体重調節および(または)エネルギー恒常性回路に影響を及ぼす(病理学的な)代謝条件の調節のための手段と方法を提供することであった。

課題を解決するための手段

0007

当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられた実施例を提供することによって達成することができる。

0008

従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。本発明は、体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害に関連する疾患および障害、および、糖尿病、神経変性疾患、および癌のような活性酸素防御に関連する障害の調節に関与する特定の遺伝子を提供する。とりわけ、本発明ではヒトMnk遺伝子、特にヒトMnk2遺伝子変異体を上述した条件に関与するものとして記載する。

0009

用語「GenBankアクセッション番号」とは、全米バイオテクノロジー情報センターNCBI)のGenBankデータベースエントリに関するものである(BensonらのNucleic AcidsRes.28,2000,15−18)。

0010

タンパク質キナーゼは、多くの細胞機能調節に関与する重要な分子である。キイロショウジョウバエLK6セリントレオニンキナーゼ遺伝子は、微小管に関連することができる短命なキナーゼとして記載されている(J.Cell Sci.1997 110(2):209−219)。ショウジョウバエ複眼の発生・発育における遺伝的な分析により、RASシグナル伝達経路の調節における役割示唆された(Genetics 2000 156(3):1219−1230)。本発明に記載したように、ヒト相同体に最も近いショウジョウバエLK6キナーゼは、MAPキナーゼ結合キナーゼ2(Mnk2、例えば変異体Mnk2aおよびMnk2b)およびMAPキナーゼ結合キナーゼ1(Mnk1)である。すべての3タンパク質は大部分が細胞質局在している。Mnkは、pk42 MAPキナーゼErk1およびErk2およびp38 MAPキナーゼによってリン酸化される。このリン酸化は、成長因子ホルボールエステルおよびRasおよびMosのような発癌遺伝子に反応してトリガされる他に、ストレスシグナル伝達分子およびサイトカインによってもトリガされる。Mnkタンパク質のリン酸化は、そのキナーゼ活性原核開始因子4Eの方向に向かって刺激する(EMBO J.16:1909−1920(1997)、Mol Cell Biol 19:1871−1880(1999)、Mol Cell Biol 21:743−754(2001))。原核開始因子4E(elF4E)のリン酸化は、タンパク質翻訳の調節を結果としてもたらす(Mol Cell Biol 22:5500−5511(2001))。

0011

Mnkタンパク質によるタンパク質翻訳の刺激作用のモードを述べる異なる仮説が存在する。大部分の刊行物には、MAPキナーゼ結合キナーゼの活性化時点でのcap−依存のタンパク質翻訳に関するポジティブな刺激効果が記載されている。従って、Mnkタンパク質の活性化は、タンパク質翻訳の間接的な刺激作用または調節、例えば細胞質ホスホリパーゼ2α(BBA1488:124−138、2000)に対する作用につながる。

0012

Mnkの阻害剤(CGP57380およびCGP052088と呼ばれる)は従来の技術に記載されている(Knaufらの2001、Mol.Cell.Biol.21:5500、Tschoppらの2000、Mol Cell Biol Res Comm 3:205およびSlentz−Keslerらの2000、Genomics 69:63)。CGP052088は、Mnk1の生体外キナーゼ活性の阻害のための70 nMのIC50を備えたスタウロスポリン誘導体である。CGP57380は、Mnk2(Mnk2aまたはMnk2b)またはMnk1の選択的な低分子量、非細胞障害性の阻害剤である。CGP57380の細胞培養細胞への添加は、Mnk2(Mnk2aまたはMnk2b)またはMnk1と形質移入し、リン酸化されたeIF4Eの強い低下を結果としてもたらした。

0013

これまでには、Mnkキナーゼが体重の調節および熱産生に関与すること、よって肥満症のような代謝疾患、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および糖尿病、神経変性疾患、および癌、例えば生殖器官の癌のような活性酸素防御に関連する障害と関与し得ることは記載されていない。本適用例において、Mnkキナーゼの正しい遺伝子投与量がエネルギー恒常性の維持にとって必須であることを実証する。遺伝子スクリーニングを用いて、Mnkキナーゼ相同性遺伝子の突然変異が主要なエネルギー保管物質である中性脂肪含有量の著しい増加による肥満症の原因となることを同定した。さらには、本発明は、脱共役タンパク質(UCPs)の活性に影響を及ぼし、その結果、改変ミトコンドリア活性につながるMnkキナーゼにおける突然変異に関連するものである。また、本発明はMnk−特異阻害剤CGP57380およびその誘導体を用いた代謝障害治療に関連するものでもある。

0014

本発明において、Mnkのキイロショウジョウバエ相同体の正しい遺伝子投与量が、ハエ成体におけるエネルギー恒常性の維持、およびミトコンドリアの脱共役タンパク質の活性にとって必須であることを実証する。遺伝子スクリーニングを用いて、Mnk相同性遺伝子の突然変異が主要なエネルギー保管物質である中性脂肪含有量の著しい増加によるキイロショウジョウバエの肥満症の原因となることを同定した。脱共役タンパク質の活性を調節する因子を同定することを目的にデザインされた第2スクリーニングにおいて、発明者らはこのMnk相同性遺伝子の突然変異が脱共役タンパク質の活性の低減の原因となることを発見した。従って、本発明は、Mnkのショウジョウバエ相同体が細胞小器官、望ましくはミトコンドリア膜の安定性および(または)機能(作用)に寄与することの知見に基づくものでもある。LK6キナーゼにおける突然変異が脱共役タンパク質(UCP)の活性に影響し、ミトコンドリア活性の変化につながることを見出した。

0015

さらに、発明者らは、Mnk2遺伝子のマウス相同体が絶食、および遺伝的に誘導された肥満症によって調節されることを明らかにする。さらには、Mnk2のmRNAを生体外脂肪細胞分化中に強く上方制御する(実施例を参照)。本発明は、Mnk2転写物が大部分のマウス組織において発現されること、その中で最も高い発現レベルを示すのは白色(WAT)および脂肪組織(BAT)であることを明らかにする。白色脂肪組織における発現は、絶食マウスおよびob/obマウスにおいては約60%減少する。

0016

アクチン−mMnk2DN遺伝子組換えマウスの分析により、mMnk2DN導入遺伝子異所性発現(実施例を参照)が体重の明らかな増加につながることが明らかにされた。それは、高脂肪食の場合のみならず食餌制限の場合にも見出されるので、その効果は食餌依存性であるように思われる。従って、発明者らはMnk2が体重の調節において重要な役割を果たしていることを結論する。

0017

加えて、発明者らは、両者のヒトMnk2スプライス変異体相対発現ベルが分析したすべての組織に対して同一であることを見出した。両Mnk2変異体は共に、代謝障害、すなわち脂肪および筋肉組織に関連性のあるヒト組織において最も高い発現レベルを示す。さらには、両Mnk2変異体は共に、ヒト脂肪細胞分化中に上方制御される。従って、発明者らはMnk2 (またはその変異体)が成熟ヒト脂肪細胞の代謝における機能(作用)を有することを結論する。

0018

また、発明者らは、細胞を過剰発現するMnk2における細胞の中性脂肪レベルが対照細胞のレベルと比較して、4〜12日目の脂質生成において著しく低くなることを見出した。さらには、細胞を過剰発現するMnk2は、外来性グルコースから取り出した脂質の合成における効果が弱かった。その結果、脂質合成を刺激したインスリンのレベルは対照細胞と比較して、脂質生成の12日目で著しく低下した。また、発明者らは、外来性脂肪酸輸送が細胞を過剰発現するMnk2の血漿膜全域にわたること、従ってこれらの代謝産物エステル化は対照細胞と比較して脂質生成の12日目で相当に低いことを見出した。

0019

Mnkキナーゼファミリーのタンパク質に対して相同性を持つタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上記のように疾患および障害を調査研究するために好適である。Mnkキナーゼに関連する分子の発見は、上記のように疾患および障害の診断、治療、および予後において有用である新規組成物を提供することによって当分野における要望応えることができる。

0020

本タンパク質ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、説明した特定の装置、プロトコル細胞株ベクターおよび試薬に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書中に記載する方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料をここに記載した。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連し得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明がこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。

0021

本発明は、Mnk相同性タンパク質がエネルギー恒常性および脂肪代謝、特に中性脂肪、および本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドの代謝と保管を調節することを開示する。また、本発明は、Mnk相同性タンパク質が直接的にまたは間接的に膜安定性および(または)機能(作用)細胞小器官、特にミトコンドリア、および、本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドに関与することも開示する。本発明はまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関連するものである。また、本発明は、体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および糖尿病、神経変性疾患、および癌、例えば生殖器官の癌のような活性酸素防御に関連する障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法に関するものである。

0022

よって、Mnk相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物またはから入手可能である。特に好適なのは、ヒトMnk相同性ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸、特にポリペプチドおよびヒトMnk2タンパク質(図3Dおよび3Eに示したようにスプライス変異型Mnk2a、Genbankアクセッション番号AF237775、または図3Fおよび3Gに示したようにスプライス変異型Mnk2b、GenBankアクセッション番号AF237776またはNM_017572.1、Genbankアクセッション番号AF237775は提出者の要求により除去された旧番号Genbankアクセッション番号XM_030637に同一である;図3BにおけるClustal W複数配列アライメントを参照、また、図3D−Gにおける配列を参照)またはヒトMnk1タンパク質(図3Hおよび3Iに示したようにGenbankアクセッション番号AB000409.1およびNM_003684.2);Genbankアクセッション番号AB000409は提出者要求により除去された旧番号Genbankアクセッション番号XM_001600に同一である;図3CにおけるClustal W複数配列アライメントを参照)をコードする核酸である。

0023

本発明は、特に、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝の調節に寄与し、および(または)細胞小器官の膜安定性および(または)機能(作用)に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に関するものであり、当該核酸分子には下記が含まれるものである。
(a)Genbankアクセッション番号AF237775、NM_017572.1、AB000409.1、またはNM_003684.2のヌクレオチド配列、および(または)その補体
(b)1 xSSCおよび0.1%のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む溶液中で、50℃にて(a)の核酸分子、特に図3に示したようにアミノ酸配列をコードする核酸に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列、
(c)遺伝暗号変性内における(a)または(b)の配列に対応する配列、
(d)図3に示したように、少なくとも85%、望ましくは少なくとも90%、より望ましくは少なくとも95%、より望ましくは少なくとも98%および99,6%までアミノ酸配列に同一のポリペプチドをコードする配列、
(e)突然変異によって(a)〜(d)の核酸分子と異なる配列であり、当該突然変異がコード化されたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止を引き起こす配列または
(f)少なくとも15塩基、望ましくは少なくとも20塩基、より望ましくは少なくとも25塩基および最も望ましくは少なくとも50塩基の長さを有する(a)〜(e)のヌクレオチド配列の任意の部分的配列

