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課題

血管新生を制御する手段、従来の方法では血管新生を促進することが難しかった例えば高齢者など特定の被験者集団における血管新生をも促進し、また所定の部位での血管新生をより正確に制御する手段を提供する。

解決手段

本発明に従って、選択した患者においておよび特定の部位に標的輸送するいくつかの好ましい態様において、血管新生を制御する方法、すなわち血管形成を増強または阻害する方法においてEC前駆体を用いることができる。例えば、EC前駆体は、血管新生を増強するために、または血管新生阻害剤、例えば抗−もしくは親−血管新生剤をそれぞれ、病理学的もしくは実利的血管新生部位に輸送するために用いることができる。さらに、もう一つの態様において、EC前駆体は、損傷血管の内皮再形成誘導することができ、このように平滑筋細胞増殖を間接的に阻害することによって再狭窄を減少させるために用いることができる。

概要

背景

血管は、酸素および栄養素生体組織に供給し、生体組織から老廃物を除去する手段である。血管新生は、例えばフォークマンシング(Folkman and Shing、J. Biol. Chem. 267(16)、10931〜10934(1992))による総説に述べられているように、それによって新しい血管が形成されるプロセスである。このように血管新生は重要なプロセスである。これは、再生発達および創傷修復において不可欠である。しかし、血管新生が不適当であれば、重大な結末を生じうる。例えば、血管新生の結果として多くの固形腫瘍に血管が通じて初めて腫瘍は急速に増殖し始め、転移し始める。血管新生はこれらの機能に対して非常に重要であるため、健康を維持するためには注意深く制御しなければならない。血管新生プロセスは、血管内皮増殖因子VEGF)および塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)のようなマイトゲンによって活性化された内皮細胞(EC)から分泌されたプロテアーゼによって基底膜崩壊と共に始まると考えられている。細胞遊走して増殖し、間質間隙に塊状の内皮細胞を形成し、その後血管ループが形成されて、密な接合部が形成され、新しい基底膜が形成されて毛細管が発達する。
成人では、内皮細胞の増殖速度は、体内の他の細胞タイプと比較して典型的に低い。これらの細胞の代謝回転時間は1000日を超えることがある。厳密な制御下で血管新生の結果急速な増殖が起こる生理学例外は、女性生殖器創傷治癒の際に認められる。
血管新生の発生には、微小血管増殖の陽性および陰性制御間の局所平衡の変化を必要とする。生体が血管新生に対するそのコントロールを失うと、異常な血管新生が起こり、血管増殖過度または不十分となる。例えば、潰瘍、脳卒中および心臓発作のような状態は、自然治癒に通常必要な血管新生が存在しないことに起因する可能性がある。これに対し、過剰な血管増殖は、腫瘍の増殖および転移、失明乾癬ならびにリウマチ性関節炎にとって都合がよい可能性がある。
血管新生増殖因子の持つ治療的意味は最初に、フォークマンとその同僚によって20年前に記述された(Folkman、N. Engl. J. Med., 285:1182〜1186(1971))。このように、創傷および潰瘍の治癒の場合のように、程度の大きい血管新生が望ましい場合がある。最近の研究から、心筋梗塞および後肢虚血動物モデルタケシタら(Takeshita)、Circulation, 90:228〜234(1994)およびタケシタら(Takeshita)、J. Clin. Invest., 93:662〜70(1994))において、側副動脈発達を促進および/または増強するために、繊維芽細胞増殖因子(FGF)ファミリーヤナギサワ-ミワ(Yanagisawa-Miwa)ら、Science, 257:1401〜1403(1992)、およびバファーら(Baffour)、J. Vasc Surg, 16:181〜91(1992))、内皮細胞増殖因子ECGF)(プら(Pu)、J. Surg. Res., 54:575〜83(1993))、およびより最近では血管内皮増殖因子(VEGF)のような組換え型血管新生増殖因子を用いることが実際に可能であることが確立された。
逆に、血管新生の阻害が望ましい場合もある。例えば、多くの疾患は、持続的な制御されない血管新生によって進行する。関節炎では、新しい毛細血管が関節に侵入し、軟骨破壊する。糖尿病では、新しい毛細管が硝子体に侵入して、出血し、失明を起こす。目の血管新生は最も一般的な失明の原因である。腫瘍の増殖および転移は血管新生に依存する。腫瘍は、自身が増殖するためには新しい毛細血管の増殖を絶えず刺激しなければならない。
これらの疾患に対する現在の治療法は適切でない。持続的な血管新生を予防する薬物、例えば薬剤(TNP-470)、モノクローナル抗体、およびアンチセンス核酸が現在試験中である。しかし、血管新生を阻害する新規薬剤が必要である。
最近、血管新生を制御する遺伝子療法の実現が可能であることが示されている。例えば、虚血の治療における血管新生の促進は、ウサギモデルおよび遺伝子輸送系としてハイドロゲルコーティング血管形成術バルーンを用いたVEGFによるヒトの臨床試験において証明された。血管壁へのVEGF遺伝子の移入成功し、持続的に発現させると、その後、虚血した後肢に血管新生が増強された(タケシタら(Takeshita)、Laboratory Investigation, 75:487〜502(1996);アイスナーら(Isner)、Lancet, 348:370(1996))。さらに、VEGFをコードするDNAを虚血組織に直接筋肉内注射すると、虚血組織の血管が増加し、血管新生を誘発することが証明された(ツルミら(Tsurumi)、Circulation, 94(12):3281〜3290(1996))。
血管新生を制御するもう一つの方法は、多くの理由からさらに望ましい。例えば、本来の内皮細胞(EC)の数および/または生存率は経時的に減少すると考えられている。このように、特定の患者集団、例えば高齢者では、投与した血管新生サイトカインに反応することができるECの定住集団は限られている可能性がある。
その上、血管新生を促進または抑制する物質は、ある部位では有用であるかも知れないが、それらは別の部位では望ましくない可能性がある。このように、所定の部位での血管新生をより正確に制御する手段が望ましい。

概要

血管新生を制御する手段、従来の方法では血管新生を促進することが難しかった例えば高齢者など特定の被験者集団における血管新生をも促進し、また所定の部位での血管新生をより正確に制御する手段を提供する。 本発明に従って、選択した患者においておよび特定の部位に標的輸送するいくつかの好ましい態様において、血管新生を制御する方法、すなわち血管形成を増強または阻害する方法においてEC前駆体を用いることができる。例えば、EC前駆体は、血管新生を増強するために、または血管新生阻害剤、例えば抗−もしくは親−血管新生剤をそれぞれ、病理学的もしくは実利的血管新生部位に輸送するために用いることができる。さらに、もう一つの態様において、EC前駆体は、損傷血管の内皮再形成誘導することができ、このように平滑筋細胞増殖を間接的に阻害することによって再狭窄を減少させるために用いることができる。なし

目的

フォークマン&シング(Folkman and Shing、J. Biol. Chem. 267(16)、10931〜10934(1992))
Folkman、N. Engl. J. Med., 285:1182〜1186(1971)
タケシタら(Takeshita)、Circulation, 90:228〜234(1994)
タケシタら(Takeshita)、J. Clin. Invest., 93:662〜70(1994)
ヤナギサワ-ミワ(Yanagisawa-Miwa)ら、Science, 257:1401〜1403(1992)
バファーら(Baffour)、J. Vasc Surg, 16:181〜91(1992)
プら(Pu)、J. Surg. Res., 54:575〜83(1993)
タケシタら(Takeshita)、Laboratory Investigation, 75:487〜502(1996)
アイスナーら(Isner)、Lancet, 348:370(1996)
ツルミら(Tsurumi)、Circulation, 94(12):3281〜3290(1996)






血管新生を制御する手段、従来の方法では血管新生を促進することが難しかった例えば高齢者など特定の被験者集団における血管新生をも促進し、また所定の部位での血管新生をより正確に制御する手段の提供が望まれていた

効果

実績

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牽制数
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請求項1

CD34+またはFlk−1+内皮前駆細胞またはその改変型を含有する、血管新生に関連した疾患治療用の血管新生制御剤

請求項2

制御が血管新生の減少である、請求項1記載の剤。

請求項3

制御が血管新生の増強である、請求項1記載の剤。

請求項4

細胞が血管新生を阻害する化合物を含むよう改変されている、請求項2記載の剤。

請求項5

内皮前駆細胞が改変された内皮細胞であって、該細胞が内皮細胞マイトゲン発現するよう改変されている、請求項3記載の剤。

請求項6

内皮細胞マイトゲンまたは内皮細胞マイトゲンをコードする核酸をさらに含む、請求項1記載の剤。

請求項7

請求項8

化合物が細胞障害性化合物である、請求項4記載の剤。

請求項9

化合物が血管新生阻害剤である、請求項4記載の剤。

請求項10

内皮細胞マイトゲンが、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、上皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ、血小板由来内皮増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、マクロファージ-CSF、顆粒球/マクロファージCSFおよび酸化窒素シンターゼからなる群より選択される、請求項6記載の剤。

