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図面 (15)

課題

患者における移植拒絶、特に、心臓移植拒絶診断またはモニタリングする方法を提供することを、本発明の課題とする。

解決手段

上記課題は、患者における1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出することにより、患者における移植拒絶、特に、心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法を提供することによって解決された。移植拒絶、特に心臓移植拒絶を診断またはモニタリングするための診断オリゴヌクレオチド、およびこれらを含むキットまたはシステムもまた記載される。1つの実施形態において、個体の免疫状態を評価する方法であって、該個体における造血速度またはそれらの変異経路に沿った造血細胞分布に依存して異なったレベル発現される1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する、方法が提供される。

概要

背景

(発明の分野)
この出願は、臓器移植後発現プロファイリングの分野にある。

(発明の背景
疾患の診断、予後、重症度分類、および治療における現在の欠点の多くに対して、疾患の基礎を成す分子機構の同定、ならびに疾患状態の発生または進行を発現パターンにより予測するか、または特定の治療的介入に対する患者の反応を予測するヌクレオチド配列(またはヌクレオチド配列の集合)の発見を介して、取り組みがなされ得る。特に、容易にアクセス可能細胞および組織からの、予測値によるヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列集合の同定は、非常に価値がある。例えば、末梢血は、全ての患者から得られ得、そして低コストかつ多くの時点で容易に採取することができる。このことは、容易に入手できないか、もしくは侵襲的で有害な手順を介してのみ入手可能な大部分の他の細胞型および組織型に対して、望ましい対照である。また、所望する場合、遺伝子発現分析に先立って血液試料中の多くの細胞型を容易に分離し得るため、循環血液中に存在する種々の細胞型は、発現プロファイリング実験にとって理想的である。発現プロファイリング技術を用いた疾患の研究にとって、そして診断技術の開発および治療標的の同定にとって、血液が非常に魅力的基質を提供する一方で、血液試料中の発現プロファイリングの値は、それらの細胞型における遺伝子発現の変化が、疾患に対する予兆、ならびに疾患の病因および進行に関連する程度に依存する。

造血は、血液の全ての細胞型の発生および成熟である。これらとしては、赤血球血小板および白血球が挙げられる。白血球は、さらに、顆粒球好中球好酸球好塩基球)および単核細胞モノイトリンパ球)に分類される。これらの細胞は、循環プールを満たすため、そしてこの系の損傷およびチャレンジ応答するために前駆細胞から発生および成熟される。これは骨髄脾臓胸腺肝臓リンパ節粘膜結合リンパ組織(MALT)および末梢血において生じる。

前駆細胞は、各系統未成熟形態に分化し、そしてこれらの未成熟細胞は、成熟細胞にさらに発達する。このプロセスは、造血成長因子の影響および指向下で生じる。造血が刺激される場合、末梢血には多くの未成熟な細胞が存在し、いくつかの場合、前駆細胞は増加した頻度で見出される。例えば、CD34+細胞(造血幹細胞)は、免疫系に対する損傷を有する末梢血において頻度が増加し得る。好中球については、「バンド」形状が増加し、赤血球については、網状赤血球、または有核赤血球が認められる。リンパ球は、リンパ芽球(未成熟リンパ球)に先行する。

種々の系統の赤血球の生成速度を測定することは、重要な臨床目的であり得る。種々の血球の生成に関連する造血障害は、薬理学的に処置され得る。例えば、貧血(低赤血球)は、エリスロポイエチン(造血増殖因子)で処置され得、そしてこの治療に対する応答は、RBC生成速度を測定することによって評価され得る。低好中球数は、G−CSF投与によって処置され得、そしてこの治療は、好中球生成速度を測定することによってモニタリングされ得る。あるいは、赤血球障害の診断は、系統特異的生成速度の決定によって非常に促進される。例えば、貧血(低RBC)は、減少された細胞生成または増加した細胞の破壊によって引き起こされ得る。後者の場合、細胞生成速度は、減少されるよりもむしろ増加され、そして治療の影響は非常に異なる。赤血球生成速度の測定の臨床的用途のさらなる議論を、以下にする。

赤血球生成速度の評価は、診断および非血液病障害について有用であり得る。特に、急性同種移植拒絶の診断およびモニタリングは、このようなアプローチにより有益であり得る。急性同種移植拒絶の現在の診断およびモニタリングは、侵襲性同種移植生検および生検病歴の評価によって達成される。このアプローチは、患者の手順の経費費用疼痛および不快感熟練した臨床医の必要性、手順の合併症の危険性、免疫系機能に対する洞察力欠如、ならびに病理学的評価の変動に起因して、最適とは言えない。さらに、生検は、同種移植片に重大な細胞侵襲が生じた後にのみ、急性同種拒絶を診断し得る。この時点で、このプロセスはすでに、同種移植に損傷を引き起こしている。これらの全ての理由のために、プロセスにおける初期段階での急性拒絶を診断およびモニタリングし得る単純な血液試験が必要とされる。同種拒絶は、免疫系の機能細胞の存在に依存する。さらに、拒絶のプロセスは造血の活性化を引き起こし得る。最後に、急性拒絶を処置または予防するのに効果的な免疫抑制治療は、造血を抑制し得る。これらの理由のために、造血細胞生成速度の評価は、急性拒絶の診断およびモニタリングにおいて有用であり得る。

細胞の発達および生成速度を測定する現在の技術は不適切である。最も一般的なアプローチは、長期にわたって目的の系統の成熟細胞の数を測定するものである。例えば、患者が貧血(低赤血球数)について処置されている場合、臨床医は血球数を測定して循環の赤血球(RBC)数を評価する。これが効果的であるために、臨床医は長期にわたって細胞数を測定しなければならず、そして治療に対する応答を評価できるまで2〜4週間待たなければならない。同じ制限が、血液の全ての細胞系統の評価に当てはまる

代替的なアプローチは、顕微鏡下でこれらの細胞を計数することによって末梢血における未成熟細胞数を計数することである。これは、細胞生成速度のより迅速な評価を可能にし得るが、熟練した血液学者による評価の必要性、観察者による変動および形態学だけに基づいて全ての前駆細胞を識別できないことによって制限される。

骨髄生検は、細胞生成速度の評価について貴重な基準である。熟練した臨床医の必要性、読み手の変動および形態学だけによる感度の欠如の制限に加えて、この技術はまた、費用、患者の不快感および病院に長期間通院する必要性によって限定される。従って、患者における造血速度を測定するための、信頼性のある迅速な手段が必要とされる。

造血と疾患プロセスの多様性との間の関係に加えて、心臓血管性疾患、炎症、自己免疫疾患およびリウマチ様疾患感染性疾患移植拒絶、癌および悪性腫瘍、ならびに内分泌疾患のような広範なクラスを含む広範な疾患プロセスにおいて、白血球(例えば、Tリンパ球およびBリンパ球単球および顆粒球(好中球を含む))の役割を指示する多数の文献が存在する。例えば、アロテーム性動脈硬化症再狭窄移植血管病変(transplant vasculopathy)および急性冠状症候群のような疾患を一般に生じるような多くの心臓血管性疾患は、全て重大なT細胞の関与を実証する(非特許文献1〜3)。これらの疾患は、慢性炎症性障害兆候として現在認識され、動脈系図(arterial tree)における傷害プロセスに対して継続応答を生じる(Rossら(1999)Ann Thorac Surg 67:1428−33)。リンパ球、単球および好中球の遺伝子およびそれらの生成物差示的発現は、文献において明確に実証されている。特に興味深いのは、免疫系の循環細胞における差示的発現の例示であり、これは、他の炎症性疾患または例えば、静止状疾患よりむしろ不安定なアンギナに一般的に関連するのとは対照的に、特定の疾患(例えば、アロテーム性動脈硬化症)についての特異性を実証する。

多くの個々の遺伝子、例えば、CD11b/CD18(Kassirerら(1999)Am Heart J 138:555−9);白血球エラスターゼ(Amaroら(1995)Eur Heart J 16:615−22;およびCD40L(Aukrustら(1999)Circulation 100:614−20)は、種々の血管疾患マーカーとしてのある程度の感度および特異性を実証する。さらに、種々のインビトロの実例において操作された単球の精製された集団から単離された、差示的に発現された標的遺伝子およびフィンガープリント遺伝子の同定は、心臓血管疾患の範囲を診断およびモニタリングするために提案されている(例えば、Falbに対する米国特許番号第6,048,709号;同第6,087,477号;同第6,099,823号;および同第6,124,433号「COMPOSITIONS AND METHODS FOR THETREATMNTAND DIAGNOSIS OF CARDIOVASCULAR DISEASE」(WO 97/30065もまた参照のこと)を参照のこと)。Lockhart,米国特許番号第6,033,860号「EXPRESSION PROFILES IN ADULTANDFETAL ORGANS」は、組織サンプルにおける同定された遺伝子のセブセットについての発現プロファイルの使用、および薬物効果のモニタリングを提案する。

疾患の診断、予後、およびモニタリングのための発現プロフィルに基づく技術の精度は、もし問題の疾患に対してある程度の特異性をそれぞれ有する数多くの差次的発現ヌクレオチド配列が、協調した様式で同定およびアッセイされ得る場合、激的に高まる。診断用途に多数の遺伝子(遺伝子セット)の発現を用いることは、アッセイおよび集団のばらつきの克服を助ける。WohlgemuthのPCT出願WO 02/057414「LEUKOCYTE EXPRESSION PROFILING」は、差次的発現ヌクレオチドのセットを同定している。

この改善された正確性を達成するために、一旦同定されたヌクレオチド配列のセットは、疾患の診断、予後およびモニタリングにとって最も有用な所定のセットにおいて差示的に発現されたヌクレオチドを同定するために変動される必要がある。本発明は、これらおよび他の必要性を説明し、かつ移植拒絶および末梢血の遺伝子、または他のヌクレオチド配列の差示的な調節が示され得る造血速度の決定に適用される。

概要

患者における移植拒絶、特に、心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法を提供することを、本発明の課題とする。上記課題は、患者における1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出することにより、患者における移植拒絶、特に、心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法を提供することによって解決された。移植拒絶、特に心臓移植拒絶を診断またはモニタリングするための診断オリゴヌクレオチド、およびこれらを含むキットまたはシステムもまた記載される。1つの実施形態において、個体の免疫状態を評価する方法であって、該個体における造血速度またはそれらの変異経路に沿った造血細胞の分布に依存して異なったレベルで発現される1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する、方法が提供される。なし

目的

発現プロファイリング技術を用いた疾患の研究にとって、そして診断技術の開発および治療標的の同定にとって、血液が非常に魅力的な基質を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

明細書に記載のインビトロでの方法。

技術分野

0001

(関連出願)
本発明は、米国仮特許出願第10/131,831号(2002年4月24日出願)および同第10/325,899号(2002年12月20日出願)の優先権を主張する。

背景技術

0002

(発明の分野)
この出願は、臓器移植後発現プロファイリングの分野にある。

0003

(発明の背景
疾患の診断、予後、重症度分類、および治療における現在の欠点の多くに対して、疾患の基礎を成す分子機構の同定、ならびに疾患状態の発生または進行を発現パターンにより予測するか、または特定の治療的介入に対する患者の反応を予測するヌクレオチド配列(またはヌクレオチド配列の集合)の発見を介して、取り組みがなされ得る。特に、容易にアクセス可能細胞および組織からの、予測値によるヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列集合の同定は、非常に価値がある。例えば、末梢血は、全ての患者から得られ得、そして低コストかつ多くの時点で容易に採取することができる。このことは、容易に入手できないか、もしくは侵襲的で有害な手順を介してのみ入手可能な大部分の他の細胞型および組織型に対して、望ましい対照である。また、所望する場合、遺伝子発現分析に先立って血液試料中の多くの細胞型を容易に分離し得るため、循環血液中に存在する種々の細胞型は、発現プロファイリング実験にとって理想的である。発現プロファイリング技術を用いた疾患の研究にとって、そして診断技術の開発および治療標的の同定にとって、血液が非常に魅力的基質を提供する一方で、血液試料中の発現プロファイリングの値は、それらの細胞型における遺伝子発現の変化が、疾患に対する予兆、ならびに疾患の病因および進行に関連する程度に依存する。

0004

造血は、血液の全ての細胞型の発生および成熟である。これらとしては、赤血球血小板および白血球が挙げられる。白血球は、さらに、顆粒球好中球好酸球好塩基球)および単核細胞モノイトリンパ球)に分類される。これらの細胞は、循環プールを満たすため、そしてこの系の損傷およびチャレンジ応答するために前駆細胞から発生および成熟される。これは骨髄脾臓胸腺肝臓リンパ節粘膜結合リンパ組織(MALT)および末梢血において生じる。

0005

前駆細胞は、各系統未成熟形態に分化し、そしてこれらの未成熟細胞は、成熟細胞にさらに発達する。このプロセスは、造血成長因子の影響および指向下で生じる。造血が刺激される場合、末梢血には多くの未成熟な細胞が存在し、いくつかの場合、前駆細胞は増加した頻度で見出される。例えば、CD34+細胞(造血幹細胞)は、免疫系に対する損傷を有する末梢血において頻度が増加し得る。好中球については、「バンド」形状が増加し、赤血球については、網状赤血球、または有核赤血球が認められる。リンパ球は、リンパ芽球(未成熟リンパ球)に先行する。

0006

種々の系統の赤血球の生成速度を測定することは、重要な臨床目的であり得る。種々の血球の生成に関連する造血障害は、薬理学的に処置され得る。例えば、貧血(低赤血球)は、エリスロポイエチン(造血増殖因子)で処置され得、そしてこの治療に対する応答は、RBC生成速度を測定することによって評価され得る。低好中球数は、G−CSF投与によって処置され得、そしてこの治療は、好中球生成速度を測定することによってモニタリングされ得る。あるいは、赤血球障害の診断は、系統特異的生成速度の決定によって非常に促進される。例えば、貧血(低RBC)は、減少された細胞生成または増加した細胞の破壊によって引き起こされ得る。後者の場合、細胞生成速度は、減少されるよりもむしろ増加され、そして治療の影響は非常に異なる。赤血球生成速度の測定の臨床的用途のさらなる議論を、以下にする。

0007

赤血球生成速度の評価は、診断および非血液病障害について有用であり得る。特に、急性同種移植拒絶の診断およびモニタリングは、このようなアプローチにより有益であり得る。急性同種移植拒絶の現在の診断およびモニタリングは、侵襲性同種移植生検および生検病歴の評価によって達成される。このアプローチは、患者の手順の経費費用疼痛および不快感熟練した臨床医の必要性、手順の合併症の危険性、免疫系機能に対する洞察力欠如、ならびに病理学的評価の変動に起因して、最適とは言えない。さらに、生検は、同種移植片に重大な細胞侵襲が生じた後にのみ、急性同種拒絶を診断し得る。この時点で、このプロセスはすでに、同種移植に損傷を引き起こしている。これらの全ての理由のために、プロセスにおける初期段階での急性拒絶を診断およびモニタリングし得る単純な血液試験が必要とされる。同種拒絶は、免疫系の機能細胞の存在に依存する。さらに、拒絶のプロセスは造血の活性化を引き起こし得る。最後に、急性拒絶を処置または予防するのに効果的な免疫抑制治療は、造血を抑制し得る。これらの理由のために、造血細胞生成速度の評価は、急性拒絶の診断およびモニタリングにおいて有用であり得る。

