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技術 生理活性物、それを含むアレルギー抑制活性剤、免疫調整剤、飲食品、サプリメントおよび医薬品

出願人 中野産業株式会社
発明者 菅原卓也
出願日 2009年10月2日 (10年4ヶ月経過) 出願番号 2009-230906
公開日 2010年5月27日 (9年8ヶ月経過) 公開番号 2010-116391
状態 未査定
技術分野 非アルコール性飲料 食品の着色及び栄養改善 植物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 果物加工 外皮粉 穀物加工食品 界面活性剤液 生理活性物 固形画分 水含有溶媒 野菜加工食品
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (8)

課題

免疫疾患等の疾病治療、予防に有効で安全なソルガム抽出物を含む生理活性物を提供する。

解決手段

ホワイトソルガムを、有機溶媒を含む抽出溶媒に浸漬して得られた抽出物は、図1に示すように、IgE産生抑制活性を有する。前記有機溶媒としては、例えば、メタノールクロロホルムとの混合溶媒があげられる。前記ソルガム抽出物は、この他に、インターフェロンγ産生促進活性脱顆粒抑制活性アレルギー抑制活性免疫調整活性を有する。前記ソルガム抽出物を含む本発明の生理活性物は、飲食品サプリメント医薬品等に適用可能である。

概要

背景

ソルガムは、イネ科モロコシ属に属し、アメリカインド、中国、メキシコ、ナイジェリア等の国々で生産量が多い穀物種である。ソルガムは、グレイン・ソルガム、スイート・ソルガム、ブルーム・ソルガムおよびグラス・ソルガムの4種類に大別される。最近、小麦アレルギー対策のための穀物として、グルテンを含まない品種ホワイト・ソルガムが注目されている。ホワイト・ソルガムは、グレイン・ソルガムの一種であり、グルテンを含まないという特性の他に、必須アミノ酸を含み、ミネラルビタミンB群食物繊維および不飽和脂肪酸豊富であるという特性を有する。このような特性に鑑み、ホワイト・ソルガムを利用した食品の開発が行われている。ホワイト・ソルガムを利用した食品としては、例えば、パフスナック菓子(特許文献1)、麺類(特許文献2)、発泡性飲料(特許文献3)およびシロップ(特許文献4)等がある。

従来のホワイト・ソルガムの利用方法は、その栄養特性に着目したものが多かったが、ホワイト・ソルガムの性能を十分に引き出す技術が開発されたとはいえない。一方、免疫疾患等の疾病において、安全で有効な医薬品、食品の開発が求められている。このような背景から、近年、水含有溶媒によるソルガム抽出物について、免疫疾患等の疾病に対する有効性が研究されている(特許文献5)。しかしながら、ホワイト・ソルガムを含む各種ソルガムについては、さらに、その性能を引き出す技術の開発が期待されている。

概要

免疫疾患等の疾病の治療、予防に有効で安全なソルガム抽出物を含む生理活性物を提供する。ホワイト・ソルガムを、有機溶媒を含む抽出溶媒に浸漬して得られた抽出物は、に示すように、IgE産生抑制活性を有する。前記有機溶媒としては、例えば、メタノールクロロホルムとの混合溶媒があげられる。前記ソルガム抽出物は、この他に、インターフェロンγ産生促進活性脱顆粒抑制活性アレルギー抑制活性免疫調整活性を有する。前記ソルガム抽出物を含む本発明の生理活性物は、飲食品サプリメント、医薬品等に適用可能である。

目的

本発明の目的は、免疫疾患等の疾病の治療、予防に有効で安全なソルガム抽出物を含む生理活性物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

ソルガム抽出物を含む生理活性物であって、前記ソルガム抽出物が、ソルガムの一部または全部を、有機溶媒を含む抽出溶媒で抽出した抽出物であることを特徴とする生理活性物。

請求項2

前記抽出溶媒が、アルコールヘキサン酢酸エチルおよびクロロホルムからなる群から選択された少なくとも一つの有機溶媒を含む、請求項1記載の生理活性物。

請求項3

前記アルコールが、メタノールエタノールプロパノールおよびブタノールからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項2記載の生理活性物。

請求項4

前記抽出溶媒が、メタノール、エタノール、ヘキサンおよびクロロホルムからなる群から選択された少なくとも一つの有機溶媒を含む、請求項1記載の生理活性物。

請求項5

前記抽出溶媒が、少なくともメタノールとクロロホルムとを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の生理活性物。

請求項6

前記抽出溶媒におけるメタノール(X)とクロロホルム(Y)との含有割合(X:Y)が、1:1〜1:5の範囲である、請求項5記載の生理活性物。

請求項7

前記ソルガムが、ホワイト・ソルガムである、請求項1から6のいずれか一項に記載の生理活性物。

請求項8

前記ソルガムの一部が、外皮である、請求項1から7のいずれか一項に記載の生理活性物。

請求項9

請求項1から8のいずれか一項に記載の生理活性物を含むアレルギー抑制活性剤

請求項10

前記生理活性物が、ソルガム外皮の抽出物を含む、請求項9記載のアレルギー抑制活性剤。

請求項11

前記アレルギー抑制活性が、IgE産生抑制活性、IFN−γ産生の促進活性および脱顆粒抑制活性からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項9または10記載のアレルギー抑制活性剤。