請求項11

内皮細胞マイトゲンが血管内皮増殖因子である、請求項10記載の剤。

請求項12

疾患がリウマチ性関節炎乾癬、眼の血管新生、糖尿病性腎症血管新生緑内障、または血管新生依存的腫瘍もしくは腫瘍転移である、請求項2記載の剤。

請求項13

疾患が脳血管虚血腎虚血虚血、脚の虚血、虚血性心筋症、および心筋虚血である、請求項3記載の剤。

請求項14

カテーテルによる虚血部位特異的輸送用のものである請求項1ないし13の何れかの請求項記載の血管新生制御剤。

請求項15

カテーテルによる虚血部位特異的輸送用の生理学的に許容される投与剤形での請求項1ないし14の何れかの請求項記載の血管新生制御剤。

請求項16

患者において虚血組織の有無をスクリーニングするための標識したCD34+またはFlk−1+内皮前駆細胞を含有する剤を含有する請求項1ないし15の何れかの請求項記載の血管新生制御剤。

請求項17

CD34+またはFlk−1+内皮前駆細胞が循環末梢血から単離されたものである請求項16記載の血管新生制御剤。

請求項18

CD34+またはFlk−1+内皮前駆細胞が単核血球細胞である請求項17記載の血管新生制御剤。

請求項19

内皮細胞マイトゲンをコードする核酸をさらに含む、請求項請求項1ないし18の何れかの請求項記載の血管新生制御剤。

請求項20

CD34+またはFlk−1+内皮前駆細胞および内皮細胞マイトゲンまたは同物質をコードする核酸を患者へのインビボでのカテーテルによる虚血部位特異的輸送用キットであって、担体溶液と、CD34+またはFlk−1+内皮前駆細胞と、内皮細胞マイトゲンをコードする核酸または内皮細胞マイトゲンと、輸送手段としてのカテーテルとを含むキット。

請求項21

CD34+またはFlk−1+内皮前駆細胞が循環末梢血から単離されたものである請求項20記載のキット。

請求項22

CD34+またはFlk−1+内皮前駆細胞が単核血球細胞である請求項21記載のキット。

技術分野

0001

本発明は、血管新生を制御する方法及び剤に関するものである。

背景技術

0002

血管は、酸素および栄養素生体組織に供給し、生体組織から老廃物を除去する手段である。血管新生は、例えばフォークマンシング(Folkman and Shing、J. Biol. Chem. 267(16)、10931〜10934(1992))による総説に述べられているように、それによって新しい血管が形成されるプロセスである。このように血管新生は重要なプロセスである。これは、再生発達および創傷修復において不可欠である。しかし、血管新生が不適当であれば、重大な結末を生じうる。例えば、血管新生の結果として多くの固形腫瘍に血管が通じて初めて腫瘍は急速に増殖し始め、転移し始める。血管新生はこれらの機能に対して非常に重要であるため、健康を維持するためには注意深く制御しなければならない。血管新生プロセスは、血管内皮増殖因子VEGF)および塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)のようなマイトゲンによって活性化された内皮細胞(EC)から分泌されたプロテアーゼによって基底膜崩壊と共に始まると考えられている。細胞遊走して増殖し、間質間隙に塊状の内皮細胞を形成し、その後血管ループが形成されて、密な接合部が形成され、新しい基底膜が形成されて毛細管が発達する。
成人では、内皮細胞の増殖速度は、体内の他の細胞タイプと比較して典型的に低い。これらの細胞の代謝回転時間は1000日を超えることがある。厳密な制御下で血管新生の結果急速な増殖が起こる生理学例外は、女性生殖器創傷治癒の際に認められる。
血管新生の発生には、微小血管増殖の陽性および陰性制御間の局所平衡の変化を必要とする。生体が血管新生に対するそのコントロールを失うと、異常な血管新生が起こり、血管増殖過度または不十分となる。例えば、潰瘍、脳卒中および心臓発作のような状態は、自然治癒に通常必要な血管新生が存在しないことに起因する可能性がある。これに対し、過剰な血管増殖は、腫瘍の増殖および転移、失明乾癬ならびにリウマチ性関節炎にとって都合がよい可能性がある。
血管新生増殖因子の持つ治療的意味は最初に、フォークマンとその同僚によって20年前に記述された(Folkman、N. Engl. J. Med., 285:1182〜1186(1971))。このように、創傷および潰瘍の治癒の場合のように、程度の大きい血管新生が望ましい場合がある。最近の研究から、心筋梗塞および後肢虚血動物モデルタケシタら(Takeshita)、Circulation, 90:228〜234(1994)およびタケシタら(Takeshita)、J. Clin. Invest., 93:662〜70(1994))において、側副動脈発達を促進および/または増強するために、繊維芽細胞増殖因子(FGF)ファミリーヤナギサワ-ミワ(Yanagisawa-Miwa)ら、Science, 257:1401〜1403(1992)、およびバファーら(Baffour)、J. Vasc Surg, 16:181〜91(1992))、内皮細胞増殖因子ECGF)(プら(Pu)、J. Surg. Res., 54:575〜83(1993))、およびより最近では血管内皮増殖因子(VEGF)のような組換え型血管新生増殖因子を用いることが実際に可能であることが確立された。
逆に、血管新生の阻害が望ましい場合もある。例えば、多くの疾患は、持続的な制御されない血管新生によって進行する。関節炎では、新しい毛細血管が関節に侵入し、軟骨破壊する。糖尿病では、新しい毛細管が硝子体に侵入して、出血し、失明を起こす。目の血管新生は最も一般的な失明の原因である。腫瘍の増殖および転移は血管新生に依存する。腫瘍は、自身が増殖するためには新しい毛細血管の増殖を絶えず刺激しなければならない。
これらの疾患に対する現在の治療法は適切でない。持続的な血管新生を予防する薬物、例えば薬剤(TNP-470)、モノクローナル抗体、およびアンチセンス核酸が現在試験中である。しかし、血管新生を阻害する新規薬剤が必要である。
最近、血管新生を制御する遺伝子療法の実現が可能であることが示されている。例えば、虚血の治療における血管新生の促進は、ウサギモデルおよび遺伝子輸送系としてハイドロゲルコーティング血管形成術バルーンを用いたVEGFによるヒトの臨床試験において証明された。血管壁へのVEGF遺伝子の移入成功し、持続的に発現させると、その後、虚血した後肢に血管新生が増強された(タケシタら(Takeshita)、Laboratory Investigation, 75:487〜502(1996);アイスナーら(Isner)、Lancet, 348:370(1996))。さらに、VEGFをコードするDNAを虚血組織に直接筋肉内注射すると、虚血組織の血管が増加し、血管新生を誘発することが証明された(ツルミら(Tsurumi)、Circulation, 94(12):3281〜3290(1996))。
血管新生を制御するもう一つの方法は、多くの理由からさらに望ましい。例えば、本来の内皮細胞(EC)の数および/または生存率は経時的に減少すると考えられている。このように、特定の患者集団、例えば高齢者では、投与した血管新生サイトカインに反応することができるECの定住集団は限られている可能性がある。
その上、血管新生を促進または抑制する物質は、ある部位では有用であるかも知れないが、それらは別の部位では望ましくない可能性がある。このように、所定の部位での血管新生をより正確に制御する手段が望ましい。

先行技術

0003

フォークマン&シング(Folkman and Shing、J. Biol. Chem. 267(16)、10931〜10934(1992))
Folkman、N. Engl. J. Med., 285:1182〜1186(1971)
タケシタら(Takeshita)、Circulation, 90:228〜234(1994)
タケシタら(Takeshita)、J. Clin. Invest., 93:662〜70(1994)
ヤナギサワ-ミワ(Yanagisawa-Miwa)ら、Science, 257:1401〜1403(1992)
バファーら(Baffour)、J. Vasc Surg, 16:181〜91(1992)
プら(Pu)、J. Surg. Res., 54:575〜83(1993)
タケシタら(Takeshita)、Laboratory Investigation, 75:487〜502(1996)
アイスナーら(Isner)、Lancet, 348:370(1996)
ツルミら(Tsurumi)、Circulation, 94(12):3281〜3290(1996)

発明が解決しようとする課題

0004

血管新生を制御する手段、従来の方法では血管新生を促進することが難しかった例えば高齢者など特定の被験者集団における血管新生をも促進し、また所定の部位での血管新生をより正確に制御する手段の提供が望まれていた。

