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技術 哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための組成物及び方法

出願人 ザスクリプスリサーチインスティテュート
発明者 ボイトラー,ブルースジヨルジエル,フイリツプ
出願日 2006年7月20日 (13年3ヶ月経過) 出願番号 2008-522996
公開日 2009年4月9日 (10年7ヶ月経過) 公開番号 2009-514788
状態 未査定
技術分野 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 動物の育種及び生殖細胞操作による繁殖 生物学的材料の調査,分析 特有な方法による材料の調査、分析 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物、その培養処理 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性 非環式または炭素環式化合物含有医薬
主要キーワード 妨害位置 同等条件 排除機 正サイズ 加水分解酵素類 集積システム 初期ギャップ ロボット化
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (10)

課題・解決手段

哺乳動物対象におけるグラム陽性細菌感染治療するための、組成物及び方法を提供する。哺乳動物対象におけるグラム陽性細菌皮膚感染を治療するための、組成物及び方法をさらに提供する。Scd1遺伝子発現活性化するか、又はScd1遺伝子産物を活性化する化合物の有効量を哺乳動物対象に投与することを含む、組成物及び方法をさらに提供する。

概要

背景

表面上皮は、病原体に対する防御第一線を構成する。この防御は、バリア機能及び特異的な殺菌性エフェクター分子の両方に依存する。例えば、哺乳動物の皮膚は、高度に架橋したケラチンの層により被覆された、密に連結した細胞から構成されており、正常には細菌を浸透させないなどの理由から、物理的な保護を与える。ヒトにおいて、粘膜上皮異形成又は表皮水疱症などのいくつかの遺伝性疾患(これらは、様々なレベルで皮膚の上皮構造に影響を及ぼす。)は、易感染性が非常に高くなる。Vidalら、Nat Genet 10:229−34、2995;Witkopら、Am J Genet31:414−27、1979。しかし、皮膚は、その物理的完全性が破られた場合でも、殺菌活性を示す。皮膚は生物活性分子を保有しており、その中でも、ディフェンシン及びカテリシジンなどの抗菌性ペプチドAMPs)は、微生物侵入に対する宿主防御に対して不可欠で重要なものである(Zasloff、Nature 415:389−95、2002;Zasloff、N Engl J Med 347:1199−200、2002)。

AMPsは最もよく研究されている皮膚防御分子であるが、一方、その他の保護システムもまた存在し得る。皮脂腺により産生されるモノ不飽和脂肪酸(MUFA)はこの点に関して言及されており、いくつかのMUFAは殺菌性であることが知られている。Millerら、Arch Dermatol 124:209−15、1988;Wille及びKydonieus、Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 16:176−87、2003。しかし、抗微生物防御に対するこれらの寄与はインビボでは認められておらず、その生合成微生物刺激による制御に支配されることも分かっていない。当技術分野で、哺乳動物対象での微生物感染に対する反応における、先天性免疫反応刺激する改良組成物及び方法の開発が必要とされている。さらに、哺乳動物対象におけるグラム陽性細菌感染及びグラム陽性細菌による皮膚感染を治療するための改良組成物及び方法を開発する必要がある。

概要

哺乳動物対象におけるグラム陽性細菌感染を治療するための、組成物及び方法を提供する。哺乳動物対象におけるグラム陽性細菌皮膚感染を治療するための、組成物及び方法をさらに提供する。Scd1遺伝子発現活性化するか、又はScd1遺伝子産物を活性化する化合物の有効量を哺乳動物対象に投与することを含む、組成物及び方法をさらに提供する。

目的

細胞においてグラム陽性殺菌活性を調節する化合物を同定するための方法が提供され、この方法は、トール様受容体2を発現する細胞を含有する細胞に基づくアッセイ系と試験化合物を接触させることと、トール様受容体2シグナリングを活性化するのに有効であるように選択された量でこのアッセイ系にリガンドを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

Scd1遺伝子発現活性化する化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染治療するための方法。

請求項2

化合物がトール様受容体2のアゴニストである、請求項1に記載の方法。

請求項3

化合物が、小型の化学分子、抗体、アンチセンス核酸、短いヘアピンRNA又は短い干渉RNAである、請求項1に記載の方法。

請求項4

グラム陽性細菌感染が、Streptococcuspyogenes(化膿連鎖球菌)感染又はStaphlococcusaureus(黄色ブドウ球菌)感染である、請求項1に記載の方法。

請求項5

対象が、Scd1遺伝子における機能喪失又は機能低下突然変異を有する、請求項2に記載の方法。

請求項6

Scd1遺伝子産物を活性化する化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法。

請求項7

化合物がトール様受容体2のアゴニストである、請求項6に記載の方法。

請求項8

化合物が、小型の化学分子、抗体、アンチセンス核酸、短いヘアピンRNA又は短い干渉RNAである、請求項6に記載の方法。

請求項9

グラム陽性細菌感染が、化膿連鎖球菌(Streptococcuspyogenes)感染又は黄色ブドウ球菌(Staphlococcusaureus)感染である、請求項6に記載の方法。

請求項10

対象が、Scd1遺伝子における機能喪失又は機能低下突然変異を有する、請求項7に記載の方法。

請求項11

モノ不飽和脂肪酸の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法。

請求項12

モノ不飽和脂肪酸が、パルミトレイン酸又はオレイン酸である、請求項11に記載の方法。

請求項13

グラム陽性細菌感染が化膿連鎖球菌(Streptococcuspyogenes)感染又は黄色ブドウ球菌(Staphlococcusaureus)感染である、請求項11に記載の方法。

請求項14

モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与が、局所又は皮内である、請求項11に記載の方法。

請求項15

モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与が、筋肉内、皮下、腹腔内又は静脈内である、請求項11に記載の方法。

請求項16

Scd1生合成経路の産物である化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法。

請求項17

化合物がモノ不飽和脂肪酸である、請求項16に記載の方法。

請求項18

モノ不飽和脂肪酸が、パルミトレイン酸又はオレイン酸である、請求項17に記載の方法。

請求項19

グラム陽性細菌感染が化膿連鎖球菌(Streptococcuspyogenes)感染又は黄色ブドウ球菌(Staphlococcusaureus)感染である、請求項16に記載の方法。

請求項20

モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与が、局所又は皮内である、請求項16に記載の方法。

請求項21

モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与が、筋肉内、皮下、腹腔内又は静脈内である、請求項16に記載の方法。

請求項22

細胞においてグラム陽性細菌殺菌活性を調節する化合物を同定するための方法(該方法は、トール様受容体2を発現する細胞を含有する細胞に基づくアッセイ系と試験化合物を接触させることと、トール様受容体2シグナリングを活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系にリガンドを提供することと(トール様受容体2シグナリングは、リガンドに対する反応性シグナル化し、Scd1遺伝子発現を調節することができる。)、トール様受容体2シグナリングにおける、及びScd1遺伝子発現の調節における、試験化合物の効果を検出することと(このアッセイにおける試験化合物の有効性はグラム陽性細菌殺菌活性であることを示す。)、を含む。)。

請求項23

リガンドが、内因性リガンド又は外因性リガンドである、請求項22に記載の方法。

請求項24

外因性リガンドが、リポ多糖類リピッドA、ジアシルリポペプチドトリアシル化リポペプチド、S−MALP−2、R−MALP−2、細菌性リポペプチド、Pam2CSK4、リポタイコ酸又はザイモサンAである、請求項23に記載の方法。

請求項25

外因性リガンドが、S−MALP−2又はR−MALP−2である、請求項24に記載の方法。

請求項26

外因性リガンドが、Salmonellaminnesota(サルモネラミネソタ由来の、ラフ型リポ多糖類、スムース型リポ多糖類又はリピッドAである、請求項23に記載の方法。

請求項27

検出段階がさらに、細胞においてScd1遺伝子発現又はScd1遺伝子産物の活性化を測定することを含み、Scd1遺伝子発現又はScd1遺伝子産物が、外因性リガンドと細胞との接触に反応して活性化される、請求項23に記載の方法。

請求項28

外因性リガンドが、グラム陽性細菌の成分であり、グラム陰性細菌の成分ではない、請求項27に記載の方法。

請求項29

内因性リガンドが脂質である、請求項23に記載の方法。

請求項30

化合物が、トール様受容体2経路シグナリングのアゴニストである、請求項22に記載の方法。

請求項31

検出段階が、化合物によるトール様受容体2へのリガンドの結合の促進を測定することをさらに含む、請求項22に記載の方法。

請求項32

検出段階が、細胞アッセイにおいてScd1遺伝子産物の増加を測定することをさらに含む、請求項22に記載の方法。

請求項33

検出段階が、細胞アッセイにおいてScd1遺伝子産物活性の上昇を測定することをさらに含む、請求項22に記載の方法。

請求項34

検出段階が、細胞アッセイにおいてモノ不飽和脂肪酸合成の上昇を測定することをさらに含む、請求項22に記載の方法。

請求項35

細胞アッセイが、マクロファージ細胞をさらに含む、請求項22に記載の方法。

請求項36

細胞アッセイが、皮脂腺由来の細胞をさらに含む、請求項22に記載の方法。

請求項37

細胞アッセイが、セボサイト細胞をさらに含む、請求項36に記載の方法。

請求項38

検出段階が、トール様受容体2に結合する標識化リガンドを測定することをさらに含む、請求項22に記載の方法。

請求項39

標識化リガンドが、放射性標識又は蛍光標識されている、請求項38に記載の方法。

請求項40

トール様受容体2をアッセイ系に提供することと、アッセイ系においてトール様受容体2シグナリングにおける試験化合物の効果(このアッセイでの試験化合物の有効性は調節の指標である。)を検出することと、をさらに含む、請求項22に記載の方法。

請求項41

検出段階が、化合物によるトール様受容体2へのリガンドの結合の低下をもたらすことをさらに含む、請求項22に記載の方法。

請求項42

検出段階が、化合物によるトール様受容体2へのリガンドの結合上昇をもたらすことをさらに含む、請求項22に記載の方法。

請求項43

検出段階が、細胞アッセイにおいてステアロイルCoA不飽和化酵素1活性の上昇を測定することをさらに含む、請求項22に記載の方法。

請求項44

検出段階が、細胞アッセイにおいてモノ不飽和脂肪酸合成の上昇を測定することをさらに含む、請求項43に記載の方法。

請求項45

検出段階が、細胞アッセイにおいてグラム陽性細菌殺菌活性の上昇を測定することをさらに含む、請求項22に記載の方法。

請求項46

哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染に対するリスク因子診断するための方法(該方法は、細胞又は組織を対象から採取することと、トール様受容体2に対する内因性リガンド又は外因性リガンドと細胞又は組織を接触させることと、リガンドと接触した細胞又は組織におけるScd1遺伝子産物の産生を測定することと、哺乳動物対象におけるScd1遺伝子産物の機能低下又は機能喪失を検出することと、を含む。)。

請求項47

細胞又は組織が、マクロファージ、セボサイト又は皮脂腺由来である、請求項46に記載の方法。

請求項48

Scd1遺伝子産物の機能低下又は欠如がグラム陽性細菌感染に対するリスクを上昇させる、請求項46に記載の方法。

請求項49

Scd1遺伝子産物の機能低下又は欠如が細胞におけるモノ不飽和脂肪酸合成を低下させる、請求項46に記載の方法。

請求項50

Scd1遺伝子産物の機能低下又は欠如がグラム陽性細菌感染に対する炎症反応を低下させる、請求項46に記載の方法。

請求項51

Scd1遺伝子産物の機能低下又は欠如が患者損傷部位での炎症反応を低下させる、請求項50に記載の方法。

請求項52

Scd1遺伝子産物の欠如が、炎症が所望の防御機構である状態に対するリスクを上昇させる、請求項46に記載の方法。

請求項53

リガンドが、外因性リガンド、リポタイコ酸(LTA)、ジアシル化リポペプチド、トリアシル化リポペプチド、S−MALP−2、細菌性リポペプチド、ペプチドグリカンマンナン非メチル化CpGDNA、フラジェリン又は1本鎖RNAである、請求項46に記載の方法。

請求項54

外因性リガンドがS−MALP−2である、請求項46に記載の方法。

請求項55

リガンドが、内因性リガンド、脂質、脂肪ステロールリポタンパク質脂肪酸酸化LDL、トロンボスポンジン又はβ−アミロイドである、請求項46に記載の方法。

請求項56

哺乳動物対象において、Scd1遺伝子機能喪失により誘発される疾患又はそれに対する遺伝性素因を診断する方法(該方法は、哺乳動物対象から得られた、細胞試料タンパク質試料又は核酸試料において、突然変異Scd1タンパク質又は突然変異Scd1タンパク質をコードする核酸の存在を調べることを含み、かかるタンパク質又は核酸の存在は、Scd1遺伝子機能喪失により誘発される疾患又はそれに対する遺伝性素因の指標である。)。

請求項57

Scd1遺伝子機能喪失により誘発される疾患が、グラム陽性細菌感染に対する易感染性の上昇である、請求項56に記載の方法。

請求項58

タンパク質試料又は細胞試料を抗Scd1抗体に接触させることと、野生型又は突然変異Scd1タンパク質の存在を検出することと、をさらに含む、請求項56に記載の方法。

請求項59

検出段階が、哺乳動物対象からの単核食細胞又はマクロファージの蛍光活性化細胞分類FACS分析をさらに含む、請求項58に記載の方法。

請求項60

ハイブリダイズ条件下で突然変異Scd1遺伝子をコードする標識化DNA又はRNA分子と核酸試料を接触させることと、ハイブリダイゼーション後、標識化DNA又はRNA分子を検出することと、をさらに含み、標識化DNA又はRNAの検出が、試料中の突然変異Scd1遺伝子をコードする核酸分子の存在の指標である、請求項56に記載の方法。

請求項61

認識配列が突然変異Scd1遺伝子における突然変異により影響を受ける制限酵素と核酸試料を接触させることと、制限酵素との接触後、断片の有無又は核酸断片の変化があることを検出することと、をさらに含み、制限酵素との接触後の、断片の欠如又は核酸断片の変化があることが、試料中の突然変異Scd1遺伝子をコードする核酸分子の存在の指標である、請求項56に記載の方法。

請求項62

異種の核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物(該核酸は、Scd1遺伝子の機能喪失対立遺伝子を含有し、該動物は、野生型の表現型に対して、グラム陽性細菌感染に対する易感染性を含む表現型を示す。)。

請求項63

Scd1突然変異動物の表現型が、皮脂腺が発育不全であること又はモノ不飽和脂肪酸を合成できないことを特徴とする、請求項62に記載のトランスジェニック非ヒト動物。

請求項64

Scd1遺伝子における機能喪失対立遺伝子がT227Kでのアミノ酸置換である、請求項62に記載のトランスジェニック非ヒト動物。

請求項65

動物がマウス又はラットである、請求項62に記載のトランスジェニック非ヒト動物。

請求項66

請求項62に記載のトランスジェニック非ヒト動物由来の細胞又は細胞株

請求項67

トール様受容体2−シグナリング活性調節因子に対するスクリーニングインビトロ法(該方法は、請求項66に記載の細胞又は細胞株を試験化合物と接触させることと、細胞におけるモノ不飽和脂肪酸合成量、グラム陽性細菌感染に対する易感染性又はトール様受容体2誘導性マクロファージ活性化活性の上昇又は低下を検出することと、それによりトール様受容体2誘導性マクロファージ活性化活性の調節因子として試験化合物を同定することと、を含む。)。

