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課題・解決手段

本発明は、免疫原性組成物、例えば、多糖類タンパク質複合体およびタンパク質免疫原の安定性を改善するための当該分野における必要性に関する。本発明は、概して、免疫原性組成物を安定化させ、阻害する新規処方に関する。さらに詳細には、以下に記載される本発明は、免疫原性組成物を安定化させ、微粒子形成(例えば、凝集沈殿)を阻害する処方に対する当該分野における必要性に取り組み、この免疫原性組成物は、容器手段、例えば、発酵槽生物反応器バイアルフラスコバッグシリンジゴム栓チューブなどの中で加工、開発、処方、製造および/または貯蔵される。

概要

背景

生物薬剤分野において、免疫原性組成物(例えば、タンパク質免疫原多糖類タンパク質複合体)の安定性を改善することは、必要であり、かつ非常に望ましい目標であることが一般的に認められている。例えば、免疫原性組成物は、患者投与される場合に、新鮮で、的確で、専門的でなければならない。免疫性組成物の安定性および/または外観における変化、例えば、変色、混濁または白濁のために、患者または使用者製品信用できなくなる。さらに、多くの免疫原性処方は多剤容器中に分配されるので、長時間にわたって活性成分(例えば、多糖類−タンパク質複合体)の用量の均一性保証されなければならない(例えば、白濁溶液は、不均一な用量パターンつながり得る)。さらに、免疫原性組成物は、その「予想される」保存期間全体にわたって活性でなければならず、免疫原性組成物が不活性または他の望ましくない形態(例えば、凝集物)へ分解すると、生成物の全濃度が低下する。

特定の免疫原性組成物(例えば、タンパク質免疫原、多糖類−タンパク質複合体)の安定性は、特異的タンパク質またはキャリアタンパク質に少なくとも一部依存することが文献で報告されている(Hoら、2001;Hoら、2002;Bolgianoら、2001)。例えば、破傷風トキソイド(TT)またはCRM197キャリアタンパク質のいずれかと共役する髄膜炎菌性C(MenC)多糖類およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)b型(Hib)多糖類の安定性分析により、キャリアタンパク質に依存する様々な安定性が明らかになった(Hoら、2002)。別の研究(Hoら、2001)において、2つの異なる製造業者から得られるMenC−CRM197複合体が分析され(Hoら、2001)、この場合、MenC−CRM197複合体はその共役化学および複合体多糖類(どちらも同じキャリアタンパク質、CRM197を有する)の長さが異なっていた。この研究から得られるデータは、共役化学(例えば、直接または化学的スペーサー基を介するかのいずれかの還元的アミノ化)、共役部位の数、多糖類鎖の長さ、pH、貯蔵緩衝液貯蔵温度および凍結解凍サイクルなどの因子も免疫原性組成物の安定性に影響を及ぼすことがさらに示された。

したがって、免疫原性組成物の処方を開発する場合、安全で安定で、強固であり費用有効性である生成物を保証するために、多くの因子を考慮しなければならない。このような検討事項には、これに限定されないが、免疫原性組成物の化学的安定性(例えば、多糖類の加水分解、多糖類の解重合タンパク質分解またはタンパク質フラグメンテーション)、免疫原性組成物の物理的/熱安定性(例えば、凝集沈殿吸着)、免疫原性組成物の容器/密封システムとの適合性、免疫原性組成物と不活性成分(例えば、緩衝液、塩、賦形剤抗凍結剤)間の相互作用、製造プロセス、投与形態(例えば、凍結乾燥液体)、輸送、貯蔵および取り扱い中遭遇する環境条件(例えば、温度、湿度剪断力)、製造から使用までの時間の長さが含まれる。

タンパク質二次および三次構造変化を誘発するシリコーン油は、あるタンパク質医薬製剤においてみられる凝集/沈殿に関与し得ることが当該分野では示唆されている(Jonesら、2005)。例えば、1980年代には、ヒトインシュリンの凝集における原因物質として、使い捨てプラスチックシリンジからのシリコーン油の放出が数件報告されている(ChantelauおよびBerger、1985;Chantelauら、1986;Chantelau、1989;Bernstein、1987;Baldwin、1988;CollierおよびDawson、1985)。Chantelauら(1986)の観察によると、10回分のインシュリン製剤から3回以上抜き取った(シリコーン処理された使い捨てシリンジを使用)後に、シリコーン油混入のためにバイアルが混濁し始め、その結果、インシュリンは凝集し、不活性化した(Chantelauら、1986)。逆説的に、シリコーン油はプラスチックの必須成分である。なぜなら、ゴム栓潤滑化し、この栓がシリンジバレルの下へ移動するのを容易にする(即ち、シリコーン油は処方のシリンジ通過性を改善する)ためである。

さらに、シリコーン油の使用は、シリンジに限定されない。その理由は、タンパク質吸着を最小限に抑えるためのガラスバイアルコーティングとして、充填作業中のゴム栓の集塊を予防するための潤滑剤として、ガラスおよびエラストマー密封装置の処理可能性/機械加工性に重要な潤滑剤として、そしてバイアルゴム栓に針が貫通するのを容易にするための潤滑剤として使用されるためである。さらに、シリンジ、ガラスバイアル、ゴム栓などのシリコーン処理は、十分に制御されず、また標準化もされていないプロセスであり、したがって、ロットごとのシリコーン油含量のばらつきが大きい。

概要

本発明は、免疫原性組成物、例えば、多糖類−タンパク質複合体およびタンパク質免疫原の安定性を改善するための当該分野における必要性に関する。本発明は、概して、免疫原性組成物を安定化させ、阻害する新規処方に関する。さらに詳細には、以下に記載される本発明は、免疫原性組成物を安定化させ、微粒子形成(例えば、凝集、沈殿)を阻害する処方に対する当該分野における必要性に取り組み、この免疫原性組成物は、容器手段、例えば、発酵槽生物反応器、バイアル、フラスコバッグ、シリンジ、ゴム栓、チューブなどの中で加工、開発、処方、製造および/または貯蔵される。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

多糖類タンパク質複合体を安定化させる処方であって、(i)pH緩衝塩溶液、ここで該緩衝液は、約3.5から約7.5のpKaを有する、(ii)界面活性剤および(iii)1つまたは複数の多糖類−タンパク質複合体を含む処方。

請求項2

多糖類−タンパク質複合体処方が、バイアルバイアルストッパー、バイアル密封装置ガラス密封装置、ゴム密封装置、プラスチック密封装置、シリンジシリンジストッパーシリンジプランジャーフラスコビーカー目盛付シリンダー発酵槽生物反応器チューブパイプバッグジャーアンプルカートリッジおよび使い捨てペンからなる群の1つまたは複数から選択される容器手段中に含まれる、請求項1記載の処方。

請求項3

容器手段がシリコーン処理されている請求項1記載の処方。

請求項4

緩衝液が、1mMから10mMの最終濃度およびpH5.8から6.0のコハク酸塩である請求項1記載の処方。

請求項5

界面活性剤がポリソルベート80である請求項1記載の処方。

請求項6

処方中のポリソルベート80の最終濃度が、処方の少なくとも0.01%から10%ポリソルベート80重量/体積である請求項5記載の処方。

請求項7

多糖類−タンパク質複合体が1つまたは複数の肺炎球菌多糖類を含む請求項1記載の処方。

請求項8

1つまたは複数の髄膜炎菌性多糖類、1つまたは複数の髄膜炎菌性抗原タンパク質、またはその組み合わせをさらに含む請求項1記載の処方。

請求項9

1つまたは複数の連鎖球菌多糖類、1つまたは複数の連鎖球菌抗原タンパク質、またはその組み合わせをさらに含む請求項1記載の処方。

請求項10

多糖類−タンパク質複合体処方が、CRM197ポリペプチドと共役するエスニューモニエ(S.pneumoniae)血清型多糖類複合体、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型6B多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型9V多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型14多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型18C多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型19F多糖類、およびCRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型23F多糖類複合体を含む、7価肺炎球菌複合体(7vPnC)処方である、請求項1記載の処方。

請求項11

多糖類−タンパク質複合体処方が、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型4多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型6B多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型9V多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型14多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型18C多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型19F多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型23F多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型1多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型3多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型5多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型6A多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型7F多糖類およびCRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型19A多糖類を含む13価肺炎球菌複合体(13vPnC)処方である、請求項1記載の処方。

請求項12

処方がアジュバントをさらに含む請求項1記載の処方。

請求項13

アジュバントがリン酸アルミニウムである請求項12記載の処方。

請求項14

連鎖球菌C5aペプチダーゼSCP組成物を安定化させる処方であって、(i)pH緩衝塩溶液、ここで該緩衝液は約3.5から約6.5のpKaを有する、(ii)界面活性剤および(iii)連鎖球菌C5aペプチダーゼを含む処方。

請求項15

SCP処方が、バイアル、バイアルストッパー、バイアル密封装置、ガラス密封装置、ゴム密封装置、プラスチック密封装置、シリンジ、シリンジストッパー、シリンジプランジャー、フラスコ、ビーカー、目盛付シリンダー、発酵槽、生物反応器、チューブ、パイプ、バッグ、ジャー、アンプル、カートリッジおよび使い捨てペンからなる群の1つまたは複数から選択される容器手段中に含まれる、請求項14記載の処方。

請求項16

容器手段がシリコーン処理されている請求項15記載の処方。

請求項17

緩衝液が、1mMから10mMの最終濃度およびpH5.8から6.0のコハク酸塩である請求項14記載の処方。

請求項18

界面活性剤がポリソルベート80である請求項14記載の処方。

請求項19

処方中の前記ポリソルベート80の最終濃度が処方の0.01%から10%ポリソルベート80重量/体積である請求項18記載の処方。

請求項20

SCP組成物が、連鎖球菌ポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド、髄膜炎菌性ポリペプチドおよびブドウ球菌ポリペプチドから選択される1つまたは複数のポリペプチドをさらに含む請求項14記載の処方。

請求項21

SCP組成物が、連鎖球菌多糖類、肺炎球菌多糖類、髄膜炎菌性多糖類およびブドウ球菌多糖類からなる群から選択される1つまたは複数の多糖類をさらに含む、請求項14記載の処方。

請求項22

処方が、アジュバントをさらに含む請求項14記載の処方。

請求項23

アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムである請求項22記載の処方。

請求項24

シリコーン処理された容器手段中に含まれる多糖類−タンパク質複合体の、シリコーンにより誘発される凝集阻害する処方であって、(i)pH緩衝塩溶液、ここで該緩衝液は約3.5から約7.5のpKaを有する、(ii)アルミニウム塩および(iii)1つまたは複数の多糖類−タンパク質複合体を含む処方。

請求項25

緩衝液が、1mMから0mMの最終濃度およびpH5.8から6.0のコハク酸塩である請求項24記載の処方。

請求項26

ポリソルベート80(Tween(商標)80)をさらに含み、前記処方中のポリソルベート80の最終濃度が、処方の少なくとも0.01%から10%ポリソルベート80重量/体積である、請求項24記載の処方。

請求項27

多糖類−タンパク質複合体が1つまたは複数の肺炎球菌多糖類を含む、請求項24記載の処方。

請求項28

1つまたは複数の髄膜炎菌性多糖類、1つまたは複数の髄膜炎菌性抗原タンパク質、またはその組み合わせをさらに含む、請求項24記載の処方。

請求項29

1つまたは複数の連鎖球菌多糖類、1つまたは複数の連鎖球菌抗原タンパク質、またはその組み合わせをさらに含む、請求項24記載の処方。

請求項30

アジュバントをさらに含む請求項24記載の処方。

請求項31

シリコーン処理された容器手段中に含まれる連鎖球菌C5aペプチダーゼ(SCP)組成物のシリコーンにより誘発される凝集を阻害する処方であって、(i)pH緩衝塩溶液、ここで該緩衝液は約3.5から約6.5のpKaを有する、(ii)アルミニウム塩および(iii)連鎖球菌C5aペプチダーゼを含む処方。

請求項32

緩衝液が、1mMから10mMの最終濃度およびpH5.8から6.0のコハク酸塩である、請求項31記載の処方。

請求項33

ポリソルベート80(Tween(商標)80)をさらに含み、前記処方中の前記ポリソルベート80の最終濃度が、処方の少なくとも0.01%から10%ポリソルベート80重量/体積である、請求項31記載の処方。

請求項34

SCP組成物が、連鎖球菌ポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド、髄膜炎菌性ポリペプチドおよびブドウ球菌ポリペプチドから選択される1つまたは複数のポリペプチドをさらに含む、請求項31記載の処方。

