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技術 ドコサヘキサエン酸生成ヤロウィア・リポリティカ(YARROWIALIPOLYTICA)株

出願人 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
発明者 ダムド,ハワード・ジーギリーズ,ピーター・ジヨンマクール,ダニエル・ジヨセフピカタジオ,スチーブン・ケイラギアンテイ,ジエイムズ・ジヨンスー,ツイシオングヤダブ,ナレンドラ・エスツアング,ホンシアングズー,クイン・クンセイプ,ジヨン・イー
出願日 2005年11月3日 (13年10ヶ月経過) 出願番号 2007-540127
公開日 2008年6月19日 (11年3ヶ月経過) 公開番号 2008-520193
状態 特許登録済
技術分野 微生物、その培養処理 特定動物用飼料 飼料(2)(一般) 乳製品 食品の着色及び栄養改善 突然変異または遺伝子工学 食用油脂 微生物による化合物の製造 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性 非環式または炭素環式化合物含有医薬 脂肪類、香料
主要キーワード 製品部門 絶対標準 特定間隔 海水生物 炭素含有源 特別号 代替え品 延長ステップ
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2008年6月19日)のものです。
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図面 (20)

課題・解決手段

油画分の5.6%を超えるドコサヘキサエン酸(ω−3多価不飽和脂肪酸であるDHA)を生成できる油性酵母ヤロウィアリポリティカ(Yarrowia lipolytica)の組換え株について記述される。この株は、異種のデサチュラーゼエロンガーゼ、およびアシルトランスフェラーゼ発現する様々なキメラ遺伝子を含んでなり、場合により様々な天然デサチュラーゼおよびアシルトランスフェラーゼノックアウトを含んでなり、DHAの合成および高蓄積を可能にする。生産宿主細胞について特許請求され、前記宿主細胞内でDHAを生成する方法についても特許請求される。

概要

背景

ドコサヘキサエン酸(DHA、cis−4,7,10,13,16,19−ドコサヘキサエン酸、C22:6ω−3)は、脳機能発育、機能性発達、および健康的維持に必須であり、乳児期から老齢に至るまで必要とされる(非特許文献1)。DHA欠乏症は、胎児アルコール症候群注意欠陥多動性障害嚢胞性線維症フェニルケトン尿症単極性うつ病攻撃的敵意、および副腎白質萎縮症と関係がある。対照的にDHAの摂取増大は、炎症性疾患(例えば関節リウマチ)、タイプII糖尿病高血圧アテローム性動脈硬化鬱病心筋梗塞血栓症、ある種の癌において、そしてアルツハイマー疾患などの変性障害発症の予防のために有益であり、または好ましい効果を有することが示されている。

(例えばサケマスサバ)はこの長鎖脂肪酸高濃度で自然に含有するため、それらは重要なDHA源である。豊富な研究に基づいて[(非特許文献2)でレビューされる]、米国心臓協会、全米コレステロール教育プログラム世界保健機関、欧州心臓学会議、米国糖尿病協会、および英国栄養科学諮問パネルは、いずれも心臓保護効果のために毎週2回の魚の摂取を推奨する(各摂取は約450mg/日のDHAおよびエイコサペンタエン酸(EPA、C20:5ω−3)当量を提供する)。このようにして、DHAは機能性食品幼児栄養、バルク栄養、および動物の健康に関連する多様な製品に組み込まれる。

ドコサペンタエン酸DPA、C22:5ω−3)の生理学的機能についてはなお未知であるが、この脂肪酸はDHAの代謝前駆物質であり、鎖長延長を通じたEPAのすぐ下流の生成物である。DPAはまた、魚油中に含有されることが知られているが、含有量は極めて低い。DPAの唯一既知の機能は、医薬品を脳に輸送するキャリアとしてのその有用性である(特許文献1)。しかしDHA欠乏代償としてDPAが増大することが知られているので、DPAは動物の体内生理学役割を果たしているかもしれないことが予想される(非特許文献3)(非特許文献4)(非特許文献5)。したがってDPAおよびDHAのどちらも重要なω−3脂肪酸として考慮しなくてはならない。当業者はDHAに向けたここでの教示が、DPAが将来望ましい生成物になれば、その生産にもおしなべて適用でき適切であることを認識するであろう。

DHAは異なるタイプの魚油および海洋プランクトン中に自然に見られるが、このω−3脂肪酸の供給は高まる需要を満たすのに十分でないことが予期される。魚油は高度に不均一な組成を有し(したがってDHAを濃縮するための大規模な精製を要する)、不快な味および臭いを有し(除去を経済的に困難にし、油を食物成分として許容できなくする)、重金属汚染物質の環境的生物濃縮および入手可能性の変動を被りやすい(天候、疾患または魚の乱獲のため)。

魚油の代替物として、DHAはまた微生物的にも生成できる。一般に微生物油生産は、適切な培養培地中でDHAを自然に合成できる適切な微生物を培養して、(通常の細胞代謝過程で起きる)油合成をさせることを伴い、発酵培地からの微生物の分離、および細胞内油回収のための処理が続く。利用する特定微生物に基づいて、多数の異なるプロセスが存在する[例えば、シゾキトリウム(Schizochytrium)種(特許文献2)(特許文献3)、ウルケニア(Ulkenia)(特許文献4)、シュードモナス(Pseudomonas)種YS−180(特許文献5)、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属株LFF1(特許文献6)、クリプテコジニウムコーニイ(Crypthecodinium cohnii)(特許文献7)(非特許文献6)(非特許文献7)、エミリアニア(Emiliania)種(特許文献8)1993年、およびジャポノキトリウム(Japonochytrium)種(ATCC#28207)(特許文献9)1989年]。さらに次の微生物もDHAを生成する能力を有することが知られている。ビブリオマリナス(Vibrio marinus)(深海から単離された細菌、ATCC#15381)と、微細藻類キクテラクリティカ(Cyclotella cryptica)およびイソクリシスガルバナ(Isochrysis galbana)と、スラウストキトリウム・アウレウム(Thraustochytrium aureum)(ATCC#34304)(非特許文献8)およびATCC#28211、ATCC#20890、およびATCC#20891と命名されたスラウストキトリウム(Thraustochytrium)種などの有鞭毛真菌。そしてこれらのプロセスのいくつかは様々な制限の結果として工業的商品化には適応できないが、DHAの商業的生産のために少なくとも3つの次の異なる発酵プロセスがある。DHASCOTM生産のためのC.コーニイ(cohnii)の発酵メリーランド州コロンビアのマーテックバイオサイエンス社(Martek Biosciences Corporation(Columbia,MD))、以前にDHAGoldとして知られていた油の生産のためのシゾキトリウム(Schizochytrium)種の発酵(マーテック・バイオサイエンス社(Martek Biosciences Corporation)、およびDHactiveTM生産のためのウルケニア(Ulkenia)種の発酵(ドイツ国フランクフルトニュートリノバ(Nutrinova(Frankfurt,Germany))。これらの成功にもかかわらず、発酵は微生物それ自身の自然の能力に依存するために、これらの各方法には、油の収率を実質的に改善できず、または生成された油組成物の特性を調節できないという欠点がある。

したがって組換え手段を使用したDHAの微生物生産は、天然微生物源からの生成に比べていくつかの利点を有することが予期される。例えば宿主中への新しい生合成経路の導入によって、および/または望まれない経路の抑止によって、宿主の天然由来微生物脂肪酸プロフィール改変し、それによって所望PUFA(またはその抱合形態)の生成レベルの増大をもたらし、望まれないPUFAの生成を低減することができるので、油生成に好ましい特性を有する組換え微生物を使用できる。第2に組換え微生物は、特異的用途を有するかもしれない特定形態でPUFAを提供できる。そして、最終的に培養条件を調節することで、とりわけ微生物的発現酵素特定基質源を提供することで、または望まれない生化学的経路を抑止するための化合物の添加/遺伝子操作によって、微生物油生産を操作できる。したがって例えばその他のPUFA下流または上流生成物の顕著な蓄積なしに、このようにして生成されたω−3対ω−6脂肪酸比率を修正し、または特定のPUFA(例えばDHA)生成を操作することが可能である。

まず、そして、DHAの微生物的生成は中間脂肪酸、EPAの合成を必要とする。ほとんどの微生物的に生成されたDHAは、(主に高等植物藻類コケ、真菌、線形動物、およびヒトに見られる)Δ6デサチュラーゼエロンガーゼ経路を通じて合成され、そこでは1.)Δ12デサチュラーゼの作用によってオレイン酸がLAに変換され、2.)場合によりΔ15デサチュラーゼの作用によってLAがALAに変換され、3.)Δ6デサチュラーゼの作用によってLAがGLAに変換され、および/またはALAがSTAに変換され、3.)C18/20エロンガーゼの作用によってGLAがDGLAに変換され、および/またはSTAがETAに変換され、3.)Δ5デサチュラーゼの作用によってDGLAがARAに変換され、および/またはETAがEPAに変換され、および4.)場合によりΔ17デサチュラーゼの作用によってARAがEPAに変換される(図1)。しかしEPA生合成のための代案のΔ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路がユーグレナ種などのいくつかの生物で作動し、そこではそれがC20PUFA形成のための支配的経路である(非特許文献9、特許文献10および非特許文献10)。この経路では上述のように、1.)Δ9エロンガーゼによってLAおよびALAがEDAおよびETrAにそれぞれ変換され、2.)Δ8デサチュラーゼによってEDAおよびETrAがDGLAおよびETAにそれぞれ変換され、3.)DGLAおよびETAが最終的にEPAに変換される。EPA合成に際して、C20/22エロンガーゼは基質のDPAへの変換に関与し、Δ4デサチュラーゼによる不飽和化がそれに続いてDHAが生じる。

文献は、様々な比率のω−3/ω−6PUFA生合成経路がサッカロミセスセレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)(非油性酵母)に導入されるいくつかの最近の例を報告する。具体的には(非特許文献11)はリノレン酸の合成を報告し、(Knutzon)らに付与された(特許文献11)はリノール酸(LA)、γ-リノレン酸(GLA)、ALA、およびステアリドン酸(STA)の生産を実証した。(非特許文献12)はEPAの生産について述べ、(非特許文献13)はDHA(全脂肪酸の3.8%、EPAを基質として供給)を初めて生成した。しかしこれらの成功にもかかわらず、商業的量のDHA(すなわち全脂肪酸に対して5〜30%を超える)の経済的生産を可能にする複雑な代謝操作は報告されていない。さらにこのような操作のための宿主生物の最適の選択に関わる相当な矛盾が存在する。

最近、ピカタッジョ(Picataggio)ら、特許文献12および同時係属出願である特許文献13は、ARA、EPAおよびDHAなどのPUFAの生成のための好ましいクラスの微生物としての油性酵母、具体的にはヤロウィアリポリティカ(Yarrowia lipolytica)(以前はカンジダリポリチカ(Candida lipolytica)として分類された)の有用性を探求した。油性酵母は自然に油合成および蓄積ができる酵母として定義され、油蓄積は細胞乾燥重量の約80%に達することができる。これらの生物におけるω−6およびω−3脂肪酸生成の自然の欠如にもかかわらず(自然に生成されるPUFAは18:2脂肪酸(そしてそれほど多くはないが18:3脂肪酸)に限定されるので)、ピカタッジョ(Picataggio)ら、特許文献9は、比較的単純な遺伝子操作アプローチを利用したY.リポリティカ(lipolytica)における(全脂肪酸の)1.3%のARAおよび1.9%のEPAの生成、かつより複雑な代謝エンジニアリングを使用した28%以下のEPAの生成を実証した。しかしながら、特定の宿主生物におけるDHAの経済的な商業生産を可能にする、同様の研究は実施されていない。

本出願人は、Δ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路を使用して、全油画分中に5%を超えるDHAを生成できるヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の様々な株を操作することで、既述の問題を解決した。この油性酵母におけるDHA生産性をさらに増強する追加的代謝操作および発酵方法、ならびにΔ9エロンガーゼ/Δ8 デサチュラーゼ経路を通じてDHAの生産を可能にする方法(それによってGLAを欠くDHA含有油を生成する)を提供する。