請求項68

トール様受容体2シグナリング活性の調節因子に対するスクリーニングのインビボ法(該方法は、請求項62に記載のトランスジェニック動物を試験化合物と接触させることと、細胞におけるモノ不飽和脂肪酸合成量、グラム陽性細菌感染に対する易感染性又はトール様受容体2誘導性のマクロファージ活性化活性の上昇又は低下を検出することと、それによりトール様受容体2誘導性マクロファージ活性化活性の調節因子として試験化合物を同定することと、を含む。)。

技術分野

0001

政府支援の陳述
本発明は、National Institutes of Healthからの交付番号第U54−AI54523による政府支援によりなされた。政府は、本発明において所定の権利を有する。

0002

関連出願の相互参照
本願は、米国仮出願第60/701,216号(2005年7月20日出願)及びExpress Mail第EV670672061 USによる、米国出願「COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING GRAM POSITIVEBACTERIALINFECTION IN A MAMMALIANSUBJECT」(2006年7月19日出願)の優先権を主張し、これらの全体の開示を参照により組み込む。

0003

分野
本発明は、全般的に、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染治療するするための、組成物及び方法に関する。本発明はさらに、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌皮膚感染を治療するための組成物及び方法に関する。本組成物及び方法はさらに、哺乳動物対象に、Scd1遺伝子発現活性化する、又はScd1遺伝子産物を活性化する化合物の有効量を投与することを含む。

背景技術

0004

表面上皮は、病原体に対する防御第一線を構成する。この防御は、バリア機能及び特異的な殺菌性エフェクター分子の両方に依存する。例えば、哺乳動物の皮膚は、高度に架橋したケラチンの層により被覆された、密に連結した細胞から構成されており、正常には細菌を浸透させないなどの理由から、物理的な保護を与える。ヒトにおいて、粘膜上皮異形成又は表皮水疱症などのいくつかの遺伝性疾患(これらは、様々なレベルで皮膚の上皮構造に影響を及ぼす。)は、易感染性が非常に高くなる。Vidalら、Nat Genet 10:229−34、2995;Witkopら、Am J Genet31:414−27、1979。しかし、皮膚は、その物理的完全性が破られた場合でも、殺菌活性を示す。皮膚は生物活性分子を保有しており、その中でも、ディフェンシン及びカテリシジンなどの抗菌性ペプチドAMPs)は、微生物侵入に対する宿主防御に対して不可欠で重要なものである(Zasloff、Nature 415:389−95、2002;Zasloff、N Engl J Med 347:1199−200、2002)。

0005

AMPsは最もよく研究されている皮膚防御分子であるが、一方、その他の保護システムもまた存在し得る。皮脂腺により産生されるモノ不飽和脂肪酸(MUFA)はこの点に関して言及されており、いくつかのMUFAは殺菌性であることが知られている。Millerら、Arch Dermatol 124:209−15、1988;Wille及びKydonieus、Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 16:176−87、2003。しかし、抗微生物防御に対するこれらの寄与はインビボでは認められておらず、その生合成微生物刺激による制御に支配されることも分かっていない。当技術分野で、哺乳動物対象での微生物感染に対する反応における、先天性免疫反応刺激する改良組成物及び方法の開発が必要とされている。さらに、哺乳動物対象におけるグラム陽性細菌感染及びグラム陽性細菌による皮膚感染を治療するための改良組成物及び方法を開発する必要がある。

0006

本発明は、全般的に、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するするための、組成物及び方法に関する。哺乳動物対象においてグラム陽性細菌皮膚感染を治療するために、組成物及び方法がさらに提供される。ステアロイルCoA不飽和化酵素1(Scd1)遺伝子発現を活性化するか又はScd1遺伝子産物、ステアロイルCoA不飽和化酵素を活性化する化合物の有効量を哺乳動物対象に投与することを含む、組成物及び方法がさらに提供される。

0007

マウスにおける先天性免疫不全表現型は、モノ不飽和脂肪酸(MUFA)合成に必須である酵素の構造に影響を与える突然変異であることが明らかにされている。C57BL/6マウスのENU−誘導性生殖細胞系列突然変異誘発を使用して、Flake(flk)C57BL/6マウスの劣性生殖細胞系列突然変異が単離、同定された。flk突然変異マウスは、トール様受容体2を活性化することにより先天性免疫反応を誘発する、Streptococcus pyogenes(化膿連鎖球菌)及びStaphylococcus aureus(黄色ブドウ球菌)、グラム陽性病原体による皮膚感染を排除する点で障害がある。ポジショナルクローニング及び配列決定により、flkがステアロイルCoA不飽和化酵素1遺伝子(Scd1)の新規対立遺伝子であることが分かった。

0008

Scd1遺伝子発現を活性化する化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法が提供される。ある態様において、本化合物はトール様受容体2のアゴニストである。別の態様において、本化合物は、小型の化学分子、抗体、アンチセンス核酸、短いヘアピンRNA又は短い干渉RNAである。グラム陽性細菌感染は、例えば、Streptococcus pyogenes(化膿連鎖球菌)感染又はStaphlococcus aureus(黄色ブドウ球菌)感染であり得る。さらなる態様において、本方法は、Scd1遺伝子において機能喪失又は機能低下の突然変異を有する対象を治療することを含む。

0009

Scd1遺伝子産物を活性化する化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法が提供される。ある態様において、本化合物はトール様受容体2のアゴニストである。別の態様において、本化合物は、小型の化学分子、抗体、アンチセンス核酸、短いヘアピンRNA又は短い干渉RNAである。グラム陽性細菌感染は、例えば、Streptococcus pyogenes(化膿連鎖球菌)感染又はStaphlococcus aureus(黄色ブドウ球菌)感染であり得る。さらなる態様において、本方法は、Scd1遺伝子において機能喪失又は機能低下の突然変異を有する対象を治療することを含む。

0010

モノ不飽和脂肪酸の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法が提供される。モノ不飽和脂肪酸は、例えば、パルミトレイン酸又はオレイン酸であり得る。グラム陽性細菌感染は、例えば、Streptococcus pyogenes(化膿連鎖球菌)感染又はStaphlococcus aureus(黄色ブドウ球菌)感染であり得る。ある態様において、モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与は、局所又は皮内である。別の態様において、モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与は、筋肉内、皮下、腹腔内又は静脈内である。

0011

Scd1生合成経路の産物である化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療する方法が提供される。ある態様において、本化合物はモノ不飽和脂肪酸である。モノ不飽和脂肪酸は例えば、パルミトレイン酸又はオレイン酸であり得る。グラム陽性細菌感染は例えば、Streptococcus pyogenes(化膿連鎖球菌)感染又はStaphlococcus aureus(黄色ブドウ球菌)感染であり得る。ある態様において、モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与は、局所又は皮内である。別の態様において、モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与は、筋肉内、皮下、腹腔内又は静脈内である。

0012

細胞においてグラム陽性殺菌活性を調節する化合物を同定するための方法が提供され、この方法は、トール様受容体2を発現する細胞を含有する細胞に基づくアッセイ系と試験化合物を接触させることと、トール様受容体2シグナリングを活性化するのに有効であるように選択された量でこのアッセイ系にリガンドを提供することと(トール様受容体2シグナリングは、リガンドに対する反応性シグナル化し、Scd1遺伝子発現を調節することができる。)、トール様受容体2シグナリングにおける、及びScd1遺伝子発現の調節における、試験化合物の効果を検出することと(このアッセイにおける試験化合物の有効性はグラム陽性細菌殺菌活性であることを示す。)、を含む。ある態様において、リガンドは、内因性リガンド又は外因性リガンドである。詳細な態様において、外因性リガンドは、リポ多糖類リピッドA、ジアシルリポペプチドトリアシル化リポペプチド、S−MALP−2、R−MALP−2、細菌性リポペプチド、Pam2CSK4、リポタイコ酸又はザイモサンAである。さらなる詳細な態様において、外因性リガンドはMALP−2である。さらなる詳細な態様において、外因性リガンドは、Salmonella Minnesota(サルモネラミネソタ由来ラフ型リポ多糖類、スムース型リポ多糖類又はリピッドAである。詳細な態様において、外因性リガンドは、グラム陽性細菌の成分であるが、グラム陰性細菌の成分ではない。さらなる詳細な態様において、内因性リガンドは脂質である。本化合物は例えば、トール様受容体2経路シグナリングのアゴニストであり得る。

0013

実施形態において、本方法は、細胞におけるScd1遺伝子発現又はScd1遺伝子産物の活性化を測定することをさらに含む(ここで、Scd1遺伝子発現又はScd1遺伝子産物は、外因性リガンドと細胞との接触に反応して活性化される。)検出段階を含む。

0014

さらなる実施形態において、検出段階が、化合物によるトール様受容体2へのリガンドの結合の促進を測定することをさらに含む方法が提供される。検出段階が、細胞アッセイにおいてScd1遺伝子産物の増加を測定することをさらに含む方法が提供される。検出段階が、細胞アッセイにおいてScd1遺伝子産物活性の上昇を測定することをさらに含む方法が提供される。検出段階が、細胞アッセイにおいてモノ不飽和脂肪酸合成の上昇を測定することをさらに含む方法が提供される。さらなる態様において、検出段階は、トール様受容体2に結合する標識化リガンドを測定することをさらに含む。標識化リガンドは例えば、放射性標識又は蛍光標識である。

0015

さらなる態様において、本細胞アッセイは、例えば、マクロファージ細胞又は皮脂腺由来の細胞を含み得る。皮脂腺由来の細胞はセボサイト細胞であり得る。

0016

実施形態において、本方法は、トール様受容体2をアッセイ系に提供することと、アッセイ系においてトール様受容体2シグナリングにおける試験化合物の効果(ここで、このアッセイにおける試験化合物の有効性は調節の指標である。)を検出することと、をさらに含む。

0017

実施形態において、検出段階は、化合物によるトール様受容体2へのリガンドの結合の低下をもたらすことをさらに含む。さらなる実施形態において、検出段階は、化合物によるトール様受容体2へのリガンドの結合の上昇をもたらすことをさらに含む。さらなる実施形態において、検出段階は、細胞アッセイにおいてステアロイルCoA不飽和化酵素1活性の上昇を測定することをさらに含む。さらなる実施形態において、検出段階は、細胞アッセイにおいてモノ不飽和脂肪酸合成の上昇を測定することをさらに含む。さらなる実施形態において、検出段階は、細胞アッセイにおいてグラム陽性細菌殺菌活性の上昇を測定することをさらに含む。

0018

細胞又は組織を対象から採取することと、トール様受容体2に対する内因性リガンド又は外因性リガンドと細胞又は組織を接触させることと、リガンドと接触した細胞又は組織におけるScd1遺伝子産物の産生を測定することと、哺乳動物対象におけるScd1遺伝子産物の機能低下もしくは機能喪失を検出することと、を含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染に対するリスク因子診断するための方法が提供される。細胞又は組織は、例えば、マクロファージ、セボサイト又は皮脂腺由来である。

0019

ある態様において、Scd1遺伝子産物の機能低下又は欠如がグラム陽性細菌感染に対するリスクを上昇させるような方法が提供される。別の態様において、Scd1遺伝子産物の機能低下又は欠如により、細胞におけるモノ不飽和脂肪酸の合成が低下する。さらなる態様において、Scd1遺伝子産物の機能低下又は欠如により、グラム陽性細菌感染に対する炎症反応が低下する。詳細な態様において、Scd1遺伝子産物の機能低下又は欠如により、患者における損傷部位での炎症反応が低下する。さらなる態様において、Scd1遺伝子産物の欠如により、炎症が所望の防御機構である状態に対するリスクが上昇する。リガンドは例えば、外因性リガンド、リポタイコ酸(LTA)、ジアシル化リポペプチド、トリアシル化リポペプチド、S−MALP−2、細菌性リポペプチド、ペプチドグリカンマンナン非メチル化CpG DNA、フラジェリン又は1本鎖RNAであり得る。リガンドは例えば、内因性リガンド、脂質、脂肪ステロールリポタンパク質脂肪酸酸化LDL、トロンボスポンジン又はβ−アミロイドであり得る。

0020

したがって、哺乳動物対象から得られた、細胞試料タンパク質試料又は核酸試料において、突然変異Scd1タンパク質又は突然変異Scd1タンパク質をコードする核酸の存在を調べることを含む(ここで、このようなタンパク質又は核酸の存在は、Scd1遺伝子機能喪失により誘発される疾患又はそれに対する遺伝性素因を示す。)、哺乳動物対象においてScd1遺伝子機能喪失により誘発される疾患又は遺伝性素因を診断する方法が提供される。ある態様において、Scd1遺伝子機能喪失により誘発される疾患では、グラム陽性細菌感染に対する易感染性が高まる。

0021

実施形態において、本方法は、タンパク質試料又は細胞試料を抗Scd1抗体に接触させることと、野生型又は突然変異Scd1タンパク質の存在を検出することと、をさらに含む。本方法の別の態様において、検出段階は、哺乳動物対象由来の単核食細胞又はマクロファージの蛍光活性化細胞分類FACS分析をさらに含む。別の態様において、本方法は、ハイブリダイズ条件下で突然変異Scd1遺伝子をコードする標識化DNA又はRNA分子と核酸試料を接触させることと、ハイブリダイゼーション後、標識化DNA又はRNA分子を検出することと、をさらに含み、ここで、標識化DNA又はRNAの検出は、試料中での突然変異Scd1遺伝子をコードする核酸分子の存在を示す。さらなる態様において、本方法は、認識配列が突然変異Scd1遺伝子における突然変異により影響を受ける制限酵素と核酸試料を接触させることと、制限酵素との接触後、断片の有無又は核酸断片の変化があることを検出することと、を含む(制限酵素との接触後、断片の欠如又は核酸断片の変化があることは、試料中での突然変異Scd1遺伝子をコードする核酸分子の存在を示す。)。

0022

異種の核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物(この核酸は、Scd1遺伝子の機能喪失対立遺伝子を含有し、この動物は、野生型の表現型に対して、グラム陽性細菌感染に対する易感染性を含む表現型を示す。)が提供される。トランスジェニック非ヒト動物 Scd1突然変異動物の表現型は、例えば、皮脂腺が発育不全であること又はモノ不飽和脂肪酸を合成できないことを特徴とする。トランスジェニック非ヒト動物は、Scd1遺伝子における機能喪失対立遺伝子、例えば、T227Kでのアミノ酸置換を有し得る。本トランスジェニック非ヒト動物は、例えば、マウス又はラットであり得る。ある態様において、細胞又は細胞株は、トランスジェニック非ヒト動物由来であり得る。

