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技術 放射線療法が動物の皮膚と粘膜とに及ぼす有害な影響を低減する方法

出願人 コルゲート・パーモリブ・カンパニーコロラド・ステート・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデーション
発明者 ダヴェンポート,デボラ・ジェイグロス,キャシー・エルオギルヴィー,グレゴリー・ケイハンド,マイケル・エス
出願日 2008年6月18日 (11年4ヶ月経過) 出願番号 2008-159052
公開日 2009年2月19日 (10年8ヶ月経過) 公開番号 2009-035533
状態 特許登録済
技術分野 非環式または炭素環式化合物含有医薬 飼料(2)(一般) 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性 特定動物用飼料
主要キーワード 維持エネルギー 中間水 乾物ベース 高放射線量 落花生殻 メンヘーデン油 栄養素成分 逐次選択
関連する未来課題
重要な関連分野

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課題

癌に苦しんでおり放射線療法を受けている及び等の愛玩動物における皮膚と粘膜との障害を低減する方法とこの目的で使用するためのフード組成物を提供する。

解決手段

癌を有し放射線療法を受けている動物の皮膚と粘膜とに生じる障害の重症度を、オメガ−6多価不飽和脂肪酸類を含みかつオメガ−3多価不飽和脂肪酸類とアルギニンとの混合物を補充した栄養的にバランスのとれたフード組成物を前記動物に供給することで軽減する。

概要

背景

概要

癌に苦しんでおり放射線療法を受けている及び等の愛玩動物における皮膚と粘膜との障害を低減する方法とこの目的で使用するためのフード組成物を提供する。癌を有し放射線療法を受けている動物の皮膚と粘膜とに生じる障害の重症度を、オメガ−6多価不飽和脂肪酸類を含みかつオメガ−3多価不飽和脂肪酸類とアルギニンとの混合物を補充した栄養的にバランスのとれたフード組成物を前記動物に供給することで軽減する。なし

目的

本発明が適用可能であるような範囲において必要要件である要素は、栄養素としてオメガ−6多価不飽和脂肪酸類を含む栄養的にバランスのとれたペットフード組成物中に、上記の表Iに指定する割合で、オメガ−3多価不飽和脂肪酸類とアルギニンとの混合物が存在することである

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
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請求項1

癌を有し放射線療法を受けている愛玩動物の正常な細胞への有害な影響を軽減する方法であって、オメガ−6多価不飽和脂肪酸類を含む栄養的にバランスのとれたペットフードと、オメガ−3多価不飽和脂肪酸類とアルギニンとの混合物を前記フードに補充することと、次に、少なくとも前記動物放射線にさらされる期間の間中、前記動物に前記フードを供給することと、を含む方法。

請求項2

前記オメガ−3多価不飽和脂肪酸類は、前記フード組成物中に乾物ベースで約2.5〜約7.5%の濃度で存在する、請求項1に記載の方法。

請求項3

アルギニンは、前記フード組成物中に乾物ベースで約2.0〜約3.5%の濃度で存在する、請求項1に記載の方法。

請求項4

前記フード中に存在するオメガ−3多価不飽和脂肪酸類対オメガ−6脂肪酸類重量比は約0.3:1〜3.5:1である、請求項1に記載の方法。

請求項5

前記栄養的にバランスのとれたフードは、乾物ベースで約27〜35%の脂肪含量と乾物ベースで約15〜約27%の炭水化物含量とを有し、オメガ−3多価不飽和脂肪酸類対オメガ−6多価不飽和脂肪酸類の重量比は約0.3:1〜3.5:1の範囲内である、請求項1に記載の方法。

発明の詳細な説明

0001

発明の背景
発明の分野
本発明は、癌に苦しんでおり放射線療法を受けている及び等の愛玩動物における皮膚と粘膜との障害を低減する方法に関し、本方法は、この目的で使用するためのフード組成物を含む。
従来技術
癌を有する動物における臨床放射線療法は、動物の正常な組織細胞とに生化学的変化を誘発し、正常な組織と細胞とに障害を引き起こすことは周知である。放射線療法の最中の患者の正常な組織の障害を改善するための手段が、明らかに必要である。そのような改善を与えるための以前の方法は、患者に望ましくない副作用を及ぼすことがしばしばある化学薬剤を患者に投与することを含んでいる。