特公昭61(1986)−204136号公報
米国特許第5,340,742号明細書
米国特許第6,582,941号明細書
米国特許第6,509,178号明細書
米国特許第6,207,441号明細書
米国特許出願公開第2004/0161831 A1号明細書
米国特許出願公開第2004/0072330 A1号明細書
特開平5(1993)−308978号公報
特開平1(1989)−99588号公報
国際公開第00/34439号パンフレット
米国特許第6,136,574号明細書
国際公開第2004/101757号パンフレット
米国特許仮出願第60/624812号明細書
ホロクス(Horrocks),L.A.およびY.K.イョオ(Yeo)著、「Pharmacol.Res.」40(3):211〜225頁(1999年)
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ケンドリック(Kendrick)著、「Lipids」,27:15ページ(1992年)
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ドマーグ(Domergue),F.ら著、「Eur.J.Biochem.」269:4105〜4113頁(2002年)
レイラ(Pereira),S.L.ら著、「Biochem.J.」384:357〜366頁(2004年)

概要

全油画分の5.6%を超えるドコサヘキサエン酸(ω−3多価不飽和脂肪酸であるDHA)を生成できる油性酵母ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の組換え株について記述される。この株は、異種のデサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびアシルトランスフェラーゼを発現する様々なキメラ遺伝子を含んでなり、場合により様々な天然デサチュラーゼおよびアシルトランスフェラーゼノックアウトを含んでなり、DHAの合成および高蓄積を可能にする。生産宿主細胞について特許請求され、前記宿主細胞内でDHAを生成する方法についても特許請求される。

目的

豊富な研究に基づいて[(非特許文献2)でレビューされる]、米国心臓協会、全米コレステロール教育プログラム、世界保健機関、欧州心臓学会議、米国糖尿病協会、および英国栄養科学諮問パネルは、いずれも心臓保護効果のために毎週2回の魚の摂取を推奨する(各摂取は約450mg/日のDHAおよびエイコサペンタエン酸(EPA、C20:5ω−3)当量を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
2件
牽制数
3件

この技術が所属する分野

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請求項1

a)Δ6デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、b)C18/20エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、c)Δ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、d)Δ17デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子e)C20/22エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびf)Δ4デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子。のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア(Yarrowia)種を含んでなるドコサヘキサエン酸生成のための組換え生産宿主細胞

請求項2

a)Δ15デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、b)Δ6デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、c)C18/20エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、d)Δ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子e)C20/22エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびf)Δ4デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子。のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア(Yarrowia)種を含んでなるドコサヘキサエン酸生成のための組換え生産宿主細胞。

請求項3

a)Δ9エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、b)Δ8デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、c)Δ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、d)Δ17デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子e)C20/22エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびf)Δ4デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子。のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア(Yarrowia)種を含んでなるドコサヘキサエン酸生成のための組換え生産宿主細胞。

請求項4

a)Δ15デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、b)Δ9エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、c)Δ8デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、d)Δ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子e)C20/22エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびf)Δ4デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子。のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア(Yarrowia)種を含んでなるドコサヘキサエン酸生成のための組換え生産宿主細胞。

請求項5

遺伝子プールが、場合によりΔ12デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子を含んでなる請求項1、2、3または4のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。

請求項6

背景ヤロウィア(Yarrowia)種が、Δ12デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている請求項5に記載の組換え生産宿主。

請求項7

前記ω−3/ω−6脂肪酸生合成経路遺伝子の少なくとも1つが、配列番号210〜221よりなる群から選択される核酸配列を有するプロモーター配列の制御下にある請求項1、2、3または4のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。

請求項8

前記Δ12デサチュラーゼが、配列番号29、31、33、35、36、37、39、41、43、45、46、48〜50よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項5に記載の組換え生産宿主。

請求項9

前記Δ6デサチュラーゼが配列番号2および5よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記C18/20エロンガーゼが配列番号23および26よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項1または2のどちらかに記載の組換え生産宿主細胞。

請求項10

前記Δ9エロンガーゼが配列番号70および23よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記Δ8デサチュラーゼが配列番号78、80、および82よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項3または4のどちらかに記載の組換え生産宿主細胞。

請求項11

前記Δ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子が、酵素基質として、a)リノレン酸およびジホモ−γ−リノレン酸、b)α−リノレン酸およびエイコサテトラエン酸、およびc)リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、α−リノレン酸、およびエイコサテトラエン酸よりなる群から選択される少なくとも2つの脂肪酸を結合する二機能Δ5/Δ6デサチュラーゼポリペプチドをコードする請求項1、2、3または4のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。

請求項12

前記二機能Δ5/Δ6デサチュラーゼポリペプチドが、配列番号15および18よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項11に記載の組換え生産宿主。

請求項13

前記Δ5デサチュラーゼが、配列番号7、9、12、15、および18よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記C20/22エロンガーゼが配列番号101および103よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記Δ4デサチュラーゼが配列番号105および107よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1、2、3、または4のいずれか一項に記載の組換え生産宿主細胞。

請求項14

前記Δ17デサチュラーゼが、配列番号20に記載のアミノ酸配列を有する請求項1または3のどちらかに記載の組換え生産宿主細胞。

請求項15

遺伝子プールが、場合によりΔ15デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子を含んでなる請求項1または3のどちらかに記載の組換え生産宿主細胞。

請求項16

前記Δ15デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子が、酵素基質としてオレイン酸およびリノール酸の双方を結合する二機能Δ15/Δ12デサチュラーゼポリペプチドをコードする請求項2または4のいずれかに記載の組換え生産宿主。

請求項17

前記二機能Δ15/Δ12デサチュラーゼポリペプチドが、配列番号52に記載のアミノ酸配列を有する請求項16に記載の組換え生産宿主。

請求項18

前記Δ15デサチュラーゼが、配列番号52、54、54、56、58、60、62、および64〜68よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項2または4のいずれかに記載の組換え生産宿主。

請求項19

遺伝子プールが、場合によりa)Δ9デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、b)C16/18エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびc)C14/16エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子よりなる群から選択されるω−3/ω−6脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる請求項1、2、3または4のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。

請求項20

前記C16/18エロンガーゼが配列番号84、87、および95よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記C14/16エロンガーゼが配列番号98に記載のアミノ酸配列を有する請求項19に記載の組換え生産宿主。

請求項21

遺伝子プールが、場合によりa)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT1)、b)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT2)、c)リン脂質:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(PDAT)、d)アシル−CoA:1−アシリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼLPCAT)、e)グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、およびf)リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)よりなる群から選択されるアシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子を含んでなる請求項1、2、3または4のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。

請求項22

前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT1)が配列番号123、および125〜129よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT2)が配列番号131、133、135、および137よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記リン脂質:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(PDAT)が配列番号118に記載のアミノ酸配列を有し、前記グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)が配列番号139に記載のアミノ酸配列を有し、前記リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)が配列番号109、113、および116よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、前記アシル−CoA:1−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ(LPCAT)が配列番号121に記載のアミノ酸配列を有する請求項21に記載の組換え生産宿主。

請求項23

a)Δ6デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、b)C18/20エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、c)Δ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、d) Δ17デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、e)C20/22エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、f)Δ4デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、g)C16/18エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、および、 h)Δ12デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア(Yarrowia)種を含んでなる、ドコサヘキサエン酸生産のための組換え生産宿主細胞であって、背景ヤロウィア(Yarrowia)種が、オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ(Ura3)、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(Leu2)、アシル−coAオキシダーゼ(Pox3)、アシル−CoAオキシダーゼ(Pox2)、Δ12デサチュラーゼ、およびリパーゼ1(Lip1)よりなる群から選択される酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている組換え生産宿主細胞。

請求項24

a)i.Δ6デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびC18/20エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびΔ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびΔ17デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびC20/22エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびΔ4デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、ii.Δ9エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびΔ8デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびΔ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびΔ17デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびC20/22エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびΔ4デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、iii.Δ15デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、Δ6デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびC18/20エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびΔ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびC20/22エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびΔ4デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、iv.Δ15デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、Δ9エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびΔ8デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびΔ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびC20/22エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、およびΔ4デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子よりなる群から選択される少なくとも1組の遺伝子、およびb)i.Δ12デサチュラーゼ、ii.Δ9デサチュラーゼ、iii.C14/16エロンガーゼ、iv.C16/18エロンガーゼよりなる群から選択される酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子、およびc)(i)DGAT1、DGAT2、およびPDATよりなる群から選択されるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、(ii)アシル−CoA:1−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ(LPCAT)、(iii)グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、(iv)リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、(v)ホスホリパーゼC、および(vi)ホスホリパーゼA2よりなる群から選択される酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア(Yarrowia)種を含んでなる、ドコサヘキサエン酸生成のための組換え生産宿主細胞であって、(1)背景ヤロウィア(Yarrowia)種が、Δ12デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするあらゆる天然遺伝子を欠いており、(2)背景ヤロウィア(Yarrowia)種が、リパーゼ1(Lip1−)、ペルオキシソームアシルCoAオキシダーゼACO3(Pox3−)、アシル−CoAオキシダーゼ2(Pox2−)、オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ(Ura3−)、サッカピンデヒドロゲナーゼ(Lys5−)、リパーゼ2(Lip2−)、およびイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(Leu2−)よりなる群から選択される酵素をコードするあらゆる天然遺伝子を欠いている組換え生産宿主細胞。

請求項25

宿主全脂肪酸の%として少なくとも約5%のドコサヘキサエン酸を含んでなる微生物油を生成する請求項1、2、3または4のいずれか一項に記載の組換え生産宿主。

請求項26

宿主がドコサヘキサエン酸を含んでなる微生物油を生成し、微生物油があらゆるγ−リノール酸を欠いている請求項25に記載の組換え生産宿主。

請求項27

a)請求項1、2、3、または4のいずれか一項に記載の生産宿主を培養して、ドコサヘキサエン酸を含んでなる微生物油が生成され、b)場合によりステップ(a)の微生物油を回収することを含んでなるドコサヘキサエン酸を含んでなる微生物油の生成方法

請求項28

請求項27に記載の方法によって生成される微生物油。

請求項29

油が少なくとも約5%のドコサヘキサエン酸を含有する請求項28に記載の微生物油。

請求項30

油があらゆるγ−リノール酸を欠いている請求項28に記載の微生物油。

請求項31

油がリノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノール酸、アラキドン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選択される脂肪酸を含んでなる請求項28に記載の混合油

請求項32

請求項27に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる食品

請求項33

類似食品、肉製品穀物製品ベーカリー食品スナック食品、および乳製品よりなる群から選択される請求項32に記載の食品。

請求項34

請求項27に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる、メディカルフード栄養補助食品乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品

請求項35

請求項27に記載の方法によって生成される有効量の微生物油を含んでなる動物飼料

請求項36

ペットフード反芻動物飼料家禽飼料、および水産養殖飼料よりなる群から選択される請求項35に記載の動物飼料。

請求項37

有効量の微生物油を含んでなり、場合により請求項1、2、3または4のいずれか一項に記載の組換え宿主を含んでなる酵母バイオマスを含んでなる動物飼料。

請求項38

酵母バイオマスが、タンパク質、脂質、炭水化物ビタミンミネラル、および核酸よりなる群から選択される飼料栄養素を含んでなる請求項37に記載の動物飼料。

請求項39

請求項27に記載の方法によって生成される微生物油と食品とを組み合わせることを含んでなるドコサヘキサエン酸で栄養強化された食品の製造方法。

請求項40

メディカルフード、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品の製造方法であって、請求項27に記載の方法によって生成される微生物油と製品とを組み合わせることを含んでなるドコサヘキサエン酸で製品が栄養強化される方法。

請求項41

請求項27に記載の方法によって生成される微生物油と動物飼料とを組み合わせることを含んでなるドコサヘキサエン酸で栄養強化された動物飼料の製造方法。

請求項42

請求項37に記載の動物飼料と飼料栄養素を含んでなる酵母バイオマスとを組み合わせることを含んでなるドコサヘキサエン酸を含んでなる動物飼料を飼料栄養素で栄養強化する方法。

