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図面 (6)

課題

細胞接着阻害活性を有するクラゲ抽出画分によるクラゲの新たな有効利用を図る。

解決手段

細胞接着阻害活性を有する、特定の精製処理をしたクラゲ抽出画分を、次の(A)〜(C)の工程を含む方法によりクラゲから抽出する:(A)クラゲに、pHが6〜9の緩衝液プロテアーゼ阻害剤及び終濃度が1〜6Mの塩化ナトリウムを加えてホモジナイズし、クラゲ混合液を得る工程;(B)上記(A)の工程により得られたクラゲ混合液を、沈殿上清に分離する工程;(C)上記(B)の工程により分離された上清を、クラゲ抽出画分として回収する工程。

概要

背景

クラゲは、刺胞動物鉢虫綱ヒドロ虫綱、十文字クラゲ及び箱虫綱に属する動物のうち、浮遊生活をする種の総称である。クラゲは、体がゼラチン質で柔らかく、その重量のおおよそ99%が海水で、おおよそ1%がコラーゲンを主成分とするタンパク質となっている。
一部のクラゲは、突然大発生することがあり、大量発生したエチゼンクラゲ漁網にからまる被害が、近年、日本の漁業において深刻化している。また、大発生したミズクラゲ工場火力発電所取水口詰まるなどの被害を出すこともある。これらの工場や発電所では、取水口付近のクラゲを捕獲・除去することにより、これらの被害を防いでいるが、捕獲されたクラゲについては、そのまま廃棄処理されているのが実情である。

エチゼンクラゲについては、中国や日本において、細切りにして乾燥させ塩蔵したものを水で戻して酢の物や和え物などにするなど、一部が加工食品として利用されているが、消費量はそれほど多くはない。また、ミズクラゲについては、小型のため、加工食品に不向きである。このように、クラゲ類は、未利用でほとんど資源化されていない生物であるということができる。

このため、クラゲを有効利用することを目的として、クラゲからコラーゲンを抽出する方法が開発されている(特許文献1〜3)。コラーゲンは、ゼラチンの材料や、健康食品の成分として産業上有用である。
これらの方法は、クラゲを細断又は粉砕した後、酵素によりクラゲの体組織を分解して、コラーゲンを可溶化して溶液に抽出し、塩析によりコラーゲン等のタンパク質を沈殿させて、コラーゲンを回収するものである。
しかし、これらの方法は、もっぱらコラーゲンを効率よく回収することを目的とするものであり、塩析により沈殿しない成分についてはあまり注目されてはいなかった。
また、これらの方法は、コラーゲンを効率よく回収することを目的とするため、体組織を分解するプロテアーゼ等による酵素反応を積極的に利用するものであった。

尚、これらの方法とは全く正反対に、プロテアーゼ阻害剤高濃度塩化ナトリウムを含む溶液を用いて、ヒドラからという無脊椎動物からコラーゲンを溶解・抽出する方法が非特許文献1に記載されている。しかし、この方法は、学術的分析目的で特定のコラーゲンを抽出するものであった。

コラーゲンについては、XVIII型コラーゲンC末端断片であるエンドスタチンというペプチドが、血管新生抑制作用を介して抗腫瘍活性を示すことが知られている。しかし、このペプチドの抗腫瘍活性に関する詳細な分子メカニズムは未だ十分に解明されていない(非特許文献2)。

特開2008−31106号公報
特開2007−51191号公報
特開2004−99513号公報
Susan J. Fowlerら他5名、2000年発行、The Journal of Biological Chemistry、vol.275、50、pp.39589-39599
Huan-Li Xuら他3名、2008年発行、Current Protein & Peptide Science、vol.9、issue 3、pp.1389-2037

概要

細胞接着阻害活性を有するクラゲ抽出画分によるクラゲの新たな有効利用をる。細胞接着阻害活性を有する、特定の精製処理をしたクラゲ抽出画分を、次の(A)〜(C)の工程を含む方法によりクラゲから抽出する:(A)クラゲに、pHが6〜9の緩衝液、プロテアーゼ阻害剤及び終濃度が1〜6Mの塩化ナトリウムを加えてホモジナイズし、クラゲ混合液を得る工程;(B)上記(A)の工程により得られたクラゲ混合液を、沈殿と上清に分離する工程;(C)上記(B)の工程により分離された上清を、クラゲ抽出画分として回収する工程。

目的

本発明は、上記従来の状況に鑑み、クラゲの新たな有効利用を図ることを目的とするものである。

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

次の(A)〜(C)の工程を含む方法によりクラゲから抽出したことを特徴とする、クラゲ抽出画分:(A)クラゲに、pHが6〜9の緩衝液プロテアーゼ阻害剤及び終濃度が1〜6Mの塩化ナトリウムを加えてホモジナイズし、クラゲ混合液を得る工程;(B)上記(A)の工程により得られたクラゲ混合液を、沈殿上清に分離する工程;(C)上記(B)の工程により分離された上清を、クラゲ抽出画分として回収する工程。