請求項12

前記脱顆粒抑制活性が、好塩基球の脱顆粒抑制活性である請求項11記載のアレルギー抑制活性剤。

請求項13

請求項1から8のいずれか一項に記載の生理活性物を含む免疫調整剤

請求項14

前記生理活性物が、ソルガム外皮の抽出物を含む、請求項13記載の免疫調整剤。

請求項15

前記免疫調整活性が、IgE産生の抑制活性、IFN−γ産生の促進活性および脱顆粒抑制活性からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項13または14記載の免疫調整剤。

請求項16

前記脱顆粒抑制活性が、好塩基球の脱顆粒抑制活性である請求項15記載の免疫調整剤。

請求項17

請求項1から8のいずれか一項に記載の生理活性物、請求項9から12のいずれか一項に記載のアレルギー抑制活性剤、および、請求項13から16のいずれか一項に記載の免疫調整剤からなる群から選択された少なくとも一つを含む飲食品

請求項18

請求項1から8のいずれか一項に記載の生理活性物、請求項9から12のいずれか一項に記載のアレルギー抑制活性剤、および、請求項13から16のいずれか一項に記載の免疫調整剤からなる群から選択された少なくとも一つを含むサプリメント

請求項19

請求項1から8のいずれか一項に記載の生理活性物、請求項9から12のいずれか一項に記載のアレルギー抑制活性剤、および、請求項13から16のいずれか一項に記載の免疫調整剤からなる群から選択された少なくとも一つを含む医薬品。

技術分野

0001

本発明は、ソルガム抽出物を含む生理活性物、それを含むアレルギー抑制活性剤免疫調整剤飲食品サプリメントおよび医薬品に関する。

背景技術

0002

ソルガムは、イネ科モロコシ属に属し、アメリカインド、中国、メキシコ、ナイジェリア等の国々で生産量が多い穀物種である。ソルガムは、グレイン・ソルガム、スイート・ソルガム、ブルーム・ソルガムおよびグラス・ソルガムの4種類に大別される。最近、小麦アレルギー対策のための穀物として、グルテンを含まない品種ホワイト・ソルガムが注目されている。ホワイト・ソルガムは、グレイン・ソルガムの一種であり、グルテンを含まないという特性の他に、必須アミノ酸を含み、ミネラルビタミンB群食物繊維および不飽和脂肪酸豊富であるという特性を有する。このような特性に鑑み、ホワイト・ソルガムを利用した食品の開発が行われている。ホワイト・ソルガムを利用した食品としては、例えば、パフスナック菓子(特許文献1)、麺類(特許文献2)、発泡性飲料(特許文献3)およびシロップ(特許文献4)等がある。

0003

従来のホワイト・ソルガムの利用方法は、その栄養特性に着目したものが多かったが、ホワイト・ソルガムの性能を十分に引き出す技術が開発されたとはいえない。一方、免疫疾患等の疾病において、安全で有効な医薬品、食品の開発が求められている。このような背景から、近年、水含有溶媒によるソルガム抽出物について、免疫疾患等の疾病に対する有効性が研究されている(特許文献5)。しかしながら、ホワイト・ソルガムを含む各種ソルガムについては、さらに、その性能を引き出す技術の開発が期待されている。

先行技術

0004

特開2004−135530号公報
特開2004−337095号公報
特開2005−40045号公報
特開2005−323555号公報
特開2007−254338号公報

発明が解決しようとする課題

0005

そこで、本発明の目的は、免疫疾患等の疾病の治療、予防に有効で安全なソルガム抽出物を含む生理活性物を提供することである。

課題を解決するための手段

0006

前記目的を達成するために、本発明の生理活性物は、ソルガム抽出物を含む生理活性物であって、前記ソルガム抽出物が、ソルガムの一部または全部を、有機溶媒を含む抽出溶媒で抽出した抽出物であることを特徴とする。

発明の効果

0007

本発明の生理活性物は、有機溶媒を含む抽出溶媒によるソルガム抽出物を含むことによって、例えば、IgEの産生抑制活性インターフェロンγ(IFN−γ)の産生促進活性脱顆粒抑制活性アレルギー抑制活性または免疫調整活性を有する。また、ソルガムは、長年食品として利用されているため、その安全性にも優れる。このため、本発明の生理活性物は、例えば、アレルギー抑制活性剤、免疫調整剤、飲食品、サプリメント、医薬品等に適用でき、免疫疾患の予防や改善に有効である。