0023

トール様受容体2−シグナリング活性調節因子に対するスクリーニングインビトロ法が提供される(この方法は、トランスジェニック非ヒト動物由来であり得る細胞又は細胞株を試験化合物と接触させることと、細胞におけるモノ不飽和脂肪酸合成量、グラム陽性細菌感染に対する易感染性又はトール様受容体2誘導性のマクロファージ活性化活性の上昇又は低下を検出することと、それによりトール様受容体2誘導性マクロファージ活性化活性の調節因子として試験化合物を同定することと、を含む。)。トール様受容体2シグナリング活性の調節因子に対するスクリーニングのインビボ法が提供される(この方法は、トランスジェニック非ヒト動物由来であり得る細胞又は細胞株を試験化合物と接触させることと、細胞におけるモノ不飽和脂肪酸合成量、グラム陽性細菌感染に対する易感染性又はトール様受容体2誘導性のマクロファージ活性化活性の上昇又は低下を検出することと、それによりトール様受容体2誘導性マクロファージ活性化活性の調節因子として試験化合物を同定することと、を含む。)。

発明を実施するための最良の形態

0024

本発明は、全般的に、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するするための、組成物及び方法に関する。哺乳動物対象においてグラム陽性細菌皮膚感染を治療するために、組成物及び方法がさらに提供される。ステアロイルCoA不飽和化酵素1(Scd1)遺伝子発現を活性する、又はScd1遺伝子産物、ステアロイルCoA不飽和化酵素を活性化する化合物の有効量を哺乳動物対象に投与することを含む、組成物及び方法がさらに提供される。モノ不飽和脂肪酸である化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法が提供される。

0025

C57BL/6マウスのENU−誘導性の劣性生殖細胞系列突然変異であるflake(flk)は、トール様受容体2(TLR2)を活性化することにより先天性免疫反応を誘発する、Streptococcus pyogenes(化膿連鎖球菌)及びStaphylococcus aureus(黄色ブドウ球菌)、グラム陽性病原体による皮膚感染を除去する点で障害がある。ポジショナルクローニング及び配列決定により、flkがステアロイルCoA不飽和化酵素1遺伝子(Scd1)の新規対立遺伝子であることが分かった。flakeホモ接合体は、モノ不飽和脂肪酸(MUFA)パルミトレイン酸(C16:1)及びオレイン酸(C18:1)を合成することができない(これらは両者とも、グラム陽性(しかし、グラム陰性ではない)生物に対して殺菌性がある。)。S.aureus感染マウスでの皮内MUFA投与により、細菌排除が促進される。正常なマウスにおいて、Scd1(そのプロモーターにおいて非常に多くのNF−κエレメントを有する遺伝子)の転写は、TLR2シグナリングにより強力かつ特異的に誘導される。同様に、ヒトセボサイトにおいて、Scd1遺伝子は、TLR2シグナリングにより誘導される。これらの観察から、哺乳動物において、制御された、脂質に基づく抗菌エフェクター経路の存在が明らかとなり、グラム陽性細菌感染の治療又は予防に対する新しいアプローチ示唆される。

0026

「患者」、「対象」、「脊椎動物」又は「哺乳動物」は、交換可能に使用され、ヒト患者及び非ヒト霊長類ならびに、ウサギ、ラット及びマウスなどの実験動物及びその他の動物といった哺乳動物を指す。動物には、例えば、ヒツジイヌウシニワトリ両生類及び爬虫類など、哺乳動物及び非哺乳動物といった全ての脊椎動物が含まれる。

0027

「治療する」又は「治療」は、症状、合併症もしくは疾病生化学的指標の発現を予防又は遅延させる、症状を緩和する、又は疾病、状態もしくは疾患(例えば、癌又は転移性の癌)のさらなる進行を抑制もしくは阻止するための、本発明の、抗体組成物、化合物及び物質の投与を含む。治療は、予防的なもの(疾病の発現を遅延させる、又はその臨床的もしくは亜臨床的症状の発現を予防するため)、又は疾患発現後の症状の治療的抑制もしくは緩和であり得る。

0028

細胞におけるトール様受容体の「阻害因子」、「活性化因子」及び「調節因子」は、トール様受容体結合又はシグナリングに対するインビトロ及びインビボアッセイを用いて同定される、それぞれ、阻害する、活性化する、又は調節する分子、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト及びこれらのホモローグ及び摸倣体、を指すために用いられる。

0029

「調節因子」には、阻害因子及び活性化因子が含まれる。阻害因子は、例えば、トール様受容体に対して、結合する、部分的又は全体的に、刺激をブロックする、活性化を低下、防御、遅延させる、不活性化する、感度を減じる、又はトール様受容体の活性を下方制御する作用物質であり、例えばアンタゴニストである。活性化因子は、例えば、トール様受容体に対して、結合する、刺激する、増加させる、開く、活性化する、促進する、活性化を強化する、感度を上昇させる、又はトール様受容体の活性を上方制御する作用物質であり、例えばアゴニストである。調節因子には、例えば、活性化因子又は阻害因子、受容体と結合するタンパク質とのトール様受容体の相互作用を変化させる作用物質が含まれ、これには、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物多糖類もしくは上記のものの組み合わせ(例えばリポタンパク質、糖タンパク質など)が含まれる。調節因子には、一般に、天然に生じるトール様受容体リガンドの修飾体(例えば、活性が変化しているもの)、ならびに、天然に生じる、及び合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小型の化学分子などが含まれる。阻害剤及び活性化剤に対する「細胞に基づくアッセイ」には、例えば、本明細書中に記載のように、トール様受容体を発現する細胞に調節因子化合物推定されるものを適用し、次いで、トール様受容体シグナリングにおける機能的影響を調べることが含まれる。「細胞に基づくアッセイ」には、以下に限定されないが、哺乳動物対象由来のインビボの組織もしくは細胞試料又はインビトロの細胞に基づくアッセイが含まれ、このアッセイは、阻害の程度を調べるために、活性化因子、阻害因子又は調節因子候補で処理したトール様受容体を、阻害因子、活性化因子又は調節因子なしの対照と比較することを含む。対照試料(阻害因子で処理しないもの)の相対的トール様受容体活性値を100%とし得る。対照に対するトール様受容体活性値が約80%、場合によっては50%又は25から0%となる場合、トール様受容体の阻害となる。対照に対するトール様受容体活性値が110%、場合によっては150%、場合によっては200から500%又は1000%から3000%超となる場合に、トール様受容体の活性化となる。

0030

例えば、リガンドと推定されるものがアッセイプレート上で免疫接着コートされたトール様受容体分子に結合する能力によって、分子がトール様受容体に結合する能力を調べることができる。非トール様受容体への結合と比較することにより、結合の特異性を調べることができる。

0031

「試験化合物」は、Scd1又はトール様受容体2の調節因子として試験される何らかの化合物を指す。試験化合物は、何らかの小型の有機分子又はタンパク質などの生物学的存在、例えば、抗体もしくはペプチド、糖、核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAiもしくはリボザイムなど、又は脂質であり得る。あるいは、試験化合物は、Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の遺伝子操作物である調節因子であり得る。通常、試験化合物は、小型の有機分子、ペプチド、脂質又は脂質類似体である。

0032

ある実施形態において、リガンド又は受容体を固定化することの何れかにより、トール様受容体に結合する抗体をアッセイすることができる。例えば、アッセイには、Ni−活性化NTレジンビーズ上でHisタグに融合させられたトール様受容体を固定化することが含まれ得る。適切な緩衝液中で抗体を添加し、ある一定温度にてある時間、ビーズをインキュベートし得る。未結合物質を除去するために洗浄した後、例えばSDS、高pHの緩衝液などを用いて結合タンパク質解離させ、分析し得る。

0033

「シグナリング反応性」とは、トール様受容体、例えばトール様受容体2、を介したシグナリングを指す。シグナリング反応性は、例えば、トール様受容体2(TLR2)及びScd1により形成され、それを通じてシグナルが広がる、膜貫通複合体に依存しているLPS反応を指し得る。TLR2シグナルは、直接又は間接的に、MALP2誘導及びScd1発現上昇を介してシグナルを送る。例えばマクロファージ又は皮脂腺細胞においてTLR2シグナリングが生じ得る。細胞に基づくアッセイにおける測定のためにシグナルを生じさせる化合物は、例えば、酵素又は蛍光物質との共役により生じさせることができる。標識として関心のある酵素は、第一に、加水分解酵素類、特にホスファターゼエステラーゼ及びグリコシダーゼ又はオキシダーゼ類、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物には、フルオレセイン及びその誘導体ローダミン及びその誘導体、ダンシルウンベリフェロンなどが含まれる。化学発光化合物には、ルシフェリン及び2,3−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが含まれる。

0034

「トール様受容体2シグナリングにおける試験化合物の影響の検出」とは、哺乳動物対象における、疾病、疾患の症状又は疾病の副作用の、軽減、排除又は予防などの、哺乳動物対象における治療的又は予防的効果を指し得る。「トール様受容体2シグナリングにおける試験化合物の影響の検出」とは、例えば、TLR2シグナリングのMALP2刺激及びScd1遺伝子発現の上方制御により測定されるような、診断アッセイなどの細胞に基づくアッセイにおいて効果を有する化合物を指し得る。Scd1遺伝子における機能喪失突然変異、例えばflake突然変異は、Streptococcus pyogenes(化膿連鎖球菌)及びStaphylococcus aureus(黄色ブドウ球菌)、トール様受容体2を活性化することにより先天性免疫反応を誘発するグラム陽性病原体による皮膚感染の除去に障害がある。flakeホモ接合体は、モノ不飽和脂肪酸(MUFA)パルミトレイン酸(C16:1)及びオレイン酸(C18:1)を合成することができない(これらは両者とも、グラム陽性(しかし、グラム陰性ではない)生物に対して殺菌性がある。)。S.aureus感染マウスでの皮内MUFA投与により、細菌排除が促進される。

0035

本発明が特定の方法、試薬、化合物、組成物又は生物学的系に限定されず、言うまでもなく、これらが様々であり得ることを理解されたい。また、本明細書中で使用される用語が特定の実施形態のみを説明する目的のものであり、限定するものではないことも理解されたい。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の、「a」、「an」及び「the」には、内容によって他に明白に指示されない限り、複数形の意味が含まれる。したがって、例えば、「細胞(a cell)」に対する意味には、2以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。

0036

「約」という用語は、本明細書中で使用される場合、量、時間などの測定できる値を指すとき、変動が開示される方法を実施するのに適切であるように、具体的な値から、±20%又は±10%、より好ましくは±5%、さらにより好ましくは±1%及びさらにより好ましくは±0.1%の変動を包含するものとする。

0037

他に定められない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の試験に対する実施において本明細書中で述べられるものと同様又は同等であるあらゆる方法及び材料を使用することができるが、好ましい材料及び方法を本明細書中で述べる。本発明を説明し、主張することにおいて、次の技術用語を使用する。

0038

SCD1遺伝子発現又はSCD1遺伝子産物又はトール様受容体2の調節因子としての抗体
本明細書中で具体的に述べられる抗体及びその抗原結合断片は、トール様受容体2(TLR2)と特異的に結合する、及び/又は活性化するか、又はScd1遺伝子発現もしくはScd1遺伝子産物と特異的に結合するか、及び/又は活性化し、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染に対する先天性免疫反応を調節又は活性化し得る。

0039

TLR2に結合する抗体又はScd1遺伝子産物に結合する抗体は、トール様受容体2経路を介した細胞におけるシグナリングを調節する化合物として有用である。例えば、Takeda及びAkira、Cell Microbiol 5:143−153、2003を参照のこと。

0040

あるいくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ハイブリドーマ細胞株により産生される抗体が選択的に結合する抗原に選択的に結合する(例えば、競合的結合又は同じエピトープへの結合、例えば立体構造又は線状エピトープ)。このように、エピトープは、抗体が結合する既知のエピトープに対して、空間的に近接近している、又は機能的に関連している、例えば、直線的配列もしくは立体配置空間において、重複又は隣接するエピトープであり得る。ペプチドスレッディングプログラムを使用して、コンピュータを用いて可能なエピトープを同定し、例えばトール様受容体2もしくはScd1遺伝子産物の、突然変異体又は断片(例えば、トール様受容体2もしくはScd1遺伝子産物のドメインの、突然変異体又は断片)への抗体の結合をアッセイすることによってなど、当技術分野で公知の方法を用いて確認することができる。

0041

本明細書中に記載の抗体の配列を決定する方法は当技術分野で公知であり、例えば、ハイブリドーマ細胞株から抗体をコードするcDNAを単離し同定するために、公知の技術を使用することにより抗体の配列を決定することができる。cDNAの配列を決定するための方法は当技術分野で公知である。

0042

本明細書中に記載の抗体は通常、少なくとも1又は2個の重鎖可変領域(VH)及び少なくとも1又は2個の軽鎖可変領域(VL)を有する。VH及びVL領域は、さらに、超可変性の領域、いわゆる相補性決定領域(CDR)に分けることができ、これらには、より保存性が高いフレームワーク領域(FR)が散在する。これらの領域は詳細に定義されている(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91−3242,1991及びChothiaら、J.Mol.Biol.196:901−917、1987を参照。)。1以上のフレームワーク領域を含有する抗体又は抗体断片もまた本発明において有用である。このような断片は、リポ多糖類により誘発されているトール様受容体2のドメインに特異的に結合する、及び、リポ多糖類により誘導されている細胞においてScd1遺伝子産物活性を調節又は活性化する、又はグラム陽性細菌に対する先天性免疫反応を調節もしくは活性化する能力を有する。

0043

本明細書中に記載の抗体は、重鎖及び/又は軽鎖定常領域を含み得(定常領域は通常、抗体と宿主組織又は因子との間の結合に介在し、免疫系のエフェクター細胞及び古典的な補体系補体第一成分(C1q)を含む。)、したがって、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖をそれぞれ形成することができる。例えば、抗体は四量体であり得る(2個の免疫グロブリン重鎖及び2個の免疫グロブリン軽鎖であり、これらは例えばジスルフィド結合により結合され得る。)。抗体は、重鎖定常領域の一部(例えば、CH1、CH2及びCH3と呼ばれる3個の重鎖ドメインのうち1個)、又は軽鎖定常領域の一部(例えば、CLと呼ばれる領域の一部)のみを含有し得る。

0044

抗原−結合断片もまた本発明に含まれる。このような断片は、(i)Fab断片(すなわち、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる1価断片);(ii)F(ab’)2断片(すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結されている2個のFab断片を含有する2価の断片);(iii)VH及びCH1ドメインからなるFd断片;(iv)抗体のシングルアームのVL及びVHドメインからなるFv断片、(v)dAb断片(Wardら、Nature 341:544−546、1989)(これは、VHドメインからなる。)及び/又は(vi)単離された相補性決定領域(CDR)であり得る。

0045

自動ペプチド合成機器において、又は、全長遺伝子もしくは遺伝子断片の発現によってなど、当技術分野で公知の方法を用いて、抗体の断片(上述のような抗原結合断片を含む。)を合成することができ、例えば、抗体分子ペプシン消化により、Scd1遺伝子産物F(ab’)2断片を生成させることができ、Fab断片は、F(ab’)2断片のジスルフィド架橋を減少させることにより生成させることができる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片を比較的速く同定できるように、Fab発現ライブラリを構成することができる(Huseら、Science 246:1275−81、1989)。

