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技術 相同的組換えを用いた位置指定クローニングおよびサブクローニングのための方法ならびに組成物のキット

出願人 ヨーロピアンモレキュラーバイオロジーラボラトリー
発明者 スチュワート,フランシス,エー.ザン,ヨウミンムイラース,ヨエプ,ピーター,ポール
出願日 2008年11月28日 (11年5ヶ月経過) 出願番号 2008-303506
公開日 2009年5月21日 (10年11ヶ月経過) 公開番号 2009-106295
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物、その培養処理
主要キーワード 適合性要件 予備線 修復時間 採取点 参照文 パルスコントローラ 末端アーム 図式的表示
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図面 (19)

課題

制限酵素またはPCR方法論によって都合よく利用できるものよりも長いDNA断片を、クローニングするための、より効率的な方法の提供。

解決手段

細菌性リコンビナーゼによって媒介される相同的組換えを用いたDNAサブクローニングのための方法および組成物の提供。具体的には、相同的組換えを用いたクローニング方法、クローニングベクターとして有用なポリヌクレオチドを含む組成物、該ポリヌクレオチド組成物を含む細胞、ならびにRecE/TやRedα/βなどの細菌性リコンビナーゼにより媒介されるクローニングに有用なキット

概要

背景

2.発明の背景
大腸菌におけるDNAのクローニングおよびサブクローニング分子生物学土台をなすものである。DNAクローニングとは、複製起点二本鎖DNA断片作動可能に連結して、大腸菌または他の適当な宿主内で増やすプロセスをいう。DNAサブクローニングとは、例えばPCRによってin vitroで、または大腸菌や他の適当な宿主内での増殖によりin vivoで、すでに増幅されているDNA分子から二本鎖DNA断片を取得し、次にその二本鎖DNA断片を作動可能な複製起点に連結するプロセスをいう。大腸菌でのクローニングおよびサブクローニングは、典型的には、DNA断片末端を、大腸菌の複製起点と選択マーカーを含む線状化ベクターの末端にライゲートすることにより行なわれる。選択マーカーをベクター中に含めるのは、大腸菌宿主細胞に導入したとき、新たにクローン化された産物(その挿入物を含むプラスミド)が保持され増幅されることを確実にするためである。

従来のクローニング法にはいくつかの制限がある。例えば、通常のクローニングは制限酵素の使用を必要とするので、DNA断片の選択は、関心のあるDNA領域中の制限酵素認識部位利用可能性によって制限される。所望のDNA断片の内部ではなく境界を切断する制限部位が存在しなければならない。最も有用な制限酵素はかなり頻繁に切断するので、作製される線状DNA断片のサイズも制限される。

DNA断片を生成するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用が増えるにつれて、従来のサブクローニングには第2の大きな欠点が提起された。PCR産物の末端は、熱安定性ポリメラーゼにより増幅PCR産物の3'末端に付加された非鋳型ヌクレオチドのために、ライゲーション反応において非効率的である。さらに、PCRの使用は高リスク突然変異を伴う。したがって、分子生物学者らは、DNAの断片を、特に制限酵素またはPCRの方法論によって都合よく利用できるものよりも長い断片を、クローニングするための新規で、より効率的な方法を探し求めてきた。

相同的組換えはDNA断片をクローニングおよびサブクローニングするための代替法である。宿主の相同的組換え系を利用する、大腸菌でのPCR産物のサブクローニング法はすでに開示されている(Olinerら, 1993, Nucleic AcidsRes. 21:5192-97(非特許文献1); Bubeckら, 1993, Nucl. Acids. Res. 21:3601-3602(非特許文献2))。そのような方法では、関心のあるDNA断片を増幅するために、線状化ベクターの両末端の配列に相同末端配列を含むように設計されたPCRプライマーを使用する。次いで、PCR産物と線状化ベクターを大腸菌に導入する。大腸菌宿主細胞内での相同的組換えがプラスミドベクターへのPCR産物配列の挿入をもたらす。こうした方法はPCR断片をサブクローニングするには有用であると分かったが、長いDNA断片のサブクローニング、または任意のサイズのDNA断片のクローニングには応用されていない。

もう一つの方法として、末端に長い相同性領域をもつ2つの線状DNA分子(一方が複製起点を有する)を用いて大腸菌sbcBC宿主細胞を形質転換するin vivoサブクローニング法が開示されている。相同的組換えがin vivoで起こり、新たに形成されたプラスミドの環化と増幅をもたらす(Degryse, 1996, Gene 170:45(非特許文献3))。その後、相同的組換えを媒介する大腸菌sbcBC宿主細胞の能力は、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスゲノムDNA由来の大きなDNA断片をサブクローニングするために応用された(Chartierら, 1996, J. Virol. 70:4805(非特許文献4); Messerleら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14759-14763(非特許文献5); He, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514(非特許文献6))。記載されるように、大腸菌sbcBC宿主細胞における相同的組換えによるそれぞれのサブクローニングは、大腸菌の複製起点の両側に長い相同性領域を位置づけるために、少なくとも2つの調製的サブクローニング工程を必要とする。さらに、大腸菌sbcBC株におけるDNAクローニングは記載されていない。

最近、RecE/RecT(RecE/T)またはRedα/Redβ(Redα/β)のいずれかにより媒介される相同的組換えは、大腸菌においてDNA分子を操作するのに有用であることが見いだされた(Zhangら, 1998, Nature Genetics, 20, 123-128(非特許文献7); Muyrersら, 1999, Nucleic AcidsRes. 27: 1555-1557(非特許文献8))。これらの論文は、大腸菌において、インタクト自律複製性の環状DNA分子はどれも、該環状分子中に存在する領域と同一のDNA配列の短い領域によって挟まれた線状DNA断片とのRecE/TまたはRedα/β媒介相同的組換えにより、改変され得ることを示している。相同的組換えによる環状分子への線状DNA断片の組込みは、その隣接(フランキング)配列間の配列と環状DNA分子中の対応する配列を置き換える。

明細書中での文献の引用は、それが本発明の先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきでない。
Olinerら, 1993, Nucleic AcidsRes. 21:5192-97
Bubeckら, 1993, Nucl. Acids. Res. 21:3601-3602
Degryse, 1996, Gene 170:45
Chartierら, 1996, J. Virol. 70:4805
Messerleら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14759-14763
He, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514
Zhangら, 1998, Nature Genetics, 20, 123-128
Muyrersら, 1999, Nucleic Acids Res. 27: 1555-1557

概要

制限酵素またはPCRの方法論によって都合よく利用できるものよりも長いDNA断片を、クローニングするための、より効率的な方法の提供。細菌性リコンビナーゼによって媒介される相同的組換えを用いたDNAサブクローニングのための方法および組成物の提供。具体的には、相同的組換えを用いたクローニング方法、クローニングベクターとして有用なポリヌクレオチドを含む組成物、該ポリヌクレオチド組成物を含む細胞、ならびにRecE/TやRedα/βなどの細菌性リコンビナーゼにより媒介されるクローニングに有用なキット

目的

本発明は、機能性リコンビナーゼ発現する細菌細胞を培養することを含んでなる、二本鎖標的DNAをベクターに導入する方法であって、該細菌細胞は、(a) 第1の二本鎖末端および第2の二本鎖末端を含む標的DNAと、(b)ベクターDNA鎖に沿って次の順序で、(i) 第1の二本鎖相同性アーム、(ii)複製起点、(iii) 第2の二本鎖相同性アームを含むベクターDNAと、を含有し、そして、ベクターDNA鎖の第1の相同性アームの配列が、標的DNA鎖の第1の末端の配列に相同であり、かつベクターDNA鎖の第2の相同性アームの配列が、標的DNA鎖の第2の末端の配列に相同であり、その結果、標的DNAがベクターDNAの該相同性アーム間に挿入される、上記方法を提供する

効果

実績

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請求項1

機能性リコンビナーゼ発現する細菌細胞を培養することを含んでなる、二本鎖標的DNAをベクターに導入する方法であって、該細菌細胞は、(a) 第1の二本鎖末端および第2の二本鎖末端を含む標的DNAと、(b)ベクターDNA鎖に沿って次の順序で、(i) 第1の二本鎖相同性アーム、(ii)複製起点、(iii) 第2の二本鎖相同性アームを含むベクターDNAと、を含有し、そして、ベクターDNA鎖の第1の相同性アームの配列が、標的DNA鎖の第1の末端の配列に相同であり、かつベクターDNA鎖の第2の相同性アームの配列が、標的DNA鎖の第2の末端の配列に相同であり、その結果、標的DNAがベクターDNAの該相同性アーム間に挿入される、上記方法。

請求項2

組換えDNA分子を作製する方法であって、 a)細胞に二本鎖ベクターを導入すること、ただし、該細胞は二本鎖標的DNAを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該ベクターは複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含むものであり、該標的DNAは標的DNA配列と2つの末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第1の末端、標的DNA配列、第2の末端の順序で含むものであり、そして、該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームの配列が、該標的DNA鎖上の第1の末端の配列に相同であり、かつ該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームの配列が、標的DNA鎖上の第2の末端の配列に相同であること、 b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる上記方法。

請求項3

組換えDNA分子を作製する方法であって、 a)細胞に二本鎖ベクターと第1および第2の二本鎖オリゴヌクレオチドを導入すること、ただし、該細胞は二本鎖標的DNAを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該ベクターは複製起点と2つの二本鎖相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含むものであり、該標的DNAは標的DNA配列と2つの二本鎖末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第1の末端、標的DNA配列、第2の末端の順序で含むものであり、該第1のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなり、該第1のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第2のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、該第2のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第3のヌクレオチド配列および第4のヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチド鎖を含んでなり、該第3のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第4のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同であること、 b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる上記方法。

請求項4

組換えDNA分子を作製する方法であって、 a)細胞に二本鎖標的DNA分子を導入すること、ただし、該細胞はベクターを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該標的DNAは標的DNA配列と2つの二本鎖末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第1の末端、標的DNA配列、第2の末端の順序で含むものであり、該ベクターは複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含むものであり、そして、該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームの配列が、該標的DNA鎖上の第1の末端の配列に相同であり、かつ該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームの配列が、標的DNA鎖上の第2の末端の配列に相同であること、 b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる上記方法。

請求項5

組換えDNA分子を作製する方法であって、 a)細胞に二本鎖標的DNA分子と第1および第2の二本鎖オリゴヌクレオチドを導入すること、ただし、該細胞はベクターを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該標的DNAは標的DNA配列と2つの二本鎖末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第1の末端、標的DNA配列、第2の末端の順序で含むものであり、該第1のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなり、該第1のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第2のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、該第2のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第3のヌクレオチド配列および第4のヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチド鎖を含んでなり、該第3のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第4のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同であり、そして、該ベクターは複製起点と2つの二本鎖相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含むものであること、 b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる上記方法。

請求項6

組換えDNA分子を作製する方法であって、 a)細菌性リコンビナーゼを発現する細胞に二本鎖ベクターと二本鎖標的DNAを導入すること、該ベクターは複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含むものであり、該標的DNAは標的DNA配列と2つの末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第1の末端、標的DNA配列、第2の末端の順序で含むものであり、そして、該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列が、該標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列が、標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同であること、 b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる上記方法。

請求項7

組換えDNA分子を作製する方法であって、 a)細菌性リコンビナーゼを発現する細胞に、二本鎖ベクターと二本鎖標的DNA分子と第1および第2の二本鎖オリゴヌクレオチドを導入すること、該ベクターは複製起点と2つの二本鎖相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含むものであり、該標的DNAは標的DNA配列と2つの二本鎖末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第1の末端、標的DNA配列、第2の末端の順序で含むものであり、該第1のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなり、該第1のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第2のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、該第2のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第3のヌクレオチド配列および第4のヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチド鎖を含んでなり、該第3のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第4のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同であること、 b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる上記方法。

請求項8

宿主細胞プロモーターに機能的に連結された部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ベクターが部位特異的リコンビナーゼの第1および第2の認識部位をさらに含み、第1の認識部位が第1および第2の相同性アームの外側に位置し、第2の部位特異的リコンビナーゼ認識部位が第1および第2の相同性アームの内側に位置し、そして、ステップb)の間に、またはステップb)の後で、部位特異的リコンビナーゼの発現を誘導する、請求項6に記載の方法。

請求項9

宿主細胞がプロモーターに機能的に連結された部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ベクターが部位特異的リコンビナーゼの第1および第2の認識部位をさらに含み、第1の認識部位が第1および第2の相同性アームの外側に位置し、第2の部位特異的リコンビナーゼ認識部位が第1および第2の相同性アームの内側に位置し、そして、ステップb)の間に、またはステップb)の後で、部位特異的リコンビナーゼの発現を誘導する、請求項7に記載の方法。

請求項10

宿主細胞がプロモーターに機能的に連結された部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ベクターが第1および第2の相同性アームの内側に位置する部位特異的エンドヌクレアーゼの認識部位をさらに含み、そして、ステップb)の間に、またはステップb)の後で、部位特異的エンドヌクレアーゼの発現を誘導する、請求項6に記載の方法。

請求項11

宿主細胞がプロモーターに機能的に連結された部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ベクターが第1および第2の相同性アームの内側に位置する部位特異的エンドヌクレアーゼの認識部位をさらに含み、そして、ステップb)の間に、またはステップb)の後で、部位特異的エンドヌクレアーゼの発現を誘導する、請求項7に記載の方法。

請求項12

ベクターが第1および第2の相同性アームの外側に位置する選択マーカーをさらに含み、そして、該ベクターがベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、次の2つの順序のいずれかで、i) 第1の相同性アーム、選択マーカー、複製起点、および第2の相同性アーム、またはii) 第1の相同性アーム、複製起点、選択マーカー、および第2の相同性アームを含む、請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。

請求項13

選択マーカーが前記ベクターを含む細胞に抗生物質耐性を賦与する、請求項12に記載の方法。

請求項14

細菌性リコンビナーゼがRecE/Tリコンビナーゼ、Redα/βリコンビナーゼ、またはRecE/TリコンビナーゼとRedα/βリコンビナーゼの両方である、請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。

請求項15

前記細胞が細菌細胞である、請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。

請求項16

前記細胞が大腸菌細胞である、請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。

請求項17

前記細胞がRecE/Tリコンビナーゼおよび/またはRedα/βリコンビナーゼを組換え的に発現する真核細胞である、請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。

請求項18

前記ベクターに挿入された標的DNAを含む組換えDNA分子を単離することをさらに含む、請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。

請求項19

関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含んでなり、第1のベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列が、第1の標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ第1のベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列が、第1の標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同である、上記ベクター。

請求項20

複製起点が細菌の複製起点である、請求項19に記載のベクター。

請求項21

複製起点が大腸菌内で機能する、請求項19に記載のベクター。

請求項22

複製起点が哺乳動物細胞内で機能する、請求項19に記載のベクター。

請求項23

関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターを含有する細胞であって、該ベクターが複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含んでなり、第1のベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列が、第1の標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ第1のベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列が、第1の標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同である、上記細胞。

請求項24

細菌の細胞である、請求項23に記載の細胞。

請求項25

標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用なキットであって、1つ以上の容器内に、 a) 関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含んでなり、第1のベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列が、第1の標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ第1のベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列が、第1の標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同である、該ベクター、および b)細菌性リコンビナーゼを含む細胞、を含んでなる上記キット。

請求項26

相同性アームがBAC、PAC、ラムダプラスミドまたはYACに基づくクローニングベクターに対する配列相同性を有する、請求項25に記載のキット。

請求項27

第1および第2の二本鎖オリゴヌクレオチドがBAC、PAC、ラムダ、プラスミドまたはYACに基づくクローニングベクターに対する配列相同性を有する、請求項25に記載のキット。

請求項28

標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用なキットであって、1つ以上の容器内に、 a) 関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含む該ベクター、 b) 3'から5'の方向に、次の順序で、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなる第1の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、該第1のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第2のヌクレオチド配列が標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同である、該第1のオリゴヌクレオチド、 c) 3'から5'の方向に、次の順序で、第3のヌクレオチド配列および第4のヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなる第2の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、該第3のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第4のヌクレオチド配列が標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同である、該第2のオリゴヌクレオチド、および d)細菌性リコンビナーゼを含む細胞、を含んでなる上記キット。

請求項29

前記細胞が大腸菌細胞である、請求項25または28に記載のキット。

請求項30

前記細胞がDNAを取り込む能力のある凍結細胞である、請求項25または28に記載のキット。

請求項31

標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用なキットであって、1つ以上の容器内に、 a) 関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含む該ベクター、 b) 3'から5'の方向に、次の順序で、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなる第1の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、該第1のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第2のヌクレオチド配列が標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同である、該第1のオリゴヌクレオチド、および c) 3'から5'の方向に、次の順序で、第3のヌクレオチド配列および第4のヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなる第2の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、該第3のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第4のヌクレオチド配列が標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同である、該第2のオリゴヌクレオチド、を含んでなる上記キット。