0008

細胞の発達および生成速度を測定する現在の技術は不適切である。最も一般的なアプローチは、長期にわたって目的の系統の成熟細胞の数を測定するものである。例えば、患者が貧血(低赤血球数)について処置されている場合、臨床医は血球数を測定して循環の赤血球(RBC)数を評価する。これが効果的であるために、臨床医は長期にわたって細胞数を測定しなければならず、そして治療に対する応答を評価できるまで2〜4週間待たなければならない。同じ制限が、血液の全ての細胞系統の評価に当てはまる

0009

代替的なアプローチは、顕微鏡下でこれらの細胞を計数することによって末梢血における未成熟細胞数を計数することである。これは、細胞生成速度のより迅速な評価を可能にし得るが、熟練した血液学者による評価の必要性、観察者による変動および形態学だけに基づいて全ての前駆細胞を識別できないことによって制限される。

0010

骨髄生検は、細胞生成速度の評価について貴重な基準である。熟練した臨床医の必要性、読み手の変動および形態学だけによる感度の欠如の制限に加えて、この技術はまた、費用、患者の不快感および病院に長期間通院する必要性によって限定される。従って、患者における造血速度を測定するための、信頼性のある迅速な手段が必要とされる。

0011

造血と疾患プロセスの多様性との間の関係に加えて、心臓血管性疾患、炎症、自己免疫疾患およびリウマチ様疾患感染性疾患移植拒絶、癌および悪性腫瘍、ならびに内分泌疾患のような広範なクラスを含む広範な疾患プロセスにおいて、白血球(例えば、Tリンパ球およびBリンパ球単球および顆粒球(好中球を含む))の役割を指示する多数の文献が存在する。例えば、アロテーム性動脈硬化症再狭窄移植血管病変(transplant vasculopathy)および急性冠状症候群のような疾患を一般に生じるような多くの心臓血管性疾患は、全て重大なT細胞の関与を実証する(非特許文献1〜3)。これらの疾患は、慢性炎症性障害兆候として現在認識され、動脈系図(arterial tree)における傷害プロセスに対して継続応答を生じる(Rossら(1999)Ann Thorac Surg 67:1428−33)。リンパ球、単球および好中球の遺伝子およびそれらの生成物差示的発現は、文献において明確に実証されている。特に興味深いのは、免疫系の循環細胞における差示的発現の例示であり、これは、他の炎症性疾患または例えば、静止状疾患よりむしろ不安定なアンギナに一般的に関連するのとは対照的に、特定の疾患(例えば、アロテーム性動脈硬化症)についての特異性を実証する。

0012

多くの個々の遺伝子、例えば、CD11b/CD18(Kassirerら(1999)Am Heart J 138:555−9);白血球エラスターゼ(Amaroら(1995)Eur Heart J 16:615−22;およびCD40L(Aukrustら(1999)Circulation 100:614−20)は、種々の血管疾患マーカーとしてのある程度の感度および特異性を実証する。さらに、種々のインビトロの実例において操作された単球の精製された集団から単離された、差示的に発現された標的遺伝子およびフィンガープリント遺伝子の同定は、心臓血管疾患の範囲を診断およびモニタリングするために提案されている(例えば、Falbに対する米国特許番号第6,048,709号;同第6,087,477号;同第6,099,823号;および同第6,124,433号「COMPOSITIONS AND METHODS FOR THETREATMNTAND DIAGNOSIS OF CARDIOVASCULAR DISEASE」(WO 97/30065もまた参照のこと)を参照のこと)。Lockhart,米国特許番号第6,033,860号「EXPRESSION PROFILES IN ADULTANDFETAL ORGANS」は、組織サンプルにおける同定された遺伝子のセブセットについての発現プロファイルの使用、および薬物効果のモニタリングを提案する。

0013

疾患の診断、予後、およびモニタリングのための発現プロフィルに基づく技術の精度は、もし問題の疾患に対してある程度の特異性をそれぞれ有する数多くの差次的発現ヌクレオチド配列が、協調した様式で同定およびアッセイされ得る場合、激的に高まる。診断用途に多数の遺伝子(遺伝子セット)の発現を用いることは、アッセイおよび集団のばらつきの克服を助ける。WohlgemuthのPCT出願WO 02/057414「LEUKOCYTE EXPRESSION PROFILING」は、差次的発現ヌクレオチドのセットを同定している。

0014

この改善された正確性を達成するために、一旦同定されたヌクレオチド配列のセットは、疾患の診断、予後およびモニタリングにとって最も有用な所定のセットにおいて差示的に発現されたヌクレオチドを同定するために変動される必要がある。本発明は、これらおよび他の必要性を説明し、かつ移植拒絶および末梢血の遺伝子、または他のヌクレオチド配列の差示的な調節が示され得る造血速度の決定に適用される。

先行技術

0015

Smith−Norowitzら(1999)Clin Immunol 93:168−175
Judeら(1994)Circulation 90:1662−8
Belchら(1997)Circulation 95:2027−31

課題を解決するための手段

0016

本発明は、例えば、以下を提供する:
項目1)
個体の免疫状態を評価する方法であって、該個体における造血速度またはそれらの変異経路に沿った造血細胞の分布に依存して異なったレベルで発現される1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する、方法。
(項目2)
請求項1に記載の方法であって、前記1つ以上の遺伝子が、以下:












からなる群より選択されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチドを含む、方法。
(項目3)
前記発現レベルが、前記1つ以上の遺伝子によって発現されるRNAレベルを測定することによって決定される、請求項2に記載の方法。
(項目4)
前記RNAレベルをPCRによって検出する、請求項3に記載の方法。
(項目5)
前記RNAレベルが、ハイブリダイゼーションによって検出される、請求項3に記載の方法。
(項目6)
前記発現レベルが、前記1つ以上の遺伝子によって発現される1つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、請求項1に記載の方法。
(項目7)
個体における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、造血速度を検出する工程を包含する、方法。
(項目8)
前記検出が、個体に直接適用される、請求項7に記載の方法。
(項目9)
前記検出が、個体から単離されたサンプルに適用される、請求項7に記載の方法。
(項目10)
請求項7に記載の方法であって、前記検出が、RNAプロファイリングアッセイ、イムノアッセイ蛍光活性細胞ソーティング、タンパク質アッセイ、MRI画像化、骨髄吸引、および核画像化からなる群より選択される、方法。
(項目11)
前記RNAプロファイルアッセイが、PCRベースのアッセイである、請求項10に記載
の方法。
(項目12)
前記RNAプロファイルアッセイが、ハイブリダイゼーションベースのアッセイである、請求項10に記載の方法。
(項目13)
請求項10に記載の方法であって、前記RNAプロファイルアッセイが、前記個体における1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程をさらに包含し、ここで、該1つ以上の遺伝子が、以下:
















からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
(項目14)
請求項7に記載の方法であって、前記移植拒絶が、心臓移植拒絶腎臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、膵島移植拒絶、移植拒絶、骨髄移植拒絶、幹細胞移植拒絶、異種移植片拒絶、および機械器官置換拒絶からなる群より選択される、方法。
(項目15)
請求項7に記載の方法であって、前記移植拒絶が、心臓移植である、方法。
(項目16)
請求項7に記載の方法であって、前記移植拒絶が、肝臓移植である、方法。
(項目17)
請求項7に記載の方法であって、前記移植拒絶が、腎臓移植である、方法。
(項目18)
請求項7に記載の方法であって、前記移植拒絶が、骨髄移植である、方法。
(項目19)
請求項7に記載の方法であって、前記移植拒絶が、膵島移植である、方法。
(項目20)
請求項7に記載の方法であって、前記移植拒絶が、幹細胞移植である、方法。
(項目21)
個体における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、造血速度またはそれらの変異経路に沿った造血細胞の分布を検出する工程を包含し、ここで、該検出が、RNAプロファイリングアッセイ、イムノアッセイ、蛍光活性細胞ソーティング、タンパク質アッセイ、MRI画像化、骨髄吸引、および核画像化からなる群より選択される、方法。
(項目22)
前記RNAプロファイルアッセイが、PCRベースのアッセイである、請求項21に記載の方法。
(項目23)
前記RNAプロファイルアッセイが、ハイブリダイゼーションベースのアッセイである、請求項21に記載の方法。
(項目24)
請求項21に記載の方法であって、前記RNAプロファイルアッセイが、前記個体における1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程をさらに包含し、ここで、該1つ以上の遺伝子が、以下:
















からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
(項目25)
請求項21に記載の方法であって、前記移植拒絶が、心臓移植拒絶、腎臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、膵島移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植拒絶、幹細胞移植拒絶、異種移植片拒絶、および機械的器官置換拒絶からなる群より選択される、方法。
(項目26)
請求項21に記載の方法であって、前記移植拒絶が、心臓移植である、方法。
(項目27)
請求項21に記載の方法であって、前記移植拒絶が、肝臓移植である、方法。
(項目28)
請求項21に記載の方法であって、前記移植拒絶が、腎臓移植である、方法。
(項目29)
請求項21に記載の方法であって、前記移植拒絶が、骨髄移植である、方法。
(項目30)
請求項21に記載の方法であって、前記移植拒絶が、膵島移植である、方法。
(項目31)
請求項21に記載の方法であって、前記移植拒絶が、幹細胞移植である、方法。
(項目32)
患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、該患者における1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする工程を包含し、ここで、該1つ以上の遺伝子が、以下:












からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
(項目33)
請求項32に記載の方法であって、前記患者において1つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする工程をさらに包含し、ここで、該1つ以上のさらなる遺伝子が、以下:




からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
(項目34)
患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、前記患者において1つ以上の発現レベルを検出して、該患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする工程を包含し、ここで、該1つ以上の遺伝子が、配列番号36、87、94、107、お
よび91からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
(項目35)
請求項34に記載の方法であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号36である、方法。
(項目36)
請求項34に記載の方法であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号87である、方法。
(項目37)
請求項34に記載の方法であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号94である、方法。
(項目38)
請求項34に記載の方法であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号107である、方法。
(項目39)
請求項34に記載の方法であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号91である、方法。
(項目40)
患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、該患者における1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする工程を包含し、ここで、該1つ以上の遺伝子が、以下:








からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
(項目41)
請求項40に記載の方法であって、前記患者において1つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする工程をさらに包含し、ここで、該1つ以上のさらなる遺伝子が、以下:




からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
(項目42)
患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、該患者における1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における腎臓移植拒絶を診断またはモ
タリングする工程を包含し、ここで、該1つ以上の遺伝子が、以下:
















からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
(項目43)
請求項42に記載の方法であって、前記患者において1つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングする工程をさらに包含し、ここで、該1つ以上のさらなる遺伝子が、以下:




からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
(項目44)
請求項32に記載の方法であって、前記遺伝子の少なくとも2個の発現レベルを検出する工程を包含する、方法。
(項目45)
請求項32に記載の方法であって、前記遺伝子の少なくとも10個の発現レベルを検出する工程を包含する、方法。
(項目46)
請求項32に記載の方法であって、前記遺伝子の少なくとも100個の発現レベルを検出する工程を包含する、方法。
(項目47)
請求項32に記載の方法であって、前記遺伝子の全ての発現レベルを検出する工程を包含する、方法。
(項目48)
請求項32に記載の方法であって、前記移植拒絶が、心臓移植拒絶、腎臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、膵島移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植拒絶、幹細胞移植拒絶、異種移植片拒絶、および機械的器官置換拒絶からなる群より選択される、方法。
(項目49)
請求項32に記載の方法であって、前記移植拒絶が、心臓移植拒絶である、方法。
(項目50)
請求項32に記載の方法であって、前記移植拒絶が、肝臓移植拒絶である、方法。
(項目51)
請求項32に記載の方法であって、前記移植拒絶が、腎臓移植拒絶である、方法。
(項目52)
請求項32に記載の方法であって、前記移植拒絶が、骨髄移植拒絶である、方法。
(項目53)
請求項32に記載の方法であって、前記移植拒絶が、膵島移植拒絶である、方法。
(項目54)
請求項32に記載の方法であって、前記移植拒絶が、幹細胞移植拒絶である、方法。
(項目55)
請求項32に記載の方法であって、前記発現レベルが、前記1つ以上の遺伝子によって発現されるRNAレベルを測定することによって決定される、方法。
(項目56)
請求項55に記載の方法であって、前記1つ以上の遺伝子によって発現される前記RNAレベルを検出する前に、前記患者からRNAを単離する工程をさらに包含する、方法。
(項目57)
請求項55に記載の方法であって、前記RNAレベルが、PCRによって検出される、方法。
(項目58)
請求項57に記載の方法であって、前記PCRが、以下:
































からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるプライマーを使用する、方法。
(項目59)
請求項58に記載の方法であって、前記PCRが、以下:
















からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる対応するプローブを使用する、方法。
(項目60)
請求項55に記載の方法であって、前記RNAレベルが、ハイブリダイゼーションによって検出される、方法。
(項目61)
請求項55に記載の方法であって、前記RNAレベルが、オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって検出される、方法。
(項目62)
請求項61に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、以下:












からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、方法。
(項目63)
請求項61に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが、DNA、RNA、cDNA、PNA、ゲノムDNA、または合成オリゴヌクレオチドを含む、方法。
(項目64)
請求項32に記載の方法であって、前記発現レベルが、前記1つ以上の遺伝子によって発現される1つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、方法。
(項目65)
請求項64に記載の方法であって、前記1つ以上のタンパク質が、以下:












からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
(項目66)
請求項33に記載の方法であって、前記1つ以上の遺伝子の前記発現レベルが、該1つ以上の遺伝子によって発現される1つ以上のタンパク質を測定することによって検出され、そして前記1つ以上のさらなる遺伝子の前記発現レベルが、該1つ以上のさらなる遺伝子によって発現される1つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、方法。
(項目67)
請求項66に記載の方法であって、前記1つ以上の遺伝子によって発現される前記1つ以上のタンパク質が、以下:












からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、そして前記1つ以上のさらなる遺伝子によって発現される前記1つ以上のタンパク質が、以下:




からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
(項目68)
請求項40に記載の方法であって、前記発現レベルが、前記1つ以上の遺伝子によって発現される1つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、方法。
(項目69)
請求項68に記載の方法であって、前記1つ以上のタンパク質が、以下:








からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
(項目70)
請求項41に記載の方法であって、前記1つ以上の遺伝子の前記発現レベルが、該1つ以上の遺伝子によって発現される1つ以上のタンパク質を測定することによって検出され、そして前記1つ以上のさらなる遺伝子の前記発現レベルが、該1つ以上のさらなる遺伝子
によって発現される1つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、方法。
(項目71)
請求項70に記載の方法であって、前記1つ以上の遺伝子によって発現される前記1つ以上のタンパク質が、以下:








からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、そして前記1つ以上のさらなる遺伝子によって発現される前記1つ以上のタンパク質が、以下:




からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
(項目72)
請求項42に記載の方法であって、前記発現レベルが、前記1つ以上の遺伝子によってコードされる1つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、方法。
(項目73)
請求項72に記載の方法であって、前記1つ以上のタンパク質が、以下:








からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
(項目74)
請求項43に記載の方法であって、前記1つ以上の遺伝子の前記発現レベルが、該1つ以上の遺伝子によって発現される1つ以上のタンパク質を測定することによって検出され、そして前記1つ以上のさらなる遺伝子の前記発現レベルが、該1つ以上のさらなる遺伝子によって発現される1つ以上のタンパク質を測定することによって検出される、方法。
(項目75)
請求項74に記載の方法であって、前記1つ以上の遺伝子によって発現される前記1つ以上のタンパク質が、以下:








からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、そして前記1つ以上のさらなる遺伝子によって発現される前記1つ以上のタンパク質が、以下:




からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
(項目76)
請求項64に記載の方法であって、前記測定が、血清を測定する工程を包含する、方法。
(項目77)
請求項64に記載の方法であって、前記タンパク質が、細胞表面タンパク質である、方法。
(項目78)
請求項64に記載の方法であって、前記測定が、蛍光活性細胞選別機を使用する工程を包含する、方法。
(項目79)
実質的に精製されたオリゴヌクレオチドであって、[配列番号X+Y−新規遺伝子配列+文献配列]からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、オリゴヌクレオチド。
(項目80)
実質的に精製されたオリゴヌクレオチドであって、以下[これらが正しい配列であることを確実にするためにチェックする]:








からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、オリゴヌクレオチド。
(項目81)
請求項79に記載のオリゴヌクレオチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド。
(項目82)
請求項80に記載のオリゴヌクレオチドに対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド。
(項目83)
請求項79に記載のオリゴヌクレオチドに対して高いストリンジェンシーハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド。
(項目84)
請求項80に記載のオリゴヌクレオチドに対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド。
(項目85)
請求項79に記載の診断オリゴヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が、DNA、cDNA、PNA、ゲノムDNA、または合成オリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
(項目86)
請求項32に記載の方法であって、検出される前記発現レベルが、患者の体液中の発現レベルである、方法。
(項目87)
請求項86に記載の方法であって、前記体液が、末梢血である、方法。
(項目88)
患者において移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、該患者における4つ以上の遺伝子の発現レベルを検出して、該患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする工程を包含し、ここで、該4つ以上の遺伝子が、以下:












からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
(項目89)
患者において腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法であって、該患者の体液中の1つ以上のタンパク質を検出して、該患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする工程を包含し、ここで、該1つ以上の遺伝子が、以下:




からなる群より選択されるタンパク質配列を含む、方法。
(項目90)
少なくとも2つの単離されたポリヌクレオチドを含む体液中の遺伝子発現を検出するためのシステムであって、ここで、該単離されたポリヌクレオチドが、遺伝子の発現を検出し、ここで、該遺伝子が、以下:












からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、そして該遺伝子が、移植される器官を拒絶しない個体における白血球中の遺伝子の発現と比較して、移植される器官を拒絶する個体中の体液で差示的に発現される、システム。
(項目91)
少なくとも2つの単離されたポリヌクレオチドを含む体液中の遺伝子発現を検出するためのシステムであって、ここで、該単離されたポリヌクレオチドが、遺伝子の発現を検出し、ここで、該遺伝子が、以下:












からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、そして該遺伝子の発現が、造血速度またはそれらの変異経路に沿った造血細胞の分布に関連する、システム。
(発明の要旨)
これらの要求に応えるために、本発明は、差示的な遺伝子発現を検出するためのシステムに関する。1つの形式において、方法によって、個体の成熟経路に沿う造血速度または造血細胞の分布に依存して異なるレベルで発現された1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程による個体の免疫状態の評価が提供される。1つ以上の遺伝子は、

0017

0018

0019

0020

から選択されたヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチドを含む。発現レベルは、1つ以上の遺伝子によって発現されたRNAレベルを測定することによって検出され得る。1つのバリエーションにおいて、このRNAレベルはPCRによって検出される。別のバリエーションにおいて、このRNAレベルは、ハイブリダイゼーションによって検出される。この発現レベルはまた、1つ以上の遺伝子によって発現された1つ以上のタンパク質を測定することによって検出され得る。

0021

本発明はさらに、造血速度の検出によって個体における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関する。この検出は、個体に直接適用され得るか、または個体から単離されたサンプルに適用され得る。検出は、RNAプロファイリングアッセイ、免疫アッセイ、蛍光活性化細胞ソーティング、タンパク質アッセイ、末梢血細胞学アッセイ、MRI画像化、骨髄吸引、および/または核画像化によって達成され得る。1つのバリエーションにおいて、RNAプロファイルアッセイはPCPベースのアッセイである。別のバリエーションにおいて、このRNAプロファイルアッセイは、ハイブリダイゼーションベースのアッセイである。このRNAプロファイルアッセイは、1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程をさらに包含し、ここで、1つ以上の遺伝子は、

0022

0023

0024

0025

から選択されたヌクレオチド配列を含む。移植拒絶としては、心臓移植拒絶、腎臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、膵臓小島移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植拒絶、幹細胞移植拒絶、異種移植拒絶および人工組織置換拒絶の1つ以上が挙げられ得る。

0026

別の局面において、本発明は、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者における1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出することによって患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、ここでこの1つ以上の遺伝子は、

0027

0028

0029

0030

から選択されるヌクレオチド配列を含む。1つにバリエーションにおいて、本発明はさらに、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、患者における1つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出することに関し、ここで、1つ以上のさらなる遺伝子は、

0031

0032

から選択されるヌクレオチド配列を含む。

0033

さらなるバリエーションにおいて、本発明は、患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者における1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出することによって患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、ここで、この1つ以上の遺伝子は、

0034

0035

0036

から選択されるヌクレオチド配列を含む。1つのバリエーションにおいて、この方法は、患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者における1つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含し、ここで、1つ以上のさらなる遺伝子は、

0037

0038

から選択されるヌクレオチド配列を含む。

0039

本発明はまた、患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者における1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出することによってこの患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、ここで、この1つ以上の遺伝子は、

0040

0041

0042

0043

から選択されるヌクレオチド配列を含む。1つのバリエーションにおいて、この方法はさらに、患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者における1つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含し、ここで、1つ以上のさらなる遺伝子は、

0044

0045

から選択されるヌクレオチド配列を含む。

0046

別の局面において、移植拒絶を診断またはモニタリングする方法は、少なくとも2つの遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。別のバリエーションにおいて、移植拒絶を診断またはモニタリングする方法は、少なくとも10個の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。さらなるバリエーションにおいて、移植拒絶を診断またはモニタリングする方法は、少なくとも100個の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。な
おさらなるバリエーションにおいて、移植拒絶を診断またはモニタリングする方法は、列挙された全ての遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。

0047

別のバリエーションにおいて、移植拒絶は、心臓移植拒絶、腎臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、膵臓小島移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植拒絶、幹細胞移植拒絶、異種移植拒絶および人工器官置換拒絶から選択され得る。

0048

別の局面において、移植拒絶を検出する方法は、1つ以上の遺伝子によって発現されるRNAレベルを測定することにより発現レベルを検出する工程を包含する。この方法はさらに、1つ以上の遺伝子によって発現されたRNAレベルを検出する前に、患者からRNAを単離する工程を包含する。

0049

1つのバリエーションにおいて、このRNAレベルはPCRによって検出される。なおさらなるバリエーションにおいて、このPCRは、

0050

0051

0052

0053

0054

0055

0056

からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるプライマーを使用する。あるいは、このPCRは、

0057

0058

0059

0060

0061

からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる対応するプローブを使用する。このRNAレベルは、このプローブへのハイブリダイゼーションによって検出され得る。さらなるバリエーションにおいて、このRNAレベルは、オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって検出される。オリゴヌクレオチドの例としては、

0062

0063

0064

0065

から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらなるバリエーションにおいて、このオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列SEQID NO:(配列番号)36を有する。さらなるバリエーションにおいて、このオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列SEQ ID NO:87を有する。なおさらなるバリエーションにおいて、このオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列SEQ ID NO:94を有する。さらなるバリエーションにおいて、このオリゴヌクレオチドは、SEQ ID
NO:91からなるヌクレオチド配列を有する。別のバリエーションにおいて、このオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:107からなるヌクレオチド配列を有する。
このオリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、cDNA、PNA、ゲノムDNA、または合成オリゴヌクレオチドであり得る。

0066

別の局面において、移植拒絶を検出する方法は、1つ以上の遺伝子によって発現される1つ以上のタンパク質を測定することによって発現レベルを検出する工程を包含する。1つのバリエーションにおいて、この1つ以上のタンパク質は、

0067

0068

0069

から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなるバリエーションにおいて、この方法は、

0070

0071

によって発現される1つ以上のさらなるタンパク質を検出する工程を包含する。なお別のバリエーションにおいて、1つ以上のタンパク質は、

0072

0073

0074

0075

から選択され得、そして1つ以上のタンパク質は、

0076

0077

から選択され得る。

0078

別の局面において、患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法は、患者における心臓移植拒絶を診断またはモニタリングするために、1つ以上の遺伝子によって発現される1つ以上のタンパク質を測定することによって、この患者における1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。1つ以上のタンパク質は、

0079

0080

0081

から選択されるアミノ酸配列を含み得る。あるいは、1つ以上の遺伝子の発現レベルは、1つ以上の遺伝子によって発現された1つ以上のタンパク質、および1つ以上のさらなる遺伝子によって発現された1つ以上のタンパク質を測定することによって検出され得る。1つのバリエーションにおいて、1つ以上の遺伝子によって発現されたこの1つ以上のタンパク質は、

0082

0083

0084

から選択されたアミノ酸配列を含み、そして1つ以上のさらなる遺伝子によって発現された1つ以上のタンパク質は、

0085

0086

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

0087

別の局面において、患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法は、この患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングするために、1つ以上の遺伝子によってコードされる1つ以上のタンパク質を測定することによって、患者における1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。1つのバリエーションにおいて、この1つ以上のタンパク質は、

0088

0089

0090

0091

から選択されるアミノ酸配列を含む。別のバリエーションにおいて、この方法は、1つ以上のさらなる遺伝子によって発現された1つ以上のタンパク質を測定することによって1つ以上のさらなる遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含する。1つ以上の遺伝子によって発現された1つ以上のタンパク質は、

0092

0093

0094

から選択されるアミノ酸配列を含み、そして1つ以上のさらなる遺伝子によって発現された1つ以上のタンパク質は、

0095

0096

から選択されたアミノ酸配列を含み得る。

0097

タンパク質検出は、血清を測定することによって達成され得る。別のバリエーションにおいて、タンパク質は、細胞表面タンパク質である。さらなるバリエーションにおいて、この測定は、蛍光活性化細胞ソーターを用いることを包含する。

0098

別の局面において、本発明は、

0099

0100

0101

0102

から選択されるヌクレオチド配列を有する実質的に精製されたオリゴヌクレオチド、SEQID NO:333−664から選択されるヌクレオチド配列を有する実質的に精製されたオリゴヌクレオチド、および

0103

0104

0105

0106

から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドに少なくとも90%配列同一性を有する実質的に精製されたオリゴヌクレオチドに関する。さらなる局面において、本発明は、

0107

0108

0109

0110

から選択されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドに、高ストリンジェンシーでハイブリダイズする実質的に精製されたオリゴヌクレオチドに関する。これらの配列は、移植拒絶および/または心臓移植拒絶のための診断的オリゴヌクレオチドとして使用され得る。このオリゴヌクレオチドは、DNA、cDNA、PNA、ゲノムDNA、または合成オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有し得る。

0111

別の局面において、本発明は、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、ここで、この患者の体液中の1つ以上の遺伝子の発現レベルが検出される。さらなるバリエーションにおいて、この体液は、末梢血である。

0112

別の局面において、本発明は、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、この方法は、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者における4つ以上の遺伝子の発現レベルを検出する工程を包含し、ここで、この4つ以上の遺伝子は、

0113

0114

0115

0116

から選択されるヌクレオチド配列を含む。

0117

別の局面において、この発明は、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングするために、この患者の体液中の1つ以上のタンパク質を検出することによって、この患者における腎臓移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、ここで、この1つ以上のタンパク質は、SEQID NO:76、SEQ ID NO:2663、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:2696、SEQ ID NO:2736、SEQ ID NO:2751、SEQ ID NO:2631、SEQ ID NO:2675、SEQ ID NO:2700、およびSEQ ID NO:2693から選択されるタンパク質配列を有する。

0118

さらなる局面において、本発明はまた、少なくとも2つの単離されたポリヌクレオチド
を含む、体液中の遺伝子発現を検出するためのシステムに関し、ここで単離されたポリヌクレオチドは遺伝子発現を検出し、この遺伝子は、SEQID NO.2,

0119

0120

0121

から選択されるヌクレオチド配列を含み、そして、この遺伝子は、移植された器官を拒絶しない個体の白血球における遺伝子発現と比較して、移植された器官が拒絶される個体の体液中で差示的に発現される。

0122

別の局面において、本発明は、少なくとも2つの単離されたポリヌクレオチドを含む、体液中の遺伝子発現を検出するためのシステムに関し、ここで、この単離されたポリヌクレオチドは、遺伝子の発現を検出し、ここで、この遺伝子は、

0123

0124

0125

0126

から選択されるヌクレオチド配列を含み、そしてこの遺伝子発現は、造血速度またはその成熟経路に沿う造血細胞の分布に関する。

0127

本発明はまた、SEQID NOS:3016−3117、SEQ ID NOS:3108−3117から選択されるヌクレオチド配列を含む1つ以上の遺伝子の発現レベルを検出することによって、患者における移植拒絶を診断またはモニタリングする方法に関し、この方法は、CMV感染の検出において有用である。

0128

配列表の簡単な説明)
配列番号1〜332は、同種移植片拒絶および他の障害の診断およびモニタリングのための遺伝子発現マーカーに対応する50マーオリゴヌクレオチドである。

0129

配列番号333〜664は、プローブ1〜332によって同定される遺伝子に対する参照mRNA配列である。

0130

配列番号665〜995は、遺伝子1〜332についての左方向PCRプライマーの第1のセットである。

0131

配列番号996−1326は、遺伝子1〜332についての右方向PCRプライマーの第1のセットである。

0132

配列番号1327−1657は、遺伝子1〜332についての第1のセットPCRプライマーに対するTaqmanプローブである。

0133

配列番号1658−1903は、選択された遺伝子1〜332についての左方向PCRプライマーの第2の代替のセットである。

0134

配列番号1904−2151は、選択された遺伝子1〜332についての右方向PCRプライマーの第2の代替のセットである。

0135

配列番号2152−2399は、選択された遺伝子1〜332についての第2の代替のセットPCRプライマーに対するTaqmanプローブである。

0136

配列番号2400−2626は、1〜332において同定される遺伝子由来mRNAによってコードされるタンパク質である。

0137

配列番号2627−2795は、図7ならびに表6および表8において、遺伝子を同定するために使用される50マーオリゴヌクレオチドアレイプローブである。

0138

配列番号2796−2924は、腎移植および拒絶において変化した発現を示す、表8中の遺伝子に対する参照mRNA配列である。

0139

配列番号2925−3015は、表8において変化した発現を示す遺伝子によってコードされるタンパク質である。

0140

配列番号3016−3081は、50マーオリゴヌクレオチドアレイプローブであり、実施例における遺伝子を同定するために使用される。

0141

配列番号3082−3107は、実施例において論じられる遺伝子およびプライマーである。

0142

配列番号3108−3117は、ヒト遺伝子由来のmRNAであり、ここで、調節はCMV感染の際に変化される。

0143

(表の簡単な説明)
表1:表1は、白血球プロファリングによる研究に対して感受性のある疾患または状態を列挙する。

0144

表2:移植マーカー
A.移植遺伝子:同種移植片拒絶のモニタリングに有用な遺伝子がここに列挙される。遺伝子記号および名称が与えられる。配列番号50マーは、遺伝子に特異的な50マーオリゴヌクレオチドの配列番号である。(Build 160、2003年2月16日)からのNCBI Unigene番号(HS)は、RNAまたはcDNAについて、(Genbank Release 135、2003年4月15日)からの受託番号として与えられ、遺伝子に対応するGenbank番号である。ACCによって同定される配列は、配列表(配列番号RNA/cDNA)にある。