請求項2

前記(A)の工程において、塩化ナトリウムの終濃度を1〜2Mとし、さらに、次の(D)〜(F)の工程により精製したことを特徴とする、請求項1に記載のクラゲ抽出画分:(D)前記(C)の工程により得られたクラゲ抽出画分に、終濃度が5〜6Mとなるように塩化ナトリウムを加える工程;(E)上記(D)の工程により塩化ナトリウムを加えたクラゲ抽出画分を、沈殿と上清に分離する工程;(F)上記(E)の工程により分離された上清を、クラゲ抽出画分として回収する工程。

請求項3

さらに、次の(G)及び(H)の工程により精製したことを特徴とする、請求項1又は2に記載のクラゲ抽出画分:(G)クラゲ抽出画分を、等電点電気泳動により分画する工程;(H)上記(G)の工程により分画したクラゲ抽出画分のうち、等電点がpH3.5〜4.0の画分を回収する工程。

請求項4

前記クラゲが、鉢虫綱に属するクラゲであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載のクラゲ抽出画分。

請求項5

前記(A)の工程で加える緩衝液のpHが7〜8であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載のクラゲ抽出画分。

請求項6

前記(A)の工程で使用するプロテアーゼ阻害剤が、エチレンジアミン四酢酸EDTA)、フェニルメチルスルフォニルフォルオライドPMSF)及びN−エチルマレイミド(NEM)の混合プロテアーゼであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載のクラゲ抽出画分。

請求項7

請求項1〜6のいずれかに記載のクラゲ抽出画分を含むことを特徴とする、細胞接着阻害剤

請求項8

請求項1〜6のいずれかに記載のクラゲ抽出画分を含むことを特徴とする、抗腫瘍剤

請求項9

次の(A)〜(C)の工程を含むことを特徴とする、細胞接着阻害活性を有するクラゲ画分の抽出方法:(A)クラゲに、pHが6〜9の緩衝液、終濃度が1〜6Mの塩化ナトリウム及びプロテアーゼ阻害剤を加えてホモジナイズし、クラゲ混合液を得る工程;(B)上記(A)の工程により得られたクラゲ混合液を、沈殿と上清に分離する工程;(C)上記(B)の工程により分離された上清を、クラゲ抽出画分として回収する工程。

技術分野

0001

本発明は、特定の製法によりクラゲから抽出された画分であって、細胞接着阻害活性を有するクラゲ抽出画分に関する。

背景技術

0002

クラゲは、刺胞動物鉢虫綱ヒドロ虫綱、十文字クラゲ及び箱虫綱に属する動物のうち、浮遊生活をする種の総称である。クラゲは、体がゼラチン質で柔らかく、その重量のおおよそ99%が海水で、おおよそ1%がコラーゲンを主成分とするタンパク質となっている。
一部のクラゲは、突然大発生することがあり、大量発生したエチゼンクラゲ漁網にからまる被害が、近年、日本の漁業において深刻化している。また、大発生したミズクラゲ工場火力発電所取水口詰まるなどの被害を出すこともある。これらの工場や発電所では、取水口付近のクラゲを捕獲・除去することにより、これらの被害を防いでいるが、捕獲されたクラゲについては、そのまま廃棄処理されているのが実情である。

0003

エチゼンクラゲについては、中国や日本において、細切りにして乾燥させ塩蔵したものを水で戻して酢の物や和え物などにするなど、一部が加工食品として利用されているが、消費量はそれほど多くはない。また、ミズクラゲについては、小型のため、加工食品に不向きである。このように、クラゲ類は、未利用でほとんど資源化されていない生物であるということができる。

0004

このため、クラゲを有効利用することを目的として、クラゲからコラーゲンを抽出する方法が開発されている(特許文献1〜3)。コラーゲンは、ゼラチンの材料や、健康食品の成分として産業上有用である。
これらの方法は、クラゲを細断又は粉砕した後、酵素によりクラゲの体組織を分解して、コラーゲンを可溶化して溶液に抽出し、塩析によりコラーゲン等のタンパク質を沈殿させて、コラーゲンを回収するものである。
しかし、これらの方法は、もっぱらコラーゲンを効率よく回収することを目的とするものであり、塩析により沈殿しない成分についてはあまり注目されてはいなかった。
また、これらの方法は、コラーゲンを効率よく回収することを目的とするため、体組織を分解するプロテアーゼ等による酵素反応を積極的に利用するものであった。

