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図面 (11)

課題

長期間の飼育が可能でかつ、他の組織に影響を与えない骨疾患モデル動物と、これを用いた骨疾患改善能の評価方法を提供する。

解決手段

骨形成能欠損した実験動物であって、自然体で有されるべきInterferon induced transmembrane protein5(IFITM5)遺伝子領域の一部又は全部、あるいはこの遺伝子の上流プロモーター領域が改変されている、骨形成能が欠損した実験動物。

概要

背景

これまで、骨形成不全症骨軟化症くる病骨減少症骨粗鬆症骨硬化症大理石病、鎖骨頭蓋異形成症、等の骨疾患に関する基礎的研究、骨疾患の治療薬の開発等に使用するための適当なモデル動物は存在しなかった。そのため、たとえば骨粗鬆症に関しては、卵巣摘出動物が主に使用されている。また、骨粗鬆症モデル動物として小胞体ストレスセンサーOASIS遺伝子欠損マウス(特許文献1)が存在するが、この遺伝子は骨芽細胞以外の細胞でも発現しているため、骨組織以外への影響が考えられ骨組織のみの正確な解析は困難であった。

骨芽細胞の分化に重要な役割を果たす転写因子Cbfa1/Runx2のノックアウトマウスは、軟骨形成および骨形成に重大な影響を及ぼすが、胎生致死非特許文献1)のためモデル動物として使用することはできない。また、骨芽細胞特異的で骨芽細胞の分化に重要なもう一つの転写因子Ostrixのノックアウトマウスは骨量が少なく、特に鎖骨が未発達であるが、誕生後数十分内に呼吸障害で死に至るため(非特許文献2)モデル動物として使用できない。

また、骨芽細胞特異的で、かつ骨芽細胞の分化成熟後期過程である石灰化期で発現量が増加するタンパク質としてオステオカルシンが知られている。しかしながら、オステオカルシン遺伝子ノックアウトマウスは骨量が増加することから、オステオカルシンは過剰な骨形成を抑制する機能を有することが報告されている(非特許文献3)。これまで骨芽細胞に特異的でかつ骨形成の促進に関与する遺伝子またはタンパク質は見出されていなかった。したがって、骨芽細胞に特異的でかつ骨形成を促進する遺伝子を改変した骨疾患モデル動物は存在しない。
PCT/JP2006/319628
Komori, T. et al. Target disruption ofCbfa1 results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts. Cell 89: 755-764 (1997)
Nakashima, K. e al., The novel zinc finger-containing transcription factor Osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell 108: 17-29 (2002)
Ducy, P. et al., Increased bone formation in osteocalcin-deficient mice. Nature 382: 448-452 (1996)
Hanagata, N. et al., Phenotype and expression pattern of osteoblast-like cells cultured on polystyrene and hydroxyapatite with pre-adsorbed type-I collagen. Journal of Biomedical Materials Research Part A 83(2): 362-371 (2007)

概要

長期間の飼育が可能でかつ、他の組織に影響を与えない骨疾患モデル動物と、これを用いた骨疾患改善能の評価方法を提供する。骨形成能欠損した実験動物であって、自然体で有されるべきInterferon induced transmembrane protein5(IFITM5)遺伝子領域の一部又は全部、あるいはこの遺伝子の上流プロモーター領域が改変されている、骨形成能が欠損した実験動物。

目的

本発明は、このような背景から、長期間の飼育が可能でかつ、他の組織に影響を与えない骨疾患モデル動物とこれを用いた骨疾患改善能の評価方法を提供することを目的とした。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

骨形成能欠損した実験動物であって、自然体では有されるべきInterferoninducedtransmembraneprotein5(以下IFITM5と記す。)遺伝子領域の一部又は全部あるいはこの遺伝子の上流プロモーター領域が改変されていることを特徴とする実験動物。

請求項2

請求項1に記載の実験動物において、前記遺伝子改変対立遺伝子片方のみが改変されたヘテロ接合体であることを特徴とする実験動物。

請求項3

請求項1に記載の実験動物において、前記遺伝子改変は対立遺伝子の両方が改変されたホモ接合体であることを特徴とする実験動物。

請求項4

請求項1から3のいずれかに記載の実験動物において、前記遺伝子改変を全身に及ぼさせてあることを特徴とする実験動物。

請求項5

請求項1から3のいずれかに記載の実験動物において、前記遺伝子改変を特定の部位のみに生じさせてあることを特徴とする実験動物。

請求項6

骨形成能が欠損した実験動物であって、請求項1から5のいずれかに記載の実験動物の子孫であることを特徴とする実験動物。

請求項7

請求項6に記載の実験動物において、請求項1から5のいずれかに記載の実験動物同士の交配によるものであることを特徴とする実験動物。

請求項8

請求項6に記載の実験動物において、請求項1から5のいずれかに記載の実験動物と同士と前記遺伝子改変が存在しない実験動物との交配によるものであることを特徴とする実験動物。

