図面 (/)

技術 生体内に分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAの簡便な精密定量法

出願人 並木禎尚
発明者 並木禎尚並木珠
出願日 2008年1月31日 (12年10ヶ月経過) 出願番号 2008-046817
公開日 2009年8月13日 (11年4ヶ月経過) 公開番号 2009-178155
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード セラミッククロス ノーベル賞 非放射性物質 シリカクロス セラミック担体 多孔質セラミック 高感度測定 核酸医薬
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2009年8月13日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (3)

課題

本発明の課題は、生体内分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAを簡便、かつ精密に定量する方法を提供することにある。

解決手段

(A)標識物質を結合したsiRNAを生物投与する、もしくは細胞の培養液に添加する工程;(B)該生物、もしくは該細胞から該siRNAを含むトータルRNAを同時に精製抽出する工程;及び(C)該抽出RNA中の標識物質を測定することにより、生体に分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAを簡便、かつ精密に定量する方法を提供する。

概要

背景

医学分野において、薬物の病巣部への運搬を目指した薬物送達システムが開発されてきたが、未だ決定的なものは存在しない。特に、2006年度ノーベル賞受賞テーマであるsiRNAの機能の解明以降、siRNAは疾患の原因遺伝子破壊する新規核酸医薬としても大変期待されているが、患部へのsiRNAの送達法の開発は非常に遅れている。

その一因として、実験動物等の生体内分布したsiRNAを蛍光顕微鏡等により定性的に検出する方法は存在するものの、生体内に分布したsiRNAを簡便、かつ精密に定量する有効な手段が存在しないことがあげられる。

その状況の中で、最近、蛍光色素等によるsiRNAの標識技術、カラム等によるRNAの精製抽出技術、及び蛍光色素の高感度測定技術が開発されている。

概要

本発明の課題は、生体内に分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAを簡便、かつ精密に定量する方法を提供することにある。 (A)標識物質を結合したsiRNAを生物投与する、もしくは細胞の培養液に添加する工程;(B)該生物、もしくは該細胞から該siRNAを含むトータルRNAを同時に精製抽出する工程;及び(C)該抽出RNA中の標識物質を測定することにより、生体に分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAを簡便、かつ精密に定量する方法を提供する。

目的

本発明の課題は、生体内に分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAを簡便、かつ精密に定量する方法を提供することにある。特に、標識物質として放射性同位元素等の危険な物質を使用しない場合には、どこでも安全に使用できる方法となる。

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

(A)標識物質を結合したsiRNA(smallinterferingRNA;短鎖干渉RNA)を生物投与する、もしくは細胞培養液に添加する工程;(B)該生物、もしくは該細胞から該siRNAを含むトータルRNAを同時に精製抽出する工程;及び(C)該抽出RNA中の標識物質を測定することにより、生体分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAを定量することを特徴とする、siRNAの簡便な精密定量法

請求項2

上記標識物質には、蛍光色素、Biotin、Biotin化合物、Digoxigenin、Digoxigenin化合物、Dinitrophenol、Dinitrophenol化合物、放射性同位元素のいずれか、もしくはこれらの組み合わせを用いる請求項1に記載のsiRNAの簡便な精密定量法。

請求項3

上記トータルRNAの精製抽出には、シリカ粒子シリカ粉末シリカ繊維グラスファイバー)、シリカメンプレン、シリカクロス一体型多孔質シリカセラミック粒子セラミック粉末セラミック繊維セラミックメンプレン、セラミッククロス、一体型多孔質セラミックのいずれか、もしくはこれらを混成したもの、もしくはこれらを混合したものを用いる請求項1に記載のsiRNAの簡便な精密定量法。

技術分野

0001

本発明は、生体内分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAの簡便な精密定量法に関する。

背景技術

0002

医学分野において、薬物の病巣部への運搬を目指した薬物送達システムが開発されてきたが、未だ決定的なものは存在しない。特に、2006年度ノーベル賞受賞テーマであるsiRNAの機能の解明以降、siRNAは疾患の原因遺伝子破壊する新規核酸医薬としても大変期待されているが、患部へのsiRNAの送達法の開発は非常に遅れている。

0003

その一因として、実験動物等の生体内に分布したsiRNAを蛍光顕微鏡等により定性的に検出する方法は存在するものの、生体内に分布したsiRNAを簡便、かつ精密に定量する有効な手段が存在しないことがあげられる。