0046

その他の抗体及び抗体断片を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、Fv断片の2個のドメイン、VL及びVHは別個の遺伝子によりコードされているが、組み換え法又は、VL及びVH領域が1価分子(1本鎖Fv(scFv)として知られている。)を形成するためにペアとなる単一のタンパク質鎖としてこれらが生成されることを可能にする合成リンカーを用いて、これらを連結することができる;例えばBirdら、Science 242:423−426、1988;Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883、1988;Colcherら、Ann.NY Acad.Sci.880:263−80、1999;及びReiter、Clin.Cancer Res.2:245−52、1996を参照のこと。

0047

1本鎖抗体を作製するための技術もまた、米国特許第4,946,778号及び同第4,704,692号に記載されている。このような1本鎖抗体は、抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含される。当業者にとって公知の従来技術を用いてこれらの抗体断片を得て、インタクトな抗体をスクリーニングするのと同様にして、有用性についてこれらの断片をスクリーニングする。さらに、1本鎖抗体は、複合体又は多量体を形成することができ、それにより、同じ標的タンパク質の異なるエピトープに対して特異性を有する多価抗体となる。

0048

本明細書中に記載の抗体及びその一部は、モノクローナル抗体であり得、モノクローナル抗体から作製するか、又は当技術分野で公知の合成法により作製し得る。抗体を組み換え法により作製することができる(例えば、ファージディスプレイにより作製する、又は例えば、米国特許第5,223,409号;WO92/18619;WO91/17271;WO92/20791;WO92/15679;WO93/01288;WO92/01047;WO92/09690;WO90/02809;Fuchsら、Bio/Technology 9:1370−1372、1991;Hayら、Human Antibody Hybridomas 3:81−85、1992;Huseら、Science 246:1275−1281、1989;Griffithsら、EMBO J.12:725−734、1993;Hawkinsら、J.Mol.Biol.226:889−896、1992;Clacksonら、Nature 352:624−628、1991;Gramら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3576−3580、1992;Garradら、Bio/Technology 9:1373−1377、1991;Hoogenboomら、Nucl.AcidsRes.19:4133−4137、1991;及びBarbasら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978−7982、1991に記載のコンビナトリアル法による。)。

0049

一例として、TLR2ポリペプチド又はScd1ポリペプチドもしくは断片を用いて(例えば、TLR24もしくはそのScd1遺伝子産物由来の抗原性ペプチド断片(すなわち、その一部の配列を有する。))又はTLR2抗原もしくはScd1抗原もしくはそれらの抗原性断片を発現する細胞を用いて、動物に対して免疫付与することにより、トール様受容体2に対する抗体又はScd1遺伝子産物に対する抗体を作製することができる。ある実施形態において、本明細書中に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片は、精製されたTLR2又はScd1遺伝子産物に結合することができる。ある実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、組織切片、全細胞(生きている細胞、細胞溶解又は分画化したもの)又は膜分画において、TLR2又はScd1遺伝子産物と結合することができる。マクロファージのMALP−2活性化によりScd1遺伝子発現又はScd1タンパク質活性の調節、活性化又は阻害を測定するなど、例えばインビトロ系において、抗体を試験することができる。

0050

TLR2又はScd1遺伝子産物由来の抗原性ペプチドを使用する場合、これには通常、TLR2又はScd1遺伝子産物のドメインの少なくとも8(例えば10、15、20、30、50、100以上)の連続するアミノ酸残基が含まれる。ある実施形態において、抗原性ペプチドは、TLR2又はScd1遺伝子産物のドメイン全てを含む。生成された抗体は、ネイティブ型で(すなわち、直線又は立体構造エピトープを有する抗体は本発明内である。)、変性もしくは非ネイティブ型で、又は両方で、タンパク質のうち1つに特異的に結合し得る。例えば、コンピュータを利用した抗原性予想アルゴリズムによるものなど、当技術分野で公知の方法により、抗原性である可能性が高いペプチドを同定することができる。変性型ではなくそのネイティブ型でタンパク質に結合する抗体を同定することにより、立体構造エピトープを同定することができる場合もある。

0051

場合によっては担体(すなわち、会合分子の免疫原性を安定化又は向上させる物質)に連結されている抗原を用いて、宿主動物(例えば、ウサギ、マウス、モルモット又はラット)に免疫付与することができ、場合によっては、アジュバントとともに投与できる(例えば、Ausbelら、前出を参照。)。典型的な担体は、キーホールリンペットへモシアニン(KLH)及び典型的なアジュバントであり、これらは通常、フロイントアジュバント(完全又は不完全)、アジュバントミネラルゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性物質リソレシチンなど)、プルロニックポリオールポリアニオン、ペプチド、油乳剤ジニトロフェノールBCG(bacille Calmette−Guerin)及びCorynebacterium parvumなどを含め、宿主動物の種から選択される。KLHはまた、アジュバントと呼ばれる場合もある。例えば、アフィニティークロマトグラフィー法(ポリペプチド抗原又はその断片がレジン上に固定化されている。)により、宿主において産生された抗体を精製することができる。

0052

抗原性ペプチドにより包含されるエピトープは通常、タンパク質の表面上(例えば親水性領域)又は抗原性の高い領域(このような領域は、電荷を有する多くの残基を含有することに基づいて主に選択することができる。)に位置する。タンパク質の表面に局在する可能性が特に高い領域を示すために、ヒトタンパク質配列のEmini表面確率分析を使用することができる。

0053

抗体は完全ヒト抗体であり得る(例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子(カッパラムダアルファIgA1及びIgA2)、ガンマIgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、デルタイプシロン及びミュー定常領域遺伝子又は無数免疫グロブリン可変領域遺伝子のものなど、ヒト免疫グロブリン配列から抗体を産生するように遺伝子操作されているマウス又はその他の哺乳動物において作製された抗体)。あるいは、抗体は非ヒト抗体であり得る(例えば、げっ歯類(例えば、マウス又はラット)、ヤギ、ウサギ又は非ヒト霊長類(例えばサル)抗体)。

0054

マウスではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を担うトランスジェニックマウスにおいてヒトモノクローナル抗体を生成させることができる。ヒトタンパク質由来のエピトープに対する特異的親和性を有するヒトmAbを分泌するハイブリドーマを作製するために、これらのマウスから得た脾臓細胞(関心のある抗原で免疫付与した後)を使用することができる(例えば、WO91/00906、WO91/10741;WO92/03918;WO92/03917;Lonbergら、Nature 368:856−859、1994;Greenら、Nature Genet.7:13−21、1994;Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851−6855、1994;Bruggemanら、Immunol.7:33−40、1993;Tuaillonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720−3724、1993;及びBruggemanら、Eur.J.Immunol.21:1323−1326、1991を参照。)。

0055

抗−TLR2抗体又は抗−Scd1抗体はまた、可変領域又はその一部(例えばCDR)が非ヒト生物(例えばラット又はマウス)において産生されるものでもあり得る。したがって、本発明は、キメラ、CDR−移植ヒト化抗体及び、非ヒト生物において産生され、次いで、ヒトにおいて抗原性を低下させるために(例えば、可変フレームワーク又は定常領域において)修飾された抗体を包含する。当技術分野で公知の組み換え技術により、キメラ抗体(すなわち、異なる部分が異なる動物種由来である抗体(例えば、マウスmAbの可変領域及びヒト免疫グロブリンの定常領域)を作製することができる。例えば、マウスのFcをコードする領域を除去するためにマウス(又はその他の種)モノクローナル抗体分子のFc定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で消化することができ、ヒトFc定常領域をコードする遺伝子の同等部分でそれを置換することができる(例えば、欧州特許出願第125,023号;同第184,187号;同第171,496号;及び同第173,494号を参照;またWO86/01533;米国特許第4,816,567号;Betterら、Science 240:1041−1043、1988;Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439−3443、1987;Liuら、J.Immunol.139:3521−3526、1987;Sunら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214−218、1987;Nishimuraら、Cancer Res.47:999−1005、1987;Woodら、Nature 314:446−449、1985;Shawら、J.Natl.Cancer Inst.80:1553−1559、1988;Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851、1984;Neubergerら、Nature 312:604、1984;及びTakedaら、Nature 314:452、1984も参照のこと。)
ヒト化又はCDR移植抗体において、(免疫グロブリン重又は軽鎖の)レシピエントCDRの少なくとも1又は2個、通常は3個全てがドナーCDRで置き換えられる(例えば、米国特許第5,225,539号;Jonesら、Nature 321:552−525、1986;Verhoeyanら、Science 239:1534、1988;及びBeidlerら、J.Immunol.141:4053−4060、1988を参照。)。トール様受容体2、Scd1遺伝子又はScd1遺伝子産物に対するヒト化抗体の結合に必要なCDR数のみ置き換える必要がある。ドナーはげ歯類抗体であり得、レシピエントはヒトフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークであり得る。通常、CDRを提供する免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ(げっ歯類のものであることが多い。)、フレームワークを提供する免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。アクセプターフレームワークは、天然に生じる(例えばヒト)フレームワーク、コンセンサスフレームワークもしくは配列又は少なくともそれと85%(例えば、90%、95%、99%)同じである配列であり得る。「コンセンサス配列」は、関連のある配列のファミリーにおいて最も高頻度に起こるアミノ酸(又はヌクレオチド)から形成されるものである(例えば、Winnaker、Genes to Clones、Verlagsgesellschaft、Weinheim、Germany、1987を参照。)。コンセンサス配列における各位置には、そのファミリーのその位置において最も高頻度で起こるアミノ酸残基が来る(2種類のものが同じ頻度で起こる場合、何れも含まれ得る。)。「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域を指す。特定のアミノ酸残基が置換されているか、欠失しているか、又は付加されている(例えば抗原結合を促進するためにフレームワーク領域において。)、トール様受容体2、Scd1遺伝子又はScd1遺伝子産物に対するヒト化抗体を作製することができる。例えば、ヒト化抗体は、ドナーのものと同一の、又はレシピエントのフレームワーク残基のもの以外のアミノ酸レセプターと同一のフレームワーク残基を有する。このような抗体を作製するために、ヒト化免疫グロブリン鎖の選択された少数のアクセプターフレームワーク残基を対応するドナーアミノ酸により置換する。CDRに隣接して、又はCDRと相互作用する領域で置換が行われ得る(米国特許第5,585,089号、特にカラム12−16を参照。)。ヒト化抗体のためのその他の技術は、EP519596A1に記載されている。

0056

上述のようにして、又は当技術分野で公知のその他の方法を用いて、トール様受容体2に対する抗体又はScd1遺伝子産物に対する抗体をヒト化することができる。例えば、抗原結合に直接関与しないFv可変領域の配列をヒトFv可変領域由来の相当する配列で置換することにより、ヒト化抗体を作製することができる。ヒト化抗体を作製するための一般的な方法は、Morrison、Science 229:1202−1207、1985;Oiら、BioTechniques 4:214、1986及びQueenら(米国特許第5,585,089号;同第5,693,761号及び同第5,693,762号)で与えられている。MALP−2活性化によるマクロファージにおけるScd1遺伝子発現又はScd1タンパク質活性の調節、活性化又は阻害を測定する能力など、所望の機能を有するTLR2もしくはScd1又はそれらの断片に対する抗体を産生するハイブリドーマから、これらの方法で必要とされる核酸配列を得ることができる。次いで、ヒト化抗体又はその断片をコードする組み換えDNAを適切な発現ベクターへとクローニングすることができる。

0057

ある一定の実施形態において、本抗体は、エフェクター機能を有し、補体結合することができるが、一方、その他においては、エフェクター細胞を補充することも補体結合もできない。本抗体はまた、Fc受容体結合能が殆ど又は全くない可能性もある。例えば、これは、アイソタイプもしくはサブタイプ又は断片又はFc受容体に結合できないその他の突然変異体であり得る(例えば、本抗体は、突然変異(例えば欠失)Fc受容体結合領域を有し得る。)。Fc領域欠く抗体は通常、補体結合できず、したがって、それらが結合する細胞の細胞死の原因である可能性はより少ない。

0058

その他の実施形態において、治療薬(例えば、抗生物質)又は検出可能な標識などの異種物質に抗体をカップリングさせ得る。検出可能な標識には、酵素(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼアルカリホスファターゼβ−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼ)、補欠分子族(例えば、ストレプトアビジンビオチン及びアビジン/ビオチン)又は蛍光発光生物発光又は放射活性物質(例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド又はフィコエリスリン(これらは蛍光である。)、ルミノール(これは発光である。)、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリン(これらは生物発光である。)及び99mTc、188Re、111In、125I、131I、35S又は3H(これらは放射活性である。)。)が含まれ得る。

0059

トール様受容体2又はScd1タンパク質又はこれらの断片(マクロファージのMALP−2活性化による、Scd1遺伝子発現又はScd1タンパク質活性の、調節、活性化又は阻害に関連する断片など)を(例えば、アフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降により)単離するために、又は例えば細胞溶解液もしくは上清中で(例えばウエスタンブロッティング、酵素免疫吸着測定法ELISA)、放射性免疫アッセイなどによる。)又は組織切片において、それらを検出するために、本明細書中に記載の抗体(例えば、モノクローナル抗体)を使用することもできる。これらの方法により、特定のタンパク質の発現量及びパターンを調べることが可能となる。診断を行う、又は臨床試験もしくは治療の効果を評価することにおいて、この情報は有用であり得る。

0060

本発明はまた、上述の抗体をコードする核酸及びベクター及びこれらを含有する細胞(例えば、CHO細胞又はリンパ細胞などの哺乳動物細胞)(例えば、トール様受容体2又はScd1タンパク質に特異的に結合する抗体をコードする核酸で形質転換された細胞)も含む。同様に、本発明は、本発明の抗体を産生する細胞株(例えばハイブリドーマ)及びこれらの細胞株を作製する方法を含む。

0061

Scd1ポリペプチド又はトール様受容体2ポリペプチド及びこれらの調節因子の免疫学的検出
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いたScd1遺伝子又はトール様受容体2遺伝子及び遺伝子発現の検出に加えて、Scd1又はトール様受容体2タンパク質を検出するために免疫アッセイを使用することもできる。このようなアッセイは、Scd1又はトール様受容体2の調節因子に対するスクリーニングのために、ならびに治療及び診断適用のために有用である。Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質を定性的又は定量的に分析するために、免疫アッセイを使用することができる。適用可能技術の総括は、Harlow & Lane、Antibodies:A Laboratory Manual、1988で見出すことができる。

0062

A.抗体の作製
Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質と特異的に反応するポリクローナル及びモノクローナル抗体を作製する方法は、当業者にとって公知である(例えば、Coligan、Current Protocols in Immunology、1991;Harlow & Lane、前出;Goding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、第2版、1986;及びKohlerら、Nature 256:495−497、1975を参照。)。このような技術には、ファージ又は同様のベクターにおける組み換え抗体ライブラリからの抗体の選択による抗体調製、ならびにウサギ又はマウスへの免疫付与によるポリクローナル及びモノクローナル抗体の調製が含まれる(例えば、Huseら、Science 246:1275−1281、1989;Wardら、Nature 341:544−546、1989を参照。)。