請求項9

物質骨疾患改善能を評価する方法であって、請求項1から8のいずれかに記載の実験動物と前記遺伝子改変が存在しない実験動物とに被験物質投与し、両実験動物の表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量をそれぞれ測定して、両者を比較することを特徴とする骨疾患改善能の評価方法

請求項10

物質の骨疾患改善能を評価する方法であって、請求項1から8のいずれかに記載の実験動物に被験物質を投与したものと投与しないものとを作り、両実験動物の表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量をそれぞれ測定して、両者を比較することを特徴とする骨疾患改善能の評価方法。

技術分野

0001

本発明は、骨形成能欠損した実験動物とそれを用いた骨疾患改善能の評価方法に関する。

背景技術

0002

これまで、骨形成不全症骨軟化症くる病骨減少症骨粗鬆症骨硬化症大理石病、鎖骨頭蓋異形成症、等の骨疾患に関する基礎的研究、骨疾患の治療薬の開発等に使用するための適当なモデル動物は存在しなかった。そのため、たとえば骨粗鬆症に関しては、卵巣摘出動物が主に使用されている。また、骨粗鬆症モデル動物として小胞体ストレスセンサーOASIS遺伝子欠損マウス(特許文献1)が存在するが、この遺伝子は骨芽細胞以外の細胞でも発現しているため、骨組織以外への影響が考えられ骨組織のみの正確な解析は困難であった。

0003

骨芽細胞の分化に重要な役割を果たす転写因子Cbfa1/Runx2のノックアウトマウスは、軟骨形成および骨形成に重大な影響を及ぼすが、胎生致死非特許文献1)のためモデル動物として使用することはできない。また、骨芽細胞特異的で骨芽細胞の分化に重要なもう一つの転写因子Ostrixのノックアウトマウスは骨量が少なく、特に鎖骨が未発達であるが、誕生後数十分内に呼吸障害で死に至るため(非特許文献2)モデル動物として使用できない。

0004

また、骨芽細胞特異的で、かつ骨芽細胞の分化成熟後期過程である石灰化期で発現量が増加するタンパク質としてオステオカルシンが知られている。しかしながら、オステオカルシン遺伝子ノックアウトマウスは骨量が増加することから、オステオカルシンは過剰な骨形成を抑制する機能を有することが報告されている(非特許文献3)。これまで骨芽細胞に特異的でかつ骨形成の促進に関与する遺伝子またはタンパク質は見出されていなかった。したがって、骨芽細胞に特異的でかつ骨形成を促進する遺伝子を改変した骨疾患モデル動物は存在しない。
PCT/JP2006/319628
Komori, T. et al. Target disruption ofCbfa1 results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts. Cell 89: 755-764 (1997)
Nakashima, K. e al., The novel zinc finger-containing transcription factor Osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell 108: 17-29 (2002)
Ducy, P. et al., Increased bone formation in osteocalcin-deficient mice. Nature 382: 448-452 (1996)
Hanagata, N. et al., Phenotype and expression pattern of osteoblast-like cells cultured on polystyrene and hydroxyapatite with pre-adsorbed type-I collagen. Journal of Biomedical Materials Research Part A 83(2): 362-371 (2007)

発明が解決しようとする課題

0005

本発明は、このような背景から、長期間の飼育が可能でかつ、他の組織に影響を与えない骨疾患モデル動物とこれを用いた骨疾患改善能の評価方法を提供することを目的とした。

課題を解決するための手段

0006

発明1の実験動物は、骨形成能が欠損した実験動物であって、自然体で有されるべきInterferon induced transmembrane protein5 (以下IFITM5と記す。)遺伝子領域の一部又は全部あるいはこの遺伝子の上流プロモーター領域が改変されていることを特徴とする。
発明2は、発明1の実験動物において、前記遺伝子改変対立遺伝子片方のみが改変されたヘテロ接合体であることを特徴とする。

0007

発明3は、発明1の実験動物において、前記遺伝子改変は対立遺伝子の両方が改変されたホモ接合体であることを特徴とする。

0008

発明4は、発明1から3のいずれかの実験動物において、前記遺伝子改変を全身に及ぼさせてあることを特徴とする。

0009

発明5は、発明1から3のいずれかの実験動物において、前記遺伝子改変を特定の部位のみに生じさせてあることを特徴とする。

0010

発明6は、骨形成能が欠損した実験動物であって、発明1から5のいずれかの実験動物の子孫であることを特徴とする。

0011

発明7は、発明6の実験動物において、発明1から5のいずれかの実験動物同士の交配によるものであることを特徴とする。

0012

発明8は、発明6の実験動物において、発明1から5のいずれかの実験動物と前記遺伝子改変が存在しない実験動物との交配によるものであることを特徴とする。

0013

発明9の骨疾患改善能の評価方法は、発明1から8のいずれかの実験動物と前記遺伝子改変が存在しない実験動物とに被験物質投与し、両実験動物の表現型あるいは骨形成関連マーカー物質生成量をそれぞれ測定して、両者を比較することを特徴とする。