0002

発明の要約
本発明は、癌を有し放射線療法を受けている動物の正常な細胞の放射線障害は、多価不飽和オメガ−3脂肪酸類アルギニンとの混合物を補充した食餌を用いて動物を強化することで低減できるという発見前提とする。

0003

好適な実施例の詳細な説明
本発明によれば、癌を有する動物、特に愛玩動物における放射線療法の有害な影響を低減する方法が、そのような治療を受ける動物に、栄養素としてオメガ−6脂肪酸類を含むフード組成物であって、乾物ベースで約2.5〜約7.5%のオメガ−3脂肪酸類と約2.0〜約3.5%のアルギニンとを含み、フード中のオメガ−3脂肪酸対オメガ−6脂肪酸の重量比は約0.3:1〜3.5:1の範囲内であるようにフードの栄養素含量を補充したフード組成物を供給することで得られる。

0004

本方法において使用するフード組成物の栄養素含量は、乾物ベースで約27〜約35%の脂肪乾物で約15〜約27%の炭水化物とを含むのが本発明の実施において特に有利であり、本明細書において使用する「乾物ベース」という用語は、水分を除去した後のフード製品の栄養素含量を意味する。このタイプのフード組成物は、同時係属特許出願USSN 08/544,421に開示されており、この組成物は、癌を有する動物における代謝障害重症度を軽減するのに有効である。しかしながら従来技術は、癌を有する動物にこのフード組成物を供給して代謝障害を低減することと、そのようなフードを供給されたそのような動物が放射線療法にさらされた場合の正常な皮膚及び粘膜の細胞の障害の低減と、の間の関連を提供していない。

0005

本発明は一般に、ドライ入りまたは中間水ペットフード製品を含む全ての形態のペットフードに適用されることを意図したものであり、こうした用語はペットフード配合及び製造の当業者には理解されるように、こうしたフードは従来、必須栄養成分としてオメガ−6脂肪酸類を含む。

0006

本発明のペットフード組成物は、タンパク、脂肪若くは炭水化物成分または製品形態のいかなる特定のリストによっても限定されることを意図しておらず、というのはこれらは、所望の糧食の栄養バランス並びにペットフード製造業者にとっての入手可能性に完全に依存するからである。一般に、栄養のバランスをとるための成分(nutritionally balancing ingredient)の例えばビタミン類ミネラル類及びその他同様なものの他に、本発明のフード組成物は、水分含量約10〜約90重量%、好ましくは約65〜約75重量%を有し、下記の表Iに列記する栄養素含量を有するように配合される。

0007

表I
栄養素栄養素含量%(乾物ベース)
炭水化物約15〜約27
タンパク質約35〜約48
脂肪約27〜約35
オメガ−6脂肪酸類約2.0〜約6.0
オメガ−3脂肪酸類 約2.5〜約7.5
アルギニン約2.0〜約3.5
栄養のバランスをとるための物質の例えば 約0.4〜約1.0
ビタミン類(A、B1、B2、B6、E)
及びミネラル類(Ca、P、Na、K、
Mg、Fe、Cl)
放射線療法による細胞障害の改善に本発明が適用可能であるような範囲において必要要件である要素は、栄養素としてオメガ−6多価不飽和脂肪酸類を含む栄養的にバランスのとれたペットフード組成物中に、上記の表Iに指定する割合で、オメガ−3多価不飽和脂肪酸類とアルギニンとの混合物が存在することである。

0008

本発明のペットフード組成物を製造するために使用する脂肪及び炭水化物栄養素を、フード源としての肉、肉副産物、他の動物性タンパク質源及び穀粒のような成分によって供給してよい。肉が意味するのは、山羊、及び他の哺乳類の肉並びに家禽及びである。肉副産物としては、限定するものではないが、腎臓、脳、肝臓、並びに内容物を除去した及び腸が挙げられる。加えて、肉、肉副産物、及び他の動物性タンパク質源混合物は、本発明のペットフード中に使用するのに適している。栄養素成分はまた、様々な量の穀粒の例えば小麦トウモロコシ大麦及び米並びに繊維質増量材(fibrous bulking material)の例えばセルロースビートパルプ落花生殻または大豆繊維を含んでよい。

