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図面 (20)

課題

核酸を、多細胞生物体細胞インヴィヴォで導入する方法の提供。

解決手段

緻密にした物質投与される器官への標的細胞による取り込みを容易にするため、標的遺伝子置換し、改変しまたは除去するように、遺伝子発現発現が望ましくない内生的な核酸にハイブリッド形成、または部位特異的統合を行い、臨床効果を達成する。より具体的には、核酸をポリカチオンを有するキャリヤ分子にさせる。核酸は好ましくは凝縮状態に緻密化する。

概要

背景

機能外来性遺伝子は、インヴィトロトランスフェクション、直接ミクロ注入電気窄孔法、およびリン酸カルシウムとの共沈を含む種々の物理的方法によって哺乳類細胞に導入することができる。しかし、これらの技術の大部分は無傷動物内の細胞に遺伝子をデリバリするためには非実用的である。

インヴィヴォでの受容体依存性の緻密化していないDNAのデリバリ。受容体媒介遺伝子導入トランス遺伝子を適当な受容体細胞に導入する際にインヴィヴォおよびインヴィトロで成功することが示された。この方法は、関係する組織の表面の特定の受容体を標的にするように選択される共有結合したリガンドを含むポリカチオン蛋白質(通常ポリ−L−リシン)に、DNAを結合することを含む。遺伝子は組織によって集められ、細胞核移送され、時間を変えて発現される。標的組織のトランス遺伝子の発現の全体のレベルは幾つかの因子に依存する:DNAキャリヤ複合体の安定性標的細胞の表面の特異的受容体の存在と数、受容体−キャリヤリガンドの相互作用エンドサイトーシスおよび複合体の細胞核への移送、および標的細胞の核中の遺伝子転写の有効性である。

ウらは、USP 5,166,320 に、ポリ核酸結合剤(例えばポリリシンポリアルギニンポリオルニチン、ヒストンアビジン、またはプロタミン)および組織受容特異的蛋白質リガンドの共役体を使用するDNAの組織特異的デリバリを開示している。肝臓細胞を標的にするために、ウは「アシアロ糖蛋白質ガラクトース末端)リガンド」を示唆している。これらは、適当な糖蛋白質の脱シアル化によって、またはラクトースを非ガラクトース挙動蛋白質に結合することによって形成することができると、ウは言っている。ポリ核酸と共役体のモル比は、1:10ないし10:1さらに一般的には1:5ないし5:1、さらに好ましくは1:2ないし3:1の範囲である。ウらによって記述されていないが、われわれの手元には、ウの方法は少なくとも80nmの直径をもつ構造体が得られている。

ロウらは、USP 5,108,921 に、受容体依存性エンドサイトーシスを使用して細胞を形質転換するためDNAにビオチンを結合することを開示している。
ストンプらは、USP 5,122,466 に、そしてマックケーブらは、USP 5,120,657 に、物質にポリリシンを共投結合し、次にDNAをそれに複合させることにより、DNAを金属ペレットに結合することを開示している。得られた生成物は次に細胞の弾道形質転換に使用される。参照ストンプら、7欄、29〜37行目およびマックケーブら、7欄、49〜65行目。

ワグナーらは、Proc.Natl.Acad.Sci.,88:4255-4259(1991)に、受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞にDNAをデリバリするためトランスフェリン−ポリリシン結合体とDNAを複合化することを開示している。ワグナーらは、80-100 nm の直径のドーナツ形の構造体にプラスミドDNAを緻密にするように混合物中にポリカチオンが十分にあることが重要であると教示し、エンドサイトーシスの発生を容易にすると彼等は推測している。ワグナーらは、一層小さい直径の構造体を得る価値については認識してなく、またさらなる緻密化を得る方法を教示していない。ワグナーらの構造体は多分子コンプレックスであり、これはマクロファージ食作用に一層無防備であり、標的組織による取り込みにあまり敏感に反応しないという欠点をもつ。

の緻密化していないDNAの直接の注入。裸のDNAを動物組織直接注入することによって遺伝子発現を検出する可能性は、最初ドベンスキらによって、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,81:7529-33(1984)に示され、マウス肝臓または脾臓に注入したウイルスまたはプラスミドのDNAは検出できるレベルで発現されたことを示した。このDNAはリン酸カルシウムを使用して沈澱させ、ヒアルロニダーゼおよびコラゲナーゼ一緒に注入された。トランスフェクションした遺伝子は宿主動物の肝臓中に複製することが示された。ベンベニスティおよびレシェフは、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,83:9551-55(1986)に、リン酸カルシウム沈澱DNAを新生児ラット腹腔内に注入し、トランスフェクション48時間後、動物の肝臓中の遺伝子発現に注目した。1990年に、ウォルフらは、Science, 247:1456-68(1990)に、DNAまたはRNA発現ベクターをマウスの筋肉に直接注入すると2ヶ月までの期間、遺伝子の発現を検出できることを報告した。この技法アスカジら、New Biologist,3:71-81(1991)によって拡張され、裸のDNAをラットの心臓に直接注入し、注入した遺伝子は動物の心臓中に25日まで発現された。ジストロフィンのための遺伝子を含む他の遺伝子は、この技法を使用してマウスの筋肉に注入された。この方法は、標的組織に直接注入することによる遺伝子の投与によって動物に免疫反応を生成させるための幅広アプローチ土台を形成している。遺伝子は、一時的に発現され、特定の抗原を生成する(参照、ドネリーら、The Immunologist,21,20-26(1994)最近の概説)。しかし、これらの実験に使用されるDNAは、細胞内での生存、細胞核への取り込み、または標的細胞の核中の転写の割合を改善するように改質されあるいは緻密にされていなかった。

溶液中のDNAの挙動。リン酸塩中心軸が負に高帯電された性質によって、DNAは溶液中で棒状の分子であり、その基本構造ヘリックスと結合した水和殻の修飾によって摂動することができる。この摂動は、二つの方法でもたらされる;第一に、DNA分子の荷電中性化度の変化が、広範囲な緻密化となり、緻密構造の形でDNA相を結局分離する(沈澱)、そして第二に、DNAヘリックスの比誘電率の変化が緻密構造を形成することになる。これらの摂動はDNA分子のコンホメーションを変化させて、曲げて緻密になる可撓性ポリマーを可能にし、DNA分子の流体力学の性質を著しく変えることになる。得られた構造はDNAが比較的高等真核生物中の染色体あるいはウイルスキャプシドの内側で呈する性質に似た性質であると考えられている。

比較的高等な真核生物の核中のDNAは、リシンおよびアルギニン(ヒストン類)またはアルギニン(プロタミン類)が多く含まれている塩基性核蛋白質(すなわち、ヒストン類およびプロタミン類)と完全に結合する。これらの塩基性蛋白質とDNAのコンプレックスは、染色体形成の際に生じるDNA緻密化をコントロールするために反応し、遺伝子発現の制御に一役を担うと考えられる。ウイルス、バクテリアおよび真核生物の細胞核中に生理学的に生じるDNA緻密化は、実験室再現することは非常に困難である。理論的には、DNAの中心軸の高く負に荷電した性質によって、DNAの荷電を中性化するような変化は広範囲な緻密化をもたらし、結局、緻密構造の形でDNA相を分離する(沈澱)。しかし、DNA−ポリカチオンコンプレックスの溶液中での振舞はDNAとポリカチオン蛋白質とのコンプレックス形成のための方法に依存する。

核蛋白質コンプレックス形成のためのモデルとしてカチオンホモポリペプチドを使用するオリンズ、オリンズおよびフォンヒップルによる研究は(J.Mol.Bio。24,157-176,1967)、溶液中で両成分をアニーリングした後に、カチオンのポリペプチド(ポリ−L−リシン、ポリ−L−アルギニンおよびポリ−L−オルニチン)とDNAの特定のコンプレックスの生成のための証拠を示した。この方法は2Mないし0.010 MのNaCl濃度からステップダウン透析を含んでいた。

この研究でいくつかのコメントをすることができる。先ず、ポリカチオンをDNAに添加して形成されたコンプレックスの熱変性は、研究した各ケースで生じたDNAにポリカチオンを結合し、DNAの二本鎖構造を安定にする。このシステムは、比誘電率の変化(すなわち、アルコール脱水)が、DNAの熱変性特性の変化がないDNA崩壊となるものとは異なることに注目することが重要である。第二に、分光光度計による研究は、260nm での最大吸収が、300nm(ポリカチオンもDNAも何ら吸収を示さない領域)よりも大きい波長濁度が連続して増加する赤色に僅かにシフトすることを示した。これらの特性は、DNAとポリペプチドとの間の相互作用によって生じる可能性がある、コンホメーションの小さい変化が変則の吸収スペクトルによって検出されたことを示していると考えられた。第三に、塩基性ポリペプチドをDNAに添加して形成されたコンプレックスは、分子凝集となり、沈澱物を生成することになる。

旋光分散および偏光二色性は、塩基性ホモポリペプチドおよびDNA間の溶液中での相互作用の研究に応用された。シャピロレングおよびフェルセンフェルド(Biochemistry,8:3219-3232,1969)は、旋光性試験してDNAコンプレックスの形成と関連した二次構造の変化を、ステップダウン塩透析における両成分をアニーリングするものとは基本的に異なるDNAにポリリシンをコンプレックスするためのプロトコルを用いて、解明させた。彼等は直接ポリリシンとDNAを高塩溶媒(1M NaCl)中に混合し、「可溶性」コンプレックスを形成させた。

高度の濁度は溶液中のコンプレックスと関連し、成分の凝集を示す。偏光二色スペクトルが 320ないし 360nmの範囲の波長で漸近的ベースラインに達するので、凝集はコンプレックスの旋光性を決定するために使用した。異常なスペクトルは常に濁度と関連していた。われわれは、光学活性の変化が凝集の際の高次分子コンプレックスの形成から生じると推論した。

上述の実験条件下で得られたDNAコンプレックスは、約5000から10000 単位の間で変化する半沈降係数をもつ。平均粒子は直径340nm であり、(光散乱によって与えられる情報を使用して計算した)そして粒子平均乾燥質量が約70核酸ポリペプチド分子単位に相当していた。これらの研究によって提供される情報は、完全に量的ではないが、DNAが塩基性ポリペプチドに結合した後に受ける構造の変化を表す。

溶液におけるDNA−ポリベースコンプレックスの構造の幾つかの局面が研究された(ハイネスギャレットおよびグラツェル,Biochemistry,9:4410-4416, 1970)。電子顕微鏡によってシャピロらによって記述されたコンプレックスの規則正しい性質を確認された;DNA構造体外形が300nm のドーナツ状のトロイドとして形成していた。DNAポリ塩基コンプレックスのC.D.および電子顕微鏡の特徴は、一本鎖ポリヌクレオチド−ポリベースコンプレックス、すなわち、rRNA、ポリ(A)、ポリ(U)等)が異常な光学活性を示さないので、ワトソンクリックDNAヘリックスにある構造因子に対応していることである。また、規則正しい構造は電子顕微鏡で検出することができる。基本傾斜および/またはヘリックスピッチの変化が、コンプレックス中に観察することができるかどうか明らかにするために、コンプレックスのX線回折パターンが決定された。二重ヘリックスは水溶液中の遊離DNAに対し得られる通常B形である;DNAのCまたはA形に対しては明確なトランジションは見られず、DNAが溶液中の塩基性ポリペプチドに入り込む際に異なる構造形が存在することを示唆している。また塩濃度が減少するときDNA−ポリリシンコンプレックス中のカウンターイオンが連続的に置換することにより示されるように、電荷が直接ペアになるDNA−ポリメラーゼコンプレックスの結合もある。従って塩基と荷電したアミノ基との間の強い相互作用はいずれも全く有りそうにない。従って、溶液中のDNAの異常な回転力キラルパッキングから生じ、この種の現象は同じ平面内の分子の非対称のパッキングに大きい周期性が現れることと関連している。

ルマンらは、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,68:1986-90(1971)に、ファージDNAの希釈溶液を十分に高い濃度の単一の中性のポリマー(ポリエチレンオキシド)を高NaCl(細胞内の環境に似せた)の存在下に混合すると、ファージDNA分子はファージ頭部の緻密な中身に近づく粒子に崩壊する。DNAコンプレックスの構造はゴスルおよびシェルマンによって決定された(Nature 259: 333-335,1976)。彼等の発表とさらに詳細な報告(Gosule,L.,Chattoraj.D.K.,and Schellman.J.,Advances in Polyamine Research 1:201-215,1978)は、塩基性ポリペプチド(スペルミンおよびスペルミジン)によるDNAのコンパクション(非常に希釈した溶液中)は、最初にLi,Biopolymers,12:287(1973)によって記載された条件下に、トロイド構造で得られた。ゴスルおよびシェルマンによって生成されたコンプレックスは最大半径が約50nmに詰められたファージDNAの単一DNA単位からなる単分子構造をもっていた。著者らはポリアミンバクテリア細胞に存在することが知られていると記している。またDNAコンパクションはLaemmli,PNAS 72:4288-92(1975)およびPost and Zimm,Biopolymers,21:2123-32(1982)によって議論されている。
この明細書中引用した全参照文献はここに参照文献として組み込まれる。いずれの参照文献も従来技術を構成している。参照文献の議論は引用した文書が正確で適切であることを吟味する権利を保有する。
米国特許第5,166,320号明細書
米国特許第5,108,921号明細書
Lerman et al., Proc.Nat.Acad.Sci.USA,68:1986-90(1971)

概要

核酸を、多細胞生物体の細胞にインヴィヴォで導入する方法の提供。緻密にした物質が投与される器官への標的細胞による取り込みを容易にするため、標的遺伝子を置換し、改変しまたは除去するように、遺伝子発現、発現が望ましくない内生的な核酸にハイブリッド形成、または部位特異的統合を行い、臨床効果を達成する。より具体的には、核酸をポリカチオンを有するキャリヤ分子にさせる。核酸は好ましくは凝縮状態に緻密化する。なし

目的

標的A.一般 「標的にする」は、臨床目的を達成するために有効な量で標的細胞に入るように緻密にした核酸を投与することである

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

凝集核コンプレックスから成る非天然に生じる組成物であって、各コンプレックスが一本鎖又は二本鎖核酸分子および1またはそれ以上のキャリヤ分子から成り、前記キャリヤ分子が核酸にコンプレックスするポリカチオンを有し、そして任意に標的細胞に結合しこれによって前記コンプレックスがさらに容易に標的細胞に入ることができる標的細胞結合部分を有し、前記コンプレックスが12−30nmの直径に緻密化されている組成物。

請求項2

キャリヤ分子が標的細胞結合部分から成り、標的細胞結合部分が抗体または抗体の特異的結合断片である請求項1記載の非天然に生じる組成物。

請求項3

抗体がpIgR、CD4またはgp120を特異的に結合する請求項2記載の非天然に生じる組成物。

請求項4

標的細胞結合部分がガラクトースラクトースおよびマンノースからなる群から選択される請求項1記載の非天然に生じる組成物。

請求項5

非凝集核酸コンプレックスから成る非天然に生じる組成物を調製する方法であって、各コンプレックスが一本鎖又は二本鎖核酸分子および1またはそれ以上のキャリヤ分子から成り、前記方法が:12−30nmである直径にコンプレックスを緻密にするために十分なカオトロピック塩濃度でキャリヤ分子と核酸分子を混合し、これによって非凝集核酸コンプレックスが形成され、各コンプレックスは一本鎖又は二本鎖核酸分子および1またはそれ以上のキャリヤ分子から成る方法。

請求項6

キャリヤ分子が標的細胞結合部分から成り、標的細胞結合部分が抗体または抗体の特異的結合断片である、請求項5記載の非天然に生じる組成物を調製する方法。

請求項7

抗体がpIgR、CD4またはgp120を特異的に結合する請求項6記載の非天然に生じる組成物を調製する方法。

請求項8

標的細胞結合部分がガラクトース、ラクトースおよびマンノースからなる群から選択される請求項5記載の非天然に生じる組成物を調製する方法。

請求項9

キャリヤ分子がポリカチオンである請求項5記載の非天然に生じる組成物を調製する方法。

請求項10

非凝集核酸コンプレックスから成る非天然に生じる組成物を調製する方法であって、各コンプレックスが一本鎖又は二本鎖核酸分子および1またはそれ以上のポリカチオンキャリヤ分子から成り、前記方法が:コンプレックスを形成するように溶媒中に核酸分子とポリカチオンキャリヤ分子を混合し、前記混合は追加のカオトロピック塩の不在で行われ、これによって核酸は凝集体を形成することなくポリカチオンキャリヤ分子と可溶性コンプレックスを形成し、各コンプレックスは核酸分子および1またはそれ以上のポリカチオンキャリヤ分子から成り、コンプレックスは12−30nmの直径をもつ。