課題を解決するための手段

0005

本発明者らは、HSCに用いられているものと同様の技法を用いて、EC前駆体を循環血中から単離できることを見出した。インビトロでは、これらの細胞はECに分化する。実際に、適当な薬剤を加えてECに分化するのであれば、それらがECになることができる限り、多能性未分化細胞を用いることができる。
本発明者らはまた、インビボで、異種、同種、および自家EC前駆体移植片が、活性な血管新生または血管損傷部位に取り込まれること、すなわちそれらが選択的にそのような部位に遊走することを見出した。この知見は驚くべきことであった。したがって、本発明によってそのような部位を標的とすることができる。
本発明は、選択した部位で血管新生の速度変化を必要とする選別患者における血管新生を制御する方法を提供する。血管新生に必要な変化は、血管新生の減少または増強であってもよい。これは治療すべき疾患によって決定される。本発明の方法に従って、望ましい結果を達成するために内皮前駆細胞またはその改変型の有効量を患者に投与する。
例えば、リウマチ性関節炎、乾癬、目の血管新生、糖尿病性腎症血管新生緑内障、血管新生依存型腫瘍および腫瘍の転移のような疾患の治療において、望ましくない血管新生を減少させるために、血管新生を阻害する化合物、例えば細胞毒性化合物または血管新生阻害剤を含むよう改変された改変内皮細胞を投与することができる。
例えば脳血管虚血、腎虚血虚血、脚の虚血、虚血性心筋症および心筋虚血の治療において血管新生を増強するためには、内皮前駆細胞を投与する。血管新生をさらに増強するためには、内皮細胞マイトゲンを発現するよう改変した内皮前駆細胞を用いてもよい。さらに、内皮細胞マイトゲンまたは内皮細胞マイトゲンをコードする核酸をさらに投与することができる。
もう一つの態様において、本発明は、血管新生の増強または損傷血管の治療法を提供する。これらの方法に従って、内皮前駆細胞を患者、好ましくは末梢血から単離し、これを患者に再投与する。患者はまた、内皮細胞増殖に対する内皮細胞マイトゲンで治療してもよい。バルーン血管形成術血管内ステントまたは血管移植片留置の結果、血管損傷が起こりうる。
本発明はまた、患者における虚血組織または血管損傷の有無をスクリーニングする方法を提供する。該方法は、標識したEC前駆細胞に患者を接触させ、虚血組織または血管損傷部位で標識細胞を検出することを含む。
本発明はまた、本明細書に記述の方法において予想される全ての用途のための薬学的産物およびキットを含む。
本発明のその他の局面は下に開示する。

発明の効果

0006

本発明に従って、EC前駆体を用い選択した患者においておよび特定の部位に標的輸送するいくつかの好ましい態様において、血管新生を制御する方法、すなわち血管形成を増強または阻害する方法を提供できる。例えば、EC前駆体は、血管新生を増強するために、または血管新生阻害剤、例えば抗−もしくは親−血管新生剤をそれぞれ、病理学的もしくは実利的血管新生部位に輸送するために用いることができる。さらに、もう一つの態様において、EC前駆体は、損傷血管の内皮再形成誘導することができ、このように平滑筋細胞増殖を間接的に阻害することによって再狭窄を減少させるために用いることができる。

図面の簡単な説明

0007

図1A〜1Gは、細胞の形状および形成を示す。図1Aは、標準培地と共にフィブロネクチン上にMBCD34+を播種した7日後の紡錘形接着細胞ATCD34+)を示す(10)。DiI色素モレキュラープローブ社)で標識したMBCD34+および非標識MBCD34−(1:100の比)の共培養をフィブロネクチンコーティング皿に播種した48時間後にネットワーク形成(1B)およびコード様構造(1C)を認めた。これらのコードは主にDiI標識MBCD34+由来細胞(ATCD34+)を含んだ。共培養後最初の12時間に、MBCD34+由来細胞はクラスタを形成して多数の状塊を示した(1D、1E)。ATCD34+は辺縁部分から発芽するが、丸い細胞は中心部に残り、数日後にクラスタから離れる。5日後、acLDL-DiI(モレキュラー・プローブ社)の取り込みがATCD34+の辺縁部で認められたが、クラスタの中心部では認められなかった(1F、1G)。
図2は、プラスチックのみ(CD34+/non)、コラーゲンコーティング(CD34+/COL)、またはフィブロネクチン(CD34+/FN)上のMBCD34+およびフィブロネクチン上のMBCD34−(CD34-/FN)の単培養の12時間および3日後のATCD34+細胞数を示す。ATCD34+は、フィブロネクチン上に播種すると12時間および3日目での細胞数が有意に多かった(p<0.05、ANOVAによる)。
図3は、新たに単離したMBCD34+、培養7日後のATCD34+、およびHUVECのFACS分析を示す。細胞をCD34、CD31(バイオデザイン社);Flk-1、Tie-2(サンタクルズ・バイオテクノロジー社);およびCD45に対する抗体を用いてFITCで標識した。結果は全て、3回の実験によって確認した。それぞれの箱の中の黒い部分は陰性抗原ゲートを指し、白い部分は陽性ゲートを指す。個々のゲートに示す数値は、対応する陰性対照標識と比較して決定した細胞の百分率を示す。
図4は、MBCD34−、MBCD34+、ATCD34+、ヒト冠動脈平滑筋細胞(HCSMC)およびHUVECにおけるecNOSmRNAの発現を示す。DNAはそれぞれ1×106個までの細胞から逆転写した。得られた各DNAを、ecNOS mRNAを検出するために、プライマー対センスアンチセンス:AAG ACATTTTCGGGCTCA CGCTGCGCACCC/TGG GGTAGG CAC TTT AGT AGT TCTCCTAAC、配列番号:1)を用いてPCR(40サイクル)によって増幅した。増幅産物のそれぞれを1%アガロースゲル上で分析した。1本のバンドのみが認められ、これはecNOSの予想される大きさ(548 bp)に対応した。レーン1=MBCD34−、レーン2=MBCD34+、レーン3=3日後のATCD34+、レーン4=7日後のATCD34+、レーン5=HCSMC、レーン6=HUVEC。
図5は、ATCD34+からのNO放出を、NO測定器(Iso-NO、ワールドプレシジョンインストルメンツ社)に接続したNO特異的ポーラログラフィー電極で測定したことを示すグラフである(17)。NO電極の較正は、以下の式:2KNO2+2KI+2H2SO4→2NO+I2+2H2O+2K2SO4、に従って実験プロトコルの前に毎日実施した。標準的な較正曲線は、KIおよびH2SO4を含む較正溶液にKNO2の漸増濃度(0〜500 nmol/L)を加えて得た。NOに対する電極の特異性は、基準NOガスからNOを測定することによって既に報告されている(18)。6ウェルプレートで培養したATCD34+を洗浄し、次に濾過したクレブス・ヘンセレイト溶液5mlに浸した。細胞プレートスライド加温器ラブライン・インストルメンツ社)上に置き、温度を35〜37℃に維持した。NO測定のために、センサープローブウェルに垂直に挿入して、電極の先端を溶液表面から2mm下にした。NOの測定は、pmol/105細胞として標記し、VEGF(1、10、100 ng/ml)およびAch(0.1、1、10 μM)の漸増用量を加えたウェルにおいて行った。HUVECおよびウシ大動脈ECを陽性対照として用いた。陰性対照としてのHCSMCでは、NOは検出できなかった。報告された全ての値は各群10測定の平均値として表す。
図6A〜6Dは、MBCD34+とHUVECの共培養を示す。新しく単離したMBCD34+をDiI色素で標識し、密度278個/mm2でフィブロネクチンコーティングチャンバースライド(ヌンク社)に接着したコンフルエントHUVEC単層上に播種した。MBCD34+から紡錘形の接着細胞(ATCD34+)への分化は12時間以内にHUVECに認められた(6A)。ATCD34+細胞数は単層上で3日間増加し(6B)、網目構造が部分的に認められた(6C)。共培養の3日後、双方の細胞をマトリゲル(ベクトン・ディキンソン社)コーティングスライド上に再度播種すると、12時間以内にDiI-標識ATCD34+およびHUVECを含む毛細管ネットワーク構造が示された(6D)。
図7は、HUVECをTNF-α(20 ng/ml)で12時間前処置することによって、および/またはATCD34+/HUVEC共培養をVEGF(50 ng/ml)とインキュベートすることによって調べた、MBCD34+分化に及ぼす活性化ECおよびVEGFの作用を示す。
図8A〜8Kは、インビボで異種(図8A〜8H)、同種(8I)、および自家(8J、8K)EC前駆細胞を投与した後の虚血後肢から回収した切片の図である。(8A、8B)DiI-標識MBCD34+を注射後6週間の小さい筋肉動脈における赤色蛍光(|||)。緑色蛍光(\\\)はEC特異的レクチンUEA-1を指す。(8C)DiI-標識MBCD34+注射後4週間に2重フィルターを通して写真撮影した、筋の間の毛細管におけるDiI(赤色)およびCD31(緑色)。(8D)CD31を発現する宿主毛細管構造に取り込まれたMBCD34+によるCD31発現を示す、(C)と同じ毛細管構造。(8E、8F)MBCD34+注射後2週間の免疫染色は、tie-2受容体(緑色蛍光)を発現するDiI-標識MBCD34+由来細胞を含む毛細管を示す。ほとんどのMBCD34+由来細胞はtie-2陽性で、赤色蛍光がないことによって特定されるtie-2陽性の本来の(宿主)毛細管細胞に取り込まれている。(8G、8H)DiI-標識MBCD34−の注射後2週間。単離したMBCD34−由来細胞(赤色)は筋の間に認めることができるが、これらの細胞はCD31を発現しない。 (8I)βガラクトシダーゼトランスジェニックマウスから単離したMBFlk−1+を投与後4週間のB6,129マウスの虚血した脚から採取した筋の免疫組織化学βガラクトシダーゼ染色。βガラクトシダーゼを過剰発現している細胞(矢印)は毛細管および小動脈に取り込まれている;これらの細胞は抗CD31抗体およびBS-1レクチンによってECであると特定された。 (8J、8K)自家MBCD34+を投与後4週間でのウサギ虚血後肢から採取した筋肉切片。DiI蛍光(J)は、位相差顕微鏡写真において認められる毛細管中のMBCD34+由来細胞の位置を示す(8K)。各尺度棒は50μmを示す。
図8A〜8Kは、インビボで異種(図8A〜8H)、同種(8I)、および自家(8J、8K)EC前駆細胞を投与した後の虚血後肢から回収した切片の図である。(8A、8B)DiI-標識MBCD34+を注射後6週間の小さい筋肉内動脈における赤色蛍光(|||)。緑色蛍光(\\\)はEC特異的レクチンUEA-1を指す。(8C)DiI-標識MBCD34+注射後4週間に2重フィルターを通して写真撮影した、筋の間の毛細管におけるDiI(赤色)およびCD31(緑色)。(8D)CD31を発現する宿主毛細管構造に取り込まれたMBCD34+によるCD31発現を示す、(C)と同じ毛細管構造。(8E、8F)MBCD34+注射後2週間の免疫染色は、tie-2受容体(緑色蛍光)を発現するDiI-標識MBCD34+由来細胞を含む毛細管を示す。ほとんどのMBCD34+由来細胞はtie-2陽性で、赤色蛍光がないことによって特定されるtie-2陽性の本来の(宿主)毛細管細胞に取り込まれている。(8G、8H)DiI-標識MBCD34−の注射後2週間。単離したMBCD34−由来細胞(赤色)は筋の間に認めることができるが、これらの細胞はCD31を発現しない。 (8I)βガラクトシダーゼトランスジェニックマウスから単離したMBFlk−1+を投与後4週間のB6,129マウスの虚血した脚から採取した筋の免疫組織化学βガラクトシダーゼ染色。βガラクトシダーゼを過剰発現している細胞(矢印)は毛細管および小動脈に取り込まれている;これらの細胞は抗CD31抗体およびBS-1レクチンによってECであると特定された。 (8J、8K)自家MBCD34+を投与後4週間でのウサギ虚血後肢から採取した筋肉切片。DiI蛍光(J)は、位相差顕微鏡写真において認められる毛細管中のMBCD34+由来細胞の位置を示す(8K)。各尺度棒は50μmを示す。
図9は、EC前駆細胞が露出した動脈表面に接着し、内皮細胞を思わせる形態を見せることを示す走査型電子顕微鏡写真からの写真である。