0004

その状況の中で、最近、蛍光色素等によるsiRNAの標識技術、カラム等によるRNAの精製抽出技術、及び蛍光色素の高感度測定技術が開発されている。

発明が解決しようとする課題

0005

本発明の課題は、生体内に分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAを簡便、かつ精密に定量する方法を提供することにある。特に、標識物質として放射性同位元素等の危険な物質を使用しない場合には、どこでも安全に使用できる方法となる。

課題を解決するための手段

0006

出願人は先に、siRNA等の核酸医薬を磁気送達可能な磁性ナノ粒子、及びその製造方法を提案している(特願2007−198104)。該発明過程において、10〜18塩基対以上のRNAを精製抽出可能なカラムを用いて、標識物質を結合したsiRNAを含むトータルRNAを同時に、生物、もしくは細胞から精製抽出後、標識物質の定量を行うことにより上記課題を解決しうるという知見を得た。

0007

本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、(A)標識物質を結合したsiRNAを生物に投与する、もしくは細胞の培養液に添加する工程;(B)該生物、もしくは該細胞から該siRNAを含むトータルRNAを同時に精製抽出する工程;及び(C)該抽出RNA中の標識物質を測定することにより、生体に分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAを簡便、かつ精密に定量する方法を提供する。

発明を実施するための最良の形態

0008

本発明の生体内に分布したsiRNA、もしくは細胞内に取り込まれたsiRNAの精密な簡便定量法は、(A)標識物質を結合したsiRNAを生物に投与する、もしくは細胞の培養液に添加する工程;(B)該生物、もしくは該細胞から該siRNAを含むトータルRNAを同時に精製抽出する工程;及び(C)該抽出RNA中の標識物質を測定することにより、生体に分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAを簡便、かつ精密に定量することを特徴とする。

0009

本発明の生体内に分布したsiRNA、もしくは細胞内に取り込まれたsiRNAの精密な簡便定量においては、(A)標識物質を結合したsiRNAを生物に投与する、もしくは細胞の培養液に添加する工程;(B)該生物、もしくは該細胞から該siRNAを含むトータルRNAを同時に精製抽出する工程;及び(C)該抽出RNA中の標識物質を測定することにより、生体に分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAを定量する工程からなる。

0010

先ず、本発明において用いられるsiRNAについて述べる。siRNAは、通常、19〜23塩基対からなる短い2本鎖RNAで、哺乳動物細胞内において遺伝子配列特異的に遺伝子発現を抑制する機能をもつことが知られている。即ち、siRNAを用いて狙った遺伝子の発現を特異的に制御することが可能である。しかし、siRNAは不安定、かつ高価であるため、目的部位にsiRNAを効率良く送達する技術の開発が望まれている。

0011

しかし、siRNAを生体内に投与した後の、siRNAの生体内分布を簡便、かつ精密に定量する有効な手段が現在まで存在しなかったことが一因となり、siRNAの患部への送達法の開発は非常に遅れている。

0012

次に、本発明の生体内に分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAの簡便な精密定量法について、工程毎に説明する。先ず、上記工程(A)について説明する。上記工程(A)は、標識物質を結合したsiRNAを生物に投与する、もしくは細胞の培養液に添加する工程である。

0013

本発明において用いられるsiRNAの標識物質については、例えば、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、FAM、Fluorescein、HEX、TET、Texas Red、TAMRA、R6G、ROX,JOE、Yakima yellow、BiodipyFL、Biodipy 530/550、Biodipy TR、BiodipyTMR、Alexa Fluor350、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor660、Alexa Fluor667、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor750、Cascade Blue、Marina Blue、Pacific Blue等の蛍光色素、Biotin、Digoxigenin、Dinitrophenol等の非放射性物質、もしくは、放射性同位元素等、特に限定されず、siRNAを標識することのできるものは全て用いることができるが、蛍光色素であることが好ましい。

0014

本発明において用いられるsiRNAの標識物質の結合部位については、siRNAの3’末端、5’末端等、特に限定されず、siRNAを標識することのできる結合部位は全て用いることができる。

0015

標識物質を結合したsiRNAは、生体内、生体外のいずれにおいても使用することができる。生体内で使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈内、実質臓器内(例えば、脳、目、甲状腺乳腺心臓肝臓膵臓腎臓副腎卵巣精巣等)、管腔臓器管腔内(例えば、食道十二指腸空腸回腸大腸胆嚢尿管膀胱内等)、脳脊髄腔内、胸腔内腹腔内、筋肉内、関節内、皮下、皮内等、特に限定されない。