請求項35

SCP組成物が、連鎖球菌多糖類、肺炎球菌多糖類、髄膜炎菌性多糖類およびブドウ球菌多糖類からなる群から選択される1つまたは複数の多糖類をさらに含む、請求項31記載の処方。

請求項36

処方がアジュバントをさらに含む、請求項31記載の処方。

請求項37

髄膜球菌(N.meningitidis)2086タンパク質組成物を安定化させる処方であって、(i)pH緩衝塩溶液(前記緩衝液は、約3.5から約7.5のpKaを有する)、(ii)界面活性剤および(iii)髄膜球菌2086タンパク質を含む処方。

請求項38

界面活性剤がポリソルベート80である、請求項37記載の処方。

請求項39

処方がアルミニウム塩アジュバントをさらに含む、請求項37記載の処方。

請求項40

シリコーン処理された容器手段中に含まれる髄膜球菌2086タンパク質組成物のシリコーンにより誘発される凝集を阻害する処方であって、(i)pH緩衝塩溶液、ここで該前記緩衝液は、約3.5から約7.5のpKaを有する、(ii)アルミニウム塩および(iii)髄膜球菌2086タンパク質を含む処方。

技術分野

0001

本発明は、一般に、免疫学細菌学ワクチン処方タンパク質定性およびプロセス開発の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、免疫原性組成物沈殿阻害する新規処方に関する。

背景技術

0002

生物薬剤分野において、免疫原性組成物(例えば、タンパク質免疫原多糖類タンパク質複合体)の安定性を改善することは、必要であり、かつ非常に望ましい目標であることが一般的に認められている。例えば、免疫原性組成物は、患者投与される場合に、新鮮で、的確で、専門的でなければならない。免疫性組成物の安定性および/または外観における変化、例えば、変色、混濁または白濁のために、患者または使用者製品信用できなくなる。さらに、多くの免疫原性処方は多剤容器中に分配されるので、長時間にわたって活性成分(例えば、多糖類−タンパク質複合体)の用量の均一性保証されなければならない(例えば、白濁溶液は、不均一な用量パターンつながり得る)。さらに、免疫原性組成物は、その「予想される」保存期間全体にわたって活性でなければならず、免疫原性組成物が不活性または他の望ましくない形態(例えば、凝集物)へ分解すると、生成物の全濃度が低下する。

0003

特定の免疫原性組成物(例えば、タンパク質免疫原、多糖類−タンパク質複合体)の安定性は、特異的タンパク質またはキャリアタンパク質に少なくとも一部依存することが文献で報告されている(Hoら、2001;Hoら、2002;Bolgianoら、2001)。例えば、破傷風トキソイド(TT)またはCRM197キャリアタンパク質のいずれかと共役する髄膜炎菌性C(MenC)多糖類およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)b型(Hib)多糖類の安定性分析により、キャリアタンパク質に依存する様々な安定性が明らかになった(Hoら、2002)。別の研究(Hoら、2001)において、2つの異なる製造業者から得られるMenC−CRM197複合体が分析され(Hoら、2001)、この場合、MenC−CRM197複合体はその共役化学および複合体多糖類(どちらも同じキャリアタンパク質、CRM197を有する)の長さが異なっていた。この研究から得られるデータは、共役化学(例えば、直接または化学的スペーサー基を介するかのいずれかの還元的アミノ化)、共役部位の数、多糖類鎖の長さ、pH、貯蔵緩衝液貯蔵温度および凍結解凍サイクルなどの因子も免疫原性組成物の安定性に影響を及ぼすことがさらに示された。

0004

したがって、免疫原性組成物の処方を開発する場合、安全で安定で、強固であり費用有効性である生成物を保証するために、多くの因子を考慮しなければならない。このような検討事項には、これに限定されないが、免疫原性組成物の化学的安定性(例えば、多糖類の加水分解、多糖類の解重合タンパク質分解またはタンパク質のフラグメンテーション)、免疫原性組成物の物理的/熱安定性(例えば、凝集、沈殿、吸着)、免疫原性組成物の容器/密封システムとの適合性、免疫原性組成物と不活性成分(例えば、緩衝液、塩、賦形剤抗凍結剤)間の相互作用、製造プロセス、投与形態(例えば、凍結乾燥液体)、輸送、貯蔵および取り扱い中遭遇する環境条件(例えば、温度、湿度剪断力)、製造から使用までの時間の長さが含まれる。

0005

タンパク質二次および三次構造変化を誘発するシリコーン油は、あるタンパク質医薬製剤においてみられる凝集/沈殿に関与し得ることが当該分野では示唆されている(Jonesら、2005)。例えば、1980年代には、ヒトインシュリンの凝集における原因物質として、使い捨てプラスチックシリンジからのシリコーン油の放出が数件報告されている(ChantelauおよびBerger、1985;Chantelauら、1986;Chantelau、1989;Bernstein、1987;Baldwin、1988;CollierおよびDawson、1985)。Chantelauら(1986)の観察によると、10回分のインシュリン製剤から3回以上抜き取った(シリコーン処理された使い捨てシリンジを使用)後に、シリコーン油混入のためにバイアルが混濁し始め、その結果、インシュリンは凝集し、不活性化した(Chantelauら、1986)。逆説的に、シリコーン油はプラスチックの必須成分である。なぜなら、ゴム栓潤滑化し、この栓がシリンジバレルの下へ移動するのを容易にする(即ち、シリコーン油は処方のシリンジ通過性を改善する)ためである。

0006

さらに、シリコーン油の使用は、シリンジに限定されない。その理由は、タンパク質吸着を最小限に抑えるためのガラスバイアルコーティングとして、充填作業中のゴム栓の集塊を予防するための潤滑剤として、ガラスおよびエラストマー密封装置の処理可能性/機械加工性に重要な潤滑剤として、そしてバイアルゴム栓に針が貫通するのを容易にするための潤滑剤として使用されるためである。さらに、シリンジ、ガラスバイアル、ゴム栓などのシリコーン処理は、十分に制御されず、また標準化もされていないプロセスであり、したがって、ロットごとのシリコーン油含量のばらつきが大きい。

発明が解決しようとする課題

0007

従って、免疫原性組成物の安定性を向上させ、沈殿を阻害する処方が当該分野において継続して必要とされている。

課題を解決するための手段

0008

本発明は概して、免疫原性組成物を安定化させ、その沈殿を阻害する新規処方に関する。さらに詳細には、ある実施形態において、本発明は容器手段中に含まれる免疫原性組成物の沈殿を阻害する新規処方に関する。ある特定の実施形態において、本発明は、シリコーン油相互作用、剪断力、輸送時の攪拌などに対して免疫原性組成物を安定化させる新規処方に関する。

0009

従って、ある実施形態において、本発明は、多糖類−タンパク質複合体を安定化させる処方に関し、この処方は、(i)pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約7.5のpKaを有する)、(ii)界面活性剤および(iii)1つまたは複数の多糖類−タンパク質複合体を含む。一つの特定の実施形態において、多糖類−タンパク質複合体処方は、容器手段中に含まれる。ある実施形態において、この容器手段は、バイアル、バイアルストッパー、バイアル密封装置、ガラス密封装置、ゴム密封装置、プラスチック密封装置、シリンジ、シリンジストッパーシリンジプランジャーフラスコビーカー目盛付シリンダー発酵槽生物反応器チューブパイプバッグジャーアンプルカートリッジおよび使い捨てペンからなる群の1つまたは複数から選択される。ある実施形態において、この容器手段はシリコーン処理されている。

0010

ある実施形態において、処方のpH緩衝塩溶液は、5.5から7.5のpHを有する。他の実施形態において、緩衝液は、リン酸塩コハク酸塩ヒスチジンまたはクエン酸塩である。ある実施形態において、緩衝液は、最終濃度1mMから10mM、pH5.8から6.0のコハク酸塩である。ある特定の実施形態において、コハク酸塩緩衝液の最終濃度は5mMである。他の実施形態において、pH緩衝塩溶液中の塩は、塩化マグネシウム塩化カリウム塩化ナトリウムまたはその組み合わせを含む。ある特定の実施形態において、pH緩衝塩溶液中の塩は塩化ナトリウムである。

0011

別の実施形態において、処方の界面活性剤は、ポリソルベート20(Tween(商標)20)、ポリソルベート40(Tween(商標)40)、ポリソルベート60(Tween(商標)60)、ポリソルベート65(Tween(商標)65)、ポリソルベート80(Tween(商標)80)、ポリソルベート85(Tween(商標)85)、Triton(商標)N−101、Triton(商標)X−100、オキシトキシノール40、ノノキシノール−9、トリエタノールアミン、トリエタノールアミンポリペプチドオレエートポリオキシエチレン−660ヒドロキシステアレート(PEG−15、Solutol H15)、ポリオキシエチレン−35−リシノール酸塩(Cremophor EL(商標))、大豆レシチンおよびポロキサマーからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、界面活性はポリソルベート80である。別の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は、少なくとも0.01%から10%ポリソルベート80重量/処方体積である。他の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は、0.01%ポリソルベート80重量/処方体積である。さらに別の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は0.05%ポリソルベート80重量/処方体積である。別の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は0.1%ポリソルベート80重量/処方体積である。ある他の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は1.0%ポリソルベート80重量/処方体積である。さらに別の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は10.0%ポリソルベート80重量/処方体積である。

0012

別の実施形態において、多糖類−タンパク質複合体は1つまたは複数の肺炎球菌多糖類を含む。ある実施形態において、1つまたは複数の肺炎球菌多糖類は、エスニューモニエ(S.pneumoniae)血清型4多糖類、エス・ニューモニエ血清型6B多糖類、エス・ニューモニエ血清型9V多糖類、エス・ニューモニエ血清型14多糖類、エス・ニューモニエ血清型18C多糖類、エス・ニューモニエ血清型19F多糖類、エス・ニューモニエ血清型23F多糖類、エス・ニューモニエ血清型1多糖類、エス・ニューモニエ血清型3多糖類、エス・ニューモニエ血清型5多糖類、エス・ニューモニエ血清型6A多糖類、エス・ニューモニエ血清型7F多糖類およびエス・ニューモニエ血清型19A多糖類である。ある実施形態において、多糖類−タンパク質複合体処方のタンパク質は、CRM197、破傷風トキソイド、コレラトキソイド百日咳トキソイド、大腸菌(E.coli)易熱性トキソイド(LT)、肺炎球菌溶血素トキソイド、肺炎球菌表面タンパク質A(PspA)、肺炎球菌付着因子タンパク質A(PsaA)、連鎖球菌からのC5aペプチダーゼ、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)タンパク質D、卵白アルブミンキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミンBSA)およびツベルクリン精製タンパク質誘導体PPD)からなる群から選択される。

0013

一つの特定の実施形態において、多糖類−タンパク質複合体処方は、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型4多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型6B多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型9V多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型14多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型18C多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型19F多糖類およびCRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型23F多糖類を含む7価肺炎球菌複合体(7vPnC)処方である。

0014

別の具体的な実施形態において、多糖類−タンパク質複合体処方は、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型4多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型6B多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型9V多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型14多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型18C多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型19F多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型23F多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型1多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型3多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型5多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型6A多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型7F多糖類およびCRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型19A多糖類を含む13価肺炎球菌複合体(13vPnC)処方である。

0015

他の実施形態において、処方は、1つまたは複数の髄膜炎菌性多糖類、1つまたは複数の髄膜炎菌性抗原タンパク質、またはその組み合わせをさらに含む。さらに別の実施形態において、処方は、1つまたは複数の連鎖球菌多糖類、1つまたは複数の連鎖球菌抗原タンパク質、またはその組み合わせをさらに含む。

0016

ある他の実施形態において、処方は1つまたは複数のアジュバントをさらに含む。好適なアジュバントの例を以下に記載する。

0017

他の実施形態において、本発明は、連鎖球菌C5aペプチダーゼ(SCP)組成物を安定化させる処方に関し、この処方は、(i)pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約6.5のpKaを有する)、(ii)界面活性剤および(iii)連鎖球菌C5aペプチダーゼを含む。一つの特定の実施形態において、SCP処方は容器手段中に含まれる。ある実施形態において、容器手段は、バイアル、バイアルストッパー、バイアル密封装置、ガラス密封装置、ゴム密封装置、プラスチック密封装置、シリンジ、シリンジストッパー、シリンジプランジャー、フラスコ、ビーカー、目盛付シリンダー、発酵槽、生物反応器、チューブ、パイプ、バッグ、ジャー、アンプル、カートリッジおよび使い捨てペンからなる群の1つまたは複数から選択される。