0014

発明10の骨疾患改善能の評価方法は、発明1から8のいずれかの実験動物に被験物質を投与したものと投与しないものとを作り、両実験動物の表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量をそれぞれ測定して、両者を比較することを特徴とする。

0015

発明者は、IFITM5が骨形成に関与することをin vitroで見出し(非特許文献4、Table 1)、さらにこの遺伝子の機能について調べ、以下に記載する事実を得た。
図1aに示すようにマウス骨芽細胞を適当な培地で培養すると骨芽細胞が成熟し石灰化により骨結節を形成する。骨芽細胞が石灰化する時期にはオステオカルシン遺伝子(Bglap1/2)の発現が誘導されることが知られているが、IFITM5遺伝子の発現はBglap2と同様に石灰化期に発現が誘導された。IFITM5遺伝子の発現誘導とともにタンパク質レベルでも発現量が増加していることを確認した。
また、骨形成促進因子であるBMP−2を添加すると骨結節の増加に伴いIFITM5遺伝子の発現量も増加し、一方、骨形成抑制因子であるインターロイキン1(IL−1)を添加すると骨結節の減少に伴いIFITM5遺伝子の発現量も減少した(図1b, c)。
これらのことから、IFITM5は骨形成に関与することが示唆された。

0016

IFITM5遺伝子はIFITMファミリーメンバーとして知られている。IFITMファミリーはマウスでは少なくとも5つの機能的なメンバー(IFITM1, IFITM2, IFITM3, IFITM5, IFITM6)が知られているが、骨結節の増減と正の相関があるのはIFITM5だけである(図1d)。

0017

16.5日目のマウス胚のin situハイブリダイゼーションによりIFITM5遺伝子の発現組織を調べたところ、図2に示すように腰椎胸椎口蓋骨骨、下顎骨頭蓋骨上顎骨鼻骨大腿骨脛骨指骨など軟骨内骨化および膜性骨化の両骨組織で発現が認められ、他の組織での発現は認められなかった。また、骨組織においては、軟骨細胞では発現せず、特に骨膜の周囲に位置する骨芽細胞、海綿骨周囲に位置する骨芽細胞において顕著に発現していた。これらのことから、IFITM5遺伝子は骨芽細胞でのみ発現する骨芽細胞特異的遺伝子であるといえる。
以上の事実からIFITM5は骨形成に関与し、かつ骨芽細胞に特異的であることが示唆されたため、これを利用して新たな実験動物のこの遺伝子改変動物の作製に至った。

発明の効果

0018

本発明のIFITM5遺伝子改変非ヒト動物およびその一部により、これまで不明であった骨形成の分子機構解明のための有用なモデルとして、また、IFITM5が様々な骨疾患にどのように関与するかを調べる有用なモデルとして役立つ。
本発明の骨疾患改善評価方法によると、骨芽細胞に作用して骨疾患を治療しうる薬剤の開発、および骨疾患の診断方法の開発に貢献することができる。
また、動脈硬化乳癌でも骨形成に類似した石灰化現象が認められ、骨芽細胞あるいは骨芽細胞に類似した細胞の関与が報告されている。IFITM5遺伝子改変非ヒト動物あるいはIFITM5遺伝子改変非ヒト動物の一部は、これらの疾患による石灰化機序、治療薬、診断薬および診断方法の開発への利用も期待できる。
さらに、IFITM5の一塩基多型(SNP)や変異を有する動物の表現型の解析により骨疾患の診断が可能となる。

発明を実施するための最良の形態

0019

IFITM5遺伝子を欠損したノックアウトマウスの作製
本発明における遺伝子改変とは、内因性のIFITM5遺伝子の塩基配列のうち、1塩基以上に置換欠失、挿入の操作を行うこと(ノックアウト)、あるいは外因性のIFITM5遺伝子を染色体上に導入する操作を行うこと(トランスジェニック)である。前者では、IFITM5遺伝子の機能的欠損を引き起こし、後者ではIFITM5遺伝子の機能的亢進を引き起こす。

0020

これらの操作が加えられた改変動物は、IFITM5遺伝子の対立遺伝子の片方のみに操作が加えられたヘテロ接合体、および両方に操作が加えられたホモ接合体、およびそれらの出生前胎仔も含まれる。