請求項43

飼料栄養素が、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、および核酸よりなる群から選択される請求項42に記載の方法。

請求項44

ヒトまたは動物によって消費可能または使用可能な形態でドコサヘキサエン酸を含有する請求項27に記載の方法によって生成される微生物油を提供することを含んでなるエイコサペンタエン酸強化された栄養補助食品をヒト、動物または水産養殖生物に提供する方法。

請求項45

ドコサヘキサエン酸の欠乏症処置するために、ヒトまたは動物によって消費可能または使用可能な形態でドコサヘキサエン酸を含有する請求項27に記載の方法によって生成される微生物油を提供することを含んでなる動物またはヒトにおけるドコサヘキサエン酸の欠乏症の処置方法

請求項46

ATCC名称ATCC______を有する、ドコサヘキサエン酸生産に有用な組換え生産宿主ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowialipolytica)Y3000。

関連出願との関係

0001

本願は、その内容全体を参照によって本明細書に引用する、2004年11月4日に出願された米国仮特許出願第60/624812号明細書の利益を主張する。

技術分野

0002

本発明はバイオテクノロジー分野にある。より具体的には本発明は、ドコサヘキサエン酸(ω−3多価不飽和脂肪酸)を高濃度で効率的に生成できる、油性酵母ヤロウィアリポリティカ(Yarrowia lipolytica)の組換え株に関する。

背景技術

0003

ドコサヘキサエン酸(DHA、cis−4,7,10,13,16,19−ドコサヘキサエン酸、C22:6ω−3)は、脳機能発育、機能性発達、および健康的維持に必須であり、乳児期から老齢に至るまで必要とされる(非特許文献1)。DHA欠乏症は、胎児アルコール症候群注意欠陥多動性障害嚢胞性線維症フェニルケトン尿症単極性うつ病攻撃的敵意、および副腎白質萎縮症と関係がある。対照的にDHAの摂取増大は、炎症性疾患(例えば関節リウマチ)、タイプII糖尿病高血圧アテローム性動脈硬化鬱病心筋梗塞血栓症、ある種の癌において、そしてアルツハイマー疾患などの変性障害発症の予防のために有益であり、または好ましい効果を有することが示されている。

0004

(例えばサケマスサバ)はこの長鎖脂肪酸を高濃度で自然に含有するため、それらは重要なDHA源である。豊富な研究に基づいて[(非特許文献2)でレビューされる]、米国心臓協会、全米コレステロール教育プログラム世界保健機関、欧州心臓学会議、米国糖尿病協会、および英国栄養科学諮問パネルは、いずれも心臓保護効果のために毎週2回の魚の摂取を推奨する(各摂取は約450mg/日のDHAおよびエイコサペンタエン酸(EPA、C20:5ω−3)当量を提供する)。このようにして、DHAは機能性食品幼児栄養、バルク栄養、および動物の健康に関連する多様な製品に組み込まれる。

0005

ドコサペンタエン酸DPA、C22:5ω−3)の生理学的機能についてはなお未知であるが、この脂肪酸はDHAの代謝前駆物質であり、鎖長延長を通じたEPAのすぐ下流の生成物である。DPAはまた、魚油中に含有されることが知られているが、含有量は極めて低い。DPAの唯一既知の機能は、医薬品を脳に輸送するキャリアとしてのその有用性である(特許文献1)。しかしDHA欠乏代償としてDPAが増大することが知られているので、DPAは動物の体内生理学役割を果たしているかもしれないことが予想される(非特許文献3)(非特許文献4)(非特許文献5)。したがってDPAおよびDHAのどちらも重要なω−3脂肪酸として考慮しなくてはならない。当業者はDHAに向けたここでの教示が、DPAが将来望ましい生成物になれば、その生産にもおしなべて適用でき適切であることを認識するであろう。

0006

DHAは異なるタイプの魚油および海洋プランクトン中に自然に見られるが、このω−3脂肪酸の供給は高まる需要を満たすのに十分でないことが予期される。魚油は高度に不均一な組成を有し(したがってDHAを濃縮するための大規模な精製を要する)、不快な味および臭いを有し(除去を経済的に困難にし、油を食物成分として許容できなくする)、重金属汚染物質の環境的生物濃縮および入手可能性の変動を被りやすい(天候、疾患または魚の乱獲のため)。

0007

魚油の代替物として、DHAはまた微生物的にも生成できる。一般に微生物油生産は、適切な培養培地中でDHAを自然に合成できる適切な微生物を培養して、(通常の細胞代謝過程で起きる)油合成をさせることを伴い、発酵培地からの微生物の分離、および細胞内油回収のための処理が続く。利用する特定微生物に基づいて、多数の異なるプロセスが存在する[例えば、シゾキトリウム(Schizochytrium)種(特許文献2)(特許文献3)、ウルケニア(Ulkenia)(特許文献4)、シュードモナス(Pseudomonas)種YS−180(特許文献5)、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属株LFF1(特許文献6)、クリプテコジニウムコーニイ(Crypthecodinium cohnii)(特許文献7)(非特許文献6)(非特許文献7)、エミリアニア(Emiliania)種(特許文献8)1993年、およびジャポノキトリウム(Japonochytrium)種(ATCC#28207)(特許文献9)1989年]。さらに次の微生物もDHAを生成する能力を有することが知られている。ビブリオマリナス(Vibrio marinus)(深海から単離された細菌、ATCC#15381)と、微細藻類キクテラクリティカ(Cyclotella cryptica)およびイソクリシスガルバナ(Isochrysis galbana)と、スラウストキトリウム・アウレウム(Thraustochytrium aureum)(ATCC#34304)(非特許文献8)およびATCC#28211、ATCC#20890、およびATCC#20891と命名されたスラウストキトリウム(Thraustochytrium)種などの有鞭毛真菌。そしてこれらのプロセスのいくつかは様々な制限の結果として工業的商品化には適応できないが、DHAの商業的生産のために少なくとも3つの次の異なる発酵プロセスがある。DHASCOTM生産のためのC.コーニイ(cohnii)の発酵メリーランド州コロンビアのマーテックバイオサイエンス社(Martek Biosciences Corporation(Columbia,MD))、以前にDHAGoldとして知られていた油の生産のためのシゾキトリウム(Schizochytrium)種の発酵(マーテック・バイオサイエンス社(Martek Biosciences Corporation)、およびDHactiveTM生産のためのウルケニア(Ulkenia)種の発酵(ドイツ国フランクフルトニュートリノバ(Nutrinova(Frankfurt,Germany))。これらの成功にもかかわらず、発酵は微生物それ自身の自然の能力に依存するために、これらの各方法には、油の収率を実質的に改善できず、または生成された油組成物の特性を調節できないという欠点がある。

0008

したがって組換え手段を使用したDHAの微生物生産は、天然微生物源からの生成に比べていくつかの利点を有することが予期される。例えば宿主中への新しい生合成経路の導入によって、および/または望まれない経路の抑止によって、宿主の天然由来微生物脂肪酸プロフィール改変し、それによって所望PUFA(またはその抱合形態)の生成レベルの増大をもたらし、望まれないPUFAの生成を低減することができるので、油生成に好ましい特性を有する組換え微生物を使用できる。第2に組換え微生物は、特異的用途を有するかもしれない特定形態でPUFAを提供できる。そして、最終的に培養条件を調節することで、とりわけ微生物的発現酵素特定基質源を提供することで、または望まれない生化学的経路を抑止するための化合物の添加/遺伝子操作によって、微生物油生産を操作できる。したがって例えばその他のPUFA下流または上流生成物の顕著な蓄積なしに、このようにして生成されたω−3対ω−6脂肪酸比率を修正し、または特定のPUFA(例えばDHA)生成を操作することが可能である。

0009

まず、そして、DHAの微生物的生成は中間脂肪酸、EPAの合成を必要とする。ほとんどの微生物的に生成されたDHAは、(主に高等植物藻類コケ、真菌、線形動物、およびヒトに見られる)Δ6デサチュラーゼエロンガーゼ経路を通じて合成され、そこでは1.)Δ12デサチュラーゼの作用によってオレイン酸がLAに変換され、2.)場合によりΔ15デサチュラーゼの作用によってLAがALAに変換され、3.)Δ6デサチュラーゼの作用によってLAがGLAに変換され、および/またはALAがSTAに変換され、3.)C18/20エロンガーゼの作用によってGLAがDGLAに変換され、および/またはSTAがETAに変換され、3.)Δ5デサチュラーゼの作用によってDGLAがARAに変換され、および/またはETAがEPAに変換され、および4.)場合によりΔ17デサチュラーゼの作用によってARAがEPAに変換される(図1)。しかしEPA生合成のための代案のΔ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路がユーグレナ種などのいくつかの生物で作動し、そこではそれがC20PUFA形成のための支配的経路である(非特許文献9、特許文献10および非特許文献10)。この経路では上述のように、1.)Δ9エロンガーゼによってLAおよびALAがEDAおよびETrAにそれぞれ変換され、2.)Δ8デサチュラーゼによってEDAおよびETrAがDGLAおよびETAにそれぞれ変換され、3.)DGLAおよびETAが最終的にEPAに変換される。EPA合成に際して、C20/22エロンガーゼは基質のDPAへの変換に関与し、Δ4デサチュラーゼによる不飽和化がそれに続いてDHAが生じる。

0010

文献は、様々な比率のω−3/ω−6PUFA生合成経路がサッカロミセスセレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)(非油性酵母)に導入されるいくつかの最近の例を報告する。具体的には(非特許文献11)はリノレン酸の合成を報告し、(Knutzon)らに付与された(特許文献11)はリノール酸(LA)、γ-リノレン酸(GLA)、ALA、およびステアリドン酸(STA)の生産を実証した。(非特許文献12)はEPAの生産について述べ、(非特許文献13)はDHA(全脂肪酸の3.8%、EPAを基質として供給)を初めて生成した。しかしこれらの成功にもかかわらず、商業的量のDHA(すなわち全脂肪酸に対して5〜30%を超える)の経済的生産を可能にする複雑な代謝操作は報告されていない。さらにこのような操作のための宿主生物の最適の選択に関わる相当な矛盾が存在する。

0011

最近、ピカタッジョ(Picataggio)ら、特許文献12および同時係属出願である特許文献13は、ARA、EPAおよびDHAなどのPUFAの生成のための好ましいクラスの微生物としての油性酵母、具体的にはヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)(以前はカンジダリポリチカ(Candida lipolytica)として分類された)の有用性を探求した。油性酵母は自然に油合成および蓄積ができる酵母として定義され、油蓄積は細胞乾燥重量の約80%に達することができる。これらの生物におけるω−6およびω−3脂肪酸生成の自然の欠如にもかかわらず(自然に生成されるPUFAは18:2脂肪酸(そしてそれほど多くはないが18:3脂肪酸)に限定されるので)、ピカタッジョ(Picataggio)ら、特許文献9は、比較的単純な遺伝子操作アプローチを利用したY.リポリティカ(lipolytica)における(全脂肪酸の)1.3%のARAおよび1.9%のEPAの生成、かつより複雑な代謝エンジニアリングを使用した28%以下のEPAの生成を実証した。しかしながら、特定の宿主生物におけるDHAの経済的な商業生産を可能にする、同様の研究は実施されていない。

0012

本出願人は、Δ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路を使用して、全油画分中に5%を超えるDHAを生成できるヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の様々な株を操作することで、既述の問題を解決した。この油性酵母におけるDHA生産性をさらに増強する追加的代謝操作および発酵方法、ならびにΔ9エロンガーゼ/Δ8 デサチュラーゼ経路を通じてDHAの生産を可能にする方法(それによってGLAを欠くDHA含有油を生成する)を提供する。

0013

特公昭61(1986)−204136号公報
米国特許第5,340,742号明細書
米国特許第6,582,941号明細書
米国特許第6,509,178号明細書
米国特許第6,207,441号明細書
米国特許出願公開第2004/0161831 A1号明細書
米国特許出願公開第2004/0072330 A1号明細書
特開平5(1993)−308978号公報
特開平1(1989)−99588号公報
国際公開第00/34439号パンフレット
米国特許第6,136,574号明細書
国際公開第2004/101757号パンフレット
米国特許仮出願第60/624812号明細書
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課題を解決するための手段