0018

他の実施形態において、処方のpH緩衝塩溶液は5.5から7.5のpHを有する。他の実施形態において、緩衝液は、コハク酸塩、ヒスチジン、リン酸塩またはクエン酸塩である。一つの特定の実施形態において、緩衝液は、1mMから10mMの最終濃度、pH5.8から6.0のコハク酸塩である。別の具体的な実施形態において、コハク酸塩緩衝液の最終濃度は5mMである。さらに別の実施形態において、pH緩衝塩溶液中の塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはその組み合わせを含む。

0019

ある実施形態において、処方中の界面活性剤は、ポリソルベート20(Tween(商標)20)、ポリソルベート40(Tween(商標)40)、ポリソルベート60(Tween(商標)60)、ポリソルベート65(Tween(商標)65)、ポリソルベート80(Tween(商標)80)、ポリソルベート85(Tween(商標)85)、Triton(商標)N−101、Triton(商標)X−100、オキシトキシノール40、ノノキシノール−9、トリエタノールアミン、トリエタノールアミンポリペプチドオレエート、ポリオキシエチレン−660ヒドロキシステアレート(PEG−15、Solutol H15)、ポリオキシエチレン−35−リシノール酸塩(Cremophor EL(商標))、大豆レシチンおよびポロキサマーからなる群から選択される。一つの特定の実施形態において、界面活性剤はポリソルベート80である。ある実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は、0.01%から10%ポリソルベート80重量/処方体積である。さらに別の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は0.01%ポリソルベート80重量/処方体積である。他の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は0.05%ポリソルベート80重量/処方体積である。さらに別の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は0.1%ポリソルベート80重量/処方体積である。別の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は1.0%ポリソルベート80重量/処方体積である。さらに別の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は10.0%ポリソルベート80重量/処方体積である。

0020

ある他の実施形態において、SCP組成物は、連鎖球菌ポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド、髄膜炎菌性ポリペプチドおよびブドウ球菌ポリペプチドからなる群から選択される1つまたは複数のポリペプチドをさらに含む。さらに別の実施形態において、SCP組成物は、連鎖球菌多糖類、肺炎球菌多糖類、髄膜炎菌性多糖類およびブドウ球菌多糖類からなる群から選択される1つまたは複数の多糖類をさらに含む。

0021

別の実施形態において、処方は、1つまたは複数のアジュバントをさらに含む。好適なアジュバントの例を以下に記載する。

0022

別の実施形態において、本発明は、シリコーン処理された容器手段中に含まれる多糖類−タンパク質複合体のシリコーンにより誘発される沈殿を阻害する処方に関し、この処方は(i)pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約7.5のpKaを有する)、(ii)アルミニウム塩および(iii)1つまたは複数の多糖類−タンパク質複合体を含む。ある実施形態において、シリコーン処理された容器手段は、バイアル、バイアルストッパー、バイアル密封装置、ガラス密封装置、ゴム密封装置、プラスチック密封装置、シリンジ、シリンジストッパー、シリンジプランジャー、フラスコ、ビーカー、目盛付シリンダー、発酵槽、生物反応器、チューブ、パイプ、バッグ、ジャー、アンプル、カートリッジおよび使い捨てペンからなる群の1つまたは複数から選択される。

0023

ある実施形態において、処方中のpH緩衝塩溶液は、5.5から7.5のpHを有する。他の実施形態において、処方中の緩衝液は、リン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジンまたはクエン酸塩である。さらに別の実施形態において、緩衝液は、1mMから10mMの最終濃度、pH5.8から6.0のコハク酸塩である。ある特定の実施形態において、コハク酸塩緩衝液の最終濃度は5mMである。さらに別の実施形態において、pH緩衝塩溶液中の塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはその組み合わせを含む。ある特定の実施形態において、pH緩衝塩溶液中の塩は塩化ナトリウムである。

0024

他の実施形態において、アルミニウム塩は、水酸化アルミニウムリン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムである。一つの特定の実施形態において、アルミニウム塩はリン酸アルミニウムである。

0025

ある他の実施形態において、処方は、ポリソルベート80(Tween(商標)80)をさらに含む。一つの特定の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は、少なくとも0.01%から10%ポリソルベート80重量/処方体積である。

0026

別の実施形態において、多糖類−タンパク質複合体は1つまたは複数の肺炎球菌多糖類を含む。ある実施形態において、1つまたは複数の肺炎球菌多糖類は、エス・ニューモニエ血清型4多糖類、エス・ニューモニエ血清型6B多糖類、エス・ニューモニエ血清型9V多糖類、エス・ニューモニエ血清型14多糖類、エス・ニューモニエ血清型18C多糖類、エス・ニューモニエ血清型19F多糖類、エス・ニューモニエ血清型23F多糖類、エス・ニューモニエ血清型1多糖類、エス・ニューモニエ血清型3多糖類、エス・ニューモニエ血清型5多糖類、エス・ニューモニエ血清型6A多糖類、エス・ニューモニエ血清型7F多糖類およびエス・ニューモニエ血清型19A多糖類である。

0027

ある他の実施形態において、多糖類−タンパク質複合体処方のタンパク質は、CRM197、破傷風トキソイド、コレラトキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌易熱性トキソイド(LT)、肺炎球菌溶血素トキソイド、肺炎球菌表面タンパク質A(PspA)、肺炎球菌付着因子タンパク質A(PsaA)、連鎖球菌からのC5aペプチダーゼ、インフルエンザ菌タンパク質D、卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)およびツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)からなる群から選択される。

0028

一つの特定の実施形態において、多糖類−タンパク質複合体処方は、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型4多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型6B多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型9V多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型14多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型18C多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型19F多糖類およびCRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型23F多糖類を含む7価肺炎球菌複合体(7vPnC)処方である。

0029

別の具体的な実施形態において、多糖類−タンパク質複合体処方は、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型4多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型6B多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型9V多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型14多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型18C多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型19F多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型23F多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型1多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型3多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型5多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型6A多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型7F多糖類およびCRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型19A多糖類を含む13価肺炎球菌複合体(13vPnC)である。

0030

さらに他の実施形態において、処方は、1つまたは複数の髄膜炎菌性多糖類、1つまたは複数の髄膜炎菌性抗原タンパク質、またはその組み合わせをさらに含む。

0031

別の実施形態において、処方は、1つまたは複数の連鎖球菌多糖類、1つまたは複数の連鎖球菌抗原タンパク質、またはその組み合わせをさらに含む。

0032

ある他の実施形態において、処方は1つまたは複数のアジュバントをさらに含む。好適なアジュバントの例を以下に記載する。

0033

他の実施形態において、本発明は、シリコーン処理された容器手段中に含まれる連鎖球菌C5aペプチダーゼ(SCP)組成物のシリコーンにより誘発される沈殿を阻害する処方に関し、この処方は、(i)pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約6.5のpKaを有する)、(ii)アルミニウム塩および(iii)連鎖球菌C5aペプチダーゼを含む。ある実施形態において、容器手段は、バイアル、バイアルストッパー、バイアル密封装置、ガラス密封装置、ゴム密封装置、プラスチック密封装置、シリンジ、シリンジストッパー、シリンジプランジャー、フラスコ、ビーカー、目盛付シリンダー、発酵槽、生物反応器、チューブ、パイプ、バッグ、ジャー、アンプル、カートリッジおよび使い捨てペンからなる群の1つまたは複数から選択される。

0034

別の実施形態において、処方のpH緩衝塩溶液は、5.5から7.5のpHを有する。他の実施形態において、緩衝液は、コハク酸塩、ヒスチジン、リン酸塩またはクエン酸塩である。ある実施形態において、緩衝液は、1mMから10mMの最終濃度、pH5.8から6.0のコハク酸塩である。別の実施形態において、pH緩衝塩溶液中の塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはその組み合わせを含む。

0035

ある他の実施形態において、処方は、ポリソルベート80(Tween(商標)80)をさらに含む。一つの特定の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は0.01%から10%ポリソルベート80重量/処方体積である。

0036

さらに他の実施形態において、SCP組成物は、連鎖球菌ポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド、髄膜炎菌性ポリペプチドおよびブドウ球菌ポリペプチドからなる群から選択される1つまたは複数のポリペプチドをさらに含む。

0037

ある他の実施形態において、SCP組成物は、連鎖球菌多糖類、肺炎球菌多糖類、髄膜炎菌性多糖類およびブドウ球菌多糖類からなる群から選択される1つまたは複数の多糖類をさらに含む。

0038

さらに別の実施形態において、処方は1つまたは複数のアジュバントをさらに含む。好適なアジュバントの例を以下に記載する。

0039

他の実施形態において、本発明は、髄膜球菌2086タンパク質組成物を安定化させる処方に関し、この処方は、(i)pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約6.5のpKaを有する)、(ii)界面活性剤および(iii)髄膜球菌2086タンパク質を含む。髄膜球菌2086タンパク質の例を以下に記載する。一つの特定の実施形態において、髄膜球菌2086タンパク質処方は容器手段中に含まれる。ある実施形態において、容器手段は、バイアル、バイアルストッパー、バイアル密封装置、ガラス密封装置、ゴム密封装置、プラスチック密封装置、シリンジ、シリンジストッパー、シリンジプランジャー、フラスコ、ビーカー、目盛付シリンダー、発酵槽、生物反応器、チューブ、パイプ、バッグ、ジャー、アンプル、カートリッジおよび使い捨てペンからなる群の1つまたは複数から選択される。

0040

他の実施形態において、処方のpH緩衝塩溶液は、5.5から7.5のpHを有する。他の実施形態において、緩衝液は、コハク酸塩、ヒスチジン、リン酸塩またはクエン酸塩である。一つの特定の実施形態において、緩衝液は、1mMから10mMの最終濃度、pH5.8から6.0のコハク酸塩である。別の具体的な実施形態において、コハク酸塩緩衝液の最終濃度は5mMである。さらに別の実施形態において、pH緩衝塩溶液中の塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはその組み合わせを含む。

0041

ある実施形態において、処方中の界面活性剤は、ポリソルベート20(Tween(商標)20)、ポリソルベート40(Tween(商標)40)、ポリソルベート60(Tween(商標)60)、ポリソルベート65(Tween(商標)65)、ポリソルベート80(Tween(商標)80)、ポリソルベート85(Tween(商標)85)、Triton(商標)N−101、Triton(商標)X−100、オキシトキシノール40、ノノキシノール−9、トリエタノールアミン、トリエタノールアミンポリペプチドオレエート、ポリオキシエチレン−660ヒドロキシステアレート(PEG−15、Solutol H15)、ポリオキシエチレン−35−リシノール酸塩(Cremophor EL(商標))、大豆レシチンおよびポロキサマーからなる群から選択される。一つの特定の実施形態において、界面活性剤はポリソルベート80である。ある実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は0.01%から10%ポリソルベート80重量/処方体積である。さらに別の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は0.01%ポリソルベート80重量/処方体積である。他の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は0.05%ポリソルベート80重量/処方体積である。さらに別の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は0.1%ポリソルベート80重量/処方体積である。別の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は1.0%ポリソルベート80重量/処方体積である。さらに別の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は10.0%ポリソルベート80重量/処方体積である。

0042

ある他の実施形態において、髄膜球菌2086タンパク質組成物は、連鎖球菌ポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド、髄膜炎菌性ポリペプチドおよびブドウ球菌ポリペプチドからなる群から選択される1つまたは複数のポリペプチドをさらに含む。さらに別の実施形態において、髄膜球菌2086タンパク質組成物は、連鎖球菌多糖類、肺炎球菌多糖類、髄膜炎菌性多糖類およびブドウ球菌多糖類からなる群から選択される1つまたは複数の多糖類をさらに含む。

0043

別の実施形態において、処方は1つまたは複数のアジュバントをさらに含む。好適なアジュバントの例を以下に記載する。

0044

他の実施形態において、本発明は、シリコーン処理された容器手段中に含まれる髄膜球菌2086タンパク質組成物のシリコーンにより誘発される沈殿を阻害する処方に関し、この処方は、(i)pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約6.5のpKaを有する)、(ii)アルミニウム塩および(iii)髄膜球菌2086タンパク質を含む。ある実施形態において、容器手段は、バイアル、バイアルストッパー、バイアル密封装置、ガラス密封装置、ゴム密封装置、プラスチック密封装置、シリンジ、シリンジストッパー、シリンジプランジャー、フラスコ、ビーカー、目盛付シリンダー、発酵槽、生物反応器、チューブ、パイプ、バッグ、ジャー、アンプル、カートリッジおよび使い捨てペンからなる群の1つまたは複数から選択される。