0021

前記遺伝子の改変は、ノックアウトの場合、内因性のIFITM5遺伝子の少なくとも一部を欠損させる変異を導入し、機能的欠損を有するように操作する。マウスIFITM5のゲノムDNAはBac cloneなどから単離することができる。トランスジェニックの場合は、外因性のIFITM5遺伝子を用いるが、ヒトの疾患モデルのためにはヒトのIFITM5遺伝子を使用することが望ましい。ヒトIFITM5遺伝子の塩基配列はGenbankアクセッション番号NM_001025295、BC150562、BC150563などで公表されており、公知の手法により単離可能である。

0022

現在まで、マウス、ラットウシイヌニワトリでIFITM5の存在が知られているが、ハムスターウサギモルモットネコサル等の実験動物、およびヒツジウマブタ等の家畜などでも同様にIFITM5類似遺伝子の存在が確認されているのでこれらを利用することも可能である。

0023

本発明のノックアウト動物は公知の方法で作製することができる。
ノックアウト動物を作製するためにはIFITM5のターゲティングベクターを設計し構築する。IFITM5遺伝子のターゲティングベクターは当該遺伝子の全部あるいは一部を喪失あるいは破壊させ、機能を失わせるか、あるいは機能を低下させるものである。ここで機能とは、骨形成あるいは石灰化に関する機能のことを言う。
ターゲティングベクターとしては、IFITM5遺伝子を含むゲノムDNAに対して相同組換えを起こすように設計されたIFITM5遺伝子に相同な2つのポリヌクレオチド、および選択マーカーを含むことが好ましい。IFITM5遺伝子に相同な2本のポリヌクレオチドは相同領域が長いほど良く、また長さは0.5〜20Kb、好ましくは1〜10Kbである。

0024

本発明で用いられるターゲティングベクターの選択マーカーはポジティブ選択マーカーネガティブ選択マーカーあるいは両方を含むことができる。ポジティブ選択マーカーとしては例えば、ネオマイシン耐性遺伝子ハイグロマイシン耐性遺伝子アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などがあり、ネガティブ選択マーカーとしては例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子ジフテリア毒素A遺伝子などを使用することができる。
ターゲティングベクターの基本骨格となるベクターは特に限定されず、大腸菌などの形質転換を行う細胞中自己複製できるものであれば良い。たとえば、pGEM−1(Promega社)等が使用できる。

0025

本発明のターゲティングベクターは公知の方法により構築できる。すなわち、IFITM5に相同な2本のポリヌクレオチドおよび選択マーカーをベクターに挿入することにより構築できる。
構築したターゲティングベクターを用いて相同組換えを行う。相同組換えはES細胞を用いることが望ましい。ES細胞はTT2細胞が多く使用されるが、AB−1細胞、J1細胞、R1細胞などを使用しても良い。
ターゲティングベクターをES細胞に導入する方法としては、エレクロポレーション法、DEAEデキストラン法、リポソーム法などがあり、いずれの方法でも良い。
IFITM5遺伝子がターゲティングされているかどうかは、たとえばターゲティングベクターの外側のゲノムDNA領域上、およびターゲティングベクター配列のうち薬剤耐性遺伝子上などから設計したプライマーを用いてPCRを行うことにより確認できる。また、ターゲティングベクターに含まれないゲノム領域を認識するプローブを設計し、IFITM5遺伝子を含むゲノムを適当な制限酵素で処理することにより得られるゲノム断片と、上記のプローブをハイブリダイズするサザンブロットによっても確認できる。

0026

相同組換えされたES細胞は、8細胞期胚あるいは胚盤胞内にマイクロマニピュレーション法、凝集法などの方法により移植する。8細胞期胚あるいは胚盤胞の胚は、FSH様作用を有するPMSGおよびLH作用を有するhCGなどのホルモン剤により過排卵処理した雌動物と雄動物を交配させることにより得ることが出来る。
ES細胞を移植されたキメラ胚は動物、好ましくは偽妊娠動物(去勢した雄動物と交配した雌動物)の子宮移入する。キメラ胚を移入された動物はキメラ動物出産する。キメラ動物は体色や被毛色など公知の方法により確認できる。
キメラ動物を成熟するまで飼育し、雄のキメラ動物と野生型の雌動物と交配させる。誕生した動物の体色、被毛色などによりES細胞がキメラ動物の生殖系列に導入されたことを確認することができる。胚内に移植された相同組換えES細胞が生殖系列に導入されたIFITM5遺伝子欠損動物はヘテロ接合体動物である。
このヘテロ接合体の雄動物とヘテロ接合体の雌動物を交配させることによりIFITM5遺伝子欠損ホモ接合体動物を得ることができる。ホモ接合体動物の確認は、たとえば尻尾などから染色体DNAを抽出しPCR等により行うことができる。
本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、IFITM5タンパク質の発現が調節されている。
マウスの場合、IFITM5遺伝子欠損マウスはIFITM5タンパク質の発現が抑制され、骨量が野生型に比べて減少しているが、野生型マウスと同じ飼育条件下でも発生、繁殖寿命には欠陥が生じない。