図面の簡単な説明

0008

図1は、本発明の実施例1および2の生理活性物について、IgE産生ヒト骨髄腫細胞株におけるIgE産生抑制効果を示すグラフである。
図2は、本発明の実施例2の生理活性物について、熱安定性を示すグラフである。
図3は、本発明の実施例2の生理活性物について、抗体産生に対する効果を示すグラフであり、(A)は、血中IgE量への効果を示すグラフであり。(B)は、血中IgG量への効果を示すグラフであり、(C)は、血中IgA量への効果を示すグラフであり、(D)は、血中IgM量への効果を示すグラフである。
図4は、本発明の実施例2の生理活性物について、血中OVA特異的抗体の産生に対する効果を示すグラフであり、(A)は、血中OVA特異的IgE量への効果を示すグラフであり、(B)は、血中OVA特異的IgG量への効果を示すグラフであり、血中OVA特異的IgA量への効果を示すグラフである。
図5は、本発明の実施例2の生理活性物について、IFN−γ産生に対する効果を示すグラフであり、(A)は、血中IFN−γ量への効果を示すグラフであり、(B)は、脾臓リンパ球のIFN−γ産生量への効果を示すグラフである。
図6は、本発明の実施例2の生理活性物について、RBL−2H3細胞の脱顆粒抑制活性を示すグラフである。
図7は、比較例1および本発明の実施例1、3および4の生理活性物について、IgE産生ヒト骨髄腫細胞株におけるIgE産生抑制効果を示すグラフである。

0009

本発明の生理活性物は、前述のように、ソルガム抽出物を含む生理活性物であって、前記ソルガム抽出物が、ソルガムの一部または全部を、有機溶媒を含む抽出溶媒で抽出した抽出物であることを特徴とする。

0010

本発明において、前記ソルガムは、特に制限されず、ホワイト・ソルガム、グレイン・ソルガム、スイート・ソルガム、ブルーム・ソルガム、グラス・ソルガム等があげられ、中でもホワイト・ソルガムが好ましい。

0011

本発明において、前記ソルガム抽出物の調製に使用するソルガムは、例えば、ソルガム全体でもよいし、ソルガムの一部でもよい。前記ソルガムの一部とは、例えば、ふすま外皮内皮、ふすまを除いた部分、外皮を除いた部分、内皮を除いた部分等があげられる。

0012

前記抽出溶媒は、前記有機溶媒を含んでいればよい。前記抽出溶媒は、例えば、水系溶媒含有量が低いことが好ましく、具体的には、前記水系溶媒の含有量は、例えば、20体積%以下であり、好ましくは、10体積%以下であり、好ましくは検出限界以下であり、特に好ましくは有機溶媒のみからなることが好ましい。前記水系溶媒としては、例えば、水、リン酸緩衝液等の各種緩衝液があげられる。

0013

前記有機溶媒としては、例えば、アルコールヘキサン酢酸エチルクロロホルム等があげられる。前記アルコールとしては、特に制限されないが、例えば、メタノールエタノールプロパノールブタノール等があげられ、好ましくは、エタノール、メタノールであり、より好ましくはエタノールである。前記抽出溶媒において、前記有機溶媒は一種類でもよいし、二種類以上でもよい。また、前記抽出溶媒がアルコールを含有する場合、アルコールは一種類でもよいし二種類以上でもよい。

0014

前記抽出溶媒が、二種類以上の有機溶媒を含む場合、有機溶媒の組み合わせは特に制限されないが、例えば、アルコールとクロロホルムとの組み合わせが好ましく、より好ましくは、メタノールとクロロホルムとの組み合わせである。

0015

前記抽出溶媒におけるアルコールの添加割合は、特に制限されないが、例えば、50v/v%以下の範囲であり、好ましくは、20〜50v/v%の範囲である。また、前記抽出溶媒における添加溶媒の割合は、特に制限されないが、例えば、80v/v%以下の範囲であり、好ましくは、50〜80v/v%の範囲である。前記抽出溶媒において、前記アルコール(X)と前記添加溶媒(Y)との添加割合(X:Y)は、特に制限されないが、1:1〜1:5の範囲であり、好ましくは1:1〜1:2の範囲である。具体例として、メタノールとクロロホルムとの添加割合も、例えば、同様の範囲である。

0016

前記ソルガム抽出物は、例えば、前記抽出溶媒を用いて製造することができる。具体的には、例えば、ソルガムの全部または一部(ソルガム原料ともいう)を前記抽出溶媒に浸漬することで調製できる。前記抽出溶媒に対するソルガムの添加割合は、特に制限されないが、例えば、抽出溶媒100mLに対して、ソルガム原料100g以下の範囲が好ましく、より好ましくは20〜50gの範囲である。抽出条件は、特に制限されないが、処理温度は、例えば、20〜40℃の範囲が好ましく、より好ましくは25〜30℃の範囲であり、処理時間は、例えば、2〜72時間の範囲が好ましく、より好ましくは15〜30時間の範囲である。抽出は、ソルガム原料を浸漬した前記抽出溶媒を撹拌することが好ましい。

0017

抽出処理後、前記ソルガム原料を浸漬した前記抽出溶媒を、そのままソルガム抽出物として使用してもよいが、例えば、遠心やろ過等の分離処理によって、前記抽出溶媒から固形画分不溶性画分)を除去し、液体画分溶性画分)をソルガム抽出物として回収することが好ましい。また、前記ソルガム抽出物は、例えば、さらに、濃縮処理希釈処理脱色処理脱臭処理加熱処理酵素処理等の処理を施してもよい。