0045

別の実施形態において、処方のpH緩衝塩溶液は、5.5から7.5のpHを有する。他の実施形態において、緩衝液は、コハク酸塩、ヒスチジン、リン酸塩またはクエン酸塩である。ある実施形態において、緩衝液は、1mMから10mMの最終濃度、pH5.8から6.0のコハク酸塩である。別の実施形態において、pH緩衝塩溶液中の塩は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはその組み合わせを含む。

0046

ある他の実施形態において、処方は、ポリソルベート80(Tween(商標)80)をさらに含む。一つの特定の実施形態において、処方中のポリソルベート80の最終濃度は0.01%から10%ポリソルベート80重量/処方体積である。

0047

さらに他の実施形態において、髄膜球菌2086タンパク質組成物は、連鎖球菌ポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド、髄膜炎菌性ポリペプチドおよびブドウ球菌ポリペプチドからなる群から選択される1つまたは複数のポリペプチドをさらに含む。

0048

ある他の実施形態において、髄膜球菌2086タンパク質組成物は、連鎖球菌多糖類、肺炎球菌多糖類、髄膜炎菌性多糖類およびブドウ球菌多糖類からなる群から選択される1つまたは複数の多糖類をさらに含む。

0049

さらに別の実施形態において、処方は、1つまたは複数のアジュバントをさらに含む。好適なアジュバントの例を以下に記載する。

0050

本発明の他の特性および利点は、以下の詳細な説明、その実施形態、および請求の範囲から明らかになるであろう。

0051

本発明は、多糖類−タンパク質複合体およびタンパク質免疫原などの免疫原性組成物の安定性を改善するための当該分野において継続する必要性に対処する。従って、本発明は概して、免疫原性組成物を安定化させ、沈殿を阻害する、新規界面活性剤処方および/または新規アルミニウム塩処方に関する。さらに詳細には、以下に記載される本発明は、容器手段、例えば、発酵槽、生物反応器、バイアル、フラスコ、バッグ、シリンジ、ゴム栓、チューブ中などで、加工、開発、処方、製造および/または貯蔵される免疫原性組成物を安定化させ、その微粒子形成(例えば、凝集、沈殿)を阻害する処方に対する当該分野の必要性に対処する。

0052

発明の背景において前述したように、例えばこれに限定されないが、免疫原性組成物の化学的安定性、免疫原性組成物の物理的/熱安定性、免疫原性組成物の容器/密封システムとの適合性、免疫原性組成物および不活性成分(例えば、緩衝液、塩、賦形剤、抗凍結剤)間の相互作用、製造プロセス、投与形態、輸送、貯蔵および取り扱い中に遭遇する環境条件(例えば、温度、湿度、剪断力)、製造から使用までの時間の長さを包含する様々な因子が、免疫原性組成物の安定性に影響を及ぼす。

0053

本発明の免疫原性組成物の安定性は、当業者に周知であり、慣例的である標準的技術を用いて容易に決定される。例えば、免疫原性組成物は、安定性、凝集、免疫原性、微粒子形成、タンパク質(濃度)損失などについて、これに限定されないが、光散乱光学密度、沈降速度遠心分離沈降平衡遠心分離、円二色性(CD)、Lowry分析、ビシンコニン酸(BCA)分析、抗体結合などを包含する方法により分析される。

0054

すでに詳細に記載したように、本発明は、免疫原性組成物を、界面活性剤、例えば、Tween(商標)80を用いて処方することにより、免疫原性組成物の安定性が向上され、沈殿が阻害されるという予想外で驚くべき結果に関する。例えば、本発明(例えば、実施例2参照)において、13価肺炎球菌複合体(13vPnC)であって、緩衝塩溶液中で処方され、単回投与シリンジ中に充填されたものは、2〜8℃で、水平オービタルシェーカーにより穏やかに攪拌すると、10分以内に溶液から析出し始めることが観察された。(13vPnC免疫原性組成物の典型的な加工、輸送および貯蔵状態シミュレートするために水平オービタルシェーカーを使用した)。しかし、緩衝塩溶液および0.001%Tween(商標)80中で処方され、単回投与シリンジ中に充填され、2〜8℃で穏やかに撹拌された13vPnCは、25時間安定で、目に見える沈殿の兆候は無かった(データは不図示)。従って、このデータは、界面活性剤(例えば、Tween(商標)80)を免疫原性組成物処方に添加することにより、免疫原性組成物の安定性が向上されることを証明した。

0055

13vPnCの第二の安定性研究は、界面活性剤を処方に添加すると、13vPnCの安定性が著しく向上されることをさらに裏付けた。例えば、0.05%Tween(商標)80を用いた13vPnC処方(表1)およびTween(商標)80を用いない13vPnC処方(0.0%、表1)の安定性(即ち、13vPnC抗原性の変化を測定することにより分析)を2時間にわたって評価した。表1に示すように、2時間の分析で13の血清型多糖類(Tween(商標)80なしで処方)の抗原性が有意に減少した。しかし、非常に劇的なことに、0.05%Tween(商標)80を含む13vPnC処方(表1)は、2時間の抗原性分析の間中、強固な安定性を示した。0.01%Tween(商標)80または0.05%Tween(商標)80のいずれかを用いて250mLガラスビン中で処方された13vPnCは、処方を30分間、2〜8℃で撹拌することにより誘発される著しい剪断力に抵抗し、抗原性はほとんどまたは全く失われない(例えば、実施例2、表2参照)。

0056

他の実験(実施例3)において、免疫原性連鎖球菌C5aペプチダーゼ(SCP)組成物の安定性は、界面活性剤、例えば、Tween(商標)80を用いて処方した場合に、大きく向上されることが示された。例えば、図1Aに示すように、5mMコハク酸塩緩衝液(pH6.0)、10mMリン酸塩緩衝液(pH7.0および7.4)または10mM Tris緩衝液(pH7.5)のいずれかを用いて処方したSCP(55μg/mL)を2日間攪拌した後、SCP濃度が有意に減少した(例えば、90%以上)。しかし、図1Bに示すように、0.025%Tween(商標)80をSCPコハク酸塩、SCPリン酸塩およびSCPTris処方に、2日間攪拌する前に添加することにより、SCPの損失が完全に阻害され、これは図1Aで観察された。

0057

本発明の13vPnC免疫原性組成物はまた、アジュバント、例えば、リン酸アルミニウム(AlPO4)を用いるか、または用いないで処方することができる。従って、別の一連の実験(実施例4)において、13vPnC免疫原性組成物を、5mMコハク酸塩緩衝液(pH5.8)、0.85%NaClおよびAlPO4(0.25mgアルミニウム/ml)中、界面活性剤を添加せずに処方した(例えば、Tween(商標)80は処方中に含まれていなかった)。

0058

これらの実験において、13vPnC免疫原性組成物(AlPO4の存在下で処方)を様々なシリコーン処理された容器手段およびシリコーン処理されていない容器手段中に充填し(例えば、表3参照)、2〜8℃で撹拌することにより、模擬輸送および取り扱い条件に付した。これらの実験において(実施例4)、さらに高いシリコーン含量を有する容器手段は、さらに高度の13vPnC微粒子形成およびさらに高い割合の13vPnC抗原性損失を示した。微粒子のFTIR分析は、この微粒子がタンパク質およびシリコーンからなり(データは不図示)、約85%の13vPnCがAlPO4と結合することを示し、この場合、残りの15%は溶液中遊離(AlPO4と結合しない)13vPnCであった。

0059

AlPO4を用いて処方された13vPnC免疫原性組成物および用いて処方された13vPnC免疫原性組成物(これを次に同じシリンジ中に充填した)を比較する別の実験において、AlPO4なしで処方された13vPnCは、試験されたシリンジ中で、AlPO4を含む13vPnCよりも高い抗原性損失を維持することが見出された(例えば、図6および図7参照)。

0060

従って、本発明は前述のように、免疫原性組成物の安定性に影響を及ぼす様々な因子(例えば、剪断力、輸送攪拌、シリコーン油相互作用、吸着、製造プロセス、温度、湿度、製造から使用までの時間の長さなど)に対して、免疫原性組成物、例えば、多糖類−タンパク質複合体(例えば、13vPnC)およびタンパク質免疫原(例えば、連鎖球菌C5aペプチダーゼ、髄膜球菌ORF 2086タンパク質)を安定化し、その凝集または沈殿を阻害する新規処方に関する。

0061

ある実施形態において、本発明は、多糖類−タンパク質複合体を安定化させる処方に関し、この処方は、pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約7.5のpKaを有する)、界面活性剤および1つまたは複数の多糖類−タンパク質複合体を含む。他の実施形態において、多糖類−タンパク質複合体処方は容器手段中に含まれる。別の実施形態において、本発明は連鎖球菌C5aペプチダーゼ(SCP)組成物を安定化させる処方に関し、この処方は、pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約6.5のpKaを有する)、界面活性剤および連鎖球菌C5aペプチダーゼを含む。ある実施形態において、SCP処方は容器手段中に含まれる。別の実施形態において、本発明は、髄膜球菌2086タンパク質組成物を安定化させる処方に関し、この処方は、pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約7.5のpKaを有する)、界面活性剤および髄膜球菌2086タンパク質を含む。ある実施形態において、髄膜炎菌性2086処方は容器手段中に含まれる。

0062

ある他の実施形態において、本発明は、シリコーン処理された容器手段中に含まれる多糖類−タンパク質複合体の、シリコーンにより誘発される沈殿を阻害する処方に関し、この処方は、pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約7.5のpKaを有する)、アルミニウム塩および1つまたは複数の多糖類−タンパク質複合体を含む。別の実施形態において、本発明は、シリコーン処理された容器手段中に含まれる連鎖球菌C5aペプチダーゼ(SCP)組成物の、シリコーンにより誘発される沈殿を阻害する処方に関し、この処方は、pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約6.5のpKaを有する)、アルミニウム塩および連鎖球菌C5aペプチダーゼを含む。ある他の実施形態において、本発明は、シリコーン処理された容器手段中に含まれる髄膜球菌2086タンパク質組成物の、シリコーンにより誘発される沈殿を阻害する処方に関し、この処方は、pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約7.5のpKaを有する)、アルミニウム塩および髄膜球菌2086タンパク質を含む。

0063

さらに他の実施形態において、本発明は、髄膜球菌2086タンパク質の抗原安定性およびアルミニウム塩アジュバント(例えば、AlPO4)に対する結合(%)を最適化する処方に関し、この処方は、pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約7.5のpKaを有する)、界面活性剤、アルミニウム塩、および髄膜球菌2086タンパク質を含む。ある実施形態において、この処方は容器手段中に含まれる。

0064

以下で定義するように、「沈殿」、「沈殿物」、「微粒子形成」、「混濁」および「凝集」なる用語は交換可能に用いることができ、多糖類−タンパク質複合体またはタンパク質(またはポリペプチド)免疫原の「凝集」をもたらす物理的相互作用または化学反応を意味する。凝集(例えば、タンパク質凝集)のプロセスは周知であり(しかし十分には理解されていない)、当該分野において記載され、熱、圧力、pH、攪拌、剪断力、凍結−解凍脱水重金属フェノール系化合物、シリコーン油、変性剤などをはじめとする多くの物理化学的ストレスによりしばしば影響を受ける。

0065

以下に定義するように、本発明の「多糖類−タンパク質複合体」、「肺炎球菌複合体」、「7価肺炎球菌複合体(7vPnC)」、「13価肺炎球菌複合体(13vPnC)」、「連鎖球菌C5aペプチダーゼ(SCP)免疫原性組成物」および「髄膜球菌2086タンパク質免疫原性組成物」は、液体処方凍結液体処方および固体(例えば、凍結乾燥)処方を包含する。

0066

A.界面活性剤
前述のように、本発明は、免疫原性組成物の安定性に影響を及ぼす様々な因子(例えば、剪断力、輸送攪拌、シリコーン油相互作用、吸着、製造プロセス、温度、湿度、製造から使用までの時間の長さなど)に対して免疫原性組成物を安定化させ、凝集を阻害する処方に関する。ある実施形態において、本発明は界面活性剤を含む処方に関する。

0067

界面活性剤(または表面活性剤)は一般に(a)親水性基または部分および親油性疎水性)基または部分を含む分子または化合物および/または(b)溶液の表面張力を減少させる分子、物質または化合物として定義される。本明細書において定義される場合、本発明の「界面活性剤」は、免疫原性組成物処方の表面張力を低下させる分子または化合物である。