0027

IFITM5遺伝子改変非ヒト動物あるいはその一部による骨疾患改善物質探索方法
骨疾患改善物質の評価方法であって、(a)本発明の非ヒト動物あるいはその一部に被験物質を投与あるいは接触させ、(b)前記被験物質を投与あるいは接触させた非ヒト動物あるいはその一部における表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量を調べ、被験物質を投与あるいは接触させていない対照の非ヒト動物あるいはその一部における表現型あるいは骨形成関連マーカー物質の生成量と比較し、(c)(b)の結果に基づいて被験物質を選択する骨疾患の改善物質を評価することを特徴とする骨疾患改善物質の探索方法を提供する。

0028

ここで、非ヒト動物の一部とは、組織または細胞などである。また、投与は経口投与非経口投与であり、非経口投与としては、例えば静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、気道内等の全身投与、あるいは骨、骨髄への局所投与等が挙げられる。表現型とは、体長、体重等、および骨量、骨密度骨強度など、骨組織形態計測に利用されている指標である。骨形成関連マーカー物質とはアルカリフォスファターゼI型コラーゲンオステオポンチン、オステオカルシン、骨シアロタンパク質など、骨形成に関連して生成される物質である。

0029

本発明の探索方法の対象となる被験物質は特に限定されるものではない。たとえば、アミノ酸、タンパク質、核酸多糖合成物質天然物質などを挙げることができる。これらの被験物質は単独でも組み合わせても良い。
このようにして選択された被験物質はIFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質に障害のある骨疾患の改善薬として有効である。

0030

IFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質を測定することによる骨疾患改善物質の探索方法
骨疾患改善物質の評価方法であって、(a)非ヒト動物あるいはその一部に被験物質を投与あるいは接触させ、(b)非験物質を投与あるいは接触させた非ヒト動物あるいはその一部のIFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質の発現量を調べ、非験物質を投与あるいは接触させていない非ヒト動物あるいはその一部のIFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質の発現量と比較し、(c)(b)の結果に基づいて被験物質の骨疾患改善能を評価することを特徴とする骨疾患改善物質を探索する方法を提供する。
IFITM5遺伝子の発現量を調べる方法は、特に限定されるものではく、例えばRT−PCR、リアルタイム定量PCR、ノーザンハイブリダイゼーションなどが挙げられる。

0031

IFITM5タンパク質の発現量を調べる方法は、特に限定されるものではなく、例えばウエスタンブロッティング法などが挙げられる。

0032

IFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質を測定することによる骨疾患の診断方法
被験者あるいは被験動物から組織を採取し、IFITM5遺伝子あるいはIFITM5タンパク質の発現量を測定することにより骨形成能あるいは骨疾患の診断を行う方法を提供する。
IFITM5遺伝子およびIFITM5タンパク質の測定方法は特に限定されるものではなく、前記の例と同様な方法で測定することができる。

0033

IFITM5遺伝子ノックアウトES細胞の作製
IFITM5遺伝子のゲノムDNAのクローンは、市販のBac clon (ID: RP23−388N13)から得た。ターゲティングベクターはNeoカセットを含むベクターの両側にBac cloneから切り出したゲノムをShort arm、Long armとしてクローニングした。さらにネガティブセレクションマーカーとしてDTA(ジフテリア毒素)を挿入し、コンストラクトとして(short−Neo−long−DTA)を作製した(図3)。
次に、ターゲティングベクターより直鎖状にしたDNAをエレクトロポレーションにより4−7x107個のES細胞に導入した。G418により1週間選択をおこなった後、生き残ったコロニーを数百個ピックアップした。ピックアップしたES細胞はさらに1週間培養した後、ゲノムDNAを抽出し、PCR法を用いて相同組換えクローンをスクリーニングした。ここで得た陽性クローンをさらに5‘側、3’側に設計した2組のプローブを用いてサザンブロットを行い、ターゲティングベクターの相同組換え体を確認した(図4)。

0034

IFITM5遺伝子ノックアウトマウスの作製
実施例1で作製されたIFITM5遺伝子が破壊されたES細胞をマイクロインジェクションにより交配後3.5日目のC57BL6の胚盤胞に移入し、偽妊娠マウスの子宮に移した。得られたキメラマウスをC57BL6マウスと交配し、生殖系列にIFITM5遺伝子の破壊が導入されたヘテロ接合マウスを得た。さらに、これらのヘテロ接合マウス同士を交配させることにより本発明のIFITM5遺伝子がノックアウトされた遺伝子改変動物を得た。
本発明におけるIFITM5遺伝子欠損マウスは野生型マウスと同じ飼育条件で生育できた。