0009

本発明の方法の実施において有用な典型的な缶入りドッグフード製品は、以下の諸成分の混合物から製造する:
表II
成分 重量%
水 25〜30
肺、ビーフ肺葉40〜45
肝臓6〜10
鶏肉5〜8
米 4〜8
魚油(オメガ−3及びオメガ−6脂肪酸源) 5〜8
セルロース0.5〜2
ビーフパルプ0.5〜2
無機塩類炭酸カルシウム酸化鉄クエン酸カリウム) 0.5〜2
アルギニン0.2〜0.6
ビタミン類0.01〜0.2
タウリン0.02〜0.2
ミネラル類0.01〜0.2
本発明の実施において有用なペットフード製品を製造する際には、オメガ−6多価不飽和脂肪酸類が本ペットフード製品中に乾物ベースで約2.0〜約6.0%の濃度で存在する場合に、オメガ−3多価不飽和脂肪酸類の濃度は、本発明の動物用フード製品中に乾物ベースで約2.5〜約7.5%、好ましくは乾物ベースで約7.0〜約7.5%の濃度で存在するように栄養素組成を調節する。

0010

オメガ−3及びオメガ−6多価不飽和脂肪酸類を、魚油類の例えばメンヘーデン、サバニシンアンチョビー及びサケによって提供するのが最も便利であり、これらは全て、かなりのレベルのオメガ−3及びオメガ−6多価不飽和脂肪酸類を有する。オメガ−3多価不飽和脂肪酸類であるC20:5エイコサペンタエン酸及びC22:6ドコサヘキサエン酸は魚油の典型的なものであり、一緒になって、魚油の約25〜38重量%を占める。オメガ−6多価不飽和脂肪酸類としてはリノール酸及びアラキドン酸が挙げられ、これらは、魚油中により少ない濃度、一般に約10重量%未満存在する。

0011

本発明のペットフード製品には、乾物ベースで約2.0〜約3.5%、好ましくは乾物ベースで約3.0〜約3.5%のアルギニンを含むようにアルギニンを補充する。配合物の加工の最中に、例えば、本ペットフードの諸成分の混合の最中及び混合の後に、本発明のペットフード製品のアルギニン及び魚油成分を本フード製品中に取り入れる。こうした成分の分配は、従来の手段によって成し遂げることができる。

0012

本ペットフード中に他の添加剤を必要に応じて含めてよい。こうした他の添加剤としては、香味料、ビタミン類、ミネラル類、着色料及びこれらの混合物が挙げられる。こうした添加剤は、栄養のためと美味にするために加える。適切な量は当業者であれば容易に決定できる。しかしながら、こうした成分を通常約5%まで使用する。このカテゴリー内の成分を例示すると、酸化鉄、塩化ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、及び他の食用塩類、香味料、ビタミン類、ミネラル類並びに着色料が挙げられる。

0013

本発明の実施に従って製造されるペットフード製品を、挽いた動物及び家禽のタンパク性組織と残りの諸成分とを混合することで製造し、残りの諸成分としては、魚油類、アルギニン、穀粒並びに栄養のバランスをとるための他の成分及び特殊目的添加剤の例えばビタミン及びミネラル混合物、無機塩類、セルロース及びビートパルプ増量剤及びその他同様なものが挙げられる。加工に十分な水も加える。諸成分をブレンドしながら加熱するのに適した容器を使用する。

0014

成分混合物の加熱を任意の適切な方法で、例えば、直接スチームインジェクションによってまたは熱交換器を備える容器を使用することによって達成してよい。最後の成分を加えた後に、約70°F〜約140°Fの範囲にわたる温度に混合物を加熱する。この範囲外の温度は許容可能であるが、他の加工助剤を使用しなければ工業的には実用的でないかもしれない。適切な温度に加熱すると、材料は濃厚液体の形態になる。この濃厚な液体生成物を次に缶に充填する。蓋をし、容器をハーメチックシールする。次いで、内容物を殺菌するように設計された従来の装置中にシール済み缶を置く。この殺菌は通常、正確な温度と配合とによって決まる適切な時間の間、230°Fを超える温度に加熱することで成し遂げられる。

0015

本発明の完全な理解のために、ペットフード組成物という用語は一般に、愛玩動物のための単独のフード摂取を提供するような市販の栄養的にバランスのとれたペットフードに適用されることを意図したものであることを理解するべきである。