0014

本発明は、ドコサヘキサエン酸(DHA)を生成するように組換えられた生産宿主、該宿主を生成する方法、および本発明の組換え宿主によって生成された微生物油を含有する食品に関する。

0015

したがって、一実施形態において、本発明は、
a)Δ6デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
b)C18/20エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
c)Δ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
d)Δ17デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子
e)C20/22エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、および
f)Δ4デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア(Yarrowia)種を含んでなる、エイコサペンタエン酸生成のための組換え生産宿主細胞を提供する。

0016

別の実施形態では、本発明は、
a)Δ15デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
b)Δ6デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
c)C18/20エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
d)Δ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子
e)C20/22エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、および、
f)Δ4デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア(Yarrowia)種を含んでなる、ドコサヘキサエン酸生成のための組換え生産宿主細胞を提供する。

0017

他の実施形態では、本発明は、
a)Δ9エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
b)Δ8デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
c)Δ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
d)Δ17デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子
e)C20/22エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、および、
f)Δ4デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア(Yarrowia)種を含んでなる、ドコサヘキサエン酸生成のための組換え生産宿主細胞を提供する。

0018

別の実施形態では、本発明は、
a)Δ15デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
b)Δ9エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
c)Δ8デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、
d)Δ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子
e)C20/22エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、および、
f)Δ4デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子
のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路の遺伝子を含んでなる遺伝子プールを含んでなる、背景ヤロウィア(Yarrowia)種を含んでなる、ドコサヘキサエン酸生成のための組換え生産宿主細胞を提供する。

0019

好ましい実施形態では、本発明の生産宿主は、場合によりΔ12デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子を含んでなる。別の好ましい実施形態では、本発明は全脂肪酸の%として少なくとも約5%のドコサヘキサエン酸を有する微生物油を生成する組換え生産宿主を提供する。

0020

別の実施形態では、本発明は、
a)本発明の生産宿主を培養し、ドコサヘキサエン酸を含んでなる微生物油が生成されるステップと、
b)場合によりステップ(a)の微生物油を回収するステップ
を含んでなるドコサヘキサエン酸を含んでなる微生物油の生産方法を提供する。

0021

別の実施形態では、本発明は、本発明の方法および生産宿主によって作られる微生物油を提供する。好ましい実施形態では、本発明の微生物油はDHAを含有するが、あらゆるγ−リノール酸を欠いている。

0022

別の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって生成された微生物油の有効量を含んでなる食品を提供する。代案としては本発明は、本発明の方法によって生成された微生物油の有効量を含んでなる、メディカルフード栄養補助食品乳児用調製粉乳、および医薬品よりなる群から選択される製品を提供する。

0023

代案としては、本発明の方法によって生成された微生物油の有効量を含んでなる本発明動物飼料を提供する。

0024

別の実施形態では、本発明は、ヒトまたは動物によって消費可能または使用可能な形態でドコサヘキサエン酸を含有する、本発明の方法によって生成された微生物油を提供するステップを含んでなる、エイコサペンタエン酸で強化されたヒト、動物または水産養殖生物栄養補助食品を提供する方法を提供する。

0025

代案としては本発明は、ドコサヘキサエン酸欠乏症を処置するヒトまたは動物によって消費可能または使用可能な形態でドコサヘキサエン酸を含有する、本発明の方法によって生成された微生物油を提供するステップを含んでなる、動物またはヒトにおいて前記欠乏症を処置する方法を提供する。

0026

生物学的寄託
以下の命名、登録番号、および寄託日を有する以下の生物材料バージニア州マナッサス(Manassa,VA)20110−2209ユニバーシティ・ブールヴァード10801の米国微生物系統保存機関(ATCC)に寄託した。

0027

0028

本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明によって、本発明をより完全に理解できるであろう。

0029

以下の配列は、37C.F.R.§1.821〜1.825(「ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件配列規則」)を満たし、世界知的所有権機関(WIPO)標準ST.25(1998)およびEPOおよびPCTの配列表要件(規則5.2および49.5(aの2)、および実施細則第208号および附属書C)に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、37C.F.R.§1.822で述べられる規則に従う。

0030

列番号1〜153、および210〜221は、表1で同定されるプロモーター、遺伝子またはタンパク質(またはその断片)をコードするORFである。

0031

0032

0033

0034

0035

0036

0037

配列番号154および156−209は表2に同定されるプラスミドである。

0038

0039

0040

配列番号155は、ヤロウィア(Yarrowia)種中で最適に発現される遺伝子のコドン最適化翻訳開始部位に対応する。

0041

配列番号222は、真菌Δ15およびΔ12デサチュラーゼに見られるHis Box 1モチーフに対応する。

0042

配列番号223は、真菌タンパク質を有するΔ15デサチュラーゼ活性を示すモチーフに対応するのに対し、配列番号224は真菌タンパク質を有するΔ12デサチュラーゼ活性を示すモチーフに対応する。

0043

配列番号225〜238は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)プロモーター領域を増幅するのに使用される、プライマーYL211、YL212、YL376、YL377、YL203、YL204、GPAT−5−1、GPAT−5−2、ODMW314、YL341、ODMW320、ODMW341、27203−F、および27203−Rにそれぞれ対応する。

0044

配列番号239〜242はそれぞれ、リアルタイム分析のために使用されるオリゴヌクレオチドYL−URA−16F、YL−URA−78R、GUS−767F、およびGUS−891Rである。

0045

配列番号243は、W497L突然変異を含んでなる突然変異AHAS遺伝子である。

0046

配列番号244〜249は、W497L突然変異を含んでなる突然変異ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)AHAS遺伝子の合成のために使用される410、411、412、413、414、および415にそれぞれ対応するプライマーである。

0047

配列番号250〜281は、合わせるとスラウストキトリウム・アウレウム(Thraustochytrium aureum)Δ4デサチュラーゼのコドン最適化コード領域全体を含んでなる、16対のオリゴヌクレオチドに対応する(すなわち、D4−1A、D4−1B、D4−2A、D4−2B、D4−3A、D4−3B、D4−4A、D4−4B、D4−5A、D4−5B、D4−6A、D4−6B、D4−7A、D4−7B、D4−8A、D4−8B、D4−9A、D4−9B、D4−10A、D4−10B、D4−11A、D4−11B、D4−12A、D4−12B、D4−13A、D4−13B、D4−14A、D4−14B、D4−15A、D4−15B、D4−16A、およびD4−16B)。

0048

配列番号282〜289は、コドン最適化Δ4デサチュラーゼ遺伝子合成中のPCR増幅のために使用される、プライマーD4−1F、D4−4R、D4−5F、D4−8R、D4−9F、D4−12R、D4−13、およびD4−16Rにそれぞれ対応する。

0049

配列番号290および291は、コドン最適化Δ4デサチュラーゼ遺伝子の合成中に使用される、プライマーYL251およびYL252にそれぞれ対応する。

0050

配列番号292〜307は、合わせるとI.ガルバナ(galbana)Δ9エロンガーゼのコドン最適化コード領域全体を含んでなる、8対のオリゴヌクレオチドに対応する(すなわちそれぞれIL3−1A、IL3−1B、IL3−2A、IL3−2B、IL3−3A、IL3−3B、IL3−4A、IL3−4B、IL3−5A、IL3−5B、IL3−6A、IL3−6B、IL3−7A、IL3−7B、IL3−8A、およびIL3−8B)。

0051

配列番号308〜311は、コドン最適化Δ9エロンガーゼ遺伝子合成中のPCR増幅のために使用される、プライマーIL3−1F、IL3−4R、IL3−5F、およびIL3−8Rにそれぞれ対応する。

0052

配列番号312はpT9(1−4)で記述される417bpのNcoI/PstI断片であり、配列番号313はpT9(5−8)で記述される377bpのPstI/Not1断片である。

0053

配列番号314〜339は、合わせるとコドンミドリムシ(E.gracilis)Δ8デサチュラーゼの最適化コード領域全体を含んでなる13対のオリゴヌクレオチドに対応する(すなわちそれぞれD8−1A、D8−1B、D8−2A、D8−2B、D8−3A、D8−3B、D8−4A、D8−4B、D8−5A、D8−5B、D8−6A、D8−6B、D8−7A、D8−7B、D8−8A、D8−8B、D8−9A、D8−9B、D8−10A、D8−10B、D8−11A、D8−11B、D8−12A、D8−12B、D8−13A、およびD8−13B)。

0054

配列番号340〜347は、コドン最適化Δ8デサチュラーゼ遺伝子合成中のPCR増幅のために使用される、プライマーD8−1F、D8−3R、D8−4F、D8−6R、D8−7F、D8−9R、D8−10F、およびD8−13Rにそれぞれ対応する。

0055

配列番号348はpT8(1−3)で記述される309bpのNco/BgIII断片であり、配列番号349はpT8(4−6)で記述される321bpのBgIII/XhoI断片であり、配列番号350はpT8(7−9)で記述される264bpのXhoI/SacI断片であり、配列番号351は、pT8(10−13)で記述される369bpのSac1/Not1断片である。

0056

配列番号352および353は、pDMW255中のD8S−2合成中に使用されるプライマーODMW390およびODMW391にそれぞれ対応する。

0057

配列番号354および355は、実施例9で述べらるキメラD8S−1::XPRおよびD8S−2::XPR遺伝子である。

0058

配列番号356および357は、D8S−3合成中に使用されるプライマーODMW392およびODMW393に対応する。

0059

配列番号358および359は、ミドリムシ(Euglena gracilis)からのΔ8デサチュラーゼ増幅のために使用される、プライマーEg5−1およびEg3−3にそれぞれ対応する。

0060

配列番号360〜363は、Δ8デサチュラーゼクローン配列決定のために使用される、プライマーT7、M13−28Rev、Eg3−2、およびEg5−2にそれぞれ対応する。

0061

配列番号364は、D8S−3増幅のために使用されるプライマーODMW404に対応する。

0062

配列番号365は、D8S−3を含んでなる1272bpのキメラ遺伝子である。

0063

配列番号366および367は、クローンされたD8S−3遺伝子中で新しい制限酵素部位作り出すのに使用される、プライマーYL521およびYL522にそれぞれ対応する。

0064

配列番号368〜381は、D8SFを生成する部位特異的変異誘発反応で使用される、プライマーYL525、YL526、YL527、YL528、YL529、YL530、YL531、YL532、YL533、YL534、YL535、YL536、YL537、およびYL538にそれぞれ対応する。

0065

配列番号382は、Creリコンビナーゼ酵素によって認識されるLoxP遺伝子組換え部位に対応する。

0066

配列番号383および384は、プラスミドpY80の合成中にGPD::Fm1::XPR2を増幅するのに使用される、プライマー436および437にそれぞれ対応する、

0067

配列番号385〜388は、二機能Δ5/Δ6デサチュラーゼをクローンするのに使用される、プライマー475、477、478、および476にそれぞれ対応する。

0068

配列番号389および390は、部位特異的変異誘発によってプラスミドpY91MからプラスミドpY91Vを作り出すのに使用される、プライマー505および506にそれぞれ対応する。

0069

配列番号391〜393は、BDクローンテッククリエイタースマート(BD−Clontech Creator Smart))(登録商標cDNAライブラリーキットのプライマーである、スマート(SMART)IVオリゴヌクレオチド、CDSIII/3’PCRプライマー、および5’−PCRプライマーにそれぞれ対応する。

0070

配列番号394は、M.アルピナ(alpina)cDNAライブラリー配列決定のために使用されるM13順方向プライマーに対応する。

0071

配列番号395〜398および400〜401は、M.アルピナ(alpina)LPAAT2 ORFのクローニングのために使用される、プライマーMLPAT−F、MLPAT−R、LPAT−Re−5−1、LPAT−Re−5−2、LPAT−Re−3−1、およびLPAT−Re−3−2にそれぞれ対応する。