0005

尚、これらの方法とは全く正反対に、プロテアーゼ阻害剤高濃度塩化ナトリウムを含む溶液を用いて、ヒドラからという無脊椎動物からコラーゲンを溶解・抽出する方法が非特許文献1に記載されている。しかし、この方法は、学術的分析目的で特定のコラーゲンを抽出するものであった。

0006

コラーゲンについては、XVIII型コラーゲンC末端断片であるエンドスタチンというペプチドが、血管新生抑制作用を介して抗腫瘍活性を示すことが知られている。しかし、このペプチドの抗腫瘍活性に関する詳細な分子メカニズムは未だ十分に解明されていない(非特許文献2)。

0007

特開2008−31106号公報
特開2007−51191号公報
特開2004−99513号公報
Susan J. Fowlerら他5名、2000年発行、The Journal of Biological Chemistry、vol.275、50、pp.39589-39599
Huan-Li Xuら他3名、2008年発行、Current Protein & Peptide Science、vol.9、issue 3、pp.1389-2037

発明が解決しようとする課題

0008

本発明は、上記従来の状況に鑑み、クラゲの新たな有効利用を図ることを目的とするものである。

課題を解決するための手段

0009

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究した結果、特定の精製処理をしたクラゲ抽出画分が、以外にも、細胞接着阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

0010

すなわち、本発明は、次の(1)〜(6)のクラゲ抽出画分、これらのクラゲ抽出画分を含む細胞接着阻害剤(7)及び抗腫瘍剤(8)、並びに、細胞接着阻害活性を有するクラゲ画分の抽出方法(9)を提供するものである。

0011

(1)次の(A)〜(C)の工程を含む方法によりクラゲから抽出したことを特徴とする、クラゲ抽出画分:
(A)クラゲに、pHが6〜9の緩衝液、プロテアーゼ阻害剤及び終濃度が1〜6Mの塩化ナトリウムを加えてホモジナイズし、クラゲ混合液を得る工程;
(B)上記(A)の工程により得られたクラゲ混合液を、沈殿と上清に分離する工程;
(C)上記(B)の工程により分離された上清を、クラゲ抽出画分として回収する工程。

0012

(2)前記(A)の工程において、塩化ナトリウムの終濃度を1〜2Mとし、さらに、次の(D)〜(F)の工程により精製したことを特徴とする、上記(1)に記載のクラゲ抽出画分:
(D)前記(C)の工程により得られたクラゲ抽出画分に、終濃度が5〜6Mとなるように塩化ナトリウムを加える工程;
(E)上記(D)の工程により塩化ナトリウムを加えたクラゲ抽出画分を、沈殿と上清に分離する工程;
(F)上記(E)の工程により分離された上清を、クラゲ抽出画分として回収する工程。

0013

(3)さらに、次の(G)及び(H)の工程により精製したことを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載のクラゲ抽出画分:
(G)クラゲ抽出画分を、等電点電気泳動により分画する工程;
(H)上記(G)の工程により分画したクラゲ抽出画分のうち、等電点がpH3.5〜4.0の画分を回収する工程。

0014

(4)前記クラゲが、鉢虫綱に属するクラゲであることを特徴とする、上記(1)〜(3)のいずれかに記載のクラゲ抽出画分。

0015

(5)前記(A)の工程で加える緩衝液のpHが7〜8であることを特徴とする、上記(1)〜(4)のいずれかに記載のクラゲ抽出画分。

0016

(6)前記(A)の工程で使用するプロテアーゼ阻害剤が、エチレンジアミン四酢酸EDTA)、フェニルメチルスルフォニルフォルオライドPMSF)及びN−エチルマレイミド(NEM)の混合プロテアーゼであることを特徴とする、上記(1)〜(5)のいずれかに記載のクラゲ抽出画分。

0017

(7)上記(1)〜(6)のいずれかに記載のクラゲ抽出画分を含むことを特徴とする、細胞接着阻害剤。

0018

(8)上記(1)〜(6)のいずれかに記載のクラゲ抽出画分を含むことを特徴とする、抗腫瘍剤。

0019

(9)次の(A)〜(C)の工程を含むことを特徴とする、細胞接着阻害活性を有するクラゲ画分の抽出方法:
(A)クラゲに、pHが6〜9の緩衝液、終濃度が1〜6Mの塩化ナトリウム及びプロテアーゼ阻害剤を加えてホモジナイズし、クラゲ混合液を得る工程;
(B)上記(A)の工程により得られたクラゲ混合液を、沈殿と上清に分離する工程;
(C)上記(B)の工程により分離された上清を、クラゲ抽出画分として回収する工程。