0016

以下の実施例は、本発明の具体的であるが限定するものではない実施例を説明することを意図したものである。
実施例
ペットフード製品の製造
本発明の実施において有用なペットフード製品を製造するために、下記の表IIIに列記する諸成分の混合物をブレンドし、混合物を135°Fに15分間加熱し、続いて110°Fで缶に充填して濃厚な液体を形成し、これを缶詰にし、250°Fで83分間殺菌した。

0017

表III
ペットフード製品の成分組成
成分ポンド/100ポンド
肺、ビーフ 44.00
水 26.12
肝臓、豚肉8.00
米、パーボイルド 6.00
メンヘーデン魚油(I) 5.75
鶏肉、機械的に除骨 5.50
天然香料* 1.50
セルロース1.00
ビーフパルプ1.00
クエン酸カリウム0.50
L−アルギニン0.30
炭酸カルシウム0.10
ビタミン混合物** 0.08
ミネラル混合物*** 0.05
タウリン0.05
べんがら0.03
塩化コリン0.02
合計 100.00
*Applied Food Biotechnologiesから入手可能
**Roche Animal Health and Nutritionから入手可能
***J. M. Huber Corporationから入手可能

(I)メンヘーデン油****の脂肪酸組成脂肪酸のwt%

パルミチン酸(16:0) 16.2
パルミトレイン酸(16:1) 11.6
ステアリン酸(18:0) 2.9
オレイン酸(18:1) 10.9
リノール酸(18:2) 1.2
リノレン酸(18:3) 1.6
オクタデカテトラエン酸(18:4) 3.2
エイコサペンタエン酸(20:5) 14.1
ドコサヘキサエン酸(22:6) 11.9
エイコサン酸(20:1) 1.3
アラキドン酸(20:4) 1.7
ドコサペンタエン酸(22:5) 2.4
****Zapata Protein, Inc.から市販されている。脂肪酸濃度<1%のものは含めない。

0018

示した表IIIの諸成分から製造しかつレトルト殺菌済みのペットフード製品を分析したところ、表IVに記録するように、以下の諸成分が存在することが示された:
表IV
ペットフード製品の栄養素組成
栄養素 重量%乾物%
水分 71.6 N/A
タンパク質10.7 37.8
脂肪9.3 32.6
炭水化物6.1 21.4
繊維、粗 1.0 3.5
灰分 1.3 4.7
カルシウム0.15 0.54
リン0.14 0.49
ナトリウム0.08 0.28
カリウム0.30 1.1
マグネシウム0.01 0.04
塩化物0.11 0.41
オメガ−6多価不飽和脂肪酸0.6 2.3
オメガ−3多価不飽和脂肪酸 2.07 7.3
アルギニン0.89 3.2
癌を有し放射線療法を受けている犬に供給した場合の、正常な皮膚及び粘膜の細胞の障害の低減における表IVに説明したフード組成物の効果を決定するために、組織学的に確認された鼻腔悪性腫瘍形成を有する12匹の犬を、ある州立大学の比較腫瘍学ユニットから抜き取った患者集団から逐次選択した。犬が悪液質であるかまたは研究のための選択の前の30日のうちに化学療法外因性ステロイド、若くは麻酔法を受けていた場合には、こうした犬をこの研究から除外した。加えて、併発疾患の例えば腎不全肝硬変内分泌疾患、肥満症、または高カルシウム血症を有する犬は除外した。

0019

全ての犬は、二重無作為配置の研究に加わり、「食餌1」及び「食餌2」と呼ばれる2種の食餌のうちの一方の供給を受けた。こうした食餌は等カロリーでであり、6.1kJの代謝エネルギー/gを提供した。各犬には、この研究に含まれる2種の食餌のうちの一方の等カロリー量維持エネルギー必要量(kcal=2[70重量kg0.75])のみを供給した。食餌1は、表IVに説明したような本発明の成分組成を有した。対照食餌である食餌2は、食餌1中に存在するメンヘーデン魚油及びアルギニン成分の代わりに大豆油を用い、従って食餌2は、食餌1よりも低いレベルのオメガ−3脂肪酸類及びアルギニンを含んだ以外は食餌1と同一だった。評価期間は、放射線療法開始前ベースラインの1週間(「0日」と呼ぶ)、放射線療法開始から7日後、並びに放射線療法終了後21日及び42日だった。