0072

配列番号399および402は、Y.リポリティカ(lipolytica)LPAAT1 ORFの5’(1129bp)および3’(938bp)領域にそれぞれ対応する。

0073

配列番号403および404は、「対照」プラスミドpZUF−MOD−1を創生するのために使用される、プライマーpzuf−mod1およびpzuf−mod2にそれぞれ対応する。

0074

配列番号405および406は、M.アルピナ(alpina)DGAT1 ORFのクローニングのために使用される、プライマーMACAT−F1およびMACAT−Rにそれぞれ対応する。

0075

配列番号407および408は、M.アルピナ(alpina)DGAT2 ORFのクローニングのために使用される、プライマーMDGAT−FおよびMDGAT−R1にそれぞれ対応する。

0076

配列番号409および410は、M.アルピナ(alpina)GPATを増幅する縮重PCRのために使用される、プライマーMGPAT−N1およびMGPAT−NR5にそれぞれ対応する。

0077

配列番号411〜413は、M.アルピナ(alpina)GPATの3’−末端増幅のために使用される、プライマーMGPAT−5N1、MGPAT−5N2、およびMGPAT−5N3にそれぞれ対応する、

0078

配列番号414および415は、クローンテック(Clontech)のユニバーサルゲノムウォーカーTMキットからのゲノム歩行のために使用されるゲノムウォーカーアダプターに対応する。

0079

配列番号416〜419は、ゲノム歩行で使用されるPCRプライマーであるMGPAT−5−1A、Adaptor−1(AP1)、MGPAT−3N1、およびNested Adaptor Primer 2(AP2)にそれぞれ対応する。

0080

配列番号420および421は、M.アルピナ(alpina)GPATを増幅するために使用される、プライマーmgpat−cdna−5およびmgpat−cdna−Rにそれぞれ対応する。

0081

配列番号422および423は、M.アルピナ(alpina)ELO3の3’−末端領域を単離するゲノム歩行のために使用される、プライマーMA Elong 3’1およびMA elong 3’2にそれぞれ対応する。

0082

配列番号424および425は、M.アルピナ(alpina)ELO3の5’−末端領域を単離するゲノム歩行のために使用される、プライマーMA Elong 5’1および4MA Elong 5’2にそれぞれ対応する。

0083

配列番号426および427は、M.アルピナ(alpina)cDNAから完全なELO3を増幅するために使用される、プライマーMA ELONG 5’ NcoI 3およびMA ELONG 3’NotI1にそれぞれ対応する。

0084

配列番号428および429は、Y.リポリティカ(lipolytica)YE2のコード領域を増幅するために使用される、プライマーYL597およびYL598にそれぞれ対応する。

0085

配列番号430および431は、Aco 3’ターミネーターを含有するNotI/PacI断片増幅するのに使用される、プライマーYL325およびYL326にそれぞれ対応する。

0086

配列番号432〜435は、Y.リポリティカ(lipolytica)YE1のコード領域を増幅するために使用される、プライマーYL567、YL568、YL569、およびYL570にそれぞれ対応する。

0087

配列番号436および437は、Y.リポリティカ(lipolytica)YE1のクローニング中の部位特異的変異誘発のために使用される、プライマーYL571およびYL572にそれぞれ対応する。

0088

配列番号438および439は、Y.リポリティカ(lipolytica)CPT1 ORFのクローニングのために使用される、プライマーCPT1−5’−NcoIおよびCPT1−3’−NotIにそれぞれ対応する。

0089

配列番号440および441は、S.セレヴィシエ(cerevisiae)ISC1 ORFのクローニングのために使用されるプライマーIsc1FおよびIsc1Rにそれぞれ対応する。

0090

配列番号442および443は、S.セレヴィシエ(cerevisiae)PCL1 ORF.のクローニングのために使用される、プライマーPcl1FおよびPcl1Rにそれぞれ対応する。

0091

配列番号444〜447は、Y.リポリティカ(lipolytica)DGAT2遺伝子の標的を定めた中断のために使用される、プライマーP95、P96、P97、およびP98にそれぞれ対応する。

0092

配列番号448〜450は、中断されたY.リポリティカ(lipolytica)DGAT2遺伝子の標的を定めた組み込みをスクリーニングするのに使用される、プライマーP115、P116、およびP112にそれぞれ対応する。

0093

配列番号451〜454は、Y.リポリティカ(lipolytica)PDAT遺伝子の標的を定めた中断のために使用される、プライマーP39、P41、P40、およびP42にそれぞれ対応する。

0094

配列番号455〜458は、中断されたY.リポリティカ(lipolytica)PDAT遺伝子の標的を定めた組み込みをスクリーニングするのに使用される、プライマーP51、P52、P37、およびP38にそれぞれ対応する。

0095

配列番号459および460は、Y.リポリティカ(lipolytica)DGAT1の単離のために使用される縮重プライマーであるP201およびP203としてそれぞれ同定される。

0096

配列番号461〜465は、Y.リポリティカ(lipolytica)中の推定上のDGAT1遺伝子の標的を定めた中断のためのターゲティングカセットの創生ために使用される、プライマーP214、P215、P216、P217、およびP219にそれぞれ対応する。

0097

配列番号466および467は、中断されたY.リポリティカ(lipolytica)DGAT1遺伝子の標的を定めた組み込みをスクリーニングするのに使用される、プライマーP226およびP227にそれぞれ対応する。

発明を実施するための最良の形態

0098

以下をはじめとする、本明細書で引用した全ての特許、特許出願、および公報は、引用することによりそれらの内容全体を組み込んだものとする。
米国特許出願第10/840478号明細書(2004年5月6日出願)、
米国特許出願第10/840579号明細書(2004年5月6日出願)、
米国特許出願第10/840325号明細書(2004年5月6日出願)、
米国特許出願第10/869630号明細書(2004年6月16日出願)、
米国特許出願第10/882760号明細書(2004年7月1日出願)、
米国特許出願第10/985109号明細書(2004年11月10日出願)、
米国特許出願第10/987548号明細書(2004年11月12日出願)、
米国仮特許出願第60/624812号明細書(2004年11月4日出願)、
米国特許出願第11/024545号明細書および米国特許出願第11/024544号明細書(2004年12月29日出願)、
米国仮特許出願第60/689031号明細書(2005年6月9日出願)、
米国特許出願第11/183664号明細書(2005年7月18日出願)、
米国特許出願第11/185301号明細書(2005年7月20日出願)、
米国特許出願第11/190750号明細書(2005年7月27日出願)、
米国特許出願第11/225354号明細書(2005年9月13日出願)、
米国特許出願第10/253,882号明細書(2005年10月19日出願)、および
米国特許出願第11/254,173号明細書(2005年10月19日出願)。
米国特許出願第10/840478号明細書(2004年5月6日出願)、
米国特許出願第10/840579号明細書(2004年5月6日出願)、
米国特許出願第10/840325号明細書(2004年5月6日出願)、
米国特許出願第10/869630号明細書(2004年6月16日出願)、
米国特許出願第10/882760号明細書(2004年7月1日出願)、
米国特許出願第10/985109号明細書(2004年11月10日出願)、
米国特許出願第10/987548号明細書(2004年11月12日出願)、
米国仮特許出願第60/624812号明細書(2004年11月4日出願)、
米国特許出願第11/024545号明細書および米国特許出願第11/024544号明細書(2004年12月29日出願)、
米国仮特許出願第60/689031号明細書(2005年6月9日出願)、
米国特許出願第11/183664号明細書(2005年7月18日出願)、
米国特許出願第11/185301号明細書(2005年7月20日出願)、
米国特許出願第11/190750号明細書(2005年7月27日出願)、
米国特許出願第11/225354号明細書(2005年9月13日出願)、
米国特許出願第10/253,882号明細書(2005年10月19日出願)
米国特許出願第11/254,173号明細書(2005年10月19日出願)
米国特許出願第10/253,882号明細書(2005年10月19日出願)
米国特許出願第11/254,173号明細書(2005年10月19日出願)

0099

主題発明に従って、本出願人は、5%を超えるドコサヘキサエン酸(DHA、22:6、ω−3)を生成できるヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)生産宿主株を提供する。この特定の多価不飽和脂肪酸(PUFA)の蓄積は、高レベル組換えのために、発現油性酵母宿主にΔ6デサチュラーゼ、C18/20エロンガーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、C20/22エロンガーゼ、および Δ4デサチュラーゼ活性をコードするタンパク質を含んでなる機能性ω−3/ω−6脂肪酸生合成経路を導入して達成される。したがってこの開示は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)を遺伝子操作して、DHAおよびその誘導体の商業生産を可能にできることを実証する。生成方法もまた特許請求される。

0100

主題発明には多くの用途がある。ここで開示される方法によって作られるPUFAまたはその誘導体は、食餌代用物、または栄養補給剤、特に乳児用調製粉乳として、静脈内栄養補給を受ける患者のために、または栄養不良を防止または処置するために使用できる。代案としては、正常な使用において受容者が所望量の栄養補助受け入れるように調合された調理油脂肪またはマーガリン中に精製されたPUFA(またはその誘導体)を組み込んでもよい。PUFAはまた、乳児用調製粉乳、栄養補給剤またはその他の食品に組み込んでもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としての用途があるかもしれない。場合により組成物薬学的用途(ヒトまたは獣医学)のために使用してもよい。この場合PUFAは、一般に経口投与されるが、例えば非経口的(例えば皮下、筋肉内または静脈内)、経直腸経膣、または局所的(例えば軟膏またはローション)など、それによってそれらが成功裏に吸収されるあらゆる経路によって投与できる。

0101

組換え手段によって生成されたPUFAをヒトまたは動物に補給することは、添加PUFAレベルならびにそれらの代謝子孫の増大をもたらすことができる。例えばDHAでの処置は、DHAのレベル増大だけでなく、エイコサノイド(すなわちプロスタグランジンロイコトリエントロンボキサン)などのDHAの下流生成物をもたらす。複雑な調節機序は、このような機序を防止、調節または克服して、個体中の特異的PUFAの所望レベルを達成するために、様々なPUFAを組み合わせ、または異なるPUFA抱合体を添加することを望ましくする。

0102

水産養殖飼料(すなわち乾燥飼料、半湿および湿潤飼料)は一般に栄養素組成物の少なくとも1〜2%がω−3および/またはω−6PUFAであることを必要とするので、代案の実施形態では、ここで開示される方法によって作られたPUFA、またはその誘導体をこれらの調合物合成において利用できる。

0103

定義
本開示中では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。

0104

読み取り枠」はORFと略記される。

0105

ポリメラーゼ連鎖反応」はPCRと略記される。

0106

「米国微生物系統保存機関」はATCCと略記される。

0107

「多価不飽和脂肪酸」はPUFAと略記される。

0108

ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」はDAG ATまたはDGATと略記される。

0109

リン脂質:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」はPDATと略記される。

0110

グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ」はGPATと略記される。

0111

リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ」はLPAATと略記される。

0112

アシル−CoA:1−アシリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ」は「LPCAT」と略記される.