発明の効果

0020

本発明のクラゲ抽出画分は、細胞接着阻害活性を奏するものである。さらに、(D)〜(F)ないし(G)、(H)の工程により精製されたクラゲ抽出画分は、細胞接着阻害成分がさらに純度が高く精製された画分であり、同じ濃度(mg/ml)でより高い細胞接着阻害活性を奏するものである。
また、本発明のクラゲ抽出画分は、抗腫瘍活性を奏するものである。
さらに、本発明の細胞接着阻害活性を有するクラゲ画分を抽出する方法は、医薬品等原料となる細胞接着阻害活性を有するクラゲ画分を効率よく抽出できるだけでなく、クラゲ体に多量に含まれる水と塩化ナトリウムを利用してコラーゲンを沈殿させるため、産業上有用なコラーゲンを経済的かつ効率よく回収することができるという優れた効果を奏するものである。

発明を実施するための最良の形態

0021

以下、本発明を実施するための最良の形態について説明する。尚、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
本発明の細胞接着阻害活性を有するクラゲ抽出画分は、次の(A)〜(C)の工程を含む方法によりクラゲから抽出することができる。
(A)クラゲに、pHが6〜9の緩衝液、終濃度が1〜6Mの塩化ナトリウム及びプロテアーゼ阻害剤を加えてホモジナイズし、クラゲ混合液を得る工程;
(B)上記(A)の工程により得られたクラゲ混合液を、沈殿と上清に分離する工程;
(C)上記(B)の工程により分離された上清を、クラゲ抽出画分として回収する工程。

0022

ここで、クラゲとは、刺胞動物門鉢虫綱、ヒドロ虫綱、十文字クラゲ綱及び箱虫綱に属する動物のうち、浮遊生活をする種を意味する。
例えば、鉢虫綱に属するクラゲとしては、根口クラゲ目に属するエチゼンクラゲ、ビゼンクラゲタコクラゲ、エビクラゲ及びサカラクラゲ等、口クラゲ目に属するミズクラゲ、ユウレイクラゲアカクラゲ等、クラゲ目に属するムラサキカムリクラゲ、クロカムリクラゲ、エフィラクラゲ等が挙げられる。

0023

また、ヒドロ虫綱に属するクラゲとしては、カミクラゲ、ウラマクラゲ、エダアシクラゲ、カツオカンムリ、ギンカクラゲ、オワンクラゲ、フサウミコップ、ハナガサクラゲ、マミズクラゲ、カギテクラゲ、カラカサクラゲ、ツヅミクラゲ、ニチリンクラゲ、カツオノエボシボウニラヨウラククラゲ、ハナワクラゲ、シダザクラクラゲ、ヒトツクラゲ等が挙げられる。
次に、十文字クラゲ綱に属するクラゲとしては、アサガオクラゲ、ムシクラゲ、ジュウモンジクラゲ等が挙げられる。
そして、箱虫綱に属するクラゲとしては、アンドンクラゲ、ハブクラゲ等が挙げられる。

0024

これらのクラゲのうち、特に鉢虫綱に属するクラゲを用いることが好ましい。より好ましくは、エチゼンクラゲ又はミズクラゲを用いるのがよい。

0025

また、上記(A)の工程で使用するpHが6〜9の緩衝液としては、特に限定されず、例えば、pHを6〜9に調整したクエン酸リン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液グリシン水酸化ナトリウム緩衝液などを用いることができる。
ここで、pHを6〜9に調整する方法としては、例えば、クエン酸−リン酸緩衝液の場合には、クエン酸とリン酸水素二ナトリウムのそれぞれの水溶液を混合して、モル比がおおよそ1:1〜1:4程度になるようにすればよい。また、リン酸緩衝液の場合には、リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムのそれぞれの水溶液を混合して、モル比がおおよそ10:1〜1:10になるようにすればよい。トリス−塩酸緩衝液の場合には、塩酸とトリス(ヒドロキシメチルアミノメタンの水溶液を混合して、モル比がおおよそ1:1〜1:10となるようにすればよい。そして、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液の場合には、水酸化ナトリウムとグリシンのそれぞれの水溶液を混合して、モル比がおおよそ1:1〜1:10となるようにすればよい。
より好ましくは、緩衝液のpHを7〜8に調整するがよく、この場合には、例えば、リン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液を用いることができる。

0026

上記(A)の工程で使用するプロテアーゼ阻害剤としては、至適pHが6〜9の間にあるプロテアーゼに対する阻害剤を用いることが好ましく、これらに限定されるわけではないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、フェニルメチルスルフォニルフォルオライド(PMSF)、N−エチルマレイミド(NEM)、N−トシル−L−フェニルアラニルクロロメチルケトンTPCK)、フッ化4−(2−アミノエチルベンゼンスルホニル塩酸塩AEBSF)、N−α−トシル−L−リシルクロロメチルケトン(TLCK)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(EGTA)等を用いることができ、またこれらを混合して用いることもできる。
これらの中でも特に、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、フェニルメチルスルフォニルフォルオライド(PMSF)及びN−エチルマレイミド(NEM)の混合物を用いることが好ましい。