0145

B.マイクロアレイデータ:配列番号50マー、遺伝子、遺伝子名称、ACCおよび配列番号RNA/cDNAは、A(上記)のように各遺伝子について与えられる。同定された各遺伝子は、データのノンパラメトリック分析から与えられるNRにおいてノンパラメトリックスコアおよび中間値ランクを有する。これらの遺伝子は、最高から最低へとランキングされる。ダウンレギュレートされた遺伝子は、この欄において1として記される。

0146

C.PCRプライマー:各遺伝子についてのリアルタイムPCRに対するプライマーおよびプローブは、それらの配列番号により与えられる。各遺伝子は、1または2セットの順方向および逆方向のPCRプライマーならびにTaqmanまたは類似のアッセイにおける検出のためのハリブリダイゼーションプローブを有する。

0147

D.PCRデータ:リアルタイムPCRデータをテキストに記載されるように、sybr緑色技術を使用して移植サンプルのセットに対して作成する。各遺伝子について、この分析に使用されるサンプル数(n)が与えられる。Fisher検定およびt−検定についてのオッズ比およびp値が与えられて、急性拒絶サンプルの比較が与えられる(テキストを参照のこと)。

0148

E.移植タンパク質:各遺伝子について、RefSeqデータベース(Genbank
Release 135、2003年4月18日)において対応するタンパク質は、配列表についてのそのタンパク質に対する配列番号により与えられる(RefSeqペプチド受託番号)。

0149

表3:アレイのためのウイルス遺伝子ウイルスゲノムを使用して、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドを設計した。使用されるウイルスゲノムについての受託番号は、オリゴヌクレオチド設計に使用される領域の遺伝子名および位置により与えられる。

0150

表4.心臓同種移植片拒絶の遺伝子発現マーカーの発見のための従属変数
安定なグレード0は、続く生検に対する拒絶を経験しない患者におけるグレード0生検である。HGまたは最高のグレードは、中心部の病理学者および局所的な病理学者からのより高い生検グレードを従属変数の決定に使用したことを意味する。

0151

表5.リアルタイムPCRアッセイレポーターおよびクエンチャー色素。レポーターおよびクエンチャー色素の種々の組み合わせは、リアルタイムPCRに有用である。レポーターおよびクエンチャー色素は、必要に応じて、前出に規定される特定の組み合わせで作動する。各レポーターについて、クエンチャー色素に対する適切な選択が与えられる。

0152

表6.拒絶マーカーPCRアッセイ結果
リアルタイムPCRアッセイの結果を、拒絶のないサンプルに対する拒絶サンプルの比較について列挙する。倍率変化は、各遺伝子拒絶および/または拒絶のないサンプルの発現について与えられる。拒絶クラスおよび拒絶のないクラスを比較するt−検定についてのp値が与えられる。

0153

表7.アレイ拒絶有意差分析のまとめの結果。マイクロアレイについての有意差分析(SAM)を使用する、急性拒絶に対する白血球遺伝子発現の相関分析についてのまとめの結果が与えられる。5つの分析を記載する。拒絶クラスおよび拒絶のないクラスを規定するために使用されたISHLTグレードが与えられる。各場合において、3つの病理学の読み取りからの最高のグレードを分析のために取った。全てのサンプルは2つの分析のために使用される。他の分析は、患者あたり1つのサンプルのみを使用することによる(「非冗長性」)か、または所定のクラス内の患者あたり1つのサンプルのみを使用することによる(「クラス内の非冗長性」)分析において使用される患者の冗長性を減少する。分析に使用されるサンプルの数が与えられて、達成される最低の検出率FDR)が記される。

0154

表8.腎臓組織拒絶アレイ有意差分析。コントロールに対して急性拒絶を有する腎臓組織に対するマイクロアレイを使用して、アップレギュレートされたと同定された遺伝子を列挙する。マイクロアレイについての有意差分析(SAM)を使用して、各遺伝子に対する偽検出率(FDR)を決定した。白血球において公知の発現を有する遺伝子を表に記す。

0155

表9.拒絶マーカー配列分析。表2に列挙される63個の同種移植片拒絶マーカーについて、遺伝子配列分析を実施した。これらの遺伝子およびタンパク質を受託番号によって同定する。各遺伝子の細胞局在化を、分泌された、核、ミトコンドリア細胞質または細胞膜のいずれかとして記載する。遺伝子の機能もまた、記載する。

0156

表10.種々の系統の未成熟細胞に対する遺伝子発現マーカーが、例として表10に与えられる。

0157

表11.造血速度の変化は、多くの疾患状態および他の病理学に相関している。このような状態の例を表11に列挙する。

0158

表12.この表は、CMV感染の診断およびモニタリングについての値を有すると同定
されたオリゴヌクレオチドおよび関連する遺伝子を列挙する。最初の列は、配列表のオリゴヌクレオチドに対応する配列番号を与える。unigene番号、Genbank受託番号およびGI番号もまた、公知の場合は各配列について与えられる。受託番号に関連する遺伝子名が、与えられる。この鎖は、−1または1として記され、これは、このプローブが配列(−1)の相補鎖から設計されたか、または配列(1)から直接設計されたことを意味する。次に、各プローブのヌクレオチド配列がまた、与えられる。各遺伝子について、実施例7に記載される有意差分析からの偽検出率(FDR)は、適用可能である場合に与えられる。WBCは白血球計数である。WPTは、移植後の週数である。

図面の簡単な説明

0159

図1は、新規なヌクレオチド配列のヌクレオチド配列および/または予測されるタンパク質配列の特徴についての模式的な指示セットを示す模式的なフローチャートである。
図2は、自動化RNA調製機の構成要素を示す。
図3は、グラフに示されたミニアレイに対する6つのハイブリダイゼーションの結果を示す(各列についてn=6)。エラーバーはSEMである。この実験は、AP調製RNAからの平均シグナルがCy3およびCy5の両方についてのGS調製RNAからの平均シグナルの47%であることを示す。
図4は、ミニアレイに上での9つの白血球特異的遺伝子の各々について、平均バックグランドを差し引いたシグナルを示す。この平均は、各遺伝子について3〜6個の上記のハイブリダイゼーションに対するものである。エラーバーは、SEMである。
図5は、多くの遺伝子についてのCy5シグナルに対するCy3の比を示す。正規化後、この比をハイブリダイゼーションの間の変数に対して補正し、異なる時間において実施した実験間の比較を可能にする。この比は、Cy5バックグランドを差し引いたシグナルでCy3バックグランドを差し引いたシグナルを除したものとして計算される。各バーは、3〜6のハイブリダイゼーションについての平均である。エラーバーはSEMである。
図6は、ミニアレイを使用するコントロールRNAについてのデータ中央値Cy3バックグランド減算シグナルを示す。
図7:心臓同種移植片拒絶診断遺伝子A.5つのマーカー遺伝子についての拒絶サンプル発現データおよび拒絶のないサンプル発現データの例。各サンプルについて、関連する拒絶グレードは、5つの差次的に発現される遺伝子についての発現比であることが示される。これらの遺伝子は、オリゴヌクレオチドに対する配列番号によって同定される。グレード0サンプルとグレード3Aサンプルとの間の平均倍率の差は、下部で計算される。B.CART分類モデル。心臓拒絶の診断のための3つの遺伝子分類モデルについての決定ツリー。第1のステップにおいて、遺伝子223の発現を使用して、患者を2つの枝に分ける。次いで、各枝の残りのサンプルを1つの残りの遺伝子によってさらに分ける。サンプルを拒絶または拒絶がないのいずれかとして分類する。1つの拒絶のないサンプルは、拒絶サンプルとして誤って分類される。C.CART分類モデルに対する代理物。実施例に記載されるCART拒絶モデルにおける3つのスプリッター遺伝子の各々について、CARTアルゴリズムによって同定された5つの上部代理遺伝子を列挙する。
図7:心臓同種移植片拒絶診断遺伝子A.5つのマーカー遺伝子についての拒絶サンプル発現データおよび拒絶のないサンプル発現データの例。各サンプルについて、関連する拒絶グレードは、5つの差次的に発現される遺伝子についての発現比であることが示される。これらの遺伝子は、オリゴヌクレオチドに対する配列番号によって同定される。グレード0サンプルとグレード3Aサンプルとの間の平均倍率の差は、下部で計算される。B.CART分類モデル。心臓拒絶の診断のための3つの遺伝子分類モデルについての決定ツリー。第1のステップにおいて、遺伝子223の発現を使用して、患者を2つの枝に分ける。次いで、各枝の残りのサンプルを1つの残りの遺伝子によってさらに分ける。サンプルを拒絶または拒絶がないのいずれかとして分類する。1つの拒絶のないサンプルは、拒絶サンプルとして誤って分類される。C.CART分類モデルに対する代理物。実施例に記載されるCART拒絶モデルにおける3つのスプリッター遺伝子の各々について、CARTアルゴリズムによって同定された5つの上部代理遺伝子を列挙する。
図8AリアルタイムPCRを使用するマイクロアレイを使用して発見された遺伝子の差次的発現の検証。複数のアッセイに対する各患者サンプルについてのCtをR50コントロールRNAにおけるCtと共に示す。三角形は、RT逆転写)コントロールを表す。
図8BリアルタイムPCRを使用するマイクロアレイを使用して発見された遺伝子の差次的発現の検証。グランザイムBの発現とアクチン参照との間の倍率の差をCMV疾患に罹患する患者および罹患していない患者由来の3サンプルについて示す。
PCRプライマーのエンドポイント試験。電気泳動およびミクロ流体学(microfluidics)を使用して、遺伝子特異的PCRプライマーの産物を評価する。β−GUS画像レーン3は、プライマーF178およびR242についての画像である。レーン2およびレーン1は、それぞれ非テンプレートコントロールおよびRTコントロールに対応する。β−GUSプライマーF178およびR242の電気泳動図ゲル画像からのレーン3のグラフ図。β−アクチンゲル画像。レーン3は、プライマーF75およびR178についての画像である。レーン2およびレーン1は、それぞれ非テンプレートコントロールおよびRTコントロールに対応する。β−アクチンプライマーF75およびR178の電気泳動図、ゲル画像からのレーン3のグラフ図。
図10:PCRプライマー効率試験出発RNA量のlogに対するCtの標準曲線を2つの遺伝子について示す。
図11:リアルタイムPCRコントロール遺伝子分析11の候補コントロール遺伝子を6つの全血サンプル(PAX)に対するリアルタイムPCRを使用して、同じ患者由来の6つの単核サンプル(CPT)と対で試験した。各サンプルを2回試験した。各遺伝子について、サンプル間での遺伝子の変動性垂直軸(上部グラフ)上に示す。各遺伝子についての平均Ct値もまた示す(下部グラフ)。2μgのRNAをPAXサンプルに対して使用し、0.5μgの総RNAを単核サンプル(CPT)に対して使用した。
図12確立されたマーカーとの同時発現による拒絶マーカーの発見マイクロアレイを使用して、240人の移植レシピエント由来のサンプル中の遺伝子配列番号85および遺伝子配列番号302の発現を測定した。各サンプルについて、遺伝子配列番号85についての発現測定値を遺伝子配列番号302に対してプロットする。
図13:拒絶の診断のための3−遺伝子PCRアッセイについてのROC(レシーバーオペレーター特性)曲線(例17を参照のこと)。各試験のカットオフについての感受性および擬陽性率を示す。

0160

(発明の詳細な説明)
(定義)
他に規定しない限り、すべての科学用語および技術用語を、それらの用語が関連する技術分野で慣用されている意味と同様の意味を有するものとして理解する。本発明の目的のために、以下の用語を下記のように定義する。

0161

本発明の脈絡の中では、用語「遺伝子発現系(gene expression system)」は、遺伝子発現を検出するための任意の系、装置(デバイス)、または手段のことを意味し、診断薬、候補ライブラリー・オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド・セット、またはプローブ等が含まれる。

0162

用語「モニタリング(monitoring)」は、本明細書では、個人または個人の健康もしくは疾患状態についての有用な状態を提供するために遺伝子セットを使用することの説明に用いられる。「モニタリング」として、予後の決定、重症度分類、薬物療法の選択、進行中の薬物療法の評価、結果の予測、治療に対する応答測定、疾患または疾患合併症、時間とともに疾患の進行を追うことまたは患者健康状態に関して任意の情報を提供すること、投薬が標識を持つ必要がない疾患の小さなサブユニットにとって重要であると思われる既知の作用分子機構である実験的治療から得られる利益を得そうな患者を選択すること、より侵襲的/高価な試験、例えば非侵襲的血液試験からより侵襲的なオプション(例えば生検)に至る検査カスケードを決定する手助けするために、患者集団スクリーニングすること、または別の適応症を治療するために用いられる薬物の副作用を評価する検査が挙げられる。

0163

用語「診断用オリゴヌクレオチド・セット(diagnostic oligonulceotide set)」は、2個以上のオリゴヌクレオチドからなるセットを意味し、差次的発現について評価した際に、それらのオリゴヌクレオチドに対応した遺伝子は、予測的データを集合的に生成する。そのような予測データは、概して診断、予後、治療結果のモニタリング等に関する。一般に、診断用オリゴヌクレオチド・セットの構成要素は、予測値を与えるDNA配列突然変異または多型よりはむしろ、診断用オリゴヌクレオチド・セットの構成要素の発現パターンであるという点で、疾患等の特定の形質または表現型と相関することから、個人の遺伝子型を直接決定するためにDNA分析によって評価されるオリゴヌクレオチド配列と区別される。診断用オリゴヌクレオチド・セットの特定の構成要素(または成分)が、場合によっては、種々の周知分析法(例えばサザンブロット法、RFLP、AFLPSSCP、およびSNP)のいずれかによる直接的な遺伝子タイピングに従う一つ以上の突然変異または多型を示すこともできると理解される。

0164

「疾患特異的標的オリゴヌクレオチド配列(disease specific target origonucleotide sequence)」 は、疾患または疾患群に対する治療標的であるポリぺプチド、最も一般的にはタンパク質、あるいは治療マ
ルチサブユニット・タンパク質の一サブユニットをコードする遺伝子または他のオリゴヌクレオチドである。

0165

「候補ライブラリー(candidate library)」または「候補オリゴヌクレオチド・ライブラリー(candidate oligonucleotide library)」は、一つ以上の基準によって特定の疾患または疾患群と関連している可能性が高い複数のオリゴヌクレオチド配列(または遺伝子配列)からなる集合を意味する。上記基準は、例えば、疾患状態での差次的発現パターンまたは科学的もしくは技術的文献で報告されたような生体外(in vitro)での活性化または休止している白血球での差次的発現パターン、配列データベースで報告されているような組織て特異的発現、あるいは目的とする組織もしくは細胞型での差次的発現である。一般に、候補ライブラリーは、少なくとも2つの成分または構成要素、より一般的にはライブラリーは、約10以上、または約100、または約1,000、またはそれ以上の成分または構成要素を有する。

0166

用語「疾患基準(disease criterion)」は、本明細書では疾患の指標を示すために用いられ、該指標として、例えば、診断因子予後因子、病歴または家族歴によって示される因子、遺伝的要因、または症候、同様に、上記リストから選択されるようないくつかの指標に関連した疾患の明白な、または確かな診断が挙げられる。疾患基準として、過去にさかのぼる健康データまたは将来の健康データ(例えば、患者の病歴、臨床検査結果診断試験結果、臨床イベント、投薬、リスト、治療に対する反応、および危険因子)を含む患者の健康状態を記述したデータが挙げられる。