請求項32

DNAベクターが精製されている、請求項25、28または31に記載のキット。

請求項33

DNAベクター、第1の二本鎖オリゴヌクレオチド、および第2の二本鎖オリゴヌクレオチドが精製されている、請求項28または31に記載のキット。

請求項34

標的DNA分子が細菌、ウイルス寄生生物、または原生動物のDNAを含んでなる、請求項25、28または31に記載のキット。

請求項35

標的DNA分子が障害または疾患に関連することが知られたまたは予想された遺伝的突然変異または多型を含む、請求項25、28または31に記載のキット。

請求項36

細菌性リコンビナーゼがRecE/Tリコンビナーゼ、Redα/βリコンビナーゼ、またはRecE/TリコンビナーゼとRedα/βリコンビナーゼの両方である、請求項25〜29のいずれか1項に記載のキット。

請求項37

標的DNAが、遺伝的に突然変異を起こしたとき、障害または疾患に関連することが知られているか、または障害または疾患に関連すると予想される、請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。

請求項38

標的DNAが細菌、ウイルス、寄生生物、または原生動物のDNAである、請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。

請求項39

ベクターに挿入された標的DNAを含む組換えDNA分子を検出することをさらに含む、請求項2、4、6、8または10に記載の方法。

請求項40

ベクターに挿入された標的DNAを含む組換えDNA分子を検出することをさらに含む、請求項3、5、7、9または11に記載の方法。

請求項41

請求項39に記載の方法を実施することを含んでなる病原体の存在の検出方法であって、標的DNAが感染症を有すると予想された患者由来するものであり、第1および第2の相同性アームの配列が該病原体のDNA中に存在する配列に相同である、上記方法。

請求項42

請求項40に記載の方法を実施することを含んでなる病原体の存在の検出方法であって、標的DNAが感染症を有すると予想された患者に由来するものであり、第2および第4のヌクレオチド配列が該病原体のDNA中に存在する配列に相同である、上記方法。

請求項43

病原体がウイルス、細菌、原生動物、真菌、または寄生生物である、請求項41または42に記載の方法。

請求項44

請求項39に記載の方法を実施することを含んでなる遺伝的状態、遺伝的疾患遺伝的障害または多型的形質の存在の検出方法であって、標的DNAが遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質を有すると予想された患者に由来するものであり、第1の相同性アームの配列が遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の上流の配列に相同であり、かつ第2の相同性アームの配列が遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の下流の配列に相同である、上記方法。

請求項45

請求項40に記載の方法を実施することを含んでなる遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質の存在の検出方法であって、標的DNAが遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質を有すると予想された患者に由来するものであり、第1の二本鎖オリゴヌクレオチドの配列が、遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の上流の配列に相同であり、かつ第2の二本鎖オリゴヌクレオチドの配列が、遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の下流の配列に相同である、上記方法。

請求項46

遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質が癌、喘息関節炎薬剤耐性薬剤毒性、または神経的、神経精神的、代謝的、筋肉的、心血管的な、もしくは皮膚の状態、疾患または障害であるか、あるいはこれらに罹りやすくする、請求項44または45に記載の方法。

請求項47

前記ベクターが第1および第2の相同性アームの外側に位置する選択マーカーをさらに含み、そして、該ベクターが、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、次の2つの順序のいずれかで、i) 第1の相同性アーム、選択マーカー、複製起点、および第2の相同性アーム、またはii) 第1の相同性アーム、複製起点、選択マーカー、および第2の相同性アームを含む、請求項19に記載のベクター。

請求項48

前記ベクターの配列が、複製起点と選択マーカーの両方の5'側または3'側に、少なくとも5またはそれ以上のヌクレオチド塩基対の配列の直接反復を1以上含まない、請求項47に記載のベクター。

技術分野

0001

1.序
本発明は、細菌性リコンビナーゼによって媒介される相同的組換えを用いたDNAクローニングおよびサブクローニングのための方法ならびに組成物に関する。特定の実施形態においては、RecE/TもしくはRedα/βリコンビナーゼ、または細菌の相同的組換えを開始させるための機能的に均等な系(例えば、ファージP22由来のerf)が使用される。特に、本発明はクローニング方法、診断方法クローニングベクターとして有用なポリヌクレオチドを含む組成物、そのようなポリヌクレオチド組成物を含む細胞、ならびにRecE/TおよびRedα/β媒介クローニングに有用なキットに関する。

背景技術

0002

2.発明の背景
大腸菌におけるDNAのクローニングおよびサブクローニングは分子生物学土台をなすものである。DNAクローニングとは、複製起点二本鎖DNA断片作動可能に連結して、大腸菌または他の適当な宿主内で増やすプロセスをいう。DNAサブクローニングとは、例えばPCRによってin vitroで、または大腸菌や他の適当な宿主内での増殖によりin vivoで、すでに増幅されているDNA分子から二本鎖DNA断片を取得し、次にその二本鎖DNA断片を作動可能な複製起点に連結するプロセスをいう。大腸菌でのクローニングおよびサブクローニングは、典型的には、DNA断片末端を、大腸菌の複製起点と選択マーカーを含む線状化ベクターの末端にライゲートすることにより行なわれる。選択マーカーをベクター中に含めるのは、大腸菌宿主細胞に導入したとき、新たにクローン化された産物(その挿入物を含むプラスミド)が保持され増幅されることを確実にするためである。

0003

従来のクローニング法にはいくつかの制限がある。例えば、通常のクローニングは制限酵素の使用を必要とするので、DNA断片の選択は、関心のあるDNA領域中の制限酵素認識部位利用可能性によって制限される。所望のDNA断片の内部ではなく境界を切断する制限部位が存在しなければならない。最も有用な制限酵素はかなり頻繁に切断するので、作製される線状DNA断片のサイズも制限される。

0004

DNA断片を生成するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用が増えるにつれて、従来のサブクローニングには第2の大きな欠点が提起された。PCR産物の末端は、熱安定性ポリメラーゼにより増幅PCR産物の3'末端に付加された非鋳型ヌクレオチドのために、ライゲーション反応において非効率的である。さらに、PCRの使用は高リスク突然変異を伴う。したがって、分子生物学者らは、DNAの断片を、特に制限酵素またはPCRの方法論によって都合よく利用できるものよりも長い断片を、クローニングするための新規で、より効率的な方法を探し求めてきた。

0005

相同的組換えはDNA断片をクローニングおよびサブクローニングするための代替法である。宿主の相同的組換え系を利用する、大腸菌でのPCR産物のサブクローニング法はすでに開示されている(Olinerら, 1993, Nucleic AcidsRes. 21:5192-97(非特許文献1); Bubeckら, 1993, Nucl. Acids. Res. 21:3601-3602(非特許文献2))。そのような方法では、関心のあるDNA断片を増幅するために、線状化ベクターの両末端の配列に相同末端配列を含むように設計されたPCRプライマーを使用する。次いで、PCR産物と線状化ベクターを大腸菌に導入する。大腸菌宿主細胞内での相同的組換えがプラスミドベクターへのPCR産物配列の挿入をもたらす。こうした方法はPCR断片をサブクローニングするには有用であると分かったが、長いDNA断片のサブクローニング、または任意のサイズのDNA断片のクローニングには応用されていない。

0006

もう一つの方法として、末端に長い相同性領域をもつ2つの線状DNA分子(一方が複製起点を有する)を用いて大腸菌sbcBC宿主細胞を形質転換するin vivoサブクローニング法が開示されている。相同的組換えがin vivoで起こり、新たに形成されたプラスミドの環化と増幅をもたらす(Degryse, 1996, Gene 170:45(非特許文献3))。その後、相同的組換えを媒介する大腸菌sbcBC宿主細胞の能力は、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスゲノムDNA由来の大きなDNA断片をサブクローニングするために応用された(Chartierら, 1996, J. Virol. 70:4805(非特許文献4); Messerleら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14759-14763(非特許文献5); He, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514(非特許文献6))。記載されるように、大腸菌sbcBC宿主細胞における相同的組換えによるそれぞれのサブクローニングは、大腸菌の複製起点の両側に長い相同性領域を位置づけるために、少なくとも2つの調製的サブクローニング工程を必要とする。さらに、大腸菌sbcBC株におけるDNAクローニングは記載されていない。

0007

最近、RecE/RecT(RecE/T)またはRedα/Redβ(Redα/β)のいずれかにより媒介される相同的組換えは、大腸菌においてDNA分子を操作するのに有用であることが見いだされた(Zhangら, 1998, Nature Genetics, 20, 123-128(非特許文献7); Muyrersら, 1999, Nucleic AcidsRes. 27: 1555-1557(非特許文献8))。これらの論文は、大腸菌において、インタクト自律複製性の環状DNA分子はどれも、該環状分子中に存在する領域と同一のDNA配列の短い領域によって挟まれた線状DNA断片とのRecE/TまたはRedα/β媒介相同的組換えにより、改変され得ることを示している。相同的組換えによる環状分子への線状DNA断片の組込みは、その隣接(フランキング)配列間の配列と環状DNA分子中の対応する配列を置き換える。

0008

明細書中での文献の引用は、それが本発明の先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきでない。
Olinerら, 1993, Nucleic AcidsRes. 21:5192-97
Bubeckら, 1993, Nucl. Acids. Res. 21:3601-3602
Degryse, 1996, Gene 170:45
Chartierら, 1996, J. Virol. 70:4805
Messerleら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14759-14763
He, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514
Zhangら, 1998, Nature Genetics, 20, 123-128
Muyrersら, 1999, Nucleic Acids Res. 27: 1555-1557

課題を解決するための手段

0009

3.発明の概要
本発明は、細菌性リコンビナーゼによって媒介される相同的組換えを用いたDNAのクローニングおよびサブクローニングのための方法ならびに組成物に関する。細菌性リコンビナーゼは好ましくはRecE/Tおよび/またはRedα/βである。こうした方法は、指定された標的DNA配列に隣接する配列と相同な短いDNA領域および複製起点を含むベクターを用いて、関心のあるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの混合物をクローニング、サブクローニング、増殖または増幅するために使用することができる。

0010

一つの実施形態において、本発明は、機能性リコンビナーゼを発現する細菌細胞を培養することを含んでなる、二本鎖標的DNAをベクターに導入する方法であって、該細菌細胞は、(a) 第1の二本鎖末端および第2の二本鎖末端を含む標的DNAと、(b)ベクターDNA鎖に沿って次の順序で、(i) 第1の二本鎖相同性アーム、(ii)複製起点、(iii) 第2の二本鎖相同性アームを含むベクターDNAと、を含有し、そして、ベクターDNA鎖の第1の相同性アームの配列が、標的DNA鎖の第1の末端の配列に相同であり、かつベクターDNA鎖の第2の相同性アームの配列が、標的DNA鎖の第2の末端の配列に相同であり、その結果、標的DNAがベクターDNAの該相同性アーム間に挿入される、上記方法を提供する。

0011

別の実施形態においては、組換えDNA分子を作製する方法が提供され、該方法は、a)細胞に二本鎖ベクターを導入すること、ただし、該細胞は二本鎖標的DNAを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該ベクターは複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含むものであり、該標的DNAは標的DNA配列と2つの末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第1の末端、標的DNA配列、第2の末端の順序で含むものであり、そして、該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームの配列が、該標的DNA鎖上の第1の末端の配列に相同であり、かつ該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームの配列が、標的DNA鎖上の第2の末端の配列に相同であること、および、b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる。

0012

別の実施形態においては、組換えDNA分子を作製する方法が提供され、該方法は、a)細胞に二本鎖ベクターと第1および第2の二本鎖オリゴヌクレオチドを導入すること、ただし、該細胞は二本鎖標的DNAを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該ベクターは複製起点と2つの二本鎖相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含むものであり、該標的DNAは標的DNA配列と2つの二本鎖末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第1の末端、標的DNA配列、第2の末端の順序で含むものであり、該第1のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなり、該第1のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第2のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、該第2のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第3のヌクレオチド配列および第4のヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチド鎖を含んでなり、該第3のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第4のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同であること、および、b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる。

0013

別の実施形態においては、組換えDNA分子を作製する方法が提供され、該方法は、a)細胞に二本鎖標的DNA分子を導入すること、ただし、該細胞はベクターを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該標的DNAは標的DNA配列と2つの二本鎖末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第1の末端、標的DNA配列、第2の末端の順序で含むものであり、該ベクターは複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含むものであり、そして、該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームの配列が、該標的DNA鎖上の第1の末端の配列に相同であり、かつ該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームの配列が、標的DNA鎖上の第2の末端の配列に相同であること、および、b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる。

0014

別の実施形態においては、組換えDNA分子を作製する方法が提供され、該方法は、a)細胞に二本鎖標的DNA分子と第1および第2の二本鎖オリゴヌクレオチドを導入すること、ただし、該細胞はベクターを含みかつ細菌性リコンビナーゼを発現するものであり、該標的DNAは標的DNA配列と2つの末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第1の末端、標的DNA配列、第2の末端の順序で含むものであり、該第1のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなり、該第1のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第2のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、該第2のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第3のヌクレオチド配列および第4のヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチド鎖を含んでなり、該第3のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第4のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同であり、そして、該ベクターは複製起点と2つの二本鎖相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含むものであること、および、b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる。

0015

別の実施形態においては、組換えDNA分子を作製する方法が提供され、該方法は、a)細菌性リコンビナーゼを発現する細胞に二本鎖ベクターと二本鎖標的DNAを導入すること、ただし、該ベクターは複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含むものであり、該標的DNAは標的DNA配列と2つの末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第1の末端、標的DNA配列、第2の末端の順序で含むものであり、そして、該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列が、該標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列が、標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同であること、および、b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる。

0016

この方法の特定の実施形態では、宿主細胞がプロモーターに機能的に連結された部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該ベクターが部位特異的リコンビナーゼの第1および第2の認識部位をさらに含み、第1の認識部位が第1および第2の相同性アームの外側に位置し、第2の部位特異的リコンビナーゼ認識部位が第1および第2の相同性アームの内側に位置し、そして、ステップb)の間に、またはステップb)の後で、部位特異的リコンビナーゼの発現を誘導する。

0017

この方法の別の特定の実施形態では、宿主細胞がプロモーターに機能的に連結された部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該ベクターが第1および第2の相同性アームの内側に位置する部位特異的エンドヌクレアーゼの認識部位をさらに含み、そして、ステップb)の間に、またはステップb)の後で、部位特異的エンドヌクレアーゼの発現を誘導する。

0018

別の実施形態において、本発明は、組換えDNA分子を作製する方法を提供し、該方法は、a)細菌性リコンビナーゼを発現する細胞に、二本鎖ベクターと二本鎖標的DNA分子と第1および第2の二本鎖オリゴヌクレオチドを導入すること、ただし、該ベクターは複製起点と2つの二本鎖相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含むものであり、該標的DNAは標的DNA配列と2つの二本鎖末端を、標的DNA鎖に沿って3'から5'の方向に、第1の末端、標的DNA配列、第2の末端の順序で含むものであり、該第1のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなり、該第1のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第2のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、該第2のオリゴヌクレオチドは、3'から5'の方向に、次の順序で、第3のヌクレオチド配列および第4のヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチド鎖を含んでなり、該第3のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第4のヌクレオチド配列が該標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同であること、および、b) 該細胞を、細胞内相同的組換えを起こさせる条件にさらすこと、を含んでなる。

0019

この方法の特定の実施形態では、宿主細胞がプロモーターに機能的に連結された部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該ベクターが部位特異的リコンビナーゼの第1および第2の認識部位をさらに含み、第1の認識部位が第1および第2の相同性アームの外側に位置し、第2の部位特異的リコンビナーゼ認識部位が第1および第2の相同性アームの内側に位置し、そして、ステップb)の間に、またはステップb)の後で、部位特異的リコンビナーゼの発現を誘導する。

0020

この方法の別の特定の実施形態では、宿主細胞がプロモーターに機能的に連結された部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、該ベクターが第1および第2の相同性アームの内側に位置する部位特異的エンドヌクレアーゼの認識部位をさらに含み、そして、ステップb)の間に、またはステップb)の後で、部位特異的エンドヌクレアーゼの発現を誘導する。

0021

特定の実施形態において、該ベクターは相同性アームの外側に位置する選択マーカーをさらに含み、そして、該ベクターがベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、次の2つの順序のいずれかで、i) 第1の相同性アーム、選択マーカー、複製起点、および第2の相同性アーム、またはii) 第1の相同性アーム、複製起点、選択マーカー、および第2の相同性アームを含む。特定の実施形態において、選択マーカーは該ベクターを含む細胞に抗生物質耐性を賦与する。

0022

種々の特定の実施形態では、細菌性リコンビナーゼはRecE/Tリコンビナーゼ、Redα/βリコンビナーゼ、またはRecE/TリコンビナーゼとRedα/βリコンビナーゼの両方である。他の特定の実施形態では、前記細胞が細菌細胞である。他の特定の実施形態では、前記細胞が大腸菌細胞である。他の特定の実施形態では、前記細胞がRecE/Tおよび/またはRedα/βタンパク質組換え的に発現する真核細胞である。他の特定の実施形態では、前記方法が前記ベクターに挿入された標的DNAを含む組換えDNA分子を単離することをさらに含む。