0018

つぎに、本発明のアレルギー抑制活性剤は、本発明の生理活性物を含むことを特徴とする。前記生理活性物は、前述のソルガム抽出物を含んでいればよいが、例えば、ソルガム外皮の抽出物を含むことが好ましい。

0019

また、前記アレルギー抑制活性は、例えば、IgE(IgE抗体)の産生抑制活性である。前記生理活性物中の前記IgE産生抑制因子は、例えば、40〜60℃の温度での加熱処理でも完全に失活しない、脂質が関与する非タンパク質物質である。また、前記アレルギー抑制活性は、例えば、インターフェロンγ(IFN−γ)の産生促進活性である。さらに、前記アレルギー抑制活性は、例えば、脱顆粒抑制活性であり、具体的には、顆粒産生細胞の脱顆粒抑制活性である。前記顆粒産生細胞としては、特に制限されないが、例えば、好塩基球好酸球好中球単球マスト細胞腸管クロム親和性様細胞ECL細胞)、ヒスタミン神経細胞等があげられる。前記顆粒に含まれる物質としては、特に制限されないが、例えば、ヒスタミン、キマーゼヘパリン走化性因子プロスタグランジンロイコトリエン等のアレルギーに関与する物質があげられる。

0020

アレルギー症状は、例えば、好塩基球や肥満細胞の細胞表面上に存在する免疫グロブリン(IgE)のレセプターへの結合により誘起される脱顆粒が原因で、引き起こされることが知られている。また、B細胞によるIgE産生は、例えば、IFN−γにより抑制されることが知られている。本発明の生理活性物は、IFN−γの産生を促進し、IgEの産生を抑制し、または脱顆粒を抑制することから、アレルギー抑制活性剤として使用できる。

0021

本発明の免疫調整剤は、本発明の生理活性物を含むことを特徴とする。本発明の免疫調整剤における免疫調整活性としては、例えば、IgEの産生抑制活性、IFN−γの産生促進活性、脱顆粒抑制活性等があげられる。前記脱顆粒抑制活性は、具体的には、顆粒産生細胞の脱顆粒抑制活性である。前記顆粒産生細胞としては、特に制限されないが、例えば、前述の細胞等があげられる。前記顆粒に含まれる物質としては、特に制限されないが、例えば、前述のアレルギーに関与する物質があげられる。

0022

免疫疾患の発症は、一般に、1型ヘルパーT細胞(Th1細胞)と2型ヘルパーT細胞(Th2細胞)とのバランス異常に密接に関連することが知られている。例えば、アレルギーの発症において重要な役割を担う免疫グロブリンE(IgE)の産生は、つぎのようなメカニズムで調節される。すなわち、Th2細胞が分泌したサイトカインは、B細胞に作用し、IgE産生の促進に働く。その一方で、Th1細胞の分泌するIFN−γは、Th2細胞の働きを抑える作用を有し、IgE産生を抑制する。このように、Th1細胞とTh2細胞とが、互いに作用することにより、IgE産生が調節されている。そして、免疫疾患は、Th2細胞の機能亢進により、このTh1細胞とTh2細胞とのバランス(いわゆる、Th1/Th2バランス)が崩れた状態と考えられている。本発明の生理活性物は、IgEの産生を抑制し且つIFN−γの産生を促進することから、前記Th1/Th2バランスを調整できるため、免疫調整剤として使用できる。

0023

本発明の飲食品は、本発明の生理活性物、本発明のアレルギー抑制活性剤、および、本発明の免疫調整剤からなる群から選択される少なくとも一つを含むことを特徴とする。本発明において、飲食品とは、例えば、飲料、食品を含み、前記食品とは、例えば、一般食品、保健機能食品を含む。前記一般食品としては、特に限定されないが、例えば、穀物加工食品野菜加工食品果物加工食品、食肉加工食品水産物加工食品乳製品、健康食品等があげられる。また、前記保健機能食品は、一般に機能性食品とも称される。前記保健機能食品としては、例えば、特定保健用食品栄養機能食品等があげられる。本発明の飲食品は、例えば、さらに、種々の食品素材助剤安定化剤等を含んでもよい。

0024

本発明のサプリメントは、本発明の生理活性物、本発明のアレルギー抑制活性剤、および、本発明の免疫調整剤からなる群から選択される少なくとも一つを含むことを特徴とする。本発明において、前記サプリメントとは、前述の保健機能食品を含む。前記サプリメントの剤形としては、特に制限されないが、例えば、散剤細粒剤顆粒剤錠剤被覆錠剤カプセル剤トローチ剤液剤等があげられる。また、前記サプリメントは、例えば、さらに、賦形剤結合剤滑沢剤崩壊剤吸収促進剤乳化剤、安定化剤、防腐剤等の各種添加剤等を含んでいてもよい。