0008

本発明者らは血管新生を制御し、特定の被験者集団における血管新生を促進し、および特定の組織をより正確に標的とする手段を見出した。これらの方法は全て内皮細胞前駆体を用いることを含む。一つの好ましい前駆細胞は血管芽細胞である。
生後の血管新生は、既存の本来の血管に由来する完全に分化した内皮細胞(EC)の増殖、遊走、および再形成に全面的に起因すると考えられている(1)。この成人での例を、脈管形成とは区別して血管新生と呼び、この用語はEC前駆細胞からの胎児血管の形成に適用される(2)。
血管新生とは対照的に、脈管形成は、その辺縁にEC前駆細胞(例えば血管芽細胞)および中心部に造血幹細胞(HSC)を含むクラスタ形成または血中島様物として始まることが典型である(3)。この密接な予測可能空間的関係に加えて、そのようなEC前駆細胞およびHSCは、flk-1、tie-2、およびCD-34を含む特定の共通する抗原決定因子共有する。その結果、これらの前駆細胞は、共通の仮説的前駆体である血管芽細胞(ヘマンギオブラスト)に由来すると解釈されている。

0009

末梢血に由来するHSCを移植すると、持続的な造血回復を得ることができるという証明は、循環中の幹細胞に関する推論的な証拠となり得る(5)。この知見は現在、骨髄移植代わるものとして臨床的に利用されている。
本発明者らはHSCについて用いられている技法と同様の技法を用いて、EC前駆細胞を循環中の血液から単離できることを見出した。インビトロでは、これらの細胞はECに分化する。実際に、本発明者らは、適当な薬剤を加えてそれがECに分化するのであれば、なおもそれがECになることができる限り、多能性未分化細胞を用いることができる。
本発明者らはまた、インビボで、異種、同種および自家EC前駆細胞移植片が活性な血管新生または血管損傷部位に取り込まれること、すなわちそれらがそのような部位に選択的に遊走することも見出した。この知見は驚くべきことであった。従って、本発明によってそのような部位を標的にすることができる。
本発明によれば、EC前駆体は、選択した患者および特殊な部位を目標にするための何らかの好ましい態様において、血管新生を制御する方法、すなわち血管形成を増強または阻害する方法に用いることができる。例えば、EC前駆体は、血管新生を増強するために、または血管新生制御剤、例えば抗−もしくは親−血管新生剤をそれぞれ病変部位もしくは実利的血管新生部位に輸送するために用いることができる。さらに、もう一つの態様においてEC前駆体は、損傷した血管の内皮再形成を誘発し、このように平滑筋細胞増殖を間接的に阻害することによって再狭窄を減少させるために用いることができる。

0010

一つの好ましい態様において、EC細胞を単独で用いて患者の血管新生を増強することができる。何らかの患者集団、典型的に高齢患者はECの数が限られているか、または機能的ECの数が限られている可能性がある。このように例えば、VEGFのような強力な血管新生促進剤を用いることによって血管形成を刺激したいと思っても、そのような血管形成はEC欠乏のために制限されることがある。しかし、EC前駆体を投与すれば、そのような患者における血管形成を増強することができる。
したがって本方法により、虚血組織の血管新生の促進のような、血管新生を制御するようデザインされた広い範囲の戦略が可能となる(24)。例えば、VEGFおよびbFGFのようなECマイトゲンは、本来のECの増殖、遊走、再形成を刺激して、それによって親血管からの新たな新芽(sprout)を形成するために用いられている(25)。そのような治療例においておそらく制限因子となる可能性があるのは、投与した血管新生サイトカインに反応する能力を有するEC定住集団である。NO産生年齢関数として減少するという知見(26)は、EC数の減少および/または生存率の減少を示す可能性があるが、これは自家EC移植によって対処することができる。末梢血に由来するHSCの自家移植に関して今日までに示された成功(5)から、治療的血管新生に対する「供給側の」アプローチが臨床で実現可能であることが支持される。本明細書において示されるインビボデータは、自家EC移植が実現可能であることを示し、インビトロ実験は、EC前駆体(MBCD34+由来EC)がエクスビボで容易に操作でき、増殖させることができることを示している。

0011

これらのEC前駆体が血管新生の塊部分に移動するという本発明者らの知見によって、これらの細胞は、遺伝子治療の自家ベクターとして、および虚血または血管損傷の診断に有用である。例えば、これらの細胞は血管新生を増強すると共に阻害するために用いることができる。例えば、抗新生物療法では、EC前駆細胞は、細胞障害剤、サイトカイン、または免疫反応を刺激する共刺激分子、その他の抗癌剤、または血管新生阻害剤と共に、または結合させてトランスフェクトすることができる。限局性虚血の治療には、血管新生サイトカインおよび/または選択したマトリクス蛋白の構成的な発現を得るために、EC前駆体を先にトランスフェクトすることによって血管新生を増幅することができる(27)。さらに、EC前駆体は例えば、放射性標識によって標識し、患者に投与して虚血組織または血管損傷の検出に用いてもよい。

0012

EC前駆体は、治療前の患者の末梢血または骨髄から得たヒト単核球細胞から得てもよい。EC前駆体はまた、異種または自家臍帯血から得てもよい。末梢血は簡便であるため好ましい。末梢血の白血球分画は最も好ましい。EC前駆体は、未成熟ヒト造血前駆細胞(HSC)上に存在するEC前駆体特異抗原を認識する抗体を用いて単離してもよい。例えば、CD34はEC前駆体およびHSCに共通して認められる。CD34は全てのHSCに発現されているが、造血幹細胞では分化すると失われる(6)。これはまた、成人において、最も活性化されたECを含む多くのECによって発現される(7)。血管内皮増殖因子(VEGF)の受容体であるFlk-1(8)もまた、初期HSCおよびECの双方によって発現されるが、造血分化の過程において発現されなくなる(9)。
末梢血からEC前駆体を得るためには、約5 ml〜約500 mlを患者から採血する。好ましくは約50 ml〜約200 mlの血液を採取する。
EC前駆体はインビボで、前駆細胞を採取する前に、漸増(recruitment)増殖因子、例えばGM-CSFおよびIL-3を患者に投与することによって増殖させることができる。
自家移植において造血前駆細胞を得てこれを用いる方法は、その開示が本明細書に参照として組み入れられる、米国特許第5,199,942号に開示されている。
特定の分離法によって前駆細胞が得られれば、例えば制御されない血管新生または血管損傷を含む多くの疾患を治療するために選択した患者にそれらを投与してもよい。細胞はまた、低温条件で保存してもよい。選択的に、細胞は例えば、その開示が参照として組み入れられる、米国特許第5,541,103号に開示されている方法を用いてエクスビボで増殖させてもよい。
前駆細胞は、例えば静脈内注入、大量1回投与、およびカテーテルによる部位指向性輸送を含む如何なる適した手段によっても患者に投与される。好ましくは患者から得た前駆細胞を再投与する。一般に約106〜約1018個の前駆細胞を移植のために患者に投与する。