0167

用語「分子署名(molecular signature)」または「発現プロフィル(expression profile)」は、候補ライブラリーを構成する複数の成分(例えば、少なくとも2、多くの場合約10、約100,約1,000、もしくはそれ以上)に対する発現値の集合を意味する。多くの場合、分子署名は、候補もしくは診断用ヌクレオチド配列または遺伝子のライブラリーまたはアレイのヌクレオチド配列全てに対する発現パターンを表す。あるいは、上記分子署名は、候補ライブラリーの1つ以上のサブセットの発現パターンを表す。用語「オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)」は、2つ以上のヌクレオチドを意味する。ヌクレオチドは、天然または合成のDNAまたはRNAであってもよい。

0168

本明細書で用いられる用語「健康な個人(healthy individual)」は、特定の疾患または疾患基準に関連している。すなわち、個人は特定の疾患基準を示すものではなく、また特定の疾患と診断されるものではない。問題となっている個人は、もちろん、症状を示すことができるか、もしくは別の疾患に対する種々の指標因子を持つことができることがわかるだろう。

0169

同様に、「疾患と診断された個人(individual diagnosed with a disease)」は、特定の疾患(または疾患基準)と診断された個人を意味する。そのような個人は、別の疾患(関連または非関連疾患)に関連した、または該疾患と診断された疾患基準も示す。

0170

「アレイ(array)」は、空間的または論理的に組織化された集まり、例えばオリゴヌクレオチドによってコードされたRNAまたはタンパク質等のオリゴヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列産物である。いくつかの実施形態では、アレイは候補ライブラリーの産物に特異的な抗体または他の結合試薬を含む。

0171

発現パターンに言及する場合、遺伝子発現での「質的(qualitative)」な
違いは、相対値割り当てられない違いを意味する。すなわち、そのような違いは、「全か無の(all or nothing)」の評価によって示される。そのような全か無の評価は、例えば発現が検出閾値を上回るか、または下まわるか(発現のオンオフ/パターン)であることができる。あるいは、質的違いは発現産物の異なる種類、例えば異なる対立遺伝子(突然変異または多形対立遺伝子等)および変異体配列変異体および翻訳後修飾変異体を含む)を意味する。

0172

一方、遺伝子発現のパターンについて言及する場合、「量的(quantitative)」違いは、段階的なスケールで値を割り当てることができる発現の違いを意味する(例えば、0〜5または1〜10スケール、+〜+++スケール、または1等級〜5等級スケール;説明のために選択される数が完全に任意なものであり、発明を制限するために解釈されるべきものではないと理解される)。

0173

(本発明の遺伝子発現システム
本発明は、配列表に示したオリゴヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を検出するヌクレオチド配列を持つ1つ以上のDNA分子を持つ遺伝子発現系による遺伝子発現の検出方法を目的とする。一態様では、オリゴヌクレオチドは、白血球で差次的発現する遺伝子の発現を検出する。上記遺伝子発現系は、候補ライブラリー、診断薬、診断用オリゴヌクレオチド・セット、または診断用プローブ・セットであってもよい。上記DNA分子分子は、ゲノムDNA、RNA、タンパク質核酸(PNA)、cDNA、または合成オリゴヌクレオチドであってもよい。本明細書で教示した処置に続いて、白血球での遺伝子発現を分析するために目的とする配列を同定することができる。そのような配列は疾患状態を予測することが可能である。

0174

(本発明の診断用オリゴヌクレオチド)
本発明は、相関が個人の健康状態とヌクレオチド配列に対応するRNAまたはタンパク質産物の個人での発現とのあいだに存在する、表2、表8および配列表に記した白血球候補ライブラリーの成分を含む診断用オリゴヌクレオチドおよび診断用オリゴヌクレオチド・セットに関する。場合によっては、そのような検出に必要なオリゴヌクレオチドは1つだけである。診断用オリゴヌクレオチド・セットの成分を、RNAまたはタンパク質産物の発現を検出することが可能な任意の手段によって同定することができ、該手段として、限定されるものではないが、差次的発現スクリーニング、PCR、RT−PCR、SAGE分析、高性能配列解読装置、マイクロアレイ、液体または他のアレイ、タンパク質をベースとした方法(例えば、ウェスタンブロット法プロテオミクス、および本明細書に記載した他の方法)、ならびに、本明細書でさらに記載されるように、データ・マイニング法が挙げられる。

0175

一実施形態では、診断用オリゴヌクレオチド・セットは、少なくとも1つの疾患基準なしで個人での発現に関連して少なくとも1つの白血球が関与する疾患に対する少なくとも1つの疾患基準で、個人の白血球で差次的に発現される表2、表8または配列表に記された少なくとも2つのオリゴヌクレオチド配列を含み、2つ以上のヌクレオチドの発現が、以下に述べるように、少なくとも1つの疾患基準と相関している。

0176

別の実施形態では、診断用オリゴヌクレオチド・セットは、差次的に発現され、かつ差次的発現/相関がこれまでは記述されていなかった表2または配列表に記されたオリゴヌクレオチド配列を有する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、診断用オリゴヌクレオチド・セットは、アレイ上に固定される。

0177

別の実施形態では、診断用ヌクレオチド(またはヌクレオチド・セット)は、表2、表8または配列表に記された白血球候補ライブラリーの成分に関連しており、それに対して
相関が個人の健康状態(または疾患基準)のあいだに存在する。診断用ヌクレオチドは、表2、表8、および配列表に記された候補ライブラリーの成分の完全長遺伝子配列(または予測された完全長遺伝子配列)に部分的または全体的に含まれる(または由来する)。いくつかの場合では、オリゴヌクレオチド配列は、EST、または染色体配列から設計され、これらは、公のデータベース由来である。これらの場合において、全長遺伝子配列は、知られていなくても良い。いくつかの場合での全長配列は、遺伝子予測アルゴリズムを使用して予測され得る。あるいは、全長が、クローニングにより決定され得、標準分子生物学的アプローチを使用する目的の配列を含む全長遺伝子または遺伝子の配列決定が、本明細書中に記載される。cDNAが公開データベースのどの配列とも一致しない、cDNAライブラリの発明者らの配列決定から設計されるオリゴヌクレオチドについても、同じことがいえる。

0178

上記診断用ヌクレオチドはまた、相関配列または完全長遺伝子と共発現する他の遺伝子に由来するものであってもよい。複数の遺伝子は、複数の発現パターンを共有することができる。なぜなら、それらは同一の分子経路で調節されるからである。発現に類似性があることから、行動遺伝子が診断用遺伝子セットにおける診断用遺伝子の代わりとなりうる点で、該行動遺伝子が代理物として同定される。実施例4は、上記データからの代理物の発見を明示する。代理配列表は、候補診断遺伝子の代理の配列を同定する。

0179

本明細書で使用されるように、用語「遺伝子クラスター」または「クラスター」は、発現パターンによって関連づけられた遺伝子からなる群を意味する。すなわち、遺伝子のクラスターは、異なる条件(例えば、移植片の非拒絶または移植片拒絶)でも同様の調節がなされた遺伝子からなる遺伝子クラスターである。1つのクラスター内の各々の遺伝子の発現プロファイルは、そのクラスター内の少なくとも1つの他の遺伝子の発現プロファイルと相関させるべきである。相関の評価は、種々の統計学的方法を用いておこなってもよい。この明細書で用いられるように、用語「代理物(surrogate)」は、診断分析で診断用遺伝子の代わりとして用いることが可能な発現プロファイルを持つ遺伝子を意味する。そのような遺伝子は、しばしば診断用遺伝子としての同一遺伝子クラスターのメンバーである。そのような診断用遺伝子セットの各成分に対して、以下に説明するような類似の発現パターンを持つ遺伝子の同定を介して、潜在的な代理物のセットを同定することができる。

0180

多くの統計解析は、相関係数を発生することで、2つの遺伝子発現パターン間の相関性を記述する。相関係数が0.8以上の場合、パターンは相関していると考えてもよい。好ましい実施形態では、相関係数は0.85、0.9、または0.95を超えなければならない。他の統計学的方法は、一定量の相互情報を生成して、2つの遺伝子発現パターン間の相関性を記述する。標準化相互情報値が0.7以上の場合、パターンは相関していると考えられる。好ましい実施形態では、標準化相互情報値は、0.8、0.9、または0.95を超えなければならない。パターンが遺伝子発現データ階層的クラスタリングに密接に集まる場合、該パターンも同様に考えることができる(Eisenら、1998)。類似パターンは、階層的クラスタリングで最も近い1、2、5、10、20、50、または100の隣り合うものの中にあるか、あるいは類似度(Eisenら、1998) が0.5、0.7、0.8、0.9、0.95、または0.99を上回る遺伝子である可能性がある。類似パターンを、CART(Brennanら、1994)による分類木の中で代理物であるとわかる遺伝子として同定することも可能である。しばしば、しかし常にではないが、遺伝子クラスターの成分は、類似の遺伝子発現パターンに加えて、類似の生物学的機能を持っている。

0181

本発明の診断用遺伝子に対して、相関している遺伝因子、クラスター、および代理物が同定されている。これらの代理物を、アッセイの際に、代理物として診断用遺伝子の代わ
りに、または該診断用遺伝子に加えて用いることが可能である。

0182

本発明も、診断用プローブ・セットを提供する。プローブが、限定されるものではないが、増幅DNA、増幅RNA、cDNA、合成オリゴヌクレオチド、部分的または完全長核酸配列を含む診断用ヌクレオチド・セットのヌクレオチド配列を特異的に同定することが可能な任意の試薬を含むものであると理解される。また、プローブは、診断ヌクレオチド配列のタンパク質産物(例えば、抗体および他の親和性試薬)を識別することが可能である。

0183

また、各々のプローブが1つの遺伝子に対応、複数のプローブが1つの遺伝子に対応、もしくはその両方、または1つのプローブが2つ以上のプローブに対応すると理解される。

0184

開示された核酸分子相同体と変異体とを本発明で用いてもよい。標準の方法を使用して整列配置する場合、これらの核酸分子の相同体および変異体は配列同一性が比較的高い。本発明に包含される配列は、本明細書で開示した配列に対して、配列同一性が少なくとも40〜50、50〜60、70〜80、80〜85、85〜90、90〜95、または95〜100%である。

0185

発現プロファイリングに関して、開示された配列での変異が依然として遺伝子発現の検出を可能とすることが理解される。遺伝子発現検出に求められる配列同一性の程度は、オリゴマーの長さに依存して変化する。60merでは、60mer中での6〜8のランダム突然変異または6〜8のランダム欠失は、遺伝子発現検出に影響を及ぼさない。Hughes, TR, et al. ”Expression profiling using microarrays fabricated by an ink jet
oligonucleotide synthesizer. Nature Biotechnology, 19:343−347(2001)。DNA配列の長さが増加するにつれて、まだ遺伝子発現検出が可能なあいだ、許容される突然変異数または欠失数が増加する。

0186

業者によって認められるように、本発明の配列はシーケンシングエラーを含む可能性がある。すなわち、誤ったヌクレオチド、フレームシフト未知のヌクレオチドまたはシーケンシング・エラーの他の型が配列のいずれかにある可能性がある。しかし、正しい配列は本明細書では相同体およびストリンジェンシーの定義に入る。

0187

ヒトゲノムでの特異的ハイブリダイゼーションのために必要なオリゴヌクレオチドプローブの最小長は、2通りの方法を使用して推定されることができる。第1の方法は、プローブが偶然にヒトゲノムにおいてユニークであるという統計議論を使用する。手短に言うと、複雑さCのゲノムで長さLのオリゴヌクレオチドに対して予想される独立完全一致(Po)の数は、以下の等式によって求めることができる(Laird CD, Chromosoma 32:378 (1971)。すなわち、
Po=(1/4)L * 2C
哺乳類ゲノムの場合、2C=〜3.6x109であり、14〜15ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドはゲノムで一度だけ見られると思われる。しかし、哺乳類のゲノムのコード配列中のヌクレオチドの配分は無作為でなく(Lathe, R. J. Mol. Biol. 183:1 (1985) )、より長いオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションの特異性の増加にとって好ましいと思われる。実際的な条件では、このことは長さが19〜40ヌクレオチドのプローブでうまくいく(Sambrook Jら、以下)。特異的プローブの長さを推定する第2の方法は、選択された条件下でハイブリダイズするのに十分な長さのプローブを用いることで、またその配列をサーチしてヒトゲノム
中の配列に一致させたり、ユニークな一致を選択するコンピュータを使用することである。プローブ配列は、Sambrookら、infraの第11章で記述されるように、所望のハイブリダイゼーション特性に基づいて選択される。プライマー3プログラムは、これらのプローブを設計することに役立つ((S. Rozen and H. Skaletsky 1996,1997; プライマー3コードはウェブサイト(genome.wi.mit.edu/genome software/other/プライマー3.html)で入手可能である。これらのプローブの配列は、BLASTまたはMEGABLASTのようなプログラムを使用しているヒトの正真正の配列のデータベースに対して、ペアワイズに比較される(Madden, T.L et al.(1996) Meth. Enzymol. 266:131−141)。大部分のヒト・ゲノムが現在データベースに含まれるので、一致する数が測定される。所望のターゲット配列に対してユニークであるプローブ配列が選択される。

0188

いくつかの実施形態では、診断用ヌクレオチドプローブセットは、アレイ上に固定される。このアレイは、任意に、一つ以上のチップ・アレイ、プレート・アレイ、ビーズ・アレイ、ピン・アレイ、膜アレイ固体表面アレイ、液体アレイ、オリゴヌクレオチド・アレイ、ポリヌクレオチド・アレイもしくはcDNAアレイマイクロタイター・プレート、ピン・アレイ、ビーズ・アレイ、膜、またはチップを含む。

0189

いくつかの実施形態では、上記白血球関連疾患は、表1に記された疾患から選択される。別の実施形態では、いくつかの実施形態では、上記疾患はアテローム性動脈硬化症または心臓同種移植片拒絶である。別の実施形態において、疾患は、うっ血性心不全、アンギナ、および心筋梗塞である。

0190

いくつかの実施形態で、本発明の診断用オリゴヌクレオチドは、疾患状態に関連していることがしられている遺伝子(「既知のマーカー」)と組み合わせて診断用遺伝子セットとして用いられる。既知のマーカーを診断用ヌクレオチドと組み合わせて用いることで、既知マーカー単独では得られない情報を提供することができる。既知マーカーとして、提供した従来の表によって同定されたものが挙げられる。

0191

(造血)
本発明はまた、本発明の診断用オリゴヌクレオチドを使用する造血速度の測定の方法およびモニタリングおよび移植拒絶反応の診断のための方法として、任意の方法による造血速度の方法に向けられる。前駆体細胞および未成熟細胞はしばしば、細胞特異的表現型マーカーを有する。これらは、未成熟の細胞または前駆体細胞において制限された様式で発現される遺伝子および/またはタンパク質である。この発現は、成熟と共に減少する。種々の系統の未成熟細胞についての遺伝子発現マーカーが、例として以下の表10に与えられる。

0192

(表10:)