0024

本発明は、Mnk相同性タンパク質(本明細書中ではMnkと呼ばれる)、特にMnk2 (Mnk2aまたはMnk2b)またはMnk1、およびこれらをコードするポリヌクレオチドが中性脂肪保管の調節に関与し、それゆえエネルギー恒常性にも関与するという知見に基づく。また、本発明は、Mnk相同性タンパク質が直接的にまたは間接的に膜安定性および(または)機能(作用)細胞小器官、特にミトコンドリア、および、本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドに関与することも開示する。本発明では、体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および糖尿病、神経変性疾患、および癌、例えば生殖器官の癌のような活性酸素防御に関連する障害の診断、試験、予防、または治療のための核酸分子またはポリペプチドを認識するヌクレオチド、タンパク質またはそのエフェクター、例えば抗体、アプタマーアンチセンス分子リボザイムRNAi分子ペプチド、低分子量の有機分子およびその他の受容体から成る組成物の使用法が記載されている。

0025

従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。エネルギー恒常性、代謝、および肥満症において新規機能をともなう遺伝子を発見するため、モデル生物体キイロショウジョウバエ(Meigen)を用いて機能的な遺伝子スクリーニングを実施した。キイロショウジョウバエは、生物学において最も集中的に研究された生物体の1つであり、ヒトを始めとした高等真核生物に共通する多くの発生過程および細胞過程調査のためのモデルシステムとして役に立つ(例えば、Adamsらの、Science 287:2185−2195(2000)を参照)。キイロショウジョウバエのモデル生物体としての成功の大部分は、生物学的プロセスに関与するフォワード遺伝子スクリーニングの威力に起因する。(Johnston Nat Rev Genet 3:176−188(2002);Rorth、Proc Natl Acad Sci U S A 93:12418−12422(1996)を参照)。スクリーニングのための1つのリソースは、専売のキイロショウジョウバエEPライン在庫コレクションであった。このコレクションのPベクターは、UAS部位へのGal4の結合時に、隣接するゲノムショウジョウバエ配列に転写できる基底プロモーターに融合したGal4−UAS結合部位を有する。これによって、EPラインのコレクションの内在性側面遺伝子配列の過剰発現が可能となる。加えて、UAS部位の活性化なしでは、EP因子の遺伝子への統合は、遺伝子活性の低下を引き起こす可能性があるので、機能喪失表現型を評価することにより、その機能を確定することができる。

0026

中性脂肪は、細胞において最も効果的なエネルギーの保管場所であり、肥満した患者において著しく増加されるものである。本発明において、発明者らは遺伝子スクリーニングを用いて、Lk6相同性遺伝子の突然変異が中性脂肪レベルの著しい変化によって反映される体重の変化の原因となることを同定した。エネルギー恒常性において機能を有する遺伝子を分離するため、数千のEPラインの中性脂肪含有量を長期にわたる食餌期間後に検査した。さらなる分析のための肯定的な候補として、中性脂肪含有量が顕著に変化したラインを選択した。本発明において、6日間の給餌後の同一遺伝子型を有するハエのプールの中性脂肪含有量を、例えば、中性脂肪測定法のような方法を使用して分析したが、これは本発明の範囲を限定するものではなく、その結果を以下に実施例の項において記載した。遺伝子機能損失による中性脂肪含有量の変化は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。

0027

中性脂肪含有量分析の結果を図1に示した。EP(3)3333およびEP(3)3576統合に対するハエのホモ接合性を中性脂肪測定法で分析した。ホモ接合性生存ラインEP(3)3333およびEP(3)3576の中性脂肪含有量の平均増加はおよそ140%である(図1)。以上の点から、その染色体遺伝子座86F7(推定、EP(3)3333ハエおよびEP(3)3576ハエのEPベクターが結合している染色体部位)における非常に可能性が高い遺伝子活性の損失は、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から、両方の事例において、肥満したハエモデルを表している。遺伝子機能の損失による中性脂肪含有量の増加は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。

0028

本発明のMnkタンパク質をコード化をする核酸をプラスミド救出技術を使用して同定した。EP(3)3333およびEP(3)3576統合に対して直接的に3′局在するゲノムDNA配列を分離した。それらの分離したゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(GadFly;FlyBase(1999)Nucleic AcidsResearch 27:85−88も参照)のような公共データベースをスクリーニングし、それによってMnk相同性遺伝子の5′エキソンの5′領域におけるEP(3)3333の統合側、および代替5′エキソンの5′領域におけるEP(3)3576を確認した(図2)。図2はこの遺伝子座分子構造を示す。ゲノムDNA配列をアセンブリによって、EP(3)3333およびEP(3)3576の統合部位を含んだ中間の黒色点線として表した。数字は、ゲノムDNA座標染色体3L上の7544500位置から始まる)を表す。2つの「cDNA」ライン上の灰色バーは、予測遺伝子(GadFly&Magpie)を表し、「Pエレメント」ライン上の灰色記号はEP−ベクター統合部位を表す。遺伝子CG17342の予測エキソンは、濃灰色のバーとして、およびEP(3)32517および予測イントロン薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。

0029

Lk6(ショウジョウバエにおけるMnk相同性遺伝子)は、GadFly配列分析プログラムによって予測される遺伝子に対してコード化する(GadFlyアクセッション番号CG17342)。本発明においてMnkと呼ばれる図3に示した遺伝子のために、肥満症および代謝疾患の調節を記載した機能的データは従来の技術には存在しない。

0030

また、ポリペプチドが細胞小器官の膜安定性および(または)機能(作用)に寄与する核酸分子をコードし、UCPを修飾できることがわかっているショウジョウバエのタンパク質を表現することは好適である。補足実施例も参照。補足実施例において実証したように、本明細書に記載のポリペプチド(およびコード化核酸分子)は、キイロショウジョウバエ遺伝子dUCPyの過剰発現が原因で生じたショウジョウバエにおける特定の眼の表現型を修飾、例えば増強することができた。ショウジョウバエの複眼におけるdUCPy(ヒトUCPsに対する相同性を有する)の過剰発現は、遺伝的「修飾因子スクリーニング」の「読み取り」として使用できる、明確に視認できる眼障害を引き起こした。

0031

当該「修飾因子スクリーニング」においては、その眼中発現を修飾するために、数千の異なる遺伝子を変異誘発さしめる。変異誘発した遺伝子の1つがdUCPyと相互に影響し、その活性を修飾する場合には、眼障害の増強または抑制が発生するであろう。そのようなハエは識別が容易なので、選択して相互作用する遺伝子を単離することができる。補足実施例に示すように、dUCPy活性によって誘発された眼障害を強化する遺伝子を推定した。この遺伝子は、上記のように、ヒトMnkタンパク質に対して高い相同性を有するショウジョウバエのLK6遺伝子と呼ばれる。本明細書に記載したMnk−ポリペプチド(および遺伝子)における突然変異は、修飾および改変されたミトコンドリア活性を備え得る表現型および(または)生理学的変化につながることが構想される。これは、次には、特に、エネルギー代謝の改変、変異熱産生および(または)エネルギー恒常性の改変につながる可能性がある。補足実施例に示すように、dUCPy活性によって誘発された眼障害を強化する遺伝子を推定した。

0032

よって、Mnk相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、ヒトLk6/Mnk相同体、特にMnk2変異体(Mnk2aまたはMnk2b)またはMnk1をコードする核酸である。本発明は、Mnk、特にMnk2変異体(Mnk2aまたはMnk2b)またはMnk1のアミノ酸配列から成るポリペプチドを説明する。異なる種(ヒトおよびショウジョウバエ)のMnkタンパク質間の比較(Clustal X 1.8)を行って、図3Aに示した。相同性に基づいて、本発明のMnkタンパク質および各相同性タンパク質またはペプチドは少なくともある程度の活性を共有する。

0033

特定の実施例によれば、本発明には、GenBankアクセッション番号AF237775、NM_017572.1、AB000409.1、またはNM_003684.2の核酸配列から成るポリヌクレオチドが包含される。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、Mnkをコードする多数のヌクレオチド配列(一部は既知であり天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する)を産生することが可能である。したがって本発明では、可能コドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作製し得るような、ありとあらゆる可能性のあるヌクレオチド配列変異体が考慮されている。この組み合わせは、天然のMnkのヌクレオチド配列に適用されるような標準トリプレット遺伝暗号に従って作製されるものであり、このような変異は全て特異的に開示されているものと考慮される。Mnkおよびその変異体をコードするヌクレオチド配列は、望ましくは好適に選択されたストリンジェントな条件下で天然のMnkのヌクレオチド配列に対してハイブリダイズ可能ではあるが、Mnkをコードするヌクレオチド配列、または実質上異なるコドンの使用法を有する誘導体を産出することは有益であり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を増加するようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変更することなく、Mnkおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由には、天然の配列から産出される転写物より望ましい、例えば半減期が長いなどの特性を有するRNA転写物の産出がある。本発明には、Mnkおよびその誘導体をコードする、DNA配列またはその部分を全て合成化学によって産出することも包含される。その産生後には、本発明の出願時に当分野で周知の試薬を用いて、この合成配列を任意の入手可能な多数の発現ベクターおよび細胞系中に挿入することが可能である。さらに、合成化学を用いて、Mnkまたはその任意の部分をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。

0034

さらに本発明に包含されるのは、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のヌクレオチド配列、特にGenBankアクセッション番号AF237775、NM_017572.1、AB000409.1、またはNM_003684.2で示される配列にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl、G.M.およびS.L.Berger(1987:MethodsEnzymol.152:399−407)およびKimmel、A.R.(1987;Methods Enzymol.152:507−511)で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブ溶解温度(Tm)に基づいており、定義されたストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、1時間 1 xSSCおよび0.1% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を用いて50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68℃にて、特に1時間 0.2 x SSCおよび0.1% SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中で50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68℃にて洗浄後、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。本発明に包含されているMnkをコードする変異核酸配列には、異なるヌクレオチドの欠損、挿入、または代替が含まれており、同一物または機能に同等なMnkをコードするポリペプチドを結果としてもたらす。

0035

コードされたタンパク質には、サイレント変化を産生し、機能的に等価なMnkを結果としてもたらすアミノ酸残基の欠損、挿入、または置換も含まれ得る。計画アミノ酸代替は、Mnkの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性電荷、溶解度、疎水性親水性、および(または)両親媒性特性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ;正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ;そして類似の親水性値を持つ非荷電極ヘッドグループを有するアミノ酸には、ロイシンイソロイシン、およびバリングリシンおよびアラニンアスバラギンおよびグルタミン;セリンおよびトレオニン;フェニルアラニンおよびチロシンが含まれ得る。