0020

評価期間にわたって患者から抜き取った血液中のオメガ−3及びオメガ−6脂肪酸類の血清脂肪酸濃度を、下記の表Vに記録する。
表V
血清脂肪酸濃度
経過時間(単位は日)
0 7 21 42
オメガ3脂肪酸類血清濃度(umol/L)
・ドコサヘキサエン酸(C22:6)
食餌1 1.95 21.13 18.70 22.81
食餌2 3.96 5.16 3.48 3.66
・エイコサペンタエン酸(C20:5)
食餌1 1.03 17.95 18.0 25.93
食餌2 1.16 0.80 1.02 1.10
オメガ−6脂肪酸類
・リノール酸(C18:2)
食餌1 73.92 34.45 31.26 25.96
食餌2 62.84 88.32 69.12 58.26
表Vに記録するデータは、本発明の食餌である食餌1を供給された犬は、ベースライン(0日)と及び食餌2を供給された犬と比較して、有意に(p<0.001)高い血清レベルのオメガ−3多価不飽和脂肪酸類であるドコサヘキサエン酸(C22:6)及びエイコサペンタエン酸(C20:5)と;濃度の低下したオメガ6多価不飽和脂肪酸であるリノール酸(C18:2)と;を有することを示す。

0021

下記の表VI及びVIIに報告するように、血清オメガ−3多価不飽和脂肪酸類であるドコサヘキサエン酸(C22:5)及びエイコサペンタエン酸(C20:5)のレベルの上昇は、炎症性メディエーターのより低い組織濃度に有意に(p=ゼロとの差の有意性)関連することが確定した。炎症性メディエーターのレベルは、皮膚と粘膜との障害の減少の生化学的証拠を提供する。

0022

食餌1及び食餌2が放射線障害の改善に及ぼす効果を評価するために検討した研究パラメータは、高(300cGy)及び低(200cGy)1日放射線量の領域の皮膚及び口腔粘膜から採取した6mmのパンチ生検材料によって評価した炎症性メディエーターであるプロスタグランジンE2(PGE2)、11−デヒドロトロンボキサンB2(11DTXB2)の生成、並びに組織学スコアであり、下記の表VI〜VIIに記録する。

0023

下記の表VIは、患者の唇内側(口腔粘膜)から採取した試料中の、炎症性メディエーターであるPGE2及び11DTXB2(炎症の生化学的マーカー)の存在を記録する。
表VI
血清脂肪酸類と口腔粘膜の炎症性メディエーターとの順位相関
口腔粘膜の
炎症性メディエーター
オメガ−3脂肪酸類 PGE2 11DTXB2
・ドコサヘキサエン酸(C22:6)相関係数-0.11299 -0.15750
p 0.2313 0.0942
・エイコサペンタエン酸(C20:5) 相関係数 -0.22354 -0.21390
p 0.0168 0.0223
オメガ−6脂肪酸類
・リノール酸(C18:2) 相関係数 0.04855 0.31450
p 0.6079 0.0007
表VIに記録するデータは、オメガ−3多価不飽和脂肪酸類であるドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸の負の相関、すなわち、試料中に存在するオメガ−3脂肪酸レベルが高い程、患者が直面する炎症は低いことを示す。データはさらに、オメガ−6脂肪酸であるリノール酸の正の相関、すなわち、オメガ−6多価不飽和脂肪酸レベルが高い程、メディエーターレベルが高く、患者が直面する炎症は高いことを示す。

0024

下記の表VIIは、患者の皮表から採取した試料中の、炎症性メディエーターであるPGE2及び11DTXB2の存在を記録する。
表VII
血清脂肪酸類と皮膚の炎症性メディエーターとの順位相関。
皮膚の
炎症性メディエーター
オメガ−3脂肪酸類 PGE2 11DTXB2
・ドコサヘキサエン酸(C22:6)相関係数-0.13259 -0.16783
p 0.01596 0.0769
・エイコサペンタエン酸(C20:5) 相関係数 -0.2729 -0.16456
p 0.0040 0.0829
オメガ−6脂肪酸類
・リノール酸(C18:2) 相関係数 0.15504 0.23658
p 0.0995 0.0120
表VIIに記録するデータは、高いレベルのオメガ−3脂肪酸類であるエイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸を用いた患者においては、炎症性メディエーターの皮膚濃度は、順位相関によって有意に低いことを示す。より低い濃度の炎症性メディエーターは、放射線療法の急性副作用を改善する際に役割を果たすと考えられている。