0193

0194

末梢血液サンプル中のこれらの遺伝子および他の遺伝子のレベルを測定することにより、未成熟細胞または前駆体細胞の数および割合の評価が、行われ得る。赤血球および血小板におけるRNA定量が、特に使用される。これらの細胞は、その成熟形態において無核化される。発達の間、血小板を巨核球から切り取り、核なしの相補性的なRNAを採取する。RNAは、血小板により迅速に消費される。赤血球は、核のある細胞として開始するが、核は、成熟プロセスの最後に向かって押し出される。これらの細胞は、細胞の120日の寿命の最初の2日以内で迅速に消費される。

0195

これらの無核化細胞型について、遺伝子発現マーカーは、細胞株のみに対して特異的であり(未成熟形態に対しては特異的でなく)、細胞生成速度の測定に有用でなければならない。他の血液細胞型に対する系統に特異的な遺伝子は、RNAレベルについて測定される場合、細胞生成速度のマーカーとして働く。これは、RNAが、これらの場合に未成熟形態に対して特異的であるためである。例えば、ヘモグロビンは、赤血球に対して特異的であるが、ヘモグロビンRNAは、新たに産生された赤血球に特異的である。従って、赤血球の産生速度が増加する場合、系統特異的RNA(例えば、ヘモグロビン)のレベルもまた、増加される。

0196

造血成長因子およびサイトカインは、不完全な系統特異性を有する。G−CSFは、低い顆粒白血球数を患者に投与し、そしてその効果は、全ての系統(顆粒白血球、赤血球、血小板など)の刺激である。溶血性貧血は、複数の細胞系統の産生を増加するよう導くが、増大した需要における唯一の系統が、赤血球である。造血応答の特異性の欠如のために、赤血球および血小板産生速度が、リンパ球系統の増加した産生の代理物として働き得る。リンパ球系統のための代理物としてRBCおよび血小板産生速度を使用することは、これらの細胞における核の欠如および系統特異的RNAレベルを単純に測定することにより細胞産生速度を測定する容易さのために、有用であり得る。

0197

造血速度は、末梢血の遺伝子発現プロファイルを使用して測定され得る。RBCおよび血小板特異的遺伝子は、核の欠如および速度論のために、測定のための独特の機会を提供する。新しい細胞=抹消血中の細胞型由来の新しい/はるかに多くのRNA。未成熟リンパ球は、免疫活性化および免疫拒絶反応についてさらにより特異的であり得る。リンパ球前駆体の細胞特異的マーカーが、同定される(リンパ芽球としても知られる)。以下を参照のこと。顆粒白血球前駆体および巨核球のマーカーまたは任意の血液細胞の未成熟形態が、この点において有用であり得る。

0198

(造血速度を測定するための適用)
造血速度の変化が、多くの疾患状態および他の病理に関連付けられてきた。このような状態の例を、表11に列挙する。当業者は、他のこのような条件に気付く。さらに、本発明の1つの局面は、造血速度の変化の間の関連の同定である。従って、造血速度の測定に向けられる本発明の方法は、多くの疾患状態および他の病理の診断およびモニタリングに適用され得る。さらに、これらの方法は、患者のための適切な治療を決定するのに有益であり得る。

0199

0200

本発明の方法はまた、造血速度の変化に相関される疾患および他の病理の治療レジメンをモニタリングするのに有用である。さらに、この方法が使用されて、造血速度に影響する薬物での処置をモニタリングし得る。当業者は、多くのこのような薬剤を知っている。以下の薬剤は、このような例である。

0201

エリトロポイエチンは、減少した赤血球生成に起因する種々の貧血を処置するのに使用される成長因子である。遺伝子発現または他の手段による赤血球生成をモニタリングすることは、投薬を改善し得、そしてこの高価な薬剤を使用する治療への応答のより早い評価のための手順を提供する。

0202

neupogen(G−CSF)が、免疫抑制または化学療法に通常関する低い好中球量(好中球減少)の処置のために使用される。遺伝子発現試験または他の手段により好中球産生をモニタリングすることは、投薬、患者の選択、短縮された治療の持続時間を改善し得る。

0203

プレドニゾン/免疫抑制−免疫抑制の最も一般的な副作用の1つは、造血の抑制である。これは、あらゆる細胞系統で生じ得る。遺伝子発現モニタリングまたは造血速度の他の測定法が使用されて、特定の細胞株の血球減少について通常モニタリングし得、そして投薬を改変し、治療を改変し、または特定の造血成長因子を加えるためにその情報が使用され得る。以下の細胞数自体は、あまり感受性でなく、所定の投薬量延長された治験の必要性が生じ、その後効力および毒性が評価され得る。

0204

化学療法剤をモニタリングすると−ほとんどの化学療法剤は、いくらかまたは全ての系統について骨髄を抑制する。遺伝子発現試験または造血速度を評価する他の手段が使用されて、特定の細胞株における血球減少について通常モニタリングし得、そして情報を使用して投薬を改変し得、治療を改変し得、または特定の増殖成長因子を加え得る。

0205

(一般分子生物学レファレンス
本発明の文脈のなかで、核酸および/またはタンパク質は、周知の分子生物学的技術によって操作される。そのような数々の方法についての詳細なプロトコールは、例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology (2000年を通して増補) John Wiley & Sons, New York (”Ausubel”); Sambrook et al. Molecular Cloning − A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1−3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989(”Sambrook”),および Berger and Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques, MethodsinEnzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (”Berger”)に記載されている。

0206

上記レファレンスに加えて、例えば本発明のcDNAプローブの増幅に有用な生体外(in vitro)増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qレプリカーゼ増幅、および他のRNAポリメラーゼ媒介技術(例えば、NASBA)のRNAポリメラーゼのプロトコールは、Mullisら(1987)米国特許第4,683,202号; PCR Protocols A Guide to Methodsand Applications(Innisら編) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (”Inns”); Arnheim and Levinson (1990) C&EN 36; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81; Kwohら(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86,1173; Guatelliら(1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:1874; Lomellら(1989) J Clin Chem 35:1826; Landegrenら(1988) Science 241:1077; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291; Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560; Barringerら(1990) Gene 89:117, およびSooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13:563に見いだされる。本発明の文脈で核酸のクローニングに有用なさらなる方法として、Wal
lace et al.の米国特許第5,426,039号が挙げられる。PCRによる大きな核酸を増幅する改善された方法が、Cheng et al. (1994) Nature 369:684およびそこに挙げられたレファレンスにまとめられている。

0207

本発明の特定のポリヌクレオチド(例えばオリゴヌクレオチド)は、モノヌクレオチドおよび/またはトリヌクレオチドに基づくホスホラミダイトカップリング化学を含む種々の固相戦略を利用して合成することができる。例えば、核酸配列は、活性モノマーおよび/またはトリマーを、伸びているポリヌクレオチド鎖へ連続的に追加することによって合成することができる。例えばCaruthers, M.H. et al. (1992) Meth Enzymol. 211:3を参照のこと。

0208

所望の配列を合成する代わりに、本質的にどのような核酸であっても種々の商業的供給元に特別注文することが可能である。そのような供給元として、Midland Certified Reagent Company、Great American Gene Company, ExpressGen, Inc.、Operon Technologies, Inc.、その他多くがある。

0209

同様に、核酸およびタンパク質マイクロアレイの商業的供給元が利用可能であり、例えばAgilent Technologies, Palo Alto, CA、Affymetrix, Santa Clara,CAなどが挙げられる。

0210

本発明に関連した一領域は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションである。当業者は、ハイブリダイゼーションの厳密性(stringency)に基づくハイブリダイゼーション条件を区別する。例えば、厳密性の高い(高ストリンジェント)条件として、0.5 M NaHPO4, 7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、 および1 mMEDTA中、65℃でのフィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーションをおこない、68℃で0.1XSSC/0.1%SDSで洗浄することを含むことも可能である((Ausubel F. M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc.,
およびJohn Wiley & sons, Inc., New York, at p. 2.10.3)。中程度のストリンジェント条件として、例えば、0.2XSSC/0.1% SDS、42℃での洗浄が含むことも可能である(Ausubelら、1989, 上掲)。

0211

本発明は、本発明のDNA配列にハイブリダイズし、そのことから該DNA配列の相補体でもある核酸分子、好ましくはDNA分子も含む。そのようなハイブリダイゼーション条件は、上記したように、厳密性の高いものであっても、厳密性がやや劣るものであってもよい。例えば、核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド(「オリゴ(oligo)」である場合、高ストリンジェント条件は、例えばピロリン酸ナトリウム、37℃(14塩基オリゴヌクレオチド用)、48℃(17塩基オリゴヌクレオチド用)、55℃(20塩基オリゴヌクレオチド用)、および60℃(23塩基オリゴヌクレオチド用)で6xSSC/0.05%ナトリウムピロホスフェート中で洗浄することを意味することができる。これらの核酸分子は、標的ヌクレオチド配列アンチセンス分子として作用することができ、該分子は標的ヌクレオチド配列調節で、および/または標的ヌクレオチド配列核酸配列の増幅反応でのアンチセンス・プライマーとして、有用である。さらに、そのような配列は、リボザイムの一部として、および/または三重らせん配列にとっても有用であると思われ、また標的ヌクレオチド配列制御にも有用である。またさらに、そのような分子を、疾
患を生ずる対立遺伝子の存在が検出可能である診断方法の構成要素として用いることができる。

0212

診断用ヌクレオチドセットの同定)
(候補ライブラリー(Candidate Library))
白血球で差次的に発現される候補遺伝子ライブリーは、診断用オリゴヌクレオチド・セットと疾患特異的標的ヌクレオチド配列の同定および評価用の基質である。

0213

白血球という用語は、一般的に、有核赤血球ではない任意の有核血液細胞のことをいう。より具体的には、白血球は大まかに2つのクラスに分離される。第1のクラスは顆粒球、最も広く行き渡って、例えば好中球が含まれ、同様に低い頻度で好酸球および好塩基球が含まれる。第2のクラスは、非顆粒または無核の白血球であり、単球およびリンパ球(例えば、T細胞およびB細胞)が含まれる。第2のクラス(非顆粒状であるか単核白血球)は、単球とリンパ球(例えばT細胞とB細胞)を含む。炎症性およびリウマチ性疾患神経変性疾患(例えば、例えばアルツハイマー痴呆)、心血管疾患、内分泌疾患、移植拒絶、悪性腫瘍、および感染疾患、ならびに表1に示す他の疾患等の多種多様な疾患プロセスにおける白血球(例えば、好中球、単球、およびリンパ球)に関連した詳細な従来文献がある。単核球は、慢性免疫応答に関与する一方、顆粒球は、白血球のほぼ60%を占めており、急性炎症性刺激に対する非特異的で型にはまった反応を示し、しばしば生存期間はわずか24時間である。

0214

多数の疾患関連プロセスでのそれらの広範囲にわたる関与および/または影響に加えて、白血球は種々の理由から、臨床的および実験的な評価にとって特に魅力的な基質である。最も重要なことは、それらが本質的にあらゆる潜在的被検者から低コストで容易に利用されることである。採取は、最小限に侵襲的でほとんど痛みがなく、障害も少なく、あるいは回復時間も最小限である。採取は、種々の臨床および非臨床的設定で、著しい技術的支出なしに、最小限に訓練された人員(例えば採血者医療技術者等)によって行うことができる。また、白血球は再生可能であり、一人の被験者に対して複数の時間点で利用可能である。

0215

初期候補ライブラリーのアセンブリー
初期候補ライブラリーは、「調査している(mining)」刊行物および配列データベースと差次的発現ライブラリーの構築とから組み立てられた。ライブラリー内の候補オリゴヌクレオチド配列は、完全長または部分的な核酸配列、デオキシリボ核酸(DNA)配列、cDNA配列RNA配列、合成オリゴヌクレオチド配列等であってもよい。核酸配列は、長さが少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、またはそれ以上の長さのものとすることができる。あるいは、候補ヌクレオチド配列のタンパク質産物は、以下にさらに記載されるような標準的方法を使用する候補ライブラリにおいて表され得る。診断用オリゴヌクレオチドの選択および確認では、長さが50ヌクレオチドの核酸配列を使用して、8,031の候補オリゴヌクレオチド配列からなる初期ライブラリーを、以下に記載されるように構築した。

0216

(候補ヌクレオチド・ライブラリー)
本発明者らは、活性化白血球と休止白血球で差次的に発現される初期候補ヌクレオチド・ライブラリーの成分を同定した。その初期候補ヌクレオチド・ライブラリーから、候補のプールを、表2、表8、および配列表に列挙されるように選択した。したがって、本発明は表2、表8および配列表に示されるヌクレオチド配列を含む候補白血球ヌクレオチド・ライブラリーを提供する。別の実施形態では、本発明は表2、表8および配列表に示される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む候補ライブラリーを提供する。別の実施
形態では、本発明は表2、表8および配列表に示される少なくとも2つのヌクレオチド配列を含む候補ライブラリーを提供する。もう一つの実施形態では、少なくとも2つのヌクレオチド配列は、長さが19ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、または少なくとも100ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、デオキシリボ核酸(DNA)配列、リボ核酸(RNA)配列、合成オリゴヌクレオチド配列、またはゲノムDNA配列を含む。ヌクレオチド配列が各々1つの遺伝子と一致する可能性があり、あるいはいくつかのヌクレオチド配列が1つの遺伝因子と一致する可能性があるいはその両方の可能性がある。

0217

本発明は、候補ヌクレオチド・ライブラリーに対するプローブも提供する。本発明の一実施形態では、プローブは表2、表8または配列表でリストされる少なくとも2つのヌクレオチド配列を含む。これらのヌクレオチド配列は、少なくとも1つの白血球関連疾患のための少なくとも1つの疾患基準を持つ個人の白血球および少なくとも1つの疾患基準を持たない個人の白血球で差次的に発現される。2つ以上のヌクレオチド配列の発現は、少なくとも1つの疾患基準と相関している。プローブが候補ヌクレオチド・ライブラリーのRNA発現またはタンパク質発現を検出する可能性があると理解される。代わりに、またはそれに加えて、プローブは、さらに後述するように、候補ヌクレオチド配列に関連した遺伝子型を検出することができる。別の実施形態では、候補ヌクレオチド・ライブラリーのプローブがアレイの上で固定される。

0218

本発明の候補ヌクレオチド・ライブラリーは、本発明の診断用ヌクレオチド・セットを同定することに有用であり、それ自身が、後述するように、本発明の診断用ヌクレオチド・セットである。候補ヌクレオチド配列を、さらに特徴づけることが可能であり、また疾患標的ヌクレオチド配列および/または新規ヌクレオチド配列として、後述するように、同定してもよい。後述するように、候補ヌクレオチド配列は、像形成イメージング)試薬としての用途にも適していると思われる。

0219

(非白血球発現遺伝子の検出)
液サンプル中の遺伝子発現レベルを測定する際に、白血球から得られていないRNAが、測定され得る。例は、ウイルス遺伝子、損傷された非白血球細胞型から放出された遊離RNAまたは循環非白血球細胞型由来のRNAである。例えば、急性同種移植片拒絶反応過程において、組織損傷が、同種移植片細胞または同種移植片細胞由来のRNAの循環への放出を、生じ得る。候補同種移植片の場合において、このような転写は、筋肉ミオグロビン)または心筋トロポニンI、トロポニン(toponin)T、CK−MB)に対して特異的であり得る。末梢血中の心臓特異的mRNAの存在は、進行中の心臓細胞損傷または最近の心臓細胞損傷(急性の拒絶反応から生じる)を示し得る。従って、このような遺伝子は、同種移植片拒絶反応についての非常にすぐれた診断用マーカーであり得る。