0023

別の実施形態において、本発明は、関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターを提供し、該ベクターは複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含んでなり、第1のベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列が、第1の標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ第1のベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列が、第1の標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同である。該ベクターの特定の実施形態では、複製起点が細菌の複製起点である。別の特定の実施形態では、複製起点が大腸菌内で機能する。別の特定の実施形態では、複製起点が哺乳動物細胞内で機能する。

0024

本発明はさらに、関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターを含有する細胞を提供し、該ベクターは複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含んでなり、第1のベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列が、第1の標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ第1のベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列が、第1の標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同である。特定の実施形態では、細胞が細菌細胞である。

0025

本発明はさらに、標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用なキットを提供し、該キットは、1つ以上の容器内に、a) 関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含んでなり、第1のベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列が、第1の標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同であり、かつ第1のベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列が、第1の標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同である、該ベクター、および、b)細菌性リコンビナーゼを含む細胞、を含んでなる。該キットの特定の実施形態では、相同性アームがBAC、PAC、ラムダ、プラスミドまたはYACに基づくクローニングベクターに対する配列相同性を有する。該キットの別の特定の実施形態では、第1および第2の二本鎖オリゴヌクレオチドがBAC、PAC、ラムダ、プラスミドまたはYACに基づくクローニングベクターに対する配列相同性を有する。

0026

別の実施形態においては、標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用なキットが提供され、該キットは、1つ以上の容器内に、a)関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含む該ベクター、b) 3'から5'の方向に、次の順序で、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなる第1の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、該第1のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第2のヌクレオチド配列が標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同である、該第1のオリゴヌクレオチド、c) 3'から5'の方向に、次の順序で、第3のヌクレオチド配列および第4のヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなる第2の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、該第3のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第4のヌクレオチド配列が標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同である、該第2のオリゴヌクレオチド、および、d)細菌性リコンビナーゼを含む細胞、を含んでなる。このキットの特定の実施形態では、前記細胞が大腸菌細胞である。該キットの特定の実施形態では、前記細胞がDNAを取り込む能力のある凍結細胞である。

0027

別の実施形態において、本発明は標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用なキットを提供し、該キットは、1つ以上の容器内に、a) 関心のある標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、複製起点と2つの相同性アームを、ベクターDNA鎖に沿って5'から3'の方向に、第1の相同性アーム、複製起点、第2の相同性アームの順序で含む該ベクター、b) 3'から5'の方向に、次の順序で、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む第1のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなる第1の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、該第1のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第1の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第2のヌクレオチド配列が標的DNA鎖上の第1の末端のヌクレオチド配列に相同である、該第1のオリゴヌクレオチド、および、c) 3'から5'の方向に、次の順序で、第3のヌクレオチド配列および第4のヌクレオチド配列を含む第2のオリゴヌクレオチドDNA鎖を含んでなる第2の二本鎖オリゴヌクレオチドであって、該第3のヌクレオチド配列が該ベクターDNA鎖上の第2の相同性アームのヌクレオチド配列に相同であり、かつ該第4のヌクレオチド配列が標的DNA鎖上の第2の末端のヌクレオチド配列に相同である、該第2のオリゴヌクレオチド、を含んでなる。該キットの特定の実施形態では、DNAベクターが精製されている。該キットの特定の実施形態では、DNAベクター、第1の二本鎖オリゴヌクレオチド、および第2の二本鎖オリゴヌクレオチドが精製されている。

0028

本発明により提供されるキットの他の特定の実施形態では、標的DNA分子が細菌、ウイルス寄生生物、または原生動物のDNAを含む。他の特定の実施形態では、標的DNA分子が障害または疾患に関連することが知られたまたは予想された遺伝的突然変異または多型を含む。他の特定の実施形態では、細菌性リコンビナーゼがRecE/Tリコンビナーゼ、Redα/βリコンビナーゼ、またはRecE/TリコンビナーゼとRedα/βリコンビナーゼの両方である。

0029

本発明の方法は診断に使用することができる。例えば、プラスミドまたは線状DNA断片は、特定のDNA標的捕捉して被験者由来サンプル中のその存在(例えば、患者のサンプル中に存在するウイルスDNA)を検出するように設計することができる。一つの実施形態において、本発明は、遺伝的に突然変異を起こしたとき、障害または疾患に関連することが知られたまたは予想された標的DNAの検出方法を提供する。特定の実施形態では、標的DNAが細菌、ウイルス、寄生生物、または原生動物のDNAである。特定の実施形態では、ベクターに挿入された標的DNAを含む組換えDNA分子を検出することをさらに含む方法が提供される。別の実施形態では、前記方法はベクターに挿入された標的DNAを含む組換えDNA分子を検出することをさらに含む。

0030

別の実施形態において、本発明は病原体の存在の検出方法を提供し、その際、標的DNAは感染症を有すると予想された患者に由来するものであり、第1および第2の相同性アームの配列は該病原体のDNA中に存在する配列に相同である。特定の実施形態では、標的DNAが感染症を有すると予想された患者に由来するものであり、第2および第4のヌクレオチド配列が該病原体のDNA中に存在する配列に相同である。他の特定の実施形態では、病原体がウイルス、細菌、原生動物、真菌、または寄生生物である。

0031

他の実施形態においては、遺伝的状態、遺伝的疾患遺伝的障害または多型的形質の存在を検出する方法が提供され、その際、標的DNAは遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質を有すると予想された患者に由来するものであり、第1の相同性アームの配列は遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の上流の配列に相同であり、かつ第2の相同性アームの配列は遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の下流の配列に相同である。特定の実施形態では、遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質の存在を検出する方法が提供され、その際、標的DNAは遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質を有すると予想された患者に由来するものであり、第1の二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の上流の配列に相同であり、かつ第2の二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質に関連することが知られたまたは予想された部位の下流の配列に相同である。特定の実施形態では、遺伝的状態、遺伝的疾患、遺伝的障害または多型的形質が癌、喘息関節炎薬剤耐性薬剤毒性、または神経的、神経精神的、代謝的、筋肉心血管な、もしくは皮膚の状態、疾患または障害であるか、あるいはこれらに罹りやすくする。

0032

4.図面の説明
本明細書の最後を参照のこと。

発明を実施するための最良の形態

0033

5.発明の説明
本発明は、細菌性リコンビナーゼによって媒介される相同的組換えを用いたDNAのクローニングおよびサブクローニングのための方法ならびに組成物に関する。本発明者は、高効率の標的クローニングおよびサブクローニングを達成するために特定の方法で細菌性リコンビナーゼを利用できることを発見した。

0034

好ましくは、用いる細菌性リコンビナーゼはRecE/Tおよび/またはRedα/βである。大腸菌におけるRecE/T経路は以前に記載されており、その構成成分は一部が特徴づけられている(HallおよびKolodner, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 3205-3209; Gillenら, 1981, J. Bacteriol. 145: 521-532)。RecE/T経路を介した組換えは2個の遺伝子(すなわち、recEとrecT)の発現を必要とし、これらのDNA配列はすでに発表されている(Hallら, 1993, J. Bacteriol. 175: 277-278)。RecEタンパク質はRedαとも呼ばれているλexoと機能的に類似しており、RecTタンパク質はRedβおよびファージP22のerfと機能的に類似している(Gillenら, 1977, J. Mol. Biol. 113:27-41; Little, 1967, J. Biol. Chem. 242:679-686; RaddingおよびCarter, 1971, J. Biol. Chem. 246:2513-2518; JosephおよびKolodner, 1983, Biol. Chem. 258:10411-17; JosephおよびKolodner, 1983, Biol. Chem. 258:10418-24; MuniyappaおよびRadding, 1986, J. Biol. Chem. 261:7472-7478; KmiecおよびHollomon, 1981, J. Biol. Chem. 256:12636-12639; PoteeteおよびFenton, 1983, J. Mol. Biol. 163:257-275; Passyら, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4279-4284、ならびにそこに引用された文献)。

0035

本明細書には、位置指定DNAクローニングおよびサブクローニングのための細菌性リコンビナーゼの使用に関する方法および組成物が開示される。本明細書中で用いる「DNAクローニング」という用語は、宿主細胞内で増やすことができるように、任意の源からのDNAを自律複製ベクター中に挿入するプロセスを意味する。「DNAサブクローニング」という用語は、自律複製ベクター中にすでに存在するDNA断片を他の自律複製ベクター中に移すプロセス、または精製されたウイルスゲノムのような高度に濃縮されたDNA分子に由来するDNA断片またはPCRで増幅されたDNA断片を自律複製ベクター中に移すプロセスを意味する。「位置指定」(directed)または「標的」(targeted)クローニングおよびサブクローニングという用語は、標的DNAを選択するための、および、相同性アームの選択および方向づけによって標的DNAの挿入方向を指定するための、相同性アームの使用、そして種々の実施形態ではアダプターオリゴヌクレオチドの使用を意味する。本発明の方法は全て、DNAのクローニングとサブクローニングの両方法に適用されることに留意すべきである。

0036

本発明の組成物および方法の構築を、以下で詳細に説明する。特に、第5.1節には、相同的組換えによりDNA断片を標的クローニングするための本発明の媒介組換えクローニング法を記載する。以下の第5.2節には、関心のある標的DNA断片ターゲッティングし、捕捉し、クローニングするように設計されたDNA構築物をはじめとする本発明の組成物を記載する。また、RecE/Tおよび/またはRedα/βタンパク質のような細菌性リコンビナーゼをコードする核酸分子、そのような組成物を含む細胞、ならびにそのような核酸および細胞を構築するための方法も開示する。以下の第5.3節には、遺伝子発現を検出し、疾病状態を診断するための細菌性リコンビナーゼ標的クローニングの方法およびキットの使用を開示する。

0037

5.1相同的組換えによるクローニングおよびサブクローニングの方法
ここに記載する種々の方法は、細菌性リコンビナーゼ媒介相同的組換えにより関心のある任意のDNAを効率よく標的クローニングするために使用することができる。ここに記載する3つのアプローチは、共通の構成成分として、細菌性リコンビナーゼ組換えタンパク質を発現する細胞、およびベクターを必要とする。ベクターの例は図1Aに示してある。このベクターは3つの必須エレメント、すなわち、複製起点と2つの二本鎖DNAの短い領域(本明細書中では「相同性アーム」と呼ぶ)を含んでいる。

0038

相同性アームは、ベクターが、相同的組換えによって相同性アーム間で標的DNAを捕捉できるように特異的に設計される。相同性アーム間に標的DNAを正しく挿入するには、該アームの配列、位置および方向が重要となる。一つの実施形態において、相同性アームが標的DNAの末端に対する配列相同性を有する場合は、2つの相同性アームの配列は標的DNAに隣接するDNAの配列に対応する。すなわち、一方のアーム(図1ではAとして表示)は標的DNAの上流のDNA配列(図1ではCとして表示)に対応し、他方のアーム(図1ではBとして表示)は標的DNAの下流に位置する配列(図1ではDとして表示)に対応する。所望の挿入物に対する2つのアームの方向は、標的DNAに対する相同配列の方向と同じでなければならなず(図1参照)、こうして、相同性アームと標的DNAとの組換えにより、標的DNAが2つの相同性アームの間、つまり「内側」(図1参照)、に挿入される。本明細書中で用いるとき、位置が2つの相同性アームの間に位置づけられる場合、位置は2つの相同性アームの「内側」であると定義され、こうして、第1の相同性アームは一方向で複製起点とそれ自体の間に、そして第2の相同性アームは他方向で複製起点とそれ自体の間に位置づけられる。一方、一方向で、どちらの相同性アームもそれ自体を複製起点から隔離しない場合は、位置は2つの相同性アームの「外側」であると定義される。したがって、定義によれば、複製起点と選択マーカーはベクターの相同性アームの「外側」にあり(図1参照)、こうして、標的配列の挿入はプラスミド上に複製起点と選択マーカーを保存することとなる。他方、標的DNAは、定義によれば、相同性アームの「内側」に挿入される。図1Aは、相同性アームの「内側」と「外側」の意味を模式的に示したものである。

0039

別の実施形態において、相同性アームは1セットの二本鎖アダプターオリゴヌクレオチドに対する配列相同性を有する。そのようなアダプターオリゴヌクレオチドは図1Bに例示してある。各アダプターオリゴヌクレオチドの配列は、ベクターの相同性アームの一方の配列と、さらに、関心のある標的遺伝子に隣接する配列に相同な配列とを含む(図1C参照)。こうして、一つのアダプターオリゴヌクレオチドは、一方の相同性アームのDNA配列(図1にA'として表示)および標的DNAの上流のヌクレオチド配列(図1にC'として表示)に対する相同性を含む。二つ目のアダプターオリゴヌクレオチドは、他方の相同性アームのDNA配列(図1にB'として表示)および標的DNAの下流に位置するヌクレオチド配列(図1にD'として表示)に対する相同性を含む。この方法では、アダプターオリゴヌクレオチドの配列を変えることによって、関心のある特定の遺伝子配列をターゲッティングするように一般的相同性クローニングベクターを適合させることができる(図5参照)。本発明の各種実施形態を実行するために使用しうる方法ならびに組成物をここで詳しく説明する。

0040

以下に記載する方法は、相同的組換えによる位置指定クローニングの3つのとりうるアプローチを含む。以下で詳述するように、3つのアプローチは、それぞれ、特定のクローニング用途にそれを優先させるような独自の利点を有する。これらの方法および用途を以下で詳しく説明する。図2に示すアプローチでは、標的DNAを含む細胞にクローニングベヒクルを導入する。この第1のアプローチを使用すると、煩雑な制限分析およびin vitro操作を必要とせずに、挿入物を1つのレプリコンから別のレプリコンに都合よく移すことができる。このアプローチは、標的DNAが大腸菌のレプリコン中にすでに存在し、それの更なる使用には選ばれた部分のサブクローニングが必要となる場合に有用である。例えば、コスミド、ファージまたはBACライブラリーから単離されたDNAクローンの使用は、挿入物を配列決定するために、または遺伝子によりコードされるタンパク質を発現させるために、選ばれた部分を新ベクターにサブクローニングすることによって促進される。図3に示す第2のアプローチでは、クローニングベクターおよび標的DNAを作製し、その後、一緒に細胞に導入する。あるいはまた、図4に示すように、クローニングベクターをすでに含む細胞に、関心のあるDNAを添加してもよい。後者の2つのアプローチは、例えば癌細胞由来のDNAのように、標的DNAがなんらかの外部源に由来するものである場合に有用である。

0041

5.1.1アプローチ1:標的DNAを含む宿主細胞へのベクターの導入
図2に示すように、一実施形態では、標的DNA配列は、細菌性リコンビナーゼを発現する宿主細胞内にすでに存在する。例えば、標的DNAは、独立して複製するDNA分子、例えば、限定するものではないが、プラスミド、ファージ、細菌人工染色体(BAC)、または大腸菌宿主細胞中の大腸菌染色体上に常在しうる。RecE/TまたはRedα/βリコンビナーゼのような細菌性リコンビナーゼを発現する宿主細胞を構築する方法については、第5.2.2節に詳しく説明する。

0042

複製起点と、この起点およびマーカーの両端に位置する2つの相同性アームを含むベクターDNAを宿主細胞に導入する。好ましくは、このベクターは、線状分子であり、上記相同性アームは、線状分子の各末端に位置するが、これらアームは、内側にあってもよい。細胞に入った後、ベクターDNAの相同性アームと、標的DNA配列との間の相同的組換えにより、相同性アーム間に標的DNAが挿入され、その結果、環状のエピソームが形成される。次に、細胞を選択培地上で培養することにより、ベクターに存在する選択マーカーを選択する。環状化された分子だけが複製する能力があり、宿主細胞中で選択が可能であることから、選択培地で成長した細胞の多くは、標的DNAを含む組換え分子を含有するだろう。

0043

一実施形態では、線状ベクターDNA断片の末端を、修飾ヌクレオチド遮断することにより、相同的組換え以外のあらゆる手段、すなわち、非正統的組換えで、線状断片の末端の接合によって発生する事象の数を減少させることができる。このような修飾ヌクレオチド、例えば、ホスホチオネートヌクレオチドを、相同性アームの5’末端ヌクレオチドに組み込むことができる。修飾ヌクレオチドは、上記ベクターを構築するのに用いたプライマーオリゴヌクレオチド合成中に組み込んでもよいし(以下の第5.2.1節を参照)、あるいは、合成後に、オリゴヌクレオチドまたは線状ベクターDNAの酵素的もしくは化学的修飾により付加してもよい。オリゴヌクレオチドおよび線状DNA断片のこのような修飾の方法は、当業者には公知であり、以下の第5.2.2節に詳しく説明する。

0044

5.1.2.アプローチ2:ベクターおよび標的DNAの宿主細胞への共導入
図3に示すように、別の実施形態では、ベクターDNAおよび標識DNAをin vitroで混合した後、RecE/TまたはRedα/βリコンビナーゼを含む細胞に共導入する。標的DNAは、いかなる供給源に由来するものでもよい。例えば、標的DNAは、限定するものではないが、全血液、血漿血清、皮膚、唾液、尿、リンパ液生検吸引液組織培養細胞培地等の生物学的サンプル、あるいは、食品、水もしくはその他の材料等の非生物学的サンプルから取得することができる。このような供給源からDNAを調製する方法は、当業者には公知である(例えば、Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.を参照)。