請求項11

請求項5または10の方法によって作られた核酸と1またはそれ以上のポリカチオンの非凝集性の緻密化した非天然に生じるコンプレックス。

請求項12

(1)各コンプレックスが単一の核酸分子および1またはそれ以上のキャリヤ分子から成り、前記キャリヤ分子が核酸にコンプレックスする核酸結合部分を有し、そして、任意に、標的細胞に結合しこれによって前記コンプレックスがさらに容易に標的細胞に入ることができる標的細胞結合部分を有し、前記コンプレックスが12−30nmの直径に緻密化されている、非凝集核酸コンプレックス、および(2)製薬学的受容できるキャリヤからなる製薬組成物

請求項13

(1)各コンプレックスが単一の核酸分子および1またはそれ以上のキャリヤ分子から成り、前記キャリヤ分子が核酸にコンプレックスする核酸結合部分を有し、前記コンプレックスが12−30nmの直径に緻密化されている、非凝集核酸コンプレックス、および(2)製薬学的に受容できるキャリヤからなる製薬組成物。

請求項14

各コンプレックスがクロリドチャンネルを符号化する単一の核酸分子および1またはそれ以上のキャリヤ分子から成り、前記キャリヤ分子が核酸にコンプレックスする核酸結合部分を有し、そして、任意に、標的細胞に結合しこれによって前記コンプレックスがさらに容易に標的細胞に入ることができる標的細胞結合部分を有し、前記コンプレックスが12−30nmの直径に緻密化されている、非凝集核酸コンプレックスからなる、嚢胞性繊維症の予防または治療用製剤

請求項15

各コンプレックスがヒトLDL受容体を符号化する単一の核酸分子および1またはそれ以上のキャリヤ分子から成り、前記キャリヤ分子が核酸にコンプレックスする核酸結合部分を有し、そして、任意に、標的細胞に結合しこれによって前記コンプレックスがさらに容易に標的細胞に入ることができる標的細胞結合部分を有し、前記コンプレックスが12−30nmの直径に緻密化されている、非凝集核酸コンプレックスからなる、家族性コレステリン血症の予防または治療用製剤。

請求項16

各コンプレックスがヒト因子IXを符号化する単一の核酸分子および1またはそれ以上のキャリヤ分子から成り、前記キャリヤ分子が核酸にコンプレックスする核酸結合部分を有し、そして、任意に、標的細胞に結合しこれによって前記コンプレックスがさらに容易に標的細胞に入ることができる標的細胞結合部分を有し、前記コンプレックスが12−30nmの直径に緻密化されている、非凝集核酸コンプレックスからなる、血友病Bの予防または治療用製剤。

請求項17

核酸結合部分がポリカチオンである請求項10、12、13、14、15または16記載の製剤。

請求項18

標的細胞結合部分がガラクトース、ラクトースおよびマンノースからなる群から選択される請求項10、12、13、14、15または16記載の製剤。

請求項19

キャリヤ分子が標的細胞結合部分からなり、標的細胞結合部分が抗体または抗体の特異的結合断片である請求項10、12、13、14、15または16記載の製剤。

技術分野

0001

本願と同じ明細書で1994年3月23日に出願された米国特許出願第08/216,534号の一部継続出願であり米国では特許番号6,077,835号で特許された。本発明は核酸の緻密化および緻密にした外来性の核酸を多細胞生物体細胞に、インヴィヴォデリバリすることに関するものである。

背景技術

0002

機能外来性遺伝子は、インヴィトロトランスフェクション、直接ミクロ注入電気窄孔法、およびリン酸カルシウムとの共沈を含む種々の物理的方法によって哺乳類の細胞に導入することができる。しかし、これらの技術の大部分は無傷動物内の細胞に遺伝子をデリバリするためには非実用的である。

0003

インヴィヴォでの受容体依存性の緻密化していないDNAのデリバリ。受容体媒介遺伝子導入トランス遺伝子を適当な受容体細胞に導入する際にインヴィヴォおよびインヴィトロで成功することが示された。この方法は、関係する組織の表面の特定の受容体を標的にするように選択される共有結合したリガンドを含むポリカチオン蛋白質(通常ポリ−L−リシン)に、DNAを結合することを含む。遺伝子は組織によって集められ、細胞核移送され、時間を変えて発現される。標的組織のトランス遺伝子の発現の全体のレベルは幾つかの因子に依存する:DNAキャリヤ複合体の安定性標的細胞の表面の特異的受容体の存在と数、受容体−キャリヤリガンドの相互作用エンドサイトーシスおよび複合体の細胞核への移送、および標的細胞の核中の遺伝子転写の有効性である。

0004

ウらは、USP 5,166,320 に、ポリ核酸結合剤(例えばポリリシンポリアルギニンポリオルニチン、ヒストンアビジン、またはプロタミン)および組織受容特異的蛋白質リガンドの共役体を使用するDNAの組織特異的デリバリを開示している。肝臓細胞を標的にするために、ウは「アシアロ糖蛋白質ガラクトース末端)リガンド」を示唆している。これらは、適当な糖蛋白質の脱シアル化によって、またはラクトースを非ガラクトース挙動蛋白質に結合することによって形成することができると、ウは言っている。ポリ核酸と共役体のモル比は、1:10ないし10:1さらに一般的には1:5ないし5:1、さらに好ましくは1:2ないし3:1の範囲である。ウらによって記述されていないが、われわれの手元には、ウの方法は少なくとも80nmの直径をもつ構造体が得られている。

0005

ロウらは、USP 5,108,921 に、受容体依存性エンドサイトーシスを使用して細胞を形質転換するためDNAにビオチンを結合することを開示している。
ストンプらは、USP 5,122,466 に、そしてマックケーブらは、USP 5,120,657 に、物質にポリリシンを共投結合し、次にDNAをそれに複合させることにより、DNAを金属ペレットに結合することを開示している。得られた生成物は次に細胞の弾道形質転換に使用される。参照ストンプら、7欄、29〜37行目およびマックケーブら、7欄、49〜65行目。

0006

ワグナーらは、Proc.Natl.Acad.Sci.,88:4255-4259(1991)に、受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞にDNAをデリバリするためトランスフェリン−ポリリシン結合体とDNAを複合化することを開示している。ワグナーらは、80-100 nm の直径のドーナツ形の構造体にプラスミドDNAを緻密にするように混合物中にポリカチオンが十分にあることが重要であると教示し、エンドサイトーシスの発生を容易にすると彼等は推測している。ワグナーらは、一層小さい直径の構造体を得る価値については認識してなく、またさらなる緻密化を得る方法を教示していない。ワグナーらの構造体は多分子コンプレックスであり、これはマクロファージ食作用に一層無防備であり、標的組織による取り込みにあまり敏感に反応しないという欠点をもつ。

0007

の緻密化していないDNAの直接の注入。裸のDNAを動物組織直接注入することによって遺伝子発現を検出する可能性は、最初ドベンスキらによって、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,81:7529-33(1984)に示され、マウス肝臓または脾臓に注入したウイルスまたはプラスミドのDNAは検出できるレベルで発現されたことを示した。このDNAはリン酸カルシウムを使用して沈澱させ、ヒアルロニダーゼおよびコラゲナーゼ一緒に注入された。トランスフェクションした遺伝子は宿主動物の肝臓中に複製することが示された。ベンベニスティおよびレシェフは、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,83:9551-55(1986)に、リン酸カルシウム沈澱DNAを新生児ラット腹腔内に注入し、トランスフェクション48時間後、動物の肝臓中の遺伝子発現に注目した。1990年に、ウォルフらは、Science, 247:1456-68(1990)に、DNAまたはRNA発現ベクターをマウスの筋肉に直接注入すると2ヶ月までの期間、遺伝子の発現を検出できることを報告した。この技法アスカジら、New Biologist,3:71-81(1991)によって拡張され、裸のDNAをラットの心臓に直接注入し、注入した遺伝子は動物の心臓中に25日まで発現された。ジストロフィンのための遺伝子を含む他の遺伝子は、この技法を使用してマウスの筋肉に注入された。この方法は、標的組織に直接注入することによる遺伝子の投与によって動物に免疫反応を生成させるための幅広アプローチ土台を形成している。遺伝子は、一時的に発現され、特定の抗原を生成する(参照、ドネリーら、The Immunologist,21,20-26(1994)最近の概説)。しかし、これらの実験に使用されるDNAは、細胞内での生存、細胞核への取り込み、または標的細胞の核中の転写の割合を改善するように改質されあるいは緻密にされていなかった。

0008

溶液中のDNAの挙動。リン酸塩中心軸が負に高帯電された性質によって、DNAは溶液中で棒状の分子であり、その基本構造ヘリックスと結合した水和殻の修飾によって摂動することができる。この摂動は、二つの方法でもたらされる;第一に、DNA分子の荷電中性化度の変化が、広範囲な緻密化となり、緻密構造の形でDNA相を結局分離する(沈澱)、そして第二に、DNAヘリックスの比誘電率の変化が緻密構造を形成することになる。これらの摂動はDNA分子のコンホメーションを変化させて、曲げて緻密になる可撓性ポリマーを可能にし、DNA分子の流体力学の性質を著しく変えることになる。得られた構造はDNAが比較的高等真核生物中の染色体あるいはウイルスキャプシドの内側で呈する性質に似た性質であると考えられている。

0009

比較的高等な真核生物の核中のDNAは、リシンおよびアルギニン(ヒストン類)またはアルギニン(プロタミン類)が多く含まれている塩基性核蛋白質(すなわち、ヒストン類およびプロタミン類)と完全に結合する。これらの塩基性蛋白質とDNAのコンプレックスは、染色体形成の際に生じるDNA緻密化をコントロールするために反応し、遺伝子発現の制御に一役を担うと考えられる。ウイルス、バクテリアおよび真核生物の細胞核中に生理学的に生じるDNA緻密化は、実験室再現することは非常に困難である。理論的には、DNAの中心軸の高く負に荷電した性質によって、DNAの荷電を中性化するような変化は広範囲な緻密化をもたらし、結局、緻密構造の形でDNA相を分離する(沈澱)。しかし、DNA−ポリカチオンコンプレックスの溶液中での振舞はDNAとポリカチオン蛋白質とのコンプレックス形成のための方法に依存する。

0010

核蛋白質コンプレックス形成のためのモデルとしてカチオンホモポリペプチドを使用するオリンズ、オリンズおよびフォンヒップルによる研究は(J.Mol.Bio。24,157-176,1967)、溶液中で両成分をアニーリングした後に、カチオンのポリペプチド(ポリ−L−リシン、ポリ−L−アルギニンおよびポリ−L−オルニチン)とDNAの特定のコンプレックスの生成のための証拠を示した。この方法は2Mないし0.010 MのNaCl濃度からステップダウン透析を含んでいた。

0011

この研究でいくつかのコメントをすることができる。先ず、ポリカチオンをDNAに添加して形成されたコンプレックスの熱変性は、研究した各ケースで生じたDNAにポリカチオンを結合し、DNAの二本鎖構造を安定にする。このシステムは、比誘電率の変化(すなわち、アルコール脱水)が、DNAの熱変性特性の変化がないDNA崩壊となるものとは異なることに注目することが重要である。第二に、分光光度計による研究は、260nm での最大吸収が、300nm(ポリカチオンもDNAも何ら吸収を示さない領域)よりも大きい波長濁度が連続して増加する赤色に僅かにシフトすることを示した。これらの特性は、DNAとポリペプチドとの間の相互作用によって生じる可能性がある、コンホメーションの小さい変化が変則の吸収スペクトルによって検出されたことを示していると考えられた。第三に、塩基性ポリペプチドをDNAに添加して形成されたコンプレックスは、分子凝集となり、沈澱物を生成することになる。

0012

旋光分散および偏光二色性は、塩基性ホモポリペプチドおよびDNA間の溶液中での相互作用の研究に応用された。シャピロレングおよびフェルセンフェルド(Biochemistry,8:3219-3232,1969)は、旋光性試験してDNAコンプレックスの形成と関連した二次構造の変化を、ステップダウン塩透析における両成分をアニーリングするものとは基本的に異なるDNAにポリリシンをコンプレックスするためのプロトコルを用いて、解明させた。彼等は直接ポリリシンとDNAを高塩溶媒(1M NaCl)中に混合し、「可溶性」コンプレックスを形成させた。

0013

高度の濁度は溶液中のコンプレックスと関連し、成分の凝集を示す。偏光二色スペクトルが 320ないし 360nmの範囲の波長で漸近的ベースラインに達するので、凝集はコンプレックスの旋光性を決定するために使用した。異常なスペクトルは常に濁度と関連していた。われわれは、光学活性の変化が凝集の際の高次分子コンプレックスの形成から生じると推論した。

0014

上述の実験条件下で得られたDNAコンプレックスは、約5000から10000 単位の間で変化する半沈降係数をもつ。平均粒子は直径340nm であり、(光散乱によって与えられる情報を使用して計算した)そして粒子平均乾燥質量が約70核酸/ポリペプチド分子単位に相当していた。これらの研究によって提供される情報は、完全に量的ではないが、DNAが塩基性ポリペプチドに結合した後に受ける構造の変化を表す。

0015

溶液におけるDNA−ポリベースコンプレックスの構造の幾つかの局面が研究された(ハイネスギャレットおよびグラツェル,Biochemistry,9:4410-4416, 1970)。電子顕微鏡によってシャピロらによって記述されたコンプレックスの規則正しい性質を確認された;DNA構造体外形が300nm のドーナツ状のトロイドとして形成していた。DNAポリ塩基コンプレックスのC.D.および電子顕微鏡の特徴は、一本鎖ポリヌクレオチド−ポリベースコンプレックス、すなわち、rRNA、ポリ(A)、ポリ(U)等)が異常な光学活性を示さないので、ワトソンクリックDNAヘリックスにある構造因子に対応していることである。また、規則正しい構造は電子顕微鏡で検出することができる。基本傾斜および/またはヘリックスピッチの変化が、コンプレックス中に観察することができるかどうか明らかにするために、コンプレックスのX線回折パターンが決定された。二重ヘリックスは水溶液中の遊離DNAに対し得られる通常B形である;DNAのCまたはA形に対しては明確なトランジションは見られず、DNAが溶液中の塩基性ポリペプチドに入り込む際に異なる構造形が存在することを示唆している。また塩濃度が減少するときDNA−ポリリシンコンプレックス中のカウンターイオンが連続的に置換することにより示されるように、電荷が直接ペアになるDNA−ポリメラーゼコンプレックスの結合もある。従って塩基と荷電したアミノ基との間の強い相互作用はいずれも全く有りそうにない。従って、溶液中のDNAの異常な回転力キラルパッキングから生じ、この種の現象は同じ平面内の分子の非対称のパッキングに大きい周期性が現れることと関連している。

0016

ルマンらは、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,68:1986-90(1971)に、ファージDNAの希釈溶液を十分に高い濃度の単一の中性のポリマー(ポリエチレンオキシド)を高NaCl(細胞内の環境に似せた)の存在下に混合すると、ファージDNA分子はファージ頭部の緻密な中身に近づく粒子に崩壊する。DNAコンプレックスの構造はゴスルおよびシェルマンによって決定された(Nature 259: 333-335,1976)。彼等の発表とさらに詳細な報告(Gosule,L.,Chattoraj.D.K.,and Schellman.J.,Advances in Polyamine Research 1:201-215,1978)は、塩基性ポリペプチド(スペルミンおよびスペルミジン)によるDNAのコンパクション(非常に希釈した溶液中)は、最初にLi,Biopolymers,12:287(1973)によって記載された条件下に、トロイド構造で得られた。ゴスルおよびシェルマンによって生成されたコンプレックスは最大半径が約50nmに詰められたファージDNAの単一DNA単位からなる単分子構造をもっていた。著者らはポリアミンバクテリア細胞に存在することが知られていると記している。またDNAコンパクションはLaemmli,PNAS 72:4288-92(1975)およびPost and Zimm,Biopolymers,21:2123-32(1982)によって議論されている。
この明細書中引用した全参照文献はここに参照文献として組み込まれる。いずれの参照文献も従来技術を構成している。参照文献の議論は引用した文書が正確で適切であることを吟味する権利を保有する。
米国特許第5,166,320号明細書
米国特許第5,108,921号明細書
Lerman et al., Proc.Nat.Acad.Sci.USA,68:1986-90(1971)

発明が解決しようとする課題

0017

発明の概要本発明は、実質的に凝集しないで、核酸を緻密化するための方法、およびこの緻密化したDNAの治療用途に関するものである。緻密な核酸は生体細胞の膜、特に多細胞の生物体中の細胞を通って有効にデリバリすることができる。小さい粒子に圧縮されたDNAは核の細孔を通る核輸送に一層適しており、ヌクレアーゼから保護することができる。核酸が発現できる遺伝子を含むとき、この遺伝子は細胞中で発現することができる。