0025

本発明の医薬品は、本発明の生理活性物、本発明のアレルギー抑制活性剤、および、本発明の免疫調整剤からなる群から選択される少なくとも一つを含むことを特徴とする。本発明において、前記医薬品とは、例えば、医薬部外品も含む。前記医薬品の剤形としては、特に制限されないが、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、トローチ剤、液剤等があげられる。また、前記医薬品は、例えば、さらに、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、吸収促進剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤等の各種添加剤等を含んでいてもよい。

0026

本発明の生理活性物、アレルギー抑制活性剤、免疫調整剤、飲食品、サプリメントおよび医薬品の形態は、特に制限されず、例えば、液状、ゾル状ゲル状、固体状、粒状、粉末状等の各種形態をとることができる。また、本発明のアレルギー抑制活性剤、免疫調整剤、飲食品、サプリメントおよび医薬品は、必要に応じて、薬学的若しくは食品安全上許容される各種添加剤を含んでもよい。

0027

つぎに、本発明は、IgEの産生抑制方法、IFN−γの産生促進方法、脱顆粒抑制方法、アレルギーの抑制方法または免疫調整方法であって、本発明の生理活性物、アレルギー抑制活性剤、免疫調整剤または医薬品を投与する工程を含むことを特徴とする。投与対象としては、特に制限されず、ヒト、ヒトを除くマウス等の哺乳類等があげられる。また、細胞や組織に対して、in vivo、in vitroで投与してもよい。

0028

つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例によってなんら限定されない。

0029

以下のようにして、実施例1および2の生理活性物を調製した。

0030

(実施例1)
ホワイト・ソルガムの外皮粉末25gを、メタノール100mLに懸濁し、25℃で15時間撹拌した後、不溶物を遠心により除去した。回収した可溶性画分から、エバポレーターを用いてメタノールを除去し、メタノール抽出物を得た。前記メタノール抽出物全量をジメチルスルホキシドDMSO)2mLに溶解し、本例の生理活性物を調製した。

0031

(実施例2)
メタノールに代えて、クロロホルムおよびメタノールを2:1の体積比で混合した混合溶媒を使用した以外は、実施例1と同様にして生理活性物を調製した。

0032

調製した実施例1および2の生理活性物を用いて、以下の各種確認実験を行った。

0033

<IgE産生ヒト骨髄腫細胞株のIgE産生抑制>
実施例1および2の生理活性物について、IgE産生ヒト骨髄腫細胞株のIgE産生への影響を確認した。まず、下記表に示す組成培地に、前記生理活性物をそれぞれ添加した。実施例1の前記生理活性物は、前記培地における最終濃度が、0.00002、0.00013、0.00077、0.0046、0.028、0.17および1v/v%となるように添加し、実施例2の前記生理活性物は、前記培地における最終濃度が、0.000011、0.000064、0.00039、0.0023、0.014、0.083および0.5v/v%となるように添加した。前記生理活性物を添加した前記培地に懸濁したIgE産生ヒト骨髄腫細胞株U266(ATCCNo.TIB−196)を播種して、37℃で24時間培養した。細胞は、前記培地1mLあたり、約5×104個となるように播種した。培養後、各培養液中に分泌されたIgE量を酵素抗体法により測定した。なお、前記酵素抗体法において、吸光度測定波長は、415nmとした。また、コントロールとして、前記生理活性物に代えて、DMSOのみを添加した培地を用いて、同様に、分泌されたIgE量の測定を行った。

0034

(培地の組成)
成分 濃度
ERDF培地(極東製薬社製) 17.7g/L
インスリン10μg/mL
トランスフェリン20μg/mL
エタノールアミン20μmol/L
亜セレン酸ナトリウム25nmol/L

0035

図1のグラフに、前記IgE産生量の測定結果を示す。同図において、横軸は、前記生理活性物の添加濃度であり、縦軸は、IgE産生量(ng/mL)である。同図において、白丸(○)のプロットは、実施例1の結果を示し、白四角(□)のプロットは、実施例2の結果を示し、白三角(△)のプロットは、前記コントロールの結果を示す。同図に示すように、コントロール(△)と比較して、実施例1(○)および実施例2(□)は、低いIgE産生量を示したことから、各実施例の生理活性物が、IgE産生抑制能を有することが確認できた。特に、メタノールとクロロホルムとの混合溶媒で抽出した実施例2の生理活性物は、メタノールのみで抽出した実施例1の生理活性物よりも低い添加量で、同程度のIgE産生抑制を実現できた。具体的には、IgE産生量を約10ng/mLに抑制する際の生理活性物の添加濃度は、実施例1が0.03v/v%であり、実施例2が、0.0004v/v%であることから、実施例2の生理活性物は、実施例1の生理活性物の約75倍以上のIgE産生抑制活性を有しているといえる。また、このような有機溶媒により抽出できることから、本発明の生理活性物における活性成分は、脂質が関連する非タンパク質物質と考えられる。

0036

以上の結果から、有機溶媒を含有する抽出溶媒で抽出した本発明の生理活性物は、IgE産生抑制によるアレルギー抑制活性を有することがわかった。また、特に、メタノール等のアルコールの他にクロロホルムを含む抽出溶媒で抽出した生理活性物は、さらに優れたIgE産生抑制活性を有し、ひいては、さらに優れたアレルギー抑制活性を有することがわかった。