0045

ベクターおよび標的DNAを用意し、in vitroで混合した後、好ましくは、共電気穿孔による大腸菌中での形質転換により、細菌性リコンビナーゼタンパク質を発現する細胞に共導入する。このベクターDNAは、線状DNAまたは環状プラスミドDNAのいずれの形状をしていてもよい。好ましい実施形態では、該ベクターは、線状DNA分子である。標的DNAの供給源は、ベクターDNAに対して過剰の重量で、すなわち過多に、混合することにより、細胞に、目的とする標的DNA領域の可能な限り多数のコピーを導入し、これによって、組換え産物収率最大限にする。細胞を選択培地で成長させることにより、環状化した産物を選択する。好ましい実施形態では、上記ベクターは、抗生物質耐性マーカーを含み、細胞を抗生物質の存在下で成長させる。このような選択下で増殖可能なコロニーは、線状断片の環状化した、組換え形態を含む。

0046

一実施形態では、線状ベクターDNA断片の末端は、以下の第5.2.1節で説明するように、修飾ヌクレオチドで遮断することができる。オリゴヌクレオチドのこのような修飾の方法は、当業者には公知であり、以下の第5.2.1節で説明する。

0047

このアプローチは、標的DNAが、大腸菌以外の供給源、例えば、酵母または真核細胞から得られる場合に特に有用である。一実施形態では、この方法を診断目的に用いて、あらゆる生物サンプル中における特定のDNAの存在を検出することができる。例えば、この方法を用いて、乳癌患者から採取した生検サンプル中の特定のエストロゲン受容体またはBRCA1対立遺伝子の存在を検出することができる。

0048

別の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法による増幅に代わるものとして、上記方法を用いることにより、DNAの領域を増幅することができる。大腸菌中での相同的組換え、クローニングおよび増殖による増幅によって、PCRに基づく方法に対比していくつかの利点が得られる。第1に、PCRのエラーは、多くの目的にとって大きな欠点となり得る。PCRプライマー対の組合わせは、擬似反応産物を産生する傾向がある。さらに、最終的反応産物におけるエラー数は、エラーがDNAサンプルに導入された後、PCR増幅ラウンド毎に、指数関数的に増加する。これに対し、相同的組換えクローニングによる増幅は、大腸菌中の細胞プルーフリーディング機構という利点があるため、これより少なくとも1,000倍忠実である。第2に、本方法を用いて増幅することのできるDNA領域のサイズに対する制限が少ないことである。数キロベースより長い(5〜10kb以上の)DNA領域の増幅は、PCR法を用いては困難である。本方法は、少なくとも約100キロベースまでの、はるかに大きい領域のクローニングに適している。現在、ゲノムのクローニングは、大きなランダムライブラリーを作製した後、個々のクローンを選別および順序付けするという長々とした工程を必要とする。本方法を用いて、相同性アームを設計し、そして大きく、非重複の、連続したクローン(「コンティグ」と呼ぶ)へのゲノムのクローニングを指令するためのベクターを構築することができる。第3に、DNAをPCR法で生成した後でも、PCR産物は、さらに別の処理工程でクローニングしなければならない。相同的組換えクローニング法では、この追加のサブクローニング工程の必要がなくなる。増幅しようとするDNAの領域を相同性アームの間に単に挿入し、大腸菌宿主中に、ベクターDNAで形質転換するだけでよい。

0049

この実施形態における相同的組換えは、DNAを細胞に添加する前に、in vitroで実施することができる。例えば、単離したRecEおよびRecT、または、RecE/Tを含む細胞抽出物をDNAの混合物に添加してもよい。組換えをin vitroで行う場合には、DNA分子の選択は、適当な宿主細胞中に組換え混合物を形質転換し、前述したように、陽性クローンを選択することにより、達成される。

0050

5.1.3アプローチ3:ベクターDNAを含む宿主細胞への標的DNAの導入
別の実施形態では、ベクターDNAをすでに含む細胞に、標的DNAを導入する。標的DNAは、前記5.1.2節に記載したように、どんな供給源に由来するものでもよく、線状または環状のいずれの形態をしていてもよい。前述のように、いったん標的DNAが細胞内に入ると、相同性アームと標的DNA間の相同的組換えにより、相同性アーム間への標的DNAの挿入が起こる。しかし、この場合、所望の産物および非組換えベクターの両方が選択マーカー遺伝子を発現するので、逆選択(counter-selection)によって、非組換えベクターに対して選択する必要がある。本明細書中では、この逆選択を達成するため、様々な実施形態について詳述する。例えば、一実施形態では、部位特異的組換えおよび切除反応を用いた方法を使用することができる。このアプローチを図5に示す。別の実施形態では、非組換えベクターを切断する誘導可能なヌクレアーゼを誘導する。これらいずれの実施形態でも、組換え産物を含まないベクターは除去される。

0051

上記ベクターを、まずプラスミドとして構築し、次に、宿主細胞に導入し、そこで、増殖させることができる。図5に示すように、上記ベクターは、(i)複製起点(任意の起点)と;(ii)選択マーカー(Sm)と;(iii)2つの相同性アームと;(iv)出発プラスミドベクターに対して選択するのに用いることができる逆選択マーカー、例えば、限定するものではないが、部位特異的リコンビナーゼの1対の認識部位(相同性アームの外側に位置する第1認識部位、および相同性アームの内側に位置する第2認識部位)、もしくはエンドヌクレアーゼの認識部位等を含む。本明細書で用いられるように、部位が2つの相同性アームの間に位置する場合、該部位は相同性アームの「内側」に位置するという。これによって、一方向で、第1相同性アームが、複製起点とそれ自体との間にあり、反対方向で、第2相同性アームが、複製起点とそれ自体との間に位置する。これに対し、一方向で、相同性アームのいずれも、それ自体と複製起点とを隔てていない場合には、位置は、相同性アームの「外側」であると定義する(相同性アームの「内側」と「外側」の意味を図式的に説明した図1を参照のこと)。前記の第5.1節に記載したように、複製起点と選択マーカーは、相同性アームの外側に配置し、これによって、標的配列の挿入が、プラスミド上の複製起点と選択マーカーを保存するようにしなければならない。好ましくは、逆選択マーカー、エンドヌクレアーゼ部位、もしくは、2つの部位特異的リコンビナーゼ標的部位の1つは、複製起点および選択マーカーとは反対側で、相同性アームの「内側」に配置する(図5参照)。

0052

非組換えベクターに対する逆選択を可能にする当業者には公知のあらゆる方法を用いることができる。例えば、一実施形態では、逆選択は、誘導可能な部位特異的リコンビナーゼ(SSR)により達成することができる。部位特異的リコンビナーゼは、部位特異的リコンビナーゼ標的部位(SSRTs)と呼ばれる2つの標的部位を認識する酵素であり、これら部位で、DNA鎖の交換および切除反応を媒介する働きをする(Halletら、FEMS Microbiol. Rev., 1997, 21:157-78;Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5:521-7:Starkら、1992, TrendsGenet., 8:432-9)。部位特異的リコンビナーゼの例は、当業者には公知であり、限定するものではないが、Cre、Flp、KwまたはRリコンビナーゼを含む(Nunes-Dubyら、1998, Nucleic Acids Res. 26:391-406;Ringroseら、1997, Eur. J. Biochem. 248:903-912;Utatsuら、1987, J. Bacteriol. 169:5537-5545)。2つの直接反復SSRTが環状プラスミドに常在する場合には、2つのSSRT間の部位特異的組換えにより、2つの環状プラスミドが形成される。複製起点を含む産物だけが、細胞内に維持される。従って、環状プラスミドにおける2つの直接反復SSRT間の部位特異的組換えにより、複製起点を含まない側では、2つのSSRT間に位置するDNA配列の欠失が起こる。

0053

2つのSSRTを含むDNAベクターが構築されるが、両者は、直接反復配列として配向され、1つは、相同性アームの内側に位置し、他方は、該アームの外側で、かつ、選択マーカー(SM)と複製起点との間に位置する。このように位置するSSRT間の組換えにより、選択マーカーからの複製起点の分離が起こる(図5)。従って、SSRは、2つのSSRTを含む非組換えDNAベクターに作用し、その結果、宿主細胞からそのようなプラスミドが消失する。

0054

次に、標準的方法により、宿主細胞をベクターDNAで形質転換する。この実施形態では、該宿主細胞は、1)RecE/Tおよび/またはRedα/β遺伝子と、2)SSRをコード化する遺伝子を含んでいなければならない。好ましくは、RecE/Tおよび/またはRedα/β遺伝子の発現は誘導性であるが、構成性発現も可能である。SSRTを認識する部位特異的リコンビナーゼ(SSR)をコードする遺伝子は誘導性でなければならない。誘導性および構成性プロモーターは当業者には公知であり、組換え遺伝子の構築および発現におけるそれらの使用方法は、以下の第5.2.3節に記載する。RecE/Tおよび/またはRedα/β遺伝子が、発現のために誘導を必要とする場合には、コンピテント細胞を作製する直前に、発現を誘導するような条件下で、ベクターを含む細胞を成長させる。ベクターDNAを含む宿主細胞を選択し、選択培地にプレートし、増殖させることにより維持する。

0055

次に、ベクターを含む宿主細胞から、コンピテント細胞を作製する。細胞を標的DNAで形質転換する。その際、該標的DNAは、あらゆる供給源から作製することができ、例えば、任意の細胞から作製した全ゲノムのDNAでもよい。細胞を短時間培養して、相同的組換えを起こさせる。相同的組換えにより、1つのSSRTを含む相同性アーム間の配列が欠失され、標的遺伝子配列が挿入される。次に、SSRの発現を誘導する。このSSRは、非組換えベクターにおける直接反復SSRTに作用し、これによって、選択マーカーとプラスミドの複製起点を分離する。挿入標的を含むプラスミドは、唯1つのSSRTを有し、インタクトのままである。この工程全体を通じて、選択を維持しても、しなくてもよいが、SSRの誘導後間もなく、すなわち、部位特異的組換えが起こって間もなく、選択を課する必要がある。このようにして、SSRの誘導により、挿入標的遺伝子を含むプラスミドの選択が行われる。

0056

別の実施形態では、エンドヌクレアーゼを用いて、相同的組換えの直前、その最中、あるいは、その後のいずれかに、in vivoで相同性アーム間のベクターを線状化することができる。線状プラスミドは、環状化されない限り、細胞中生存し得ないため、組換え前のベクターの線状化は、正しい組換え産物を選択するだろう。組換え後、エンドヌクレアーゼの持続した活性が、挿入断片を含むプラスミドの選択を助ける。何故なら、相同的組換え中に、SSRは、エンドヌクレアーゼ認識部位を欠失し、その代わりに、標的DNAを挿入するからである。エンドヌクレアーゼは、非組換えベクターだけを切断し、挿入された標的配列を有するプラスミドはインタクトのままにしておくため、組換え後のエンドヌクレアーゼの持続した活性が、非組換え産物を逆選択する。この実施形態では、非常に稀有な認識部位を有するエンドヌクレアーゼを用いて、これ以外の部位が、宿主細胞DNAに存在しないようにしなければならない。このような「レアカッター(rare-cutter)」の例は、当業者には公知であり、限定するものではないが、λcos、酵母HO、またはPI-Sce1等のイントロンコード化エンドヌクレアーゼが含まれる。エンドヌクレアーゼの認識部位を2つの相同性アーム間にクローニングし、エンドヌクレアーゼによる酵素消化によって、相同性アーム間でのベクターの線状化が起こるようにする。エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現は誘導性でなければならない。誘導性タンパク質発現のための構築物および方法については、以下の第5.2.3節で述べる。

0057

別の実施形態では、エンドヌクレアーゼではなく、SSR、例えば、Creリコンビナーゼを用いて、in vivoで非組換えベクターを線状化することができる(Mullinsら、1997, Nucleic AcidsRes. 25:2539-40)。この場合には、相同性アームの内側に位置する唯1つのSSRT部位を有するベクターを構築する。オリゴヌクレオチド中に1コピーの同じSSRTを含む過剰量のオリゴヌクレオチドを標的DNAと混合し、標的DNAと共に宿主中に共形転換する。好ましくは、このオリゴヌクレオチドは、短い二本鎖DNA分子である。組換え用分子の1つが短いオリゴヌクレオチドに常在するSSRTを有する場合は、部位特異的リコンビナーゼが、そのSSRTで、ベクターを線状化する(Mullinsら、1997、前掲)。

0058

別の実施形態では、前述した部位特異的組換えおよびエンドヌクレアーゼのアプローチを組み合わせることができる。この場合、非組換えベクターが、相同性アームの内側に、SSRTとエンドヌクレアーゼ部位の両方を含むようにする。このアプローチの一実施形態では、SSRTおよびエンドヌクレアーゼは、単一の誘導プロモーターの制御下で、共調節することができる。このようなタンパク質の共調節された誘導性発現のための構築物および方法については、以下の第5.2.3節に述べる。

0059

別の実施形態では、逆選択のために、これらの部位特異的組換えを組み合わせて用いることが可能である。この実施形態では、2対のSSR/SSRT、例えば、Cre/loxとFlp/FRTを使用する。このベクターは、複製起点と選択マーカーとの間に、第1のSSR、すなわち、SSR1に対する2つの部位を含み、その一方は相同性アームの内側に位置し、他方は相同性アームの外側に位置する。さらに、該ベクターは、第2のSSR、すなわち、SSR2に対する1つの部位を含み、これは相同性アームの内側に位置している。SSR2に対するもう1つの部位は、短い二本鎖オリゴヌクレオチド上に位置し、標識DNAに対して過剰量が、細胞形質転換中、標的DNAと一緒に添加される。特定の実施形態では、例えば、線状化工程のための1つのSSR/SSRT対はCre/loxPであり、欠失工程のためのもう一方の対は、Flp/FRTである。

0060

別の実施形態では、細胞に対する直接的逆選択を用いることができる。この場合には、プラスミドの複製起点が、大腸菌内での単一コピー(または非常に低いコピー)での維持を指令する。このクラスの複製起点は、ファージP1起点、ならびに、大腸菌染色体起点oriCに基づくプラスミド等のイテロン(iteron)クラスの起点を含む。適した複製起点については、Helinski, D.R, Toukdarian, A.E., Novick, R.P. “Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology” 第2版Frederick C. Niedhardt編、ASMpress, Washington, 1996, ISBN 1-55581-084-5の第122章、pp2295-2324を参照されたい。この場合、SSRTを含まないベクターを構築してもよく、逆選択遺伝子は、相同性アームの間に含まれる。このような逆選択マーカー遺伝子は、当業者には公知であり、例えば、sacB、ccdB、もしくはテトラサイクリン耐性遺伝子を用いることができる(また、適した逆選択遺伝子および方法の一覧については、Reyratら、1988、Infect. Immun. 66:4011-7も参照されたい)。意図する相同的組換え反応は、逆選択遺伝子を欠失することにより、意図する組換え産物を保有する細胞が逆選択圧の下で生存すると同時に、非組換えベクターを保有する細胞は死滅するようにする。

0061

5.2相同的組換えによるクローニングおよびサブクローニングのための組成物
様々な実施形態における相同的組換えによるクローニングのための組成物をここに記載する。以下の第5.2節に記載するクローニング方法の各々については、次の3つの成分が、単一細胞共存する必要がある:第1に、標的配列に対して配列相同性を有するDNAの2つの短い領域(本明細書では「相同性アーム」と呼ぶ)を保有するベクター;第2に、RecE/Tおよび/またはRedα/βタンパク質対、もしくはその他の細菌性リコンビナーゼ;第3に、標的DNA配列。細菌性リコンビナーゼによって媒介される相同性アームに存在するこれら相同配列と、標的遺伝子の隣接した領域との間の組換えによって、標的DNAが2つの相同性アームの間に挿入もしくは「捕捉」される。これら組成物と、それらの構築方法については本明細書で詳しく説明する。

0062

5.2.1相同性クローニングベクター
相同性クローニングベクターは、複製起点と、選択マーカーと、目的とする標的DNAを捕捉するように設計されたDNAの2つの短い領域とを含む線状または環状DNAベクターでありうる。使用するアプローチもしくは方法に応じて、数種の形態のクローニングベクターが考えられる。好ましい形態およびそれらの構築方法は、図1〜5に示してあり、本明細書で詳しく説明する。

0063

5.2.1.1複製起点
ベクターは複製起点を必要とするが、これはプラスミドの複製および増殖のために必要である。大腸菌でのクローニングおよび増殖のためには、あらゆる大腸菌複製起点を用いることができ、その例は当業者には公知である(Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、ならびに、その中の参照文献を参照のこと)。容易に入手可能なプラスミド複製起点の非制限的例は、ColE1由来の複製起点(Bolivarら、1977, Gene 2:95-113;Sambrookら、1989、前掲)、pACYC184等のプラスミドに存在するp15A起点(ChangおよびCohen, 1978, J. Bacteriol. 134:1141-56;Miller、1992, p.10.4-10.11も参照)、ならびに、低コピープラスミド発現のために利用可能なpSC101起点であり、これらはすべて、当業者にはよく知られている。