0027

上記(A)の工程では、終濃度が1〜6Mとなるように塩化ナトリウムを加えるが、クラゲには、約0.6Mの塩化ナトリウムが含まれるため、これを差し引いた塩化ナトリウムを加えればよい。
高濃度の塩化ナトリウムを加えることにより、溶液中に分散しているコラーゲン等のタンパク質の一部が凝集して沈殿を始める。
従来のクラゲからコラーゲンを抽出する方法としては、まず、クラゲを脱水してから、溶媒を加えてコラーゲンを抽出する方法がある。しかし、本発明の方法では、クラゲを脱水することなく塩化ナトリウムを加えてコラーゲンを沈殿させるため、脱水する工程を簡略化できるのみならず、クラゲに含まれる水と塩化ナトリウムを有効利用できる経済性にも優れた方法である。実際、本発明の方法は、加える緩衝液の量はクラゲの体積の数分の1以下であってもよく、水をあまり必用としない方法である。

0028

上記(A)の工程では、クラゲをホモジナイズするが、ホモジナイズとはクラゲを細かくする方法であればいかなる方法でもよく、例えば、回転羽根スターラー等を用いて長時間攪拌する方法でもよいし、高速回転刃により揃断する方法であってもよいし、ミル等により破砕する方法でもあってもよいし、超音波により細分化する方法であってもよい。また、これらを組み合わせた方法であってもよい。

0029

なお、上記(A)の工程では、緩衝液の添加、プロテアーゼ阻害剤の添加、塩化ナトリウムの添加及びホモジナイズを行うが、これらは、どのような順序で行ってもよい。
しかしながら、再現性よく細胞接着阻害活性画分を得るためには、ホモジナイズの前にプロテアーゼ阻害剤を添加しておくことが好ましい。例えば、緩衝液、プロテアーゼ阻害剤及び塩化ナトリウムを加えてからホモジナイズすることができ、あるいは、緩衝液及びプロテアーゼ阻害剤を加えてからホモジナイズし、その後に塩化ナトリウムを加えることもできる。

0030

上記(B)の工程は、上記(A)の工程で得られたクラゲ混合液を、沈殿と上清に分離する工程である。
ここで、沈殿と上清に分離するとは、不溶物と溶液とを分離することを意味する。例えば、遠心分離により沈殿と上清を分離する方法でもよいし、長時間静置して沈殿と上清を分離する方法であってもよいし、膜により沈殿物濾過する方法であってもよい。また、これらを組み合わせた方法であってもよい。
この中でも遠心分離による方法が短時間にできるため好ましく、例えば、遠心分離機を用いて、4000〜12000rpmで5〜20分間遠心することにより、不溶物を沈殿させることができる。

0031

上記(C)の工程は、上記(B)の工程で分離した上清を回収する工程であり、例えば、デカンテーションや、ピペット等により上清のみを回収することができる。
このようにして回収された上清は、細胞接着阻害活性を有する成分を有する画分である。また、残った沈殿は、コラーゲンを主体とするタンパク質等の凝集物であり、これをコラーゲン材料として利用することができる。

0032

本発明の細胞接着阻害活性を有するクラゲ抽出画分は、上記のように(A)〜(C)の工程により得ることができるが、(A)〜(C)以外の工程をさらに前中後に含む方法により得られるものであってもよい。
例えば、上記の(A)〜(C)の工程の後に、次の(D)〜(F)の工程によりさらに精製することができる。
ただし、この場合には、(A)の工程において、塩化ナトリウムの終濃度を1〜2Mとして、一段回目は低い塩化ナトリウム濃度で塩析し、次の(D)〜(F)からなる二段階目の塩析において高い塩化ナトリウム濃度で塩析する:
(D)前記(C)の工程により得られたクラゲ抽出画分に、終濃度が5〜6Mとなるように塩化ナトリウムを加える工程;
(E)上記(D)の工程により塩化ナトリウムを加えたクラゲ抽出画分を、沈殿と上清に分離する工程;
(F)上記(E)の工程により分離された上清を、クラゲ抽出画分として回収する工程。

0033

上記の(A)〜(C)の工程により得られたクラゲ抽出画分又は上記の(A)〜(F)の工程により得られたクラゲ抽出画分は、さらに次の(G)及び(H)の工程により精製することができる。
(G)クラゲ抽出画分を、等電点電気泳動により分画する工程;
(H)上記(G)の工程により分画したクラゲ抽出画分のうち、等電点がpH3.5〜4.0の画分を回収する工程。