0220

(発現パターンの生成)
(RNA、DNA、またはタンパク質試料の獲得)
差次的に発現された候補ヌクレオチド配列のライブラリーの同定または構築の後で、候補ライブラリーの複数成分に対応した白血球発現プロフィールが得られる。一人以上の被検者からの白血球試料が標準的な方法によって得られる。最も一般的に、これらの方法では、末梢血を経皮静脈経由で採血する。末梢血管系から全血の循環白血球を採取することが最も単純で、侵襲が最小であり、さらに最も低コストの選択肢である一方で、多数の他の採取法があり、ある状況下では好ましく用いられることはいうまでもない。実際、例えば、中心ライン(central line)、中心動脈、または実際に心臓カテーテル、あるいは中央血管系に接近する外科的手技の際に得られる末梢血管系から採取された白血球間には、関連する差異が存在しない。また、少なくとも部分的に白血球から構成さ
れる他の体液または組織も所望の白血球試料である。例えば、気管支鏡検査法の間、肺から得られる流体試料は、白血球が豊富であり、かつ本発明の文脈中で発現プロファイリング、(例えば診断、予後のため)または肺移植拒絶、炎症性肺疾患、もしくは感染肺疾患モニターがやりやすい。他の組織の流体試料、例えば結腸、洞、食道小腸膵管胆道系、膀胱尿管頸部または子宮、その他の内視鏡検査によって得たものも好適である。試料を、白血球を含む他の源、例えば尿、胆汁髄液大便、胃または腸管分泌物精液、または固形の器官もしくは関節生検から得てもよい。

0221

最も高い頻度で、白血球の混合集団(例えば全血で見いだされたもの)を本発明の方法で利用する。粗分離(例えば赤血球からの混合白血球の粗分離)および/または濃縮化(例えばショ糖パーコール、もしくはフィコール勾配上での濃縮化)または他の公知方法を用いて、十分な量でRNAおよびタンパク質の発現産物の回収を促進し、また非特異的バックグラウンドを減少させることができる。いくつかの例では、白血球の亜母集団を精製することが求められ、それを行う方法、例えば密度または親和性勾配、フロー・サイトメトリー、蛍光活性化セルソーティングFACS)、免疫磁気分離、「パニング」等が入手可能な文献および下記に説明されている。

0222

(発現プロファイリングのためのDNA、RNA、およびタンパク質試料の入手)
発現パターンは、DNA、またはRNAまたはタンパク質生成物のレベルにて評価され得る。例えば、種々の技術は、全血からRNAの単離に利用できる。細胞(リボソームRNAtRNAの存在または非存在下で)からのmRNAの単離を可能にするいかなる技術でも、利用することができる。手短に言えば、後に続く遺伝子発現分析に好適な信頼性が高い全RNA単離を可能にする1つの方法を以下に説明する。被験者から末梢血(静脈または動脈のいずれか)を抗凝固剤(例えばEDTA、クエン酸塩、またはヘパリン)の入った1本以上の滅菌された内毒素無しの試験管に取る。一般に、上記試料は少なくとも2つの部分に分けられる。1つの部分は、DNAまたはタンパク質等の将来の分析のために例えば5〜8mlの全血を凍らせて保存しておく。第2の部分は、例えば約8mlの全血であり、Sambook, Ausubel、下記、および米国特許第5,728,822号および第4,843,155号等に記載されたような種々の技術のいずれかによる全RNAの単離用に処理される。

0223

代表的に、約8mlの全血(ほとんどの状況下で直ちに成人被験者から入手可能な量)から得られる単核白血球の被験者試料から、全RNAが5〜20μg得られる。この量は、例えば、少なくとも2つのプローブ・アレイに対して標識およびハイブリダイゼーションを行う上で十分な量である。候補ライブラリーのヌクレオチドの発現パターンを分析するための標識プローブを、標準的な方法を用いて被験者のRNA試料から調製する。多くの場合、cDNAはポリTプライマーと、標識(例えば放射性または蛍光)ヌクレオチドとを用いて、全RNAから合成される。次に、結果として生じる標識cDNAを、候補ヌクレオチド・ライブラリーの成分に対応するプローブとハイブリダイズさせ、ライブラリーの各ヌクレオチド配列に対して、発現データを得る。被験者試料(例えば、他の生物学的流体および試料から得た白血球または末梢血白血球)から単離したRNAを候補ライブラリーのヌクレオチドの発現パターンの分析のために用いる。

0224

しかし、場合によっては、白血球試料から抽出されるRNAの量が制限されるので、RNAから合成を増幅することが望ましい。増幅は、プローブ標識の効率を増加させることによって、または標識前にRNA試料を増幅することによって達成可能である。増幅プロセスのあいだ、いかなるバイアス(遺伝子発現レベルに関して)も導入しない増幅方法を選択するために、注意を払わなければならないと考えられる。

0225

いくつかの方法は利用可能であり、これらの方法は、例えばClontech(ガラス
蛍光標識キット(Glass Fluorescemting Kit))もしくはStratagene(フェアプレイマイクロアッセイ標識キット(Fairplay Microassay Labeling Kit))、またはマイクロマックス・キット(Micromax kit)(New England Nuclear, Inc.)を用いて、限定量のRNAからのシグナルを増やす。あるいは、標識がない状態でT7−ポリTプライマーを用いてRNAからcDNAを合成し、Genisphere (3DNA Submicro)由来のDNAデンドリマーをプライマー上でポリT配列とハイブリダイズさせるか、もしくは蛍光標識配列に対して相補的な「キャプチャー配列(caapture sequence)」とハイブリダイズさせる。各々の3DNA分子は250個の蛍光分子を持つので、各cDNAを強く標識することができる。

0226

あるいは、RNA試料を標識に先立って増幅する。例えば、米国特許第6,132,997号で述べられるように、線形増幅をおこなってもよい。T7−polyTプライマーを用いてRNAのcDNAコピーを生成する。つぎに、第2のDNA鎖を作って増幅のための基質を完成させる。プライマーに組み込まれたT7プロモーターを用いて、オリジナルRNAのアンチセンス・コピーを多数作る。蛍光色素標識したヌクレオチドを、直接RNAに組み込む。あるいは、アミノアリル(amino allyl)標識ヌクレオチドをRNAに取り込み、Hughesの記載にしたがって、つぎに蛍光色素をアミノ・アリル基化学的に結合させる。増幅のための他の典型的な方法は以下に記載する。

0227

単離RNAが白血球由来のRNAを含まなければならないが、程度の差はあっても他の細胞型のRNAを含む可能性があると考えられる。その上、単離RNAは、先に述べたように白血球(例えば単球および/またはTリンパ球)のサブセットに由来する可能性がある。RNA誘導のために使用される細胞型のそのような考慮は、使用される発現プロファイリングの方法に依存する。白血球のサブセットは、蛍光活性化セル・ソーター(FACS)、微量流体法(microfluidics)細胞分離システム、または種々の他の方法によって得られることができる。細胞の選別(セル・ソーティング)は、診断用遺伝子セットの発見のために産物としての遺伝子セットの実現のため、またはその両方のために、必要と思われる。セル・ソーティングは、種々の技術(Galbraith et al. 1999, Cantorら、1975参照、またGuava Technologies, Hayward, CAの技術を参考)で、達成できる。

0228

DNA試料は、DNA突然変異、単一ヌクレオチド多型(SNP)、または他の多型の存在について分析するために得るとよい。DNAの単離は、標準の技術(例えばManiatus、上掲)を用いておこなう。

0229

候補ヌクレオチド産物の発現もプロテオミクスを使用して評価可能である。タンパク質は、患者血清または白血球細胞由来のタンパク質試料で検出される。血清の調製は、標準の方法を用いて全血の遠心によっておこなう。血清中に存在するタンパク質は、種々の白血球と非白血球細胞のいずれかから産生されると考えられ、白血球から分泌されたタンパク質を含む可能性がある。あるいは、白血球または白血球の亜母集団の調製は、先に述べたようおこなう。細胞タンパク質の調製は、周知の方法によって白血球サンプルからおこなう(例えばTrizol (Invitrogen Life Technologies, cat # 15596108; Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162, 156; Simms, D.,Cizdziel, P.E., and Chomczynski, P. (1993) Focus(登録商標) 15, 99; Chomczynski, P., Bowers−Finn, R., and Sabat
ini, L. (1987) J. of NIH Res. 6, 83; Chomczynski, P. (1993) Bio/Techniques 15,532; Bracete, A.M., Fox, D.K., and Simms, D. (1998) Focus 20, 82; Sewall, A. and McRae, S. (1998) Focus 20,36; Anal Biochem 1984 Apr;138(l): 141−3、A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids; Wessel D, Flugge UI. (1984) Anal Biochem. 1984 Apr;138(1): 141−143)。

0230

測定法自体は、タンパク質マーカーの細胞表面での発現にもとづいて細胞が選別および/または計数されるセル・ソーティング・アッセイであってもよい(Cantorら、1975,Galbraithら、1999を参照のこと)。

0231

(発現パターンの入手)
次いで、候補ライブラリーの成分に対応する複数のヌクレオチドの発現パターンまたはプロファイルを、一つ以上の試料の白血球で評価する。一般的に、白血球は患者末梢血試料に由来するが、すでに示したように、多くの他の試料供給源もまた好適である。これらの発現パターンは、いくつかのRNAまたはタンパク質産物に対する相対的または絶対的発現値のセットを構成するもので、該産物は複数の評価ヌクレオチド配列に対応し、本明細書ではそれをそれらのヌクレオチド配列に対する患者の「発現プロファイル」と称する。候補ライブラリーのわずか1つの独立成分のための発現パターンが得られる一方で、一般に、より多くのヌクレオチド配列(例えば約2、約5、約10、約20、約50、約100、約200、約500、約1000、またはそれ以上)に対応している発現パターンを得ることが好ましい。ライブラリーにある差次的発現した各々の発現構成要素の発現パターンは、診断、予後、モニタリングなどの予測値に関して限られた特異性および感度を与える。

0232

臨床研究、データ、患者グループ
議論を目的として、被験者または被検者白血球試料はという用語は、健康および/または疾患状態に関係なく個人を意味する。被検者は、患者、試験参加候補者、コントロール被験者、スクリーニング被検者または白血球試料が得られる他のいかなるクラスの個人とすることができる。本発明の前後関係で評価され、かつ本明細書の文脈のなかで評価される個人の他のいかなる種類でもありえる。したがって、被験者は、疾患で診断可能であり、疾患の症状、または疾病素質、例えば疾患に対する家族(遺伝的)歴または病歴(医学的)因子、その他を1つ以上持つことができる。あるいは、被験者は、上記因子または基準のいずれかに関して健康でありえる。本明細書で用いられる用語「健康な(healthy)」は、特定の疾患または疾患因子もしくは疾患基準に関係するもので、任意の絶対的評価または状態に対応するように定義することはできないことは、いうまでもない。したがって、任意の特定の疾患または疾患基準に関連して健康であると判断された個人は、実際のところ、他の1つ以上の疾患があるか、もしくは他の1つ以上の疾患基準を示し得る。

0233

さらに、本発明の議論が集中し、かつヒト配列および試料を用いて例証される一方で、実験動物(例えばマウスラットモルモット、およびウサギ)、家畜(例えば、ウシウマヤギヒツジ、およびトリ)、ならびにペット(例えば、イヌおよびネコ)のようなヒト以外の動物に対して、適切な候補ライブラリーの構成または選択を通して、本発明が等しく適用される。

0234

(発現データを得るための方法)
発現データを得る多数の方法は公知であり、これらの技術の任意の一つ以上を単独または組合わせたものが、本発明の文脈で発現プロファイルを決定する上で好適である。例えば、発現パターンは、ノーザン分析、PCR、RT−PCR、Taq Man分析、またはFRET検出によって評価可能であり、一つ以上の分子ビーコンのモニタリング、オリゴヌクレオチド・アレイに対するハイブリダイゼーション、cDNAアレイに対するハイブリダイゼーション、ポリヌクレオチド・アレイに対するハイブリダイゼーション、液状マイクロアレイに対するハイブリダイゼーション、マイクロエレクトリック・アレイに対するハイブリダイゼーション、分子ビーコン、cDNAシーケンシング、クローン・ハイブリダイゼーション、cDNAフラグメントフィンガープリンティング、遺伝子発現の連続分析(SAGE)、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイおよび/またはディファレンシャル・スクリーニング(例えば、Lockhart and Winzeler (2000) Nature 405:827−836,およびその文献で引用した文献を参照)でおこなう。

0235

例えば、特異的PCRプライマーは、候補ヌクレオチドライブラリーのメンバーに対して設計される。ポリdTオリゴヌクレオチド・プライマーからの逆転写によって被験者試料RNA由来のcDNAを調製し、PCRにかける。二重鎖cDNAは、PCR産物の逆転写に好適なプライマーを用いて調製可能であり、続いてin vitro転写を用いてcDNAの増幅がおこなわれる。in vitro転写の産物は、候補ライブラリーのオリジナル成分に対応するセンスRNAである。PCR産物を当該技術分野で公知のいくつかの方法で評価してもよい。そのような方法として、TaqManまたは分子ビーコン・プローブ等の標識プライマーの検出を用いたリアルタイムアセスメントが挙げられる。PCR産物の分析に好適な技術プラットフォームとして、ABI7700、5700または7000の配列決定システム(Sequence Detection Systems)(Applied Biosystems, FosterCity, CA)、MJリサーチオプティコン(MJ Research Opticon)(MJ Research, Waltham, MA)、ロッシュ・ライトサイクラー(Roche Diagnositics, Indianapolis, IN)、ストラタジーン(Stratagene)MX4000(Stratagene, La Jolla, CA)、バイオ・ラッド・サイクラー(Bio−Rad iCycler) (Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA)が挙げられる。あるいは、分子ビーコンを用いてRNAまたはDNA試料中の核酸配列の存在を検出し、もしくは続いて任意の方法、例えばIVT(in vitro転写)またはNASBA(核酸配列にもとづいた増幅)を用いて配列の増幅をおこなう。分子ビーコンは、候補ヌクレオチド・ライブラリーの成分に対する配列相補性により設計され、蛍光標識が結合している。各々のプローブは、非オーバーラップ発光波長で異なる蛍光ラベルを持っている。例えば、10個の遺伝子の発現は、10種類の異なる配列特異的分子ビーコンを使用して評価可能である。

0236

あるいはまたは加えて、分子ビーコンは、一度に複数のヌクレオチド配列の発現を評価するのに用いられる。診断用ヌクレオチド・セットの成分に相補的な配列を有する分子ビーコンを設計して蛍光標識を結合させる。使用される各々の蛍光標識は、非オーバーラップ発光波長を持たなければならない。例えば、10個のヌクレオチド配列の評価は、増幅RNAもしくは非増幅RNAまたはcDNA試料に10個の配列特異的分子ビーコン(各々に対して異なる蛍光分子による標識がなされている)をハイブリダイズさせることによっておこなうことができる。そのようなアッセイは、試料標識方法の必要を回避する。

0237

あるいはまたは加えて、ビーズ・アレイを用いて、一度に複数の配列の発現を評価する
ことができる(例えば、LabMAP100, Luminex Corp, Austin, Texasを参照)。代わりにまたは加えて、エレクトリック・アレイは、Motorola (Chicago, III.) のe−センサー(e−Sensor)技術またはNanogen (San Diego, CA.)のナノチップ(Nanochip)技術として例示される。