0064

例えば、一実施形態では、ColE1由来の複製起点を含むプラスミド等の高コピープラスミドからの複製起点を用いるが、その例は、当業者には公知である(Sambrookら、1989、前掲を参照;また、Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、ならびに、その中の参照文献も参照のこと)。一例は、pUC19およびその誘導体からの起点である(Yanisch-Perronら、1985, Gene 33:103-119)。pUCベクターは、1細胞当たり300〜500コピーのレベルで存在し、外来遺伝子の挿入には好都合クローニング部位を有する。非常に高度の発現のためには、λgt11(Huynhら、1984、“DNA Cloning Techniques:, Vol I: A Practical Approach”, D. Glover編、 pp 49-78, IRL Press, Oxford)等のλベクター、あるいは、T7およびSp6ポリメラーゼ発現系(Studierら、1990, MethodsEnzymol. 185:60-89)を含む細胞内のT7またはSP6ファージプロモーターを用いることができる。

0065

これより低レベルの発現を所望する場合には、中または低コピープラスミドからの複製起点を用いることができる。中コピープラスミドは当業者には公知であり、例えば、ColE1由来の複製起点と、1細胞当たり20〜100コピーを有するpBR322(Bolivarら、1977, Gene 2:95-113;Sambrookら、1989、前掲を参照)、あるいは、pACYC100シリーズのプラスミドの1つであり、p15A複製起点を有し、1細胞当たり10〜12コピーで存在するpACYC184(ChangおよびCohen, 1978, J. Bacteriol. 134:1141-56;また、Miller、1992, p.10.4-10.11も参照)がある。また、低コピープラスミドも当業者には公知であり、例えば、pSC101起原と、1細胞当たり約5コピーとを有するpSC101がある。pACYCおよびpSC101プラスミドベクターは両者とも、適合性の複製起点と、選択抗生物質マーカーを有するため、好都合なクローニング部位を有し、pBRおよびpUCプラスミドと同じ細胞中に共存することができる。他の適したプラスミド複製起点は、λまたはファージP1レプリコンに基づくプラスミド、例えば、ロリスト(Lorist)シリーズ(Gibsonら、1987、Gene 53:283-286)を含む。

0066

さらに低い発現を所望する場合には、複製起点は、細菌染色体から得ることができる(Miller、1992、前掲;Nieldardt, F.C., ed., 1987, Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D.C.;Yarmolinsky, M.B.およびStemberg, N., 1988, pp.291-438, in Vol.1 of The Bacteriophages, R. Calendar, ed., Plenum Press, New Yorkを参照)。さらに、合成の複製起点を用いてもよい。

0067

5.2.1.2選択マーカー
プラスミドベクターを細胞内に維持するため、ベクターは、典型的には、選択マーカーを含む。当業者には公知のあらゆる選択マーカーを使用することができる。大腸菌ベクターの構築のため、大腸菌中で有効な抗生物質に対する耐性送達するあらゆる遺伝子、あるいは、容易に識別可能または選択可能な表現型の変化を送達するあらゆる遺伝子を用いることができる。好ましくは、抗生物質耐性マーカーを用いるが、これらは、例えば、TN903からのカナマイシン耐性遺伝子(FriedrichおよびSoriano, 1991, Gene. Dev. 5:1513-1523)、あるいは、他のアミノグリコシド(限定するものではないが、ジヒドロストレプトマイシンゲンタマイシンネオマイシン、パロマイシンおよびストレプトマイシンを含む)に対する耐性を賦与する遺伝子、ペニシリン(限定するものではないが、アンピシリンカルベニシリンメチシリンペニシリンNペニシリンOおよびペニシリンVを含む)に対する耐性を賦与するβラクタマーゼ遺伝子等がある。他の選択遺伝子配列として、限定するものではないが、ゼオシン耐性を賦与するポリペプチドをコードする遺伝子配列がある(Hegedusら、1998, Gene 207:241-249)。使用することのできるその他の抗生物質は、クロラムフェニコール等のアンフェニコールに対する耐性を賦与する遺伝子、例えば、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼCAT)のコード配列を使用することができる(Eikmannsら、1991, Gene 102:93-98)。当業者には理解されるように、プラスミドの維持を選択するその他の非抗生物質的方法、例えば、多様な栄養要求性マーカーを使用してもよい(Sambrookら、1989、前掲;Ausbelら、前掲)。

0068

5.2.1.3相同性アーム
ベクターの必要な成分は、二本鎖DNAの2つの短い領域であり、本明細書では「相同性アーム」と呼ばれる。図1に示したように、一実施形態では、2つの相同性アーム(AおよびBと呼ぶ)は、目的とする標的DNA(A’およびB’と呼ぶ)に隣接するDNAの配列と相同であり、一方のアームは、標的DNAから上流のDNA配列と相同で、第2のアームは、標的DNAから上流のDNA配列と相同である。本明細書では、2つの二本鎖DNA分子が、共通の同一性領域(場合によっては、1つ以上の塩基対差異により中断されていてもよい)を共有しており、相同的組換えのための基質として機能することができれば、両者は「相同」であるという。好ましい実施形態では、相同性アームは、目的とする標的DNAに隣接する二本鎖領域に対して、約22〜100以上の塩基対の連続的同一性を有する。相同性の領域は、相同性アームが依然として相同的組換えのための効率的基質である限り、1つ以上の非同一残基により中断されていてもよい。好ましい実施形態では、組換え効率を最適にするために、相同性アームは、長さが約50ヌクレオチドであり、20〜30(例えば、25)塩基対の連続して、中断されていない配列同一性を有する。連続的同一性はさらに短い領域でも可能であるが(例えば、少なくとも6、8もしくは10塩基対)、このような短い領域の連続的同一性を用いた場合、組換え効率の低下が予想される。例えば、一実施形態では、連続的同一性の長さは、6bpまで短くてもよい(KeimおよびLark, 1990, J, Structural Biology 104:97-106)。相同性アームの長さ、あるいは、隣接する標的DNA配列に対する連続的同一性の長さに上限はない。

0069

標的DNAに隣接するヌクレオチド配列は、本明細書では、標的DNAの「末端」と呼ばれる。従って、標的DNAは、2つの末端、すなわち、第1末端と第2末端を有することになる。所望の挿入断片に対する2つのアームの配向は、標的DNAに対する相同配列の配向と同じにし(図1を参照)、これによって、相同性アームと、標的DNAの第1および第2末端との間の組換えにより、2つの相同性アーム間に標的DNAが挿入されるようにしなければならない。

0070

2つの相同性アームの配列は、実験的設計に応じて選択する。相同性アームの選択に対する制限は、それが標的DNA内に1回より多く見出される配列であってはならないことと、相同的組換え反応の間、宿主細胞の他所で存在してはならないことだけである。この場合、目的とする相同的組換え産物はまだ得られるものの、代替の相同的組換え現象バックグラウンドにおいてである。一実施形態では、相同性アームの配列は、BAC、PAC、YAC(酵母人工染色体)、λEMBLまたはλGTシリーズ、ファージミド、コスミド、pBR322、pGEM、pGEX、pGEX、pET等のファージクローニングベクター、バキュロウイルスベクターアデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクター等の通常用いられるクローニングベヒクルのポリリンカーに隣接する2つの配列である。従って、単一のベクターを用いて、これらベクター中にクローニングされたあらゆる挿入断片をサブクローニングすることができる。このような相同性アームを含むベクターは、BAC、PAC、YAC、コスミドまたはλライブラリー等のDNAライブラリーからの陽性クローンに由来する挿入断片をサブクローニングするのに特に有用である。

0071

以下に説明するように、様々な実施形態において、相同性アームは、線状DNA分子の末端に位置するか、あるいは、線状DNA分子または環状DNAプラスミドベクターの内部に位置する。

0072

相同性アームは、標的ヌクレオチド配列におけるそれらの方向に対して同じ方向で配向される。言い換えれば、相同性アームは、組換えが起こった後、所望のDNA配列が該アーム間に挿入されるように配向される。相同性アームが、線状DNAの末端に位置する場合には、挿入されたDNA配列は、捕捉され、両アームの間に挿入され、これによって、環状の複製可能なプラスミドを生成する。

0073

5.2.1.4アダプターオリゴヌクレオチド相同性アーム
別の実施形態では、相同性アームのヌクレオチド配列は、アダプターオリゴヌクレオチドに存在するヌクレオチド配列と相同的である。2つのアダプターオリゴヌクレオチドの各々は、相同性アームの一方に存在するヌクレオチド配列と相同的なヌクレオチド配列と、標的DNAの2つの末端の一方と相同的な第2相同性領域とを含む。アダプターオリゴヌクレオチドは、図1に示す。ベクターの相同性アームはAおよびBと呼び、これら配列と相同的なアダプターオリゴヌクレオチドの領域は、A’およびB’と呼ぶ。標的DNAの2つの末端は、CおよびDと呼び、アダプターオリゴヌクレオチドに存在する、対応する相同的配列は、C’およびD’と呼ぶ。この実施形態では、ベクター相同性アームと、アダプターオリゴヌクレオチドの相同性領域と、標的遺伝子の隣接末端との間で、RecE/TまたはRedα/βにより媒介される組換えの結果、標的DNAが、ベクターの相同性アーム間に挿入もしくは「捕捉」される。

0074

5.2.1.5ベクターの構築
上記の線状断片または環状ベクターは、当業者には公知の標準的方法を用いて構築することができる(Sambrookら、1989、前掲;Ausubelら、前掲参照)。例えば、合成または組換えDNA技術を用いてもよい。一実施形態では、線状断片がPCR増幅により作製される。この方法では、オリゴヌクレオチドが、それらの5’末端で相同性アーム配列を、また3’末端でPCRプライマー配列を有するように、合成する。次に、これらオリゴヌクレオチドを、PCR増幅反応で、プライマーとして用いることにより、複製起点と選択遺伝子マーカーを含むDNA領域を増幅する。別の実施形態では、標準的組換えDNA技術により、プラスミドが、複製起点および選択遺伝子マーカーに隣接する、2つの適切に配向された相同性アームを含むように構築することができる(例えば、Methodsin Enzymology, 1987, Volume 154, Academic Press;Sambrookら、1989, Molecular Cloning - A Laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York;Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkを参照)。次に、例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化により、このプラスミドを線状化する。

0075

別の実施形態では、例えば、次の方法を用いて、前記の第5.1.3節で使用するベクターDNAを構築することができる。2つのオリゴヌクレオチドを合成するが、その1つは、5’から3’末端まで、該ベクターに固有の制限部位と、左相同性アームと、PCRプライマーとを含む。他方のオリゴヌクレオチドは、5’から3’末端まで、該ベクターに固有の同じ制限部位と、SSRTと、右相同性アームと、PCRプライマーとを含む。これら2つの相同性アームは、標的DNAに隣接するように選択する。SSRTは、Cre、Flp、KwまたはRリコンビナーゼ等の部位特異的リコンビナーゼ(SSR)のいずれかにより認識される部位である。オリゴヌクレオチドの合成は、2つのSSRTが、ベクターにおいて、定方向反復配列として配向されるように、設計しなければならない。2つのPCRプライマーを用いて、プラスミド起点と、選択遺伝子と、該起点および選択遺伝子間の同一SSRTとを含むDNA鋳型を増幅する。次に、PCR反応の産物を、オリゴヌクレオチドの5’末端に含まれる部位を認識する制限酵素で切断することにより、連結反応による効率的な環状化を可能にする。こうして得られた環状産物を増幅用の大腸菌中に形質転換することによって、多量のベクターを生産する。

0076

別の実施形態では、選択マーカーと、起点と、2つのクローニング部位とを有するプラスミドを用いて、オリゴヌクレオチド相同性アームを各クローニング部位にクローニングすることにより、線状断片を構築する。次に、制限酵素を用いて、プラスミドDNAを切断し、相同性アームにより結合された線状断片を生成する。この方法は、より複雑なプラスミド、例えば、真核発現エレメントを含ませるために真核エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含むプラスミドの構築に好ましい。また、これ以外の配列をベクターにサブクローニングしてもよい。

0077

該ベクターはまた、挿入された標的DNAのタンパク質発現、操作または維持のために、関心のある追加のヌクレオチド配列を含んでもよい。例えば、ベクター内の適した位置に、プロモーター配列エンハンサー配列シャインダルガルノ配列のような翻訳配列、転写因子認識部位、コザック共通配列、ならびに、終結シグナルを含むことができる。細菌細胞以外の細胞、例えば、植物、昆虫、酵母または哺乳動物細胞での組換えクローニングのためには、種特異的複製起点、転写、処理および翻訳シグナル等を含むその他の配列エレメントが必要となる場合もある。このようなエレメントは、限定するものではないが、真核複製起点、エンハンサー、転写因子認識部位、CATボックス、またはプリブナウボックスを含むことができる。

0078

RecE/Tおよび/もしくはRedα/βまたはその他の細菌性リコンビナーゼが、細胞中で、発現プラスミドから組換えにより生成される実施形態においては、選択されるベクターは、以下の第5.2.3節に記載した細菌性リコンビナーゼ発現プラスミドと適合性でなければならない。当業者であれば、1細胞に多数のプラスミドを発現させるのに必要な適合性要件について容易に理解されるであろう。原核細胞における2つ以上の構築物の増殖方法は、当業者には公知である。例えば、多数のレプリコンを含む細胞を通常の手順で選択した後、適切に適合性の複製起点と、独立した選択系とを含むベクターを用いて、これらを維持する(Millerら、1992、前掲;Sambrookら、1989、前掲参照)。

0079

5.2.2細菌性リコンビナーゼ
本明細書中に記載する発明を、主に、RecE/Tおよび/またはRedα/βの使用に関して説明する。しかし、当業者には明らかなように、本発明は、基質として1対の相同的二本鎖DNA分子を用いて相同的組換えを媒介する能力があるその他の細菌性リコンビナーゼの使用にも、同様に適用可能である。本明細書では、細菌性リコンビナーゼとは、ファージまたは細菌のいずれに由来するかに拘わらず、細菌において内在的に発現されて、相同的組換えを媒介することができる、リコンビナーゼを意味する。様々な実施形態において、細菌性リコンビナーゼは、RecE/Tおよび/またはRedα/βリコンビナーゼである。別の具体的実施形態では、相同的組換えを開始するための機能的に同等の系は、ファージP22からのerfタンパク質を含む。さらに、細菌性リコンビナーゼの個々のタンパク質成分に代わり、本発明で使用するその他の機能的成分を用いてもよい。

0080

本明細書で用いる「RecE」および「RecT」は、まず、大腸菌(例えば、大腸菌K12)のRecEまたはRecTを意味する。大腸菌RecEおよびRecTのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、よく知られている(RecE、GenBank受託番号M24905およびSWISS-PROT受託番号P15033;RecT、GenBank受託番号L23927およびSWISS-PROT受託番号P33228)。また、「Redα」および「Redβ」は、ファージλコード化タンパク質を意味する。Redαは、RecEの5’〜3’エキソヌクレアーゼに類似した5’〜3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、Redβは、RecTに類似したDNAアニーリング活性を有する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、これら両方のラムダタンパク質についてよく知られている(GenBank受託番号J02459;M17233を参照)。

0081

当業者には明らかなように、本明細書中でRecE/Tおよび/またはRedα/βと言及するとき、特に明瞭に、または文脈によって、指示されない限り、RecE/TおよびRedα/βの組合わせも含むものとする。特定の実施形態では、2つの酵素複合体の組合わせは、組換えの効率に共働作用をもたらす。

0082

使用することのできる細菌性リコンビナーゼはまた、該リコンビナーゼの成分の対立遺伝子変異体も含む。例えば、本発明のRecE/TおよびRedα/β組換え系において使用するアミノ酸配列は、RecE、RecT、Redα、またはRedβのいずれかの対立遺伝子変異体が、機能的変異体であって、少なくとも、これら変異体が相同的組換え活性を示す限り、これら変異体によってコード化されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。対立遺伝子変異体は、標準的組換えDNA技術(例えば、Methodsin Enzymology, 1987, volume 154, Academic Press;Sambrookら、1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York;およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York)、または、タンパク質進化手法(Jermutusら、1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:534-548)を用いて、通常の手順で同定および取得することができる。

0083

一般に、このような対立遺伝子変異体をコード化する核酸は、中程度にストリンジェントな条件(例えば、標準的サザンブロッティングハイブリダイゼーション条件を用いて、最終的洗浄を0.2 xSSC/0.1% SDSで、42℃にて行う;Ausubelら、編、1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & sons, Inc., New York, p. 2.10.3)、もしくは、高度にストリンジェントな条件(例えば、標準的サザンブロッティングハイブリダイゼーション条件を用いて、最終的洗浄を0.1 x SSC/0.1% SDSで、68℃にて行う;Ausubelら、前掲)下で、RecE、RecT、Redα、またはRedβのコード配列の相補体ハイブリダイズすることが可能なものでなければならない。