0036

また本発明の範囲内には、Mnkをコードする遺伝子の対立遺伝子も含まれている。本明細書で使用されているように、「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は遺伝子の代替形態であり、核酸配列において少なくとも1つの突然変異から生じ得る。対立遺伝子は、構造または機能が変異し得るかどうかわからない変異mRNAsまたはポリペプチドを結果としてもたらし得る。任意の遺伝子は、無、単一、または多くの対立遺伝子形態を持つことが可能である。対立遺伝子を誘発する一般の突然変異性変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加、または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で1回以上生じ得る。当分野で公知であり、一般に入手可能なDNAシーケンシングのための方法を用いて、本発明の任意の実施例を実行することが可能である。その方法では、例えば、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASEDNAポリメラーゼ(オハイオ州クリーブランド市のUS Biochemical社)、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer社)、熱安定性T7ポリメラーゼイリノイシカゴ市のAmersham社)、またはELONGASE増幅システムメリーランド州ゲーサーズバーグのGIBCO/BRL社)のような組換えポリメラーゼおよび校正エキソヌクレアーゼの組み合わせなどの、酵素を用い得る。望ましくは、そのプロセスを、HamiltonMICROLAB 2200(ネバダ州リノ市のHamilton社)、Peltier thermal cycler (PTC200;マサチューセッツウォータタウンのMJ Research社)およびABI377DNA配列決定装置(Perkin Elmer社)などの機械を用いて自動化する。Mnkをコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用したり、当分野で周知の種々の方法を使用することによって伸長させ、プロモーターおよび調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る方法の1つである「制限部位PCR法」は、ユニバーサルプライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知の配列を読み出す方法である(Sarkar、G.(1993)PCRMethodsApplic.2:318−322)。また、逆PCR法は、既知の領域に基づいた分岐プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために使用することも可能である(Triglia、T.らのNucleic Acids Res.16:8186)。使用可能な別の方法としては、キャプチャPCR法があり、これにはヒトおよび酵母菌人工染色体DNAにおける既知の配列に近傍するDNA断片PCR増幅が含まれる(Lagerstrom、M.らのPCR Methods Applic.1:111〜119)。未知の配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Parker、J.D.らの方法が挙げられる(1991;Nucleic Acids Res.19:3055−3060)。加えて、PCR法、ネステッドプライマー、およびPROMOTERFINDERライブラリを用いて、ゲノムDNAの中に入ることが可能である(Clontech社,Palo Alto,Calif.)。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるのに有用である。

0037

完全長cDNAをスクリーニングする際には、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを使用することが望ましい。また、遺伝子の5′領域を含んだ、より多くの配列を含むランダムプライムライブラリも望ましい。ランダムプライムライブラリの使用は、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを産しない状況において特に望ましい。ゲノムライブラリは、5′および3′非転写調節領域への配列の伸長に対して有用であり得る。市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シーケンシング産生物またはPCR産生物のサイズを分析すること、またはそのヌクレオチド配列を確認することが可能である。具体的には、キャピラリーシーケンシングは、電気泳動分離のための流動性ポリマーレーザー駆動の4つの異なる蛍光色素(各ヌクレオチドあたり1個)、および電荷結合素子(CCD)カメラによる発光波長の検出を用いることが可能である。出力および光の強度は、適切なソフトウェア(例えばPerkin Elmer社のGENOTYPERおよびSEQUENCE NAVIATOR)を使用して電気信号に変換することができ、試料の取り込みからコンピュータ分析までの全プロセス、および電子データ表示は、コンピュータ制御が可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定の試料に限られた量が存在する可能性のあるDNA小片のシーケンシング(配列決定)に特に望ましい。

0038

本発明の他の実施例によれば、Mnkをコードするポリヌクレオチド配列、または融合タンパク質またはその機能的等価物またはその断片は、適切な宿主細胞内でMnkの発現をさせるような組換えDN分子内で使用することが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ、あるいは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列を産出することができ、これらの配列はMnkをクローン化および発現するために利用することが可能である。当事者にとっては当然なことだが、非天然コドンを有するMnkがコードするヌクレオチド配列を産出することは有益であろう。例えば、特定の真核宿主または原核宿主によって好適とされるコドンは、タンパク質の発現率を高めるため、または、例えば天然配列から作成された転写物の半減期よりも長い半減期などの好ましい特性を有する組換えRNA転写を産生するために選択することが可能である。本発明のヌクレオチド配列は、種々の目的でMnkのコードする配列を変えるために、当分野で公知の方法を使用して組換えることができ、この目的には、遺伝子産物クローニング、処理、および(または)発現等が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーションおよびPCR再アセンブリによるDNAシャフリングを用い、ヌクレオチド配列を遺伝子操作することが可能である。例えば、部位特異的変異誘導を用いて、新規制限部位を挿入、グリコシル化パターンを改変、コドン優先の変更、スプライス変異体の産生、または突然変異の導入、等々を行い得る。

0039

本発明の他の実施例によれば、天然の核酸配列、修飾核酸配列またはMnkをコードする組換え核酸配列を異種配列連結反応させ、融合タンパク質をコードすることができる。例えば、Mnk活性の阻害剤に対してペプチドライブラリをスクリーニングするためには、市販の抗体によって識別可能キメラMnkタンパク質を作成することが有用であり得る。また、Mnkが異種部分から切断および精製され得るようにするため、融合タンパク質が、Mnkのコードする配列と異種タンパク質配列との間にある切断部位を含むように遺伝子操作することが可能である。他の実施例によれば、当分野で周知の化学的方法を用いて、Mnkをコードする配列の全部または一部を合成することが可能である(Caruthers et al.(1980)Nucl.AcidsRes.Symp.Ser.7:215−223,Horn et al.(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.7:225−232を参照)。あるいは、化学的な方法を用いて、Mnkのアミノ酸配列またはその一部分を合成するためにタンパク質自体を産出することが可能である。例えば、種々の固相技術を使用してペプチド合成を行うことができ(Robergeらの(1995)Science 269:202−204)、例えばABI431ペプチドシンセサイザ(Perkin Elmer社)を使用して自動合成を達成することが可能である。新規に合成したペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Creighton,T.(1983)Proteins,Structures and Molecular Principles,WH Freeman and Co.,New York,N.Y.)によって実質上精製することが可能である。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析またはシーケンシングによって確認することが可能である(例えば、Edman degradation procedure;前出のCreighton)。加えて、Mnkのアミノ酸配列またはその任意の一部は、直接合成中に変異させることができ、および(または)変異型ポリペプチドを産生するために、化学的方法を使用して、他のタンパク質またはその任意の一部から得た配列と結合させることが可能である。

0040

生物学的に活性なMnkを発現するために、Mnkをコードするヌクレオチド配列または機能的な等価物を好適な発現ベクターに挿入することができ、その発現ベクターとは、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターを指す。当業者に公知の方法を用いて、Mnkをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、生体外の組換えDNA技術、合成技術、および生体内の遺伝的な組換えが含まれる。その技術は、Sambrook,J.らの(1989)Molecular Cloning、Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.、およびAusubel,F.M.らの(1989)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.に記載されている。

0041

調節エレメントには、例えばプロモーター、開始コドン終止コドン、mRNA安定性調節エレメント、およびポリアデニル化信号が含まれる。ポリヌクレオチドの発現は、(i)サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター/エンハンサー領域のような構成型プロモーター、(ii)インシュリンプロモーター(Soriaらの2000,Diabetes 49:157を参照)、SOX遺伝子プロモーター(Liらの1998,Curr.Biol.8:971−4を参照)、Msi−1プロモーター(Sakakiバーaらの1997,J.Neuroscience 17:8300−8312を参照)、α−噴門ミオシン重鎖プロモーターまたはヒト心房性ナトリウム利尿因子プロモーター(Klugらの1996,J.clin.Invest 98:216−24;Wuらの1989,J.Biol.Chem.264:6472−79)のような組織特定のプロモーター、または(iii)テトラサイクリン誘導型システムのような誘導型プロモーターよって保証される。また、発現ベクターには、ネオマイシンハイグロマイシンまたはピューロマイシン耐性遺伝子のような、抗生物質耐性授与する選択薬剤またはマーカー遺伝子を含むことができる。これらの方法には、生体外組換えDNA技術、合成技術、および生体内遺伝子組換え技術が含まれる。その技術は、Sambrook,J.らの(1989)Molecular Cloning、Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.およびAusubel,F.M.らの(1989)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.に記載されている。本発明のさらに他の実施例によれば、天然の核酸配列、修飾核酸配列または本発明のタンパク質および相同性タンパク質をコードする組換え核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコードすることが可能である。

0042

種々の発現ベクターと宿主系を利用して、タンパク質または融合タンパク質をコードする配列を保持および発現することが可能である。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクター形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルスアデノウイルスアデノ随伴ウイルスレンチウイルスレトロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系などの微生物等が含まれているが、これらに限定されるものではない。

0043

「調節要素」または「調節配列」は、転写および翻訳を行なうために宿主細胞タンパク質と相互作用するベクター、例えばエンハンサー、プロモーター、5"および3"非翻訳領域の非翻訳領域である。このような要素の強度および特異性は様々である。利用されるベクターシステムおよび宿主にもよるが、構成型プロモーターおよび誘導型プロモーターを含んだ任意数の適切な転写要素および翻訳要素を利用することが可能である。例えば、細菌系においてクローニングを行なう場合、BLESCRITファージミドのハイブリッドlacZプロモーターような誘導型プロモーター(カリフォルニア州ラ・ホヤのStratagtagene社)またはPSPRT1プラスミド(GibcoBRL社)などを使用することが可能である。バキュロウイルスのポリドリンプロモーターは昆虫細胞において使用することが可能である。植物細胞のゲノム(例えば、熱ショックであるRUBISCO;および保管タンパク質遺伝子など)または植物ウィルス(例えば、ウィルスのプロモーターおよびリーダー配列)に由来するプロモーターおよびエンハンサーは、ベクターにクローニングすることが可能である。哺乳動物の細胞系では、哺乳動物の遺伝子または哺乳動物のウィルスからのプロモーターが望ましいとされる。Mnkをコードする複数のコピーの配列を含む細胞株を作成する必要がある場合には、SV40またはEBVに基づいたベクターを適切な選択可能マーカーと共に使用することが可能である。