0068

本発明の処方において使用される界面活性剤は、本明細書において記載される免疫原性組成物を安定化させ、凝集を阻害する任意の界面活性剤または界面活性剤の組み合わせを含む。従って、本発明の界面活性剤としては、これに限定されないが、ポリソルベート20(Tween(商標)20)、ポリソルベート40(Tween(商標)40)、ポリソルベート60(Tween(商標)60)、ポリソルベート65(Tween(商標)65)、ポリソルベート80(Tween(商標)80)、ポリソルベート85(Tween(商標)85)、Triton(商標)N−101、Triton(商標)X−100、オキシトキシノール40、ノノキシノール−9、トリエタノールアミン、トリエタノールアミンポリペプチドオレエート、ポリオキシエチレン−660ヒドロキシステアレート(PEG−15、Solutol H15)、ポリオキシエチレン−35−リシノール酸塩(Cremophor EL(商標))、大豆レシチン、ポロキサマー、ヘキサデシルアミンオクタデシルアミンオクタデシルアミノエステルリソレシチンジメチルジオタデシルアンモニウムブロミドメトキシヘキサデシルグリセロールプルロニック(pluronic)ポリオールポリアミン(例えば、ピラン硫酸デキストランポリIC、カーボポール)、ペプチド(例えば、ムラミルペプチドおよびジペプチドジメチルグリシン、ツフチン(tuftsin))、油エマルジョンミネラルゲル(例えば、リン酸アルミニウム)および免疫刺激複合体ISCOMS)が挙げられる。

0069

当業者は、界面活性剤の存在下および非存在下で特定の免疫原性組成物の表面張力を測定することにより、好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせを容易に決定できる。別法として、界面活性剤を、免疫原性組成物の凝集を軽減、阻害または防止するその能力について定性的(例えば、微粒子形成の目視検査)または定量的(例えば、光散乱、沈降速度遠心分離、光学密度、抗原性)に評価する。

0070

B.容器手段
ある実施形態において、本発明は、容器手段中に含まれる免疫原性組成物の処方に関する。本明細書において定義されるように、本発明の「容器手段」は、研究、加工、開発、処方、製造、貯蔵および/または投与中に、免疫組成物を「含有」、「保持」、「混合」、「ブレンド」、「分配」、「注入」、「移動」、「噴霧」するためなどに使用される物質の組成物を含む。例えば、本発明の容器手段としては、これに限定されないが、一般的実験室用ガラス製品、フラスコ、ビーカー、目盛り付きシリンダー、発酵槽、生物反応器、チューブ、パイプ、バッグ、ジャー、バイアル、バイアル密封装置(例えば、ゴムストッパーキャップのねじ)、アンプル、シリンジ、シリンジストッパー、シリンジプランジャー、ゴム密封装置、プラスチック密封装置、ガラス密封装置などが挙げられる。本発明の容器手段は、製造材料に限定されず、ガラス、金属(例えば、スチールステンレススチール、アルミニウムなど)およびポリマー(例えば、熱可塑性物質、エラストマー、熱可塑性物質−エラストマー)などの物質を包含する。

0071

前記の容器手段が決して網羅リストではなく、単に当業者に対して、組成物の研究、加工、開発、処方、製造、貯蔵および/または投与の間、免疫原または免疫原性組成物を含有、保持、混合、ブレンド、分配、注入、移動、噴霧などするために使用される様々な容器手段に関してのガイダンスとしての働きをすることは、当業者には理解されるであろう。本発明において使用されることが想定される追加の容器手段は、実験装置メーカーおよび製造業者、例えば、United States Plastic Corp.(Lima、OH)、VWR(商標)(West Chester、PA)、BD Biosciences(Franklin Lakes、NJ)、Fisher Scientific International Inc.(Hampton、NH)およびSigma−Aldrich(St.Louis、MO)から出版されたカタログ見出すことができる。

0072

従って、本発明の新規処方は、組成物の研究、加工、開発、処方、製造、貯蔵および/または投与の様々な段階全体にわたって、容器手段中に含まれる免疫原性処方を安定化させ、沈殿を阻害する点で特に有利である。本発明の新規処方は、免疫原性組成物を物理的/熱的ストレス(例えば、温度、湿度、剪断力など)に対して安定化させるだけでなく、マイナスの因子または影響、例えば、免疫原性組成物の容器/密封システム(例えば、シリコーン処理された容器手段)との不適合性に対して、免疫原性組成物の安定性を向上させ、沈殿を阻害する。

0073

従って、本発明の新規処方は、シリコーン油により誘発される沈殿および前述の沈殿に対して免疫原(即ち、多糖類−タンパク質複合体、タンパク質またはポリペプチド抗原)を安定化させるのに特に有用である。例えば、2006年4月26日に出願された同時係属中の米国出願番号60/795,098(本発明の一部として参照される)は、シリンジ、ガラスバイアル、ゴムストッパーなどの容器手段上で見られるシリコーン油の存在下での免疫原性組成物の凝集を記載し、界面活性剤を容器手段に添加することにより、これらの免疫原性組成物のシリコーン油により誘発される凝集が防止された。

0074

C.アジュバントおよび製剤担体/賦形剤
ある実施形態において、本発明の免疫組成物をさらに、アジュバントを用いて処方する。アジュバントは、免疫原または抗原とともに投与される場合、免疫応答を向上させる物質である。これに限定されないが、インターロイキン1−α、1−β、2、4、5、6、7、8、10、12(例えば、米国特許第5,723,127号参照)、13、14、15、16、17および18(およびその突然変異形態)、インターフェロン−α、βおよびγ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSF、例えば、米国特許第5,078,996号 およびATCC受入番号39900参照)、マクロファージコロニー刺激因子(MCSF)、顆粒球コロニー刺激因子GCSF)、ならびに腫瘍壊死因子αおよびβ(TNF)をはじめとする多くのサイトカインまたはリンホカインは、免疫調節活性を有することが証明され、従って、アジュバントとして使用できる。本発明において有用なさらに別のアジュバントとしては、制限無く、MCP−1、MIP−1α、MIP−1β、およびRANTESを包含するケモカインが挙げられる。

0075

ある実施形態において、免疫原性組成物処方の免疫応答を向上させるために使用されるアジュバントは、制限無く、MPL(商標)(3−O−脱アシル化モノホスホリルリピッドA;Corixa、Hamilton、MT)を包含し、これは米国特許第4,912,094号(本発明の一部として参照される)に記載されている。合成リピッドA類似体またはアミノアルキルグルコサミンリン酸塩化合物(AGP)、またはその誘導体もしくは類似体(Corixa(Hamilton、MT)から入手可能であり、米国特許第6,113,918号(本発明の一部として参照される)に記載されている)もアジュバントとしての使用に適している。このようなAGPの1つは、2−[(R)−3−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノエチル2−デオキシ−4−O−ホスホノ−3−O−[(R)−3−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]−2−[(R)−3−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ]−b−D−グルコピラノシド(529とも呼ばれる(以前はRC529と呼ばれた))である。この529アジュバントは、水性形態として、または安定なエマルジョン(RC529−SE)として処方される。

0076

さらに別のアジュバントとしては、鉱物油および水エマルジョン、アルミニウム塩(alum)、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど、Amphigen、Avridine、L121/スクアレン、D−ラクチドポリラクチドグリコシド、プルロニックポリオール、ムラミルジペプチド死滅ボルデテラ(Bordetella)、サポニン、例えば、米国特許第5,057,540号(本発明の一部として参照される)に記載されているStimulon(商標)QS−21(抗原性、Framingham、MA.)、およびこれから生じる粒子、例えば、ISCOMS(免疫刺激複合体)、米国特許第5,254,339号に記載されているISCOMATRIX(CSL Limited、Parkville、Australia)、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、細菌性リポ多糖類合成ポリヌクレオチド、例えば、CpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチド(米国特許第6,207,646号(本発明の一部として参照される))、欧州特許第1,296,713号および第1,326,634号に記載されているIC−31(Intercell AG、Vienna、Austria)、百日咳トキシン(PT)、または大腸菌易熱性トキシン(LT)、特にLT−K63、LT−R72、PT−K9/G129;例えば、国際特許公開番号WO93/13302およびWO92/19265(本発明の一部として参照される)が挙げられる。

0077

公開された国際特許出願番号WO00/18434(アミノ酸29位のグルタミン酸が別のアミノ酸(アスパラギン酸以外)、好ましくはヒスチジンにより置換されている)に記載されているものをはじめとするコレラトキシンおよびその突然変異体も、アジュバント(およびキャリアタンパク質)として有用である。類似のCTトキシンまたは突然変異体は、公開された国際特許出願番号WO02/098368に記載されている(この場合、アミノ酸16位のイソロイシンが別のアミノ酸で置換されている(単独またはアミノ酸68位のセリンの別のアミノ酸による置換と組み合わせて);および/またはアミノ酸72位のバリンが別のアミノ酸で置換されている)。他のCTトキシンは、公開された国際特許出願番号WO02/098369に記載されている(アミノ酸25位のアルギニンが別のアミノ酸により置換されている;および/またはアミノ酸がアミノ酸49位で挿入されている;および/または2つのアミノがアミノ酸35位および36位で挿入されている)。

0078

ある実施形態において、免疫原性組成物処方は、医薬的に許容される希釈剤、賦形剤または医薬的に許容される担体を含む。一つの実施形態において、医薬的に許容される希釈剤は、滅菌水注射用水無菌等張塩溶液または生理的緩衝液である。多糖類−タンパク質複合体および/またはタンパク質免疫原をかかる希釈剤または担体と通常の方法で混合する。本明細書において用いられる場合、「医薬的に許容される担体」なる用語は、あらゆる溶媒分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などであって、ヒトまたは他の脊椎動物宿主に対する投与に適したものを包含することが意図される。適切な担体は、当業者には明らかであり、投与経路に大きく依存する。

0079

例えば、免疫原性組成物処方中に存在する賦形剤は、保存料、化学安定剤および懸濁化剤または分散剤である。典型的には、安定剤、保存料などは、標的とされる受容者(例えば、ヒト対象)における有効性について最良の処方を決定するために最適化される。保存料の例としては、クロロブタノールソルビン酸カリウムソルビン酸二酸化硫黄没食子酸プロピルパラベンエチルバニリングリセリンフェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。安定化成分の例としては、カザミノ酸スクロースゼラチン、フェノール赤、N−Zアミン二リン酸カリウムラクトースラクトアルブミン加水分解物、および粉ミルクが挙げられる。

0080

ある実施形態において、免疫原性組成物処方を、ヒト対象に投与するために、例えば、液体、粉末エアゾル錠剤カプセル腸溶錠もしくはカプセル、または坐剤の形態で調製する。従って、免疫原性組成物処方としては、これに限定されないが、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中エマルジョン、ペースト、および移植可能徐放性または生分解性処方も挙げられる。

0081

本発明の免疫原性組成物は、通常の生理学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤、例えば、溶媒、緩衝液、アジュバント、または前述の種類の医薬製剤において有用な他の成分の選択により限定されない。適切なpH等張性、安定性、および他の通常の特性を有する、これらの医薬的に許容される組成物の前述の成分からの調製は、当該分野において可能である。

0082

D.免疫原
ある実施形態において、本発明の多糖類−タンパク質複合体処方は、1つまたは複数の肺炎球菌多糖類を含む。他の実施形態において、本発明の多糖類−タンパク質複合体処方は、1つまたは複数の連鎖球菌多糖類を含む。さらに別の実施形態において、本発明の多糖類−タンパク質複合体処方は、1つまたは複数の髄膜炎菌性多糖類を含む。さらに別の実施形態において、本発明の多糖類−タンパク質複合体処方は、1つまたは複数の肺炎球菌多糖類、1つまたは複数の肺炎球菌ポリペプチド、1つまたは複数の連鎖球菌多糖類、1つまたは複数の連鎖球菌ポリペプチド、1つまたは複数の髄膜炎菌性多糖類、および/または1つまたは複数の髄膜炎菌性ポリペプチドの組み合わせを含む。

0083

以下で定義するように、「多糖類」なる用語は、免疫原性および細菌性ワクチン分野において通常使用される抗原性単糖類要素(または抗原性単位)、例えばこれに限定されないが、「単糖類」、「オリゴ糖」、「多糖類」、「リポ糖」、「リポオリゴ糖(LOS)」、「リポ多糖類(LPS)」、「グリコレート」、「複合糖質」などを包含することを意味する。

0084

本発明の一つの特定の実施形態において、1つまたは複数の肺炎球菌多糖類は、エス・ニューモニエ血清型4多糖類、エス・ニューモニエ血清型6B多糖類、エス・ニューモニエ血清型9V多糖類、エス・ニューモニエ血清型14多糖類、エス・ニューモニエ血清型18C多糖類、エス・ニューモニエ血清型19F多糖類、エス・ニューモニエ血清型23F多糖類、エス・ニューモニエ血清型1多糖類、エス・ニューモニエ血清型3多糖類、エス・ニューモニエ血清型5多糖類、エス・ニューモニエ血清型6A多糖類、エス・ニューモニエ血清型7F多糖類およびエス・ニューモニエ血清型19A多糖類である。