0063

Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質と特異的に反応する抗体を作製するために、Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の一部を含有する多くの免疫原を使用することができる。例えば、組み換えScd1タンパク質もしくはトール様受容体2タンパク質又はこれらの抗原性断片を本明細書中に記載のように単離することができる。上述のように真核又は原核細胞において、組み換えタンパク質を発現させ、上記で全般的に述べたように精製することができる。モノクローナル又はポリクローナル抗体の作製に対して、組み換えタンパク質は好ましい免疫原である。あるいは、本明細書中で開示された配列由来で担体タンパク質に共役された合成ペプチドを免疫原として使用できる。純粋な形態又は混合形態で、天然に生じたタンパク質もまた使用することができる。次に、抗体産生可能な動物に生成物注入する。タンパク質を測定するための免疫アッセイにおいてその後使用するために、モノクローナル又はポリクローナル抗体の何れかを作製することができる。

0064

ポリクローナル抗体の作製法は当業者にとって公知である。フロイントアジュバントなどの標準的アジュバント及び標準的な免疫付与プロトコールを使用し、タンパク質により近交系マウス(例えばBALB/Cマウス)又はウサギに対して免疫付与する。試験採血を行い、βサブユニットに対する反応性のタイターを調べることにより、免疫原調製物に対する動物の免疫反応監視する。免疫原に対する抗体のタイターが適切に高くなったら、動物から採血し、抗血清を調製する。必要に応じて、タンパク質に対して反応性のある抗体を濃縮するために、抗血清をさらに分画化することができる(Harlow & Lane、前出を参照。)。

0065

当業者によく知られている様々な技術により、モノクローナル抗体を得ることができる。簡潔に述べると、通常は骨髄腫細胞との融合によって、所望の抗原により免疫付与した動物由来の脾臓細胞を不死化する(Kohlerら、Eur.J.Immunol.6:511−519、1976参照。)。他の不死化の方法には、Epstein Barr Virus(エプスタイン・バーウイルス)、癌遺伝子又はレトロウイルスでの形質転換又は当技術分野で周知のその他の方法が含まれる。抗原に対する所望の特異性及び親和性の抗体の産生について、1個の不死化細胞から生じたコロニーをスクリーニングし、脊椎動物宿主の腹腔への注入を含む様々な技術により、このような細胞により産生されたモノクローナル抗体の収率を向上させることができる。あるいは、Huseら、Science 246:1275−1281、1989により概略が述べられている一般的プロトコールに従い、ヒトB細胞からのDNAライブラリをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体又はその結合断片をコードするDNA配列を単離することができる。

0066

モノクローナル抗体及びポリクローナル血清回収し、例えば固体支持体上に固定化された免疫原を用いた固相免疫アッセイなど、免疫アッセイにおいて免疫原タンパク質に対してタイターを調べる。通常、104以上のタイターを有するポリクローナル抗血清を選択し、競合結合免疫アッセイを用いて、非Scd1又はトール様受容体2タンパク質に対するその交差反応性について試験する。特異的ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体は一般に、少なくとも約0.1mM、より一般的には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μM又はそれより良い、最も好ましくは0.01μM又はそれより良いKdで結合する。非ヒト哺乳動物などの種から他の交差反応オルソログを減ずることにより、ヒトScd1タンパク質又はヒトトール様受容体2など、特定のScd1オルソログ又はトール様受容体2オルソログに対してのみ特異的な抗体を作製することもできる。このようにして、Scd1又はトール様受容体2に対してのみ結合する抗体を得ることができる。

0067

Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質に対する特異的抗体入手可能となったら、様々な免疫アッセイ法によりタンパク質を検出することができる。さらに、Scd1遺伝子産物又はトール様受容体2の調節因子として治療的に抗体を使用することができる。免疫学的手法及び免疫アッセイ手法の概説に関しては、Basic and Clinical Immunology(Stites & Terr編、第7版、1991)を参照のこと。さらに、いくつかの形態の何れかにおいて本発明の免疫アッセイを行うことができる(これらは、Enzyme Immunoassay(Maggio編、1980);及びHarlow & Lane、前出で幅広く概説されている。)。

0068

B.免疫学的結合アッセイ
よく認識されている多くの免疫学的結合アッセイの何れかを用いて、Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質を検出、及び/又は定量することができる(例えば、米国特許第4,366,241号;同第4,376,110号;同第4,517,288号;及び同第4,837,168号を参照。)。一般的免疫アッセイの概説に関して、Methodsin Cell Biology:Antibodies in Cell Biology、volume37(Asai編、1993);Basic and Clinical Immunology(Stites & Terr編、第7版 1991)も参照のこと。免疫学的結合アッセイ(又は免疫アッセイ)は通常、選択したタンパク質又は抗原(この場合、Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質又はこれらの抗原性部分)に特異的に結合する抗体を使用する。当業者にとって周知である、及び上述のような多くの手法の何れかにより、抗体(例えば、抗Scd1遺伝子産物又は抗トール様受容体2)を作製することができる。

0069

免疫アッセイではまた、抗体及び抗原により形成された複合体に特異的に結合するために、及びその複合体を標識するために、標識物質を使用することも多い。標識物質そのものは、抗体/抗原複合体を含む部分の1つであり得る。したがって、標識物質は、標識されたScd1遺伝子産物又は標識されたトール様受容体2であり得る。あるいは、標識物質は、抗体/Scd1遺伝子産物又は抗体/トール様受容体2複合体に特異的に結合する、二次抗体などの、第三の部分であり得る(二次抗体は通常、一次抗体が由来する種の抗体に特異的である。)。プロテインA又はプロテインGなど、免疫グロブリン定常領域に特異的に結合することができるその他のタンパク質を標識物質として使用することもできる。これらのタンパク質は、様々な種由来の免疫グロブリン定常領域と強い非免疫性反応性を示す(例えば、Kronvalら、J.Immunol.111:1401−1406、1973;Akerstromら、J.Immunol.135:2589−2542、1985)。ビオチン(ストレプトアビジンなどの別の分子がこれに対して特異的に結合できる。)などの検出可能部分で、標識物質を修飾することができる。様々な検出可能部分が当業者にとって周知である。

0070

アッセイを通じて、試薬の各組み合わせ後、インキュベート及び/又は洗浄段階が必要であり得る。インキュベート段階は約5秒から数時間、場合によっては約5分から約24時間まで、様々であり得る。しかし、インキュベート時間は、アッセイ形式、抗原、溶液量、濃度などに依存する。通常、周囲温度にてアッセイを行うが、10℃から40℃などの温度範囲にわたりアッセイを行うことができる。

0071

非競合アッセイ形式:試料中のScd1遺伝子産物又はトール様受容体2を検出するための免疫アッセイは、競合的又は非競合的の何れかであり得る。非競合的免疫アッセイは、抗原量を直接測定するアッセイである。ある好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、例えば、抗Scd1遺伝子産物又は抗トール様受容体2抗体を固定化する固体基板にこれらを直接結合させ得る。次に、これらの固定化抗体が、試験試料中に存在するScd1遺伝子産物又はトール様受容体2を捕捉する。次に、Scd1遺伝子産物に対する二次抗体または標識を担うトール様受容体2に対する抗体などの標識物質により、このように固定化されたScd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質を結合させる。あるいは、二次抗体は標識を欠き得るが、代わって、二次抗体が由来する種の抗体に特異的な標識された三次抗体を結合させることができる。検出可能部分を与えるために、二次又は三次抗体は通常、ビオチン(例えばストレプトアビジンなどの別の分子がこれに対して特異的に結合できる。)などの検出可能部分で修飾することができる。

0072

競合的アッセイ形式:競合的アッセイにおいて、試料中に存在する未知のScd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質により抗Scd1タンパク質又は抗トール様受容体2抗体から置き換えられた(競合し排除された)、既知の添加した(外来性の)Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の量を測定することにより、試料中に存在するScd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の量を間接的に測定する。ある競合的アッセイにおいて、Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の既知量を試料に添加し、次に、Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質に特異的に結合する抗体とその試料を接触させる。抗体に結合した外来性のScd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の量は、試料中に存在するScd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の濃度に反比例する。特に好ましい実施形態において、抗体を固体基板に固定化する。Scd1タンパク質/抗体複合体又はトール様受容体2タンパク質/抗体複合体中に存在するScd1遺伝子産物又はトール様受容体2の量を測定するか、あるいは、残存する非複合体化タンパク質の量を測定するかの何れかにより、抗体に結合するScd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の量を測定することができる。標識されたScd1タンパク質分子又はトール様受容体2分子を与えることにより、Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の量を検出することができる。

0073

ハプテン阻害アッセイは別の好ましい競合的アッセイである。このアッセイにおいて、既知のScd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質を固体基板に固定化する。抗Scd1抗体又は抗トール様受容体2抗体の既知量を試料に添加し、次にこの試料を固定化したScd1遺伝子産物又はトール様受容体2と接触させる。既知の固定化Scd1遺伝子産物又はトール様受容体2と結合した抗Scd1抗体又は抗トール様受容体2抗体の量は、試料中に存在するScd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の量と反比例する。同じく、抗体の固定化断片又は溶液中に残存する抗体の断片の何れかを検出することにより、固定化抗体の量を検出することができる。検出は、抗体が標識されている場合、直接的であり得、又は、上述のように、抗体に特異的に結合する標識部分を次いで添加することによる間接的なものであり得る。

0074

交差反応性の決定:交差反応性を調べるために、競合的結合形式での免疫アッセイを使用することもできる。例えば、固体支持体にScd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質を固定化することができる。固定化抗原への抗血清の結合に競合するアッセイに、タンパク質(例えば、Scd1遺伝子産物又はトール様受容体2及びホモローグ)を添加する。添加したタンパク質が固定化タンパク質への抗血清の結合に対して競合する能力を、Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質がそれ自身と競合する能力と比較する。標準的計算を用いて、上記タンパク質に対する%交差反応性を計算する。上記で挙げた添加タンパク質のそれぞれとの交差反応性が10%未満である抗血清を選択し、プールする。交差反応抗体は、場合によっては、添加した考慮されるタンパク質、例えば遠縁のホモローグなど、を用いた免疫吸着により、プールした抗血清から除く

0075

次に、おそらくScd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の対立遺伝子もしくは多型変異体であると考えられる第二のタンパク質を免疫原タンパク質と比較するために、上述のような競合的結合免疫アッセイにおいて、免疫吸着を行い、プールした抗血清を使用する。この比較を行うために、各タンパク質の広い範囲の濃度で2種類のタンパク質をそれぞれアッセイし、固定化タンパク質に対する抗血清の結合の50%を阻害するのに必要な各タンパク質の量を決定する。結合の50%を阻害するのに必要とされる第二のタンパク質の量が、結合の50%を阻害するのに必要とされるScd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の量の10倍未満である場合、第二のタンパク質は、Scd1遺伝子産物又はトール様受容体2免疫原に対して生成されたポリクローナル抗体に特異的に結合すると言われる。

0076

その他のアッセイ形式:試料中のScd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の存在を検出及び定量するために、ウエスタンブロットイムノブロット)分析を使用する。この技術には、通常、分子量に基づきゲル電気泳動により試料タンパク質を分離することと、分離したタンパク質を適切な固体支持体(ニトロセルロース膜ナイロン膜又は誘導化ナイロン膜など)に転写することと、Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質に特異的に結合する抗体と試料をインキュベートすることと、が含まれる。抗Scd1タンパク質抗体又は抗トール様受容体2抗体は、固体支持体上でScd1遺伝子産物又はトール様受容体2と特異的に結合する。これらの抗体を直接標識するか、あるいは、抗Scd1タンパク質抗体又は抗トール様受容体2抗体に特異的に結合する標識化抗体(例えば、標識されたヒツジ抗マウス抗体)を用いてその後に検出することができる。

0077

その他のアッセイ形式には、リポソーム免疫アッセイ(LIA)が含まれるが、これは、特異的な分子(例えば抗体)に結合するように設計したリポソームを使用し、封入された試薬又はマーカーを放出させる。次いで、標準的技術に従い、放出された化学物質を検出する(Monroeら、Amer.Clin.Prod.Rev.5:34−41、1986)。

0078

非特異的結合の低下:当業者にとって当然のことながら、免疫アッセイにおいて非特異的結合を最低限に抑えることが必要とされることが多い。特に、アッセイが固体基板に固定化された抗原又は抗体を含む場合、基板に対する非特異的結合の量を最低限に抑えることが望ましい。このような非特異的結合を低下させる手段は当業者にとって周知である。通常、この技術には、タンパク性組成物で基板を被覆することが含まれる。特に、ウシ血清アルブミンBSA)、脱脂粉乳及びゼラチンなどのタンパク質組成物が広く使用されるが、粉末乳が最も好ましい。

0079

標識:アッセイで使用される特定の標識又は検出可能な基は、それがアッセイで使用される抗体の特異的結合を顕著に妨害しない限り、本発明の重大な態様ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的又は化学的特性を有する何らかの物質であり得る。このような検出可能な標識は、免疫アッセイの分野でよく開発されており、一般に、このような方法において有用である殆どのあらゆる標識を本発明に適用することができる。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的電気的、光学的又は化学的手段により検出可能な何らかの組成物である。本発明における有用な標識には、磁気ビーズ(例えばDYNABEADSTM)、蛍光色素(例えば蛍光イソチオシアネートテキサスレッド、ローダミンなど)、放射性標識(例えば、3H、125I、35S、14C又は32P)、酵素(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びELISAで一般に使用されるその他のもの)、化学発光標識及び金コロイドなど発色標識又は色ガラス又はプラスチックビーズ(例えばポリスチレンポリプロピレンラテックスなど)が含まれる。

0080

当技術分野で周知の方法に従い、アッセイの所望の成分と標識を直接又は間接的にカップリングさせることができる。上記で示されているように、広く様々な標識を使用することができ、必要とされる感度、化合物との共役の容易さ、安定性の条件、利用可能な機器及び処分の条件に依存して標識を選択する。

0081

放射活性標識は、間接的手段により連結されることが多い。一般に、リガンド分子(例えばビオチン)は、分子と共有結合する。次に、リガンドが別の分子(例えばストレプトアビジン)と結合するが、これは、本質的に検出可能であるか、又はシグナル系と共有結合するか(検出可能な酵素、蛍光化合物又は化学発光化合物など)、の何れかである。Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質を認識する抗体又は、抗Scd1タンパク質抗体もしくは抗トール様受容体2抗体を認識する二次抗体との何らかの適切な組み合わせでリガンド及びその標的を使用することができる。

0082

例えば酵素又は蛍光色素分子と共役させることにより、シグナルを生じさせる化合物にに分子を直接共役させることもできる。標識として関心のある酵素は、主に、加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、又はオキシダーゼ、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物には、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化学発光化合物には、ルシフェリン及び2,3−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが含まれる。使用することができる様々な標識又はシグナルを生じさせる系の概説として、米国特許第4,391,904号を参照のこと。