0044

細菌系では、多数の発現ベクターがMnkの使用目的に応じて選択することが可能である。例えば、多量のMnkが抗体の誘発のために必要な場合には、容易に精製される、融合タンパク質の高レベル発現を誘導するベクターを使用することが可能である。そのようなベクターには、多機能大腸菌クローニング、Mnkをコードする配列が、ハイブリッドタンパク質が産生されるようにアミノ末端Metおよびその結果生じた7つのβ−ガラクトシダーゼの残基に対する配列を有するベクターフレームに結合することが可能であるBLUESCRIPTファージミド(Stratagene社)のような発現ベクター、pIN ベクター(Van Heeke,G.およびS.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264:5503−5509)、その他が含まれているが、それらに限定されるものではない。また、GEXシリーズ(Amersham Biosciencies社、Uppsala、スウェーデン)のベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)を有する融合タンパク質として発現することも可能である。一般に、そのような融合タンパク質は可溶であり、グルタチオンアガロースビーズに対する吸着、それに続く遊離グルタチオンの存在下における溶出によって産生した溶解細胞から容易に精製することができる。そのようなシステムで作られたタンパク質は、所定のクローンポリペプチドがGST部分から意のままに開放することができるように、ヘパリントロンビン、またはXA因子プロテアーゼ切断部位を含むようにデザインすることが可能である。酵母菌、サッカロミセスセレビジエにおいて、α因子アルコールオキシダーゼ、およびPGHなどの構成型プロモーターまたは誘導型プロモーターを含むいくつかのベクターを使用することが可能である。論評に関しては、前出のAusubelら、およびGrantらの(1987)MethodsEnzymol 153:516−544を参照。

0045

植物発現ベクターを使用する事例によれば、Mnkをコードする配列の発現をプロモーターの任意の1つによって駆動することが可能である。例えば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターのようなウィルスプロモーターを単独またはTMVからのオメガリーダー配列(Takamatsu,N.(1987)EMBO J.6:307−311)と共に使用することが可能である。あるいは、RUBISCOの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することが可能である(Coruzzi,G.らの(1984)EMBO J.3:1671−1680、Broglie,R.らの(1984)Science 224:838−843、およびWinter,J.らの(1991)Results Probl. Cell Differ.17:85−105)。これらの作成物は、直接DNA形質転換または病原体媒介性の形質移入によって、植物細胞内に導入することができる。そのような技術は、一般に入手できるいくつかの論評に記載されている(例えば、『マグロヒル科学技術年鑑』(McGraw Hill Yearbook of Science and Technology)(1992)McGraw Hill New York NYのHobbs,S.またはMurry,L.E.を参照。ページ番号191−196)。

0046

また、昆虫システムを用いてMnkを発現することも可能である。例えば、昆虫系の1つでは、オートグラファカリフォルニアニュークレアの多面性ウィルス(AcNPV)がベクターとして使用され、ハスモンヨウ近似種(Spodoptera frugiperda)細胞またはウワバ(Trichoplusia)の幼虫における外来遺伝子を発現している。Mnkをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子等のウィルスの不必須領域へクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれることが可能である。Mnkの首尾良い挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、外殻タンパク質欠ける組換えウィルスを産出する。さらに、組換えウィルスを用いて、Mnkが発現され得るTrichoplusiaの幼虫のS.frugiperda細胞を感染することが可能である(Engelhard,E.K.らの(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.91:3224−3227)。

0047

哺乳動物の宿主細胞においては、いくつかのウィルスベースの発現系を利用することが可能である。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び3連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物/翻訳複合体にMnkをコードする配列を結合し得る。ウィルスゲノム非必須E1またはE3領域における挿入を用いて、感染した宿主細胞においてMnkを発現する能力のある生ウィルスを得ることが可能である(Logan、J.およびShenk、T.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81:3655−3659)。加えて、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物の宿主細胞における発現を高めることが可能である。

0048

特定の開始シグナルによって、Mnkをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。そのようなシグナルには、ATG開始コドンおよび近傍する配列が含まれる。Mnkをコードする配列、その開始コドン、および上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。但し、コーディング配列のみ、またはその一部のみが挿入される事例においては、ATG 開始コドンを含んだ外来性翻訳調節シグナルが提供される必要がある。さらに、その開始コドンは、全挿入の翻訳を確実にするため、正しい読み取りフレーム中に存在する必要がある。外来性の翻訳要素および開始コドンは、天然および合成の両方を含めた様々な起源の産物であり得る。発現の効率は、文献 (Scharf、D.らの(1994)Results Probl.Cell Differ.20:125−162)に記載されたように、使用される特定の細胞系に対して適切なエンハンサーを包括することによって高めることが可能である。

0049

加えて、宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節する能力、または発現したタンパク質を所望の形態で処理する能力に対して選択することも可能である。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、それらに限定されるものではない。タンパク質の「プレプロ」形を切断する翻訳後の処理を用いて、正しい挿入、折りたたみ、および(または)機能を促進することが可能である。CHO、HeLa、MDCKHEK293、およびWI38などの翻訳後の活性のための固有の細胞装置および特徴のある機構を有する種々の宿主細胞は、外来タンパク質の正しい修飾および処理を確実にするように選択することが可能である。

0050

長期にわたる、組換えタンパク質の高歩留産生のためには、安定した発現が望ましい。例えば、安定してMnkを発現する細胞株は、複製発現因子および(または)内在性発現因子のウィルス起源を含み、選択可能マーカー遺伝子を同一ベクター上または別個のベクター上に含み得る発現ベクターを使用して、形質転換することが可能である。ベクターの導入後、細胞は選択培地移行せしめる前に強化培地において1〜2日間増殖せしめることが可能である。選択可能マーカーの目的は、選択への抵抗性を与えることであり、その存在によって導入された配列を首尾良く発現する細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することが可能である。任意数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収することが可能である。この選択系には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler,M.らの(1980)Cell 22:817−23)、およびtk−細胞またはaprt−細胞にそれぞれ用いることができるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy,I.らの(1980)Cell 22:817−23)遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、代謝拮抗物質抗生物質または除草剤耐性は、その選択基準として用いることができ、例としてはメトトレキセートに耐性を与えるdhfr(Wigler,M.らの(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77:3567−70)、アミノグリコシッドネオマイシンおよびG−418に耐性を与えるnpt(Colbere−Garapin,F.らの(1981)J.Mol.Biol.150:1−14)、およびクロルスルフロン(chlorsulfuron)とホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(phosphinotricin acetyltransferase)にそれぞれ耐性を与えるalsまたはpat(前出のMurry)などが挙げられる。追加の選択可能遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代替としてインドールを利用することを可能にするtrpB、または細胞がヒスチジンの代替としてヒスチノルを利用することを可能にするhisDなどは(Hartman、S.C.およびR.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:8047−51)に記載されている。最近、可視マーカーは好評を博しており、アントシアニンβ−グルクロニダーゼおよびその基質GUS、ルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどのマーカーは、形質転換体を同定するためだけではなく、特定のベクター系に依存する一過性または安定したタンパク質発現定量化するために広範に使用されている(Rhodes、C.A.らの(1995)MethodsMol.Biol.55:121−131)。

0051

生体内では、基質に対するMnk無修飾ポリペプチドの酵素性キナーゼ活性を適当な刺激によって促進することができ、Mnkのリン酸化をトリガーすることができる。これは、シグナル伝達分子または環境的な影響のような細胞外のまたは細胞内の刺激によって天然の状況において誘導することが可能である。活性化されたMnkを含むシステムは、それが細胞または無細胞の環境の生物体、組織、培養であれ、外因的にこの刺激を適用することによって、または種々の技術でこの刺激を模倣することによって作成することが可能であり、さらにその一部を以下に記載した。活性化Mnkを含んだシステムは、(i)体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害、および糖尿病、神経変性疾患、および癌、例えば生殖器官の癌のような活性酸素防御に関連する障害の診断、試験、予防、および治療の目的のため、(ii)本発明の遺伝子またはそれらのコード化されたポリペプチに影響を及ぼす治療薬候補医薬品または薬物を同定または確証する目的のため、(iii)本発明の遺伝子によってコードした活性化ポリペプチドを含んだ細胞可溶化液を作成する目的のため、(iv)本発明の遺伝子によってコードしたこのソース活性化ポリペプチドから分離する目的のため産生することが可能である。

0052

本発明の一実施例によれば、上記の当該目的のため、天然刺激非依存性の活性化Mnkを、例えば、限定するものではないが、(i)天然の刺激を模倣する薬剤;(ii)MAPキナーゼ経路、ホルボールエステル、アニソマイシンの活性化剤、MAPキナーゼキナーゼキナーゼ、MAPキナーゼキナーゼ、およびMAPキナーゼの構成型活性対立遺伝子のような下流の天然の刺激に作用する薬剤、または記述したとおりのMnk自体または作成したMnkでもよい;(iii)構成型活性形態を作り出すためのMnk配列内での単一または複数のアミノ酸の置換、欠損または挿入の導入;(iv)Mnkの分離した断片の使用によって産生することが可能である。加えて、このシステムに対して活性化する組成物を同時転移することによって、異所性システム、真核または原核、生体内または生体外において酵素的に活性なMnkを作成することが可能である。これらは、例えば、限定するものではないが、MAPキナーゼERK1またはERK2またはp38MAPイソ型と共に、MAPキナーゼキナーゼMek1またはMkk6の構成型活性対立遺伝子のようなMAPキナーゼ経路の組成物であり得る。例えば、1.0mMアデノシン三リン酸、および50mM N−(2−ヒドロキシエチル)−ピペラジン−N′−(2−エタンスルホン酸)/水酸化カリウムpH 7.4、5mMの塩化マグネシウム、0.5mMのジチオスレイトールのような好適な緩衝剤条件の存在下で分離したERK2キナーゼと共に、アミノ酸置換S218DおよびS222Eを含んだMek1の変異体ポリペプチドを用いて、溶液中の分離したMnkタンパク質を活性化することが可能である(図14を参照)。

0053

マーカー遺伝子発現の有無は、所定の遺伝子の有無も示唆するが、その存在および発現は確認する必要がある。例えば、Mnkをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、Mnkをコードする配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定することが可能である。または、1つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がMnkをコードする配列と一列に配置することも可能である。マーカー遺伝子の発現は通常、誘発または選択に応答してタンデム遺伝子の発現も示す。あるいは、Mnkをコードする核酸配列を含み、Mnkを発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の方法を用いて同定することが可能である。これらの手順には、DNA−DNA、またはDNA−RNAハイブリダイゼーション、および核酸またはタンパク質の検出および(または)定量化のための膜系溶液ベース、またはチップベーステクノロジを含むタンパク質の生物学的試験法または免疫学的測定法が含まれるが、それらに限定されるものではない。