0084

また、本発明で用いられるRecE、RecT、RedαおよびRedβは、腸内菌(Enterobacteriaceae)科の原核細胞を宿主とするファージ、あるいは、これらの細胞に由来するRecE、RecT、RedαおよびRedβも含む。腸内菌科のメンバーは、限定するものではないが、各種のエシェリキア属サルモネラ属シトロバクター属クレブシエラ属、ならびに、プロテオス属を含む。このようなRecE、RecT、Redα、またはRedβ相同体は、一般に、ファージゲノムに存在する遺伝子によってコード化され、その産物は、λファージ生活環におけるRedαおよびRedβのようなファージ生活環での組換え媒介段階に参加する。

0085

RecE/T相同体は、標準的な原核遺伝子技術および組換えDNA技術(例えば、Sambrookら、前掲およびSusubelら、前掲参照)を用いて、通常の手順で同定および取得することができる。組換えDNAは、クローン化ゲノムまたはcDNAライブラリーから取得するか、もしくは、PCR増幅により得られる。例えば、ゲノムライブラリーは、標準的分子生物学的方法により作製するか、あるいは、市販されている、または市販されていない供給源から取得することができる。ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーは、標識大腸菌recEまたはrecTプローブとの核酸ハイブリダイゼーション(GrunsteinおよびHogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961)によりスクリーニングし、陽性クローンを単離して、配列決定することができる。

0086

特定の実施形態では、RecEまたはRecT相同体は、ネズミチフス菌において、通常の手順で同定することができる。recEおよびrecT遺伝子は、大腸菌K-12において、よく特性付けされており;RecE(GenBank受託番号M24905およびSWISS-PROT受託番号P15033)およびRecT (GenBank受託番号L23927およびSWISS-PROT受託番号P33228)両者のヌクレオチド配列およびタンパク質配列が知られている;(Bachmann, 1990, Microbiol. Rev. 54:130-197;Rudd, 192, in Miller, 1992,前掲、pp.2.3-2.43も参照されたい)。完全なネズミチフス菌ゲノムコスミドまたはλライブラリーを用いてもよい。次に、前述したようなハイブリダイゼーション条件を用いて、大腸菌RecTまたはRecTプローブとのハイブリダイゼーションにより、上記ネズミチフス菌ライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、2つの遺伝子は高度に相同的であると予想されることから、標準的な中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい。

0087

一実施形態では、このような条件は以下を含むことができる:6XSSC, 5Xデンハーツ溶液と、0.5%SDSと、100μg/mlの変性サケ精子DNAとを含む溶液において、DNA含有フィルターを55℃で6時間前処理する。ハイブリダイゼーションは、同じ溶液中で実施し、5〜20 X 106cpm32P-標識プローブを用いる。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で18〜20時間55℃でインキュベートした後、1X SSCおよび0.1%SDSを含む溶液において、30分60℃で2回洗浄する。次に、フィルターの水分を吸い取り乾燥させて、X線フィルム暴露してオートラジオグラフィーを実施する。用いることのできる中程度ストリンジェンシーの他の条件は当業者には公知である。フィルターの洗浄は、2X SSC、0.1%SDSを含む溶液において、1時間37℃で実施する。後のネズミチフス菌を含むクローンの単離、精製および特性決定は、当業者には公知の手順(Ausubelら、前掲参照)により実施することができる。このような配列を用いて、本発明のネズミチフス菌Rec/Tを構築することができる。

0088

あるいは、ネズミチフス菌遺伝子をネズミチフス菌mRNAから単離することができる。mRNAは、RecEまたはRecTタンパク質を発現する細胞から単離することができる。cDNAライブラリーは、mRNAの逆転写により作製し、ゲノムライブラリーをスクリーニングする前記の方法(Ausubelら、前掲参照)等、当業者には公知の方法によりスクリーニングすることができる。これ以外にも、RACE(cDNA末端の高速増幅:Rapid Amplification of cDNA Ends;Ausubelら、前掲)等のPCR技術により、recEまたはrecT cDNAを同定することができる。その際、大腸菌recEまたはrecT配列から設計した2つのプライマー: 大腸菌recEまたはrecT mRNAの5’末端と同じ配列を有する「前進(forward)」プライマーと、その3’末端に相補的な「逆進(reverse)」プライマーとを用いる。PCR産物は、配列決定により確認し、サブクローン化した後、本発明のRecE/Tを構築するのに用いることができる。また、このようなcDNA配列を用いることにより、当業者には公知の方法(Sambrookら、1989、前掲;Ausubelら、前掲参照)を用いて、ネズミチフス菌recEまたはrecT配列を単離することも可能である。

0089

本発明のRecE/T組換え酵素をコード化する核酸分子は、さらに、当業者には公知の組換えおよび合成手段(Sambrookら、1989、前掲;Ausubelら、前掲)に従い、合成および/または構築することができる。

0090

以下に述べるように、発現が調節可能(例えば、誘導可能)であり、広い範囲の発現レベルが達成できるように、配列の発現を制御する能力が、本発明の方法の実施に有利である。

0091

核酸分子は、例えば、染色体外(例えば、プラスミド、コスミドまたはバクテリオファージ上)で維持することができる。あるいは、例えば、ファージ形質導入または転位を用いて、核酸分子を染色体(例えば、大腸菌染色体)に組み込むことも可能である。従って、RecE/Tコード配列は、各細胞内に、高コピー、低コピーもしくは単コピーで存在するように標準的技法により作製することができる。また、多様な調節配列を用いて、組換えタンパク質の発現を推進することも可能である。発現/株構築のこれら態様の各々は、広い範囲の組換えタンパク質発現レベルを示す細胞を生産するように操作することができる。組換えタンパク質コード配列の単コピー染色体は、その構成が、株の構築を容易にすることから、さらに有利である。

0092

5.2.2.1タンパク質発現
細菌性リコンビナーゼは、細菌、酵母、昆虫、もしくは哺乳動物細胞において、構成的または誘導的のいずれでも発現させることができる。好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、細菌、最も好ましくは、大腸菌株において発現させる。例えば、宿主細胞は、宿主細胞染色体に位置するrecEおよびrecT遺伝子を含む。RecE/Tの発現が内在性である大腸菌株の例は公知であり、例えば、大腸菌sbcA株(Zhangら、1998、前掲)がある。あるいは、RecE/Tは、好ましくは、プラスミドベクター、例えば、pBADETγ(Zhangら、1998、前掲)またはpGETrec(Narayananら、1999, Gene Ther. 6:442-447)上で、非染色体DNAから組換えにより発現させることができる。同様に、Redα/βは、λプロファージを組み込んだ株に内在性であるか、あるいは、プラスミド、例えば、pBADαβγ(Muyrersら、1999、前掲)から発現させることができる。RecE/Tおよび/またはRedα/β発現構築物は、標準的組換えDNA技術に従って構築することができる(例えば、Methodsin Enzymology, 1987, volume 154, Academic Press;Sambrookら、1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York;ならびに、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと、尚、これら文献は各々、参照としてその全文を本明細書に組み込むものとする)。

0093

一実施形態では、RecE/Tおよび/またはRedα/βは、ColE1由来の複製起点を含むプラスミドのような高コピープラスミドから大腸菌中で発現させる。このようなプラスミドの例は当業者には公知であり(Sambrookら、1989、前掲を参照;また、Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY、ならびに、その中の参照文献も参照)、例えば、pUC19およびその誘導体(Yanisch-Perronら、1985, Gene 33:103-119)がある。

0094

様々な発現レベルで、発現(調節的または構成的発現のいずれか)を可能にする調節制御に関して、多様な調節配列が当業者にはよく知られている。広い範囲で発現させることができるということは、以下に説明するように、本発明の方法の使用には有利である。このような発現は、構成的、ならびに、調節的、あるいは、誘導的方式のいずれでも達成することができる。

0095

広い範囲の発現をもたらす誘導性発現は、多様な誘導性調節配列を用いることによって得ることができる。一実施形態では、例えば、lacI遺伝子とその無償性誘導物質IPTGを用いることにより、このようなポリペプチドをコード化する配列を、lacOP調節配列を介して転写すると、誘導性で、高レベルのRecE/Tの発現を得ることができる。

0096

RecEおよびRecTを異なるプロモーターから発現させることができる。あるいは、recEおよびrecT遺伝子を、単一プロモーターから、ポリシストロン性mRNAに発現させることもできる。このような異種プロモーターは、誘導性でも、構成性でもよい。好ましくは、発現は、誘導性プロモーターによって制御される。広い範囲の発現をもたらす誘導性発現は、様々な誘導性調節配列を用いることにより得ることができる。一実施形態では、例えば、lacI遺伝子とその無償性誘導物質IPTGを用いることにより、このようなポリペプチドをコード化する配列を、lacOP調節配列を介して転写すると、誘導性で、高レベルのRecE/Tの発現を得ることができる。使用することのできる他の様々な誘導性プロモーター系が、当業者には公知である。RecE/TまたはRedα/β構築物からの発現レベルは、強度の異なるプロモーターを用いることにより、変えることができる。

0097

使用することのできる他の調節性発現系は、限定するものではないが、例えば、アラビノーズ(AraC)により誘導可能なaraCプロモーター、TET系(GeissendorferおよびHillen, 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:657-663)、ファージλ温度のPLプロモーターおよび誘導性λリプレッサーCI857(Pirrotta, 1975, Nature 254:114-117;Petrenkoら、1989, Gene 78:85-91)、trpプロモーターおよびtrpリプレッサー系(Bennettら、1976, Proc. Natl. Acad. Sci USA 73:2351-55;Wameら、1986, Gene 46:103-112)、lacUV5プロモーター(GilbertおよびMaxam, 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:1559-63)、lpp(Nokamuraら、1982, J. Mol. Appl. Gen. 1:289-299)、T7遺伝子−10プロモーター、phoA(アルカリホスファターゼ)、recA(Horiiら、1980)、ならびに、tacプロモーター、トリプトファンにより誘導可能なtrp-lac融合プロモーター(Amannら、1983, Gene 25:167-78)を含み、これらはすべて、一般的に用いられる強力なプロモーターであり、レベルが各プロモーターにより制御される1タンパク質について、全細胞タンパク質の約1〜10%の蓄積レベルをもたらす。より強力なプロモーターを所望する場合には、tacプロモーターはlacUV5の約10倍強力であるが、高いベースラインレベルの発現をもたらすため、過剰発現が必要な場合に限り使用すべきである。より弱いプロモーターが必要な場合には、他の細菌プロモーターが当業者にはよく知られており、例えば、マルトースガラクトース、あるいは、その他の望ましいプロモーター(このようなプロモーターの配列は、Genbankから入手可能である(Burksら、1991, Nucl. AcidsRes. 19:2227-2230)。

0098

本明細書に記載した方法に有用な細胞は、RecE/Tおよび/またはRedα/βリコンビナーゼを含むあらゆる細胞である。好ましくは、宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞である。さらに好ましくは、宿主細胞は、腸内細菌細胞である。腸内菌科のメンバーは、限定するものではないが、各種のエシェリキア属、サルモネラ属、シトロバクター属、クレブシエラ属およびプロテウス属を含む。最も好ましい宿主細胞は、大腸菌細胞である。細胞はまた、適したリコンビナーゼを発現するように作製できるものであれば、あらゆる生物に由来するものでよく、限定するものではないが、酵母、ハエマウス、またはヒト細胞を含む。リコンビナーゼは、好ましくは、大腸菌に由来するRecE/Tリコンビナーゼ、もしくはファージλに由来するRedα/βリコンビナーゼ、あるいは、腸内菌もしくは腸内菌ファージに由来する機能的に同等のRecE/TまたはRedα/βリコンビナーゼ系であり、このような系が、配列相同性の領域間の組換えを媒介する。

0099

RecE/Tおよび/またはRedα/βタンパク質を発現する細胞は、事前エレクトロコンピテント(electrocompetent)にしておき、−70℃で保存することができる。

0100

これ以外にも、本発明の方法は、RecE/Tおよび/またはRedα/βの発現が可能なその他のあらゆる細胞型で実施することができる。例えば、多様な宿主−ベクター系を用いて、タンパク質コード配列を発現させることができる。これらは、限定するものではないが、ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等)に感染した哺乳動物細胞系;ウイルス(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系;酵母ベクターを含む酵母等の微生物、あるいは、バクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換した細菌を含む。ベクターの発現エレメントは、その強度および特異性が変動する。使用する宿主−ベクター系に応じて、多数の適した転写エレメントおよび翻訳エレメントのいずれか1つを用いることができる。特定の実施形態では、RecE/Tおよび/またはRedα/β遺伝子、あるいは、RecE/Tおよび/またはRedα/βの機能的に活性の部分をコードする配列を発現させる。さらに別の実施形態では、RecE/Tおよび/またはRedα/βタンパク質のドメインを含むRecE/TまたはRedα/βの断片を発現させる。

0101

ベクターにDNA断片を挿入するために、既に記載されている方法のいずれかを用いて、適切な転写/翻訳制御シグナルと、タンパク質コード配列とから成るキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、in vitro組換えDNAおよび合成方法、ならびに、in vivo組換え体遺伝子組換え)を含む。RecE/TもしくはRedα/βタンパク質またはペプチド断片をコード化する核酸配列の発現は、第2の核酸配列によって調節することにより、組換えDNA分子で形質転換した宿主中で、RecE/TもしくはRedα/βタンパク質またはペプチドを発現させることができる。例えば、RecE/TまたはRedα/βタンパク質の発現は、当業者には公知の任意のプロモーター/エンハンサーエレメントにより制御することができる。RecE/TまたはRedα/β発現を制御するのに用いることのできるプロモーターは、限定するものではないが、以下を含む:SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’長末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamotoら、1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子(Brinsterら、1982, Nature 296:39-42);ノパリンシンセターゼプロモーター領域を含む植物性発現ベクター(Herrera-Estrellaら、1984, Nature 303:209-213)またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardnerら、1981, Nucl. AcidsRes. 9:2871)、ならびに、光合成酵素リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrellaら、1984, Nature 310:115-120);Gal 4プロモーター等の酵母または他の菌類からのプロモーターエレメント、ADCアルコールデヒドロギナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロイルキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに、組織特異性を示し、トランスジェニック動物に使用されてきた以下の動物性転写制御領域を含む:膵臓腺房細胞で活性のエラスターゼI遺伝子制御領域(Swiftら、1984, Cell 38:639-646;Ornitzら、1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409;MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515);膵臓ベータ細胞で活性のインスリン遺伝子制御領域(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122)、リンパ性細胞で活性の免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら、1984, Cell 38:647-658;Adamesら、1985, Nature 318:533-538;Alexanderら、1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)、精巣胸部、リンパ性および肥満細胞で活性のマウス乳癌ウイルス制御領域(Lederら、1986, Cell 45:485-495)、肝臓で活性のアルブミン遺伝子制御領域(Pinkertら、1987, Genes and Devel. 1:268-276)、肝臓で活性のαフェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlaufら、1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648;Hammerら、1987, Science 235:53-58);肝臓で活性のα1−アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら、1987, Genes and Devel. 1:161-171)、骨髄細胞で活性のβグロビン遺伝子制御領域(Mogramら、1985, Nature 315:338-340;Kolliasら、1986, Cell 46:89-94);脳の希突起神経膠細胞で活性のミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readheadら、1987, Cell 48:703-712);骨格筋で活性のミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Sani, 1985, Nature 314:283-286)、および視床下部で活性の性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら、1986, Science 234:1372-1378)。

0102

特定の実施形態では、細菌性リコンビナーゼ(例えば、RecEまたはRecT)コード化核酸に機能的に連結されたプロモーターと、1つ以上の複製起点と、場合によっては、1つ以上の選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)を含むベクターを用いる。

0103

選択したベクターは、前記第5.2.1節に記載したベクタープラスミドと適合性でなければならない。当業者であれば、1細胞に多数のプラスミドを維持するのに必要な適合性要件について容易に理解されるであろう。原核細胞において2つ以上の構築物を増殖させる方法は、当業者には公知である。例えば、多数のレプリコンを含む細胞は、適切に適合性の複製起点と、独立した選択系とを含むベクター(Millerら、1992,前掲、Sambrookら、1989、前掲参照)を用いて、通常の手順で選択および維持することができる。