0083

標識を検出する手段は当業者にとって周知である。したがって、例えば、標識が放射活性標識である場合、検出のための手段には、シンチレーションカウンタ又はオートラジオグラフィーにおけるような写真用フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合、光の適切な波長で蛍光色素を励起し、結果として生じる蛍光を検出することにより、これを検出することができる。電荷結合素子(CCD)又は光電子増倍管などの電気的検出器を使用することにより、視覚的に蛍光を検出することができる。同様に、酵素に対して適切な基質を与え、結果として生じる反応産物を検出することにより、酵素的標識を検出することができる。最後に、単純に標識に付随する色を観察することにより、単純な発色標識を検出することができる。したがって、様々な計量スティックアッセイにおいて、共役した金はピンク見えることが多く、一方で、様々な共役ビーズはビーズの色に見える。

0084

あるアッセイ形式では、標識した成分を使用する必要がない。例えば、標識抗体の存在を検出するために、凝集アッセイを使用することができる。この場合、標識抗体を含有する試料によって、抗原被覆された粒子が凝集する。この形式において、成分を標識する必要がなく、単純な目視によって標識抗体の存在を検出する。

0085

Scd1遺伝子産物又はトール様受容体2の調節因子に対するハイスループットアッセイ
Scd1遺伝子産物又はトール様受容体2の調節因子として試験される化合物は、何らかの小型の有機分子又はタンパク質などの生物学的存在、例えば抗体もしくはペプチド、糖、核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAiもしくはリボザイム又は脂質であり得る。あるいは、調節因子は、Scd1タンパク質又はトール様受容体2タンパク質の遺伝子的に変更を加えられたものであり得る。通常、試験化合物は、小型の有機分子、ペプチド、脂質及び脂質類似体である。

0086

基本的に、本発明のアッセイにおいて、調節因子又はリガンドの可能性があるものとして、何らかの化合物を使用することができるが、殆どの場合、水性又は有機(特にDMSOベース)溶液中で溶解できる化合物が使用される。本アッセイは、アッセイ段階を自動化し、何らかの都合のよいソースから化合物をアッセイに提供することにより、大型の化学ライブラリをスクリーニングするために設計されており、これは通常、平行して行われる(例えば、ロボット化アッセイでのマイクロタイタープレートにおけるマイクロタイター形式)。Sigma(St.Louis、MO)、Aldrich(St.Louis、MO)、Sigma−Aldrich(St.Louis、MO)、Fluka Chemika−Biochemica Analytika(Buchs Switzerland)など、化合物の多くの供給業者があることが認められるであろう。

0087

ある好ましい実施形態において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の治療的化合物候補(調節因子候補又はリガンド化合物候補)を含有する、コンビナトリアルな小型有機分子又はペプチドライブラリを提供することを含む。次に、所望の特徴のある活性を示すこのような「コンビナトリアル化学ライブラリ」又は「リガンドライブラリ」のメンバー(特に化学種又はサブクラス)を同定するために、このようなライブラリを本明細書中で記載のように、1以上のアッセイにおいてスクリーニングする。このように同定された化合物は、従来の「リード化合物」となり得るか、又はそれら自身が治療薬候補又は実際の治療薬として使用され得る。

0088

コンビナトリアル化学ライブラリは、試薬などの多くの化学的「構成要素」を組み合わせることによって、化学合成又は生合成の何れかにより生成された、多岐にわたる化合物のコレクションである。例えば、ある一定の化合物の長さ(すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数)に対して全ての可能な方法において、化学的構成要素(アミノ酸)のセットを組み合わせることによって、ポリペプチドライブラリなどの直線的なコンビナトリアル化学ライブラリが形成される。化学的構成要素のこのようなコンビナトリアル混合によって、非常に多くの化合物を合成することができる。

0089

コンビナトリアル化学ライブラリの作製及びスクリーニングは当業者にとって周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリには、以下に限定されないが、ペプチドライブラリ(例えば、米国特許第5,010,175号、Furka,Int.J.Pept.Prot.Res.37:487−493、1991及びHoughtonら、Nature 354:84−88、1991)が含まれる。化学的多様性ライブラリを作製するためのその他の化学もまた使用することができる。このような化学には、以下に限定されないが、ペプトイド(例えば、PCT公開WO91/19735)、コードされたペプチド(例えば、PCT公開WO93/20242)、ランダムバイオオリゴマー(例えば、PCT公開WO92/00091)、ベンゾジアゼピン(例えば、米国特許第5,288,514号)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドなどのダイバーソマー(Hobbsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909−6913、1993)、ビニル性ポリペプチド(Hagiharaら、J.Amer.Chem.Soc.114:6568、1992)、グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣体(Hirschmannら、J.Amer.Chem.Soc.114:9217−9218、1992)、小型化合物ライブラリの類似有機合成(Chenら、J.Amer.Chem.Soc.116:2661、1994)、オリゴカルバメート(Choら、Science 261:1303、1993)及び/又はペプチジルホスホネート(Campbellら、J.Org.Chem.59:658、1994)、核酸ライブラリ(Ausbel、Berger及びSambrook、全て前出を参照。)、ペプチド核酸ライブラリ(例えば、米国特許第5,539,083号を参照。)、抗体ライブラリ(例えばVaughnら、Nature Biotechnology、14:309−314、1996及びPCT/US96/10287を参照。)、炭水化物ライブラリ(例えば、Liangら、Science 274:1520−1522、1996及び米国特許第5,593,853号を参照。)、小型有機分子ライブラリ(例えばベンゾジアゼピン、BaumC EN、1月18日、33頁(1993)を参照;イソプレノイド、米国特許第5,569,588号;チアゾリジノン及びメタチアザノン、米国特許第5,549,974号;ピロリジン、米国特許第5,525,735号及び同第5,519,134号;モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号;ベンゾジアゼピン、同第5,288,514号など)が含まれる。

0090

コンビナトリアルライブラリを作製するための機器が市販されている(例えば357MPS、390MPS、Advanced Chem Tech、Louisville KY、Symphony、Rainin、Woburn、MA、433A Applied Biosystems、FosterCity、CA、9050 Plus、Millipore、Bedford、MAを参照。)。さらに、多くのコンビナトリアルライブラリそれ自身が市販されている(例えばComGenex、Princeton、N.J.、Asinex、Moscow、Ru、Tripos、Inc.,St.Louis、MO、ChemStar、Ltd、Moscow、RU、3D Pharmaceuticals、Exton、PA、Martek Biosciences、Columbia、MDなどを参照。)。

0091

トール様受容体2/Scd1相互作用を含む経路を介したマクロファージのMALP−2誘導に関連する疾患を治療するための薬物を同定するために、候補化合物は、ストラテジーの一部として有用である。TLR2又はScd1に結合する試験化合物を候補化合物とみなす

0092

TLR2もしくはScd1に結合する、又はTLR2もしくはScd1タンパク質もしくはポリペプチドもしくはこれらの生物学的に活性のある部分の活性を調節する、候補又は試験候補を同定するためのスクリーニングアッセイもまた本発明に含まれる。以下に限定されないが、生物学的ライブラリ;空間的に指定可能な平行固相もしくは液相ライブラリ;デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法;「1ビーズ1化合物」ライブラリ法;及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリ法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ法において多くのアプローチの何れかを用いて、試験化合物を得ることができる。例えばペプチドライブラリのために生物学的ライブラリアプローチを使用することができるが、一方で、その他の4種類のアプローチも、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小型の化学分子ライブラリに対して適用可能である(Lam、Anticancer Drug Des.12:145、1997)。分子ライブラリの合成のための方法の例は、例えば、De Wittら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909、1993;Erbら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422、1994;Zuckermannら、J.Med.Chem.37:2678、1994;Choら、Science 261:1303、1993;Carrellら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059、1994;Carellら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061、1994;及びGallopら、J.Med.Chem.37:1233、1994など、当技術分野において見出すことができる。ある実施形態において、試験化合物は、TLR2又はScd1の活性化変異体である。

0093

化合物のライブラリは、溶液中(例えばHoughten、Bio/Techniques 13:412−421、1992)又はビーズ上(Lam、Nature 354:82−84、1991)、チップ(Fodor、Nature 364:555−556、1993)、細菌(米国特許第5,223,409号)、胞子(米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号及び同第5,223,409号)、プラスミド(Cullら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865−1869、1992)又はファージ上(Scottら、Science 249:386−390、1990;Devlin、Science 249:404−406、1990;Cwirlaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378−6382、1990;及びFelici、J.Mol.Biol.222:301−310、1991)で提示することができる。

0094

例えば、試験化合物存在下でTLR2/Scd1複合体を形成する能力を監視することにより、試験化合物がTLR2もしくはScd1又はこれらの生物学的活性部分の活性を調節する能力を調べることができる。トール様受容体2/Scd1相互作用を含む経路を介したマクロファージのMALP−2誘導を測定することにより、TLR2もしくはScd1又はこれらの生物学的活性部分の活性を調節することを調べることができる。トール様受容体2タンパク質がScd1に結合する能力を監視することにより、トール様受容体2もしくはScd1又はこれらの生物学的活性部分の活性を調節する試験化合物の能力を調べることもできる。結合アッセイは細胞に基づくもの又は無細胞系であり得る。

0095

本明細書中に記載の方法又は直接結合を調べるための当技術分野で公知の方法の1つにより、トール様受容体2タンパク質が、Scd1に結合する又はScd1と相互作用する能力を調べることができる。ある実施形態において、マクロファージのMALP−2誘導を監視することにより、トール様受容体2タンパク質が、Scd1に結合する又はScd1と相互作用する能力を調べることができる。マクロファージのMALP−2誘導の検出は、FLAG配列又はルシフェラーゼなどの検出可能なマーカーもコードする組み換えScd1の発現の検出を含み得る。このアッセイは、直接結合のアッセイに付加されるものであり得る。一般に、試験化合物が、トール様受容体2タンパク質のScd1への結合又はScd1タンパク質の活性化又はトール様受容体2による遺伝子発現に影響を与える能力を調べるために、このようなアッセイが使用される。

0096

一般に、試験化合物がScd1に結合し、トール様受容体2を介してシグナリングを妨害するか、又はマクロファージのMALP−2誘導に影響を与える能力を対照(結合又はマクロファージのMALP−2誘導を試験化合物なしで調べる。)と比較する。いくつかの場合において、前もって決定されている参照値を使用する。対照に対して、このような参照値を決定することができ、この場合、参照物と異なる試験試料は、化合物が関心のある分子に結合する(例えば、トール様受容体2)か、又は発現を調節する(例えば、MALP−2により誘導されている細胞においてマクロファージを調節、活性化又は阻害するか、又はグラム陽性細菌感染に反応するマクロファージを調節、活性化又は阻害する。)。参照値はまた、標準を用いて観察される、結合又はマクロファージのMALP−2誘導の量を反映し得る(例えば、トール様受容体2に対する抗体の親和性又はMALP−2誘導によるScd1発現の調節)。この場合、参照と同様である(例えば、等しいか又はそれ未満である)試験化合物は、その化合物が候補化合物であることを指す(例えば、参照抗体と同程度からそれを超える程度、トール様受容体2に結合する。)。

0097

本発明はさらに、上述のスクリーニングアッセイにより同定される新規物質及び本明細書中に記載の治療のためのその使用に関する。

0098

ある実施形態において、本発明は、Scd1遺伝子産物もしくはトール様受容体2タンパク質又は、天然に生じるかもしくは組み換えの、Scd1遺伝子産物もしくはトール様受容体2タンパク質を発現する細胞もしくは組織を使用した可溶性アッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、ハイスループット形式の固相のインビトロアッセイを提供するが、この場合、Scd1遺伝子産物もしくはトール様受容体2タンパク質又はそのリガンドを共有又は非共有相互作用を介して固相基板に結合させる。本明細書中に記載のアッセイの何れのものもハイスループットスクリーニングに適応させることができる。

0099

本発明のハイスループットアッセイにおいて、可溶性又は固体状態の何れかで、1日で最大で数千個の様々な調節因子又はリガンドをスクリーニングすることができる。インビトロでScd1遺伝子産物もしくはトール様受容体2タンパク質に対して、又は、Scd1遺伝子産物もしくはトール様受容体2タンパク質を含有する、細胞に基づく、もしくは膜に基づくアッセイに対して、この方法を使用することができる。特に、選択した調節因子候補に対して個別のアッセイを行うために、マイクロタイタープレートの各ウェルを使用するか、又は、濃度もしくはインキュベート時間の影響が見られる場合は、5から10ウェルごとに1個の調節因子を試験することができる。したがって、1枚の標準的マイクロタイタープレートで約100(例えば96)個の調節因子をアッセイすることができる。1536ウェルプレートを使用する場合、約100から約1500種類の異なる化合物を1枚のプレートで容易にアッセイすることができる。1日に多くのプレートをアッセイすることができる;本発明の集積システムを使用して、最高で約6,000、20,000、50,000又は100,000個を超える様々な化合物に対するアッセイスクリーニングが可能である。

0100

固体状態の反応に対して、関心のあるタンパク質もしくはその断片、例えば細胞外ドメイン、又は、関心のあるタンパク質もしくはその断片を融合タンパク質の一部として含有する細胞もしくは膜を固体状態の成分に直接又は間接的に、共有又は非共有結合(例えばタグ)を介して結合させることができる。タグは、様々な成分の何れかであり得る。一般に、タグを結合する分子(タグ結合剤)を固体支持体に固定し、タグ及びタグ結合剤の相互作用により、タグを付加した関心のある分子を固体支持体に結合させる。

0101

文献で詳細に記載されている既知の分子相互作用に基づき、多くのタグ及びタグ結合剤を使用することができる。例えば、タグが天然の結合剤を有する場合(例えばビオチン、プロテインA又はプロテインG)、適切なタグ結合剤(アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、免疫グロブリンのFc領域など)との結合において使用することができる。ビオチンなどの天然の結合剤を伴う分子に対する抗体もまた、広く利用可能であり、適切なタグ結合剤である(SIGMA、Immunochemicals 1998カタログSIGMA、St.Louis MOを参照のこと。)。

0102

同様に、タグ/タグ結合剤ペアを形成するために適切な抗体と組み合わせて、何らかのハプテン性又は抗原性化合物を使用することができる。数千種類の特異的抗体が市販されており、多くのさらなる抗体が文献に記載されている。例えば、ある一般的な形態において、タグは一次抗体であり、タグ結合剤は、一次抗体を認識する二次抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、受容体−リガンド相互作用もまたタグ及びタグ結合剤ペアとして適切である。例えば、細胞膜受容体のアゴニスト及びアンタゴニストである(例えば、トール様受容体、トランスフェリン、c−kit、ウイルス受容体リガンドサイトカイン受容体ケモカイン受容体インターロイキン受容体免疫グロブリン受容体及び抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリーセレクチンファミリーなどの細胞受容体−リガンド相互作用;例えば、Pigott & Power、The Adhesion Molecule Facts Book I、1993を参照。)。同様に、毒素及び毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン(例えば、オピエートステロイドなど)、細胞内受容体(例えば、ステロイド、甲状腺ホルモンレチノイド及びビタミンDを含む、様々な小型のリガンドの影響を媒介するもの;ペプチド)、薬物、レクチン、糖、核酸(線状及び環状ポリマー構造の両方)、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質及び抗体は全て、様々な細胞受容体と相互作用し得る。