0054

Mnkをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、Mnkをコードするポリヌクレオチドのプライマー、プローブ、または部分または断片を用いて、DNA−DNAまたはDNA−RNAハイブリッド形成法、または増幅によって検出することが可能である。核酸の増幅基調アッセイには、オリゴヌクレオチドの使用、またはMnkをコードするDNAまたはRNAを含んだ形質転換体を検出するためにMnkをコードする配列に基づいたオリゴマーが含まれる。本詳細書で使用された「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、最低約10ヌクレオチド、および約60ほどのヌクレオチド、望ましくは約15〜30ヌクレオチド、およびより望ましくは約20〜25ヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブまたはアンプリマーとして使用されることが可能である。

0055

タンパク質に固有のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるMnkの発現を検出および計測のためのさまざまなプロトコルは当分野で周知である。実施例には、酵素免疫測定(吸着)法(ELISA)、放射免疫測定RIA)、および蛍光細胞分析分離装置(FACS)が含まれる。Mnk上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、2部位モノクローナルベースの免疫学的測定法は好適ではあるが、競合結合アッセイを用いることが可能である。これらを含めた他の測定法は、Hampton、R.らの(ミネソタセントポール市、1990;Serological Methods,Laboratory Manual,APSPress)およびMaddox、D.E.らの(1983;J.Exp.Med.158:1211−1216)の諸所に記載されている。

0056

多岐にわたる標識技術および抱合技術が当業者に知られており、種々の核酸およびアミノ酸測定法において使用することが可能である。標識ハイブリダイゼーションを産生するための手段、またはMnkをコードするポリヌクレオチドに関連する配列検出するためのPCRプローブには、標識ヌクレオチドを使用するオリゴ標識、ダコン翻訳、末端標識またはPCR増幅が含まれる。

0057

あるいは、Mnkをコードする配列またはその任意の部分を、mRNAプローブを産出するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野で周知であり、市販もされており、T7、T3、またはSP6および標識ヌクレオチドのような適切なRNAポリメラーゼを追加することによって、生体外RNAプローブの合成に使用することが可能である。このような手順は、市販されている種々のキットミシガンカラマズーのPharmacia&Upjohn社)、Promega社(ウィスコシン州マディソン)、およびU.S.Biochemical Corp社(オハイオ州クリーブランド)を用いて実行することが可能である。

0058

また、使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒子なども含まれる。

0059

Mnkをコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養する。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用される配列および(または)ベクターによるが、分泌または細胞内に含有せしめることが可能である。Mnkをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するMnkの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。その他の組換え構造を用いて、Mnkをコードする配列を水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することが可能である。そのような精製促進ドメインには、固定化金属上の精製を可能にするヒスチダイントライファン分子のような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質Aドメインおよびフラグ伸長・親和性精製システム(ワシントン州シアトル市のImmunex Corp.)において利用されるドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。XA因子または精製ドメインとMnk間のエンテロキナーゼ(腸活素)(Invitrogen社,San Diego,Callif.)等に対して特異的な切断可能リンカー配列の抱合は、精製を促進するために使用することが可能である。そのような単一発現ベクターは、Mnkを含む融合タンパク質の発現、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ(腸活素)切断部位に先行する、6ヒスチダイン残基をコードする核酸を提供する。エンテロキナーゼ(腸活素)切断部位は、融合タンパク質からMnkを精製する手段を提供する一方、ヒスチジン残基は、IMIAC(Porath、J.らの(1992、Prot.Exp.Purif.3:263−281)に記載された固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー)上での精製を促進する。融合タンパク質を含むベクターの論考は、Kroll,D.J.らの(1993;DNA Cell Biol.12:441−453)で提供されている。組換え産出に加えて、Mnkの断片は、固相技術(Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149−2154)を用いてペプチド合成を誘導することによって産生することができる。タンパク質合成は、手動または自動の何れの技術によっても実行することが可能である。自動合成は、例えばApplied Biosystems 431ペプチドシンセサイザ(Perkin Elmer社)を用いて達成することが可能である。Mnkの種々の断片は、完全長分子を産生するために化学的方法を使用して、個別に化学的な合成および結合を行なうことが可能である。

0060

診断および治療
本発明において開示したデータは、ことを明らかにする。核酸および本発明のタンパク質およびそのエフェクター分子が、例えば、限定するものではないが、肥満症、糖尿病、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、すい臓の機能障害、動脈硬化症冠動脈疾患CAD)のような代謝障害、および上記のようなその他の疾患および障害に関連する診断目的および治療目的において有用である。従って、本発明のMnkタンパク質の診断用途および治療用途は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである:(i)タンパク質治療、(ii)小分子薬剤標的、(iii)抗体標的(治療、診断、薬剤ターゲッティング細胞毒性抗体)、(iv)診断および(または)予後マーカー、(v)遺伝子療法遺伝子送達と遺伝子除去)、(vi)研究ツール、および(vii)生体外および生体内における組織再生(これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生)。

0061

本発明の核酸およびタンパク質は、上述した種々の疾患と障害および(または)その他の病理学および障害に関与する診断用途および治療目的において有用である。例えば、限定するものではないが、遺伝子療法、および本発明のMnkタンパク質および特にそのヒト相同体において有用であり得る、本発明のMnkタンパク質をコードするcDNAsおよび特にそのヒト相同体は、それを必要とする被験体に投与された場合に有用であり得る。例証として、本発明の組成物は、例えば、限定するものではないが、肥満症、糖尿病、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、すい臓の機能障害、動脈硬化症、冠動脈疾患(CAD)のような代謝障害、およびその他の疾患および障害、特に上記のような疾患および障害に苦しむ患者の治療に有効性を有する。

0062

本発明のMnkタンパク質をコードする核酸、またはその断片は、核酸またはタンパク質の存在または量が算定されるべき診断適用例においてもさらに有用であり得る。これらの材料はさらに、治療法または診断法における使用のため、本発明の新物質に対して免疫特異的に結合する抗体の作成において有用である。

0063

例えば一実施態様においては、アンタゴニストとして直接的に、またはMnkを発現する細胞や組織に薬剤をもたらすターゲッティングまたは輸送機構として間接的に、Mnkに特異な抗体を用いることが可能である。その抗体は当分野で周知の方法を用いて作成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体一本鎖Fab断片、およびFab発現ライブラリによって産生された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体(すなわち、二量体の形成を阻害する抗体)は特に治療用に望ましい。

0064

抗体の産生のためには、ヤギウサギラット、マウス、ヒトなどを含む種々の宿主は、Mnkの任意の断片またはオリゴペプチドであって免疫抗原性の特性を有するものを注入することによって免疫化することができる。宿主の種によるが、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることが可能である。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、およびリゾレシチンプルニックポリオルポリアニオン、ペプチド、油性乳濁液キーホールリンペットヘモシニアン、およびジニトロフェノールのような表面活性物質などが含まれるが、それらに限定されるものではない。ヒトに使用されるアジュバントの中では、BCGカルメット‐ゲラン杆菌)およびコリネバクテリウムパルヴムが特に望ましい。Mnkに対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片またはオリゴペプチドは、少なくとも約5のアミノ酸からなり、より望ましくは少なくとも約10のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが望ましい。これらが、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であること、および小さな天然分子の全アミノ酸配列を含み得ることが望ましい。Mnkアミノ酸の短い伸長部は、キメラ分子に対して産生されたキーホールリンペットヘモシニアンおよび抗体等の、別のタンパク質の伸長部と融合することができる。

0065

Mnkに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術(Kohler、G.らの(1975) Nature 256:495−497;Kozbor、D.らの(1985)J.Immunol.Methods81:31−42;Cote、R.J.らのProc.Natl.Acad.Sci.80:2026−2030;Cole、S.P.らの(1984)Mol.Cell Biol.62:109−120)が含まれるが、それらに限定されるものではない。

0066

加えて、「キメラ抗体」を産出するために開発された技術、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である(Morrison,S.L.らの(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851−6855;Neuberger,M.S.et al(1984)Nature 312:604−608;Takeda,S.らの(1985)Nature 314:452−454)。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、Mnk特異性一本鎖抗体を作成する。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ成分の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって作成することが可能である(Burton、D.R.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88:11120−3)。抗体はまた、リンパ球集団における生体内産生の誘導によって産生することが可能であり、または組換え免疫グロブリンライブラリまたは文献に開示されているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによっても産生することが可能である(Orlandi、R.らの(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.86:3833−3837;Winter、G.らの(1991)Nature 349:293−299)。

0067

Mnkに対する特異的な結合部位を含む抗体断片も得ることができる。例えば、そのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって産生できる蛋白分解性断片、例えばF(ab′)2断片、およびF(ab′)2のスルフィド架橋還元することによって作成できるFab断片が含まれるが、それらに限定されるものではない。あるいは、組換え(型)の断片を作成することも可能である。例えば、Fab発現ライブラリを作製して、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にすることができる(Huse、W.D.らの(1989)Science 254:1275−1281)。

0068

種々の免疫学的測定法をスクリーニングに対して用い、所望の特異性を有する抗体を同定することが可能である。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合結合および免疫放射定量測定法のための幾多のプロトコルは、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、Mnkとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。2つの非干渉性Mnkエピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する2部位モノクローナルベースの免疫学的測定法が望ましいが、競合結合アッセイを用いることも可能である(前出のMaddox)。

0069

本発明の別の実施例によれば、Mnkポリヌクレオチドまたはその任意の断片、または核酸エフェクター分子、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイムまたはRNAi分子を治療目的のために使用することが可能である。一実施態様において、組み合わせ核酸ライブラリの使用を含んだ手順のスクリーニングおよび選択によって、アプタマー、すなわち、Mnkタンパク質に対して結合し、その活性を調節する能力のある核酸分子を作成することが可能である。

0070

さらなる実施態様によれば、Mnkをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子を、mRNAの転写を阻止することが望ましいような状況において使用することが可能である。具体的には、Mnkをコードするポリヌクレオチドに補遺的な配列を利用して細胞を形質転換することができる。このように、アンチセンス分子を用いてMnk活性を調節すること、または遺伝子機能を調節することができる。今このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたは大きな断片を、Mnkをコードする配列のコード領域または制御領域に沿ったさまざまな位置から設計することが可能である。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクチニアウィルス、または種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団送達することが可能である。当業者に公知の方法を用いて、Mnkをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに補遺的なアンチセンス分子を発現する組換えベクター構築することが可能である。これらの技術は、Sambrookら(前出)およびAusubelら(前出)の両方の文献に記載されている。Mnkをコードする遺伝子は、ハイレベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクターまたはMnkをコードするその断片を用いて、細胞または組織を形質転換することによって、オフにすることがでる。そのような作成物を用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することが可能である。DNAへの組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、RNA分子が内在性ヌクレアーゼ核酸分解酵素)によって使用不可能になるまで継続してRNA分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって1ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より長く持続することが可能である。