0018

幾つかの環境では、組織特異的キャリヤ分子は、核酸結合部分と標的組織結合部分をもつ二機能の分子が調製される。次に核酸を、臨界塩濃度でキャリヤ分子を用いて高濃度に緻密にする。核酸を装填したキャリヤ分子は、次に生物体に投与する。核キャリヤ分子は単一の核酸分子をもつ。

0019

他の好適例では、標的組織結合キャリヤ分子を使用しない。しかし、核酸はさらに、核酸と溶媒の間の相互作用を減らす核酸結合部分からなるキャリヤ分子とコンプレックスを形成して緻密にする。緻密になったコンプレックスは生物体に投与する。
後記の請求の範囲は、ここに本発明の好適例の詳説としてこの記述の中に引用して組み込まれる。

発明を実施するための最良の形態

0020

多細胞生物体外来の核酸を導入するために望ましい任意の多細胞生物体は本発明の可能性のある主題である。多細胞生物体は植物または動物、好ましくは動物である。動物は好ましくは脊椎動物であり、さらに好ましくは高等脊椎動物、すなわち、哺乳動物またはであり、哺乳動物が特に好ましい。哺乳動物の中で、好ましいものはヒトおよび他の霊長類、マウス、ラット、ラビットおよびハムスターのような実験動物およびのようなペット動物、および山羊およびのような農場動物である。これらの動物は哺乳類の4目:霊長類、齧歯類食肉類および偶蹄目類である。

0021

標的細胞標的細胞は、その神経系(例えば、脳、脊髄および末梢神経細胞)、循環系(例えば、心臓、管組織および赤血球および白血球)、消化系(例えば、および腸)、呼吸系(例えば、および)、生殖系内分泌系(肝臓、脾臓、甲状腺上皮小体)皮膚、筋肉、または結合組織に属する(動物の場合)細胞を含む生物体の組織(器官を含む)に属する。
あるいは、細胞は標的生物体の任意の器官または組織から引き出される癌細胞、または生物体に感染する寄生体または病原体の細胞、またはウイルスに感染した生物体の細胞である。

0022

肝臓に効く遺伝子療法に有用な方法は肝臓に関係する遺伝子を導入するために有効な比較的健康な組織を侵さないアプローチが必要である。受容体介在遺伝子転移を使用する幾つかの技法が、うまく使用されてきた。しかし、部分的肝切除がない場合にも、肝臓で遺伝子導入の発現を長引かすことになる容易に再現できる方法、従ってヒト遺伝子治療に使用できるものが必要である。外来DNAはリガンド−ポリ−L−リシン二共役体によってアシアログリコプロテイン(ASGP)受容体を標的にすることによって成体動物の肝細胞に導入した。有効になるためのリガンド標的技法に対しては、DNAは血液中にそのまま残るようにする形でなければならず、肝細胞の表面にASGP受容体によって認識されるように十分小さくなければならない。ワグナーら(1991)は、DNAとポリ−L−リシン/トランスフェリン結合体を直径が80-100nmのコンプレックスに凝縮して、肝腫瘍細胞トランスフェリン受容体に遺伝子を標的にさせた。この大きさのDNA結合体は肝腫瘍細胞のトランスフェリン受容体によって認識するため適当であるが、肝細胞のASGP受容体は直径が10-20nm よりも大きいリガンドに対して区別する。

0023

われわれは受容体介在摂取によって成体動物の肝臓に遺伝子を導入するための方法を開発し、遺伝子を 140日間発現させることになった(実験の継続時間)。
この方法はヒト遺伝子治療に応用するために可能性がある。この方法の主な利点は(i)DNAコンプレックスの調製が容易であること;(ii)特定の組織に遺伝子を標的にする能力;(iii)肝臓での遺伝子の発現を長引かせること;(iv)感染性ウイルスDNAが全くないのでコンプレックスが比較的安全であること;および(v)導入した遺伝子のエピソーム保存である。

0024

標的A.一般 「標的にする」は、臨床目的を達成するために有効な量で標的細胞に入るように緻密にした核酸を投与することである。これについて、DNAおよびRNAは標的細胞の核に複製することができ、その結果細胞内の核酸の最大水準が摂取後に増加することに注目する必要がある。さらに、臨床効果が核酸によって発現される蛋白質により媒介されるならば、核酸は鋳型として働き、従って、細胞内の核酸のコピーの数が小さくとも、高水準の蛋白質発現を達成することができる。
それでもなお、DNAを拾い上げる標的細胞の数および各細胞によって拾い上げられるDNA分子の数を増やすように高濃度のDNAを緻密化することが望ましい。
投与の経路および部位は標的を高めるように選択することができる。例えば、筋肉細胞を標的にするため、関連する筋肉への筋肉内注入を必然的に選択する。
肺細胞は緻密にしたDNAをエーロゾルの形で投与することによって標的にすることができる。管内皮細胞は緻密にしたDNAでバルーンカテーテルコーティング機械的にDNAを導入することによって標的にすることができる。

0025

ある場合には、核酸を緻密な状態で維持する核酸結合部分はまた、標的剤として働くことができる。正に荷電したアミノ酸のポリマーは多くの核蛋白質中で核局部化信号(NLS)として作用することが知られている。ポリ−L−リシンで凝縮したpSV40-ルシフェラーゼDNAは、そのままラットの腹部筋肉に注入された。はっきりした標的細胞結合部分がないにもかかわらず、複合DNAを注射したラットでは、裸のDNAを注射したラットよりも、20倍高いルシフェラーゼ活性を観察した。それでもなお、幾つかの好適例では、標的細胞結合部分を使用すると標的が改善される。

0026

B.標的細胞結合部分の使用 TBMを使用する場合、関連する標的細胞の接近できる構造(「受容体」)に特異的に結合しなければならない。これらの細胞に対して完全に特異的であることは必要ないが、治療に有効な共役体に十分に特異的でなければならない。好ましくは、その他の細胞との交差反応性が10%よりも小さく、さらに好ましくは5%よりも小さい。
標的細胞の接近できる構造に対してTBMが有しなければならない絶対的な最少親和力はないが、親和力が高い程良い。好ましくは、親和力は少なくとも103リットルモルであり、さらに好ましくは、少なくとも106リットル/モルである。
TBMは、標的細胞の表面でエピトープに特異的に結合する抗体(またはFab,Fab,VM,VLまたはCDRのような抗体の特異的結合断片)である。細胞、細胞膜、または単離した細胞表面抗原に対して抗体を増やす方法は、この技術分野で知られている:

0027

a.免疫脾臓細胞の生成:可溶性抗原を用いる免疫化、Hurrell,J.G.R.(1982)Monoclonal Antibodies:Techniques and Applications.CRCPress,Boca Raton,Florida.
b.コンプレックス抗原を用いる免疫化:膜、全細胞および微生物。Hurrell,J.G.R.(1982)Monoclonal Antibodies:Techniques and Applications.CRC Press,Boca Raton,Florida.
c.モノクローナル上澄み液および腹水液の生成。Andrew,S.M.and Titus,J.A.(1991)。Purification of Immunoglobulin G.in Current Protocol in Immunology(J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.J.Margulies,E.M.Shevach and W.Strober,ed.)pp.A.3.9.-A.3.12。Grrene Publishing Wiley-Interscience,New York.
d.ラビット中のポリクローナル抗血清の生成。Garvey J.S.,Cremer,N.E.and sussdorf,D.H(eds)(1977)Methods in Immunology; A Laboratory Text for Instruction and Research,Third Edition.W.A.Benjamin,North Hampton,Mass.
e.キャリヤ蛋白質への合成ペプチド化学結合による抗ペプチド抗体の生成。Jemmerson,R.,Morrow,P.I.,Klinman,N.I and Patterson,Y.(1985).合成ペプチドを使用して哺乳類のシトクロムC進化保持部位分析。Proc.Natl Acad.Sci.,U.S.A.82,1508-1512.

0028

TBMはレクチンであり、そのために、細胞表面に同起源炭水化物構造がある。
標的結合部分は標的細胞によって運ばれる受容体によって特異的に結合したリガンドである。
関連するリガンドの1のクラスは炭水化物、特に、モノおよびオリゴ糖類である。適当なリガンドは、ガラクトース、ラクトースおよびマンノースを含む。
関連するリガンドの他のクラスはペプチド類(ここで蛋白質を含む)、例えばインシュリン表皮生長因子腫瘍壊死因子プロラクチン絨毛膜ゴナドトロピンFSHLHグルカゴンラクトフェリン、トランスフェリン、アポリポプロテインE、gp120 およびアルブミンである。

0029

次に種々のクラスの標的細胞のための好ましい標的結合部分をまとめる:肝臓細胞→ガラクトース、クッパー細胞→マンノース、マクロファージ→マンノース、肺→Fab断片 対ポリメリックグロブリン受容体(Pig R)、脂肪組織→インシュリン、リンパ球→Fab 断片 対 CD4 またはgp120、腸細胞ビタミンB12、筋肉→インシュリン、繊維芽細胞→マンノース−6−ホスフェート神経細胞→アポリポプロテインE。

0030

標的結合部分はNABM/NA凝縮コンプレックスを直接注入する場合には厳密に言えば必要がない。この場合の標的細胞はコンプレックスを標的細胞の近所に注入してNABM/NA凝縮コンプレックスに受動的に接近することができる。
C.リポソーム媒介遺伝子転移種々の脂質および溶媒条件を使用してDNAをリポソーム(脂質二重層によって含まれるボディ)に封じ、リポソームを動物組織に注入して遺伝子発現を検出する可能性は、広範囲に示された(参考文献1−7)。しかし、種々の生物系に対してこの技法が可能性があるにもかかわらず、これらの実験に使用されたDNAは細胞中の生存、核への取り込み、または標的細胞の核中の転写の割合を改善するように改変または緻密化されなかった。従って、これらの方法は通常、リポソームによって運ばれる遺伝子の一時的な発現だけになっていた(参考文献4,5)。

0031

カチオン脂質はDNAを転移するためにうまく使用されてきた。このような脂質のカチオン成分はDNAを溶液中で緻密にすることができる(参考文献1〜3,7)。
この方法は多量に凝縮したDNAコンプレックスとなることを示し(参考文献1,2)、DNAをインヴィトロでトランスフェクションするとき、遺伝子転移および発現の有効性を増加することになる(裸のDNAに対して)。これらのコンプレックスの生成は、インヴィトロで遺伝子転移を促進できるが、このようなコンプレックスをインヴィヴォで注入すると、長く継続した有効な遺伝子転移とならない。
従って、われわれの凝縮方法は、DNA/カチオン脂質コンプレックスに対して構造上の特徴を与え、インヴィヴォ発現を長続きさせることができる。このような方法の組合せは2方法のいずれかによって達成することができると信じる:1.後に中性脂質を用いてリポソーム体に封じる凝縮DNAコンプレックスの生成、または2.この明細書に記載した方法を用いて、カチオン脂質を用いて凝縮する際に高凝縮単一分子DNAコンプレックスの生成が達成できる。これらのコンプレックスはインヴィヴォで動物の組織に遺伝子転移を高効率に行う必要がある。DNA凝縮のためのわれわれの方法は、得られた緻密なDNAをリポソーム体に封じるように結合させるならば、動物へのトランスフェクションのために種々の利点を提供することができる:

0032

1.リボソームは組織中の哺乳類細胞細胞質膜の脂質二重層との受動融合を促進する。
2.次に凝縮したDNAは細胞区画を通って高効率で遺伝子情報を、その発現のための核に転移することができる。
3.凝縮したDNAは細胞内の分解に対して保護され、従って新しく導入された遺伝子の発現の持続性を高めることができる。
4.ポリカチオン凝縮DNAへの可能な免疫学的応答を、免疫学的に不活性の脂質二重層に封じることによって避けることができる。

0033

参考文献1 Ghirlando,R.,Wachtel,E.J,Arad,T.,and Minsky,A.(1992)ミセル凝集物によって促されたDNAパッケージ化新規のインヴイトロDNA凝縮系
Biochemistry,31,7110-7119.
2 Braulin,W.H.,Strick,T.J.,and Record,M.T.,Jr.(1982)Biopolymers 21,1301-1309.
3 Zhu,N.,Liggitt,D.,Liu,Y.,Debs,R.(1933)成体マウスへの静脈内DNAデリバリ後の規則正しい遺伝子発現。Science,261,209-211.
4 Alino,S.F.,Bobadilla,M.,Garcia-Sanz,M.,Lejarreta,M.,Unda,F.,and Hilario,E.(1993)ヒトα1-抗トリプシン遺伝子のリボソームによるマウス肝細胞へのインヴィヴォデリバリ。Biochem.Biophys.Research Communications 192,174-181.
5 Takeshits,S.,Losordo,D.W.,Kearney,M.,Rossow,S.T.,and Isner,J.M.(1994)ラビット動脈器官培養モデル中にリボソーム媒介遺伝子転移した後の組み換え蛋白質分泌時間経過。Lab.Invest.71,387-391.
6 Jarnagin,W.R.,Debs,R.J.,Wang,S.S.,and Bissell,D.M..(1992)Nucleic AcidsRes.20,4205-4211.
7 Philip,R.,Liggitt,D.,Phillip,M.,Dazin,P.,Debs,R(1993)インヴィヴォ遺伝子デリバリ。成体マウス中のTリンパ球の有効なトランスフェクション。J.Biol.Chem.268,16087-16090.

0034

核酸結合部分核酸に可逆的に結合する物質はどれも核酸結合部分(NABM)として働くことができるが、その条件は、(1)共役体が標的細胞に達して入るまで保持するように核酸に十分に強く特異的に結合し、その結合によって、核酸にダメージを与えたり変化させることがないこと、および(2)核酸と溶媒の間の相互作用を減らし、これによって凝縮を生じさせることである。最後の基準は共役体の治療有効性である。
好ましくは、NABMはポリカチオンである。その正に荷電した基がイオンにより負に荷電したDNAに結合し、その結果、電荷中和によりDNA−溶媒の相互作用を減らす好ましいポリカチオンはポリリシンである。。他の可能性のある核酸結合部分は、Arg-Lys混合ポリマー、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、およびプロタミンを含む。

0035

核酸本発明に従う組み換えDNAおよびRNA分子構築するための基本的方法サムルック.ジェイらによって:Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second
Edition,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)
に開示されており、ここに参考文献として組み込まれる。
核酸はDNA、RNA、またはDNAまたはRNA誘導体、例えば下記のようなインヴィヴォで分解に耐えられる誘導体である。この明細書では、その前後関係によってはっきり言っていない場合は、DNAに関する文献は、必要な変更を加えて、同様に他の核酸にも適用する。核酸は一本鎖または二本鎖である。好ましくは10ないし1,000,000塩基(または塩基対)、さらに好ましくは100 ないし100,000 であり、その塩基は同じかまたは異なる。塩基は「正常の」塩基アデニン(A)、グアニン(G)、チミジン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)、または 37 CFR L § 1.822(p)にまとめられたもののような異常塩基である(1)。核酸は任意の望ましい方法で調製することができる。

0036

好適例では、核酸は標的細胞において機能的である発現遺伝子を含む。例えば遺伝子は凝縮因子、(例えば因子IX)、特異的代謝障害に含まれる酵素、(例えば尿素循環酵素、特にオルニチントランスカルバミラーゼアルギニノスクシネートシンターゼ、およびカルバミルホスフェートシンターゼ);受容体、(例えばLDL受容体);トキシン;特異的細胞または組織を除去するチミジンキナーゼイオンチャンネル(例えば嚢胞性繊維症クロリドチャンネル);膜輸送体(例えばグルコース輸送体);および細胞骨格蛋白質、(例えばジストロフィン)を符号化することができる。遺伝子は合成、cDNAまたはゲノムオリジン、またはこれらの組合せである。遺伝子は天然に生じるもの、天然に生じるポリペプチドをそれでもなお符号化する非天然に生じる遺伝子、またはこの種のポリペプチドを認識できる変異体を符号化する遺伝子である。また宿主細胞に見出されるDNAまたは正常に転写されるmRNAに「アンチセンス」であるmRNAを符号化することができるが、アンチセンスRNAはそれ自体で機能蛋白質翻訳することができない。

0037

発現される遺伝子に対して、解読配列は標的細胞中で機能しうるプロモーター配列に操作しやすく結合されなければならない。2つのDNA配列(例えばプロモーター領域配列および解読配列)は、2つのDNA配列の間の結合の性質が(1)望ましい遺伝子配列の転写に向くように領域配列中にフレームシフト突然変異を導入することにならない、または(3)プロモーター領域配列によって転写される遺伝子配列の能力を妨げないならば、操作しやすく結合されると言える。