0103

ポリウレタンポリエステルポリカーボネートポリウレアポリアミドポリエチレンイミンポリアリレンスルフィドポリシロキサンポリイミド及びポリアセテートなどの合成ポリマーもまた、適切なタグ又はタグ結合剤を形成し得る。本開示を検討すると当業者にとって明らかとなるように、本明細書中に記載のアッセイ系において、多くのその他のタグ/タグ結合剤ペアもまた有用である。

0104

ペプチド、ポリエーテルなどの一般的なリンカーもまたタグとなり得、これには、約5から200アミノ酸の間のポリgly配列などの、ポリペプチド配列が含まれる。このような柔軟性のあるリンカーは当業者にとって公知である。例えば、ポリエチレングリコールリンカーはSheawater Polymers、Inc.Huntsville、Alabamaから入手可能である。これらのリンカーは、場合によっては、アミド結合スルフィドリル結合又はヘテロ官能性結合を有する。

0105

現在利用可能な様々な方法の何れかを用いて固体基板にタグ結合剤を固定する。固体基板は、一般に、タグ結合剤の一部と反応性のある表面に化学基を固定する化学物質に基板の全て又は一部を曝露することにより、誘導化又は官能化されている。例えば、より長い鎖部分に連結させるのに適切な基には、アミン、ヒドロキシルチオール及びカルボキシル基が含まれよう。ガラス面などの様々な表面を官能化するために、アミノアルキルシラン及びヒドロキシアルキルシランを使用することができる。このような固相バイオポリマーアレイ構築は、文献で詳細に記載されている。例えば、Merrifield、J.Am.Chem.Soc.85:2149−2154、1963(例えばペプチドの固相合成について述べている。);Geysenら、J.Immun.Meth.102:259−274、1987(ピン上での固相成分の合成について述べている。);Frank & Doring、Tetrahedron 44:6031−6040、1988(セルロースディスク上での様々なペプチド配列の合成について述べている。);Fodorら、Science 251:767−777、1991;Sheldonら、Clinical Chemistry 39:718−719、1993;及びKozalら、Nature Medicine 2:753−759、1996(全て、固体基板に固定されたバイオポリマーのアレイについて述べている。)を参照のこと。タグ結合剤を基板に固定するための非化学的アプローチには、熱、UV照射による架橋などのその他の一般的な方法が含まれる。

0106

Scd1及びトール様受容体2の調節因子としての二重特異性化合物
ある態様において、非ヒト動物の血清及び/又は循環において薬物の濃度を低下させる、二重特異性化合物の候補化合物又は試験化合物を同定するための方法が提供される。例えばヒト対象など、このような化合物の投与から恩恵を受ける対象を治療するために、本方法を用いて選択された、又は最適化された化合物を使用することができる。

0107

本発明の方法の実施形態において試験することができる候補化合物は、二重特異性化合物である。本明細書中で使用される場合、「二重特異性化合物」という用語は、2つの異なる結合特異性を有する化合物を含む。典型的な二重特異性化合物には、例えば、二重特異性抗体ヘテロポリマー及び抗原に基づくヘテロポリマーが含まれる。

0108

本発明の実施形態において試験することができる二重特異性分子には、好ましくは、標的物質(例えば別個の抗体又は抗原)に対して特異的な第二の結合部分と架橋された、Scd1、好ましくはヒトScd1に特異的な結合部分が含まれる。トール様受容体2に特異的な結合部分の例には、以下に限定されないが、トール様受容体2リガンド、例えばMALP−2又は、好ましい実施形態においては、トール様受容体2に対する抗体が含まれる。

0109

別の実施形態において、そのトール様受容体2への結合能に基づいて、新規トール様受容体2結合分子を同定することができる。例えば、無細胞系の結合アッセイにおいて、化合物又は小型の化学分子のライブラリを試験することができる。例えば、ペプチド摸倣体、小型の化学分子又はその他の薬物などの試験化合物のあらゆる数を試験に対して使用することができ、生物学的ライブラリ;空間的に指定可能な平行固相もしくは液相ライブラリ;デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法;「1ビーズ1化合物」ライブラリ法;及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリ法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチの何れかを用いてこれらを得ることができる。生物学的ライブラリアプローチはペプチドライブラリに限定されるが、一方で、その他の4種類のアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小型の化学分子ライブラリに対して適用可能である(Lam、Anticancer Drug Des.12:145、1997)。

0110

調節物質及び天然の抽出物のライブラリを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、ある一定の時間で調べる調節物質の数を最大にするために、ハイスループットアッセイが必要とされる。精製又は半精製タンパク質とともに生成され得るような、無細胞系で行われるアッセイは、「第一の」スクリーニングとして好まれることが多く、ここでは、迅速に開発すること及び、試験調節物質により媒介される分子標的における変化を比較的容易に検出することを可能とするようにアッセイを作ることができる。さらに、細胞毒性の影響及び/又は試験調節物質のバイオアベイラビリティーは通常、インビトロ系では無視することができ、代わりに、このアッセイでは、上流又は下流エレメントとの結合親和性の変化を明白にできるように、分子標的における薬物の影響に主に焦点が当てられる。

0111

別の実施形態において、新規TLR2又はScd1結合分子を同定するために、当技術分野で公知のファージディスプレイ技術を使用することができる。

0112

ある実施形態において、本発明は、TLR2もしくはScd1又はそれらの生物学的活性部分に結合する、候補又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。

0113

本発明の二重特異性化合物において使用するためのさらなる物質を同定するために、TLR2又はScd1に結合する分子を同定するための、細胞に基づくアッセイを使用することができる。例えば、スクリーニングアッセイにおいて、TLR2又はScd1を発現する細胞を使用することができる。例えば、TLR2又はScd1への結合において統計的に有意な変化を生じさせる化合物を同定することができる。
ある実施形態において、アッセイは、インビトロでのTLR2又はScd1タンパク質へのその結合能に基づいてトール様受容体2結合分子が同定される無細胞系アッセイである。TLR2又はScd1タンパク質結合分子を提供することができ、直接結合を調べるための当技術分野で認められている方法を用いて、TLR2又はScd1タンパク質へのタンパク質の結合能を試験することができる。例えば、リアルタイム生体分子間相互作用分析(BIA)などの技術を用いて、標的分子へのタンパク質の結合能を調べることができる。Sjolanderら、Anal.Chem.63:2338−2345、1991及びSzaboら、Curr.Opin.Struct.Biol.5:699−705、1995。本明細書中で使用される場合、「BIA」は、反応体の何れも標識せずに、リアルタイムで生体特異的相互作用を調べるための技術である(例えばBIAcore)。生体分子間のリアルタイム反応の指標として、表面プラズモン共鳴(SPR)の光学現象の変化を使用することができる。

0114

本発明の無細胞系アッセイは、タンパク質の可溶性及び/又は膜結合形態の両方に使用できる。膜結合形態のタンパク質が使用される無細胞系アッセイの場合、タンパク質の膜結合形態が溶液中で維持されるような可溶化剤を利用することが望ましいものであり得る。このような可溶化剤の例には、n−オクチルグルコシド、n−ドデシルグルコシド、n−ドデシルマルトシドオクタノイル−N−メチルグルカミド、デカノイル−N−メチルグルカミド、Triton(R)X−100、Triton(R)X−114、Thesit(R)、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)n、3−[(3−コラミドプロピルジメチルアミニオ]−1−プロパンスルホネートCHAPS)、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアミニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート(CHAPSO)又はN−ドデシル=N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネートなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。

0115

タンパク質−タンパク質相互作用を検出可能にする適切なアッセイが当技術分野で公知である(例えば、免疫沈降、2−ハイブリッドアッセイなど)。試験化合物の存在下及び非存在下でこのようなアッセイを行うことにより、本発明のタンパク質と標的分子との相互作用を調節(例えば阻害又は促進)する化合物を同定するために、これらのアッセイを使用することができる。

0116

例えば直接結合により、タンパク質が、標的分子に結合するか又はこれと相互作用する能力を調べることができる。直接結合アッセイにおいて、複合体において標識されたタンパク質を検出することにより標的分子へのタンパク質の結合を調べることができるように、放射性同位体又は酵素標識とタンパク質をカップリングさせ得る。例えば、直接又は間接的に、の何れかで、125I、35S、14C又は3Hを用いてタンパク質を標識することができ、放射線放出を直接カウントすることにより、又はシンチレーションカウントにより、放射性同位体を検出する。あるいは、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はルシフェラーゼを用いて分子を酵素標識することができ、適切な基質から産物への変換を調べることにより、酵素標識を検出する。

0117

通常、タンパク質の一方又は両方の非複合体形態からの複合体の分離を促進するために、ならびにアッセイの自動化を行うために、本発明のタンパク質又はその結合タンパク質の何れかを固定化することが望ましい。反応体を含有するのに適切な何らかの容器中で、候補物質の存在下及び非存在下での、上流又は下流結合エレメントへの結合を行うことができる。例としては、マイクロタイタープレート、試験管及び微小遠心管が挙げられる。ある実施形態において、タンパク質がマトリクスに結合するのを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/TLR2(GST/TLR2)融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical、St.Louis、MO)又はグルタチオン誘導化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次いでこれを細胞溶解液(例えば35S−標識されたもの)及び試験調節物質と組み合わせ、複合体形成を促す条件下(例えば塩及びpHに対する生理的条件下)で混合物をインキュベートするが、僅かによりストリンジェントな条件を使用することができる。インキュベート後、非結合標識を除去するためにビーズを洗浄し、マトリクスを固定化し、放射性標識を直接(例えばビーズをシンチラント中に入れる。)、又は、続いて複合体を解離させた後、上清中で調べる。あるいは、マトリクスから複合体を解離させ、SDS−PAGEにより分離し、標準的な電気泳動技術を用いてビーズ分画で見出されるTLR2結合タンパク質のレベルをゲルから定量することができる。

0118

本アッセイで使用するために、マトリクス上にタンパク質を固定化するためのその他の技術もまた利用可能である。例えば、当技術分野で周知の技術(例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals、Rockford、Ill)を用いて、ビオチン−NHS(N−ヒドロキシ−スクシンイミド)からビオチン化分子を調製し、ストレプトアビジン被覆した96ウェルプレート(Pierce Chemicals)のウェル中で固定化することができる。

0119

反応体の何れも標識することなく、TLR2とScd1との間の相互作用を化合物が調節する能力を調べることも本発明の範囲内である。例えば、タンパク質又は標的分子の何れも標識することなく、本発明のタンパク質とその標的分子との相互作用を検出するために、マイクロフィジオメーターを使用することができる。McConnellら、Science 257:1906−1912、1992。本明細書中で使用される場合、「マイクロフィジオメーター」(例えばCytosensor)は、光アドレス電位差滴定センサー(Llight−addresssable potentiometric sensor、LAPS)を用いて、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。化合物と受容体との間の相互作用の指標として、この酸性化速度の変化を使用することができる。

0120

本発明において試験することができる抗原に基づくヘテロポリマーは、好ましくは、自己抗体により認識される抗原と架橋された、TLR2又はScd1、好ましくはヒトTLR2又はScd1に特異的である結合部分を含む。自己抗体により認識される抗原の例には、次の何れかのものが含まれるが限定されない:第VIII因子(置換組み換え第VIII因子による血友病の治療に関連する抗体);筋肉アセチルコリン受容体(この抗体は、重症筋無力症疾病に関連する。);カルジオリピン狼瘡に関連する。);血小板結合タンパク質(特発性血小板減少性紫斑病の疾病に関連する。);シェーングレン症候群に関連する多重抗原;組織移植自己免疫応答の場合に関与する抗原;心筋で見られる抗原(自己免疫性心筋炎の疾病に関連する。);免疫複合体介在性腎臓疾患に関連する抗原;dsDNA及びssDNA抗原(ループス腎炎に関連する。);デスモグレイン及びデスモプラキン天疱瘡及び類天疱瘡に関連する。);又は、特徴がよく分かっており、疾病病因に関連する何らかのその他の抗原。

0121

本発明及びそれらをなす方法において試験するための、典型的なヘテロポリマー及び抗原に基づくヘテロポリマーは当技術分野で公知である。例えば、典型的なヘテロポリマーは、WO03007971A1;U.S.20020103343A1;米国特許第5,879,679号;米国特許第5,487,890号;米国特許第5,470,570号;WO9522977A1;WO/02075275A3、WO/0246208A2又はA3、WO/0180883A1、WO/0145669A1、WO9205801A1、Lindorferら、J.Immunol.Methods.248:125、2001;Hahnら、J.Immunol.166:1057、2001;Nardinら、J.Immunol.Methods.211:21、1998;Kuhnら、J.Immunol.160:5088、1998;Taylorら、Cancer Immunol Immunother.45:152、1997;Taylorら、J.Immunol.159:4035、1997;及びTaylorら、J.Immunol.148:2462、1992において教示されている。さらに、これらのヘテロポリマーの変異体を作製することができる。例えば、ある実施形態において、様々な結合化学を用いて作製された二重特異性分子の形態を使用することができる。二重特異性分子の成分を架橋するために使用することができる典型的な試薬には、ポリエチレングリコール、SATA、SMCCならびに当技術分野で公知であり利用可能なその他のもの、例えば、Pierce Biotechnologyからのものが含まれる。試験することができる二重特異性分子の典型的な形態は、米国出願番号60/411,731(2002年9月16日出願)に記載されており、この内容を参照により本明細書中に組み込む。

0122

別の実施形態において、二重特異性分子の様々な多量体の形態を作製することができる(例えば、二量体三量体、四量体、五量体又はより高い多量体の形態)。別の実施形態において、例えば、米国出願番号60/380,211(2002年5月13日出願)(この内容を参照により本明細書中に組み込む。)に記載のように、二重特異性分子の精製形態を試験することができる。

0123

別の実施形態において、ヘテロポリマーの結合部分の1つが抗体である場合、様々なアイソタイプ(例えば、IgA、IgDIgE、IgG1、IgG2(例えば、IgG2a)、IgG3、IgG4又はIgM)の抗体を使用することができる。別の実施形態において、結合部分の1つに対して、抗体分子の一部(例えばFab断片)を使用することができる。好ましい実施形態において、結合部分の少なくとも1つはFcドメインを含有する抗体である。ある実施形態において、抗体はマウス抗体である。

0124

別の実施形態において、抗体に対する修飾の影響を試験することができ、例えば米国出願番号60/458,869(2003年3月28日出願)に記載のように、例えば抗体の脱免疫(deimmunization)の影響を試験することができる。

0125

本発明において提供される方法において、非ヒト動物の、血清、循環及び/又は組織中の物質(例えば病原体)の濃度を、少なくとも、例えば約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%又は約100%低下させることができる。

0126

別の実施形態において、対象の、血清、循環及び/又は組織中の物質の濃度を間接的に測定することができる。例えば、その動物由来の組織試料を調べることにより、例えば、血清及び/又は循環中にその物質が存在することによる病変を測定することができる。非ヒト動物の、血清、循環及び/又は組織中の物質の濃度の別の間接的測定は、その物質が非ヒト動物において感染を起こす能力を測定することである。例えば、臨床的徴候及び感染の症状における二重特異性化合物の影響を測定することができる。二重特異性化合物が感染の拡大(例えばある器官系から別のものへ、又はある個体から別の個体へ)を阻止する能力も試験することができる。