0037

<生理活性物の熱安定性>
実施例2の生理活性物について、加熱処理によるIgE産生抑制効果への影響を確認した。実施例2の生理活性物を、37、60、80、100および120℃の温度で15分間加熱処理した。そして、前記基本培地に、実施例2の非加熱の生理活性物または前記加熱処理後の生理活性物を、それぞれ最終濃度が0.002v/v%となるように添加した。これらの培地を用いたこと以外は、前述と同様にして、培養液中に分泌されたIgE量を測定した。

0038

図2のグラフに、前記IgE産生量の測定結果を示す。同図において、横軸は、前記加熱処理温度(℃)であり、縦軸は、IgE産生量(ng/mL)である。また、同図において、白丸(○)のプロットは、実施例2の前記加熱処理後の生理活性物の結果を示し、白四角(□)のプロットは、実施例2の前記非加熱の生理活性物の結果を示し、白三角(△)のプロットは、前記コントロールの結果を示す。同図に示すように、実施例2の生理活性物は、加熱処理温度が60℃以下ではIgE産生抑制活性が維持され、80℃および100℃では前記活性が消失し、120℃では前記活性が回復した。

0039

<血中IgEの産生抑制>
実施例2の生理活性物について、マウスの血中IgE量への影響を測定した。まず、前記実施例2の生理活性物について、未希釈サンプル(×1)と、DMSOで10倍希釈した10倍希釈サンプル(×10)および100倍希釈した100倍希釈サンプル(×100)とを準備した。他方、BALB/cマウスを、各群3頭となるように、未希釈(×1)群、10倍希釈(×10)群、100倍希釈(×100)群、コントロール群およびネガティブコントロール群の5群に分けた。未希釈群、10倍希釈群および100倍希釈群には、それぞれ、前述のサンプル(×1、×10および×100)25μLを、毎日経口投与した。経口投与開始から9日目および23日目、オボアルブミン(OVA)を腹腔投与して免疫した。2回目(前記23日目)の免疫から5日目(経口投与開始から28日目)に各マウスを解剖し、その血液、脾臓および腸を採取した。そして、前記血液について、血中総IgE量、総IgG量、総IgA量および総IgM量を、酵素抗体法により測定した。また、採取した前記脾臓の脾臓重量および脾臓細胞数、ならびに前記腸のパイエル板細胞数および腸間膜リンパ球数を測定した。なお、前記コントロール群は、DMSO25μLを投与し、前記ネガティブコントロール群は、生理活性物およびDMSOのいずれも投与しなかった以外は、同様にして、測定を行った。

0040

図3(A)のグラフに、前記血中総IgE量の測定結果を示し、同図(B)のグラフに、前記血中総IgG量の測定結果を示し、同図(C)のグラフに、前記血中総IgA量の測定結果を示し、同図(D)のグラフに、前記血中総IgM量の測定結果を示す。図3の各図において、各バーは、左から順に、前記コントロール群、未希釈(×1)群、10倍希釈(×10)群、100倍希釈(×100)群、およびネガティブコントロール群の結果である。同図(A)に示すように、前記各サンプル(×1、×10および×100)の投与により、血中総IgE量は、有意に低下した。これに対して、同図(B)〜(D)に示すように、前記各サンプル(×1、×10および×100)の投与により、血中総IgG量、総IgA量および総IgM量に、有意な変化はなかった。すなわち、各実施例の生理活性物は、血中の免疫グロブリンのうち、IgEのみを低減させ、アレルギー抑制活性を有することが示された。また、血中のIgG、IgAおよびIgM量が変化しなかったことから、各実施例の生理活性物は、アレルギー以外の免疫応答に影響しないことが示された。

0041

一般に、脾臓、パイエル板および腸間膜リンパ節については、以下のことが知られている。すなわち、これらはそれぞれ免疫組織であり、中でも、パイエル板および腸間膜リンパ節は小腸に存在し、消化管から侵入する微生物等の異物に対する防御を担っている。そして、これらの免疫組織の活性の低下は、例えば、感染症に対する抵抗力の低下を招く。各実施例の生理活性物によれば、前記脾臓重量、脾臓細胞数およびパイエル板細胞数については、投与による影響は観察されず、腸間膜リンパ球数については、投与による有意な増加が確認された。この結果から、各実施例の生理活性物は、アレルギーに関与するIgE産生を抑制するが、それ以外の免疫応答には抑制的には作用せず、感染症等に対する生体防御能を低下させないことが示唆された。

0042

<血中OVA特異的IgEの産生抑制>
前述と同様にして、前記実施例2の生理活性物の各サンプル(×1、×10および×100)を、BALB/cマウスに経口投与し、免疫後の血液を採取した。そして、酵素抗体法により、採取した前記血液の血中OVA特異的IgE量、IgG量およびIgA量を測定した。