0038

プロモーター領域は、プロモーターがDNA配列の効果的な転写を与えることができるならば、DNA配列に操作しやすく結合される。「操作しやすく結合」されるためには、2つの配列が互いに直ぐに近接する必要はない。DNAのような核酸分子は、転写調節情報を含むヌクレオチド配列を含み、このような配列がRNAを符号化するヌクレオチド配列に「操作しやすく結合」されている場合に、mRNAを「発現できる」と言える。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は、生物体から生物体へと変わるが、一般にRNA転写の開始を指示するプロモーターを含むことができる。このような領域はTATAボックスのような転写の開始を伴う5’−非解読配列を含むことができる。

0039

望ましくは、望ましいRNA生成物について解読する遺伝子配列に対して非解読領域3’を得ることができる。この領域は、終結およびポリアデニル化のために提供するもののような、その転写終結調節配列のために保持される。従って、解読配列に自然に隣接する3’−領域を保持することによって、転写終結信号が与えられる。転写終結信号が発現宿主細胞中で十分に機能しない場合には、宿主細胞に機能する3’領域を置換することができる。

0040

プロモーターは、宿主生物体の本来全部の細胞に活性な「偏在性」プロモーターであり、例えば哺乳類については、ベータアクチンプロモーターであり、またはその発現が標的細胞に多少とも特異的であるプロモーターであってもよい。
一般的に言うと、後者が好ましい。標的細胞中で自然に発現される遺伝子本来のプロモーターはこの目的のために使用され、例えば哺乳類の肝臓細胞中で発現するためのPEPCKホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ)プロモーターがある。他の適当なプロモーターには、アルブミン、メタロチオネイン界面活性剤アポE、ピルベートキナーゼ、LDL受容体HMGCoAリダクターゼを含みまたは標的組織中の遺伝子の転写をコントロールするために必要な因子(ホルモン食餌重金属等)によって発現および調節に特異的な組織の適当なパターンを持つように単離され、クローニングされ示された任意のプロモーターを含む。

0041

さらに広範囲のウイルスプロモーターを使用することができ;これらにはMMTV、SV-40 およびCMV を含む。「発現ベクター」は、ベクターにクローニングされてこれによりRNAまたは蛋白質生成物を生成するDNA(またはcDNA)分子を発現することができるベクターである(適当な転写および/または翻訳コントロール配列の存在による)。クローン配列の発現は、発現ベクターが適当な宿主細胞に導入されるときに生じる。原核発現ベクターを使用するならば、そのときには適当な宿主細胞はクローン配列を発現することができる任意の原核細胞である。同様に、真核発現ベクターを使用するならば、そのときには適当な宿主細胞はクローン配列を発現することができる任意の真核細胞である。

0042

発現できる遺伝子に加えてまたはその代わりに、核酸は標的細胞の遺伝物質相同な配列からなり、それによってそれ自身を相同組み換えによってゲノムに挿入(「組み込む」)ことができ、これにより遺伝子の解読またはコントロール配列を置換し、または遺伝子を全体で除去することができる。

0043

別の好適例では、核酸分子は標的生物体(ウイルスおよび他の病原体を含む)
のゲノムまたは他のDNA配列に、または生物体の細胞中に転写されるメッセンジャーRNAに「アンチセンス」であり、標的ゲノムDNAの転写または標的メッセンジャーRNAの転写を阻害するように十分にハイブリッド形成する。このようなハイブリッド形成の有効性はハイブリッド形成する配列の長さおよび構造の機能である。配列が長く相補性が完全に近いほど、相互作用は強くなる。塩基対のミスマッチの数が増加するとハイブリッド形成の有効性は落ちる。さらに、パッケージング配列DNAまたはアンチセンスRNAのGC含量も、また、AT(またはAU)塩基対と比較してGC塩基対中に存在する追加の水素結合によるハイブリッド形成の有効性に影響を与える。従って、GC含量の多い標的ハイブリッド形成が標的として好ましい。

0044

意図する目的のためにアンチセンス核酸を活性を小さくまたは不活性にするので、分子内ハイブリッド形成による二次構造を形成するアンチセンス配列を避けることが望ましい。当業者は配列が二次構造を形成する傾向があるか否かを容易に認識するだろう。二次構造は異なる標的配列を選択すことによって避けることができる。

0045

長さが約15と約100 の間の塩基対で標的配列に相補性があるオリゴヌクレオチドは、天然のモノヌクレオシドからまたは、あるいは、非架橋ホスホラス結合酸素にて置換基を有するモノヌクレオシドから合成することができる。好ましい類似体は天然産のモノヌクレオシドのメチルホスフェート類似体である。さらに好ましくは、モノヌクレオシド類似体は、これを使用すると(a)細胞膜を通して拡散する改良された能力および/または(b)対象の体内にヌクレアーゼ消化に耐えられる利点を有するオリゴヌクレオチドになるいずれかの類似体である(Miller,P.S.ら、Biochemistry 20:1874-1880(1981))。このようなヌクレオシド類似体は当該分野では良く知られている。核酸分子はDNAまたはRNAの類似体であってもよい。治療目的を満たし、ヌクレアーゼに十分に耐えられ、十分なバイオアベイラビリティー細胞取り込みを有するならば、本発明は特にDNAまたはRNA類似体の使用に制限がない。DNAまたはRNAは酵素、例えばヌクレアーゼによって、ヌクレオシド内結合(例えばメチルホスホネート類またはホスホロチオエート類)を修飾して、または修飾したヌクレオシド(例えば、2’−メチルリボースまたは1’−アルファアノマー)を組み込むことによってインヴィヴォ分解に耐えられるようにすることができる。

0046

自然に生じる結合
O--(3‘O)P(O5’)=O
代わりの結合は次のものを含む
S--(3‘O)P(O5’)=O
CH3-(3‘O)P(O5’)=O
NR2-(3‘O)P(O5’)=O
(式中のR2は水素および/またはアルキルである)
RO-(3‘O)P(O5’)=O
(式中のRは水素またはアルキルである)
S--(3‘O)P(O5’)=S

0047

また3'O−P−O5'を、3'O−CH2C(O)-O5'、3'O−C(O)−NH5'および3'C−CH2CH2S−C5'のような他の結合と置換することができる。
全体の核酸分子はこのような修飾結合を形成することができ、または5'および3'のような一定の部分のみが、このように影響を受け、エキソヌクレアーゼ耐性になる。
従って本発明に使用するために適している核酸分子は、以下のものを含むがこれに制限されない、ジデオキシリボヌクレオシドメチルホスホネートミルらのBiochemistry,18:5134-43(1979)参照、オリゴデオキシヌクレオチドホスホネート、マツクラらの Proc.Nat.Acad.Sci.,84:7706-10(1987)参照、挿入剤に共有結合したオリゴデオキシヌクレオチド、ゼリアルら、Nucleic AcidsRes.,15:9909-19(1987)参照、ポリ(L−リシン)と結合したオリゴデオキシヌクレオチド、レオネッチらの
Gene,72:32-33(1988)参照、およびリボース誘導サブユニットから集合したカルバメート結合オリゴマー、スンマートンの J.,Antisense Nucleic Acids Conference,37:44(New York 1989)参照。

0048

核酸の緻密化 核酸のコンプレックスおよび核酸結合部分が受容体媒介エンドサイトーシス、受動インターナリゼーション、受容体媒介膜透過性化、または他の応用できる機構によって取り込みを達成するために十分小さい粒子径であることが望ましい。
望ましくは、緻密になった核酸、標的結合部分、および核酸結合部分のコンプレックスは小さく、肺および脾臓のシヌソイドキャピラリー系がその大きさの凝集物を閉じ込めるので、例えば100nm 以下であり、さらに好ましくは外被孔エンドサイトーシス小嚢の一般的内径である80または90nmである。

0049

30nmよりも大きいコンプレックスは脾臓および肝臓のマクロファージによって非特異的に取り込まれ易いので、共役体も30nmよりも小さいことが好ましい。
肝臓のASGP受容体の場合には、15-23nm よりも大きいコンプレックスが取り込まれない。受容体に対するインヴィヴォでのこの大きさの制限は多分、肝臓のクッパー細胞中のガラクトシル化蛋白質のための他の受容体の存在に直接関連しているのだろう。クッパー細胞受容体はインヴィヴォでの大きい寸法のガラクトシル化分子を取り込み分解する際に有効であり、従って、肝細胞の表面にASGP受容体を用いてガラクトシル化DNAコンプレックスを取り込むために競争するだろう。最も好ましくは、肝臓デリバリのために、コンプレックスは直径が23nmよりも小さく、さらに好ましくは15nmよりも小さく、なおさらに好ましくは12nmよりも大きくない。

0050

本発明は凝集または沈澱を生じないで、そして好ましくは凝縮状態まで緻密になる核酸および核酸結合キャリヤのコンプレックスに関する(図12参照)。本発明の目的のために、DNAを次の状態の一つとして特徴付けることが有用である:正常(凝縮していない);凝縮した;弛緩した;単一凝集した(単一分子トロイドのクラスター);多疑集した(多分子トロイドのクラスター);および沈澱した。これらの状態は電子顕微鏡下での外観で定義される(表103参照)。

0051

凝縮DNAは溶媒との相互作用が最少の状態にあり、従ってDNAは、単離した球またはトロイドの形である。目に見える程度まで繊維質ではない。弛緩したDNAは、一般にDNAからのポリカチオンの乖離によって形成され、繊維質を形成する。凝集したDNAは群がったまたは多分子のトロイドを形成する。

0052

単一分子DNAコンプレックスの理論的な大きさは表106の凡例「b」および「c」で示される式によって計算することができる。好ましくは、この発明のコンプレックスは直径が、これらの式の1または両方によって計算される大きさの二倍よりも小さい。さらに大きいコンプレックスは多分子凝集DNAに相当するようだ。

0053

DNAはその電荷を中和することによって、例えばポリカチオンを添加して、または溶媒との相互作用を減らすことによって、凝縮状態に緻密化される。しかし、ポリカチオンは、凝集または沈澱を避けるようにカオトロピック剤(向混沌性剤)を使用しなくともDNAの凝集または沈澱の原因となる。従って、ポリカチオン(DNAを凝縮するため)および(必要ならば)向混沌性剤(凝集または沈澱を避けるため)の両方を賢明に使用して緻密化を行うことができる。

0054

向混沌性剤の過剰使用は、しかしDNAを弛緩することになる。好ましくは、コンプレックスは凝集してなく、直径が23nmよりも小さく凝縮した単一分子のトロイド構造を有する;緻密化の程度は、電子顕微鏡によって測定することができる。例えば、PEPCK-hFIX遺伝子とガラクトシル化ポリリシンのコンプレックスは単一分子トロイドまで緻密化され、表106に示すように、平均直径が約12nmである。

0055

「単一分子トロイド」の語は、トロイドが唯一の核酸分子を含むことを意味する;トロイドは多くのキャリヤ分子を含むことができる(例えば、ガチクトシル化ポリ−Lys)。一般的比率は、「単一分子」トロイドに対して、DNA1分子対約 100キャリヤ分子である。あるいは、そして勿論さらに正確には、この構造はモノ核酸トロイドと称される。単一分子および多分子トロイド(後者は各1個以上のDNA分子を含む)は、電子顕微鏡で観察したとき、各コンプレックスの大きさが異なることで識別でき、トロイドの多−または単一分子(DNA分子のみを数える)組成を含む。

0056

またわれわれはポリ−L−リシン結合の際にDNAの構造変化を同定するために他の技法を使用した。これらの第一は、400nm での吸光を使用する溶液中の濁度の分光光度計測定である。濁度は先ず凝集のインジケーターである。凝集は300 ないし340nm の波長での0よりも大きい円偏光二色性(CD)の値によって確認される。

0057

図18はポリ−L−リシンをDNA溶液に異なる出発濃度のNaClにて添加した濁度の効果を示す図である。塩の初期濃度が増加すると濁度は増加し(これは目視で容易に確認できる)、一層低いイオン強度でのDNAコンプレックスの凝縮により、互いに相互に作用する単一分子DNA−ポリ−L−リシンコンプレックスからなる粒子の懸濁液となることを示す。われわれは、一層低い塩濃度で凝縮したDNAの溶液は、懸濁液中に粒子物質が存在しているが、澄んでいることに注目した。異なる濁度をもつDNAコンプレックスを含む溶液は、それぞれの状態で形成されたDNA構造を目視してEMによって分析した。適当に凝縮した単一分子のDNAコンプレックスを澄んだ溶液および僅かに濁った溶液の両方に見出した。これは、懸濁液内の粒子を含む溶液が400nm で吸収しないので、400nm での最少吸収(図18)に注目した初期の低いイオン強度ではDNAコンプレックスの凝縮については正しくない。しかし、これらの溶液をEMを使用して分析するとき、われわれは図1に示される予想したトランジション構造に注目した。

0058

懸濁液中の粒子が全体に分散されると、EMによって測定された構造は、基本的に凝縮した単一分子のDNAコンプレックスと同一であった。従って、DNAコンプレックスを含む溶液の濁度は、コンプレックスの凝縮に使用した塩の初期濃度に依存する。初期の低いそして高いイオン強度でのDNAの濃度において観察された差異に対して応答できる機構は、明らかでないが、われわれは濁溶液の生成を避けて、DNAを適当に凝縮するように我々のプロトコルを適合させた。

0059

溶液中のDNA−ポリ−L−リシンコンプレックスの構造トランジションを調査分析するためのさらに信頼できる技法は、NaClの濃度が増加するとき260nm で凝縮するコンプレックスの吸光度である。懸濁液中の単一凝集DNAコンプレックスは、粒子物質が260nm で吸光しないので期待された吸光度の10〜30%のみを示した。NaClの添加は単一凝集DNAコンプレックスを懸濁液に分散させて、図11に示される吸光度の急な増加を観察した。この時点で、溶液は澄み、懸濁液中には目視できる粒子構造は存在しない。DNA−ポリ−L−リシン凝縮のこの特徴は明らかに図1に示した構造と関連する。260nm での急な吸光度の増加の原因であるNaClの濃度で、われわれはEMによって凝集していない凝縮したコンプレックスを観察した;NaClのこの臨界濃度に達する以前に、DNAコンプレックスは凝集し、さらに高いNaCl濃度ではDNAコンプレックスは弛緩した。260nm での吸光度の第二のトランジションは、懸濁液中にある凝縮したDNAコンブレックスが弛緩した結果、DNAコンプレックスが完全に可溶化したことを示している。

0060

円偏光二色(CD)を使用して、DNAの凝縮をモニターすることができる。
スペクトルがDNA単独のスペクトルと同一であるとき、DNAコンプレックスは正しく緻密になっている、すなわち、単一分子コンプレックスになっていると仮定される。言葉を変えると、220nm での正のスペクトルはDNA単独の220nm スペクトルに量的に似ており、クロスオーバー(コンプレックスのスペクトルが0点で交差する波長)は本来DNA単独の場合と同一である。DNAが多分子コンプレックスに凝集するとき、270nm での正のスペクトルはその波長で負のスペクトルに逆転する(これは psi−DNA構造またはΨ−DNAと呼ばれる)。

0061

表103は裸眼観察、円偏光二色分光計、電子顕微鏡、および260nm での吸光度によって測定される各状態の特性を示す。特に、凝縮したDNAコンプレックスを同定することができる任意の他の技法を、上記のものの代わりにまたは組み合わせて使用することができる。

0062

核酸を緻密にするために、キャリヤを核酸溶液に添加し、これによってキャリヤは核酸を粉砕する:溶媒の相互作用はは核酸を凝縮させる。好ましくは、少なくとも溶液の濁度はキャリヤを添加するときモニターされ、状態変化が速やかに検出されるようにする。濁りが一旦現れると、DNAの状態はさらにCD分光計によって分析され、DNAが凝縮しているか凝集状態にあるか測定することができる。(沈澱はまた裸眼によって検出する必要がある)。好ましくは、キャリヤは核酸溶液に、沈澱と凝集が最少になるように十分ゆっくりと添加される。沈澱または凝集が生じた場合には、向混沌性(カオトロピック)塩をゆっくり添加し、その結果を再度CD分光計によって調べなければならない。好ましい塩はNaClである。他の向混沌性(カオトロピック)塩を、投与される動物(または細胞)によって許容される限り使用することができる。適当な薬剤には硫酸ナトリウム(Na2SO4)、硫酸リチウム(Li2SO4)、硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)、硫酸カリウム(K2SO4)、硫酸マグネシウム(MgSO4)、リン酸カリウム(KH2PO4)、リン酸ナトリウム(NaH2PO4)、リン酸アンモニウム(NH4H2PO4)、リン酸マグネシウム(MgHPO4)、塩化マグネシウム(MgCl2)、塩化リチウム(LiCl)、塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カリウム(KCl)、塩化セシウム(CeCl)、酢酸アンモニウム酢酸カリウム酢酸ナトリウムフッ化ナトリウム(NaF)、フッ化カリウム(KF)、テトラメチルアンモニウムクロリド(TMA-Cl)、テトラブチルアンモニウムクロリド(TBA-Cl)、トリエチルアンモニウムクロリド(TEA-Cl)、およびメチルトリエチルアンモニウムクロリド(MTEA-Cl)を含む。