0013

前駆細胞の用途に応じて、様々な遺伝子材料を細胞に輸送してもよい。EC前駆体に輸送される遺伝子材料は、例えば、抗癌剤を含む様々な蛋白をコードする遺伝子である。そのような遺伝子には、様々なホルモン、増殖因子、酵素、サイトカイン、受容体、MHC分子等をコードする遺伝子が含まれる。「遺伝子」という用語は、その中にウイルスベクター、例えば、ヒトTNF遺伝子を含むブタポックスウイルスのようなポックスウイルスを導入してもよい細胞に対して外因性および内因性である核酸配列を含む。さらに、遺伝子によってコードされる蛋白によって全身作用を得るために、EC前駆体から分泌させるポリペプチドをコードする遺伝子を用いることも興味深い。興味深い特殊な遺伝子には、TNF、TGF-α、TGF-β、ヘモグロビンインターロイキン-1、インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロイキン-4、インターロイキン-5、インターロイキン-6、インターロイキン-7、インターロイキン-8、インターロイキン-9、インターロイキン-10、インターロイキン-11、インターロイキン-12等、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、ヒト成長因子共刺激因子B7、インスリン、第VIII因子、第IX因子、PDGF、EGF、NGF、IL-ira、EPO、βグロビン、ECマイトゲン等をコードする遺伝子と共に、これらの蛋白の生物学的に活性な突然変異蛋白質が含まれる。遺伝子はさらに、もう一つの遺伝子産物の発現を制御する、または生物学的経路の1つもしくは複数の段階を遮断する産物をコードしてもよい。さらに、遺伝子はポリペプチド、例えば受容体リガンドと融合した毒素、または腫瘍細胞のような標的に毒素を指向させる抗体をコードしてもよい。同様に遺伝子は、疾患組織または器官治療効果を送るために、標的輸送ポリペプチドと融合させた治療蛋白をコードしてもよい。
細胞はまた、特定の疾患または腫瘍と闘う免疫系の能力を増強する遺伝子を輸送するために用いることができる。例えば、細胞は、免疫系を強めるための1つ以上のサイトカイン(例えばIL-2)および/または1つ以上の抗原を輸送するために用いることができる。
これらの細胞はまた、O-クロロアセチルカルバモイルフマギロール(TNP-470)のような抗血管新生化合物のような薬剤を選択的に投与するために用いてもよい。好ましくは薬剤はリポソーム、一定時間放出カプセル等のような媒体を用いて細胞に組み入れられる。次にEC前駆体は、急速に増殖する腫瘍のような活性血管新生部位を選択的にめざし(hone in)、そこで化合物を放出すると考えられる。この方法によって、その他の部位での望ましからぬ副作用を減少することができる。
一つの態様において、本発明は虚血組織、すなわち虚血性疾患の結果として血液の欠乏をきたしている組織における血管形成を増強するために用いてもよい。そのような組織は例えば、筋肉、脳、腎臓および肺を含むことができる。虚血性疾患には、例えば脳血管虚血、腎虚血、肺虚血、脚の虚血、虚血性心筋症および心筋虚血が含まれる。

0014

血管新生をさらに増強することが望ましい場合、内皮細胞マイトゲンはまた、EC前駆細胞の投与と共に、またはその後で患者に投与してもよい。内皮細胞マイトゲンは直接、例えば動脈内、筋肉内、もしくは静脈内に投与することができ、またはマイトゲンをコードする核酸を用いてもよい。バファーら(Baffour)、前記(bFGF);プら(Pu)、Circulation, 88:208〜215(1993)(aFGF);ヤナギサワ−ミワ(Yanagisawa-Miwa)ら、前記(bFGF);フェラーラら(Ferrara)、Biochem. Biolphys. Res. Commun., 161:851〜855(1989)(VEGF);(タケシタら(Takeshita)、Circulation, 90:228〜234(1994))を参照のこと。
ECマイトゲンをコードする核酸は、その開示が本明細書に参照として組み入れられる、米国特許出願第08/675,523号に記述のように、虚血組織を還流する血管または血管損傷部位に、カテーテル、例えばハイドロゲルカテーテルを通じて投与することができる。核酸はまた、米国特許出願第08/545,998号に記述の方法を用いて虚血組織内への直接注射によって輸送することができる。
本明細書で用いられるように、「内皮細胞マイトゲン」という用語は、直接または間接的に内皮細胞の増殖を誘発することができる如何なる蛋白、ポリペプチド、突然変異蛋白質、またはその一部をも意味する。そのような蛋白には例えば、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子(aFGFおよびbFGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ(TGF-αおよびβ)、血小板由来内皮増殖因子(PD-ECGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、肝細胞増殖因子HGF)、インスリン様増殖因子(IGF)、エリスロポエチンコロニー刺激因子(CSF)、マクロファージ-CSF(M-CSF)、顆粒球/マクロファージCSF(GM-CSF)、および酸化窒素シンターゼ(NOS)が含まれる。クラグスブルンら(Klagsbrun)、Annu. Rev. Physiol., 53:217〜239(1991);フォークマンら(Folkman)、J. Biol. Chem., 267:10931〜10934(1992)、およびサイムスら(Symes)、Current Opinion in Lipidology, 5:305〜312(1994)を参照のこと。突然変異蛋白質またはマイトゲンの断片は、それらがEC細胞増殖を誘発または促進する限り用いてもよい。

0015

好ましくは、内皮細胞マイトゲンは、蛋白の分泌を容易にする分泌性シグナル配列を含む。本来のシグナル配列を有する蛋白、例えばVEGFが好ましい。本来のシグナル配列を有しない蛋白、例えばbFGFは、ルーチン遺伝子操作技法を用いてそのような配列を含むように改変することができる。ナベルら(Nabel)、Nature, 362:844(1993)を参照のこと。
無数の内皮細胞マイトゲンのヌクレオチド配列は、多くのコンピューターデータベース、例えばゲンバンクEMBLおよびスイスプロットを通じて容易に入手できる。この情報を用いて、所望の部分をコードするDNAセグメント化学的に合成してもよく、またはそのようなDNAセグメントを当技術分野におけるルーチン技法、例えばPCR増幅を用いて得てもよい。VEGFをコードするDNAは、その開示が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,332,671号に開示されている。
特定の状況では、治療転帰を最適にするために、2つ以上の異なる蛋白をコードする核酸を用いることが望ましいかも知れない。例えば、2つの蛋白、例えばVEGFとbFGFをコードするDNAを用いることができ、これらはbFGF単独で用いる場合より改善を示す。または血管新生因子は、標的とする細胞の活性を増強するために、血管新生を同時に誘発しながら、例えば酸化窒素シンターゼ、L-アルギニン、フィブロネクチン、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子およびヘパリンを含む、他の遺伝子またはそれらがコードする遺伝子産物と併用することができる。

0016

「有効量」という用語は、化合物の十分量、例えば内皮細胞マイトゲンの適当なレベル、すなわち、内皮細胞増殖を誘発および/または血管新生を誘導することができるレベル、を生じるよう輸送される核酸の十分量を意味する。このように重要な局面は発現されるマイトゲンのレベルである。したがって、多数の転写物を用いることができ、またはその結果高レベル発現が起こるプロモーターの調節下で遺伝子を用いることができる。もう一つの態様において、遺伝子は、極めて高レベルの発現が起こるような因子の調節下、例えばtatおよび対応するtar要素の調節下にあると考えられる。
EC前駆体はまた、エクスビボで細胞が血管新生を阻害するように改変してもよい。これは例えば、例えば本明細書において記述の遺伝子移入技法を用いて、血管新生阻害剤をコードするDNAを細胞に導入することによって行うことができる。血管新生阻害剤には、例えばトロンボスポンジン(ダメロンら(Dameron)、Science 265:1582〜1584(1994))のような蛋白、アンジオスタチン(オレイリーら(O'Reilly)、Cell 79:315〜328(1994))、IFN-α(フォークマン(Folkman)、J. Nature Med. 1:27〜31(1995))、トランスフォーミング増殖因子β、腫瘍壊死因子α、ヒト血小板第4因子(PF4);基底膜の貫通に必要となるプロテアーゼを阻害するプロテイナーゼ阻害剤、特にメタロプロテイナーゼTIMP-1およびTIMP-2の組織阻害剤のような、細胞遊走を抑制する物質;ならびに血管抑制的特性を示すプロタミンおとり受容体、アンジオインヒビンフマギリン類似体のような薬物、例えばTNP-470(インバーら(Ingber)、Nature 348:555〜557(1990))、VEGFのような血管新生サイトカインに対する抗体またはアンチセンス核酸が含まれる。または、細胞はそのような血管新生阻害剤とカップリングさせてもよい。