0238

もちろん、選択された特定の方法は回収RNA量、開業医の好み、利用可能な試薬および装置、検出器等のような因子に依存する。一般的に、しかし、選択された方法は、目的とする試料およびプローブの数を処理することに好適である。高スループット発現分析方法については、以下で考察する。

0239

あるいは、遺伝子発現のタンパク質産物レベルで発現が実行される。例えば、白血球試料では、タンパク質発現は、ウェスタン分析、二次元ゲル分析、クロマトグラフィ分離、質量分析検出、タンパク質融合レポーター構成体、比色アッセイ、タンパク質アレイへの結合、およびポリソームmRNAの特徴のあいだから選択される1つ以上の方法によって評価することができる。特に好ましいアプローチの一つとして、候補ライブラリーの成分に特異的な抗体のアレイに対して標識タンパク質発現産物を結合させることが含まれる。抗体を産生および評価する方法は、当該技術分野で広範囲にわたる。例えば、Coligan(上掲);およびHarlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY (”Harlow and Lane”)。候補ヌクレオチド配列の産物に対して特異的な抗体試薬の選択によって、本発明に対して適用可能な種々の免疫学的方法および免疫アッセイ方法に関するさらに詳しい説明は、例えばStites and Terr (eds.)(1991) Basic and Clinical Immunology, 7th ed.、および Paul (上掲)に見いだすことができる。別のアプローチは、脱着分光測定を実行するためのシステムを用いる。商業的に入手可能なシステムは、例えばCiphergen Biosystems, Inc. (Fremont, CA)から入手可能なものが、特にタンパク質発現の定量分析にかなり適している。実際、脱着分光測定によるアプローチにおいて使用されるタンパク質チップ(Protein Chip(登録商標))アレイ(例えば、ウェブサイト、ciphergen.com参照のこと)は、タンパク質発現検出用のアレイを提供する。あるいは、タンパク質産物のエピトープを認識する親和性試薬(例えば、抗体、小分子など)を開発する。親和性アッセイは、タンパク質アレイ・アッセイで用いられ、例えば特定のタンパク質の有無を検出する。あるいは、上記方法により親和性試薬を用いて発現の検出をおこなう。白血球の細胞表面で発現されたタンパク質の場合、標識結合性試薬は白血球の集団に結合し、蛍光活性化セル・ソーティング(FACS)を用いてタンパク質を発現する白血球を同定かつ計数する。

0240

本発明で議論される発現評価の方法もまた、診断用ヌクレオチド・セットの発見の文脈のなかで議論されるけれども、例えば以下にさらに議論するように、疾患を診断するために診断用ヌクレオチド・セットを用いた場合の発現評価に等しく適用可能であることが認められる。

0241

(高スループット発現アッセイ)
多くの適切な高スループット・フォーマットが、遺伝子発現を評価するために存在する。一般的に、高スループットという用語は、1日あたり、少なくとも約100のアッセイまたは少なくとも約500のアッセイでまたは約1000のアッセイまたは少なくとも約5000のアッセイで実行するフォーマット、あるいは少なくとも約約10,000のアッセイ、またはそれ以上のアッセイを実行するフォーマットをいう。アッセイを数える場合、評価した候補ヌクレオチド配列の数または試料の数を考慮することができる。例え
ば、候補ヌクレオチド配列に対応した単一プローブを用いたグリッド・アレイ(ドットブロット等)で実行された約100個の試料等のノーザン分析が高スループット分析であると考えられる。しかし、より一般的には、そのようなアッセイは一連二連のブロットとして実行され、各々が候補ライブラリーの異なる成分に対応した異なったプローブによって評価される。あるいは、1つ以上の試料で、または多数の試料で約100以上の候補ヌクレオチドの発現を同時に評価する方法が高スループットと考えられる。

0242

高スループット発現分析を実施するための多数の技術的プラットフォームが公知である。一般的に、そのような方法は、被験者試料または候補ライブラリーのいずれか、またはその両方の論理的または物理的アレイを含む。一般のアレイ・フォーマットは、液状アレイおよび固相アレイの両方が含まれる。例えば、核酸のハイブリダイゼーション、抗体もしくは他の受容体リガンドへの結合等、液相アレイを用いたアッセイを、マルチウェルまたはマイクロタイター・プレートで実施することができる。96ウェル、384ウェル、または1,536ウェルのマイクロタイター・プレートが幅広く利用されており、より多くのウェル数(例えば3,456および9,600)であっても使用することができる。一般に、マイクロタイター・プレートの選択は、方法および設備(例えばロボット操作およびローディング・システム)によって測定され、試料調製および分析に使われる。典型的なシステムとして、例えばBeckman−Coulter, Inc. (Fullerton, CA)のORCATMシステムおよびZymark Corporation (Hopkinton, MA)のZymateシステムが挙げられる。

0243

あるいは、種々の固相アレイを、本発明の文脈中で発現パターンを決定するために好適に用いることができる。典型的なフォーマットとして、膜またはフィルター・アレイ(例えば、ニトロセルロースナイロン)、ピン・アレイ、およびビーズ・アレイ(例えば、液体「スラリー」中で)が挙げられる。一般的に、候補ライブラリーの成分に対応する発現産物と特異的に相互作用(例えば、ハイブリダイズまたは結合する)核酸またはタンパク質試薬に対応するプローブを、固形支持体上に、例えば直接または間接的に架橋することによって固定する。本質的に、特定の発現アッセイを実行する必要のある条件や試薬に耐えることが可能な固形支持体を用いることができる。例えば、官能化ガラス、シリコン二酸化ケイ素、修飾シリコン、種々のポリマーのいずれか、例えば(ポリ)テトラフルオロエチレン、(ポリ)ビニリデンフルオリドポリスチレンポリカーボネート、またはそれらの組み合わせのすべてを固相アレイに対する基質として用いることができる。

0244

好ましい実施形態で、アレイは、例えば、上記した特定の材料のうちの1つから構成される「チップ(chip)」である。ポリヌクレオチド・プローブ,(例えば、RNAもしくはDNA(例えばcDNA)合成オリゴヌクレオチド等、または候補ライブラリーの個々の成分の発現産物と特異的に相互作用する抗体等の結合タンパク質が、論理的順番で、すなわちアレイ内でチップに固定される。また、マーカー・ヌクレオチド配列(試料の標識の設計に依存)のセンスまたはアンチセンス配列のいずれかに対して特異的親和性を持つ任意の分子を、マーカーに対する特異的親和性を失うことなくアレイ表面に固定することができ、さらに、アレイ生産のために得ることができ、かつ生産することができ、例えば、マーカーの特異的核酸配列を特異的に認識するタンパク質、リボザイム、ペプチド核酸(PNA)、または特異的親和性を有する他の化学物質もしくは分子である。

0245

核酸およびタンパク質をチップ基質に結合させる方法についての詳細な議論は、Pirrungらの米国特許第5,143,854号(“Large Scale Photolithographic Solid Synthesis Of Polypeptides And Receptor Binding Screening Thereof”)(1992年9月1日発行)、Chee他の米国特許第5,837,832号(Array of Nucleic Acid Probes On Biologi
cal Chips”)(1998年11月17日発行)、Daleの米国特許第6,087,112号(Arrays with Modified Oligonucleotide And Polynucleotide Compositions”)(2000年7月11日発行)、Bahl他の米国特許第5,215,882号(”Method Of Immobilizing Nucleic Acid On A Solid Substrate For Use In Nucleic Acid Hybridization Assays”)(1993年6月1日発行)、Katoの米国特許第5,707,807号( ”Molecular Indexing For Expressed Gene Analysis”(1998年1月13日発行)、Brown他の米国特許第5,807,522号( ”MethodsForFabricating Microarrays Of Biological samples”)(1998年9月15日発行)、Gamble他の米国特許第5,958,342号( ”Jet Droplet Device”)(1999年9月28日発行)、Chenchik他の米国特許第5,994,076号( ”Methods Of Assaying差次的発現”)(1999年11月30日発行)、Wangの米国特許第6,004,755号( ”Quantitative Microarray Hybridization Assays”) (1999年12月21日発行)、Bradley他の米国特許第. 6,048,695号(”Chemically Modified Nucleic Acids And Method For Coupling
Nucleic Acids To Solid Support”)(2000年4月11日発行)、Kamb他の米国特許第6,060,240号(”Methods For Measuring Relative Amounts Of Nucleic
Acids In A Complex Mixture And Retrieval Of Specific Sequences Therefrom”)(2000年5月9日発行)、Katoの米国特許第6,090,556号( ”Method For Quantitatively Determining The Expression Of A Gene”)(2000年7月18日発行)、およびLockhart他の米国特許第6,040,138号(”Expression Monitoring By Hybaridization To High Density Oligonucleotide Arrays” )(2000年3月21日発行)に見いだされ、本明細書ではそれらの各々の全体を援用する。

0246

例えば、標準的TAクローニング・ベクターにある候補ヌクレオチド配列に対応するcDNAインサートを、約30〜40サイクルにわたってポリメラーゼ鎖反応により増幅する。増幅PCR産物を、米国特許第5,143,854号に記載されたVSLIPSTM技術等の種々の周知技術のいずれかによってガラス支持体上に配列する。被験者試料から単離されたRNA、またはRNAに対応するcDNAを、蛍光タグ等で標識し、RNA(またはcDNA)を含む溶液を、ハイブリダイゼーションにとって好適な条件下で「プローブ」チップとともにインキュベートする。インキュベーションし、かつ非特異的ハイブリダイゼーションを除去するために洗浄した後、チップに結合した標識核酸定性的または定量的に検出し、さらに結果として生じた対応の候補ヌクレオチド配列の発現プロファイルを記録する。診断目的のために使用されるプローブが診断用ヌクレオチド配列の発見および検証の間、使用されるプローブと同一である可能性があると認められる。あるいは、プローブ配列は診断用ヌクレオチド配列の発見および検証に使用される配列とは異なる可能性がある。オーバーラップしない、または部分的にオーバーラップするヌクレオチド配列からの複数のcDNAを使用することができる。

0247

別のアプローチでは、候補ヌクレオチド・ライブラリーの成分に対応するオリゴヌクレオチドを合成してアレイ上にスポットする。あるいは、オリゴヌクレオチドを、当該分野で公知の方法(例えば、Hughesら、上掲)を用いて合成する。オリゴヌクレオチド
は、候補ヌクレオチド配列の任意の部分に対する相補性を持つように設計される。また、診断用オリゴヌクレオチド・セットの診断用途等のための発現分析の文脈のなかで、以下にさらに記載するように、オリゴヌクレオチドが特定のハイブリダイゼーション特性または特定の特性および/または感度を示すように、設計することができる。

0248

ハイブリダイゼーション・シグナルを、当該分野で公知の方法を用いて増幅することが可能であり、また本明細書に記載したように、例えばClontechキット(ガラス蛍光標識キット)、Stratageneキット(FairPlay Microarray Labeling Kit)、Micromaxキット(New England Nuclear, Inc.)、Genisphereキット(3DNA Submicro)、線形増幅(例えば米国特許第6,132,997号またはHughes, TR, et al., Nature Biotechnology, 19:343−347 (2001) および/または Westin et al. Nat Biotech. 18:199−204に記載)が挙げられる。

0249

あるいは、蛍光標識されたcDNAは、公知の方法を用いてマイクロアレイに直接ハイブリダイズされる。例えば、標識cDNAの生成は、Cy−3およびCy−5結合デオキシリボヌクレオチドを用いた逆転写によりおこなわれ、反応産物は、Cy−5標準の方法を使用して純化される。診断用ヌクレオチド・セットの同定に有用な発現データのシグナル増幅方法もまた、診断目的のための発現データの増幅に有用である。

0250

マイクロ・アレイ発現は、種々のレーザーまたはCCDをベースとしたスキャナーによってマイク・アレイを走査し、多数のソフトウェアパッケージ、例えばImagene
(Biodiscovery)、Feature Extraction(Agilent)、Scanalyze((Eisen, M. 1999.SCANALYZE User Manual; Stanford Univ., Stanford, CA. Ver 2.32.)、GenePix(Axon Instruments)により特徴を抽出することで検出可能である。

0251

別のアプローチでは、マイクロエレクトリック・アレイに対するハイブリダイゼーションを、例えばUmek et al (2001) J Mot Diagn. 3:74−84の記載通りに実行する。親和性プローブ(例えば、DNA)を金属表面に付着する。各々のプローブの基礎をなしている金属面は、金属導線および電気シグナル検出システムに接続している。非標識RNAもしくはcDNAをアレイにハイブリダイズさせるか、またはRNAもしくはcDNA試料をハイブリダイゼーション前に、例えばPCR等によって増幅させる。試料RNAまたはcDNAの特異的ハイブリダイゼーションは、検出器に送られる電気シグナルの生成をもたらす。Westin (2000) Nat Biotech. 18:199−204 (マイクロエレクトロニック・チップ・アレイのアンカー複合増幅(anchored multiplex amplification)を記載); Edman (1997) NAR 25:4907−14; Vignali (2000) J Irmnunol Methods243:243−55を参照のこと。

0252

別のアプローチでは、微量流体チップをRNA試料調製および分析に用いる。このアプローチによって、試料調製および分析が簡素化されるため、効率が高まる。手短に言うと、微量流体法を用いることで、RNA調製および分析の前に特異的白血球亜母集団をソートすることが可能である。例えば、微量流体チップはRNA(逆転写、RT−PCR)を必要とするRNA調製および反応に役立つ。手短に言えば、小量の抗凝固剤添加全血を微量流体チップ、例えばCaliper(Mountain View,CA)またはNanogen (San Diego, CA.)から入手可能なチップ上に載せる。微量
流体チップは、細胞が移動し、かつ反応が行われるチャンネルおよびリザーバーを含むものであってもよい。細胞を移動させて試薬にさらすために、機械、電気磁気重力、遠心、その他の力を利用する。例えば、全血の細胞を低張性塩類液を含むチャンバーに入れて、インキュベーション20分後に赤血球の選択的溶解をおこなう。次に、残留細胞(白血球)を洗浄液チャンバーに入れ、最終的にグアニジンイソチオシネートのような溶解緩衝液を含むことはチャンバーに持ち込まれる。白血球細胞可溶化物は、チップの中のRNA単離のために更に処理されるか、またはさらにプロセッシング(例えば標準の方法によるRNA単離)のために除去される。あるいは、微量流体法チップは、フィコールまたは他の密度試薬を含む環状のディスクである。血液試料を上記ディスクの中央に注入し、該ディスクに対して単核球の密度勾配分離に適した遠心力を生じる速度で回転され、さらなる分析または処理のために分離単核細胞を集める。

0253

上記発現評価の方法は、診断用ヌクレオチド・セットの発見の文脈のなかで議論したけれども、診断用ヌクレオチド・セットを疾患の診断等に用いることで、さらに以下に記載するように、発現評価にも適用可能であることが理解される。

0254

(発現パターンの評価)
発現パターンの評価は、質的なおよび/または量的測定尺度によっておこなうことができる。遺伝子発現(RNAまたはタンパク質産物として)を評価するための一定の上記技術が事実上、主に質的であるデータを与える。すなわち、上記方法は、発現の量的側面に関して有意情報を提供することなく異なったモードに発現を分類する発現での差異を検出する。例えば、それが候補ヌクレオチド配列の発現の有無(すなわち発現のオン/オフ・パターン)を検出する場合、技術は質的な技術と説明することができる。あるいは、遺伝子産物の異なる対立遺伝子または変異体の存在(および/または不在)を質的な技術が測定する。

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