0063

われわれは、インヴイトロでDNAの凝縮に影響する変数、および受容体媒介エンドサイトーシスによって動物にDNAコンプレックスを有効にデリバリするためのこれらのパラメーターの機能的関連性を調べた。われわれは凝縮したDNA−ポリ−L−リシンコンプレックスが溶液中に安定なままであるイオン強度とDNAの濃度との間の強い相互関係に注目した。これらの実験は、溶液中の正と負の電荷が1対1となるDNAとポリ−L−リシンの比を使用して、hFIXに対する構造遺伝子に結合したPEPCKに対する遺伝子からのプロモーターを含む4.5kbプラスミドを使用して行った。粒子を溶解するために必要なNaClの最終濃度の変化は、DNA濃度の対数関数であり、高濃度のDNA−ポリ−L−リシンコンプレックスの凝縮がイオン強度の僅かな増加でのみ生じる。このDNA濃度の物理的特性は、動物の血液中のイオン負荷にあまり影響しないので、インヴィヴォでの成体動物の組織にDNA粒子をデリバリするために非常に有利である。

0064

最少二乗法を使用するデーター線形適合は、次の関数によって記述される: LOG10(NaCl,mM)= b0*(DNA,μMリン酸塩)
+ b1 r2=0.97 式中、b0=2.52x10E-3,b1=0.577
凝縮工程の間に異なるDNAプラスミドおよび異なるDNA調製を使用するとき、上記式によって記載される関数で変化を観察した。これらの相違は多分、異なる出所および組成物のDNAに対するポリ−L−リシンの親和性の変化に関連しているのだろう。最大の結合親和力について、われわれは一般に酢酸ナトリウムおよび 2.5容量の−40 iCエタノール(方法参照)で2回沈澱させたDNAを使用する。異なる形態(すなわち、スーパーコイルニックおよび線状)のDNA、およびアニオン交換クロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配遠心分離を使用して抽出したDNAに対するポリ−L−リシンの結合親和力に明白な相違が見られなかった。これは、ポリ−L−リシン結合活性を有する異なる出所からのDNA調製において不純物の存在を示しており、これは逐次DNA沈澱によって除去される。

0065

またDNAの有効な凝縮のために必要なNaClの濃度のポリ−L−リシンの長さの効果を調べた(図19)。これらの変数の間の関係を、異なる出所からのDNAの一定濃度を使用して評価した。広範囲のポリ−L−リシンの長さを使用した;本来、市販されているポリ−L−リシンの大きさである。しかし、化学的に合成されたポリ−L−リシンの各ロット低角度光散乱分析によって測定されるような、種々の大きさの蛋白質の平均のポリ−L−リシンの長さである。各試料内の寸法の実際の分布は、分布する物質の60%から80%まで変化し、これは平均寸法の+/−20%である。単一寸法内のこの広い分布はわれわれの測定の誤差の原因になる。それにもかかわらず、ポリ−L−リシンの長さと、溶液中のDNAコンプレックスの凝縮に必要なNaClの濃度との間に、図19に認められる明白な相関関係がある。この相関関係は、大きさが150個のリシン残基までポリ−L−リシンの長さが直線関数であり、その後に関数は飽和に達し、さらに長いポリ−L−リシンではDNAの凝縮に必要なNaClの濃度の増加はない。これらのデーターはポリ−L−リシンとDNAリン酸塩中心軸との間の協同的結合と一致している。従って、DNAを凝縮するために使用されるポリ−L−リシン分子の長さを減らすことによって、動物に注入されるDNAコンプレックスの溶液は高張性が小さくなる。また、遺伝子治療のためのこの方法の有効性についてイオン強度の変化の関数の有意性を評価ため、動物の血液中のDNAコンプレックスの希釈を考慮することが重要である。図19に示されるものよりもさらに長いポリ−L−リシンを含むDNAコンプレックスを用いてラットに注入し、ラビットにはさらに短いポリ−L−リシンを注入し、両者の場合のトランスフェクション遺伝子の明確なそして不変の発現に注目した。

0066

好ましい最少の初期の塩濃度はキャリヤのコンパクション活性および塩の向混沌活性に依存する。NABMが(Lys)8または(Lys)27である場合には、初期のNaCl濃度はゼロであることができる。さらに長いポリLys 鎖では、しかし、NaClがないと、沈澱は即時である。(Lys)50では、初期のNaCl濃度は好ましくは少なくとも約300mM である。それでもなお、TBMが凝縮に影響する蛋白質であるならば、初期の塩濃度は殆どゼロである。

0067

キャリヤは連続して、または小さい不連続の工程で添加することができる。さらに高い流速、またはさらに大きいアリコートで開始し、所望の反応終点に近づくように流速またはアリコートの大きさを減らすことができる。一般には、0.1ないし10%のキャリヤ溶液を一度にDNA溶液に添加する。各添加は、一定の渦攪拌で好ましくは2秒ないし2分毎に行う。しかし、さらに長い設定時間でも良い。

0068

一好適例では、塩溶液に含まれる核酸は、好ましくは少なくとも 0.5Mであるが、1.5M以下であり、同濃度(例えば、0.5ないし1.5M NaCl)のNaCl溶液に含まれる共有結合した標的細胞結合部分(例えば、ガラクトース)を含むポリ−L−リシン(109 個のリシン)と混合する。好ましくは、核酸リン酸塩基とDNA結合部分の正に荷電した基とのモル比は、4:1ないし1:4の範囲にあり、さらに好ましくは約 1.5:1である。

0069

幾つかの実験結果を表104に示す。16実施例を行い(表104の最初の欄に星印を付けた)インヴィヴォで試験して作業し、最終のNaCl濃度(独立した変数)をDNA濃度およびポリ−L−リシンの長さ(従属した変数)に対して回帰推定し、その結果を表105に示した。

0070

接合標的結合キャリヤ分子に依存する好適例では、核酸結合部分は、標的細胞結合部分に、直接または間接に、共有結合または非共有結合して接合いる。接合は、関心のある核酸で核酸結合部分を装填した後、またはさらに通常はその前に、行うことができる。どちらの方法でも接合は核酸が核酸結合部分に結合すること、または、そのために、標的細胞結合部分の標的細胞に結合する能力を実質的に妨げてはいけない。

0071

製薬組成物および方法 緻密化した核酸は、随意にTBMと結合し、ヒトまたは他の動物対象に投与するために製薬的受け入れられるキャリヤと混合することができる。DNA溶液に対して凝縮したDNAおよび弛緩したDNAの両方を含むことができることは認められる。本発明の組成物は好ましくは、260nm で同じ濃度の裸のDNAの吸光度よりも吸光度が50%小さいような凝縮したコンプレックスで十分に豊富である。表103に述べたように、通常は、凝縮したDNAは吸光度が20-30 %であり、弛緩したDNAでは裸のDNAの吸光度の80-100%である。

0072

投与は任意適当な投与経路で行われる。投与形態はその経路に対して適当でなければならない。適当な投与経路および投与形態は、血管内(注射できる溶液)、皮下(注射できる溶液、徐々に放出するインプラント)、局所軟膏膏薬クリーム)、および経口(溶液、助剤カプセル)を含む。投与経路の幾つかは投薬形態が、例えば、保護被覆またはヌクレアーゼ阻害剤を含めて、分解から結合体を保護するように配合しなければならない。

0073

投薬は、この分野で通常行われるように、代替投薬の系統的試験によって決定する必要がある。
ラット(200-300g)は、生長または健康にはっきりと悪い影響を与えることなく実施例1のDNAコンプレックスを600 μg の用量で許容する。マウス(25g)は、はっきりした問題もなくDNAコンプレックスを150 μg注入した。
ヒトでは、一般的試験用量は60-120mgのDNAであり;この用量が有効であるには低すぎまたは毒性があるほど高すぎるならば、適量が決められるまで、系統的方法で、それぞれ増減させることができる。
短命の細胞、例えば、マクロファージについては、典型的な用量スケジュールで2週間毎に1回投与する。長命細胞、例えば、肝細胞では、2ヶ月毎に1回投与する事が好ましい。

0074

アジュバントを使用して、DNAコンプレックスの大きさを減らす(例えば2−10mM MgCl)、その安定性を増加する(例えば、スクロースデキストロースグリセロール)、または、デリバリ効率を改善する(例えば、クロロキンおよびモネンシンのようなリソソーム向性因子剤)。コンプレックスはリポソーム中封入し、保護し、標的細胞への進入を、容易にする(リポソームの細胞膜との融合)。
以下実施例により本発明を説明するが、制限するものではない。

0075

序論クリスマス病、または血友病B、は血液循環中の凝固因子IXの機能の欠乏による伴性劣性遺伝血液疾患である。ヒト第IX因子(hFIX)は、通常、肝臓中で生成される血漿糖タンパク質であり、内因性凝固経路において不可欠な役割を果たす。いったん、前身である活性血漿トロンボプラスチン(XIa)によってセリンプロテアーゼ形(IXa)に転化すると、活性化したタンパク質は凝固因子VIIIa、カルシウムイオン、および燐脂質と反応し、第X因子からXaに転化する複合体を生成する。第IX因子は、血液中への分泌の前に、その役割のために必須の幾つかの翻訳後の修飾をを肝臓中で受ける。これらは、アミノ末端グルタミン酸残基およびアスパラギン酸のβ−ヒドロキシル化によるビタミンKを含む。

0076

クリスマス病は、全ての遺伝される凝固障害のおよそ10〜20パーセントの原因となっている。冒された人は、循環する第IX因子のレベルに一般的に関連した幅広い臨床上の苦しみを示す。機能性因子第IXの厳しい遺伝子欠乏をもった患者は、柔組織および関節への内発的な出血、あるいは小さな外傷性障害後の出血がある。一時的に遺伝し欠乏を正すことで出血症状の発現を阻止するために、血漿の輸血、あるいは第IX因子に富む濃縮液が使われる。不運なことに、保存した血漿へのウイルスの混入によって、臨床上の管理が混乱してきた。血液由来の感染、例えば肝炎や後天的な免疫不全症は、遺伝的凝固障害の治療において、重大な問題になっている。これらの合併症は、代替治療の開発の重要性を強めている。

0077

ヒト凝固因子第IXのための遺伝子は、同定・配列決定されている;1,248塩基対、長さは、相補DNAから416のアミノ酸からなるタンパク質であると予想され、そして、翻訳後の修飾の後の、完全に発達したタンパク質の分子量は約54,000ダルトンである。ヒト凝固因子第IXは、血友病Bの遺伝子補正に使用されるかもしれない。

0078

P-エノールピルビン酸塩カルボキナーゼのキメラヒト因子IX(PEPCK−hFIX)遺伝子(50%がスーパーコイルし/50%が開環している)が、ガラクトシル化されたポリ−L−リシン(平均長は50あるいは109アミノ酸)とともにNaClの滴定によって凝縮された。この過程は、CDスペクトルおよび電子顕微鏡によってモニターされ、NaCl臨界濃度中で、直径10〜12nmのDNA−キャリヤ複合体の形成がなされた。我々は、この操作を使用して共役させて、PEPCK−hFIX遺伝子を、生体のラットの完全な肝臓に導入し、DNA−キャリヤ複合体がこの組織の遺伝子を特異的に標的にし、また、hFIX
DNA、mRNAおよびhFIXタンパク質がDNA−キャリヤ複合体処理の140日間後(この実験の期間)にも存在することを、証明した。DNA−共役体の注入32日間後の動物の肝臓から分離されたDNAのサザン分析によって決定されたように、この遺伝子はエピソームとして存在する.PEPCK−hFIX遺伝子の転写は、実験の期間中ずっとされている食餌によって管理される;炭水化物が含まれない食餌を一週間動物に与えることによって、hFIXの血液中への予想された誘発をもたらし、これは、ウェスタンブロットハイブリダイゼイションによって検出される。

0079

方法A.ガラクトシル化平均の鎖の長さが109(シグマ)であるL−リシン−HBrあるいは、L−リシン-Cl のポリマーを、本質的には、Monsignyら、(1984)Biol.Cell.,51,187.に記述されたようにガラクトシル化した。簡単には、2mgのポリ−L−リシンが、N,N−ジメチルフォルムアミド(5mg/ml)に溶解した89gのα−D−ガラクトピラノシルフェニルイソシアネート(シグマG-3266)と反応した。この溶液は、pH 9.0の1/10体積の1M炭酸ナトリウムを添加することによって、pH 9.0に調整された。この反応は10%の効率なので、溶液中に存在する0.8%のε−NH3基はグリコシルかされている。チューブアルミニウムホイルによって光から遮断されていて、室温で6時間混合された。この溶液を次にSpectra-Por透析チューブ(Fisher 3500 M.W.遮断)を使用して、500ml の5mM NaCl緩衝液に対して、たびたび緩衝液を交換しながら(二回/日)二日間透析した。

0080

B.リガンドの分析透析した溶液は、次に分光光度計によって、205Åおよび250Åにおいてポリ−L−リシンの濃縮物およびフェニル−ガラクトース残基の濃縮物のそれぞれについて、測定された。修飾されたガラクトースのみが、250Åにおいて溶液中で吸光するから、この段階で透析中に重大な損失はおこらず、そしてガラクトシル化反応が完全であることが確かめられる。

0081

C.複合体形成プラスミドDNAを、標準的な技術を用いて用意した。pH8.0で1mMのEDTAを含んだ10mMトリス−HCl中で、DNAを再び懸濁し、DNAの濃度は分光光度計によって決定された。RNAアーゼA+T1によってDNA調整品は二回蒸解された。この段階によって、RNAが溶液中に存在しないことが確認される(RNAはポリ−L−リシンによるDNAの凝縮を妨害する)。高濃度DNA溶液(1.5-2 mg/ml)が、次の段階から使用される。DNA凝縮の典型的なプロトコル例は、次に記述するとおりである:
a)200μlの0.75M NaCl溶液(5M NaCl溶液から加えられた)中にある300 μgのDNAを、VIBRAX装置(IKA-VIBRAX-VXR)を用いて中間速度回転攪拌した。この操作は、高塩濃度溶液中のDNAポリマーの効果的な長さを増すために好ましく、それ故、ポリ−L−リシン部分のDNA中心軸への効果的な結合が達成される。

0082

b)200μl中の0.75M NaCl溶液(5M NaCl溶液から加えられた)中にある84μgのポリ−L−リシン−ガラクトースを、30分間から1時間にかけて20μlずつに分割して、滴下した。この量は、分子の割合にしてひとつのDNAのPO4-グループを0.7のキャリヤNH3+グループの分子に転化する。

0083

c)この溶液は、この操作の終了時には濁る。3μlずつに分割した5M NaCl溶液を、視覚によってモニターしながら、濁りが消えるまで、回転攪拌している溶液中に滴下した。この操作はゆっくりと、次の5M NaClの分割を加えるのに30秒間待つ。そして、逐次2μlずつの5M NaClを加えながら、この溶液はCDスペクトル分光器のモニターにかけられる。凝縮のプロセスは、DNA複合体の特徴的なスペクトルが観察された時点で完了する。次の、同じヌクレオチド濃度での同じプラスミドDNA中の、DNA複合体の準備のために、このプロトコルはCDをモニターする必要なく踏襲でき、結果は完全に再現性がある。異なるDNA濃度あるいは異なるプラスミドを用いるときには、CDのモニターを繰り返すことは必要である。
我々は、DNA複合体の構造をモニターするための代替技術が、似た結果をもたらすことを見出した。この技術は次の各段階からなる。
a)およびb)は同上。

0084

c)この溶液は、この操作の終了時には濁る。3μlずつに分割した5M NaCl溶液を、視覚によってモニターしながら、濁りが消えるまで、回転攪拌している溶液中に滴下した。この操作はゆっくりと、次の5M NaClの分割を加えるのに30秒間待つ。この溶液を、次に、マイクロ遠心器を使用して、最高スピード(12000x G)で30分間遠心分離にかけ、そして沈殿の存在が確認された。もし沈殿が観察されたら、2μlずつに分割された5M NaClを滴下する。この溶液を、さらに0.5分回転攪拌し、そして遠心分離の段階が繰り返される。沈殿の出現は、溶液中のDNA−複合体の凝集によってであり、DNAが全部崩壊したのでなないことを示す。