0035

実施例2で得たマウスの表現型
実施例2で得たIFITM5遺伝子欠損マウスは、野生型マウスに比べ体長が小さく、かつ前肢および後肢とも発達不全であった(図5a)。また、本発明におけるIFITM5遺伝子欠損マウスは、軟骨形成には異常は認められなかったが、脛骨および尺骨湾曲していた(図5b, c)。さらに、IFITM5遺伝子欠損マウスでは、上顎骨および下顎骨の骨化が認められず、頭蓋骨も野生型に比べ薄かった(図5d)。

0036

実施例2で得た本発明マウス骨構造
野生型マウスおよび実施例2で得たIFITM5遺伝子欠損マウスから脛骨を摘出し、μ−CTにより二次海綿骨部位の立体構造を調べた(図6a)。さらにこの画像から骨形態計測パラメーターをTRI/3D−BON(ラトックシステムエンジニアリング)により求めた(図6b,c)。二次海綿骨の骨組織に対する割合(BV/TV)および二次海綿骨の骨密度(Tr.BMD)はIFITM5遺伝子欠損マウスで低かった。
これは、IFITM5遺伝子欠損マウスでは骨量が野生型に比べて低下していることを示している。IFITM5遺伝子欠損マウスでは海綿骨数(Tb.N)は野生型と変わらないが、海綿骨幅(Tb.Th)が低いことから、IFITM5遺伝子欠損マウスでは野生型マウスに比べ海綿骨が薄いことがわかる。また、皮質骨の骨密度(Cor.BMD)および皮質骨量(Cor.BMC)はIFITM5遺伝子欠損マウスが野生型マウスに比べ顕著に低く、IFITM5遺伝子欠損マウスは皮質骨量の重大な低下を引き起こすことがわかる。
さらに、図7に示すようにIFITM遺伝子欠損マウスの二次海綿骨では、骨粗鬆症の指標であるV*m.spac(大きい値ほど骨粗鬆症の度合いが大きい)は野生型に比べ大きく、V*tr.(小さい値ほど骨粗鬆症の度合いが大きい)は野生型に比べて小さいことから、IFITM5遺伝子欠損マウスでは骨粗鬆症の度合いが大きいことを示していた。

0037

実施例2で得た誕生後2日目のIFITM5遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスの頭蓋骨から骨芽細胞を単離し、5600細胞/cm2の濃度でカルチャーディッシュ播種し、10%FBS, 100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、50μg/mlのアスコルビン酸、2mmol/lのβーグリセロリン酸を含む培地で培養した。培養後40日目以降で野生型マウスから単離した骨芽細胞は石灰化による骨結節が認められたが、IFITM5遺伝子欠損マウスでは石灰化はわずかしか起こらなかった(図8a)。さらに、細胞からRNAを抽出後、逆転写によりcDNAを合成し、5’−cagctcctgggagttacagc−3’および5’−aagtggggaaagggacaaa−3’のプライマーを用いてPCRによってIFITM5遺伝子の発現量を求めた。その結果、野生型マウスでは培養後期にIFITM5遺伝子の顕著な発現増加が認められたのに対し、IFITM5遺伝子欠損マウスでは発現が認められなかった(図8b)。
これにより、野生型マウス骨芽細胞に被験物質を接触させ、接触させない対照の野生型マウス骨芽細胞とのIFITM5遺伝子の発現量を比較することにより、被験物質の骨形成能あるいは骨疾患改善能を評価することができる。

0038

実施例2で得た誕生後2日目のIFITM5遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスの頭蓋骨から骨芽細胞を単離し、前記した培地にて50日間培養した。培養後40日目以降で野生型マウスから単離した骨芽細胞は石灰化による骨結節が認められたが、IFITM5遺伝子欠損マウスでは石灰化がわずかしか観察されなかった。培養40日目の培養細胞からtotal protein extraction kit (CHEMICON)を用いて抽出したタンパク質をSDS−PAGEにて電気泳動を行った後に、Immobilon−PSQメンブレン(Millipore)にタンパク質を転写した。メンブレンは3%Immunoblot Blocking Reagent(Millipore)(0.05Teen−20を含むPBSに溶解)を用いて、室温で1hrブロッキングを行い、メンブレンを一次抗体としてIFITM5タンパク質のN末端に対するポリクロナル抗体(N末端側peptide 配列:TSYPREDPAPSSRC)を4℃で一晩インキュベートした。その後、0.05% Teen−20を含むPBSでメンブンレンを3回洗浄後、2次抗体としてHRP−F(ab’)2 of Goat Anti−rabbitIgG(H+L) (ZYMED)を加え、室温で1時間あるいは4℃で一晩インキュベートした。このメンブレンをImmobilon Western Chmilimunescent HRP Substrate( Millipore)を用いて反応させ、IFITM5タンパク質を検出した。その結果、IFITM5遺伝子欠損マウスではIFITM5タンパク質の発現が認められず、野生型マウスでは顕著に発現していた(図8c)。
これにより、野生型マウス骨芽細胞に被験物質を接触させ、接触させない対照の野生型マウス骨芽細胞とのIFITM5タンパク質の発現量を比較することにより、被験物質の骨形成能あるいは骨疾患改善能を評価することができる。