0017

血管新生が新生物の増殖に関連している場合、EC前駆細胞はまた、抗腫瘍剤または免疫系を増強する物質をコードする核酸でトランスフェクトしてもよく、またはこれらとカップリングさせてもよい。そのような物質には、例えばTNF、インターロイキン(IL)(例えば、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12)、インターフェロン(IFN)(例えば、IFN-γ)、および共刺激因子(例えばB7)のようなサイトカインが含まれる。好ましくは例えばTNFおよびIL-2を同時に輸送する多価ベクターを用いる。
核酸は、その結果細胞による核酸の取り込みおよび発現が起こるような如何なる方法によってもEC前駆体に導入される。これらの中には、ベクター、リポソーム、核DNAアジュバント補助DNA、カテーテル、遺伝子銃等が含まれる。ベクターには、国際公開公報第93/04701号に記載のような、標的輸送部分(例えば、細胞表面受容体へのリガンド)および核酸結合部分(例えば、ポリリジン)を有する化学結合体、ウイルスベクター(例えばDNAまたはRNAウイルスベクター)、PCT/US95/02140号(国際公開公報第95/22618号)に記述のような、標的部分(例えば標的細胞に特異的な抗体)および核酸結合部分(例えばプロタミン)を含む融合蛋白である融合蛋白、プラスミドファージ等が含まれる。ベクターは染色体、非染色体または合成ベクターであることができる。

0018

好ましいベクターには、ウイルスベクター、融合蛋白および化学結合体が含まれる。レトロウイルスベクターには、モロニーマウス白血病ウイルスおよびHIV-種のウイルスが含まれる。一つの好ましいHIV-種のウイルスベクターは、gagおよびpol遺伝子がHIVゲノムに由来し、env遺伝子が別のウイルスに由来する少なくとも2つのベクターを含む。DNAウイルスベクターが好ましい。これらのベクターには、オルトポックスまたはアビポックスベクターのようなポックスベクター、I型単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターのようなヘルペスウイルスベクター[ゲラーら(Geller, A.I.)、J. Neurochem, 64:487(1995);リムら(Lim, F.)、「DNAクローニング哺乳類の系(DNA Cloning:Mammalian Systems)」、グローバー(D. Glover)編(Oxford Univ. Press, Oxford England)(1995);ゲラーら(Geller, A.I.)、Proc. Natl. Acad. Sci:U.S.A., 90:7603(1993);ゲラーら(Geller, A.I.)、Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87:1149(1990)]、アデノウイルスベクター[リガールラサールら(LeGal LaSalle)、Science, 259:988(1993);ダビッドソンら(Davidson)、Nat. Genet 3:219(1993);ヤンら(Yang)、J. Virol. 69:2004(1995)]およびアデノ関連ウイルスベクター[カプリットら(Kaplitt, M.G.)、Nat. Genet. 8:148(1994)]が含まれる。
ポックスウイルスベクターは遺伝子を細胞質に導入する。アビポックスウイルスベクターは核酸の発現が短期間に限られる。アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターは、核酸の神経細胞への導入に好ましい。アデノウイルスベクターはアデノ関連ウイルス(約4ヶ月)より発現が短く(約2ヶ月)、アデノ関連ウイルスはHSVベクターより発現が短い。選択した特定のベクターは標的細胞および処置すべき状態に依存する。導入は定法、例えば感染、トランスフェクション形質導入または形質転換によって行うことができる。遺伝子移入様式の例には、例えば、裸核DNA、CaPO4沈殿DEAEデキストラン電気穿孔プロトプラスト融合リポフェクション、細胞微量注射、ウイルスベクターおよび「遺伝子銃」の使用が含まれる。

0019

蛋白をコードする核酸の操作および取り扱いを簡単にするために、核酸は、プロモーターと機能的に結合したカセットに挿入することが好ましい。プロモーターは、所望の標的組織の細胞において蛋白の発現を促進することができなければならない。適当なプロモーターの選択は容易に行うことができる。好ましくは、高発現プロモーターを用いる。適したプロモーターの例は、763-塩基対サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである。ラウス肉腫ウイルス(RSV)(デービスら(Davis)、Hum Gene Ther, 4:151(1993))およびMMTプロモーターもまた用いてもよい。特定の蛋白はそれらの本来のプロモーターを用いて発現することができる。発現を増強することができるその他の要素には、tat遺伝子またはtarエレメントのような高レベルの発現が得られるエンハンサーまたはシステムなどが含まれる。このカセットを次に、ベクター、例えばpUC118、pBR322、または例えば大腸菌複製起点を含む他の既知プラスミドベクターのようなプラスミドベクターに挿入することができる。サムルックら(Sambrook)、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)を参照のこと。プラスミドベクターはまた、マーカーポリペプチドが治療すべき生物の代謝に有害な作用を及ぼさない限り、アンピシリン耐性に関するβ-ラクタマーゼ遺伝子のような選択可能なマーカーを含んでもよい。カセットはまた、国際公開公報第95/22618号に開示のシステムのような合成的輸送系において核酸結合部分に結合することができる。

0020

必要に応じて、予め選択した化合物、例えば、DNAのような核酸を、陽イオンリポソームおよびアデノウイルスベクターのような微量輸送媒体と共に用いてもよい。リポソーム調製技法、内容物の標的輸送を調べるためには、マンニモグールドフォゲライト(Mannimo and Gould-Fogerite)、BioTechniques, 6:682(1988)を参照のこと。またフェルナー&ホルム(Felgner and Holm)、Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):21(1989)およびモーラー(Maurer, R.A.)Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):25(1989)も参照のこと。
複製欠損組換え型アデノウイルスベクターは、既知の技法に従って産生することができる。クアンチンら(Quantin)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581〜2584(1992);ストラトフォード・ペリカデットら(Stratford-Perricadet)、J. Clin. Invest., 90:626〜630(1992);およびローゼンフェルドら(Rosenfeld)、Cell, 68:143〜155(1992)を参照のこと。
核酸の有効量は発現された特定の蛋白、標的組織、患者および彼または彼臨床状態の関数となると考えられる。DNAの有効量は約1〜4000 μgで、より好ましくは約1000〜2000、最も好ましくは約2000〜4000 μgである。
または、EC前駆体は、血管新生の部位に細胞に結合させた細胞障害性部分を輸送することによって、血管新生および/または新生物増殖を阻害するために用いてもよい。細胞障害性部分は、細胞障害剤、または細菌、真菌、もしくは植物起源酵素的に活性な毒素、またはそのような毒素の酵素的に活性なポリペプチド鎖もしくは断片(「A鎖」)であってもよい。酵素的に活性な毒素およびその断片が好ましく、その例としてはジフテリア毒素A断片、ジフテリア毒素の非結合活性断片エキソトキシンA(緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデッシンA鎖、アルファサルシン、特定のシナアブラギリ蛋白、特定のジアンチン蛋白、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolacca americana)蛋白(PAP、PAPIIおよびPAP-S)、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチンサボンソウ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリンレストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシン、リシンA鎖、緑膿菌エンドトキシンAおよびPAPが好ましい。
EC前駆体とそのような細胞障害性部分との結合は、多様なカップリング剤を用いて行ってもよい。そのような試薬の例は、プロピオン酸N-サクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ)(SPDP)、イミノチオラン(IT)、塩酸ジメチルアデイピミデートのようなイミドエステルの双機能誘導体スベリン酸ジサクシニミジルのような活性エステルグルタルアルデヒドのようなアルデヒドビス(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミンのようなビスアジド化合物、2,6-ジイソシアン酸トリレンのようなジイソシアネート、および1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンのようなビス活性化フッ素化合物である。
毒素の酵素的に活性なポリペプチドは、組換え的に産生してもよい。組換え的に産生されたリシン毒素A鎖(rRTA)は、1985年8月15日に発布されたPCT国際公開公報第85/03508号に開示の方法に従って産生してもよい。組換え的に産生されたジフテリア毒素A鎖およびその非結合活性断片もまた、1985年8月15日に発布されたPCT国際公開公報第85/03508号に記述されている。