0034

ここで、等電点電気泳動とは、高分子化合物の有する固有の等電点の違いにより、高分子化合物を分離・同定する技術である。所定のpH勾配を有する媒体中で、高分子化合物を電気泳動すると、電荷を有する高分子化合物がpH勾配の中を移動する。そして、移動に伴い高分子化合物の周囲のpHが変化すると、高分子化合物の有するイオン性基により生ずる電荷がpH依存的に変化する。そして、その高分子化合物の有する固有の等電点と同じpH領域に達すると電荷の総和がゼロとなり、電界中での高分子化合物の移動が停止する。このようにして、高分子化合物を等電点に応じて分離することができる。

0035

等電点電気泳動において、所定のpH勾配を有する媒体は、例えば、両性担体を含む溶液又はゲル電場をかけてpH勾配を形成する手法や、様々なpIの側鎖を持つアクリルアミド誘導体を用いてゲル作製と同時にpH勾配を形成する固定化pH勾配法(IPG法:Immobilized pH gradient)等がある。
ここで、両体担体としては、市販のものを利用することができ、例えば、ファルマライトTM(Pharmalyte、GEヘルスケアバイオサイエンス社)、バイオライト(バイオ・ラッドラボラトリーズ社)等を用いることができる。
固定化pH勾配法(IPG法)により作製されたゲルとしては、市販のものを利用することができ、例えば、ImmobilineTM DryStrip(GEヘルスケアバイオサイエンス社)、IPG ReadyStrip(バイオ・ラッドラボラトリーズ社)等を用いることができる。

0036

等電点電気泳動により分画されたクラゲ抽出画分のうち、等電点がpH3.5〜4.0の画分を回収する方法は、例えば、複数の部屋からなる電気泳動槽を有する液相等電点電気泳動装置や、キャピラリー式の等電点電気泳動装置を用いることにより実施することができる。
例えば、複数の部屋からなる電気泳動槽を有する液相等電点電気泳動装置としては、バイオ・ラッドラボラトリーズ社のロトフォアを用いることができる。
この装置を用いた場合、次の1)〜7)の工程により、等電点がpH3.5〜4.0の画分を回収することができる。
1)ロトフォアユニットを組み立て、内部を20の部屋にフィルター仕切り、サンプル採取穴をテープでふさぐ。
2)泳動槽上部のサンプル注入口からサンプルを注入し、蓋をして注入口をふさぐ。
3)12W定電圧で5時間電気泳動を行う。
4)サンプル採取穴からニードルを差し込んでサンプルを採取、分画する。
5)各分画のpHを試験紙により計測する。
6)各分画に最終濃度モルになるようにNaClを加え、サンプルと両性担体を解離させる。
7)超純水に対して透析を行うことで両性担体を除去する。

0037

本発明において、クラゲ抽出画分とは、上記の工程により得られた画分の水分を気化などして濃縮したものないし乾固したものを含むものであり、また、水を添加して希釈したものも含むものである。

0038

本発明のクラゲ抽出画分は、実施例2からも明らかなように、細胞接着阻害活性を有するため、細胞接着阻害剤として使用することができる。
細胞接着とは、フィブロネクチンインテグリンカドヘリンその他の多様な接着分子により、細胞細胞外マトリックス接着することや、細胞同士が接着する現象をいう。細胞接着は、細胞の分化、細胞間の情報伝達、細胞の機能発現に重要な役割を果たしているため、細胞接着を阻害する物質は、細胞機能を調節する薬剤とすることができる。従って、本発明の細胞接着阻害剤は、例えば、がん浸潤転移血栓形成アポトーシス創傷治癒炎症反応免疫応答血管新生止血などを制御する薬剤として使用することができる。

0039

本発明のクラゲ抽出画分は、実施例4からも明らかなように、抗腫瘍活性を有するため、抗腫瘍剤として使用することができる。
ここで、腫瘍とは、生体が有する制御機構に反して細胞が過剰に増殖する組織又は疾患をいい、例えば、肺癌皮膚癌メラノーマ胃癌白血病大腸癌肝臓癌食道癌結腸癌直腸癌膵臓癌卵巣癌膀胱癌前立腺癌睾丸腫瘍悪性リンパ種、骨肉種、子宮頸癌脳腫瘍等が挙げられる。
本発明のクラゲ抽出画分は、特に肺癌、メラノーマに対して強い抗腫瘍活性を有すると考えられるため、肺癌又はメラノーマ用の抗腫瘍剤とすることが好ましい。
本発明の抗腫瘍剤は、本発明のクラゲ抽出画分をフィルターにより滅菌濾過し、あるいは、精製することにより製造することができる。