0085

ある実施形態において、多糖類−タンパク質複合体処方は、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型4多糖類複合体、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型6B多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型9V多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型14多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型18C多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型19F多糖類およびCRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型23F多糖類を含む7価肺炎球菌複合体(7vPnC)処方である。

0086

ある他の実施形態において、多糖類−タンパク質複合体処方は、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型4多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型6B多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型9V多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型14多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型18C多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型19F多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型23F多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型1多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型3多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型5多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型6A多糖類、CRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型7F多糖類およびCRM197ポリペプチドと共役するエス・ニューモニエ血清型19A多糖類を含む13価肺炎球菌複合体(13vPnC)処方である。

0087

多糖類は、当業者に公知の標準的技術により調製される。例えば、本発明において記載される莢膜多糖類を、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)の血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23Fから調製し、各血清型は大豆ベース培地中で増殖し、個々の多糖類を次に、遠心分離、沈殿、限外濾過、およびカラムクロマトグラフィーにより精製する。同様に、連鎖球菌多糖類(例えば、β−溶血性連鎖球菌、例えば、A群連鎖球菌B群連鎖球菌、C群連鎖球菌およびG群連鎖球菌)ならびに髄膜炎菌性多糖類(例えば、髄膜球菌リポオリゴ糖(LOS)またはリポ多糖類(LPS)からの1つまたは複数の多糖類(またはオリゴ多糖類))を、当業者に公知の一般的技術および方法を用いて、臨床的に関連する血清型または血清学的グループから調製する。精製された多糖類を次に化学的に(例えば、還元的アミノ化により)活性化して、キャリアタンパク質と反応できる多糖類を調製する。活性化したら、各莢膜多糖類を別々にキャリアタンパク質(例えば、CRM197)と共役させて、複合糖質を形成し(または各莢膜多糖類を同じキャリアタンパク質と共役させ)、単回投与処方に処方する。

0088

多糖類の化学的活性化およびその後のキャリアタンパク質(即ち、多糖類−タンパク質複合体)との共役は、通常の手段により達成される。例えば、米国特許第4,673,574号および第4,902,506号参照。

0089

キャリアタンパク質は、好ましくは非毒性かつ非反応原性であり、十分な量および純度で得ることができるタンパク質である。キャリアタンパク質は標準的共役手順に適している。本発明の特定の実施形態において、CRM197をキャリアタンパク質として使用する。

0090

CRM197(Wyeth、Sanford、NC)は、カザミノ酸および酵母エキスベースの培地中で増殖させたジフテリア菌(Corynebacterium dyphtheria)C7株(β197)の培養物から単離されたジフテリア毒素の非毒性変異体(即ち、トキソイド)である。CRM197を、限外濾過、硫酸アルミニウム沈殿、およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。別法として、CRM197を米国特許第5,614,382号(本発明の一部として参照される)に従って組み換えにより調製する。他のジフテリアトキソイドもキャリアタンパク質としての使用に適している。

0091

他の実施形態において、本発明のキャリアタンパク質は、酵素的に不活性な連鎖球菌C5aペプチダーゼ(SCP)(例えば、米国特許第6,951,653号、米国特許第6,355,255号および米国特許第6,270,775号に記載されている1つまたは複数のSCP変異体)である。

0092

他の好適なキャリアタンパク質としては、不活性化細菌毒素、例えば、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド(例えば、国際特許出願WO2004/083251に記載されているCT E29H)、大腸菌LT、大腸菌ST、および緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)から得られる外毒素Aが挙げられる。細菌外膜タンパク質、例えば、外膜複合体c(OMPC)、ポーリントランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面タンパク質A(PspA)、肺炎球菌付着因子タンパク質(PsaA)、またはインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)タンパク質Dも使用できる。他のタンパク質、例えば、卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)もキャリアタンパク質として使用できる。

0093

莢膜多糖類をキャリアタンパク質と共役させた後、多糖類−タンパク質複合体を様々な技術により精製する(多糖類−タンパク質複合体の量に関して濃縮する)。これらの技術としては、濃縮/ダイアフィルトレーション操作、沈殿/溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過が挙げられる。

0094

個々の複合糖質を精製した後、これらを配合して本発明の免疫原性組成物を処方する。本発明の多糖類−タンパク質複合体の処方は、当該分野において承認された方法を用いて行うことができる。例えば、13の各肺炎球菌複合体を、生理学的に許容されるビヒクルを用いて処方して、組成物を調製できる。かかるビヒクルの例としては、これに限定されないが、水、緩衝塩溶液、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール)およびデキストロース溶液が挙げられる。

0095

他の実施形態において、本発明は、連鎖球菌C5aペプチダーゼ(SCP)免疫原性組成物を安定化させる処方に関し、この処方はpH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約6.5のpKaを有する)、界面活性剤および連鎖球菌C5aペプチダーゼを含む。C5aペプチダーゼは高度に保存されたセリンプロテアーゼであり、全β−溶血性連鎖球菌(例えば、A、B、CおよびG群連鎖球菌)にわたって発現される。例えば、B群連鎖球菌(GBS)C5aペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列は、A群連鎖球菌(GAS)C5aペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列と98%同一である。従って、本発明のある実施形態において、免疫原性組成物β−溶血性連鎖球菌により誘発される感染症に対する免疫原性組成物は、免疫原(または抗原)を含む。

0096

一つの特定の実施形態において、本発明のC5aペプチダーゼは酵素的に不活性な連鎖球菌C5aペプチダーゼ(例えば、米国特許第6,951,653号、米国特許第6,355,255号および米国特許第6,270,775号(それぞれ具体的に本発明の一部として参照される)の1つまたは複数に記載されている1つまたは複数のSCP変異体)である。別の特定の実施形態において、本発明の新規免疫原性処方において用いされるSCPは、B群連鎖球菌からクローンされる。別の実施形態において、B群連鎖球菌SCP配列を遺伝的に突然変異させて、タンパク質分解不活性にし(例えば、米国特許第6,951,653号;第6,355,255号および第6,270,775号参照)、大腸菌において組み換えタンパク質として発現させる。

0097

別の実施形態において、本発明は、髄膜球菌2086タンパク質免疫原性組成物を安定化させる処方に関し、この処方は、pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約7.5のpKaを有する)、界面活性剤および髄膜球菌2086タンパク質を含む。髄膜球菌2086タンパク質は、「ORF2086」(例えば、国際公開番号WO 03/063766 A2(国際出願番号PCT/US02/32369)、国際公開番号WO 04/094596 A2(国際出願番号PCT/US04/011901)、および国際公開番号WO 04/065603 A2(国際出願番号PCT/US04/000800)参照(それぞれは具体的に本発明の一部として参照される))として同定される核酸配列オープンリーディングフレームによりコードされる。さらなる実施形態において、本発明は、抗原安定性および髄膜球菌2086タンパク質のアルミニウム塩アジュバント(例えば、AlPO4)との結合(%)を最適化する処方に関し、この処方は、pH緩衝塩溶液(この緩衝液は約3.5から約7.5のpKaを有する)、界面活性剤、アルミニウム塩、および髄膜球菌2086タンパク質を含む。

0098

本明細書において言及される全ての特許および刊行物は本発明の一部として参照される。

0099

E.実施例
以下の実施例は、特に他に詳細に記載されない限り、当業者に周知で慣例的な標準的技術を用いて行う。以下の実施例は、例示目的で記載し、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。

0100

0.001%−0.05%TWEEN(商標)80を含む免疫原性処方は、免疫原を安定化させ、凝集を防止する
この実施例で使用した多糖類−タンパク質複合体は、エス・ニューモニエ血清型4、6B、9V、18C、19F、14、23F、1、3、5、6A、7Fおよび19Aからの莢膜多糖類を含む13価肺炎球菌多糖類複合体(13vPnC)であり、そのそれぞれはCRM197と共役していた。当業者に公知の標準的技術を用いることにより、莢膜多糖類を調製した。簡単に言うと、各肺炎球菌多糖類血清型を大豆ベースの培地中で増殖させ、個々の多糖類を次いで遠心分離、沈殿、限外濾過、およびカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製された多糖類を共役のために化学的に活性化し、各多糖類を別々にCRM197キャリアタンパク質と共役させて、複合糖質を形成し、単剤処方を処方した。

0101

多糖類の化学的活性化およびその後のキャリアタンパク質の共役は通常の手段により行った(例えば、米国特許第4,673,574号および第4,902,506号参照)。CRM197(Wyeth、Sanford、NC)はカザミノ酸および酵母エキスベースの培地中で増殖させたジフテリア菌C7株(β197)の培養物から単離されたジフテリア毒素の非毒性変異体(即ち、トキソイド)である。CRM197を限外濾過、硫酸アルミニウム沈殿、およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。

0102

13vPnCサンプルを多糖類血清型のそれぞれに対して特異的な13の抗血清(Ab)のうちの1つと混合し、免疫複合体をArray(登録商標)360システム(Beckman Coulter、Inc.;Fullerton、CA)で光散乱測定により検出することにより、下記の抗原性実験を行った。13の血清型のそれぞれについて検出された光散乱測定値を次に標準曲線と比較し、抗原性(μg/mL)として報告した。

0103

シリンジ(BD Hypak SCF(商標))およびシリンジストッパー(BD Hypak SCF(商標))をBD Biosciences(Franklin Lakes、NJ)から購入した。Teflon(登録商標)で裏打ちされた密封装置を有する透明なホウケイ酸塩バイアル(VWR TraceClean(商標)、40mL)をVWR(商標)(West Chester、PA)から購入した。ポリソルベート80(Tween(商標)80)をJ.T.Baker(Mallinckrodt Baker、Inc.;Phillipsburg、NJ)から購入した。緩衝液塩溶液はコハク酸塩(5mM)およびNaCl(0.85%)(pH5.8)であった。

0104

13vPnC(合計体積500mL)を様々な界面活性剤濃度(Tween(商標)80;0.001%、0.005%、0.01%および0.05%、重量/体積)で次のようにして処方した:0.85%塩溶液(150mM NaCl)を1リットルのPyrex(登録商標)ガラスビーカーに添加し、続いて50mMコハク酸塩緩衝液(最終濃度5mM)および13vPnCを添加した。各血清型複合体の最終濃度は4.4μg/mLであった(血清型6B(8.8μg/mL)を除く)。13vPnC処方を次に5個の別個のガラスバイアル(バイアルごとに50mL)に分割し、0.0%、0.001%、0.005%、0.01%または0.05%のいずれかのTween(商標)80(w/v)を5個のバイアルのうちの1つに添加し、各溶液を0.22μm Durapore(登録商標)フィルター(Millipore;Billerica、MA)を通して濾過した。その後、0.65mLの各溶液を、w4432グレーストッパーを有する別個の3mLのBD HYPAK(商標)SCF(商標)ガラスシリンジ(BD Medical Pharmaceutical Systems;Franklin Lakes、NJ)中に充填し、このシリンジを100時間、2℃から8℃で水平オービタルシェーカー(60cpm)上に置いた。

0105

目視検査(データは不図示)により、Tween(商標)80の非存在下(即ち、0.0%)で処方された13vPnCは、水平オービタルシェーカーにより穏やかに撹拌すると、2〜8℃で10分以内に溶液から析出し始めることが観察された。対照的に、0.001%、0.005%、0.01%または0.05%Tween(商標)80中で処方し、2〜8℃で穏やかに撹拌した13vPnCは、最高25日まで安定であり、沈殿の兆候は見られなかった(データは不図示)。従って、このデータから、界面活性剤(例えば、Tween(商標)80)を免疫原性組成物処方に添加することにより、免疫原性組成物の安定性が向上されることがわかる。

0106

13vPnCの第二の安定性実験は、界面活性剤を処方に添加することにより、13vPnCの安定性が著しく向上されることをさらに確認する。この実験において、0.05%Tween(商標)80を用いて、また用いないで、13vPnCを処方した。Tween(商標)80なし(即ち、0.0%)で処方された13vPnCを次のようにして調製した:0.85%塩溶液(150mM NaCl)を1リットルのPyrex(登録商標)ガラスビーカーに添加し、続いて50mMコハク酸塩緩衝液(最終濃度5mM)および13vPnCを、合計体積500mLで添加した。0.05%Tween(商標)80を含む13vPnC処方を次のようにして調製した:0.85%塩溶液(150mM NaCl)を1リットルPyrex(登録商標)ガラスビーカーに添加し、続いて50mM コハク酸塩緩衝液(最終濃度5mM)、0.05%Tween(商標)80および13vPnCを、合計体積500mLで添加した。各血清型複合体の500mLの処方中の最終濃度は4.4μg/mLであった(血清型6B(8.8μg/mL)を除く)。500mLの処方をローターステーターホモジナイザーにより、6,000rpm(2〜8℃)で120分間均質化した。均質化プロセスにより空気−液体界面気泡を伴う)が形成された。