0025

下記の表VIIIに記録するデータは、血清ドコサヘキサエン酸及びエイコサペンタエン酸レベルはまた、口腔粘膜の障害の減少の組織学的証拠に有意に関連することを示す。エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の血清濃度は、粘膜領域内の細胞厚さと正に相関することが確定し、エイコサペンタエン酸(p=0.0171)及びドコサヘキサエン酸(p=0.0241)だった。

0026

表VIII
血清脂肪酸類と口腔粘膜細胞の組織学スコアとの順位相関。
口腔粘膜細胞の
組織学スコア
オメガ−3脂肪酸類
・ドコサヘキサエン酸(C22:6)相関係数0.25664
p 0.0171
・エイコサペンタエン酸(C20:5) 相関係数 0.24314
p 0.0241
オメガ−6脂肪酸類
・リノール酸(C18:2) 相関係数 -0.13776
p 0.2059
表VIIIに記録するデータは、総合最高のエイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸血清濃度を有する患者は、粘膜領域内の細胞層厚さの最良の組織学スコアを有することを示しており、これは粘膜炎の低減に対処するものであると、従って、放射線療法を受けている患者のクオリティオブライフを改良すると考えられている。

0027

臨床成績採点スキーム(clinical performance-scoring scheme)を使用して、放射線療法を受けている上記の癌患者のクオリティオブライフをさらに評価し、このスキームにおいてより低いスコアはより良好な臨床成績を示す。表IXに示すように、血清エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸は、臨床成績状況と有意な負の順位相関を有し、すなわち、試料中に存在するオメガ−3脂肪酸レベルが高い程、臨床成績採点スキームのスコアは低く、より良好な臨床成績を示している。

0028

表IX
血清脂肪酸類と臨床成績状況との順位相関。
臨床成績
オメガ−3脂肪酸類
・ドコサヘキサエン酸(C22:6)相関係数-0.36840
p 0.0139
・エイコサペンタエン酸(C20:5) 相関係数 -0.31893
p 0.0349
オメガ−6脂肪酸類
・リノール酸(C18:2) 相関係数 0.22244
p 0.1467
表V〜VIIIに記録したデータを得た分析の手順を下記に説明する。
脂肪酸の分析
脂肪酸類は、Ohta A, Mayo M C, Kramer N, LandsWE. Rapid analysis of fatty acids in plasma lipids. Lipids 1990; 25: 742-747に説明するように、Zicker et alの手順に従って分析した。
組織病理学
口腔粘膜及び皮膚の、コンピュータ化治療計画によって決定した低(200cGy)及び高(300cGy)放射線量を受けている領域内で、6mmのBaker’s生検パンチを用いて生検用に採取をした。生検は、治療の前の1週間、治療開始から1日後、治療開始から7日後、治療の終り、及び治療終了後21日に実行した。1人の病理学者が、細胞層厚さに関して組織病理学的に組織を評価した。
炎症性メディエーターの分析
低及び高放射線量を受けている領域の口腔粘膜及び皮膚を、組織病理学の場合と同じようにして得、−80℃で凍結させた。凍結した試料を清浄ガラススライド上に置き、解凍が起きる前に小さな断片に切り分けた。切り分けた断片を4mlのプラスチック培養管に移し、2mlの低温酢酸エチルを加えた。試料を次に最高速度の設定で1分間均質化し、その間、試料及び培養管を氷浴中に置いた。次いで試料及び培養管をホモジナイザーから取り出し、ホモジナイザーの先端を1mlの低温の酢酸エチルを用いて濯いだ。濯ぎ液と試料を合わせた。培養管にアルミニウム箔を用いて蓋をし、氷浴中に30分間置いた。氷浴中に30分置いた後に管に蓋をし、500gで10分間、5℃で遠心分離した。全ての上澄みを除去し、新たな4mlのプラスチック培養管中に入れた。窒素ガスの遅い流れを用いて酢酸エチルを試料から蒸発させた。湯浴(30℃)を使用して乾燥を促進した。試料残留分を500ulのEIA緩衝液(Caymen, Ann Arbor,MI)中に再懸濁した。試料を窒素ガスで覆い、−80℃で保管した。酵素免疫測定法キット(Caymen, Ann Arbor, MI)を用いて、プロスタグランジンE2及び11−デヒドロ−トロンボキサンB2に関して試料を分析した。

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