0085

結果および論考ここに記述された操作を開発するために、我々はDNA/リガンド−ポリ−L−リシン結合共役の物理的性質を、円二色性分光光度計(CD)および電子顕微鏡を使用してモニターし、機能複合体が生成することによるコンディションを研究した。我々は次に、完全な動物を使用して、DNA/リガンド−ポリ−L−リシン結合共役の物理的性質と機能との関連を決定した。様々な濃度のNaClの存在において、リガンド−ポリ−L−リシンの添加によってDNAは凝縮した。60μgのRNAの存在しないCMV−β−ガラクトシダーゼ(A)あるいはphFIX(B、C、DおよびE)のいずれにおいても、最終的に700mM NaCl中に150μlの体積にまで希釈されたものは、中間速度でVIBRAX装置(IKA-VIBRAX-VXR)を用いて回転攪拌された。19μgのα−ガラクトピラノシル−フェニルイソチオシアネート/ポリ−L−リシン二結合共役(シグマ)が、同様に希釈され、回転攪拌されているDNA溶液中に滴下された。インヴィヴォでの研究においては、150μlの700mM NaCl中の300μgのDNA(TE緩衝液中に溶解、pH 8.0)が、150μlの700mM NaCl中の95μgのα−ガラクトピラノシル−フェニルイソチオシアネート/ポリ−L−リシン二結合共役とともに凝縮した。ポリカチオンのゆっくりした添加は、濁った溶液の形成をもたらし、この濁りは、5M NaClを3μlずつの分割を徐々に滴下することで溶解する。この濁りの消失は、視覚によってモニターされ、濁りが消失した段階で、このDNA/ポリ−L−リシン複合体溶液は、電子顕微鏡(E.M.)およびCD分光光度計の両方をを用いて調べた。2μlずつに分割した5M NaClの継続した添加は、図1A〜1Fに示したような構造変化をもたらした。様々なNaCl濃度および、添加ポリ−L−リシンの存在あるいは不在における、DNA複合体の異なる構造配座を表す典型的なスペクトルは、図1に示された。DNAへのポリカチオンの結合は、長波長側へのクロスオーバーに置換することを特徴とする特異的なスペクトルとなった;このシフトは高い序列の、DNAのY型に似た非対象構造でのDNA/ポリ−L−リシン結合のカイラルパッキングに関連づけられる。図1Aに示されたように、二本鎖DNA(1M NaCl中)は特異的なスペクトルを持ち、これは様々なイオン強度におけるポリ−L−リシンの添加によって著しく部分的に変化する(図1a)。DNA/リガンド−ポリ−L−リシン結合共役のイオン強度が強まれば、複合体は凝集状態(図1C)から凝縮状態(図1Dおよび図1E)へののトランジションが進行する。これは、図1Aに示したように、複合体のスペクトルのシフトにも一致する。溶液中のイオン強度の増加とどもに生じるクロスオーバー(図1の0線)でのシフトおよび220nmでのCDスペクトルの変化が、CD分光器による凝縮DNAコンプレックスの生成をモニターする際に、特に重要である。DNA複合体の凝集に必要とされる臨界幅を超えて、イオン強度が増大したときは、この複合体は凝縮していないような、弛緩した構造をとる(図1F)。このDNA複合体の構造におけるトランジションは、CDスペクトル分光計ではモニターできず、そのため正確なNaClの滴定が、この操作の成功にとって非常に不可欠である。図1Dで観察されるDNA複合体の直径(約10nm)は、アシアロ糖タンパク質のための肝臓の受容体による、分子リガンドの取り込みのために、望まれる識別する範囲に一致する。

0086

我々はそのため、インヴィヴォにおいて、受容体−媒介エンドサイトーシスによるDNAを肝細胞に運ぶ媒介物として観察されたDNAの構造の適切さを証明した。取り込みのプロセスの性質を確証するために、我々はアシアロ糖タンパク質受容体をもっているHepG2細胞によって血液からDNA複合体を取り除いた。
DNA複合体の取り込みは、100倍モル過剰のアシアロゲトインを競合体として使用するとき完全に阻害され、複合体はASGPを通じて受容体−媒介エンドサイトーシスによって取り込まれることが示された。

0087

ラットからのP−エノールピルベイトカルボキシジナーゼ(PEPCK)の細胞ゾルの形成のための遺伝子のプロモーターからなる、キメラの遺伝子プラスミド(pPFIX)は、ヒト凝固因子第IX(hFIX)(Ferkolら、FASEB J.,7:1081(1933))のためのcDNAに結びつけられ、デリバリについていって肝臓中でのDNA発現のために使用される。時間経過におけるトランスフェクションされた動物中でのhFIX遺伝子の発現は、完全に発達したhFIXペプチドに対するモノクロナル抗体を用いて、ウェスタンブロットハイブリダイゼイションによって決定された。

0088

平均体重が約250gである、成体スプラグドーリイラットをエーテル麻酔した。前述したようにガラクトース−ポリ−L−リシンとともに混合した、300μgのpPFIXを含んだ300〜400μlの溶液を、尾部大静脈に注入した。ラットを、トランスフェクション後0、4、8、12、32、72および136日後に殺し、組織と血液サンプルを取り出した。

0089

トランスフェクションされた動物からの血漿サンプル(1μl)および、1:4に希釈されたヒトの血漿対照実験物を、SDS/10%ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動にかけ、一般的な技術を用いて、ニトロセルロース膜フィルター上に移された。ブロットは1xPBS、pH7.4、0.03%ポリオキシチレンソルビタンモノラウレート(Tween 20)、および10%(w/v)の乾燥ミルク皮膜で、室温で2時間覆った。続いて1/1000希釈のモノクロナルハツカネズミ抗人因子第IX抗体(3μg/ml)とともに室温で2時間インキュベートした。このモノクロナル抗体は、ケニス・スミス(United Blood Services、New Mexico)から親切にも提供してもらった。膜はpH 7.4の1×PBS および0.03% Tween 20で3回洗浄し、次に抗ハツカネズミlgg(H+L)−セイヨウワサビペルオキシダーゼ共役体の1/500希釈とともにインキュベートした。この膜は、次にpH 7.4の1×PBSおよび0.03% Tween 20で4回洗浄して、次に化学ルミネセンス強化した10mlのウェスタンブロット検出溶液を1分間加えた。フィルターから発するルミネセンスを、感光紙によって20秒間検出した。我々は、140日間にわたってhFIXモノクロナル抗体に対して特異的にハイブリダイズしているバンドを検出した。トランスフェクションされていない対照群においては、ハイブリダイズしているバンドは検出されなかった。

0090

トランスフェクション後32日間後の動物からの肝臓が取り出され、ゲノムDNAが一般的な技術を用いて分離された。トランスフェクションした動物からおよびトランスフェクションしていない対照からの全部で5μgのDNAが、EcoR IあるいはBgl IIによって一晩切断された。サザンブロット電気泳動を確立された方法で行った。トランスフェクションされた動物からのDNAのみが、Bgl IIで4.5kb、EcoR Iで2.6kbのプローブにハイブリダイズされた。

0091

脾臓、肺、心臓および肝臓器官を、300μgのDNA複合体によってトランスフェクションされたラットから得た。これらの器官から分離された全てのゲノムDNAについて、PCR法分析を実施した。トランスフェクションされたラットの肝臓のみが、720bpプローブについて陽性であり、ラットの脾臓、肺、心臓、あるいは対照動物の肝臓は違った。

0092

pFIXによってトランスフェクションしたラットの肝臓中のヒト因子IXのためのmRNA転写物の存在は、モロニーハツカネズミ白血病ウイルス逆転写酵素による全細胞質肝臓のRNAの処理および、ポリメラーゼ連鎖反応による生成したcDNAの増幅後に決定された。簡単には、1μgの全ラット肝臓RNAを、10UのDNAse I(RNAseは含まれない)で処理し、次に500nMの(dT)16オリゴヌクレオチドプライマーおよび500nM の各dNTP含んだ溶液に加え、次に42℃に熱し、次に1μlのcDNAプールをPEPCKプロモーターの5’UTR領域に広がるプライマーおよびhFIXのためのcDNAを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。対照として、同じRNAサンプルで逆転写酵素によってcDNAに転化していないものも、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用し、混入プラスミドDNAが増幅していないことを確かめた。生成物は、アガロースゲル電気泳動および蛍光標識されたヒト因子第IXのcDNAプローブを使用したサザンブロットによって分離された。我々は、トランスフェクションされた動物のみ、hFIXプローブによって特異的にハイブリダイズされたバンドを確認した。トランスフェクションされていない対照群、あるいは逆転写酵素によってcDNAに転化されていないトランスフェクションされたサンプルのいずれにおいてもバンドは検出されなかった。

0093

トランスフェクションされた動物の血漿中でのhFIXの機能活性は、ヒト因子第IXの凝結促進活性を測定して分析すればよい。1段階の変更は因子IX欠失ヒト血漿カオリン活性化の、部分的トロンボプラスチン時を使用した。静脈穿刺によって実験動物から血液サンプルを得る。50分の1体積の500mMクエン酸ナトリウム(pH 5.0)を、凝固を防ぐために加え、そして血漿は20℃で保存される。このサンプルを二重に分析し、次にこれらの活性は、24人の正常な人の男性からの貯められていた血漿の機能活性と比較される。正常な人の血漿中は100%の機能活性あるいは、約3μg/mlのヒト因子IXに相当する。ラット血漿中の因子IX活性のバックグランドラット血清中で、約0.15ユニット/mlの因子IX活性)は、それぞれの動物中で決定されたヒト因子IXの値からそれぞれ引かれている。バックグランドの値は、この分析で使用されたヒトIX因子アッセイで測定されたラット因子IXの非特異的交叉活性である。静脈穿刺によって実験動物から血液サンプルを得る。50分の1体積の500mM硝酸ナトリウム(pH 5.0)を、凝固を防ぐために加え、そして血漿は20℃で保存される。人の血漿中における正常なhFIX濃度は3μg/mlである。約15ng/ml(トランスフェクション72日後)から1050ng/ml(トランスフェクション48日後)の活性化ヒト因子第IXが、DNA複合体によってそれぞれの動物に注入された(表102)。
動物中で見出される組み替えhFIXの濃度の小さな変化が、デリバリー効率による違いあるいは新しく導入された遺伝子の発現による違い、のどちらを表すのかははっきりしない。このhFIX遺伝子は、動物中で140日間(この実験の期間)にわたって発現し、特に48日目に最も高いレベルを示した(表102)。

0094

トランスジェニック動物を使用して、PEPCKプロモーターからの転写を、低タンパク質・高炭水化物食の投与によって導くことが確立されている(McGraneら、1988,1990;
Shortら、1922)。トランス遺伝子の調節された発現を立証するために、我々は、一週間にわたる高タンパク質低炭水化物の食餌を与え、あるいは普通の食餌をあたえた、その前後におけるトランスフェクションした動物の血液中のhFIXの存在を、ウェスタンブロットハイブリダイゼイションによって調べた。PFIX遺伝子を含む動物中の、PFIX遺伝子の発現の三倍までの誘導を、DNA複合体の注入後140日後までに記録した。ASGEを標的にした受容体に媒介された遺伝子転移代替方法を用いた、ラット肝臓に導入されたこれと同じPEPCK−hFIX遺伝子は、2日間のみの活性であった(Ferkolら、1933);これは、高度に緻密にしたDNA複合体が、本研究において記録されたトランス遺伝子の発現の長期化の原因であろうことを、示唆する。

0095

140日間中の複数の時点のhFIXタンパク質の維持されたレベルの検出は、実験期間中を通して発現していることの証拠となる。ヒトFIX800bp.の特異的転写は、逆転写酵素による全細胞質RNAから生じたcDNAのPCR増幅によって検出され、動物の肝臓中では機能hFIXタンパク質が発現している(図3A)。mRNAの実験期間中にわたっての存在は、これらの動物中に転写活性DNAの維持されたプールがあることを示し、この持続性によって長きにわたっての発現およびhFIXと特異的mRNAの検出を説明できる。

0096

我々はまた、トランスフェクション32日後の動物の肝臓中に、トランスフェクションされたDNAを存在することを確立でき、また、その物理的性質を研究した。この採取したDNAは、このプラスミドを線状(4.5kb)にするBgl IIおよびこのプラスミドからキメラの2.6kbの遺伝子を放出するEcoRIを用いて制限酵素分析にかけられた。hFIXに特異的なプローブを使用したサザンブロットハイブリダイゼイションによって、トランスフェクションしたDNAは、トランスフェクションした肝臓中でエピソームできる状態で残っていることが示され、その理由は、Bgl IIから生じるシングルバンドが、線状プラスミドのサイズと一致し、ランダムな増殖が起こったときに予期される不鮮明なハイブリダイゼイションと対照的になるからである(図3B)。我々は、トランスフェクションしたDNAが、トランスフェクションした動物のenome中でランダムな増殖をすることの可能性を除外することはできない。しかしながら、肝臓は有糸分裂刺激(すなわち、肝切除)を受けていないので、この事象は起こりそうもない。

0097

アシアロ糖タンパク質受容体は、肝臓の柔組織の細胞にのみ存在する。それにもかかわらず、アシアロ糖タンパク質および他のガラクトース末端のリガンドが、分子リガンドの大きさに依存する機構によって、マクロファージによって取り上げられ得ることが示された。参照、Schlepper-Schafer,J.ら、Exp.Cell.Res.,5:494(1986);Bijsterbosch,M.K.ら、Mol.Pharmacol 36:484(1989);およびBijsterbosch,M.K.ら、Mol.Pharmacol
41:404(1922)。我々の実験におけるDNA/リガンド−ポリ−L−リシン複合体の大きさは、アシアロ糖タンパク質受容体の識別するための範囲と矛盾しない。このDNA複合体の特異性を研究するために、我々は、トランスフェクションした動物中の異なる組織からDNAを得て、そしてそのトタンスフェクションされたDNAをPCR法によって増幅した。我々の結果は、肝臓以外の組織中では、増幅できるDNAが存在しないことを示し、これは肝細胞の特異的な取り込みを示す。特に興味深いのは、肺や脾臓といったマクロファージを含んだ組織中においては、検出できる取り込みがなかったことである。対照的に、トランスフェクションした動物の肺や脾臓中から、トランスフェクションされたDNAを、ウらによって記述されたアシアロ糖タンパク質受容体を用いて、受容体によって媒介されたエンドサイトーシスのための方法を用いることで、我々は検出した。我々の実験中でなされた分子リガンドの小ささが、ここに報告された特異的な取り込みの原因になっていると、我々は考えている。

0098

この実施例中では、異なるプロモーター遺伝子構成物(SV40/ルシフェラーゼ)が、異なる標的細胞結合部分を使って、異なる細胞タイプ(マクロファージ)中へデリバリーされる。

0099

序論 特定の細胞による循環している糖タンパク質の認識および取り込みは、この分子表面に存在していてさらされている糖残基の性質によって決定される。特定の糖タンパク質のクリアランスシステムは、比較的限定的で、特定の種類の細胞によって媒介されている。マンノース受容体は糖タンパク質を、表面にさらされて還元されていない位置でのマンノース、グルコースフコース、およびN−アセチルグルコサミンの残基とともに認識する。様々なタンパク質および糖タンパク質が結合共役して、分離した肺胞のマクロファージに結合したこれら炭水化物残基を運び、そしてラットの循環中へ注入したマンノース−末端糖タンパク質はインヴィヴォでクッパー細胞によって取り除かれる。逆に、ガラクトース−末端タンパク質は、これは肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体によって取り除かれるのだが、これらの細胞によっては認識されることはない。この細胞−表面受容体は、循環する単球ではなく、様々なマクロファージサブタイプによって発現され、そして、マンノース−末端糖タンパク質のデリバリーおよび内面化を媒介する。このマンノース受容体は、前リソソーム区画から細胞表面への継続したリサイクルを行い、そして受容体発現はマクロファージによって調節されている。

0100

マンノース末端糖タンパク質に結合し、それ故受容体を介する遺伝子運搬の標的細胞になりうるかもしれない様々な器官(すなわち、肝臓、脾臓、肺、および骨髄)に、マクロファージは存在する。マンノース受容体を運搬する機能外来性遺伝子をデリバーする我々の能力を確かめることによって、この仮説テストした。このレポートにおいて、マンノース−末端ネオ糖タンパク質キャリヤーを合成し、ハツカネズミの腹膜浸出液から分離された一次ネズミマクロファージへの受容体媒介遺伝子転移のためのリガンドとして使用した、これはその表面に受容体を豊富に発現する。加えて、リポーター遺伝子を、マンノース−末端ネオ糖タンパク質キャリヤーを使用して、無傷のラットの肝臓および脾臓中のマクロファージにうまく転移させた。

0101

方法 材料:DNA−修飾酵素、ヌクレオチド、および5-ブロモ-4−クロロ-3−インドール−β−D−ガラクトピラノサイドをBoehringer Mannheim(Indianapolis,Indiana,USA)から購入した。ポリ(L−リシン)、a−D−マンノピラノシルフェニルイソチオシアネートアルブミン、およびa−D−ガラクトピラノシルフェニルイソチオシアネートを含む全ての化学物質を、Sigma Chemical Conmany(St.Louis,Missouri,USA)から購入した。ルシフェラーゼ分析システムを、Promega(Madison,Wisconsin,USA)から購入した。ウサギ抗−β−ガラクトシダーゼ抗体およびフルオレセインイソチオシアネート−結合共役ヤギ抗−ウサギIgGを、5Prime to 3Prime,Inc.から購入した。すべての中膜血清、および抗生物質を、Gibco Laboratories(Grand Island,New York,USA)から購入した。