0107

0.05%Tween(商標)80を含む13vPnC処方(表1)および0.05%Tween80を含まない13vPnC(表1)の安定性を2時間の期間にわたって次のようにして評価した:サンプル(20〜30mL)を0、30および120分で、0.0%および0.05%Tween(商標)80処方から除去し、サンプルをタンパク質希釈剤(Array(登録商標)360タンパク質希釈剤(カタログ番号663630);Beckman Coulter Inc.;Fullerton、CA)中1:2に希釈し、13vPnCの13の血清型全ての抗原性をArray(登録商標)360システムで分析した(表1参照)。

0108

表1に示すように、2時間の分析で、13の血清型多糖類(Tween(商標)80なしで処方)の抗原性が著しく減少した。しかし、かなり重大なことに、0.05%Tween(商標)80(表1)を含む13vPnC処方は、2時間の抗原性分析の間中、抗原性が減少せず、強固な安定性を示した。

0109

0110

13vPnC/Tween(商標)80処方を剪断力に対する安定性についてさらに試験した。この実験において、100mLの13vPnC組成物(4.4μg/mL血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、23Fおよび8.8μg/mL血清型6B、5mMコハク酸塩緩衝液、150mM NaClおよび0.25mg/mL AlPO4)を、0.0%、0.01%または0.05%のいずれかのTween(商標)80を含む3個の250mLガラスビンに添加した。3個のビンを次に撹拌機(Vortex−Genie(登録商標)2;Scientific Industries、Inc.;Bohemia、NY)上で30分間(2〜8℃)攪拌し、最大速度設定で空気−液体界面が形成された。30分後、10〜30mLのサンプルを各ビンから採取し、Array(登録商標)360タンパク質希釈剤中1:2に希釈し、13の血清型の抗原性をArray(登録商標)360システムで分析した。

0111

下記表2に見られるように、Tween(商標)80(0.0%)なしで処方された13vPnCは、撹拌後に抗原性が平均で20%減少した。0.01%Tween(商標)80を用いて処方された13vPnCは抗原性が2〜10%(平均8%)の範囲で減少し、0.05%Tween(商標)80を用いて処方された13vPnCは抗原性が0〜8%(平均3%)の範囲で減少した。従って、表2に記載したデータから、0.01%または0.05%のいずれかのTween(商標)80を用いて処方された13vPnCは、Tween(商標)80の非存在下で処方された13vPnCに対して、剪断力に対して有意に安定化されたことがわかる。

0112

0113

界面活性剤を含む処方は、連鎖球菌C5Aペプチダーゼを安定化させ、凝集を防止する
この実施例において使用される連鎖球菌C5aペプチダーゼ(SCP)を次のようにして発現させ、精製した。SCPを、アラビノース誘導系を用いて組み換えにより大腸菌において発現した。動物質を含まない合成培地を用いた大腸菌の標準的発酵プロトコルを行い、続いて細胞溶解を行った。組換えSCPを細胞溶解物の可溶性フラクションから、12〜24時間攪拌しながら60%(約3M)硫酸アルミニウムに飽和させることにより精製した。飽和溶解物を遠心分離し、上清を保持し、フェニルセファロース疎水性相互作用カラムにかけた。結合した物質を次に1M硫酸アルミニウム、20mM Tris−Cl、pH7.5で溶出し、濃縮し、PBS、pH7.4に対して膜分離した。精製された組換えSCP(rSCP)をPBS(pH7.4)で〜10mg/mLに希釈し、Posidyneフィルターに通して、内毒素を除去し、続いて滅菌のために最終濾過(0.2mM)を行い、凍結保存した(−25℃)。

0114

精製されたSCP(55μg/mL)を次に、0.025%Tween(商標)80を用いるか、またはTween(商標)80(0.0%)を用いないで、以下の緩衝液:5mMコハク酸塩緩衝液(pH6.0)、10mMリン酸塩緩衝液(pH7.0)、10mMリン酸塩緩衝液(7.4)または10mM Tris緩衝液(pH7.5)中で処方し、別のBD Hypak SCF(商標)シリンジ中に充填した。シリンジを次に水平オービタルシェーカー上に2〜8℃で置き、180cpmで2日間振とうし、SCPタンパク質濃度を修飾Lowry分析により決定した。

0115

図1に示すように、SCPの安定性は、Tween(商標)80を用いて処方した場合に大きく向上される。例えば、オービタルシェーカー上で2日後、Tween(商標)80なしで処方したSCP(図1A)は、試験した緩衝液のそれぞれのSCP濃度が有意に(例えば、90%より大)減少した。しかし、図1Bに示すように、オービタルシェーカー上に2日間設置する前に、0.025%Tween(商標)80をSCP緩衝液処方に添加することにより、SCPの損失が完全に阻害され、これは図1Aにおいて見られた。

0116

SCP/Tween(商標)80(0.025%)処方の貯蔵安定性も、それぞれ、25℃および37℃で8週間および6週間評価した(データは不図示)。簡単に言うと、SCP(200μg)を次のようなコハク酸塩緩衝液またはリン酸塩緩衝液のいずれかにおいて処方した:コハク酸塩緩衝液(5mM、pH6.0)またはリン酸塩緩衝液(15mM、pH7.4)、0.9%NaClおよび0.025%Tween(商標)80。SCP/Tween(商標)80処方の安定性を、サイズ排除−HPLC、修飾Lowry全タンパク質分析および沈殿の目視検査により分析した。この研究において、SCP/Tween(商標)80処方(いずれかの緩衝液中)は全安定性研究に関して、25℃および37℃で完全に安定であることが観察された(即ち、それぞれ最高8週間および6週間まで)。

0117

13vPnCの安定性に対するシリコーン処理された容器手段の影響
先の実験から、すぐ使用できる(単回投与)Becton Dickinson(登録商標)(BD)Hypak1型ホウケイ酸塩ガラスシリンジであって、Dow Corning(登録商標)メディカルグレードDC360シリコーンで処理されたシリンジ中に充填され、West4432/50ラテックスフリーストッパークロロブチル)およびEZチップキャップWest7025/65(合成Isoprene Bromobutyl Blend;West Pharmaceutical(登録商標)、Lionville、PA)でキャップされた場合に、13vPnC免疫原性組成物が沈殿および/または凝集することがわかった(データは不図示)。これらの実験において、13vPnCを、0.85%NaClならびに4.4μg/mlのエス・ニューモニエ血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23Fならびに8.8μg/mlのエス・ニューモニエ血清型6B(アジュバントとして、0.25mg/mLリン酸アルミニウムを含むかまたは含まない)を含有する5mMコハク酸塩緩衝液中で処方した。AlPO4の非存在下で、13vPnC粒子は容易に観察可能であり、一方、AlPO4の存在下では、13vPnC粒子は有意に減少し、検出がさらに困難であることが観察された。

0118

この実施例において、どの成分が13vPnC微粒子形成を誘発または助長するかを特定するために、一連の容器および密封装置成分(即ち、容器手段)を調べた。試験した容器手段は、シリンジ、ストッパーおよびバイアルを含み、下記表3に記載する。表3に記載するBDおよびWestストッパーを、HuberまたはJarプロセスのいずれかを用いてシリコーン処理した。シリコーン処理のHuberプロセスはより管理され、ストッパー表面上に30から60μg/cm2のシリコーンが得られ、一方、シリコーン処理のJarプロセスの結果、ストッパーの表面上に150から300μg/cm2のシリコーンが得られた。理論的計算に基づくと、ストッパーの表面積の約15%がシリンジ中の生成物と接触し、このことは、HuberおよびJarプロセスについて、それぞれ4.5から9μgおよび22.5から45μgの間のシリコーンがストッパーから抽出され得ることを示唆する。

0119

物質
シリコーンはDow Corning(登録商標)360 Medical Fluid1000センチストークバッチ番号0001846266)であった。7vPnCを、0.85%NaClならびに4.4μg/mlのエス・ニューモニエ血清型4、9、14、18C、19Fおよび23Fならびに8.8μg/mlのエス・ニューモニエ血清型6B(0.25mg/mlのリン酸アルミニウムを含む場合および含まない場合)を含有する5mMコハク酸塩緩衝液中で処方した。13vPnCを、0.85%NaClならびに4.4μg/mlのエス・ニューモニエ血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23Fならびに8.8μg/mlのエス・ニューモニエ血清型6B(0.25mg/mlのリン酸アルミニウムを含む場合および含まない場合)を含有する5mMコハク酸塩緩衝液中で処方した。一価エス・ニューモニエ血清型6B(0.85%NaClを含有し、リン酸アルミニウムを含まない5mMコハク酸塩緩衝液)を61μg/mlの濃度で処方して、13vPnC処方の全単糖類濃度をシミュレートした。

0120

方法
7vPnCおよび13vPnCを前述のように処方し、35mlの所定の処方を透明な250mlのNalgene(登録商標)ビンに添加した。各Nalgene(登録商標)ビン中に、表3に記載する容器手段成分を添加した。Nalgene(登録商標)ビンを次にLabline(登録商標)Orbit Shaker上に置き、一夜50rpmで回転させた。結果を表3にまとめる。

0121

外観。各容器手段成分を含むNalgene(登録商標)ビンを実験室中で蛍光にかざした。サンプルを通過する光線経路チンダル効果)により、微粒子の検出が可能になった。

0122

タンパク質分析。タンパク質およびアルミニウムに結合したタンパク質の合計を、処方した免疫原性組成物中の全タンパク質濃度およびアルミニウムペレットと結合したタンパク質をそれぞれ測定することにより決定した(免疫原性組成物のアリコートを遠心分離し、ペレットを塩溶液中に再懸濁させた)。ウシ血清アルブミンを標準として用いるPierce Modified Lowryタンパク質分析(カタログ#23240)を用いて分析を行った。

0123

結果
第一の実験において、13vPnC免疫原性組成物をAlPO4無しで処方し、表3に記載する一連の容器手段と接触させた。データから明らかなように(表3)、シリコーン油で処理された容器手段成分は、白色粒子の形成を誘発した。対照的に、シリコーン処理されていないDaikyo(登録商標)ストッパー(Daikyo Seiko、Ltd.、Japan)およびSchottバイアル(Schott North America Inc.;Lebanon、PA)の存在下で、微粒子は検出されなかった。

0124

0125

一価エス・ニューモニエ血清型6Bを13vPnCのモデルとして選択し、61.6μg/ml(AlPO4なし)で処方して、13vPnC処方中の全単糖類濃度をシミュレートした。シリコーン(Dow Corning 360 Medical Fluid)を処方された一価6Bのアリコート(2ppmから100ppmの範囲)に添加した。混合物をLabline(登録商標)Orbit Shaker上に2時間、50rpmで置いた。下記表4に示すように、繊維様白色微粒子が全てのシリコーン(Si)濃度で観察された。

0126

0127

13vPnC処方(AlPO4を含まない)中のシリコーンの量も調べた。シリコーン濃度をDCプラズマ発光分光分析(データは不図示)により決定した。この方法において、25シリンジの内容物をプールし、50mlのシクロヘキサンイソプロピルアルコール混合物で2回抽出した。抽出物を合し、蒸発させた。残留物可溶化させ、ゴム栓上で既存のシリコーン測定法により試験した。結果から、15.8から19.0μgのシリコーンを各シリンジから抽出できることがわかった。この量は、2.7%から3.3%のシリコーンに相当する。

0128

13vPnCをAlPO4の存在下で処方し、表3に記載される同じ容器手段に付す、別の一連の実験において、溶液中のシリコーンおよび「遊離」タンパク質(13vPnC)は微粒子の形成に関与することが明らかにされた(データは不図示)。微粒子のFTIR分析からは、微粒子はタンパク質およびシリコーンからなることもわかった(データは不図示)。これらの実験において、約85%の13vPnCがAlPO4と結合し、ここで、残りの15%は溶液中遊離(AlPO4と結合しない)13vPnCであった。対照的に、AlPO4を用いて処方された7vPnCは、AlPO4と100%結合することが観察された(データは不図示)。