0104

5.2.3宿主細胞
本発明のクローニング方法、ならびに、クローン化DNAの増殖に用いられる宿主細胞は、recEおよびrecTおよび/またはredαおよびredβ遺伝子産物を発現させるあらゆる細胞、あるいは、これら遺伝子の異種発現が可能なあらゆる細胞でよい。使用できると考えられる細胞型の例は、限定するものではないが、細菌、酵母、植物、げっ歯類、マウス、ヒト、昆虫または哺乳動物の細胞等の原核および真核細胞を含む。好ましい実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞である。最も好ましい実施形態では、宿主細胞は、大腸菌細胞である。使用できる具体的大腸菌株の例は、JC 8679およびJC 9604である。JC 8679およびJC 9604の遺伝子型は、Sex(Hfr、F+、F-、またはF’):F-である。JC8679は、次の突然変異を含む:recBC 21、recC 22、sdcA 23、thr-1、ara-14、leu B 6、DE(gpt-proA)62、lacY1、tsx-33、gluV44(AS)、galK2(Oc)、LAM-his-60、relA 1、rps L31(strR)、xyl A5、mtl-1、argE3(Oc)およびthi-1。JC 9604は、同じ突然変異と、さらに突然変異recA 56を含む。

0105

別の実施形態では、本明細書に記載したクローニングおよびサブクローニング方法の宿主細胞として、真核細胞を用いることができる。細胞リコンビナーゼ、もしくはそれらの機能的同等物を発現する、または、発現するように作製することができるあらゆる細胞を用いることができる。ヒト、マウス、サル、あるいは、その他のあらゆる生物に由来する細胞系を用いることができる。例えば、本発明の方法に有用な細胞系の非制限的例は、CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、ならびに、WI38細胞を含む。

0106

多様な宿主−ベクター系を用いて、RecE/T、Redα/βのタンパク質コード配列、またはそれらの機能的に同等な系を導入し、発現させることができる。このような方法は、当業者には公知である(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York参照)。このような系には、限定するものではないが、下記を含む:ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等)に感染した哺乳動物細胞系;ウイルス(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系;酵母ベクターを含む酵母等の微生物、あるいは、バクテリオファージ、DNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNAで形質転換した細菌。タンパク質発現の方法についても、前記第5.2.2節に記載されている。

0107

5.2.4 標的DNA
標的DNAは、実験設計に応じて選択し、長さが、1塩基対という短いものから、100キロベースを超えるものまで、あらゆる二本鎖DNAでよい。特定の実施形態では、標的は、長さ100、125、200、または300kb以下である。別の具体的実施形態では、標的DNAは、例えば、BACベクターに存在するものと同様に、25〜100キロベースである。標的DNAの他の具体的実施形態は、第6節の実施例に記載されている。標的DNAは、限定するものではないが、プラスミド、BACまたは大腸菌染色体等の独立して複製する任意のDNA分子に常在しうる。標的DNAはまた、限定するものではないが、あらゆる原核、古細菌もしくは真核細胞、または、ウイルス、ファージまたは合成起原に由来するDNAを含むあらゆるDNA供給源に常在しうる。例えば、核酸配列は、次の供給源から取得することができる:ヒト、ブタウシネコ鳥類ウマイヌ、昆虫(例えば、ショウジョウバエ)、無脊椎動物(例えば、C. elegans)、植物等。DNAは、当業者には公知の標準的方法により得ることができる(例えば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York;Glover(編), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach,MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II)。

0108

5.3 本発明の使用方法
5.3.1宿主細胞へのDNAの導入
標的DNAを含むDNA調製物を宿主細胞に送達するための、当業者には公知のあらゆる方法が、以上説明してきた本発明の方法での使用に適している。このような方法は、当業者には公知であり、限定するものではないが、細胞の電気穿孔、塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムを用いたコンピテント細胞の作製、ウイルス粒子パッケージされた標的DNAによるDNAの形質導入を含む。真核細胞に対する方法は、限定するものではないが、電気穿孔、DNAのリン酸カルシウム沈殿によるトランスフェクション、ならびに、ウイルスパッケージングを含む。好ましい実施形態では、電気穿孔を用いる。RecE/TまたはRedα/βタンパク質を含む細胞を処理することによって、これらを標準的方法による電気穿孔に対し、コンピテントとする(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing AssociatesおよびWiley Interscience, New York)。好ましくは、約50μlの電気コンピテント細胞の標準調製物を用いて、標準的方法による電気穿孔を実施する。線状または環状ベクターの形質転換を必要とする実験では、好ましくは、0.3μg以上のベクターを用いる。標的DNAを含むDNA調製物の形質転換を必要とする実験では、好ましくは、0.3μg以上を用いる。共形質転換実験については、DNAは、電気穿孔の前に混合するのが好ましい。電気穿孔の後、好ましくは、細胞を培地中に稀釈し、約1時間半の修復時間の間インキュベートした後、選択マーカー遺伝子によりもたらされた表現型変化を確認する条件下で培養した。

0109

ベクターの部位特異的組換えまたはエンドヌクレアーゼ切断を用いた実験では、SSRもしくはエンドヌクレアーゼの発現、または、SSRとエンドヌクレアーゼもしくは2つのSSRとの組合わせを、エレクトロコンピテント細胞の作製前、電気穿孔後の修復時間中、または、選択マーカーを確認する培養中のいずれかに導入する。

0110

最適な形態では、表現型変化は、一抗生物質に耐性であり、対応する抗生物質を含むプレート上で細胞を培養する。この場合、一晩の培養後、出現した抗生物質耐性コロニーは、主として、所望のサブクローニング産物を含むはずである。

0111

別の実施形態では、ファージ粒子にパッケージされたDNAの形質導入によって、DNAを宿主細胞に送達する。P1またはλ形質導入およびパッケージングプロトコルは、当業者には公知である。λパッケージング抽出物は、市販されている(例えば、Promega、ウィスコンシン州マジソン)。

0112

5.3.2オリゴヌクレオチド
本発明の方法と共に用いられるオリゴヌクレオチド相同性アーム、プライマー、ならびに、アダプターオリゴヌクレオチドは、多くの場合、長さが10〜約100ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、長さが、10ヌクレオチド、15ヌクレオチド、20ヌクレオチド、50ヌクレオチド、もしくは100ヌクレオチド、または、200ヌクレオチド以下である。好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、長さが約90ヌクレオチドである。

0113

オリゴヌクレオチドは、当業者には公知のあらゆる方法(例えば、Applied Biosystems 392/394DNA合成装置を用いた標準的ホスホロアミダイト化学)を用いて、合成することができる。さらに、合成で用いる試薬は、多数の市場供給業者のいずれから入手してもよい。

0114

本発明の方法と共に用いられるオリゴヌクレオチドまたはその誘導体は、当業者には公知のあらゆる方法、例えば、自動DNA合成装置(Biosearch、Applied Biosystems等から市販されているもの等)を用いて、合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法(1988, Nucl. AcidsRes. 16, 3209)により合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された多孔質ガラスポリマー支持体(Sarinら、1988, Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 85, 7448-7451)等を用いて、作製することができる。

0115

オリゴヌクレオチドは、修飾が相同的組換えを妨害しない限り、少なくとも1つの修飾塩基を含んでよい。例えば、このような修飾は、限定するものではないが、下記を含む:5-フルオロウラシル5-ブロモウラシル、5-クロロウシル、5-ヨードウラシルヒポキサンチンキサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒロドキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシルジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、プソイドウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、ならびに、2,6-ジアミノプリン

0116

オリゴヌクレオチドは、修飾が相同的組換えを妨害しない限り、少なくとも1つの修飾リン酸バックボーンを含んでよい。例えば、このような修飾は、限定するものではないが、下記を含む:ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアデートホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、ならびに、ホルムアセタールまたはその類似体

0117

5.3.3 DNA増幅
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を、場合により本発明とともに用いて、供給源(例えば、組織サンプル、ゲノムまたはcDNAライブラリー)から所望の配列を増幅する。既知の配列を呈示するオリゴヌクレオチドプライマーは、PCRにおけるプライマーと同様に用いることができる。PCRは、典型的に、サーマルサイクラー(例えば、Perkin-Elmer Cetus)や耐熱性ポリメラーゼ(例えば、商標Gene Amp(登録商標)のTaqポリメラーゼ)を用いて、実施する。増殖しようとする核酸鋳型は、限定するものではないが、あらゆる種に由来するmRNA、cDNAまたはゲノムDNAを含みうる。PCR増幅方法は、当業者には公知である(例えば、米国特許第4,683,202号、第4,683,195号および第4,889,818号;Gyllensteinら、1988, Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A. 85, 7652-7656;Ochmanら、1988, Genetics 120, 621-623;Lohら、1989, Science 243, 217-220を参照)。

0118

5.4診断用途のための方法
本発明の方法を用いて、外来DNAまたは変異体DNAの存在に関連する様々な感染症、症状、疾患、および障害を検出、予知、診断、もしくはモニターする、または、その治療をモニターすることができる。例えば、以下の第5.4.1節に記載するように、この方法を用いて、ウイルス感染細菌感染、または、原生動物、寄生生物もしくはその他公知の病原体による感染に関連する疾患等の様々な感染症および疾患を検出、予知、診断、またはモニターすることができる。また、以下の第5.4.2節に記載するように、この方法を用いて、遺伝的突然変異または単一ヌクレオチド多型(SNP)等の変異体DNAの存在に関連する様々な感染症、症状、疾患、および障害を検出、予知、診断、またはモニターすることができる。

0119

5.4.1外来DNAの検出
前述した本発明の方法を用いて、病原体にさらされた患者において、病原体への暴露に由来するウイルスまたは細菌DNA等の外来DNAを検出することができる。患者は、病原体による感染症の症候、または、病原体の存在に関連する疾患または障害の存在を示すこともあれば、示さない場合もある。一実施形態では、例えば、このような疾患または感染症を有する、または有すると予想される患者由来のDNAから、標的DNAサンプルを作製することができる。外来標的DNAに対して配列相同性を有する相同性アームを設計および作製することができる。次に、前記第5.1節に記載した方法のいずれかにより、細菌性リコンビナーゼを発現し、しかも、ベクターDNAを含む大腸菌宿主細胞に、上記サンプルDNAを導入する。別の実施形態では、ベクター配列に相同的な第1配列と、外来標的DNAに相同的な第2配列とを含み、前記第5.1節に詳しく記載したように配向されたアダプターオリゴヌクレオチドを設計することができる。このようなアダプターオリゴヌクレオチドを用いて、サンプルDNAおよびベクターDNA、RecE/TまたはRedα/βを発現する大腸菌宿主細胞と一緒に、共トランスフェクトするか、既にベクターDNAおよびサンプルDNAを含む細胞に直接トランスフェクトすることができる。次に、前記第5.1節に記載したように、選択培地で細胞を増殖させ、選択に耐えた細胞を、適切な大きさの挿入断片の存在について分析することができる。

0120

標的DNAは、患者または被験者生体サンプルから単離することができる。このようなサンプルとして、限定するものではないが、全血液、血漿、血清、皮膚、唾液、尿、リンパ液、生検吸引液から得た細胞、組織培養細胞、培地、または、食品、水もしくはその他の材料等の非生体サンプルがある。このような供給源からDNAを調製する方法は、当業者には公知である(例えば、Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.)。

0121

例えば、ウイルス感染症または疾患を検出もしくは診断しようとする一実施形態では、相同性アームは、既知のウイルスDNAのDNA配列と相同的なDNA配列を含みうる。該方法を用いて、ウイルスDNA鎖、または、DNAもしくはRNAウイルスDNA複製中間体のいずれかとして、ウイルスDNAを検出および単離することができる。

0122

一実施形態では、DNAウイルスのDNAゲノムまたは複製中間体は、例えば、該DNAウイルスのウイルス配列と相同的になるよう設計された相同性アーム配列を用いて、直接ターゲッティングすることができる。このようなDNAウイルスは、限定するものではないが、下記を含む:B型肝炎ウイルス、アデノ関連ウイルスおよびサイトメガロウイルス等のパルボウイルスパピローマウイルスポリオーマウイルス、および、SV40等のパポバウイルス;アデノウイルス、I型単純ヘルペス(HSV-I)、II型単純ヘルペス(HSV-II)およびエプスタインバールウイルス等のヘルペスウイルス;ならびに、痘瘡天然痘)およびワクシニアウイルス等のポックスウイルス。別の実施形態では、DNA中間体を介して複製するレトロウイルスRNAウイルスの複製中間体を直接ターゲッティングすることができる。その際、このようなRNAウイルスのウイルス配列に相同的となるように設計された相同性アーム配列を用いる。これらRNAウイルスは、限定するものではないが、下記を含む:I型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-I)、II型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-II)、I型ヒトT細胞向性ウイルス(HTLV-I)、および、II型ヒトT細胞向性ウイルス(HTLV-II)。別の実施形態では、RNA中間体を介して複製するRNAウイルスのゲノム中間体または複製中間体を検出および単離するために、RNAを単離し、当業者には公知の方法に従い、逆トランスクリプターゼを用いて、RNAのcDNAコピーに転写することができる。このようなcDNAコピーを標的DNAとして用いることにより、インフルエンザウイルス麻疹ウイルス狂犬病ウイルスセンダイ(Sendai)ウイルス、ポリオウイルスのようなピコルナウイルスコクサッキーウイルスライノウイルスレオウイルス風疹ウイルス(ドイツ麻疹)およびセムリキ森林熱ウイルスのようなトガウイルスアルボウイルス、ならびに、A型肝炎ウイルス等のRNAウイルスの存在を検出することができる。

0123

細菌感染症を診断または検出しようとする別の好ましい実施形態では、相同性アームは、既知細菌のDNA配列と相同的なDNA配列を含むことができる。例えば、一実施形態では、この相同性アームDNA配列は、病原細菌のcDNAまたはゲノムDNAに相同的でありうる。このような病原細菌は、限定するものではないが、下記を含む:化膿連鎖球菌肺炎連鎖球菌淋菌髄膜炎菌ジフテリア菌ボツリヌス菌ウエルシュ菌破傷風菌インフルエンザ菌肺炎桿菌臭鼻症菌、硬腫菌、黄色ブドウ球菌コレラ菌、大腸菌、緑膿菌カンピロバクタービブリオフィタス(Campylobacter Vibrio fetus)、Campylobacter jejuni、アエロモナスヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、セレウス菌(Baccilus cereus)、エドワージシエラ(Edwardsiella tarda)、エルシニアエンテロコリチカペスト菌結核エルニア菌、志賀赤痢菌フレクスナー赤痢菌ソネ赤痢菌、ネズミチフス菌、梅毒トレポネーマフランベジアトレポネーマピンタトレポネーマヴァンサンスピロヘータ(Borrelia vincentii)、ライム病ボレリア(Borrelia burgdorferi)、黄疸出血性レプトスピラ(Leptospira icterohemorrhagiae)、ヒト結核菌トキソプラズマ(T. gondii)、ニューモシスティス野兎病菌ウシ流産菌ブタ流産菌マルタ熱菌マイコプラズマ種、発疹チフスリケッチア、ツツガム病シリケッチアクラミジア種、ならびに、ヘリコバクターピロリ

0124

別の実施形態では、このような相同性アームDNA配列は病原菌のcDNAまたはゲノムDNAと相同的である。これらの病原菌は、限定するものではないが、Coccidioides immitis、煙色コウジ菌(Aspergillus fumigatus)、鷲口瘡カンジダ、Blacstmyces dermatidis、Cryptococcus neoformans、ならびに、Histoplasma capsulatumを含む。

0125

原生動物感染症を診断または検出しようとする別の好ましい実施形態では、相同性アームは、既知原生動物のDNA配列と相同的なDNA配列を含んでいてよい。例えば、このような相同性アームDNA配列は、あらゆる既知原生動物のcDNAまたはゲノムDNAに相同的でありうる。特に興味深い病原原生動物として、Entomoeba histolytica、口腔トリコモナス腸トリコモナス膣トリコモナスガンビアトリパノソーマ、ローデシア・トリパノソーマ、クルーズ・トリパノソーマ、ドノヴァン・リーシュマニア熱帯リーシュマニアブラジル・リーシュマニア、Pneumocystis pneumonia、三日熱マラリア原虫熱帯熱マラリア原虫、ならびに、四日熱マラリア原虫等がある。

0126

寄生生物感染症を診断または検出しようとするさらに別の好ましい実施形態では、相同性アームは、既知寄生生物のDNA配列と相同的なDNA配列を含むことができる。例えば、このような相同性アームDNA配列は、下記を含むあらゆる既知寄生生物のcDNAまたはゲノムDNAに相同的でありうる:ギョウチュウ、ヒトベンチュウ、カイチュウ、センモウチュウ、フン線虫日本住血吸虫マンソン住血吸虫ビルハルツ住血吸虫等の蠕虫、ならびに、鉤虫等。

0127

5.4.2細胞DNAにおける突然変異および多型の診断
また、本発明の方法を用いて、患者のサンプルにおける遺伝的障害を単離および検出することや、遺伝的突然変異または単一ヌクレオチド多型(SNP)のような変異体DNAの存在に関連する様々な症状、疾患および障害を予知、診断またはモニターすること、ならびに、疾患または障害を発現する遺伝的素因を検出することも可能である。