0040

次に、実施例を示して、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

0041

(クラゲからの細胞接着阻害画分の抽出)
本願明細書の図1に示すスキームにより、クラゲ体から抽出した溶液の分画を行った。より詳細には、次の(1)〜(14)の操作を行った。また、得られた各画分をSDS−PAGEにより電気泳動を行った(15)。
(1)次の試料及び試薬を混合し、メスシリンダーで100mlにメスアップして、クラゲ混合液を作製した。
クラゲ(エチゼンクラゲ又はミズクラゲ) 100g
1MのTris−HCL(pH7.6) 5ml
固形NaCl 2.55g
中性プロテアーゼ阻害剤ミックス(100×)
0.5Mのエチレンジアミン四酢酸(EDTA) 1ml
0.1Mのフェニルメチルスルフォニルフォルオライド(PMSF) 1ml
0.2MのN−エチルマレイミド(NEM) 1ml
ここで、クラゲ100gには、NaClが約3.3g含まれており、NaClは合計で5.85g(0.1mol)となるため、NaClの終濃度は1Mである。
(2)上記のクラゲ混合液を4℃で一晩攪拌した。
(3)8000rpmで30分間遠心し、1M NaCl可溶性画分を回収した。
(4)1M NaCl可溶性画分に、4M分のNaClを加え、最終濃度5M NaClとし、完全に溶解させた後、4℃で一晩静置した。
(5)8000rpmで15分間遠心し、上清(NaCl sup)と沈殿(NaCl ori)に分けた。
(6)上清(NaCl sup)は超純水に透析することで脱塩を行った後に、凍結乾燥した。
(7)沈殿(NaCl ori)は、0.5M酢酸に一晩以上完全に溶解させた後、最終濃度3MとなるようにNaClを加え、完全に溶解させた後、コラーゲンを沈殿させるために、4℃で一晩静置した。
(8)8000rpmで15分間遠心し、上清(NaCl ps)と沈殿(AcOH ppt)に分けた。
(9)上清(NaCl ps)は超純水に透析することで脱塩を行った後、凍結乾燥して保存した。
(10)沈殿(AcOH ppt)は、0.5M酢酸に一晩以上完全に溶解させた後、5mM酢酸に対して透析することで脱塩を行った後に、凍結乾燥して保存した。
(11)以上の操作により、1M NaCl可溶性画分を、NaCl sup、NaCl ori、NaCl ps及びAcOH pptの4つに分画した。
(12)上記(3)の操作で生じた沈殿に0.5Mの酢酸を加えて溶解させ、上清を回収した。
(13)上清に4M分のNaClを加え、最終濃度5M NaClとし、完全に溶解させた後、コラーゲンを沈殿させるために、4℃で一晩静置した。
(14)8000rpmで15分間遠心し、上清を取り除き、残った沈殿物を0.5M酢酸に一晩以上完全に溶解させ、次に、5mM酢酸に対して透析することで脱塩を行ってから凍結乾燥して保存した(AcOH sup)。
(15)上記の操作により得られた、NaCl sup、NaCl ori、NaCl ps、AcOH ppt及びAcOH supを、12.5%のアクリルアミドゲルを用い、ジチオトレイトール(DTT)の存在下及び非存在下において、SDS−PAGEにより電気泳動を行った。その結果を図2に示す。図2に示されるように、各画分に共通の成分と特異的な成分とが混在していた。

0042

(細胞接着評価試験
(1)検体試料塗布シャーレの作製
実施例1により凍結乾燥した各画分を2mg/mlで5mM酢酸に溶解し、これを原液とした。NaCl supについては、2mg/ml、0.4mg/ml、0.08mg/ml、0.016mg/mlの5倍希釈系列も作製した。
各シャーレへの塗布量は以下のとおりとし、セルスクレーパーを用いてシャーレに均一に塗布し、紫外線照射下で1時間乾燥した。

培養用シャーレ検体塗布量 2mg/mlとして
直径10センチの4分割 50マイクロリットル100μg/ml
直径6センチの2分割 50マイクロリットル 100μg/ml
直径2センチ 10マイクロリットル 20μg/ml

(2)細胞の播種
生理食塩水でシャーレを2回洗浄後、以下の細胞数にてシャーレに各細胞を播種した。

直径2センチの培養シャーレ 10万個程度
直径6センチの培養シャーレ100万個程度
直径10センチの培養シャーレ 300万個程度

播種より2時間又は一晩経過後に2%パラフォルムアルデヒドで固定をし、生理食塩水で洗浄後、10倍希釈ギムザ染色液で染色を行った。続いて、余分な色素洗浄除去した後、写真撮影を行った。
(3)結果
細胞接着実験に使用した細胞株とその結果は、以下のとおりである。
すなわち、NaCl sup、NaCl ori、NaCl ps、AcOH ppt及びAcOH supのうち、細胞接着阻害活性を示したのは、NaCl supとNaCl psであり(図1参照)、NaCl supは、特にメラノーマと肺がんに対して強い細胞接着阻害活性を示した(図3参照)。
腫瘍細胞
マウス悪性黒色腫(メラノーマ)細胞株(B16F10)図1、3及び4に結果を示す。
マウスルイス肺がん細胞株LLC)図3及び4に結果を示す。
マウス肝細胞がん細胞株(Hepa1-6)図3及び4に結果を示す。
マウス乳がん細胞株(Jyg-MC(A))図3に結果を示す。
マウス骨肉腫細胞株(LM8)図3に結果を示す。
(正常細胞)
マウス線維芽細胞(NIH3T3)図4に結果を示す。
マウス未分化間葉系細胞(C3H10T1/2)効果なし
マウス筋芽細胞(C2C12) 効果なし
イヌ骨肉種細胞効果なし
ウマ腱細胞効果なし