0102

マンノース末端糖タンパク質キャリヤの調製:合成の糖タンパク質キャリヤーを作成する、ここでは、平均鎖長が100(Mr 20,000Da)であるポリ(Lリシン)を、N,N−ジメチルフォルムアミドに溶解しているa−D−マンノピラノシルフェニルイソチオシアネートを使用して、糖タンパク質にした。この溶液はpH9.5の1M炭酸ナトリウムを加えることで、pH9.5に調節した。光を遮断し、22℃で16時間インキュベートしてから、溶液を5mM塩化ナトリウムに対して2日間透析した。約0.8から1.0%のポリリシン中のアミン側鎖が糖タンパク化され、これは250nmにおける吸光波長によって決定された。対照として、代替糖タンパク質キャリヤーを、a−D−ガラクトピラノシルフェニルイソチオシアネートとともに、a−D−マンノピラノシルフェニルイソチオシアネートによって合成した。

0103

レポーター遺伝子およびプラスミドの準備:発現プラスミドpGEMluc はSV40ウイルスプロモーターを含み、増大要素をP. pvralisルシフェラーゼ遺伝子結紮した。プラスミドpCMVZ およびpCMVIL2rは、E.coli lacZおよびインターロイキンの2受容体遺伝子にそれぞれ結びついている巨細胞ウイルス(CMV)プロモーターからなり、やはりレポーター遺伝子として使用される。このプラスミドはE.coli DH5a中で成長し、抽出して、そして一般的な技術(14)を用いて生成される。制限エンドヌクレアーゼによるプラスミドの分解によって、適切な長さのフラグメントが得られ、そして、1.0%アガロースゲルによる電気泳動によって、純度が達成される。プラスミドのサイズは次の通りである:pGEMluc、6.0;pCMVlacZ、10.9、pCMVIL2r、5.4 kB。プラスミドの準備において、バクテリアの遺伝子DNAは存在しなかった。

0104

マンノース末端糖タンパク質キャリヤーDNA複合体の準備:複合体は実施例1と類似して形成されるが、しかしながら、このDNAは約80%超ヘリクス構造をとり、20%は開環構造である。
細胞および細胞培養一次マクロファージを、1mlの醸造チオグリコレート媒介の腹膜内への注入4日後のマウスの腹膜腔から、分離した。この腹膜浸出液からのマクロファージは、前述したように集められ、そしてRPMIMedia 1640 中で保持した。この方法で、約5×106個の細胞を一匹のマウスから集めることができ、このうち40から75%は、形態学上の細胞の特徴および細胞化学の同定にもとづくと、単核食細胞である。トランスフェクションは、収集した1日から2日後になされる。分離した細胞は約30から60%のトランスフェクションの時点の合流がある。細胞の生存能力は、ひとつづきの細胞の数およびトリパンブルー排除によって決定される。

0105

培養中のマクロファージへのDNAデリバリー:分離1日後、マウスの腹膜腔内から分離されたこの細胞は、PBS(pH7.4)によって一度洗浄され、中膜をトランスフェクション前に素早く取り替える。5μg(0.4から0.7pmol)プラスミドを含んだ、この結合共投−DNA複合体は、培養基質に適用され、他の実験が要請されない限り、細胞上に24時間そのままの状態であることが許される。この細胞は、次にタンパク抽出のために収集しても、あるいはトランスフェクション後の幾つかの時点におけるβ−ガラクトシダーゼアッセイのために、そのまま固定してもよい。

0106

動物:平均体重が約250gである、成体のオスのスプラグドーリイラットを、エーテルを用いて麻酔した。無菌技術を用いて、300μg(20.8〜42.0pmol)のキャリヤに複合した発現プラスミドを含んだ0.3から0.6mlの溶液を、尾部の大静脈に注入した。ラットを、複合体の注入後、異なるインターバルで殺し、肝臓、肺、および脾臓をトランスフェクションした動物から分析のために取りだした。さらに、マクロファージが肺胞、骨髄、および脾臓から分離された。骨髄細胞はラットの大腿骨から得た。この大腿骨は、実験動物が殺された後に外科的に取り出されて、次に1mlの媒体髄腔に注入し髄腔から吸引した。単細胞懸濁液を、パスチュールピペットを用いて慎重に細胞を吸引することで用意した。骨髄から抽出した細胞は、RPMIMedia 1640中で8〜12時間の間維持されて、スライドガラスにつけられることができ、この時点では付着した細胞は免疫細胞化学染色のために固定されている。トランスフェクションされていない動物と模擬トランスフェクションした動物を、全ての分析において、対照群として使用した。動物実験プロトコールは、ケース
ウェスタンリザーブユニバーシティインスチテューショナルアニマルケアコミティによって検査承認された。

0107

β−ガラクトシダーゼ活性のための細胞化学的アッセイ:β−ガラクトシダーゼを発現しているそれぞれの細胞は、5-ブロモ-4-クロロ-3−インドール−β−ガラクトピラノサイド(X-gal)を前述したように用いて、以下のインキュベーションによって同定される。簡単には、この細胞を、15分間PBS中の1%グルタルアルデヒド溶液によって固定し、次に、0.5 % X-galを含んだ溶液を用いて37℃で12時間インキュベートした。また、この細胞を、非特異的エステラーゼ活性のために、染色し、これは不溶性黒灰色染料を生じる。組織培養基中の最少100 個の細胞を数えてβ−ガラクトシダーゼ活性を発現する細胞の割合を決定した。

0108

組織中のβ−ガラクトシダーゼを発現しているそれぞれの細胞は、X-galを前述したように用いて、以下のインキュベーションによって同定した。簡単には、この細胞を、10分間PBS中の0.5%グルタルアルデヒド溶液によって固定し、pH 7.5のPBSで2回洗浄し、次に、リン酸塩−緩衝塩水(pH 7.4)中の0.5%X-gal、5mMのポタシウムフェリシアネート、5mMのポタシウムフェロシアネート、および1mM塩化マグネシウムを含んだ溶液を用いて、37℃で6時間インキュベートした。この染色された組織は、PBS中の2%パラホルムアルデヒド/0.5%グルタルアルデヒドの中で、4℃で固定し、パラフィンを一般的な操作で固定し、そして5μmの切片カットした。切片を0.1%核 fast red によって対比染色した。隣接する組織の部分も、非特異的エステラーゼ活性のために染色し、これは、黒褐色を生じる。青く染色された細胞は、分光顕微鏡によって同定した。

0109

マクロファージの細胞化学的同定:細胞および組織分画は、非特異的エステラーゼ活性として染色し、これは単核食細胞に比較的特異的である。細胞の塗抹標本は、上述のように固定し、そしてa−ナフチルアセテートおよびFast Blue BB塩を含んだ濾過溶液とともに、室温で10分間インキュベートした。組織部分はこの溶液によって1〜3時間染色し、0.1%核fast redによって対比染色した。

0110

ベータガラクトシダーゼのための免疫細胞化学染色:プラスミドpCMVZでインヴィヴォでトランスフェクションした組織(脾臓および骨髄)から単離した細胞中のトランスジーンの発現は間接免疫螢光法によって測定した。細胞塗抹標本は、室温で2分間メタノールアセトンで固定し、細胞を37℃で1時間ラビット抗−b−ガラクトシダーゼポリクローナル抗体でインキュベーションした。
最初の抗体を固定した細胞塗抹標本の疫検出用PBS中で1:100に希釈した。PBS中で1:100に希釈した抗ラビットイムノグロブリンGを結合したフルオレセインイソチオシアネートを二次抗体として使用した。また細胞は、細胞核に赤い螢光を生じるヨウ化プロピジウムで対比染色した。各インキュベーションの間で、細胞を3回5分間PBSで洗浄した。染色した細胞を螢光顕微鏡で調べた。

0111

ルシフェラーゼ活性用アッセイ:培養細胞を上記のように収集し、溶菌し、前記のようにルシフェラーゼ活性を分析した。動物を犠牲にしてそのまま50ミリリットルの冷PBSでpH7.5にて潅流した後、トランスフェクションしたコントロールラットから組織を収集した。組織は溶菌緩衝液中で均質にし、10分間22℃でインキュベーションさせた。細胞溶菌液を次に5分間4℃で遠心分離し、蛋白質抽出物をルシフェラーゼ活性について分析した。溶菌液蛋白質含量についてアッセイし、測定した積算した光単位を全蛋白質含量に対して標準化した。全測定は3回行い、平均値で表した。

0112

統計学上の分析:データーは平均値(SEM)の±標準誤差で表し、スチューデントニューマンケールス(SNK)試験を使用して分散量を分析して評価した。
結果マンノース終結糖蛋白質キャリヤを使用する一次マクロファージのインヴィトロトランスフェクションリポーター遺伝子としてE.coli lacZ遺伝子を符号化する発現プラスミド(pCMVZ)を使用して、プラスミドおよびマンノース終結糖蛋白質キャリヤのコンプレックスをマウスから単離した細胞腹膜滲出物に塗布した。トランスフェクション24時間後、細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性について試験した。トランスフェクションした細胞の数は試験した全細胞の5から26パーセントまで変化した。さらに、非特異的エステラーゼ活性、トランスジーンを発現する単核細胞およびマクロファージの細胞化学マーカー特性をもつ細胞の割合は40%から75%までの範囲だった。キャリヤに結合した無関係のプラスミド(pGEMluc)またはガラクトース終結糖蛋白質キャリヤに結合した発現プラスミド(pCMVZ)からなるコンプレックスを使用するトランスフェクションは、滲出物細胞では有意のβ−ガラクトシダーゼ活性はない。薄い青色の染色がこれらのコントロール細胞に見られ、これは内生のβ−ガラクトシダーゼ活性に起因するものであるらしい。それにもかかわらず、コントロール中の青色染色細胞の割合お強度はトランスフェクションしたディッシュのものよりも著しく小さかった。マンノース終結糖蛋白質キャリヤ−DNAコンプレックスは、細胞数およびトリパンブルー染色に基づき、処理後に変わりやすい細胞の割合が、コントロールとは有意差が無かったので、細胞に対して毒性がないことを示した。

0113

マンノース終結糖蛋白質キャリヤと発現プラスミドpGEMlucのコンプレックスを、期間を増やすために腹膜滲出物から単離した細胞に塗布し、ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションに続いて24時間トランスフェクションした細胞の蛋白質抽出物で測定した。先の実験で注目されるように、転移した遺伝子の発現水準は変わった。トランスフェクションした細胞における関連するルシフェラーゼ活性の増加は8倍であり(p<0.01)、これに対して、ガラクトース終結糖蛋白質キャリヤを使用して生成したコンプレックスで処理した細胞から得られた蛋白質抽出物はトランスフェクションしていないコントロールとは有意に異なる活性を示さなかった。さらに、マンノース受容体をキャリヤと競争しなければならないトランスフェクション直前に、培養基にコンプレックスに対して百倍のモル過剰のマンノシル化ウシ血清アルブミンを添加すると、リポーター遺伝子の取り込みと発現を完全に阻害した(p<0.01)。これら細胞のトランスジーン発現の持続時間も試験した。マンノース終結糖蛋白質キャリヤと発現プラスミドpGEMlucのコンプレックスを、24時間細胞に塗布し、蛋白質抽出物をトランスフェクション後数時間の時点でルシフェラーゼ活性についてアッセイした。最適のトランスジーン発現は処理後1日で検出され、ルシフェラーゼ活性はトランスフェクション8日後にコントロール水準まで減少した。

0114

マンノース終結糖蛋白質キャリヤを使用するマクロファージのインヴィヴォトランスフェクションマンノース終結糖蛋白質キャリヤを使用してリポーター遺伝子を無傷の動物の脾臓および肝臓に移した。ラットに麻酔をかけ、300μgのプラスミド(pGEMluc)をマンノース終結糖蛋白質キャリヤに混合し、数分間にわたり尾部の大動脈に徐々に注入した。コントロールと、キャリヤに結合した無関係のプラスミド(pCMVlacZ)からなるコンプレックスを使用する動物の模擬トランスフェクションも並行して行った。全動物に残存したコンプレックスを注入した。肝臓、肺、および脾臓から抽出した組織ホモジェネート中のコンプレックスを注入した4日後にルシフェラーゼアッセイを行った。トランスフェクションした動物から得られた脾臓からの蛋白質抽出物に有意の水準のトランスジーン発現を認めた。さらに低い水準のルシフェラーゼ活性を肝臓と肺に見出した。トランスフェクションしていないラットと、マンノース終結糖蛋白質キャリヤに結合した無関係のプラスミド(pCMVlacZ)からなるコンプレックスで処理した動物は、どの組織からの蛋白質抽出物も有意のルシフェラーゼ活性はなかった。
トランスフェクション12日後、ルシフェラーゼ活性は試験した全組織でバックグラウンド水準に近づいた。

0115

トランスジーン発現の細胞分布を、pCMVlacZを含むコンプレックスを注入した3日後に脾臓および肝臓の切片で試験した。組織は、細胞化学染色によってb−ガラクトシダーゼ活性について分析した。コンプレックスで処理した動物はコントロールとして使った無関係のプラスミド(pCMVIL2r)を使用して作った。ベーターガラクトシダーゼ発現は、細胞化学染色に基づいて非特異的エステラーゼ活性を発現した細胞の分布に従った被膜下の領域にある脾臓の小細胞数個検出した。コントロールの脾臓の対応する細胞にはベータガラクトシダーゼ活性は見られなかった。希有青色染色細胞はトランスフェクションした動物の肝臓部分に存在し、やはり表面マンノース受容体をもつ肝臓内皮細胞はトランスジーンを発現しなかった。また核をもつ細胞は脾臓から単離されインヴィトロで染色した。さらに、トランスフェクションした動物とコントロールの動物の骨髄と気管支肺胞性の洗浄液から抽出した細胞もまた、X−galを含む溶液で処理し、ベータ−ガラクトシダーゼ活性について試験した。脾臓から得られた約10−20パーセントの核のある細胞が青色に染色した。模擬トランスフェクションした動物からの希有細胞も薄く青色に染色し、これは内在性β−ガラクトシダーゼに起因するらしい。それにもかかわらず、コントロール中の青色染色細胞の割合と強度はコントロール動物に見られたものよりも有意に小さかった。

0116

細菌のベータ−ガラクトシダーゼに向けたポリクローナル抗体を、トランスジーン生成物の免疫細胞化学の局在化に使用し、脾臓中の青色染色細胞が内生のベータ−ガラクトシダーゼまたはX−galの非特異的加水分解によるものではないことを確立した。核をもつ細胞は、上記の動物の脾臓と骨髄から単離し、ベータ−ガラクトシダーゼおよびフルオレセインイソチオシアネート複合抗ラビットに向けた抗体で染色し、免疫螢光を試験した。細胞化学アッセイで示された青色染色細胞と形態学的に似ている幾らかの単離した細胞は、免疫螢光染色性があった。さらに、これらの細胞は非特異的エステラーゼ活性があった。

0117

論考培養物のマクロファージおよび全動物の肝臓への機能遺伝子の転移を媒介できる合成糖蛋白質コンプレックスを開発した。マンノース終結糖蛋白質キャリヤに非共有結合した発現プラスミドは、マンノース受容体を発現する細胞に有効に導入することができる。受容体媒介遺伝子転移系によるDNAのデリバリは標的細胞の表面に存在する受容体に依存する。アシアログリコプロテイン受容体を発現できない細胞は、この系によってはトランスフェクションされなかった。マクロファージに加えて、マンノース受容体を発現できない腹膜の滲出物に存在する他の細胞のタイプ、すなわち、顆粒性白血球、リンパ球および繊維芽細胞はトランスフェクションされなかった。リポーター遺伝子の発現は、マクロファージ同定に使用した細胞化学マーカーに頼る非特異的エステラーゼまたはペルオキシダーゼ活性のいずれかをもつ細胞に局在していた。

0118

特異的受容体についてリガンドの特異性および親和性は外因性遺伝子のデリバリにかなり重要である。マクロファージはマンノース終結糖蛋白質を高い親和力と特異性で結合する。マンノース終結糖蛋白質キャリヤはリポーター遺伝子を培養基および無傷の動物のマクロファージにうまく導入したが、トランスジーン発現はガラクトース終結糖蛋白質キャリヤを使用してトランスフェクションした細胞中に検出されなかった。培養基中に存在する糖蛋白質に従属する飲作用または食作用の非特異的増加による取り込みは現れない。プラスミドのデリバリと発現は、マンノース受容体の結合部位について恐らく競争するであろう培養基にマンノシル化牛血清アルブミンを添加して阻害される。最後に、マンノース受容体はまた、暴露位置でグルコース、フコース、およびN−アセチルグルコサミン残基をもつ糖蛋白質を認識するので、マンノースに代わる単糖類を置換するとDNAキャリヤコンプレックスの親和力を増加する。さらに、単糖類は多価糖蛋白質よりも受容体に対して不十分なリガンドなので、遺伝子転移効率はオリゴ糖、即ちオリゴマンノースに炭水化物残基を変えることによって潜在的に改善することができる。