0071

上述したとおり、遺伝子発現の修飾は、アンチセンス分子、例えば、DNA、RNA、またはPNAのような核酸アナログを、Mnkすなわち、プロモーター、エンハンサー、およびイントロンをコードする遺伝子の制御領域に対してデザインすることによって得ることができる。転写開始部位(例えば始動部位から−10〜+10の間)由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん塩基対形成方法を用いて抑制が可能となる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に対して二重らせんが充分に開くような能力を阻害するためである。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩は文献に記載がある(Gee,J.E.らの(1994)In;Huber,B.E.and B.I.Carr,Molecular and Immunologic Approaches,Futura Publishing Co.,Mt.Kisco,N.Y.)。また、アンチセンスは、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、mRNAの翻訳を阻止する目的でデザインすることも可能である。

0072

また、酵素性RNA分子であるリボソームを用いて、RNAの特異的切断を触媒することも可能である。リボザイム作用の機構は、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与する。使用することが可能な実施例には、Mnkをコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する組換え型ハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的RNA標的内の特異性リボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子走査することによって最初に同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む15〜20リボヌクレオチド間の短いRNA配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造の特色に対して評価することが可能となる。候補標的の適合性もまた、リボヌクレアーゼ保護測定法を使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス容易性テストすることにより、評価することが可能である。

0073

エフェクター分子、例えば本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で知られている任意の方法を用いて調製することが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。あるいは、MnkをコードするDNA配列の生体外および生体内における転写によってRN分子を作成することもできる。このようなDNA配列は、T7またはSP6のような好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことが可能である。あるいは、RNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA構成物アンチセンスは、細胞株、細胞、または組織内に導入することができる。RN分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、分子の5′末端および(または)3′末端でのフランキング配列の追加、またはホスホロチオネートの使用、または分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく2′O−メチルが含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、例えばイノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニンシチジングアニンチミン、およびウリジンに類似の修飾態様なども含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子に適用することができる。

0074

Mnkタンパク質の活性は、例えば、前出のTschoppら(2000)によって記載されたような生体外キナーゼアッセイ、または以下に記載したようなその他任意の好適なアッセイ方式によってアッセイできる。このアッセイにおけるMnkの阻害剤としては、前出のTschoppら(2000)、または前出Knaufら(2001)によって記載されたように、CGP57380またはCGP052088のようなスタウロスポリン誘導体を使用することができる。ネガティブコントロールとしては、Mnkに対して不活性であるが、CGP052088と類似の細胞障害性を示す化合物CGP52428、またはその他任意のMnkに対する活性を例外としてキナーゼ阻害活性を備えた化学的実体を使用することができる。その上に、CGP57380の誘導体は、Mnkに対する活性のためにアッセイでき、上述したように代謝疾患の治療、予防、および診断のための物質である。CGP57380の誘導体は、例えば、従来の化学的、物理的および生化学的手段を通した修飾によって作成でき、組み合わせライブラリを産生するするために使用することが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化(amidification)などは、構造上の類似体を産出するために、有向またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。

0075

さらに、本発明は、上述したように、代謝疾患の治療、予防または診断のためのMnkキナーゼ阻害剤または活性化剤の使用法に関するものである。望ましくは、限定するものではないが、Mnkキナーゼ阻害剤はスタウロスポリン誘導体またはピラゾール誘導体とする。ピラゾール誘導体の実施例はEP−A−0 819 129において記載してあり、引用することを以って本明細書の一部となす。CGP57380は最大で30μMまでは細胞障害性を示さないので、望ましくはこの物質を用いてキナーゼ活性、望ましくはMnk2を阻害することが可能であり、上述したように代謝疾患の治療、予防、および診断のための物質として使用することが可能である。

0076

ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が提供されており、生体内、生体外およびex vivoの使用に対して同程度に適している。生体内外交通治療では、ベクターは、患者から採取した幹細胞内に導入し、同一患者自家移植で戻すためにクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法を用いて達成することが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌネコウシウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を含めた、好適な被験体に適用することが可能である。

0077

本発明の追加実施例は、医薬用許容できるキャリアと共に、上述の任意の治療効果のための医薬品組成物の投与に関するものである。このような医薬品組成物は、Mnk、Mnkに対する抗体、および擬態アゴニスト、アンタゴニスト、またはMnkの阻害剤から構成され得る。本組成物は単独で投与することができるが、少なくとも1つの安定化化合物などの他剤と共に投与することもでき、その場合には、限定するものではないが、生理食塩水緩衝生理食塩水デキストロースおよび水などを含めた、任意の消毒した、生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与することが可能である。本組成物は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明で使用した医薬品組成物は、幾つもの経路によって投与することが可能であり、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所下または直腸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。

0078

その活性成分に加えて、これらの医薬品組成物は、医薬用に使用することができる活性化合物の製剤への処理を促進する賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(ペンシルベニアイーストンのMaack Publishing Co.)の最新版を参照。経口投与用の医薬品組成物は、当分野で公知の医薬用に許容できるキャリアを使用して、経口投与に好適な投与量で製剤することができる。このようなキャリアを用いると、患者による摂取のために、医薬品組成物を錠剤丸薬糖衣錠カプセル液剤ゲル剤シロップ剤スラリー、懸濁液、その他に製剤することが可能となる。

0079

本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の様式、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和乳化カプセル化、取り込み、または凍結乾燥プロセスなどの手段によって製造することが可能である。本医薬品成分は、塩として供給することが可能であり、多くの酸と共に形成することができ、例えば、塩酸硫酸酢酸乳酸酒石酸リンゴ酸琥珀酸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。医薬品組成物を調製した後には、適切な容器充填して治療の対象となる適応症状を標識する。Mnkの投与に対する標識には、投与の量、頻度、および方法が明記される。

0080

本発明に好適な医薬品組成物には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の定量は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物の場合には、細胞培養アッセイ、例えば前脂肪細胞の細胞株の細胞培養アッセイおいて、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどの動物モデルにおいてのいずれかで、初めに治療に有効な投与量を推定することができる。また、動物モデルを好適な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することも可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療的に効果的な投薬量は、例えばMnk、その断片、特定の状態を治療するためのMnkの抗体の活性処方成分の量に関連する。治療有効度および毒性は、細胞培養または実験用動物における標準的な調剤手順によって決定することが可能であり、その例としては、ED50(集団の50%において治療に有効な量)およびLD50(集団の50%に対する致死量)などが挙げられる。治療効果と毒性効果の間の投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、投与量の使用元、患者の感受性、および投与の経路によって、この範囲内で変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被験者に関する要因を考慮して、現場医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するように調節する。配慮される要因には、疾患の重症度、被験者の身体全体健康状態、被験者の年齢、体重、および性別食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、3〜4日毎、1週間毎、または2週間毎に1回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約0.1〜100,000マイクログラムと異なり、合計投与量は約1グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者であれば、タンパク質または阻害剤とは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。

0081

別の実施例によれば、Mnkを特異的に結合する抗体は、Mnkの過剰発現または低発現と関連を有することによって特徴付けられる状態または疾患の診断、またはMnk、アゴニストまたは阻害剤で治療を受けている患者を監視するためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療で記載した方法と同様の様式で調製することが可能である。Mnkの診断アッセイには、抗体および標識を利用してヒトの体液、または細胞や組織の抽出物にあるMnkを検出する方法が含まれる。その抗体は、修飾の有無に拘わらず使用することが可能であり、共有結合または非共有結合のいずれかでレポーター分子と結合することによって標識化することが可能である。当分野で周知の種々のレポーター分子を使用することが可能であり、そのいくつかのレポーター分子を上記した。

0082

ELISA、RIA、およびFACSを始めとしたMnkを測定するための種々のプロトコルは当分野では周知であり、改変または異常レベルのMnkの発現を診断する基準を提供する。Mnk発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物から、望ましくはヒトから採取した体液または細胞をMnkに対する抗体と結合させて確定する。標準複合体形成量は、種々の方法によって定量化できるが、測光的な手段を用いることが望ましい。対照サンプルおよび疾患サンプル、例えば生検組織において発現したMnkの量を標準値と比較する。標準値と被験体の値の偏差は、疾患の診断のためのパラメータ樹立する。また、Mnk発現の分析は、当技術分野で周知であり、以下に実施例の項において詳細に記載したアッセイ形式におけるMnk活性の定量によって実施することができる。

0083

本発明の別の実施例によれば、Mnkに特定のポリヌクレオチドを診断のために用いることも可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列アンチセンスRNAおよびDNA分子、およびPNAが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、検体におけるMnkの発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現を検出および定量することが可能である。診断アッセイを用いて、Mnkの不在、存在および過剰発現を区別すること、および治療介入中にMnkレベルの調節を監視することが可能である。

0084

一実施形態によれば、Mnkまたは近縁の分子をコードするゲノム配列を始めとするポリヌクレオチド配列を検出する能力を持つPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションを用いて、Mnkをコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブの特異性は、それが高度に特異的な領域、例えば5′調節領域における独特のヌクレオチド、またはあまり特異的ではない領域、例えば特に3′コーディング領域のいずれから作られたに拘わらず、またそのハイブリダイゼーションまたは増幅(最大、高、中、または低)のストリンジェントの度合に拘わらず、そのプローブがMnk、対立遺伝子、または関連配列をコードする天然の配列のみを同定するかどうかを確定する。また、プローブは、関連する配列の検出に用いることもでき、望ましくは少なくとも50%のMnkをコードする任意の配列からのヌクレオチドが含まれているべきである。対象発明ハイブリダイゼーションプローブは、DNAまたはRNAであっても良く、AF237775、NM_017572.1、NM_003684.2、またはAB000409.1のヌクレオチド配列、またはプロモーター、エンハンサーエレメント、および天然Mnkのイントロンを始めとしたゲノム配列に由来し得る。MnkをコードするDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作製する方法には、Mnk誘導体をコードする核酸配列を、mRNAプローブを作製するためのベクターにクローニングする方法が含まれる。当業者に知られ、市販されている、このようなベクターを用いて、好適なRNAポリメラーゼおよび好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、生体内でRNAプローブを合成することが可能である。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団、例えば32Pまたは35Sのような放射性核種、またはアビジン結合系ビオチン結合系などを介してプローブに結合したアルカリホスファターゼのような酵素標識によって標識することが可能である。