0043

図4(A)のグラフに、前記血中OVA特異的IgE量の測定結果を示し、同図(B)のグラフに、前記血中OVA特異的IgG量の測定における吸光度の測定結果を示し、同図(C)のグラフに、前記血中OVA特異的IgA量の測定における吸光度の測定結果を示す。図4の各図において、各バーは、左から順に、前記コントロール群、未希釈(×1)群、10倍希釈(×10)群および100倍希釈(×100)群の結果である。同図(A)に示すように、前記各サンプル(×1、×10および×100)の投与により、血中OVA特異的IgE量は減少した。特に、10倍希釈(×10)群において、血中OVA特異的IgE量は、有意に低下した。これに対して、同図(B)および(C)に示すように、前記各サンプルの投与により、血中OVA特異的IgG量およびIgA量に、有意な変化はなかった。これらの結果から、各実施例の生理活性物は、IgE産生細胞に対して抑制的に働いて、IgEのみを低減させ、他のクラスの抗体を産生する免疫細胞には影響しないことが示唆された。このため、各実施例の生理活性物は、アレルギー応答特異的な免疫抑制活性を有することが示唆された。

0044

<IFN−γの産生促進>
前述と同様にして、前記実施例2の生理活性物の各サンプル(×1および×10)を、BALB/cマウスに経口投与し、免疫後の血液および脾臓を採取した。そして、酵素抗体法により、採取した前記血液の血中IFN−γ量、および脾臓リンパ球のIFN−γ産生量を測定した。

0045

図5(A)のグラフに、前記血中IFN−γ量の測定結果を示し、図5(B)のグラフに、前記脾臓リンパ球のIFN−γ産生量の測定結果を示す。図5の各図において、各バーは、左から順に、前記コントロール、前記各サンプル(×1および×10)の投与の結果である。同図(A)のグラフに示すように、前記各サンプル(×1および×10)の投与により、前記血中IFN−γ量は有意に増加した。また、同図(B)に示すように、前記各サンプル(×1および×10)の投与により、前記脾臓リンパ球のIFN−γ産生量は増加した。すなわち、本発明の生理活性物は、Th1細胞の機能亢進に作用し、IFN−γ産生を促進させることが示された。また、本発明の生理活性物は、前述のようにIgE産生を抑制し、かつIFN−γ産生を促進することから、Th1/Th2バランスを調整可能である。さらに、本発明の生理活性物は、前記Th1/Th2バランスの調整により、体液性免疫応答細胞性免疫応答体内バランスを細胞性免疫応答優勢傾けることで、アレルギーを抑制可能である。

0046

<脱顆粒抑制活性>
前記実施例2の生理活性物について、β−ヘキソサミニダーゼ活性指標として、ラット好塩基球RBL−2H3細胞の脱顆粒への影響を測定した。

0047

(各種溶液の調製)
まず、前記実施例2の生理活性物の各サンプル(×1および×10)を、それぞれさらに、1倍タイロード緩衝液(1×Tyrode’s Buffer)で200倍希釈し、200倍希釈サンプル(×200)と2000倍希釈サンプル(×2000)とを調製した。また、ジメチルスルホキシド(DMSO)を、前記タイロード緩衝液で200倍希釈し、コントロール液を調製した。DNPBSA(SIGMA社製)を前記タイロード緩衝液で4000倍に希釈し、抗原液を調製した。Anti DNP−IgE(SIGMA社製)を10%FBS含有DMEM培地で10000倍に希釈し、抗体液を調製した。Triton(登録商標)X−100を前記タイロード緩衝液で1000倍に希釈し、界面活性剤液を調製した。p−ニトロフェニル−2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−グルコピラノシドを、3.3mmol/Lとなるように100mmol/Lクエン酸緩衝液を用いて希釈し、基質液を調製した。

0048

(β−ヘキソサミニダーゼ活性の測定)
24穴プレートに、RBL−2H3細胞を2.5×105細胞/ウェルずつ播種し、10%FBS含有DMEM培地を用いて一晩培養した。培地を吸引除去し、PBS(−)で洗浄後、各ウェルに前記抗体液を500μLずつ添加して、2時間培養した。培養後、前記抗体液を除去し、前記タイロード緩衝液で各ウェルを2回洗浄した。洗浄後、各ウェルに前記各サンプル2.5μLを添加し、10分間インキュベートした。さらに、各ウェルに前記抗原液10μLを添加して混合し、30分間インキュベートした。インキュベート後、前記プレートを10分間氷冷し、培養上清を回収した。前記上清回収後の各ウェルに前記界面活性剤液を添加し、氷冷下で細胞を超音波破砕し、細胞破砕液を回収した。96穴プレートの各ウェルに、回収した培養上清50μLまたは細胞破砕液50μLを加え、37℃で5分間プレインキュベートした。そして、前記基質液を、前記各ウェルに100μLずつ添加し、撹拌後、37℃で25分間反応させ、つづいて、2mmol/Lのグリシン緩衝液を、各ウェルに100μLずつ添加して、反応を停止させた。各反応液について、測定波長405nmにおける吸光度を測定した(n=4)。得られた吸光度を下記式に代入し、β−ヘキソサミニダーゼ放出率(%)を算出した。また、コントロールとして、前記各サンプルに代えて、前記コントロール液を用いた以外は、前述と同様に反応させて、吸光度を測定し(n=4)、β−ヘキソサミニダーゼ放出率(%)を算出した。ブランクとして、前記抗体液に代えて、10%FBS含有DMEM培地を用い、前記各サンプルに代えて、前記タイロード緩衝液を用いた以外は、前述と同様に反応させて、吸光度を測定し(n=4)、β−ヘキソサミニダーゼ放出率(%)を算出した。