0113

「アシル−CoA:ステロール−アシルトランスフェラーゼ」はARE2と略記される。

0114

ジアシルグリセロール」はDAGと略記される。

0115

トリアシルグリセロール」はTAGと略記される。

0116

「Co−酵素A」はCoAと略記される。

0117

ホスファチジルコリン」はPCと略記される。

0118

フザリウム・モニリフォルメ(Fusarium moniliforme)」という用語は「フザリウム・ベルチシリオイデス(Fusarium verticillioides」と同義である。

0119

「食品」という用語は、一般にヒトの消費に適したあらゆる食物を指す。典型的な食品としては、肉製品穀物製品ベーカリー食品スナック食品乳製品などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

0120

「機能性食品」という用語は、それが含有する伝統的栄養素を超えて健康上の利点を提供するかもしれないあらゆる変性食物または成分を含む、潜在的に健康的な製品を包含する食物を指す。機能性食品としては、ビタミンハーブ、および栄養補給食品で強化されたシリアルパンなどの食物および飲料が挙げられる。機能性食品は、その栄養価を超えて健康上の利点を提供する物質を含有し、そこでは物質は食物中に自然に存在し、または意図的に添加される。

0121

ここでの用法では「メディカルフード」という用語は、医師監督下で経腸的に消費または投与されるために調合され、医学的評価により広く認められている科学的原理に基づいて、独特栄養要求性確立されている疾患または病状の特異的食餌管理用である食物を指す[希少難病医薬法(21 U.S.C.360ee(b)(3))第5節(b)を参照されたい]。食物は以下の場合に限り「メディカルフード」である。(i)それが経口摂取またはチューブによる経腸栄養の手段による患者への部分的なまたは専用の給食のために、特別に調合され処理された製品である(その自然な状態で使用される天然由来食材とは対照的に)。(ii)それが治療的または慢性医療的必要性のために、通常の食材または特定の栄養素を経口摂取、消化、吸収、または代謝する能力が制限されたまたは損なわれた患者、またはその食餌管理が正常な食餌の修正のみでは達成できないその他の特別な医学的に判定された栄養要件を有する患者の食餌管理を対象とする。(iii)それが医学的評価によって判定された特異的疾患または症状から帰結する、ユニークな栄養要件の管理のために特に修正された栄養補給を提供する。(iv)それが医療的監督下で使用されることが意図される。および(v)それがとりわけメディカルフードの使用指示に関して繰り返し医療的ケアを必要とする、積極的な継続中の医療的監督を受けている患者のみを対象とすることが意図される。したがって栄養補助食品または従来の食物とは異なり、独特の栄養要件が確立されている疾患または症状の特定の食餌管理を意図するメディカルフードは、特定疾患または症状のための独特の栄養補給の提供に関して科学的に妥当効能書を有してもよい。メディカルフードは医学的監督の下で使用されるという要件によって、メディカルフードは、特別な食餌用途(例えば低アレルギー性食品)のためのより幅広カテゴリーの食物、および健康機能をうたう食物(例えば栄養補助食品)とは区別される。

0122

「医学的栄養物」という用語は、ここで定義されるようなメディカルフードであり、典型的に特別な食餌要件のために特にデザインされた強化飲料を指す。医学的栄養物は、一般に特定の病状または食餌条件に焦点を合わせた食餌組成物を含んでなる。市販医学的栄養物の例としては、エンシュア(Ensure)(登録商標)およびブースト(Boost)(登録商標)が挙げられるが、これに限定されるものではない。

0123

「医薬品」という用語は、ここでの用法では、米国で販売される場合に米連邦食品医薬品化粧品法の第505または505条によって規制される化合物または物質を意味する。

0124

「乳児用調製粉乳」という用語は、それがヒト母乳シミュレーションすると言う理由で、ヒト幼児による消費のためにだけデザインされた食物を意味する。典型的な乳児用調製粉乳の市販例としては、シミラック(Similac)(登録商標)、およびイソミル(Isomil)(登録商標)が挙げられるが、これに限定されるものではない。

0125

「栄養補助食品」という用語は、次のような製品を指す。(i)食餌に栄養補給することを意図し、したがって、従来の食物として、または食事または食餌の唯一のアイテムとして使用されない。(ii)1つもしくはそれ以上の食餌成分(例えばビタミン、ミネラル、ハーブまたはその他の植物性薬品アミノ酸、酵素、およびエキスをはじめとする)またはそれらの構成要素を含有する。(iii)丸薬カプセル錠剤、または液体として経口摂取することが意図される。(iv)栄養補助食品としてラベル表示される。

0126

「食物類似物」とは、肉、チーズミルクなどに関わらず、その食物対応物と似ているように製造された食物様製品であり、その対応物の外観、味、およびテクスチャを有することが意図される。したがって「食物」という用語は、ここでの用法では食物類似物もまた包含する。

0127

「水産養殖飼料」および「アクフィード」という用語は、水産養殖産業において天然飼料を栄養補給するまたは置き換え人造または人工餌配合飼料)を指す。したがってアクアフィードは、養殖魚および甲殻類(すなわちより安価な基本的食物魚種[例えばコイ、イズミダイ、およびナマズなどの淡水魚]および高級またはすき間市場用のより高価な換金物種[例えば主にエビ、サケ、マス、ハマチ、スズキ、タイ、およびハタなどの海産および通し回遊種]の双方)に有用な人工的に配合された飼料を指す。これらの配合飼料は、互いに補完して、水産養殖種のために栄養的に完全な食餌を形成する様々な割合のいくつかの成分から構成される。

0128

動物飼料」という用語は、家畜ペット農業家畜など)をはじめとする動物による消費、または例えば養魚業などの食物生産のために飼育される動物のみを意図した飼料を指す。

0129

「飼料栄養素」という用語は、本発明の組換え生産宿主を含んでなる酵母バイオマス由来であってもよい、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、および核酸などの栄養素を意味する。

0130

ここでの用法では「バイオマス」という用語は、商業的に顕著な量でEPAを生成する組換え生産宿主の発酵からの使用済酵母細胞物質を特に指す。

0131

「脂肪酸」という用語は、(より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが)約C12〜C22の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸アルカン酸)を指す。優勢な鎖長はC16〜C22の間である。脂肪酸の構造は単純な表記法ステム「X:Y」によって表され、ここでXは特定の脂肪酸中の炭素(C)原子総数であり、Yは二重結合の数である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」(または「PUFA」)、および「オメガ−6脂肪酸」(ω−6またはn−6)」対「オメガ−3脂肪酸」(ω−3またはn−3)の違いについてさらに詳しくは、国際公開第2004/101757号パンフレットで提供される。

0132

本開示においてPUFAを既述するのに使用される命名法を下の表3に示す。「略記法」と題された欄では、オメガ−参照システムが使用されて炭素数二重結合数、およびオメガ炭素(この目的では番号1)から数えて、オメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示唆する。表の残りは、ω−3およびω−6脂肪酸およびそれらの前駆物質の一般名、本願明細書全体で使用される略語、および各化合物化学名を要約する。

0133

0134

「高レベルEPA生成」という用語は、微生物宿主の総脂質中に少なくとも約5%のEPA、好ましくは総脂質中の少なくとも約10%のEPA、より好ましくは総脂質中の少なくとも約15%のEPA、より好ましくは総脂質中の少なくとも約20%のEPA、より好ましくは総脂質中の少なくとも約25〜30%のEPA、より好ましくは総脂質中の少なくとも約30〜35%のEPA、より好ましくは少なくとも約35〜40%、そして最も好ましくは総脂質中の少なくとも約40〜50%のEPAの生成を指す。EPAの構造的な形態は限定されず、したがって例えばEPAは総脂質中に遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で存在してもよい。

0135

「あらゆるGLAを欠く」という用語は、約0.1%に至る検出可能レベルを有する機器を使用してGC分析によって測定した場合における、微生物宿主の総脂質中のあらゆる検出可能なGLAの欠如を指す。

0136

必須脂肪酸」という用語は、生物が特定の必須脂肪酸を新規に(de novo)合成できず、生きるために経口摂取しなくてはならならない特定のPUFAを指す。例えば哺乳類は、必須脂肪酸LA(18:2、ω−6)およびALA(18:3、ω−3)を合成できない。その他の必須脂肪酸としては、GLA(ω−6)、DGLA(ω−6)、ARA(ω−6)、EPA(ω−3)、およびDHA(ω−3)が挙げられる。

0137

「微生物油」または「単細胞油」は、微生物(例えば藻類、油性酵母菌、および糸状菌)によって、それらの生涯において天然に生成される油である。「油」という用語は、25℃で液体であり、通常多価不飽和脂質である脂質物質を指す。対照的に「脂肪」という用語は、25℃で固形物であり、通常飽和である脂質物質を指す。

0138

リピッドディ」とは、通常、特定のタンパク質およびリン脂質単層に結合する脂肪滴を指す。これらの細胞小器官は、ほとんどの生物が中性脂質を輸送/貯蔵する部位である。リピッドボディは、TAG−生合成酵素を含有する小胞体ミクロドメインから発生すると考えられ、それらの合成およびサイズは、特定のタンパク質構成要素によって調節されているように見える。

0139

「中性脂質」とは、貯蔵脂肪および油として一般にリピッドボディの細胞に見られる脂質を指し、細胞pHでは脂質が荷電群を有さないことからこう呼ばれる。一般にこれらは完全に非極性で水に対する親和性がない。中性脂質とは、一般に脂肪酸とグリセロールのモノ−、ジ−、および/またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはTAG(または集合的にアシルグリセロール)とも称される。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出するためには、加水分解反応が起きなくてはならない。

0140

「トリアシルグリセロール」、「油」、および「TAG」という用語は、グリセロール分子とエステル化する3個の脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す(そしてこのような用語は、本開示の全体を通して区別なく使用される)。このような油は、長鎖PUFA、ならびにより短い飽和および不飽和脂肪酸、および鎖長のより長い飽和脂肪酸を含有できる。したがって「油生合成」は、一般に細胞におけるTAG合成を指す。

0141

「アシルトランスフェラーゼ」という用語は、アミノアシル基(EC2.3.1.−)以外の基の転移に関与する酵素を指す。

0142

「DAG AT」という用語は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(アシル−CoA−ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼまたはジアシルグリセロール−O−アシルトランスフェラーゼとしても知られる)(EC2.3.1.20)を指す。この酵素は、アシル−CoAおよび1,2−ジアシルグリセロールからTAGおよびCoAへの変換に関与する(したがってTAG生合成の最終段階に関与する)。DGAT1およびDGAT2の2つのDAG AT酵素ファミリーが存在する。前者のファミリーはアシル−CoA:コレステロールアシルトランスフェラーゼ(ACAT)遺伝子ファミリーと類似しており、後者のファミリーは関連性がない(ラルディサバル(Lardizabal)ら著、J.Biol.Chem.276(42):38862〜38869頁(2001年))。

0143

「PDAT」という用語は、リン脂質:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ酵素(EC2.3.1.158)を指す。この酵素は、リン脂質のsn−2位から1,2−ジアシルグリセロールのsn−3位へのアシル基転移に関与し、その結果リゾリン脂質およびTAGが得られる(したがってTAG生合成の最終段階に関与する)。この酵素はアシル−CoA−非依存性機序を通じてTAGを合成することで、DGAT(EC2.3.1.20)とは異なる。

0144

「ARE2」という用語は、アシル−CoA+ステロール=CoA+ステロールエステルの反応を触媒するアシル−CoA:ステロール−アシルトランスフェラーゼ酵素を指す(EC2.3.1.26、ステロール−エステルシンターゼ2酵素としてもまた知られている)。

0145

「GPAT」という用語は、gpat遺伝子によってコードされ、アシル−CoAおよびsn−グリセロール3−リン酸をCoAおよび1−アシル−sn−グリセロール3−リン酸に変換する(リン脂質生合成の第1のステップ)グリセロール−3−リン酸−O−アシルトランスフェラーゼ酵素(E.C.2.3.1.15)を指す。

0146

「LPAAT」という用語は、リゾホスファチジン酸−アシルトランスフェラーゼ酵素(EC2.3.1.51)を指す。この酵素は、CoAおよび1,2−ジアシル−sn−グリセロール3−リン酸(ホスファチジン酸)を生成する、1−アシル−sn−グリセロール3−リン酸(すなわちリゾホスファチジン酸)上へのアシル−CoA基の転移に関与する。文献はまた、アシル−CoA:1−アシル−sn−グリセロール−3−リン酸2−O−アシルトランスフェラーゼ、1−アシル−sn−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼおよび/または1−アシルグリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼ(AGATと略記される)としてのLPAATについても言及する。

0147

「LPCAT」という用語は、アシル−CoA:1−アシルリゾホスファチジル−コリンアシルトランスフェラーゼを指す。この酵素は、CoAとホスファチジルコリン(PC)間のアシル基交換に関与する。ここではそれはまた、CoAとリゾホスファチジン酸(LPA)をはじめとするその他のリン脂質間のアシル交換に関与する酵素も指す。

0148

「総脂質および油画分中のパーセント(%)PUFA」とは、これらの画分中の全脂肪酸に対するPUFAのパーセントを指す。「全脂質画分」または「脂質画分」という用語は、どちらも油性生物中の全脂質(すなわち中性および極性)の合計を指すので、ホスファチジルコリン(PC)画分、ホスファチジルエタノールアミン(PE)画分、およびトリアシルグリセロール(TAGまたは油)画分内に位置する脂質を含む。しかし「脂質」および「油」という用語は、本願明細書全体で同義的に使用される。