0021

本発明の方法は、血管壁の内側の内皮を剥離させる血管損傷を治療するために用いてもよい。例えば、一次血管形成術は急性心筋梗塞の治療に広く用いられつつある。さらに、血管内ステントは、バルーン血管形成術の補助として広く用いられつつある。ステントは最適とは言えない一次結果を救うためと共に再狭窄を減少させる上で有用である。しかし、今日まで、血管内補綴物の不利な点は、動脈が3.3 mm以上の患者の約3%に血栓閉塞を起こしやすいことであった。患者がこれより小さい動脈にステント留置を受ける場合、亜急性血栓の発生率はさらに高くなる。亜急性血栓症は現在、抗凝固剤を積極的に使用する場合に限って防止される。血管への介入と強い抗凝固剤療法を併用すれば、ステント/血管形成術時に末梢血管外傷に関して有意なリスクを生じる。血管形成術および/またはステント留置を受ける患者に、またはそれらの後にEC前駆体を投与することによって内皮再形成を加速させれば、不安定なプラークを安定化し、再閉塞を予防することができる。
本発明の方法は、PCT/US96/15813号に開示の血管損傷の治療法と共に用いてもよい。
さらに、本発明の方法は、移植組織、例えば血管移植片の治癒を加速するために用いてもよい。
本発明はまた、本明細書に記述の方法において予想される全ての用途に対する薬学的産物を含む。例えば、生理学的に許容される投与剤形で、内皮細胞マイトゲンをコードする核酸およびEC前駆体を含む薬学的産物がある。
本発明はさらに、EC前駆体および内皮細胞マイトゲン、または同物質をコードする核酸を患者にインビボで全身に導入するためのキットを含む。そのようなキットは担体溶液、核酸またはマイトゲンおよび輸送手段、例えばカテーテルまたはシリンジを含む。キットはまた調製物投与方法を含んでもよい。
本明細書で述べた全ての文書は、本明細書において参照として全文が組み入れられる。
本発明は、さらに以下の実施例によって説明される。これらの実施例は本発明の理解を助けるために提供されており、制限的なものと解釈されない。

0022

材料および方法
ヒト末梢血を20ゲージ静脈内カテーテルを用いて得て、最初の3 mlを捨てた。フィコール密度勾配遠心によって血液の白血球分画を得て、プラスチック組織培養皿に播種して1時間放置し、分化した接着細胞の混入を防止した。
蛍光活性細胞ソーティング(FACS)を1×106個より多くのCD34陽性および陰性単核血球(MBCD34+、MBCD34−)について実施した。細胞はベクトン・ディッキンソン(Becton-Dickinson)社のFACSソーターおよびCD34に対する抗体を用いたリシスII分析プログラム(Biodesign社)を用いて分析した。
20%FBSおよびウシ脳抽出物(Clonetics社)を含むM-199培地を全ての細胞培養実験の標準培地として用いた。
3ヶ月齢で20〜30 gのC57BL/6Jx129/SV系の雄性マウス(Hirlan社)をこれらの実験に用いた(n=24)。動物ペントバルビタール160 mg/kgの腹腔内注射によって麻酔した。一方の大腿動脈近位末端および対応する伏在動脈の遠位部分を結紮し、その後側副枝と共に動脈を離断して切除した。(全てのプロトコルセントエリザベス協会の動物ケア使用委員会によって承認された)。
ニュージーランドホワイトウサギ(3.8〜4.2 kg、n=4、Pine Acre Rabbitry)を、キシラジン(2mg/kg)を前投与した後に、ケタミン(50 mg/kg)およびアセプロマジン(0.8 mg/kg)の混合液で麻酔した。縦方向切開した後、大腿動脈をその全長にわたって離断した;大腿動脈の全ての側枝もまた離断した。膝窩動脈および伏在動脈を遠位で、近位外腸骨動脈および全ての大腿動脈側枝を結紮した後、大腿動脈を完全に切除した(23)。

0023

単離および分析
CD34陽性単核血球(MBCD34+)は、上記のように末梢血からCD34抗体コーティング磁石ビーズ(Dynal社)によって単離した。
FACS分析により、選択した細胞の15.9±3.3%が、CD34を発現したのに対し、残りの細胞では<0.1%であったことが示された。瀉出した(MBCD34−)細胞を、対照として用いた。Flk-1抗体を、Flk-1陽性単核血球(MBFlk1+)の磁石ビーズ選択に用いた。
MBCD34+およびMBCD34−は、組織培養プラスチック皿I型コラーゲン、またはフィブロネクチン上の標準培地に別々に播種した。組織培養プラスチック皿、またはコラーゲン上に密度1×103/mm2で播種すると、限られた数のMBCD34+が接着し、紡錘形になり4週間増殖した。フィブロネクチン上に播種したMBCD34+のサブセットは直ちに接着し、3日以内に紡錘形となった(図1A);培養中の接着細胞(ATCD34+)の数は時間と共に増加した(図2)。接着細胞は、フィブロネクチンコーティングプレート上で4週間まで追跡した細胞を含むMBCD34−の培養では、散在的に認められたに過ぎなかった。
紡錘形の細胞がCD34陽性細胞に由来することを確認するため、MBCD34+を蛍光色素、DiIで標識し、非標識MBCD34−と共にフィブロネクチン上で総密度5×103/mm2で播種した;2つの細胞タイプの比は最初の単核細胞集団の比と同一であった(1%MBCD34+、99%MBCD34−)。7日後、MBCD34+に由来するDiI標識細胞は、最初は血球の1%を占めるに過ぎなかったが、FACSで分析すると、総接着細胞の60.3±4.7%を占めた。MBCD34−と共にインキュベートすると、単独で細胞密度5×10/mm2で播種した場合と比べてMBCD34+の増殖は10倍より多く増加した(d 3=131.3±26.8対9.7±3.5/mm2)。MBCD34+/MBCD34−共培養はまた、フィブロネクチンコーティングプレート上で細胞ネットワークおよび管様構造の形成を含む、MBCD34+分化を増強した(図1B、C)。これらの構造は、主にDiI-標識MBCD34+由来細胞を含む(図1C)。その上、共培養の12時間以内に、主にDiI-標識MBCD34+由来細胞(図1E)を含む多数のクラスタ形成を認めた(図1D)。これらのクラスタは中心部に丸い細胞、そして辺縁部に紡錘形状の細胞芽を含んだ。これらのクラスタの外観および構築は、解離したウズラ原外胚葉培養において認められた血液島様細胞クラスタと類似しており、これはECを誘導し、インビトロで血管構造を生じた(3)。クラスタ辺縁部のATCD34+は、EC系列の特徴であるDiI-標識アセチル化LDLを取り込むが(13)、クラスタの中心部にある細胞はそうではないことが示された(図1F、G);後者は数日後にクラスタから分離した。同様の知見はMBFlk1+を用いた実験においても認められた。

0024

白血球およびECマーカーの発現
MBCD34+のEC様表現型への進行をさらに評価するために、白血球およびECマーカーの発現について細胞をアッセイした。新たに単離したMBCD34+に対して密度1×103個/mm2で7日間培養したATCD34+を蛍光標識抗体と共にインキュベートし、FACSによって分析した(図3)。白血球共通抗原であるCD45は新しく単離した細胞の94.1%上で同定されたが、7日間培養すると基本的に失われていた(図3)。全てがEC系列(14)であるUEA-1、CD34、CD31、Flk-1、Tie-2およびE-セレクチンの発現の増強は、新しく単離したMBCD34+と比較して、培養7日後のATCD34+に検出された。単球マクロファージ系列を示唆するCD68発現は、6.0±2.4%の細胞に限定された。
第VIII因子、UEA-1、CD31、ecNOS、およびE-セレクチンの発現もまた、7日間培養後のATCD34+の免疫組織化学によって報告されている(データは示していない)。培養3、7および14日後、80%より多くのATCD34+がDiI-標識acLDLを取り込んだ(13)。
ECは独自に内皮構成的酸化窒素シンターゼ(ecNOS)を発現する。従って、MBCD34+、MBCD34−およびATCD34+のecNOS発現をRT-PCRによって調べた(15)。ecNOSmRNAはMBCD34−では検出できず、新しく単離したMBCD34+では非常に低レベルであった(図4)。しかし、7日間培養したATCD34+ではecNOS mRNAは著しく増加した(図5)。ATCD34+におけるecNOS蛋白が機能的である証拠は、EC依存型アゴニストであるアセチルコリン(Ach)およびEC特異的マイトゲンである血管内皮増殖因子(VEGF)に反応した酸化窒素測定によって証明された(16)(図5);付加的に後者は、ATCD34+と共に、機能的Flk-1受容体に関する証拠となる