0049

β−ヘキソサミニダーゼ放出率(%)=A/(A+B)×100
A=培養上清を含む反応液の吸光度
B=細胞破砕液を含む反応液の吸光度

0050

図6に、前記β−ヘキソサミニダーゼ放出率の測定結果(平均)を示す。同図において、各バーは、左から順に、コントロール、サンプル(×200)およびサンプル(×2000)を用いた測定結果であり、縦軸は、β−ヘキソサミニダーゼ放出率(%)である。同図に示すように、サンプル(×200)およびサンプル(×2000)共に、コントロールと比較して、β−ヘキソサミニダーゼ放出率(%)が抑制された。また、中でも、サンプル(×2000)は、コントロール(DMSO)に比べて、有意な抑制効果(p<0.01)が認められた。このことから、サンプル(×200)およびサンプル(×2000)共に、脱顆粒を抑制することが示された。なお、ブランクのβ−ヘキソサミニダーゼ放出率は、1.1%であった(図示せず)。

0051

このように、本発明の生理活性物は、IgEの産生を抑制し、IFN−γの産生を促進し、脱顆粒を抑制可能である。このため、本発明の生理活性物によれば、例えば、前述の、IFN−γ産生促進活性、IgE産生抑制活性または脱顆粒抑制活性から、アレルギーの発症を効果的に抑制可能であり、免疫調整可能である。

0052

(実施例3)
メタノールに代えて、エタノールを使用した以外は、実施例1と同様にして生理活性物を調製した。

0053

(実施例4)
メタノールに代えて、ヘキサンを使用した以外は、実施例1と同様にして生理活性物を調製した。

0054

(比較例1)
ホワイト・ソルガムの外皮粉末25gを、リン酸緩衝液100mLに懸濁し、25℃で15時間撹拌した後、不溶物を遠心により除去し、リン酸緩衝液抽出物を得た。前記リン酸緩衝液抽出物を本例の生理活性物とした。

0055

調製した実施例1、3、4および比較例1の生理活性物を用いて、前述と同様にして、IgE産生ヒト骨髄腫細胞株のIgE産生抑制の確認実験を行った。実施例1の前記生理活性物(メタノール抽出物)は、前記培地における最終濃度が、1、0.33、0.11、0.04および0.01v/v%となるように添加し、実施例3の前記生理活性物(エタノール抽出物)は、前記培地における最終濃度が、1、0.33、0.11、0.04および0.01v/v%となるように添加し、実施例4の前記生理活性物(ヘキサン抽出物)は、前記培地における最終濃度が、5、1.67、0.56、0.19および0.06v/v%となるように添加し、比較例1の前記生理活性物(緩衝液抽出物)は、前記培地における最終濃度が、25、8.33、2.78、0.93および0.31v/v%となるように添加した。

実施例

0056

図7のグラフに、前記IgE産生量の測定結果を示す。同図において、横軸は、前記生理活性物の添加濃度(v/v%)であり、縦軸は、IgE産生量(ng/mL)である。同図において、白丸(○)のプロットは、実施例1の結果を示し、白四角(□)のプロットは、実施例3の結果を示し、白菱形(◇)のプロットは、実施例4の結果を示し、黒丸(●)のプロットは、比較例1の結果を示し、白三角(△)のプロットは、コントロールの結果を示す。同図に示すように、比較例1(●)と比較して、実施例1(○)および実施例3(□)および実施例4(◇)は、低いIgE産生量を示し、各実施例の生理活性物が、リン酸緩衝液による抽出物に比べて、著しく高いIgE産生抑制能を有することが確認できた。具体的には、IgE産生量を約5ng/mLに抑制する際の生理活性物の添加濃度は、比較例1が、10v/v%であるのに対し、実施例1が0.4v/v%であり、実施例3が、0.1v/v%であり、実施例4が0.2v/v%であることから、実施例1、3および4の生理活性物は、比較例1の生理活性物の約10〜100倍以上のIgE産生抑制活性を有しているといえる。また、このような有機溶媒により抽出できることから、本発明の生理活性物における活性成分は、脂質が関連する非タンパク質物質と考えられる。

0057

以上のように、本発明の生理活性物によれば、有機溶媒を含む抽出溶媒によるソルガム抽出物を含むことにより、例えば、IgEの産生抑制活性、インターフェロンγ(IFN−γ)の産生促進活性、脱顆粒抑制活性、アレルギー抑制活性または免疫調整活性を発揮できる。また、ソルガムは、長年食品として利用されているため、その安全性にも優れる。このため、本発明の生理活性物は、アレルギー抑制活性剤、免疫調整剤、飲食品、サプリメント、医薬品等に適用でき、免疫疾患の予防や改善に有効である。

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