0043

(等電点電気泳動による精製)
実施例2により細胞接着阻害活性成分を有することが認められたクラゲ抽出画分を、さらに次の1)〜9)の工程からなる等電点電気泳動を用いた方法により分画した。各画分をシャーレに塗布して細胞接着阻害活性を試験した結果、図5に示すように、等電点がpI4あたりの画分に細胞接着阻害活性成分を濃縮できたことが確認された。
1)180mgの凍結乾燥したNaCl supを3mg/mlの濃度で3モル尿素60mlに溶解した。
2)4℃にて、数時間〜一晩攪拌して溶解させた。
3)最終濃度2%となるように両性担体であるバイオライト(バイオ・ラッドラボラトリーズ社)1.2ml添加した。
4)4℃、8000rpm、30分の遠心分離にて不溶物を除去した。
5)上清を液相等電点電気泳動装置(バイオラッド・ロトフォア)に添加し、陽極液を0.1モルリン酸陰極液を0.1モル水酸化ナトリウムとし、定電力12Wで6時間電気泳動を行った。
6)陰極側から陽極側に計20画分に分取した。
7)各溶液に最終濃度1モルになるように塩化ナトリウムを加えてタンパク質と両性担体を解離させ、両性担体の除去を容易にした。
8)上記(7)の各溶液を、超純水に対して充分透析を行った後、凍結乾燥した。
9)超純水に2mg/mlで溶解し、次の実験に用いた。
10)
a.上記(9)の各画分溶液を、7.5%のアクリルアミドのゲルでSDS−PAGEにより電気泳動し解析を行った。
b.上記(9)の各画分溶液を、実施例2に記載の方法と同様にシャーレに塗布し、細胞接着阻害活性を試験した。
a.及びb.の結果を図5に示す。

0044

抗腫瘍実験)
本発明のクラゲ抽出画分を用いて、次の抗腫瘍実験を行った。
(1)NaCl sup、AcOH sup又は生理食塩水と、マウスの悪性黒色腫(メラノーマ)細胞株(B176F10)との混合液を、C57BL/6雌マウスの皮下、皮内並びに尾静脈内へ各々100万個を接種した。
(2)その間、マウスは自由に飲水摂食できるようにした。
(3)接種より、2週間後にと殺、接種部位及び腫瘍臓器摘出し、4%パラフォルムアルデヒドにより固定した。
(4)パラフィン切片を作製し、顕微鏡観察を行った。
(5)結果
NaCl supと悪性黒色腫を混合したものを接種した個体では、への腫瘍転移は確認されなかった。一方、AcOH sup又は生理食塩水と悪性黒色腫を混合したものの接種では、明らかに腫瘍の肺転移巣を形成した。
このことから、本発明のクラゲ抽出画分の細胞接着阻害活性は、腫瘍細胞の細胞接着やそれに引き続く増殖及び転移を抑制する効果を示した。

0045

本発明のクラゲ抽出画分は、細胞接着阻害活性を有するため、例えば、がんの浸潤・転移、血栓形成、アポトーシス、創傷治癒、炎症反応、免疫応答、血管新生、止血などを制御する薬剤若しくはその原材料又は食品添加物等として有用である。
本発明のクラゲ抽出画分は、特に、医薬用の抗腫瘍剤又はその原材料として有用である。

図面の簡単な説明

0046

本発明のクラゲ抽出画分の抽出・分離方法及び得られたクラゲ抽出画分の悪性黒色腫(メラノーマ)細胞株(B16F10)に対する細胞接着阻害活性試験の結果を示す図である。
図1の方法により得られた各クラゲ抽出画分をSDS−PAGEにより電気泳動した結果を示す図である。
図1の方法により得られたクラゲ抽出画分NaCl supの各腫瘍細胞株に対する細胞接着阻害活性を試験した結果を示す図である。
クラゲ抽出画分NaCl supの希釈系列の各腫瘍細胞株に対する細胞接着阻害活性を試験した結果を示す図である。
クラゲ抽出画分NaCl supを等電点電気泳動しさらに2次元電気泳動した結果と、細胞接着阻害活性を示す等電点電気泳動画分を示す図である。

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