0039

実施例2で得た誕生後7日目のマウスの大腿部からKawamoto法(詳しくは下記参考文献参照)によりクライオセクションを調整した。このクライオセクションをメタノールで固定後、ヘマトキシリンエオシンで染色し(HE染色)、エタノール脱水処理を行った。この大腿部切片からレーザーマイクロダイセクションで骨芽細胞を切り出し、RNAを回収、cDNAを合成後、前記のプライマーセットでPCRを行いIFITM5遺伝子の発現量を調べた。IFITM5遺伝子欠損マウスでは遺伝子の発現は認められないが、野生型マウスではIFITM5遺伝子が発現していた(図9)。
このような方法により、回収した組織からIFITM5遺伝子の発現量を計測することができ、組織の骨形成能および骨疾患の診断を行うことができる。また、非ヒト動物に被験物質を投与し、投与してない対照の非ヒト動物とIFITM5遺伝子の発現量を測定することにより骨疾患改善物質の探索を行うことができる。これらの診断および探索は、実施例6によるIFITM5タンパク質の測定によって行ってもよい。
参考文献:Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol. Cytol. 66(2): 123-143 (2003)

0040

IFITM5と相互作用するタンパク質群プルダウン法で得た後、質量分析計により同定した結果、女性ホルモンであるエストラジオールの合成に関与する酵素HSD17B12およびHSD17B7、さらに免疫抑制剤FK506と結合するFKBP11が得られた(図10)。骨粗鬆症の主要な原因として、閉経後卵巣等から骨組織に供給されるエストラジオール濃度の低下が報告されている。IFITM5はエストラジオール合成に関与する酵素と結合していることから骨粗鬆症との関連が示唆され、IFITM5遺伝子改変動物は骨粗鬆症の発症機序および治療薬の開発に寄与することが期待できる。