0119

標的細胞に転移した遺伝子の発現の水準を決定する際の主な因子は、核への外因性DNAの生存とデリバリを含む。受容体媒介機構によって導入された遺伝子の発現はエンドソームの区画中のコンプレックスのトラッピングと分解によって制限することができる。マンノース終結糖蛋白質は、受容体媒介エンドサイトーシスによってマクロファージに導入され、プリリソソーム酸性区画にデリバリされて、続いて二次リソソームに送られる。明らかに、発現されるトランスジーンのために細胞にコンプレックスが入った後に転移したDNAは分解を避けなければならないので、導入された結合部分は分解を防止する。これらのデリバリ系によって細胞中に転移したDNAの物理的状態は、生存と続く発現に貢献することができ、DNAが非常に緊密な形でヌクレアーゼ消化に一層耐えられる。さらに大きさが小さいキャリヤ−DNAコンプレックスもまた、食作用によるものではなく、特異的にマンノース受容体を介してプラスミドを網内系の細胞に導入できる。

0120

この研究は、マンノース受容体を標的にすることによってマクロファージに特異的に向かう遺伝子転移の可能性を示しており、理論的にゴーシェー病のような代謝の種々の先天性エラーの治療に近づくことができる。またマンノース受容体を標的にする薬理学療法がゴーシェー病の患者に有効であることが示された。
修飾したヒトグルコセレブシダーゼで感染個体を繰り返し治療すると、外の炭水化物部分が分解し終結マンノース残基をさらし、病気が実質的に臨床的に改善され、肝脾腫を小さくして貧血を解消した。不幸にも、この治療のコストは多くの患者には高すぎた。骨髄移植は非神経病の形の病気に効くことが示されたが、移植の潜在的合併症が多くの患者、特に軽い病気の個体では、その実施を阻んでいる。しかし、ゴーシェー病は骨髄移植によって癒されるので、ゴーシェー病の遺伝子治療のために提案されたひとつの可能性のあるアプローチは正常のグルコセレブロシダーゼ遺伝子を自家移植した造血幹細胞生体外移植し、次に患者の中に導入することを含む。あるいは、リンパ芽球は冒された個体から収集でき、複製−不全の、野性型遺伝子を含む組み換えレトロウイルスで感染させ、患者に戻すことができた。分泌した酵素はマンノース受容体を介してマクロファージに入り、従って治療の二次標的になる。この系では、マクロファージは遺伝的修正のための一次標的である。発現の遺伝子デリバリの有効性、持続時間および発現水準に関する実際的な疑問は、この技法を用いて達成され、DNA−キャリヤコンプレックスの免疫学的性質が扱われる必要がある。それにもかかわらず、受容体媒介遺伝子治療は、このような病気の治療に健康な組織を冒すことなくアプローチする可能性をもっている。

0121

また気道上皮に発現するラット多因子免疫グロブリン受容体に向けたモノクローナル抗体Fab断片を使用した。Fabペプチドはポリ−L−リシンに共有結合し、下記方法を用いてSV40−ルシフェラーゼ発現ベクターに結合する。
DNAコンプレックスを注入したラットは、受容体を発現した組織にだけ8日間の長さで(実験の継続期間)ルシフェラーゼ活性をもった。これらの発見はDNAを成体動物の特異的組織にデリバリするためのこのシステムの融通性を強調している。

0122

序論気道への遺伝子転移の幾つかの方法は、機能性遺伝子をインヴィヴォで細胞に導入するように開発された。しかし、これらの方法の多くは特異性が不足しており、細胞毒がある。複製欠失の組み換えアデノウイルスを使用してリポーター遺伝子を、種々の動物モデル呼吸上皮細胞にデリバリしてきた。しかし、アデノウイルスを用いた治療の生理学的効果は良く理解されておらず、最近の証拠は高ウイルス力価で投与された第1世代のアデノウイルスベクターは肺の中に実質的な炎症性応答を生じることを示唆している。またリポソームを使用して、機能性遺伝子を気道上皮に転移させたが、この方法は一般に細胞には毒性があり、特異性が不足していた。

0123

受容体媒介遺伝子転移は、非感染性の非毒性のベクターを用いてDNAを特異的標的細胞にデリバリするための方法を提供することができる。この遺伝子転移の形態は、かなりの大きさのDNAプラスミドで特異的に組織を標的にし、トランスジーンだけでなく、プロモーターおよびエンハンサー要素のデリバリを可能にする。受容体媒介系の場合には、外性DNAのデリバリは、DNA−キャリヤコンプレックスの安定性、標的の細胞の表面の特異的受容体の存在と数、受容体−リガンド親和力および相互作用、およびコンプレックスの有効なインターナリゼーションに依存している。さらに、転移した遺伝子の発現はエンドソーム小嚢からの回避および標的細胞核へのトラフィッキングに依存する。受容体媒介エンドサトーシスの活用によってデリバリされる全動物のトランスジーン発現の持続時間は一般に一次的であり、治療後72時間以内にもとの水準に戻る。これは、アデノウイルス−ポリリシンおよびトランスフェリン−アデノウイルス−ポリリシンベクターを使用して、気管内経路を経て気道上皮細胞に導入されるリポーター遺伝子のためのケースであった。

0124

多因子の免疫グロブリン受容体(pIgR)を標的にするヒト気管上皮細胞一次培養が、受容体を運ぶ細胞に特異的にトランスジーンを有効デリバリさせることをわれわれは示した。この多因子の免疫グロブリン受容体は、気道上皮および粘膜下組織腺細胞を含めて、粘膜上皮細胞にのみ発現し、大きい分子のインターナリゼーションおよび非分解性の転移に特異的に採用される。この報告で、われわれはインヴィヴォでの多因子免疫グロブリン受容体を標的にすると、トランスフェクション6日後に最大である受容体を運ぶ細胞を含む組織中のトランスジーンの発現となることを示す。

0125

方法論材料。DNA修飾酵素、ヌクレオチド、および5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシドベーリンガーマンハイム(インジアナポリス、インジアナ、USA)から購入した。ルシフェラーゼアッセイシステムはプロメガ(マジソン、ウイスコンシン、USA)から入手した。プロテインA
MAPアガロースカラムビオラド(リッチンド、カリフォルニア、USA)から購入した。パパインとポリ(L−リシン)はシグマケミカル社(セントルイス、ミズーリー、USA)から入手し、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオプロプリオネートはピエスケカル社(ロックフォルドイリノイス、USA)から入手した。マウスモノクローナル抗ヒトインターロイキン2受容体抗体はダココーポレイションから入手した。(カーペンテリアカリフニルニア、USA)、そしてフルオレセインイソチオシアネート標識二次ヤギ抗マウス抗体はシグマイムノケミカルス(セントルイス、ミズーリー、USA)から入手した。イムノパーオキシダーゼ染色法に使用したベクタステインABC法は、ベクターラボラトリーズ(バーリンガム、カリフォルニア、USA)から入手した。全培養基、血清、抗生物質はギブコラボラトリーズ(グランドアイランドニューヨーク、USA)から入手した。

0126

Fab断片の調製。ラット分泌成分で免疫させたラビットから導いた抗体の単離とパパイン消化は先に述べた。簡単に言うと、ポリクローナル抗体をラビット血清から、製造元が記載しているようなプロテインA
MAPSアガロースカラムを用いて単離した。単離した免疫グロブリンG(2mg)を20μgのパパインで12時間37℃で、100mMの酢酸ナトリウム(pH5.5)、50mMのシステイン、および1mMのEDTAの存在で処理した。Fab断片を無傷の抗体およびFc断片からプロテインAカラムクロマトグラフィーによって分離した。無関係のFab(IFab)は免疫前のラビット血清からIgGのパパイン分解によって生成した。

0127

Fab−ポリリシン結合体の調製。ヘテロ二価架橋試薬N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロプリオネート(SPDP)を用いて、抗−pIgR免疫グロブリンGのFab断片をポリ(L−リシン)(Mr10,000Da)に共有結合した。Fab断片は0.1Mリン酸塩緩衝食塩水(PBS)、pH7.5中で22℃で60分間、75倍モル過剰のSPDPでインキュベーションした。2−ピリジルジスルフィド構造をFab断片に導入した後、未反応のSPDPおよび低分子量の反応生成物を透析によって除去した。修飾したFab断片のジスルフィド橋を25mMのジチオトレイトール開裂させた。ポリ(L−リシン)とSPDPの両方を15倍モル過剰で修飾Fab断片に添加し、反応を22℃で24時間行った。結合体を透析して、低分子量の反応生成物を除去し、得られた蛋白質を0.1%SDS−7.5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離して分析した。先に述べたように、結合体の分析は、ゆっくり移動した蛋白質が大きさが200kDaよりも大きい蛋白質に相当することを示した。

0128

リポーター遺伝子とプラスミド調製。発現プラスミドpGEMlucはP.pyralisルシフェラーゼ遺伝子に結合したSV40ウイルスプロモーターを含んでいた。プラスミドpCMVZおよびpCMVIL2rは、それぞれ、E.coli lacZに結合したサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびインターロイキン2受容体遺伝子からなり、リポーター遺伝子として使用した。ルシフェラーゼ活性を研究するために、これらのプラスミドを無関係のDNA(IDNA)コントロールとして使用した。プラスミドはE.coli DH5aで生長させ、抽出し、標準技法で精製した。制限エンドヌクレアーゼでのプラスミドの分解は適当な大きさの断片を生成し、純度は1.0%アガロースゲル電気泳動によって立証した。プラスミドの大きさは次のようである:pGEMluc,6.0;pCMVlacZ,10.9;およびpCMVIL2r,5.4kB。バクテリヤゲノムDNAおよびRNAでの汚染はプラスミド調製で存在しなかった。
Fab−ポリリシン−DNAコンプレックスの調製。キャリヤ−DNAコンプレックスは先に述べた方法を用いて生成した。

0129

動物:抗ラット分泌成分Fab抗体−ポリリシンキャリヤを使用してリポーター遺伝子を無傷の動物の気道および肝臓に移した。体重が約250gの成体の雄のスプラグ・ドーリイラットに麻酔をかけた。無菌技法を用いて、キャリヤに結合した発現プラスミド300μgを含む溶液0.3ないし0.6mlを尾部の大静脈に注射した。コンプレックスの注入後数回に分けて殺し、種々の器官を分析用に除いた。キャリヤに結合した無関係のプラスミド、または無関係のFab断片で作ったキャリヤに結合した発現プラスミドからなるコンプレックスを使用して動物の模擬トランスフェクションを、並行して行った。動物研究プロトコルを検討してケースウェスタンェリザーブユニバシティインスチチューショナルアニマルケアコミッティによって承認された。

0130

β−ガラクトシダーゼ活性の細胞化学アッセイ:組織中のβ−ガラクトシダーゼを発現する各細胞を先に述べた5−ブロモ−4−クロロ−3−インドイル−β−ガラクトピラノシド(X−gal)と用いるインキュベーションにより同定した。簡単に述べると、細胞を10分間PBS中の0.5%グルタルアルデヒド溶液で固定し、2回PBS、pH7.5で洗浄し、次に0.5%X−gal、5mMのポタシウムフェリシアネート、5mMのポタシウムフェロシアネート、および1mMの塩化マグネシウムを燐酸塩緩衝液食塩水(pH7.4)中からなる溶液で4時間、37℃でインキュベーションした。染色した組織を2%パラホルムアルデヒド/0.5%グルタルアルデヒドのPBS溶液終夜4℃に固定し、標準法によりパラフィンを埋め込み5μmの切片に切断した。切片を核ファーストレッドで対比染色した。青色着色細胞を光学顕微鏡で同定した。最少の100細胞を数えてβ−ガラクトシダーゼを発現する切片に対する細胞の割合を決定した。さらに隣接す切片を標準プロトコルを用いてエルシァンブルー/過ヨウ素酸シッフまたはヘマトキシロンエオシンで染色した。

0131

ルシフェラーゼ活性のアッセイ:培養基の細胞を収集し、溶菌し、先に述べたようにルシフェラーゼ活性を分析した。動物を殺して後、組織をトランスフェクションしたラットおよびコントロールラットから収集した、そしてそのまま冷PBS、pH7.5で5分間潅流した。組織を溶菌緩衝液に均質化し、22℃で10分間インキュベーションした。細胞溶菌液を続いて5分間4℃で遠心分離し、蛋白質抽出物をルシフェラーゼ活性について分析した。溶菌液を、蛋白質含量についてアッセイし、測定した積算した光単位(10秒間隔)を全蛋白質含量に対して標準化した。全測定値は3回行い平均値で表した。

0132

インターロイキン2受容体の免疫組織化学染色。プラスミドpCMVZでトランスフェクションした組織のトランスジーンの発現を間接免疫螢光法で測定した。種々の組織の凍らせた切片をアセトンで10分間−20℃で固定し、10分間22℃で処理し自己螢光を減少させた。次に切片をPBS、pH7.5の10%ヤギ血清で1時間室温でインキュベーションした。細胞は連続してマウスモノクローナル抗−インターロイキン2受容体抗体およびフルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗−マウスIgGでインキュベーションした。両方の抗体をPBS中1:100に希釈し、各インキュベーションの間に、細胞を3回、5分間PBS、pH7.5で洗浄した。染色した細胞を螢光顕微鏡で調べた。

0133

結果 抗−分泌成分Fab抗体−ポリリシンキャリヤを用いるインヴィヴォトランスフェクション抗−ラット分泌成分Fab抗体−ポリリシンキャリヤ−DNAコンプレックスを注射した全動物が生存した。ルシフェラーゼアッセイは肝臓、肺、脾臓、および心臓から抽出した組織ホモジネート中のコンプレックスを48時間注入して行った。トランスフェクションした動物から得られた肝臓と肺からの蛋白質抽出物のトランスジーン発現の有意な水準を観察した。ルシフェラーゼ活性はpIgRを発現しない組織の脾臓および心臓には発見されなかった。さらに、キャリヤに結合した無関係のプラスミド(pCMVlacZ)からなるコンプレックスまたは無関係のFab断片に基づくキャリヤに結合した発現プラスミド(pGEMluc)で処理した動物は、どの組織を調べても有意のルシフェラーゼ活性を示さなかった。従って、pIgRを運ぶ細胞を含む組織のみが、トランスフェクションされ、トランスフェクションは無関係のFab抗体に基づくコンプレックスを非特異的に取り込むことに帰することができない。

0134

4組織から導いた蛋白質抽出物のルシフェラーゼ活性を、コンプレックスの注射後の異なる時点で測定した転移遺伝子の発現の時間経過が明らかになった。pIgRをもつ組織の肝臓および肺中に持続したルシフェラーゼ活性は、それぞれ注射後4日ないし6日に、蛋白質抽出物ミリグラムにつき、最大値13795±4431および461402±230078の積算光単位(ILU)に達した。

0135

受容体を発現できなかった組織は有意のトランスジーン発現を持たなかった。トランスジーン発現の細胞分布は種々の組織の切片で試験した。pCMVlacZを含むコンプレックスを注射した3日後に、気管、肺、および肝臓の組織切片はb−ガラクトシダーゼ活性の細胞化学染色を示した。コンプレックスで処理した動物は、コントロールとして供給された無関係のプラスミド(pCMVIL2r)を使用して作った。気管での発現は、上皮表面に並ぶ細胞に制限された。β−ガラクトシダーゼ活性は模擬トランスフェクション動物からの気管切片に検出されなかった。トランスジーンの発現は変わりやすく、青色に染色した細胞の50%以上が呼吸器上皮の領域にあった。一般に、気管上皮細胞の10〜20%の範囲で発現した。気道の近接切片のアルシャンブルー/過ヨウ素酸シッフ染色に基づいて、繊毛のあるそして分泌性の(状)呼吸上皮細胞はβ−ガラクトシダーゼ活性を発現した。トランスジーンからの発現は末端気道または肺胞のいずれにも、トランスフェクションまたはコントロールの動物に検出されなかった(データーは示されていない)。これは上皮細胞の分布が、そのまま免疫細胞化学染色に基づくpIgRを発現することと適合している。希有な粘膜下組織は気管切片にあり、かすかな青色染色のみを示した。炎症性の反応は、非−、模擬−、およびトランスフェクションした動物からの気管切片のどれにも見られなかった。

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