0025

細胞−細胞相互作用
細胞−細胞相互作用は、造血(19)および血管新生(20)の際に、細胞のシグナル伝達、分化、および増殖において決定的な役割を果たすと考えられる。MBCD34+と成熟ECとの相互作用がMBCD34+のEC様表現型への分化に及ぼす影響を調べるために、DiI-標識MBCD34+をコンフルエントHUVEC単層上に播種した。接着した標識細胞は12時間以内に培養全体に認められ(図6A)、3日までその数は増加した(図6B)。50 ng/ml VEGFおよび10 ng/ml bFGFと共にインキュベートすると、DiI標識および非標識細胞の双方を含むコード様構造の網目構造が共培養の3日以内に認められた(図6C)。いずれの細胞タイプも次にマトリゲル(Becton-Dickinson社)コーティングスライド上に再度播種すると、12時間以内にDiI-標識MBCD34+由来細胞およびHUVECを含む毛細管ネットワークの形成が示された(図6D)。細胞−細胞相互作用を容易にするために、HUVECをTNF-αで前処置すると(21)、ATCD34+の数は増加した(図6E);VEGFと共培養すると相乗的な増強を認めた。同一に処置したHUVECおよびDiI-標識MBCD34−共培養では、落屑様の標識細胞を生じ、および/またはコード様構造を生じなかった。同様の知見はMBFlk1+を用いてEC前駆体を単離した場合でも認められた。

0026

インビボ血管新生
これまでの研究は、ECがインビボ血管新生に関係する主細胞となることを確立した(1)。MBCD34+がインビボで血管新生に関与することができるか否かを調べるために、本発明者らは、これまでに特徴付けされた後肢虚血に関する2つの動物モデルを用いた。ヒトMBCD34+の投与では、起こりうる移植片-宿主合併症を防止するために、C57BL/6Jx129/SV系無胸腺ヌードマウスを用いた。肢の虚血が重度である2日後、マウスに5×105個のDiI-標識ヒトMBCD34+、またはMBCD34−を尾静脈から注射した。1、2、4、および6週間後にDiI-標識細胞の有無を調べた肢の組織学的切片から、新血管形成虚血後肢に無数のDiI-標識細胞が存在することが明らかになった。標識細胞はMBCD34−注射マウスと比べてMBCD34+ではより多く、ほとんど全ての標識細胞が毛細血管壁に取り込まれているようであった(図8A、C、E、G)。
MBCD34+またはMBCD34−注射マウスはいずれも、損傷を受けていない肢には標識細胞を認めなかった。DiI-標識細胞はまた、一貫してUEA-1レクチン(図8B)、CD31(図8D)、およびTie-2(図8F)の免疫染色と共に標識された。対照的に、MBCD34−を注射したマウスからの後肢切片では、標識細胞は典型的に毛細管付近の間質に認められたが、血管の一部を形成せず、UEA-1または抗CD31抗体では標識されなかった(図8G、H)。
次に、βガラクトシダーゼを過剰発現するトランスジェニックマウスを用いてEC前駆体の同種移植片がインビボでの血管新生に関与しうるという仮説を調べた。適した抗マウスCD34抗体がないため、EC前駆体の選別にはFlk-1細胞単離を用いた。約1×104個のMBFlk1+を、B6,129系のβガラクトシダーゼトランスジェニックマウス10匹の全血から単離した。MBFlk1+または同数のMBFlk1−を2日間後肢が虚血しているB6,129マウスに注射した。注射の4週間後に回収した虚血組織のβガラクトシダーゼ免疫染色により、βガラクトシダーゼを発現する細胞が毛細管および小動脈に取り込まれることが示された(図8I);これらの細胞は抗CD31抗体およびBS-1レクチンで染色することによってECと同定された。

0027

最後に自家MBCD34+の血管新生部位へのインビボ取り込みを、一側性の後肢虚血のウサギモデルにおいて調べた。一側性の後肢虚血の外科的誘導を行う直前に、正常なニュージーランドホワイトウサギの直接静脈穿刺によって、MBCD34+を血液20 mlから単離した。手術処置終了直後に新しく単離した自家DiI-標識MBCD34+を、血液を最初に得た同じウサギの静脈に再度注射した。虚血4週間後、虚血肢の組織学的切片を調べた。DiI-標識細胞は虚血肢の新血管部分のみに局在して、毛細管に取り込まれ、一貫してCD31およびUEA-1を発現した(図8J、K)。
HSCおよびECは共通の前駆体に由来するという考えと一致して、本発明者らの知見は、適当な条件下では、MBCD34+またはMBFlk−1+の亜集団はインビトロでECに分化しうることを示唆している。その上、インビボの結果は、末梢血中の循環するMBCD34+またはMBFlk1+が血管新生のためのECの臨時源となる可能性があることを示唆している。インサイチューで分化するEC前駆体のこれらの成人種の新血管構造への取り込みは、血管形成と一致し、それ以外は胚形成限局される模範例である(2、3)。これらの細胞が血管新生を行っていない成熟した血管に取り込まれないという事実は、MBCD34+からECへのインサイチュー分化を誘導するためには、損傷、虚血、および/または効果的な血管新生が必要であることを示唆している。

0028

EC前駆体は内皮再形成を増強する
バルーン損傷の後、剥離したラット頚動脈を直ちに切除してHUVEC培地中で培養し、DiI-標識CD34+ EC前駆細胞を動脈上に播種した。1週間後、動脈をPBSで洗浄して、非接着細胞を除去した。CD34+細胞が濾過細胞に分化する能力と一致して、DiI-標識細胞は動脈の平滑筋細胞層内部に認められた。しかし、内膜表面の走査型電子顕微鏡により、DiI-標識細胞が剥離した動脈表面にも接着して、ECを思わせる形態をとることが示された(図9)。DiI-標識細胞はまた、切除した動脈分節の露出末端部での毛細管様新芽にも取り込まれ、CD34+細胞が血管新生にも関与することができる可能性があることが示唆された。
細胞外から投与したCD34+ EC前駆体細胞が、インビボで剥離した動脈表面の内皮再形成に関与することができるか否かを調べるために、新しく単離したヒトCD34+またはCD34-細胞をDiI-標識し、ヌードラットの剥離した頚動脈上に播種した。バルーン剥離後、1.0×106個の標識細胞をPBSと共に22Gカテーテルを通じて剥離した動脈に導入し、これを30分留置してから針を抜いた。次に外頚動脈を結紮し、総頚動脈内頚動脈の結紮を除去し、切開部を縫合した。翌日、ラットを麻酔して血管灌流ヒスト・チョイス(Amresco社)で固定した。剥離した動脈分節を切除し、接着したDiI-標識細胞の有無を調べたところ、これはCD34+細胞を播種した動脈では同定されたが、CD34-細胞では同定されなかった。

0029

以下の参考文献が明細書全体を通して参照されている。本明細書に記載されている全ての刊行物は本明細書に参考文献として組み込まれる。
(1) J. Folkman, Y. Shing, J. Biol. Chem. 267, 10931 (1992); W. Schaper, M. D. Brahander, P. Lewi,Circ. Res. 28, 671 (1971); W. Risau,FASEB J. 9, 926 (1995).
(2) W. Risau, H. Sariola, H-G. Zerwes, J. Sasse, P. Ekblom, et al, Development 102, 471 (1988); L. Pardanaud, C. Altman, P. Kitos, F.Dieterien-Lievre, Development 105, 473 (1989).
(3) I. Flamme, W. Risau, Development 116, 435 (1992).
(4) W. His, Abhandl. K. S. Ges. Wiss. Math. Phys. 22, 171 (1990); M. Weiss, S. H. Orkin, J. Clin. Invest. 97, 591 (1996).
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(14) B. Millauer, S. Wizigmann-Voos, H. Schnurch, R. Martinez, N. P. H. Moller, et al, Cell 72, 835 (1993); T. P. Yamaguchi, D. J. Dumont, R. A. Conlon, M. L. Breitman, J. Rossant, Development 118, 489 (1993); M. Miettinen, H. Holthofer, V. P. Lehto, A. Miettinen, I. Virtanen, Am. J. Clin. Pathol. 79, 32 (1983); E. A. Jaffe, R. L. Nachman, C. G. Becker, C. R. Minick, J. Clin. Invest. 52, 2745 (1973); P. J. Newman, M. C. Berndt, J. Gorski, G. C. White, S. Lyman, et al, Science 247, 1219 (1990); A. Vecchi, C. Garlanda, M. G. Lampugnani, M. Resnati, C. Matteucci, et al, Eur. J. Cell Biol. 63, 247 (1994); T. N. Sato, Y. Tozawa, U. Deutsch, K. Wolburg-Buchholz, Y. Fujiwara, et al, Nature 376, 70 (1995); H. Schnurch, W. Risau, Development 119, 957 (1993); M. P. Bevilacqua, Annu. Rev. Immuno. 11, 767 (1993).
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実施例

0030

本発明を、その好ましい態様を含めて詳細に説明してきた。しかし、本開示を鑑みて、請求の範囲に記載されている本発明の主旨および範囲から逸脱せずに、これに修飾および改変を加えられることが当業者には認識されると思われる。

0031

EC前駆体は、血管新生を増強するために、または血管新生阻害剤、例えば抗−もしくは親−血管新生剤をそれぞれ、病理学的もしくは実利的血管新生部位に輸送するために用いることができる。さらに、もう一つの態様において、EC前駆体は、損傷血管の内皮再形成を誘導することができ、このように平滑筋細胞増殖を間接的に阻害することによって再狭窄を減少させるために用いることができる。

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