0149

「ホスファチジルコリン」または「PC」という用語は、細胞膜主要構成要素であるリン脂質を指す。PCの化学構造は、一般にコリン分子リン酸基、およびグリセロールを含んでなるとして記述でき、そこでは脂肪酸アシル鎖がR基として、グリセロール分子のsn−1およびsn−2位上に付着する。

0150

「PUFA生合成経路酵素」と言う用語は、Δ4デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、Δ15デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、Δ9デサチュラーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ9エロンガーゼ、C14/16エロンガーゼ、C16/18エロンガーゼ、C18/20エロンガーゼおよび/またはC20/22エロンガーゼをはじめとする、PUFAの生合成に関連する酵素(および前記酵素をコードする遺伝子)のいずれかを指す。「ω−3/ω−6脂肪酸生合成経路」という用語は、適切な条件下で発現されると、ω−3およびω−6脂肪酸のいずれかまたは双方の生成を触媒する酵素をコードする一組の遺伝子を指す。典型的にω−3/ω−6脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、以下の酵素のいくつかまたは全てをコードする。Δ12デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、C18/20エロンガーゼ、C20/22エロンガーゼ、Δ9エロンガーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、Δ15デサチュラーゼ、Δ9デサチュラーゼ、、およびΔ4デサチュラーゼ。代表的な経路は図1に示され、様々な中間体を経由するオレイン酸のDHAへの変換が提供され、ω−3およびω−6脂肪酸の双方が、共通の原料からどのように生成されてもよいかを実証する。経路は自然に2つの部分に別れ、1つの部分はω−3脂肪酸、別の部分はω−6脂肪酸のみを発生させる。ω−3脂肪酸のみを発生させる部分をここでω−3脂肪酸生合成経路と称するのに対し、ω−6脂肪酸のみを発生させる部分はここでω−6脂肪酸生合成経路と称する。

0151

「機能性」という用語は、ここでω−3/ω−6脂肪酸生合成経路に関する文脈で、経路中の遺伝子のいくつか(または全て)が、活性酵素を発現し、生体内(in vivo)触媒作用または基質変換をもたらすことを意味する。いくつかの脂肪酸生成物は、この経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とするので、「ω−3/ω−6脂肪酸生合成経路」または「機能性ω−3/ω−6脂肪酸生合成経路」は、上の段落で列挙される全遺伝子が必要とされることを暗示しないものとする。

0152

「ω−6Δ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路」という用語は、次の遺伝子を最低限含むDHA脂肪酸生合成経路を指す。Δ6デサチュラーゼ、C18/20エロンガーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、C20/22エロンガーゼ、およびΔ4デサチュラーゼ。「ω−3Δ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路」という用語は、次の遺伝子を最低限含むDHA脂肪酸生合成経路を指す。Δ15デサチュラーゼ、 Δ6デサチュラーゼ、C18/20エロンガーゼ、Δ5デサチュラーゼ、C20/22エロンガーゼ、およびΔ4デサチュラーゼ。「連結Δ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路」という用語は、最低限次の遺伝子を含むDHA脂肪酸生合成経路を指す。Δ15デサチュラーゼ、 Δ6デサチュラーゼ、C18/20エロンガーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、C20/22エロンガーゼ、およびΔ4デサチュラーゼ。最後に「Δ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路」という用語は、上述のあらゆるΔ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路の1つもしくはそれ以上を総称的に指す。

0153

同様に、「ω−6Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路」という用語は、次の遺伝子を最低限含むDHA脂肪酸生合成経路を指す。Δ9エロンガーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、C20/22エロンガーゼ、およびΔ4デサチュラーゼ。「ω−3Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路」という用語は、次の遺伝子を最低限含むDHA脂肪酸生合成経路を指す。Δ15デサチュラーゼ、 Δ9エロンガーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、C20/22エロンガーゼ、およびΔ4デサチュラーゼ。「連結Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路」という用語は、次の遺伝子を最低限含むDHA脂肪酸生合成経路を指す。Δ15デサチュラーゼ、Δ9エロンガーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、C20/22エロンガーゼ、およびΔ4デサチュラーゼ。そして「Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路」という用語は、あらゆる上述のΔ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の1つもしくはそれ以上を総称的にを指す。

0154

「デサチュラーゼ」と言う用語は、不飽和化できる、すなわち1個もしくはそれ以上の脂肪酸に二重結合を導入して、興味のある脂肪酸または前駆物質を生じさせるポリペプチドを指す。特定の脂肪酸を指すために、本願明細書全体を通じてω参照システムを使用するのにもかかわらず、Δシステムを使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼの活性を示す方が都合よい。ここで特に関心が高いのは、1.)分子のカルボキシル末端から数えて8および9番め炭素原子間で脂肪酸を不飽和化し、例えばEDAからDGLAへのおよび/またはETrAからETAへの変換を触媒するΔ8デサチュラーゼ、2.)LAからGLAへのおよび/またはALAからSTAへの変換を触媒するΔ6デサチュラーゼ、3.)DGLAからARAへのおよび/またはETAからEPAへの変換を触媒するΔ5デサチュラーゼ、4.)DPAからDHAへの変換を触媒するΔ4デサチュラーゼ、5.)オレイン酸からLAへの変換を触媒するΔ12デサチュラーゼ、6.)LAからALAへのおよび/またはGLAからSTAへの変換を触媒するΔ15デサチュラーゼ、7.)ARAらEPAへのおよび/またはDGLAからETAへの変換を触媒するΔ17デサチュラーゼ、および8.)パルミチン酸からパルミトレイン酸(16:1)および/またはステアリン酸からオレイン酸(18:1)への変換を触媒するΔ9デサチュラーゼである。

0155

本発明のΔ15デサチュラーゼに言及する「二機能」という用語は、ポリペプチドが酵素基質として、オレイン酸およびLAの双方を使用する能力を有することを意味する。同様に本発明のΔ5デサチュラーゼに言及する「二機能」という用語は、ポリペプチドが以下を使用する能力を有することを意味する。(1)DGLAおよびETAよりなる群から選択される少なくとも1つの酵素基質、および(2)LAおよびALAよりなる群から選択される少なくとも1つの酵素基質。「酵素基質」とは、ポリペプチドが活性部位で基質に結合し、反応性様式でそれに作用することを意味する。

0156

「エロンガーゼ系」と言う用語は、エロンガーゼ系が作用する脂肪酸基質よりも炭素2個分長い酸を生成する、脂肪酸炭素鎖伸長に関与する4つの酵素の一揃いを指す。より具体的にはこの延長プロセスは、CoAがアシルキャリアである脂肪酸合成酵素共同して起きる(ラスナー(Lassner)ら著、The Plant Cell 8:281〜292頁(1996年))。基質特異性であり、また律速でもあることが分かった第1のステップでは、マロニル−CoAが長鎖アシル−CoAと縮合して、CO2およびβ−ケトアシル−CoAを生じる(アシル部分が炭素原子2個分伸長される)。引き続く反応には、β−ヒドロキシアシル−CoAへの還元エノイル−CoAへの脱水、および伸長されたアシル−CoAを生じる第2の還元が含まれる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、GLAからDGLA、STAからETA、およびEPAからDPAへの変換である。

0157

ここでの目的では、第1の縮合反応(すなわちマロニル−CoAのβ−ケトアシル−CoAへの変換)を触媒する酵素を総称的に「エロンガーゼ」と称する。一般にエロンガーゼの基質選択性はいくぶん幅広いが、鎖長および不飽和の程度およびタイプの双方によって区別する。したがってエロンガーゼは異なる特異性を有することができる。例えばC14/16エロンガーゼは、C14基質(例えばミリスチン酸)を利用し、C16/18エロンガーゼはC16基質(例えばパルミチン酸)を利用し、C18/20エロンガーゼはC18基質(例えばGLA、STA)を利用し、C20/22エロンガーゼはC20基質(例えばEPA)を利用する。同様にΔ9エロンガーゼは、LAおよびALAからEDAおよびETrAへの変換をそれぞれ触媒できる。いくつかのエロンガーゼは幅広い特異性を有するため、単一酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒できるかもしれない(それによって例えばC16/18エロンガーゼおよびC18/20エロンガーゼの双方として作用する)ことに留意することは重要である。好ましい実施形態では、適切な宿主を脂肪酸エロンガーゼの遺伝子で形質転換して、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその効果を判定し、脂肪酸エロンガーゼの特異性を経験的に判定することが最も望ましい。

0158

「高親和力エロンガーゼ」または「EL1S」または「ELO1」という用語は、その基質特異性が好ましくはGLAに対するものであるC18/20エロンガーゼを指す(エロンガーゼ反応の生成物がDGLA[すなわちΔ6エロンガーゼ])。このようなエロンガーゼの1つについては、国際公開第00/12720号パンフレットで述べられ、ここで配列番号22および23として提供される。しかし出願者らはこの酵素がまた、18:2(LA)および18:3(ALA)に対してもいくらかの活性を有することを示した。したがって配列番号23は、(そのΔ6エロンガーゼ活性に加えて)Δ9エロンガーゼ活性を示す。したがってここで配列番号23として提供されるC18/20エロンガーゼは、本発明で述べられるようにΔ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路内の双方で機能し、そして例えばイソクリシス・ガルバナ(Isochrysis galbana)Δ9エロンガーゼ(配列番号70)の代わりとして、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路内で機能できると結論された。

0159

「EL2S」または「ELO2」という用語は、その基質特異性が、好ましくはGLAに対するもの(エロンガーゼ反応の生成物がDGLA)および/またはSTA(エロンガーゼ反応の生成物がSTA)に対するものであるC18/20エロンガーゼを指す。このような1つのエロンガーゼについては、米国特許第6,677,145号明細書で述べられ、ここで配列番号25および26として提供される。

0160

「ELO3」という用語は、elo3遺伝子(配列番号86)によってコードされるモルティエラ・アルピナ(Mortierella alpina)C16/18脂肪酸エロンガーゼ酵素(ここで配列番号87として提供される)を指す。「YE2」という用語は、ここで配列番号94として提供される遺伝子によってコードされる、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)C16/18脂肪酸エロンガーゼ酵素(ここで配列番号95として提供される)を指す。ここで報告されるデータに基づいて、ELO3およびYE2は、どちらもパルミチン酸(16:0)からステアリン酸(18:0)への変換を優先的に触媒する。

0161

「YE1」という用語は、ここで配列番号97として提供される遺伝子によってコードされる、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)C14/16脂肪酸エロンガーゼ酵素(ここで配列番号98として提供される)を指す。ここで報告されるデータに基づいて、YE2はミリスチン酸(14:0)のパルミチン酸(16:0)への変換を優先的に触媒する。

0162

変換効率」および「%基質変換」という用語は、それによって特定の酵素(例えばデサチュラーゼまたはエロンガーゼ)が基質を生成物に変換できる効率を指す。変換効率は以下の式に従って評価される。([生成物]/[基質+生成物])×100(式中、「生成物」には、直接生成物およびそれから誘導される経路中の全生成物が含まれる)。

0163

「油性」と言う用語は、それらのエネルギー源を脂質の形態で保存する傾向がある生物を指す(ウィーテ(Weete)著、「真菌脂質生化学(Fungal Lipid Biochemistry)」第2版、Plenum、1980年)。一般にこれらの微生物細胞油含量S字形曲線に従い、対数増殖後期または定常増殖初期において脂質濃度が最大に達するまで増大し、次に定常増殖後期および死滅期において徐々に減少する(ヨンマニットチャイ(Yongmanitchai)およびワード(Ward)著、Appl.Environ.Microbiol.57:419〜25頁(1991年))。