0127

別の実施形態において、非ヒト動物において二重特異性化合物がTLR2又はScd1を含む細胞に結合する能力を測定する。例えば、ある実施形態において、リアルタイム生体分子間相互作用分析(BIA)などの技術を用いて、二重特異性化合物がTLR2又はScd1標的分子に結合する能力を調べることもできる(Sjolanderら、Anal.Chem.63:2338−2345、1991及びSzaboら、Curr.Opin.Struct.Biol.5:699−705、1995)。本明細書中で使用される場合、「BIA」は、反応体の何れも標識せずに、リアルタイムで生体特異的相互作用を調べるための技術である(例えばBIAcore)。生体分子間のリアルタイム反応の指標として、表面プラズモン共鳴(SPR)の光学現象の変化を使用することができる。

0128

別の実施形態において、非ヒト動物における細胞による物質の破壊を測定する(例えばマクロファージによる殺滅)。

0129

(本二重特異性化合物を投与されていない非ヒト動物で観察される濃度と比較した場合に)非ヒト動物の、血清及び/又は循環中の物質の濃度を低下させる化合物を選択することができる。

0130

試験する化合物の複数の中から、本アッセイにおいて試験するための化合物を選択することができる。別の実施形態において、例えばインビトロアッセイにおいてTLR2又はScd1を結合できるものとして、本アッセイにおいて試験するための二重特異性化合物が既に同定されている可能性があり、本アッセイを使用して、さらにこれを評価又は最適化することができる。このような場合、血清及び/又は循環中の物質の濃度を二重特異性化合物が低下させる能力を調べるために、血清及び/又は循環中の物質の濃度を二重特異性化合物が低下させる能力を、別の二重特異性化合物又は同じ化合物の非最適化型と比較することができる。

0131

好ましい実施形態において、およそ1μg化合物/kg体重からおよそ100μg化合物/kg体重の範囲で本発明の二重特異性化合物を投与する。本明細書中で定義される場合、二重特異性化合物の治療的有効量(すなわち有効量)の範囲は、約0.01から5000μg/kg体重、好ましくは約0.1から500μg/kg体重、より好ましくは約2から80μg/kg体重及びさらにより好ましくは約5から70μg/kg、10から60μg/kg、20から50μg/kg、24から41μg/kg、25から40μg/kg、26から39μg/kg、27から38μg/kg、28から37μg/kg、29から36μg/kg、30から35μg/kg、31から34μg/kg又は32から33μg/kg体重である。熟練者にとって当然のことながら、以下に限定されないが、疾患もしくは疾病の重症度、以前の治療、全般的健康及び/又は対象の年齢及びその他の疾患の存在を含むある一定の因子が、対象を効果的に治療するのに必要な用量に影響し得る。さらに、タンパク質、ポリペプチド又は抗体の治療的有効量での対象の治療には、単回治療が含まれ得るか、又は好ましくは、一連の治療が含まれ得る。

0132

好ましい例において、作用物質の静脈内(iv)注射後、約1から500μg/kg体重の範囲の二重特異性化合物で動物を治療する。これも当然のことながら、特定の治療のコースにわたり、治療のために使用される二重特異性化合物の有効用量を増減させることができる。用量の変更は、本明細書中に記載のような診断アッセイの結果から生じ得、明らかになり得る。

0133

試験化合物及び/又は作用物質の投与経路は、動物の循環系への静脈内(iv)注射であり得る。その他の投与経路には、以下に限定されないが、局所、非経口、皮下又は吸入によるものが含まれる。「非経口」という用語には、例えば皮下、静脈内又は筋肉内経路による注射が含まれ、また、局所投与(例えば疾病又は損傷の部位)も含まれる。移植物からの化合物の持続放出もまた当技術分野で公知である。当業者にとって当然のことながら、適切な用量は変化し、治療すべき疾患の性質、患者の体重、年齢及び全身状態及び投与経路などの因子に依存する。動物試験に従い、仮の用量を決定することができ、当技術分野で許容されている実務に従い、ヒトへの投与に対する用量の調整を行う。

0134

用量範囲にわたり、動物に候補化合物及び作用物質を投与することができる。作用物質も動物に投与する場合、作用物質投与の前、同時、後、の何れかで候補化合物を投与することができる。

0135

対象の血清及び/又は循環中に、自己抗体、感染物質又は毒素など、望ましくない作用物質が存在することに関連するヒトでの疾患又は疾病を治療するのに有用な候補化合物をスクリーニング又は評価するために、本発明のTLR2−又はScd1−発現トランスジェニック動物(例えばマウス)を使用することができる。

0136

本発明の二重特異性化合物が結合し得る典型的な標的物質には、血液感染性物質(次の何れかを含むが限定されない:ウイルス、ウイルス粒子、毒素、細菌、ポリヌクレオチド、抗体、例えば自己免疫疾患に関連する自己抗体)が含まれる。ある実施形態において、典型的な標的となるウイルス性物質には、次の何れかが含まれるが限定されない:サイトメガロウイルスインフルエンザニューキャッスル病ウイルス水疱性口内炎ウイルス狂犬病ウイルス単純ヘルペスウイルス肝炎アデノウイルス−2、ウシウイルス性下痢ウイルスヒト免疫不全ウイルスHIV)、デングウイルスマルブルグウイルス、エプスタイン−バーウイルス

0137

典型的なグラム陽性細菌性標的は、Streptococcus pyogenes(化膿連鎖球菌)、Staphylococcus aureus(黄色ブドウ球菌)、Mycobacterium tuberculosis(ヒト結核菌)、Streptococcus pneumoniae(肺炎連鎖球菌)又はBacillus subtilis(枯草菌)である。上述の方法及び組成物の何れかは、皮膚感染、地域感染型肺炎、上及び下気道感染、皮膚及び軟組織感染、院内感染肺感染、骨及び関節感染、気道感染急性細菌性中耳炎細菌性肺炎尿路感染合併感染、非合併感染、腎盂腎炎、腹内感染、深在性膿瘍細菌性敗血症中枢神経系感染、菌血症創傷感染腹膜炎髄膜炎熱傷後感染、尿生殖路感染、胃腸管感染、骨盤炎症疾患心内膜炎及びその他の血管内感染の治療に有用である。治療すべき感染は、グラム陽性細菌により起こり得る。これらには、以下に限定されないが、Staphylococcus aureus(黄色ブドウ球菌)、Staphylococcus epidermidis(表皮ブドウ球菌)、Enterococcus faecalis(大便連鎖球菌)、Enterococcus faecium(エンテロコッカスフェシウム)、Clostridium petfringens(クロストリジウムペルフリンゲン)、Clostridium difficile(クロストリジウム・ディフィシル)、Streptococcus pyogenes(化膿連鎖球菌)、Streptococcus pneumoniae(肺炎連鎖球菌)、その他の連鎖球菌属及びその他のクロストリジウム属による感染が含まれる。より具体的には、グラム陽性球菌又は薬物耐性グラム陽性球菌により感染が起こり得る。典型的なグラム陽性球菌は、以下に限定されないが、S.aureus、S.epidermidis、S.pneumoniae、S.pyogenes、M.catarhalis、C.difficile、H.pylori、クラミジア類及びEnterococcus(腸球菌)類である。

0138

菌血症はグラム陰性又はグラム陽性細菌により引き起こされ得る。グラム陰性細菌は、ペプチドグリカンの単層及びリポ多糖、リポタンパク質及びリン脂質の外層からなる薄い壁のある細胞膜を有する。典型的なグラム陰性生物には、以下に限定されないが、Escherichia(エシェリキア属)、Shigella(赤痢菌)、Edwardsiella(エドワードシエラ属)、Salmonella(サルモネラ菌)、Citrobacter(シトロバクター属)、Klebsiella(クレブシエラ菌)、Enterobacter(エンテロバクター属)、Hafnia(ハフニア属)、Serratia(セラシア属)、Proteus(プロテウス属)、Morganella(モルガネラ属)、Providencia(プロビデンシア属)、Yersinia(エルシニア)、Erwinia(エルニア属)、Buttlauxella(バッチオクセラ)、Cedecea(セデセア)、Ewingella(ユーインゲラ属)、Kluyvera(クラベラ属)、Tatumella(テイタメラ)及びRahnella(ラーネラ)からなる腸内細菌科が含まれる。腸内細菌科ではないその他の典型的なグラム陰性生物には、以下に限定されないが、Pseudomonas aeruginosa(緑膿菌)、Stenotrophomonas maltophilia(ステノトロフォモナスマルトフィリア)、Burkholderia(ブルコルデリア)、Cepacia(セパシア菌)、Gardenerella(ガーデネレラ)、Vaginalis(バギナリス)及びAcinetobacter(アシネトバクター)属が含まれる。グラム陽性生物は、ペプチドグリカンの多層及びテイコ酸の外層からなる厚い細胞膜を有する。典型的なグラム陽性生物には、以下に限定されないが、Staphylococcus aureus(黄色ブドウ球菌)、凝固酵素陰性ブドウ球菌連鎖球菌、腸球菌、コリネバクテリア及びバチルス属が含まれる。

0139

ある実施形態において、標的となる病原体は、伝統的な治療に対して耐性があり、例えば抗生物質耐性である。

0140

ある実施形態において、本発明のアッセイを行うことにおいて、二重特異性化合物の投与前、投与と同時に、又は投与後に、作用物質をトランスジェニック動物に投与する。

0141

半減期延長するために、本発明の二重特異性化合物又はその何らかの部分を修飾することができる。製薬産業において、鋳型ペプチドと類似する特性を有する非ペプチド薬として、ペプチド類似体が一般に使用される。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチドの模倣体(Pepeptide mimetics)」又は「ペプチド模倣体(Pepeptidomimetics)」と呼ばれ(Fauchere、Adv.Drug Res.15:29、1986;Veberら、TINS p.392、1985;及びEvansら、J.Med.Chem 30:1229、1987、これらは、参照により本明細書中に組み込まれる。)、通常、コンピュータ化された分子モデリングにより開発される。同等の治療又は予防効果を得るために、治療に有用なペプチドと構造的に同様のペプチド摸倣体を使用することができる。一般に、ペプチド摸倣体は、抗原ポリペプチドなど模範のポリペプチド(すなわち、生物学的又は薬理学的活性を有するポリペプチド)と構造的に類似しているが、当技術分野で公知であり、次の文献でさらに述べられている方法により、−−CH2NH−−、−−CH2S−−、−−CH2−−CH2−−、−−CH=CH−−(シス及びトランス)、−−COCH2−−、−−CH(OH)CH2−−及び−−CH2SO−−からなる群から選択される結合により場合によっては置換されている、1以上のペプチド結合を有する:Spatola,A.F.(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins Weinstein,B.編、Mercel Dekker、New York、p.267、1983;Spatola,A.F.,Vega Data、Vol.1、Issue3、「Peptide Backbone Modifications」、1983;Morley、Trends.Pharm.Sci pp.463−468、1980;Hudsonら、Int.J.Pept.Prot.Res.14:177−185、1979(−−CH2NH−−、CH2−−CH2−−);Spatolaら、Life Sci.38:1243−1249、1986(−−CH2−−S);Hann、J.Chem.Soc.Perkin.Trans.1:307−314、1982(−−CH−−CH−−、シス及びトランス);Almquistら、J.Med.Chem.23:1392−1398、1980(−−COCH2−−);Jennings−Whiteら、Tetrahedron Lett.23:2533、1982(−−COCH2−−);Szelkeら、欧州特許出願EP45665CA:97:39405、1982(−−CH(OH)CH2−−);Holladayら、Tetrahedron Lett.24:4401−4404、1983(−−C(OH)CH2−−);及びHruby、Life Sci.31:189−199、1982(−−CH2−−S−−);これらのそれぞれを参照により本明細書中に組み込む。特に好ましい非ペプチド結合は−−CH2NH−−である。このようなペプチド摸倣体は、例えば、より経済的な産物である、化学安定性がより高い、薬理学的特性が強化されている(半減期、吸収、効能効力など)、特異性が変化している(例えば、生物学的活性の広いスペクトラム)、抗原性が低下していることなどを含め、ポリペプチド実施形態を超える顕著な長所を有し得る。ペプチド摸倣体の標識は通常、定量的構造−活性データ及び/又は分子モデリングにより予想されるペプチド摸倣体の妨害しない位置に対する、直接又はスペーサー(例えばアミド基)を介した、1以上の標識の共有結合を含む。このような非妨害位置は通常、治療効果を生じさせるためにペプチド摸倣体が結合する巨大分子と直接の接触を形成しない位置である。ペプチド摸倣体の誘導化(例えば標識)は、ペプチド摸倣体の所望の生物学的又は薬理学的活性を実質的に妨害すべきではない。

0142

より安定なペプチドを得るために、アミノ酸配列の1以上のアミノ酸の同じ型のD−アミノ酸との体系的な置換(例えばL−リシンの代わりにD−リシン)を使用することができる。さらに、例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによるなど、当技術分野で公知の方法により、非天然ペプチドを生じさせることができる(Rizoら、Annu.Rev.Biochem.61:387、1992、参照により本明細書中に組み込む。)。

0143

原核又は真核細胞においてこのような修飾されたポリペプチドを産生させることができる。あるいは、化学的方法により、このようなペプチドを合成することができる。組み換え宿主での異種ポリペプチドの発現、ポリペプチドの化学合成及びインビトロ翻訳のための方法は、当技術分野で周知であり、Maniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989;Bergerら、Methodsin Enzymology、Volume152、Guide to Molecular Cloning Techniques、1987、Academic Press、Inc.,San Diego、Calif.;Merrifield、J.Am.Chem.Soc.91:501、1969;Chaiken、CRCCrit.Rev.Biochem.11:255、1981;Kaiserら、Science 243:187、1989;Merrifield、Science 232:342、1986;Kent、Annu.Rev.Biochem.57:957、1988;及びOfford、Semisynthetic Proteins、Wiley Publishing、1980(参照により本明細書中に組み込む。)においてさらに述べられている。

0144

通常、直接的化学合成によりポリペプチドを生成させ、ヘテロポリマーの結合部分として使用することができる。N末端及び/又はC末端へ共有結合により連結された非ペプチド部分を有する修飾ペプチドとしてペプチドを生成させることができる。ある好ましい実施形態において、カルボキシ末端もしくはアミノ末端の何れか又は両方が化学的に修飾される。末端アミノ基及びカルボキシル基の最も一般的な修飾は、それぞれアセチル化及びアミド化である。アシル化(例えばアセチル化)又はアルキル化(例えばメチル化)などのアミノ末端修飾及び、アミド化などのカルボキシ末端修飾ならびに、環状化を含むその他の末端修飾が、試験化合物の様々な実施形態に組み込まれ得る。ある種のアミノ末端及び/又はカルボキシ末端修飾及び/又はコア配列に対するペプチド延長により、安定性の向上、効能及び/又は効力の向上、血清プロテアーゼに対する耐性、所望の薬物動態学的特性など、有利な物理的、化学的、生化学的及び薬理学的特性が得られる。

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