0129

無タンパク質−多糖類の微粒子形成に対する影響を解明するために、25mlの7vPnCおよび13vPnCをアリコートに分け、50mlの遠心管に移した。サンプルを3,000rpmで10分間遠心分離し、上清を慎重に抽出し、Nalgene(登録商標)ビンに移した。10個のシリコーン処理されたストッパー(4432ストッパー)を各ビンに加え、オービタルシェーカー(50rpm)上に置いた。注意深く目視検査すると、7vPnC上清は微粒子を形成せず、従って無色透明のままであることが観察された。しかし、13vPnC上清は4時間観察すると少量の微粒子を示し始めた(データは不図示)。この結果は、溶液中の無タンパク質−多糖類は、シリコーンと併せて、微粒子形成に関与することを示唆した。

0130

溶液中の無タンパク質−多糖類の微粒子形成に対する寄与をさらに解明するために、一価エス・ニューモニエ血清型4および6Bを、そのそれぞれアルミニウムに対する高い結合および低い結合について選択した。これら2つの一価物質を25μg/mlから200μg/mlの範囲のタンパク質濃度で、AlPO4の非存在下および存在下で処方した。10個のシリコーン処理されたストッパー(4432ストッパー)を各処方中に入れ、これを次にオービットシェーカー(50rpm)上に置いた。下記表5に示すように、どちらの一価血清型についても全てのタンパク質濃度でAlPO4の非存在下、繊維様白色微粒子が観察された。しかし、AlPO4の存在下では、血清型4(100μg/ml)対血清型6B(200μg/ml)についてさらに低い濃度で微粒子が検出された(データは不図示)。

0131

0132

アルミニウムアジュバントはシリコーン処理された容器手段の存在下での13vPnC微粒子の形成を阻害する
実施例3において前述したように、13vPnC免疫原性組成物は、4.4μg/mLのエス・ニューモニエ血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、23Fおよび8.8μg/mLの6B型を5mMコハク酸塩緩衝液(pH5.8)および0.85%NaCl中に含む液体処方(アジュバント(例えば、アルミニウムアジュバント)を用いるか、または用いないで処方することもできる)である。13vPnCは、例えば、0.25mgアルミニウム/mlリン酸アルミニウム(AlPO4)などのアジュバントを用いて、または用いないで処方することもできる。実施例3において、AlPO4無しで処方され、BD Hypak SCF(商標)シリンジ(Hypakプランジャーでキャップされたもの)中に充填された13vPnC処方は、微粒子が観察されたために目視検査に合格せず、この場合、さらなる研究により、微粒子はタンパク質−多糖類のシリコーンとの相互作用が一因であることが明らかになった。以下の実施例において、様々な製造業者から得られるシリンジ(およびプランジャー)を13vPnC処方に関して評価した。この場合、輸送および取り扱い条件は攪拌によりシミュレートした(以下に記載)。

0133

材料
13vPnCを、0.85%NaClおよび4.4μg/mlのエス・ニューモニエ血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23Fならびに8.8μg/mlのエス・ニューモニエ血清型6B(0.25mg/mlリン酸アルミニウムを用いる場合および用いない場合の両方)を含有する5mMコハク酸塩緩衝液中で処方した。試験した容器手段を下記表6に記載する。

0134

0135

方法
処方および充填手順。下記表7に、2リットルの13vPnC処方のレシピを記載する。簡単に説明すると、0.85%塩溶液をまずガラスビーカーに添加し、続いて5mMコハク酸塩緩衝液(pH5.8)を添加し、次に連続して各エス・ニューモニエ血清型複合体を添加した。処方を次にスターラープレート上で穏やかに混合し、0.22μmのMillipore(登録商標)フィルターユニットを通して濾過した。AlPO4を含む処方に関しては、AlPO4(0.25mg/ml最終濃度)を次に添加し、処方を穏やかに混合した。テストシリンジを次に充填し(0.58ml/シリンジ)、プランジャーでキャップをした。

0136

攪拌による輸送のシミュレーション。VWR(登録商標)signature Digital Multitube攪拌機(カタログ番号14005−826)を使用して、サンプルを攪拌した。13vPnCを充填したシリンジを水平に置き、攪拌機の2つの支持プレートにより固定した。サンプルを水平な位置に保持し、500rpmポーズモード、2〜8℃で24時間攪拌した。

0137

比濁法。血清型特異性抗原性を、型特異性抗体を用いた比濁法により決定した。AlPO4を含む13vPnCに関して、1N NaOHを添加することによりリン酸アルミニウムを可溶化した。1Mクエン酸を添加することにより、溶液を直ちに中和した。AlPO4を含まない13vPnCについては、可溶化および中和を行わなかった。この分析は、Beckman Array 36−比濁計を用いて、サンプル中で形成された抗体−抗原複合体由来光散乱強度変化率を測定する。

0138

0139

結果
この研究において、様々な製造業者から得られるシリンジであって、様々なシリコーンレベル(表6)を有するものを、制御された攪拌条件に付した。各血清型の全抗原性を、攪拌前および撹拌後の両サンプルについて比濁分析により測定した。撹拌後の抗原性の損失(%)を計算し、図2から図7に示す。

0140

この研究の前に、2つの対照:(1)最悪の対照(正の対照、高シリコーン;図2)および(2)最良の対照(負の対照、シリコーン無し;図3)の抗原性損失に基づいて、攪拌条件を最適化した。条件を次に、抗原性損失が正の対照においては低いが、それでも負の対照においては検出可能であるように最適化した。これは、攪拌が弱すぎてシリンジ中で沈殿が生じなかったり;強すぎて、沈殿がシリコーン相互作用以外の他の因子(例えば、剪断力)により生じたりすることのないようにするためであった。従って、500rpm(ポーズモード)で24時間の攪拌を最も適した攪拌条件として選択し、リアルタイムの製品輸送および取り扱いにおける状態をシミュレートするために、2〜8℃の温度および水平位を使用した。

0141

この実験の結果は次のようにまとめられる:13vPnC処方(AlPO4を含む)の最大の抗原性損失は、高いシリコーンレベルのシリンジで起こった(データは不図示)。例えば、表6に記載するシリンジのうち、BD Hypakシリンジ(対照1)、BD焼成シリンジ(シリンジ3;0.1mgシリコーン)、BD高粘度(シリンジ5)およびBunderGlas PS4シリンジ(シリンジ8、0.14mgシリコーン)、それぞれは10%より高い抗原性損失を有する1以上の13vPnCを有していた。AlPO4を用いて処方した13vPnCの最小の抗原性損失は、低シリコーンレベルのシリンジで起こった。例えば、Vetterシリンジ(図4)およびSchott TopPacプラスチックシリンジ(図5)はシリコーン処理されていないシリンジと最もよく似ており(図2)、どちらもAlPO4を用いて処方された13vPnCについてわずかな抗原性損失を示した。

0142

シリコーン処理されたシリンジの存在下での、13vPnCの安定化および微粒子形成の阻害に対するリン酸アルミニウムの影響を、0.25mg/mlのAlPO4のある場合およびない場合の両方で処方した13vPnCを用いた実験において分析した。この実験では、使用したシリンジは、BD焼成低シリコーンシリンジ(表6中のシリンジ4表6)およびBunderGlas低シリコーンPS2シリンジ(表6中のシリンジ7)であった。BD焼成低シリコーンシリンジ(0.04mgシリコーン/バレル)は、典型的には、AlPO4を用いて処方した13vPnC血清型について、10%より低い抗原性損失を有し(図6A)、一方、AlPO4無しで処方された13vPnC血清型についての抗原性損失(図6B)は、5%(血清型1)から約50%(血清型23F)までの範囲の抗原性損失を有していた。BunderGlas低シリコーンPS2(0.056mgシリコーン/バレル)シリンジは、AlPO4を用いて処方した13vPnCについて5〜8%未満の抗原性損失(血清型に依存)を有し(図7A)、一方、AlPO4なしで処方された13vPnC血清型についての抗原性損失(図7B)は、約5%から約30%の範囲の抗原性損失を有していた(血清型に依存)。

0143

従って、これらのデータは併せて:(1)13vPnCの抗原性損失は、シリンジのシリコーンレベルが高いほど大きく、(2)AlPO4なしで処方された13vPnCは、試験されたシリンジの全てにおいて、AlPO4を含む13vPnCよりも高い抗原性損失を維持していたことを示す。

0144

アルミニウム塩アジュバントに対する髄膜炎菌性抗原タンパク質の結合を最適化する界面活性剤を含む処方
この実施例において使用した組み換え脂質付加髄膜球菌2086タンパク質(rLP2086)は次のようにして発現し、精製した。ネイティブリーダー配列を用いて、rLP2086を組み換えにより大腸菌において発現した。動物質を含まない合成培地を用いた大腸菌についての標準的発酵プロトコルを行い、続いて細胞溶解を行った。組み換え脂質付加髄膜球菌2086タンパク質を、50mM Tris−HCl/5mMEDTA/1%サルコシル(pH8)を用いて膜ペレットから精製した。このサルコシル抽出物を1%Zwittergent 3−14(Z3−14)に調節し、30倍過剰の50mM Tris−HCl/5mM EDTA/1%Z3−14に対して2回透析した。透析されたrLP2086抽出物を、90%エタノールを用いて沈殿させて、残存するサルコシルを除去し、50mM Tris−HCl/5mM EDTA/1%Z3−14(pH8)を用いて可溶化した。不溶物を遠心分離により除去し、上清をアニオン交換クロマトグラフィーカラムにかけ、rLP2086を未結合フラクション中に集めた。未結合物質を次に30倍過剰の25mM NaAc/1%Z3−14(pH4.5)に対して2回透析し、カチオン交換クロマトグラフィーカラムにかけた。rLP2086を、0〜0.3M NaCl勾配を用いて溶出し、凍結保存した(−25℃)。

0145

精製されたrLP2086を次に、150mM NaCl、0.020%Tween(商標)80、0.25mg(Al)/mL(AlPO4)を用いて、次の緩衝液中で処方した:10mMリン酸塩緩衝液(pH7.0)および5mMコハク酸塩緩衝液(pH6.0)。表8は、AlPO4アジュバントに対するタンパク質結合(%)を比較する。

0146

0147

引例
Baldwin、“Contamination of insulin by silicone oil:A potential hazard of plastic insulin syringes”、Diabet.Med.,5:789−790、1988.
Bartzoka、BrookおよびMcDormott、“Protein Silicone Interactions at Liquid−Liquid Interfaces.In K.L. Mittal and P. Kumar(eds.), Emulsions, Foams and Thin Films, Dekker、New York、pp.371−380、2000.
Bartzoka、BrookおよびMcDormott、“Protein−Silicone Films: Establishing the Strength of the Protein−Silicone Interaction”、Langmuir 14:1892−1898、1998b.
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図面の簡単な説明

0148

水平オービタルシェーカー上で2日間穏やかに攪拌(60cpm)する前後の連鎖球菌C5aペプチダーゼ(SCP)処方(シリンジ中に充填)の安定性を示す図である。図1Aに示すデータは、Tween(商標)80を含まずに処方されたSCP(すなわち、0%)の2日安定性であり、一方、図1Bのデータは、0.025%Tween(商標)80を用いて処方されたSCPの2日安定性である。図1Aおよび1Bに示される処方において使用される緩衝液は、コハク酸塩緩衝塩溶液(SBS)、リン酸塩緩衝塩溶液(PBS)およびトリス(ヒドロキシメチルアミノメタン(TRIS)である。
AlPO4(0.25mg/ml)を用いて処方され、BD Hypakシリンジ中に充填された13vPnCの、500rpm、2〜8℃で2時間、8時間および24時間撹拌後の全抗原性損失を示す図である。
AlPO4(0.25mg/ml)を用いて処方され、シリコーン処理されていないシリンジ中に充填された13vcPnCの、500rpm、2〜8℃で2時間、8時間および24時間撹拌後の全抗原性損失を示す図である。
AlPO4(0.25mg/ml)を用いて処方され、Vetterシリンジ中に充填された13vPnCの、500rpm、2〜8℃で2時間、8時間および24時間撹拌後の全抗原性損失を示す図である。
図5は、AlPO4(0.25mg/ml)を用いて処方され、Schott TopPacシリンジ中に充填された13vPnCの、500rpm、2〜8℃で2時間、8時間および24時間撹拌後の全抗原性損失を示す。
AlPO4(0.25mg/ml)を用いて処方された13vPnC(図6A)およびAlPO4を含まない13vPnC(図6B)で、BD Bakedシリンジ中に充填されたものの、500rpm、2〜8℃で2時間、8時間および24時間撹拌後の全抗原性損失を示す図である。
AlPO4(0.25mg/ml)を用いて処方された13vPnC(図7A)およびAlPO4を含まない13vPnC(図7B)であって、BunderGlas PS2シリンジ中に充填されたものの、500rpm、2〜8℃で2時間、8時間および24時間撹拌後の全抗原性損失を示す図である。

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