0128

一実施形態では、例えば、このような遺伝的疾患または障害を有する、もしくは有すると予想される患者由来のサンプルから単離したDNAから、標的DNAを作製することができる。好ましい実施形態では、目的とする特定の遺伝子、または、目的とするゲノム領域に相同的な配列を有する相同性アームを含むベクターを設計および作製した後、RecE/Tおよび/またはRedα/β等の細菌性リコンビナーゼを発現する大腸菌宿主細胞に導入する。次に、このサンプルDNAを宿主細胞に導入する。別の実施形態では、ベクター配列と相同的な第1配列と、目的とする標的遺伝子のDNAと相同的な第2配列とを含み、前記の第5.1節に詳述したように配向されたアダプターオリゴヌクレオチドを設計することができる。好ましい実施形態では、このようなアダプターオリゴヌクレオチドを用いて、サンプルDNAと一緒に、RecE/Tおよび/またはRedα/βを発現し、かつ、ベクターDNAを含む大腸菌宿主細胞を共トランスフェクトすることができる。あるいは、前記の第5.1節に詳しく記載したその他の相同的組換えクローニング方法のいずれを用いてもよい。次に、前記第5.1節に記載したように、細胞を選択培地で増殖させ、選択に耐えた細胞を分析して、適切な大きさの挿入断片の存在について調べることができる。次いで、当業者には公知の制限分析または配列決定技術(例えば、Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory techniques manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.を参照)により、DNAを分析し、目的とする突然変異またはDNA変異の存在を調べることができる。

0129

別の実施形態では、相同性アームまたはアダプターオリゴヌクレオチドは、目的とする遺伝的突然変異またはDNA多型の配列を含みうる。この実施形態では、サンプルDNAが突然変異を含む場合に限り、組換えが起こる。特定の突然変異を含む細胞だけが選択に対して耐性であることから、これは、特定の突然変異またはDNA多型について、多数のサンプルを診断目的でスクリーニングするのに有用でありうる。

0130

標的DNAは、ゲノムDNA、cDNA、またはミトコンドリアDNA等の任意のサンプルから得ることができる。一実施形態では、例えば、標的DNAは、ヒト染色体の領域である。別の実施形態では、標的DNAは、混合集団、例えば、目的とする複数の被験者、例えば、特定の障害に罹患した被験者に由来するゲノムDNAの集団に存在する。このような標的DNAは、全血液、血漿、血清、皮膚、唾液、尿、リンパ液、生検吸引液から取得した細胞、組織培養細胞、培地等の生物学的サンプル、または、食品、水もしくはその他の材料等の非生物学的サンプルから取得することができる。このような供給源からのDNAの作製方法は、当業者には公知である(例えば、Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory techniques manuals, 1987-1994 Current Protocols, 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.を参照)。

0131

本発明の方法を用いて試験することのできる遺伝的障害の非制限的例は、乳癌に関連するBrca-1のような遺伝病に関連する突然変異およびSNP、嚢胞性線維症関与する突然変異、テイサックス病、鎌状赤血球貧血血友病アテローム性動脈硬化病、糖尿病白血病前立腺癌およびその他の癌、ならびに、肥満症を含む。このような遺伝病としては、変形性および非変形性神経病、例えば、アルツハイマー病パーキンソン病筋萎縮性側索硬化症ハンチントン病ウイルソン病脊髄小脳性運動失調フリードライ運動失調およびその他の運動失調、クロイツフェルトヤコブ病を含むプリオン病歯状核赤核淡瘡球ルイ体萎縮病海綿状脳障害筋萎縮性ジストロフィーうつ病精神分裂病、ならびに、てんかん等が挙げられる。遺伝病はまた、例えば、低血糖またはフェニルケトン尿症等の代謝疾患も含む。さらには、心臓血管疾患および症状も含まれ、その非制限的例として、アテローム性動脈硬化病、心筋梗塞、ならびに、高血圧が含まれる。本発明は、さらに、ライム病、結核、ならびに、性感染病の検出および診断にも使用することができる。

0132

別の実施形態では、本発明の相同的組換えクローニング方法を用いて、疾患または障害の遺伝的根拠を決定することができる。例えば、遺伝的根拠がわかっていない障害に罹患した患者のサンプルから、標的DNAを単離することができる。一実施形態では、クローニング方法を用いて、このような障害を有することがわかっている、または予想される患者のグループから、疾患または障害に関与することがわかっている、もしくは予想される染色体の領域を単離することができる。次に、回収したDNAを単離した後、制限断片長多型やその他のSNP検出方法等、DNAにおける変異をマッピングするための、当業者には公知の技術を用いて、さらに分析することにより、遺伝的突然変異または多型の存在を調べることができる(例えば、Nikiforovら、1997年10月21日に発行された米国特許第5,679,524号;McIntochら、1998年12月30日付PCT国際公開WO98/59066;Goeletら、1995年5月11日付PCT国際公開WO95/12607;Wangら、1998, Science 280:1077-1082;Tyagiら、1998、Nature Biotechnol. 16:49-53;Chenら、1998、Genome Res. 8:549-556;Pastinenら、1996、Clin. Chem. 42:1391-1397;Chenら、1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:10756-10761;Shuberら、1997、Hum. Mol. Gen. 6:337-347;Liuら、1997、Genome Res. 7:389-398;Livakら、1995, Nature Genet. 9:341-342;DayおよびHumpheries, 1994, Annal. Biochem. 222:389-395を参照)。

0133

臨床的に興味深い標的障害の非制限的例は、喘息、関節炎、乾癬症湿疹アレルギー薬物耐性薬物中毒;ならびに、限定するものではないが、ヒト肉腫および癌腫などの癌、例えば、線維肉腫粘液腫脂肪肉腫軟骨肉腫骨原性肉腫脊索腫血管肉腫内皮肉腫、リンパ管肉腫リンパ管内皮腫滑膜腫中皮腫ユーイング腫平滑筋肉腫横紋筋肉腫大腸癌膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌基底細胞癌腺癌汗腺癌皮脂腺癌、乳頭状癌乳頭状腺癌嚢状腺癌、髄様癌気管支原性癌腎細胞癌肝癌胆管癌絨毛癌精上皮腫胎生期癌、ウイルムス腫、癌、精巣癌、肺癌小細胞肺癌膀胱癌上皮癌グリオーム星状細胞腫髄芽腫頭蓋咽頭腫上衣細胞腫松果体腫血管芽細胞腫聴音神経腫、希突起グリオーム、髄膜腫黒色腫神経芽細胞腫網膜芽腫等の癌;白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病骨髄芽球性前骨髄球性骨髄単球性単球性の白血病および赤白血病)、慢性白血病慢性骨髄性顆粒球性)白血病および慢性リンパ球性白血病)、ならびに、真性赤血球増加リンパ腫ホジキン病および非ホジキン病)、多発性骨髄腫ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびH鎖病を含む。さらに、相同的組換えクローニング方法は、限定するものではないが、下記を含む自己免疫疾患を有する患者の遺伝的相違の診断および検出ならびに患者の診断をするのに有用である:インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症全身性エリテマトーデスシェーグレン症候群、強皮病、多発性筋炎慢性活動性肝炎混合性結合組織疾患原発性胆汁性肝硬変悪性貧血自己免疫甲状腺炎特発性アジソン病白斑グルテン過敏性腸症グレーブス病重症筋無力症自己免疫性好中球減少症特発性血小板減少性紫斑病慢性関節リウマチ肝硬変尋常性天疱瘡自己免疫性不妊症グッドパスチャー糸球体腎炎水疱性類天疱瘡円盤狼瘡潰瘍性大腸炎、ならびに、デンスデポジット病。

0134

また、相同的組換えクローニング方法を用いて、疾患と関係のないDNA突然変異、改変、変異およびSNPを単離、診断、および、検出することもできる。その非制限的例として、非コードゲノム配列に存在するこのようなDNA突然変異、改変、変異およびSNP、または、様々なヒト血液型に関連するDNA突然変異、改変、変異およびSNPが含まれる。

0135

本発明の好ましい態様では、本発明の方法は、ヒトDNA突然変異、改変、変異およびSNPの単離、検出、診断、予知、またはモニタリングに特に有用でありうる。しかし、本明細書に記載する方法は、他の動物、例えば、蓄牛、ウマ、ヒツジヤギおよびブタを含む家畜、ネコおよびイヌを含む家庭ペット;ならびに、農業的に重要な植物および園芸植物を含む植物の疾患の単離、検出、診断、予知、またはモニタリングにも有用であることに留意すべきである。

0136

5.5キット
本発明はさらに、本明細書に記載する相同的組換えクローニングおよびサブクローニング方法の使用を容易にするキットも提供する。一実施形態では、1つ以上の容器に、下記を含んで成るキットが提供される:A)目的とする標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、ベクターDNA鎖に沿って5’から3’に向かい、第1相同性アーム、複製起点および第2相同性アームの順に、複製起点と、2つの相同性アームとを有するベクターであり、その際、第1ベクターDNA鎖上の第1相同性アームのヌクレオチド配列が、第1標的DNA鎖上の第1末端の配列と相同的であり、しかも、第1ベクターDNA鎖上の第2相同性アームのヌクレオチド配列が、第1標的DNA鎖上の第2末端のヌクレオチド配列と相同的である;B)細菌性リコンビナーゼを含む細胞。この細胞は、内在的に、または、組換えにより、リコンビナーゼを発現することができる。

0137

別の実施形態では、1つ以上の容器において、標的DNA分子の位置指定クローニングまたはサブクローニングに有用なキットで、下記を含んで成るキットを提供する:a)目的とする標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、ベクターDNA鎖に沿って5’から3’に向かい、第1相同性アーム、複製起点および第2相同性アームの順に、複製起点と、2つの相同性アームとを有するベクターであり、その際、第1ベクターDNA鎖上の第1相同性アームのヌクレオチド配列が、第1標的DNA鎖上の第1末端の配列と相同的であり、しかも、第1ベクターDNA鎖上の第2相同性アームのヌクレオチド配列が、第1標的DNA鎖上の第2末端のヌクレオチド配列と相同的である;ならびに、b)上記ベクターDNA鎖上の第1相同性アームのヌクレオチド配列と相同的な第1ヌクレオチド配列と、標的DNA鎖上の第1末端のヌクレオチド配列と相同的な第2ヌクレオチド配列とを、3’から5’に向かい第1配列および第2配列の順に有する第1オリゴヌクレオチドDNA鎖を含む第1二本鎖オリゴヌクレオチドと;c)上記ベクターDNA鎖上の第2相同性アームのヌクレオチド配列と相同的な第3ヌクレオチド配列と、標的DNA鎖上の第2末端のヌクレオチド配列と相同的な第4ヌクレオチド配列とを、3’から5’に向かい、第3ヌクレオチド配列および第4ヌクレオチド配列の順に有する第2オリゴヌクレオチド鎖を含む第2オリゴヌクレオチドと;d)細菌性リコンビナーゼタンパク質、例えば、RecE/Tおよび/またはRedα/βを含む細胞。特定の実施形態では、上記細胞は、大腸菌細胞である。

0138

別の実施形態では、1つ以上の容器を備え、下記を含んで成るキットを提供する:a)目的とする標的DNA分子の位置指定クローニングおよびサブクローニングに有用な二本鎖DNAベクターであって、ベクターDNA鎖に沿って5’から3’に向かい、第1相同性アーム、複製起点および第2相同性アームの順に、複製起点と、2つの相同性アームとを有するベクターであり、その際、第1ベクターDNA鎖上の第1相同性アームのヌクレオチド配列が、第1標的DNA鎖上の第1末端の配列と相同的であり、しかも、第1ベクターDNA鎖上の第2相同性アームのヌクレオチド配列が、第1標的DNA鎖上の第2末端のヌクレオチド配列と相同的である;b)上記ベクターDNA鎖上の第1相同性アームのヌクレオチド配列と相同的な第1ヌクレオチド配列と、標的DNA鎖上の第1末端のヌクレオチド配列と相同的な第2ヌクレオチド配列とを、3’から5’に向かい、第1ヌクレオチド配列および第2ヌクレオチド配列の順に有する第1オリゴヌクレオチドDNA鎖を含む第1二本鎖オリゴヌクレオチドと;c)上記ベクターDNA鎖上の第2相同性アームのヌクレオチド配列と相同的な第3ヌクレオチド配列と、標的DNA鎖上の第2末端のヌクレオチド配列と相同的な第4ヌクレオチド配列とを、3’から5’に向かい、第3ヌクレオチド配列および第4ヌクレオチド配列の順に、有する第2オリゴヌクレオチド鎖を含む第2オリゴヌクレオチド。

0139

様々な具体的実施形態では、キットの標的DNAは、細菌、ウイルス、寄生生物、原生動物、または病原DNAである。その他の具体的実施形態では、キットの標的DNAは、障害または疾患に関連することが知られる、もしくは予想される遺伝的突然変異または多型を含んでいてよい。別の具体的実施形態では、オリゴヌクレオチドにおいて、アダプター配列またはベクター相同性アームが、BAC、PAC、λ、プラスミド、またはYACに基づくクローニングベクターを有する。

0140

6.実施例:RecE/TおよびRedα/βクローニングおよびサブクローニング
本節に示す実施例では、本発明の相同的組換え方法を用いた好適なクローニングおよびサブクローニングを示す多数の実験を記載する。サブクローニング方法に対する多様な手法を示す。特に、1つの実施例が、これまで記載されているものより大きい挿入断片の好適なクローニング、すなわち、約150kbBACベクターからの25 kbDNA断片の位置指定サブクローニングを示すことに留意されたい。

0141

6.1 方法および材料
線状断片の作製
標準的PCR反応条件により、線状DNA断片を増幅することができる。pACYC177から、(Tn903由来の)カナマイシン耐性遺伝子を含む1972 bpのp15A起点を増幅した。起点p15Aにより、このプラスミドまたは組換え体を、ColE1適合性群起点を保有する他のプラスミドと共存させることができる。pACYC184から、p15A起点を含む1934 bpのクロラムフェニコール(Tn9由来)耐性遺伝子を増幅した。

0142

PCR反応で用いたオリゴヌクレオチドは、その3’末端に、pACYCプラスミド上でプライマーとして働く18〜30ヌクレオチド配列と、5’末端に、標的DNA領域のフランクに相同的な50〜60ヌクレオチドの長さの配列とを含んでいた。長いオリゴヌクレオチドについては、用いたPCR反応アニーリング温度は、62℃であった。PCR産物は、QIAGENPCR精製キット(QIAGEN)を用いて精製し、dH2Oで溶離した。DpnIでPCR産物を消化することにより、鋳型DNAを除去した。消化後、PCR産物をエタノールにより沈殿させ、0.5μg/ulのdH2Oで再懸濁させた。

0143

コンピテント細胞の作製
標準的方法により、電気穿孔コンピテント細胞を作製した。つまり、一晩培養したものを、適当な抗生物質を含むLB培地に100倍稀釈した。大腸菌細胞をOD600=0.25〜0.4の光学密度まで増殖させ、上で15分冷却した。細菌細胞を−5℃にて7,000 rpmで10分遠心分離した。細菌細胞ペレット氷冷10%グリセロール中に再懸濁させた後、−5℃にて10分間7,000 rpmでの遠心分離によりペレット化した。氷冷10%グリセロール中での3回の洗浄および再遠心分離の後、細胞の量に等しい量の氷冷10%グリセロール中で、細胞ペレットを懸濁させた。コンピテント細胞をエッペンドルフ試験管中の50μlのアリコートに分割し、液体窒素急速凍結した後、−70℃で保存した。

0144

プラスミドpBAD-ETγまたはpBAD-αβγを用いた実験は、標準的手段により、大腸菌宿主にこれらプラスミドを形質転換した後、0.2%グルコース、50μg/mlアンピシリンを含むLB培地中で飽和まで一晩成長させ、得られた培養物を50μg/mlアンピシリンを含むLB培地に100倍稀釈し、0.15のOD600まで成長させることから成る。次に、L-アラビノーズを0.1%の最終濃度まで添加した。0.25〜0.4のOD600まで細胞を増殖させた後、氷上で15分冷却した。

0145

電気穿孔1μlのDNA溶液(約0.5μg以上の共形質転換用DNA、または標的を保有する細胞専用の約0.3μg以上のベクターDNA、あるいは、ベクターを保有する細胞用の標的を含む約0.5μg以上のDNAを含有する)をコンピテント細胞と混合する。細胞−DNA混合物を氷冷キュベットに移した。25μFD、2.3kVに設定したバイオ−ラッド遺伝子パルサー(Bio-Rad Gene Pulser)と、200オームに設定したパルスコントローラー(Pulse Controller)を用いて、電気穿孔を実施した。電気穿孔後、LB培地(1ml)を添加した。細胞を37℃で1〜1.5時間振盪しながらインキュベートした後、ベクター中の選択マーカー遺伝子に対応する抗生物質を含むプレートに塗布した。

0146

6.2 結果
表1は、RecE/TまたはRedα/β発現の様々な供給源を用いて、目的とする様々な標的DNA領域をサブクローニングした6つの実験の概要を示す。「ET発現」と称する第1行は、表示したように、大腸菌宿主JC8679またはJC9604中の内在性RecE/T、あるいは、pBADαβγのプラスミドpBAD-RecE/T由来のRecE/TまたはRedα/βの供給源を示す。第2欄は、使用した大腸菌宿主を示す。第3欄は、標的遺伝子を示す。

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