図面の簡単な説明

0041

マウス骨芽細胞の培養におけるIFITM5遺伝子の発現挙動を示す。(a)は、分化培地で培養したマウス骨芽細胞は培養が進むと徐々に成熟し石灰化による骨結節を形成する(上図の赤い部分、アリザリンレッドカルシウムを染色)。この培養でIFITM5遺伝子は石灰化度が大きくなると発現量も増加する(下図)。Bglap2(オステオカルシン遺伝子)は石灰化に連動して発現量が増加することが知られているが、IFITM5遺伝子の発現挙動はBglap2と類似している。この培養でIFITM5のタンパク質生成量にIFITM5抗体を用いたウェスタンブロットで調べると石灰化度が大きくなるほどIFITM5タンパク質量も増加する。(b)は、分化培地に骨形成促進因子であるBMP−2を添加すると石灰化による骨結節の形成が促進される(上図)。この培養においてBMP−2の添加量が大きくなり骨結節の形成が促進されるとIFITM5遺伝子の発現量も連動して大きくなる(下図)(c)は、分化培地に骨形成抑制因子であるIL−1を添加すると石灰化による骨結節の形成が抑制される(上図)。この培養においてIL−1の添加量が大きくなり骨結節の形成が抑制されるとIFITM5遺伝子の発現量も連動して小さくなる(下図)(d)は、図1(a)の培養において培養2日目(石灰化してない時期)と培養21日目(石灰化している時期)でのIFITMメンバーの遺伝子発現量を調べると、IFITM5遺伝子のみが石灰化している時期で発現量が増加している。
マウス16.5日目の胚でのIFITM5遺伝子発現組織をin situハイブリダイゼーションで調べた結果を示す。胚の断面におけるa1〜a7がIFITM5発現部位。枠内のa1〜a7はそれぞれの部位を拡大した図。さらに枠内a1〜a7の矢頭を拡大した図がa1−1〜a7−1。青く染色されている部位がIFITM5発現部位。b1, b2は16.5日目の胚の後肢。c1は指骨。
実施例1のIFITM5ノックアウトマウス作製のためのターゲティングベクターを示す模式図。作製したターゲティングベクターはshort−Neo−long−DTA構造をもつコンストラクトである。
実施例1のSouthern blot Genotyping結果を示す写真。エレクトロポレーションにより陽性であると判断された9クローンのES細胞でサザンブロットを行った。レーン1は野生型。レーン3以外の8クローンが相同組換え体のクローンであることが確認できる。
実施例3の生後2日目のIFITM5ノックアウトマウス(IFITM5−/−)と正常マウス(WT)の比較写真。(a)は、生後2日目のIFITM5ノックアウトマウスと野生型マウス。ノックアウトマウスは体長が小さく、さらに四肢も短い。野生型マウスとは外見が顕著に異なる。(b)は、IFITM5ノックアウトマウスでは脛骨およびひ骨の変形が観察される。(c)は、IFITM5ノックアウトマウスではとう骨および尺骨の変形が観察される。(d)は、上顎下顎および頭蓋骨のvon KossaとHE染色。色く染まっている領域が骨化していることを示している。IFITM5遺伝子ノックアウトマウスでは、上顎、下顎の骨化が観察されない。また、頭蓋骨は野生型マウスに比べて薄い。
実施例4の生後2日目のIFITM5ノックアウトマウス(IFITM5−/−)と正常マウス(WT)の脛骨二次海綿骨の比較写真。(a)は、μ−CTで解析した脛骨二次海綿骨の立体構造。野生型に比べてIFITM5遺伝子ノックアウトマウスは皮質骨が薄い。(b)は、海綿骨に関するパラメーター。BV/TVは骨組織全体の体積に対する骨体積の割合、BMDは骨密度を表す。両パラメーターともIFITM5ノックアウトマウスは野生型マウスよりも低い。Tb.Thは海綿骨幅、Tb.Nは海綿骨数を表す。(c)は、皮質骨に関するパラメーター。BMDは骨中の石灰化密度、BMCは皮質骨総量。いずれもIFITM5遺伝子ノックアウトマウスは野生型に比べ低い。
実施例4のIFITM5ノックアウトマウス(IFITM5−/− )と正常マウス(WT)の脛骨二次海綿骨の骨粗鬆度を示すグラフ。 骨密度の指標となるパラメーター。V*m.spacは大きい値ほど骨粗鬆症の度合いが大きいく、V*tr.は小さい値ほど骨粗鬆症の度合いが大きい。
実施例5および実施例6の IFITM5ノックアウトマウスと野生型マウスから単離した骨芽細胞の石灰化能とIFITM5遺伝子およびタンパク質の発現を示す写真。(a)は、IFITM5遺伝子ノックアウトマウスおよび野生型マウスの頭蓋骨から単離した骨芽細胞のin vitroでの培養における石灰化(骨結節形成)をアリザリンレッドで検出。IFITM5遺伝子ノックアウトマウスでは野生型マウスに比べて骨結節が少ない。(b)は、IFITM5遺伝子ノックアウトマウスおよび野生型マウスの頭蓋骨から単離した骨芽細胞のin vitroでの培養における石灰化期のIFITM5遺伝子の発現をPCRによって検出。(c)は、IFITM5遺伝子ノックアウトマウスおよび野生型マウスの頭蓋骨から単離した骨芽細胞のin vitroでの培養における石灰化期のIFITM5タンパク質をウエスタンブロッティングにより検出。
実施例7のIFITM5ノックアウトマウスと野生型マウス大腿骨から単離した骨芽細胞のIFITM5遺伝子発現を示す写真。 大腿骨切片からレーザーマイクロダイセクションにより石灰化部位を切り出す。上左図の黄色の線で囲われた部分の石灰化部位を切り出す。上右図は切り出した後の切片。下図はPCRによる切り出した石灰化部位のIFITM5遺伝子の発現。
実施例8のIFITM5と相互作用するタンパク質の探索とIFITM5タンパク質がHSD17B7、HSD17B12、FKBP11と相互作用することを示したウェスタンブロット写真。 (a)は、Flag−IFITM5をマウス骨芽細胞で強制発現させ、得られたタンパク質溶液をFlag抗体で免疫沈降しプルダウンを行った。レーン 1は細胞から回収した全タンパク質、レーン 2は免疫沈降後の上澄み液(IFITM5と相互作用していないタンパク質)、レーン 3は免疫沈降により回収されたタンパク質(IFITM5と相互作用しているタンパク質)。レーン3に用いたタンパク質を液体クロマトグラフ質量分析計でタンパク質を同定し、IFITM5と相互作用しているタンパク質としてFBBP11、HSD17B12、HSD17B7の3種類のタンパク質を得た。(b)は、前記図10(a)で同定された3種類のタンパク質がIFITM5と相互作用していることを確認するため、Flagを連結したこれら3種類のタンパク質とIFITM5を細胞内で強制発現し、Flag抗体で免疫沈降した。その結果、FBBP11、HSD17B12、HSD17B7の3種類のタンパク質にはIFITM5が相互作用していることを確認した。FFBP11は免疫抑制剤と結合するレセプタータンパク質であり、HSD17B12およびHSD17B7はエストラジオール合成に関与する酵素である。

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