0085

Mnkをコードするポリヌクレオチド配列は、条件の診断、またはMnkの発現に関係する疾患のために使用することができる。そのような状態または疾患の実施例には、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。また、Mnkをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、糖尿病を始めとする膵臓の疾患および障害に対する治療を受けている患者の進歩状況を監視することも可能である。Mnkをコードするポリヌクレオチド配列は、変異Mnkの発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法ノーザン法ドットブロット法またはその他の膜ベースの技術、およびPCR法、またはディップスティック法、ピンELISA法またはチップアッセイにおいて使用することが可能である。このような定量方法または定性方法は当分野で公知である。

0086

特定の実施形態では、Mnkをコードするヌクレオチド配列は、肥満症、糖尿病、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、すい臓の機能障害、動脈硬化症、冠動脈疾患(CAD)、ROS産生に関連する障害、および神経変性疾患を始めとした、種々の代謝疾患および障害の活性化または誘発検出するアッセイにおいて有用であり得る。Mnkをコードするヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後、そのサンプルを洗浄し、そのシグナルを定量化し、標準値と比較する。対照試料に比較した試料において、Mnkをコードするヌクレオチド配列の改変レベルの存在は、関連疾病の存在を示す。また、このような測定法を用いて、動物研究、臨床試験、または個々の患者の治療の監視において、特定の治療上の療法の有効性を評価することも可能である。

0087

Mnkの発現に関連する疾患の診断基準を提供するため、発現に対する正常概要または標準概要を確定する。これは、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトの正常な被験者から抽出した体液または細胞を、Mnkをコードする配列またはその断片と結合させることによって達成し得る。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被験体から得た値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことが可能である。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被験体値との間の偏差を用いて疾患の存在を確定する。ひとたび疾患の存在を確定し、治療プロトコルを開始すると、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し、患者の発現レベルが正常な患者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを評価することが可能である。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日〜数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すことが可能である。

0088

肥満症、糖尿病、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、すい臓の機能障害、動脈硬化症、冠動脈疾患(CAD)を始めとした代謝疾患および障害、ROS産生に関連する障害、および神経変性疾患に関して、個体からの生検組織におけるかなり多量の転写物の存在は、疾病発生の素因を示す可能性があり、また、実際の臨床的症状の出現に先行して疾病を検出する手段を提供する可能性もある。この種のより明確な診断により、医療専門家が予防手段または積極的な早期治療を施し、膵臓の疾病および障害の発達またはさらなる進行を防止することが可能となる。Mnkをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの診断上の追加用途には、PCRの利用が含まれる得る。このようなオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素的に作成するか、または組換えソースから産出することが可能である。オリゴマーは、望ましくは2つのヌクレオチド配列から成り、その1つはセンス方向(5′.fwdarw.3′)を有し、他の1つはアンチセンス方向(3′.rarw.5′)を有し、特定の遺伝子または状況を同定するために、最適化された条件下で用いられる。オリゴマーのネスト化したセット、または縮重オリゴマーの集積である、2つの同一のオリゴマーを、あまりストリンジェントでない条件下で用いて、緊密に関連したDNA配列またはRNA配列の検出あるいは(または)定量化を行なうことが可能である。

0089

Mnkの発現を定量するために用いことができる方法には、放射標識またはビオチンヌクレオチド、調節核酸の相互増幅、および実験結果が補間された標準曲線等が含まれる(Melby,P.C.らの(1993)J.Immunol.Methods,159:235−244;Duplaa,C.らの(1993)Anal.Biochem.212:229−236)。複数試料の定量化速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、そして分光光度法または非色応答が迅速な定量に関与するような状態にあるELSA形態のアッセイを実行することによって加速することが可能である。

0090

また、本発明の別の実施例によれば、核酸Mnk配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするために有用であるハイブリダイゼーションプローブ作成することも可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または公知の方法を用いて染色体の特定領域にマッピングすることが可能である。このような技術には、FISH、FACS、または酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌P1構築または単一染色体cDNAライブラリのような人工色構造があり、Price,C.M.(1993)Blood Rev.7:127−134,およびTrask,B.J.(1991)TrendsGenet.7:149−154.FISH(Vermaらによって記述されているとおり、(1988)Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques,Pergamon Press,New York,N.Y.)などの文献で論評されているように、他の物理的な染色体のマッピング技術および遺伝マップデータと相関することが可能である。遺伝マップデータの例は、1994 Genome Issue of Science(265:1981f)に見出すことができる。物理的染色体マップ上のMnkをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子の疾病に関連するDNAの領域を画定するのに役立ち得る。

0091

本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。確定した染色体マーカーを用いた染色体標本および結合分析などの物理的マッピング技術の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝マップを拡張することが可能である。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これは、位置クローニングまたはその他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報を提供する。一旦疾患または症候群が、例えばAT〜11q22−23(Gatti,R.A.らの(1988) Nature 336:577−580)などの特定ゲノム領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがされると、その領域に対してマッピングする全ての配列は、さらなる究明用の関連遺伝子または調節遺伝子に相当することになる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することが可能である。

0092

本発明の別の実施例によれば、、本発明のタンパク質、それらの触媒作用断片または免疫抗原断片またはそのオリゴペプチド、生体外モデル、遺伝子操作を受けた細胞または動物を用いて、あらゆる薬剤スクリーニング技術を利用して化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。1つ以上の本発明のタンパク質の作用に結合し、その作用を調節するか、または模倣するエフェクター、例えば受容体、酵素、タンパク質、ペプチド、リガンドまたは基質を同定することはできるであろう。このようなスクリーニングで用いたタンパク質またはその断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内にあっても構わない。また、本発明のタンパク質とテストされる薬剤間の結合複合物の形成を測定することも可能である。また、薬剤が直接的または間接的に本発明のタンパク質の活性に影響を及ぼすこともできる。標的機構には、例えば、キナーゼ活性、特にタンパク質またはペプチドのリン酸化が含まれ、最も望ましくは、限定するものではないが、セリンおよびトレオニン残基が含まれる。別の標的機構には、リン酸化、脱リン酸、アセチル化、アルキル化、ユビキチン結合、蛋白分解性処理の細胞内局在性または劣化のような翻訳後の修飾によるMnk機能(作用)の調節が含まれ得る。さらに別の標的機構には、例えば、限定するものではないが、ホスホリパーゼAエストロゲン受容体、キナーゼ因子または翻訳因子のようなタンパク質結合パートナーを備えたMnkの相互作用が含まれ得る。特に興味深いのは、哺乳動物の細胞に対して低毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。本明細書中で使用した用語「薬剤」は、1つ以上の本発明のタンパク質の生理機能を改変または模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質または医薬品である。候補薬剤は、典型的には有機分子であり、望ましくは50〜約2,500ドルトンの分子量を有する小有機化合物であるが、幾多の化学的クラスを包含する。候補薬剤には、タンパク質、特に水素結合との構造上の相互作用に必要な機能グループが含まれ、および典型的には少なくともアミンカルボニルヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも2つの機能化グループが含まれる。候補薬剤には多くの場合、炭素環式構造または複素環式構造、および(または)1つ以上の上記機能グループと置換された芳香族構造またはポリ芳香族構造が包含される。

0093

候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイドプリンプリジン(pyrimidies)、核酸および誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせを含んだ生体分子間に見出される。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含んださまざまなソースから取得する。例えば、任意に抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を始めとして、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および直接合成のための多くの手段が利用可能である。或いは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に産生することができる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通して、天然または合成的に産生したライブラリおよび化合物は容易に修飾でき、それらを用いて組み合わせライブラリを産生することが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化(amidification)などのような公知の薬剤は、構造上の類似体を産出するために、有向またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、1つ以上の分子が標識に結合することが可能であり、その標識は直接的または間接的に検出可能な信号を提供する。

0094

使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、公開PCT出願番号WO84/03564に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法においては、本発明のタンパク質に対して適用されたように、多数の異なる小さな試験用化合物、例えばアプタマー、ペプチド、低分子量化合物などをプラスチックピンまたは他表面などの固体基質上で提供または合成する。試験用化合物は、タンパク質またはその断片と反応させ、洗浄した。次に、結合したタンパク質を、当分野で周知の方法で検出した。精製したタンパク質は、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上で直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。別の実施例によれば、タンパク質と結合可能な中和抗体がタンパク質と結合するため試験用化合物と特に競合し、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では抗体を用いて、タンパク質と1つ以上の抗原決定因子を共有する全てのペプチドの存在を検出することができる。

0095

また、候補薬剤は、さらに以下に記載したように修飾を含むかまたは含まないタンパク質またはペプチド、または他のキナーゼ基質が、本発明のタンパク質またはタンパク質断片によってリン酸化されるキナーゼアッセイにおいて見出すことが可能である。治療薬候補は、本発明のタンパク質の酵素性活性を増加または減少する能力によって同定することが可能である。キナーゼ活性は、リン酸化に起因する基質の化学的、物理的または免疫学的特質の変化によって検出することが可能である。

0096

一実施例としては、放射性同位体的に標識したリン酸基を適切なドナー分子から本発明のポリペプチドによって触媒したキナーゼ基質への転移が挙げられるであろう。基質のリン酸化に継いで、当技術分野で周知の技術を用いて基質オートラジオグラフィーを検出することが可能である。

0097

さらに別の実施例によれば、そのリン酸化に起因する基質の質量変化は、質量分析技術によって検出することが可能である。

0098

また、基質のリン酸化状態非リン酸化状態とを区別する試薬を有する基質のリン酸化状態を検出することもできる。そのような試薬は、基質のリン酸化形態とび非リン酸化形態に対して異なる親和性を有することによって、またはリン酸基に対して特定の親和性を有することによって作用することが可能である。そのような試薬は、限定するものではないが、抗体または抗体誘導体、組換え(型)の抗体様構造、タンパク質、核酸、分子を含んだ複合型の金属イオン、アニオン交換クロマトグラフィーマトリックス、親和性クロマトグラフィーマトリックスまたはその他任意の基質に対してリン酸化依存選択性を有する分子であり得る。

0099

そのような試薬は、酵素性反応中またはその後に固形担体上に固定したキナーゼ基質を検出するために利用することができる。試薬が抗体である場合、その基質に対する結合は、HarlowおよびLane、1998、Antibodies、CSH Lab Press、NY.において記載されているように、種々の技術によって検出することができる。試薬分子が抗体でない場合には、その結合はその化学的、物理的または免疫学的な特質が内生的にその結合に関連することによって、またはその結合に対して人工的に操作することによって検出することが可能である。