0016

標識物質を結合したsiRNAの投与を行う生物種は、例えば、動物、植物、微生物等、特に限定されることはないが、動物由来であることが好ましく、例えば、ヒト、サルウシヒツジヤギウマブタウサギイヌネコマウスラットモルモット等、哺乳動物であることがより好ましい。また、siRNAを取り込む細胞の種類は、例えば、体細胞生殖細胞幹細胞又はこれらの培養細胞等、特に限定されない。

0017

標識物質を結合したsiRNAの投与、もしくは添加時に、リポソーム脂質ナノ粒子ポリマー等、特に限定されず併用することができる。また、これらを併用せずに、標識物質を結合したsiRNA単独で、投与、もしくは添加することも可能である。

0018

上述した工程(A)により、標識物質を結合したsiRNAを生物に投与する、もしくは細胞の培養液に添加する。

0019

次に、上記工程(B)について説明する。上記工程(B)は、上記工程(A)で標識物質を結合したsiRNAを投与、もしくは添加した生物、もしくは細胞から該siRNAを含むトータルRNAを同時に精製抽出する工程である。

0020

本発明において用いられる生物、もしくは細胞からのトータルRNAの抽出には、例えば、チオシアン酸グアニジン等のカオトロピック塩硫酸アンモニウム等のアンチカオトロピック塩、酸性フェノールクロロホルム混合液等が用いられるが、トータルRNAの抽出が可能であれば特に制限なく使用することができる。

0021

本発明において用いられる生物からのトータルRNAの抽出には、生物の一部、もしくは全部を用いて抽出することが可能である。

0022

本発明において用いられるsiRNAを含むトータルRNAの精製には、例えば、アルコール沈殿グラスファイバー担体シリカ担体セラミック担体等が用いられるが、効率の高いグラスファイバー担体、シリカ担体、セラミック担体が好ましく、10〜18塩基以上の長さの全てのRNAを精製可能なグラスファイバー担体、シリカ担体、セラミック担体の使用がより好ましい。但し、siRNAを含むトータルRNAの精製が可能であれば、特に制限なく使用することができる。

0023

上述した工程(B)により、該生物、もしくは該細胞から標識物質を結合したsiRNAを含むトータルRNAを同時に精製抽出する。

0024

次に、上記工程(C)について説明する。上記工程(C)は、上記工程(B)で精製抽出した標識物質を結合したsiRNAを含むトータルRNA中の標識物質を測定することにより、生体に分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAを定量する工程である。

0025

本発明において用いられるsiRNAに結合した標識物質の定量は、標識物質が蛍光色素の場合、蛍光色素固有励起波長光を蛍光色素に照射し、発生した蛍光強度を測定する。該目的のため、蛍光測定装置蛍光プレートリーダー等が用いられるが、微量の蛍光物質を定量することが可能であれば特に制限なく使用できる。

0026

本発明において用いられるsiRNAに結合した標識物質の定量は、標識物質がBiotin、もしくはBiotin化合物の場合、AvidinがBiotin、もしくはBiotin化合物に特異的に結合することを利用する。即ち、ペルオキシダーゼ結合Avidin、アルカリフォスファターゼ結合Avidin等を用いることにより、Avidinに結合した該酵素基質の分解による呈色反応発光反応等を、吸光度計プレートリーダールミノメーター等を用いて定量する。

0027

本発明において用いられるsiRNAに結合した標識物質の定量は、標識物質がBiotin、Biotin化合物、Digoxigenin、Digoxigenin化合物、Dinitrophenol、Dinitrophenol化合物等の場合、これらに対しそれぞれ特異的に結合する抗体を用いる、ELISA法(Enzyme−Linked Immunosorbent assay)等公知の方法を制限なく使用できる。

0028

本発明において用いられるsiRNAに結合した標識物質の定量は、標識物質が放射性同位元素の場合、液体シンチレーションカウンタプレートシンチレーションカウンタガンマカウンタ等公知の方法を制限なく使用できる。

0029

本発明において用いられるトータルRNAの定量は、分光光度計を用いて260nmの波長における吸光度(A260)を測定し、計算により行う。具体的には、トータルRNA濃度(μg/mL)=(A260)×40×10/光路長(mm)と計算される。但し、トータルRNAの定量は、公知の方法を制限なく使用することができる。

発明の効果

0030

本発明の生体内に分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAの簡便な精密定量法を用いて、実験動物等におけるsiRNAの生体内分布を簡便、かつ精密に定量することが可能になるので、病変部へのsiRNAの送達法の開発等に大きく貢献する。

0031

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。

0032

(工程A)
週齢の雄ヌードマウス系統BALB/C nu/nu)30匹の尾静脈に、Alexa Fluoro488で標識したコントロールsiRNA(キアゲン社より購入)(300nM)と26.8μgの陽性荷電脂質ナノ粒子(O,O‘−ditetradecanoyl−N−(α−trimethylammonioacetyl)diethanolamine chloride、(DC−6−14)及びdioleoylphosphatidylethanolamine(DOPE)(モル比;1:1)から構成される)の混合物(0.5mL)を投与した。

0033

(工程B)
上記の投与を行い、0.5時間後、1.5時間後、4.5時間後、13.5時間後、40.5時間後に、それぞれ6匹のマウスを屠殺し、肺、脾臓、肝臓、腎臓、筋肉、心臓、胃、小腸、脳の各臓器摘出し、TRIZOL(フェノール/チオシアン酸グアニジン混合液;Invitrogen社より購入)を臓器25mgあたり0.7mL加え、激しく攪拌することにより、均一なホモジネートを得た。さらに、該ホモジネートに0.14mLのクロロホルムを添加し、激しく攪拌したのち4℃、12000G(重力加速度)にて15分間遠心分離を行い、上層のトータルRNAを含む水層採取した。

0034

該水層0.35mLと100%エタノール0.525mLを混合後、混合液0.7mLをシリカメンブレン充填されたカラム(miRNeasyスピンカラム(キアゲン社製))に添加し、室温、8000Gにて15秒間遠心分離することにより、シリカメンブレンにトータルRNAを吸着させた。

0035

シリカメンブレンに付着した不純物を除去するため、RWT緩衝液(キアゲン社製)0.7mLをスピンカラムに添加し、室温、8000Gにて15秒間遠心分離することによりシリカメンブレンを洗浄した。さらに、この洗浄をもう一度、繰り返した後、PRE緩衝液(キアゲン社製)0.5mLをスピンカラムに添加し、室温、8000Gにて2分間遠心分離することによりシリカメンブレンを強力に洗浄するとともに、乾燥させた。

0036

該スピンカラムにRNA分解酵素除去水(ワコー純薬製)を60μL添加し、シリカメンブレンに付着した、蛍光標識siRNAを含むトータルRNAを溶出した。

0037

(工程C)
各トータルRNA溶出液50μLを96well蛍光測定黒色プレートファルコン社製)のwell内に入れ、蛍光プレートリーダー(パーキンエルマー社製:model 1420)を用いて、励起波長495nm、蛍光波長518nmの蛍光強度を測定した。

0038

同時に、Alexa Fluoro488で標識したコントロールsiRNA10pg、100pg、1ng、10ng、100ng、1μgを50μL中に含む希釈系列をRNA分解酵素除去水で作製し、これらの希釈系列における蛍光強度を同様にして測定し、図2に示すような標準曲線を作成した。

0039

各溶出液の蛍光強度、及び該標準曲線から各溶出液に含まれる蛍光標識siRNAの量を計算した。さらに、残りの溶出液5μLを、それぞれ0.245mLのRNA分解酵素除去水で希釈後、A260を計算することにより、各溶出液のトータルRNAの濃度を計算した。

0040

最終的に、各溶出液に含まれる蛍光標識siRNAの量を各溶出液のトータルRNAの濃度で除することにより、図3に示すように、各組織に分布したsiRNA量を比較した。

0041

以上説明したように、本発明の、生体内に分布したsiRNA、もしくは細胞に取り込まれたsiRNAの簡便な精密定量法は、siRNAが医薬品として利用される上での最重要課題である患部への運搬法を開発するうえで非常に有用な手段となる。そのため、siRNAの各種送達法の開発、及び様々な疾患治療に対応する新規siRNAの開発に利用可能である。

図面の簡単な説明

0042

Alexa Fluoro488で標識したコントロールsiRNA10pg、100pg、1ng、10ng、100ng、1μgを50μL中に含む希釈系列を用いて作成した標準曲線を示したものである。この範囲において、蛍光標識siRNA量と蛍光強度の間の直線性を確認した。Alexa Fluoro488で標識したコントロールsiRNA(300nM)と26.8μgの陽性荷電脂質ナノ粒子(DC−6−14、及びDOPE(モル比;1:1)から構成される)の混合物(0.5mL)をマウスに静脈内投与した際の、siRNAの各臓器における分布の経時的変化を示したものである。それぞれ、投与後0.5時間(a)、1.5時間(b)、4.5時間(c)、13.5時間(d)、40.5時間(e)を示す。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