0100

さらに別の実施例によれば、キナーゼ基質は、基質のリン酸化状態の分析に好適な信号を作成するために、結合または検出を促進する目的で設計された特色または内因性の特色を有することが可能である。これらの特色は、限定するものではないが、ビオチン分子またはその誘導体、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ部分、6以上の連続したヒスチジン残基の1部分、アミノ酸配列またはエピトープ(抗原決定基)タグとしての機能(作用)に対するハプテン、蛍光色素、酵素または酵素断片であり得る。キナーゼ基質は、これらまたは他の特色に対して、立体障害を回避するために分子のスペーサアームを用いて連鎖することが可能である。

0101

一実施例によれば、キナーゼ基質は蛍光色素を用いて標識することが可能である。溶液中における標識基質に対する試薬の結合の後に、文献(例えば、Deshpande、S.らの(1999)Prog.Biomed.Optics(SPIE)3603:261;Parker、G.J.らの(2000)J.Biomol.Screen.5:77−88;Wu、P.らの(1997)Anal.Biochem.249:29−36を参照)において記載されているように蛍光偏光の技術を行うことが可能である。。この実施例の変形例によれば、蛍光性トレーサー分子は、分析物がキナーゼ活性を検出するために、当業者であれば間接蛍光偏光として公知の技術によって基質と競合することが可能である。

0102

本発明のタンパク質をコードする核酸を用いて遺伝子組換え細胞株および動物を作成することができる。これらの遺伝子組換え動物は、本発明生体外のタンパク質の機能および調節の研究において有用である。遺伝子組換え動物、特に哺乳動物の遺伝子組換え動物は、ヒトに共通する多くの発生プロセスおよび細胞プロセスの調査のためのモデルシステムとして役立つことができる。遺伝子組換え動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の正常な遺伝子座が突然変異される場合、胚幹細胞における相同性組換を通して作製することができる。別法として、タンパク質をコードする核酸作成物卵母細胞に注入し、ゲノムにランダムに統合する。また、本発明の遺伝子またはその変異体を、通常には発現されないか、または異常発生するような場所に発現することも可能であろう。さらには、アンチセンス分子を発現する特定の作成物のような本発明の遺伝子の変異体、または本発明のタンパク質の発現を阻止または変質する優性阻害突然変異の発現はゲノムにランダムに統合し得る。lac Zまたはルシフェラーゼのような検出可能なマーカーを、本発明の遺伝子の発現の上方制御が表現型における容易に検出可能な変化を結果としてもたらす本発明の遺伝子の遺伝子座に導入することが可能である。安定した統合のベクターには、プラスミド、レトロウィルスおよびその他の動物ウィルス、酵母菌人工染色体(YACs)などが含まれる。相同性組換えDNA構成物には、所望の遺伝的な修飾を有する本発明の遺伝子の一部が少なくとも含まれており、標的遺伝子座に対する相同性領域が含まれる。好都合なことには、ポジティブ選択およびネガティブ選択用のマーカーが含まれている。ランダム統合のためのDNA作成物には、組換えを仲介するための相同性の領域が含まれる必要はない。ランダム統合のためのDNA作成物は、本発明のタンパク質、調節元素(プロモーター)、イントロンおよびポリアデニル化信号をコードする核酸から成る。相同性組換えを通して標的遺伝子修飾を有する細胞を作成する方法は本分野で周知である。胚幹ES)細胞に関しては、ES細胞株を用いるか、または胚細胞を宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどから新たに取得することが可能である。そのような細胞は適切な線維芽細胞支持細胞層上で増殖し、そして白血病抑制因子(LIF)の存在下で増殖する。ES細胞または胚細胞を形質移入してから、遺伝子組換え動物を産生するために用いることができる。形質移入後、ES細胞を適切な培地の支持細胞層にプレーティングする。その構成物を含んでいる細胞は、選択培地を用いることによって選択することが可能である。コロニーを十分な時間をかけて増殖した後、コロニーを摘出し、相同性組換えの発生率を分析する。陽性反応を示すコロニーは、操作および桑実胚凝集に用いることが可能である。つまり、桑実胚を4〜6週間目過排卵メスから取得し、透明帯を除去し、桑実胚を組織培養皿の小さなくぼみに置く。ES細胞をトリプシン処理し、修飾細胞を桑実胚の近くのそのくぼみに置く。次の日に、凝集体偽妊娠のメスの子宮角に移す。次に、メスに出産させる。キメラの子孫は、外殻の変化によって容易に検出することができ、引き続いて突然変異の次世代への伝達のためにスクリーニングする(F1−世代)。F1−世代の子孫を修飾遺伝子の存在に対してスクリーニングし、修飾を有するオスおよびメスを交尾させ、ホモ接合性の子孫を産生する。その遺伝子改変が成長の過程で死亡率の原因となる場合には、組織または器官は、同種間移植または類遺伝子性移植、または生体外培養用として維持することができる。遺伝子組換え動物は、実験動物家畜など、例えば、マウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ウシ、ブタ、のような任意の非ヒト哺乳動物でよい。遺伝子組換え動物は、機能的研究、薬物[スクリーニング、およびその他の用途において使用され、本発明の生体内のタンパク質の機能および調節の試験おいて有用である。

0103

また、最終的に、本発明は少なくとも下記の1つから成るキットに関するものである。
(a) Mnk2(Mnk2aまたはMnk2b)またはMnk1核酸分子またはその断片;
(b) (a)の核酸を含むベクター;
(c) (a)の核酸または(b)のベクターを含む宿主細胞;
(d) (a)の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e) (a)の核酸によってコードされた融合ポリペプチド
(f) (a)の核酸または(d)または(e)のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(g) (a)の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド

0104

本キットは、診断用または治療用に使用することが可能であり、または上記に述べたようにアプリケーションをスクリーニングするため使用すること
が可能である。さらに、キットには、取扱説明書が含まれることが可能である。

0105

各図は下記を示す:
図1は、Pベクター(EP対照群と比較して)のホモ接合性生存結合に起因する、EP(3)3333およびEP(3)3576ハエの中性脂肪含有量の増加を示す。ここに示したのは、中性脂肪の突然変異体タンパク質含有量に対する比率をパーセント(%)で表したものである)。

0106

図2は変異型LK6遺伝子座の分子構造を示す。黒色点線は、EP(3)3333およびEP(3)3576の統合部位を含むcDNAの位置(染色体3R上の位置7544500から7559500まで)を示す。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは下部の2行目にバーとして示した。遺伝子CG17342(GadFly、Lk6)の予測エキソンは濃灰色のバーとして、およびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。Lk6は、GadFly配列分析プログラムにより、GadFlyアクセッション番号CG17342として予測される遺伝子に対してコードする。

0107

図3はMnkタンパク質の比較を示す。

0108

図3Aは、異なる種、ヒトMnk2(Genbankアクセッション番号AF237775と同一)を参照するhXP_030637、ヒトMnk1(Genbankアクセッション番号AB000409.1と同一)を参照するhXP_001600、およびGadFlyアクセッション番号CG17342を備えたショウジョウバエLk6遺伝子でコードしたタンパク質を参照するAAB18789からのMnkタンパク質の比較(CLUSTAL X 1.8)を示す。

0109

アライメントにおけるギャップは、「−」として表す。

0110

図3Bは、ヒトMnk2タンパク質の比較(CLUSTAL W 1.82)を示す。Genbankアクセッション番号XM_030637.3は、Genbankアクセッション番号AF237775と同一であり、およびGenbankアクセッション番号NM_017572.1は異なるヒトMnk2タンパク質の変異型を示す。

0111

図3Cは、ヒトMnk1タンパク質の比較(CLUSTAL W 1.82)を示す。Genbankアクセッション番号XM_001600.2はGenbankアクセッション番号AB000409.1と同一であり、およびGenbankアクセッション番号NM_003684.2はMnk1タンパク質の異なる変異型を示す。

0112

図3D.ヒトMAPキナーゼ結合キナーゼ(Mnk)2a(配列識別番号1;GenBankアクセッション番号AF237775、GenBankアクセッション番号XM_030637と同一)の核酸配列
図3E.ヒトMAPキナーゼ結合キナーゼ(Mnk)2a(配列識別番号2;GenBankアクセッション番号AF237775、GenBankアクセッション番号XM_030637と同一)のアミノ酸配列
図3F.ヒトMAPキナーゼ結合キナーゼ(Mnk)2b(配列識別番号3;GenBankアクセッション番号AF237776またはNM_017572)の核酸配列
図3G.ヒトMAPキナーゼ結合キナーゼ(Mnk)2b(配列識別番号4;GenBankアクセッション番号AF237776またはNM_017572)のアミノ酸配列
図3H.ヒトMAPキナーゼ結合キナーゼ(Mnk)1(配列識別番号5;GenBankアクセッション番号AB000409またはNM_003684またはXM_001600)の核酸配列
図3I.ヒトMAPキナーゼ結合キナーゼ(Mnk)1(配列識別番号6;GenBankアクセッション番号AB000409またはNM_003684またはXM_001600)のアミノ酸配列
図4は、脱共役タンパク質活性を調節する因子を発見するために使用した、脱共役タンパク質(dUCPy)の過剰発現によって誘導した眼表現型を示す。写真の左部に示したハエによれば、dUCPyは通常のレベルで発現される。写真の右部に示したハエによれば、dUCPyは過剰発現され、および眼は低下される。

0113

図5はMnk2遺伝子発現を示す。

0114

図5A野生型マウス組織におけるMnk2のリアルタイムPCR分析を示す。

0115

図5Bは絶食および肥満した(ob/ob)マウスにおけるマウスMnk2遺伝子の発現を示す。

0116

図5Cは絶食および肥満したマウスにおけるマウスMnk2遺伝子の発現を示す。

0117

図5Dは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3−L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のMnk2発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。

0118

図5Eは、哺乳動物の線維芽細胞3T3−F442A細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のMnk2発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。

0119

図5Fは、哺乳動物の線維芽細胞TA1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のMnk2発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。

0120

図6はマウスMnk1遺伝子の発現を示す。

0121

図6Aは、野生型マウス組織におけるMnk1のリアルタイムPCR分析を示す。

0122

図6Bは、異なるマウスモデルにおけるMnk1発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。

0123

図6Cは、哺乳動物の線維芽細胞3T3−L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のMnk1発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。

0124

図6Dは、哺乳動物の線維芽細胞3T3−F442A細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のMnk1発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。

0125

図6Eは、哺乳動物の線維芽細胞TA1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のMnk1発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。

0126

図7はUCPy配列を示す。

0127

図7Aは、ショウジョウバエUCPyタンパク質(配列認識番号7)をコードする核酸配列を示す。オープンリーディング・フレームには下線を引いた。

0128

図7Bは、ショウジョウバエUCPyタンパク質(配列認識番号8)をコードするアミノ酸配列を示す。

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