0164

「油性酵母菌」と言う用語は、油を生成できる酵母菌として分類される微生物を指す。一般に油性微生物の細胞油またはトリアシルグリセロール含量はS字形曲線に従い、脂質濃度は対数増殖後期または定常増殖初期において最大に達するまで増大し、次に定常増殖後期および死滅期において徐々に減少する(ヨンマニットチャイ(Yongmanitchai)およびワード(Ward)著、Appl.Environ.Microbiol.57:419〜25頁(1991年))。油性微生物が約25%を超えるその乾燥細胞重量を油として蓄積するのは珍しくない。油性酵母菌の例としては、ヤロウィア(Yarrowia)、カンジダ(Candida)、ロドトルラ(Rhodotorula)、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、トリコスポロン(Trichosporon)、およびリポマイセス(Lipomyces)属が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。

0165

発酵性炭素源」と言う用語は、微生物が代謝してエネルギーを引き出す炭素源を意味する。本発明の典型的な炭素源としては、単糖類少糖類多糖類アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステルモノグリセリドジグリセリドトリグリセリド二酸化炭素メタノールホルムアルデヒドギ酸、および炭素含有アミンが挙げられるが、これに限定されるものではない。

0166

ここでの用法では、「単離された核酸断片」は、場合により合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるRNAまたはDNAのポリマーを意味する。DNAポリマーの形態の単離された核酸断片は、1個またはそれ以上のcDNA、ゲノムDNAまたは合成DNAの断片を含んでなってもよい。

0167

アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはBLAST(「基礎局在性配列検索ツール(Basic Local Alignmant Search Tool)」アルトシュール(Altschul),S.F.ら著、J.Mol.Biol.215:403〜410頁(1993年))などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化アラインメントおよび同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、一般に10個以上の隣接するアミノ酸または30個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、20〜30個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ配列依存遺伝子同定法(例えばサザンハイブリダイゼーション)および単離(例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置(in situ)ハイブリダイゼーション)において使用してもよい。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基12〜15個の短いオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとしてPCRで使用してもよい。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定および/または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。

0168

相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばDNAについて、アデノシンチミンに相補的であり、シトシングアニンに相補的である。

0169

「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響することなく、ヌクレオチド配列の変更を可能にする遺伝コードにおける性質を指す。当業者は、任意のアミノ酸を特定化するためのヌクレオチドコドンの利用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、コドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようように、遺伝子をデザインすることが望ましい。

0170

化学的に合成された」とは、DNA配列に関連して構成要素ヌクレオチドが、生体外で(in vitro)構築されたことを意味する。確立した手順を使用してDNAの手動化学合成を達成してもよく、あるいはいくつかの市販の機器の1つを使用して自動化学合成を実施できる。「合成遺伝子」は、当業者に知られた手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲートアニールして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的アセンブルして遺伝子全体を構成する。したがってヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みを理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞から誘導された遺伝子の調査に基づくことができる。

0171

「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域を単独で指してもよく、またはコード配列先行する(5’非コード配列)およびそれに続く(3’非コード配列)制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列する制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物ゲノムにおいてその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされた遺伝子である。

0172

「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列を指す。「適切な制御配列」とは、コード配列の上流(5’非コード配列)、配列内、または下流(3’非コード配列)に位置して、転写RNAプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列イントロンポリアデニル化認識配列RNAプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでもよい。

0173

「プロモーター」とは、コード配列または機能性RNAの発現を調節できるDNA配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列に対して3’に位置する。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されてもよく、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなってもよく、あるいは合成DNAセグメントを含んでなってもよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる開発段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件呼応して、遺伝子の発現を導いてもよいことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列のはっきりした境界は完全に画定されていないので、異なる長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。

0174

「GPATプロモーター」または「GPATプロモーター領域」という用語は、gpat遺伝子によってコードされるグリセロール−3−リン酸−O−アシルトランスフェラーゼ酵素(E.C.2.3.1.15)の「ATG」翻訳開始コドンの前にあって、発現に必要である5’上流非翻訳領域を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)GPATプロモーター領域の例については、米国特許出願第11/225354号明細書で述べられる。

0175

「GPDプロモーター」または「GPDプロモーター領域」という用語は、gpd遺伝子によってコードされるグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素(E.C.1.2.1.12)の「ATG」翻訳開始コドンの前にあって、発現に必要である5’上流非翻訳領域を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)GPDプロモーター領域の例については、国際公開第2005/003310号パンフレットで述べられる。

0176

「GPMプロモーター」または「GPMプロモーター領域」という用語は、gpm遺伝子によってコードされるホスホグリセリン酸ムターゼ酵素(EC5.4.2.1)の「ATG」翻訳開始コドンの前にあって、発現に必要である5’上流非翻訳領域を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)GPMプロモーター領域の例については、国際公開第2005/003310号パンフレットで述べられる。

0177

「FBAプロモーター」または「FBAプロモーター領域」という用語は、fba1遺伝子によってコードされるフルクトースビスリン酸アルドラーゼ酵素(E.C.4.1.2.13)の「ATG」翻訳開始コドンの前にあって、発現に必要である5’上流非翻訳領域を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)FBAプロモーター領域の例については、国際公開第2005/049805号パンフレットで述べられる。

0178

「FBAINプロモーター」または「FBAINプロモーター領域」という用語は、fba1遺伝子の「ATG」翻訳開始コドンの前にあって発現に必要である5’上流非翻訳領域、ならびにfba1遺伝子のイントロンを有する5’コード領域部分を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)FBAINプロモーター領域の例については、国際公開第2005/049805号パンフレットで述べられる。

0179

「GPDINプロモーター」または「GPDINプロモーター領域」という用語は、gpd遺伝子の「ATG」翻訳開始コドンの前にあって発現に必要である5’上流非翻訳領域、ならびにgpd遺伝子のイントロンを有する5’コード領域部分を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)GPDINプロモーター領域の例については、米国特許出願第11/183664号明細書で述べられる。

0180

「YAT1プロモーター」または「YAT1プロモーター領域」という用語は、yat1遺伝子によってコードされるアンモニウム輸送体酵素(TC2.A.49;ジェンバンクGenBank)登録番号XM_504457)の「ATG」翻訳開始コドンの前にあって、発現に必要である5’上流非翻訳領域を指す。適切なヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)YAT1プロモーター領域の例については、米国特許出願第11/185301号明細書で述べられる。

0181

「EXP1プロモーター」または「EXP1プロモーター領域」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)「YALI0C12034g」遺伝子(ジェンバンク登録番号XM_501745)によってコードされるタンパク質の「ATG」翻訳開始コドンの前にあって、発現に必要である5’上流非翻訳領域を指す。「YALI0C12034g」と、sp|Q12207 S.セレヴィシエ(cerevisiae)非古典的輸出タンパク質2(その機能が、開裂可能なシグナル配列を欠くタンパク質輸出の新規経路に関与する)との顕著な相同性に基づいて、この遺伝子をEXP1と命名されたタンパク質をコードするexp1遺伝子とここで命名する。適切なヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)EXP1プロモーター領域の例は配列番号221として述べられるが、これは本来、制限を意図するものではない。当業者は、EXP1プロモーター配列の正確な境界が完全に画定されていないため、長さが増大または減少したDNA断片が、同一のプロモーター活性を有してもよいことを認識するであろう。

0182

「プロモーター活性」という用語は、プロモーターの転写効率アセスメントを指す。これは例えば(例えばノーザンブロット法またはプライマー伸長法による)プロモーターからのmRNA転写量の測定によって直接に、またはプロモーターから発現する遺伝子産物量を測定して間接に判定されてもよい。

0183

「イントロン」とは、ほとんどの真核生物において、(コード領域、5’非コード領域、または3’非コード領域のいずれかの中の)遺伝子配列中に見られる非コードDNA配列である。それらの全機能は知られていないが、いくつかのエンハンサーは、イントロン中に位置する(ジャコペリ(Giacopelli),F.ら著、「Gene Expr.」11:95〜104頁(2003年))。これらのイントロン配列は転写されるが、mRNAがタンパク質に翻訳される前にmRNA前駆体転写物内から除去される。このイントロン除去プロセスは、イントロンのどちらかの側の配列(エクソン)の自己スプライシングによって起きる。

0184

「エンハンサー」という用語は、隣接する真核生物プロモーターからの転写レベルを上昇させ、それによって遺伝子の転写を増大できるシス−制御配列を指す。エンハンサーは、数十キロベースのDNAにわたってプロモーターに作用でき、それらが制御するプロモーターに対して5’または3’であることができる。エンハンサーはまた、イントロン内に位置できる。

0185

「3’非翻訳配列」および「転写ターミネーター」と言う用語は、コード配列の下流に位置したDNA配列を指す。これには、mRNAプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列およびその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常mRNA前駆物質の3’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。3’領域は、転写、RNAプロセッシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響できる。

0186

RNA転写物」とは、RNAポリメラーゼが触媒するDNA配列の転写から得られる生成物を指す。RNA転写物がDNA配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるRNA配列であるかもしれず、成熟RNAと称される。「メッセンジャーRNA」または「mRNA」とはイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるRNAを指す。「cDNA」とは、mRNAに対して相補的であり、それから誘導される二重鎖DNAを指す。「センスRNA」とは、mRNAを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるRNA転写物を指す。「アンチセンスRNA」とは、標的一次転写物またはmRNAの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするRNA転写物を指す(米国特許第5,170,065号明細書、国際出願公開第99/28508号パンフレット)。アンチセンスRNAの相補性は、特定遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち5’非コード配列、3’非コード配列、またはコード配列にあってもよい。「機能性RNA」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞プロセスに影響するアンチセンスRNA、リボザイムRNA、またはその他のRNAを指す。

0187

作動可能に連結した」と言う用語は、1つの機能が他方の機能によって影響されるような、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響できる(すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある)場合、それはそのコード配列と作動可能に連結する。コード配列はセンスまたはアンチセンスオリエンテーションで、制御配列に作動可能に連結できる。

0188

「発現」と言う用語は、ここでの用法では、本発明の核酸断片から誘導されるセンス(mRNA)またはアンチセンスRNAの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、mRNAのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。

0189

「成熟」タンパク質とは、転写後処理されたポリペプチド、すなわち一次翻訳生成物中に存在するあらゆるプレまたはプロペプチドがそれから除去されたものを指す。「前駆物質」タンパク質とはmRNA翻訳の一次生成物を指し、すなわちプレおよびプロペプチドは存在したままである。プレおよびプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであってもよい(が、これに限定されるものではない)。

0190

「リコンビナーゼ」という用語は、部位特異的遺伝子組換えを実行して、DNA構造を変更させる酵素を指し、トランスポサーゼラムダ組み込み/切除酵素、ならびに部位特異的リコンビナーゼが挙げられる。

0191

リコンビナーゼ部位」または「部位特異的リコンビナーゼ配列」とは、リコンビナーゼが認識して結合するDNA配列を意味する。これは、機能性が維持されてリコンビナーゼ酵素がなおも部位を認識し、DNA配列に結合して2つの隣接するリコンビナーゼ部位間の遺伝子組換えを触媒できるならば、野性型または突然変異リコンビナーゼ部位であってもよいものと理解される。

0192

「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物への核酸分子の転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノム中に組み込まれてもよい。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」生物と称される。

0193

「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖DNA断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源から誘導される一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な3’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびDNA配列を細胞中に導入することができる。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。

0194

相同的組換え」と言う用語は、(交差中の)2つのDNA分子間のDNA断片の交換を指す。交換される断片は、2個のDNA分子間で同一ヌクレオチド配列の部位(すなわち「相同性領域」)に挟まれる。「相同性領域」と言う用語は、相同的組換えに関与する、核酸断片上の互いに相同性を有するひと続きのヌクレオチド配列を指す。効果的な相同的組換えは、一般に長さが少なくとも約10bpである相同性領域で起き、少なくとも約50bpの長さが好ましい。典型的に遺伝子組換えが意図される断片は、標的を定めた遺伝子中断または置換が所望される少なくとも2つの相同性領域を含有する。

0195

配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、1.)ウィスコシン州マディソンのジェネティック・コンピュータ・グループ(Genetics Computer Group(GCG)(Madison,WI))からのGCGパッケージプログラム、ウィスコンシン・パッケージ(Wisconsin Package)バージョン9.0、2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(アルトシュール(Altschul)ら著、J.Mol.Biol.215:403〜410頁(1990年))、3.)ウィスコンシン州マディソンのDNASTAR(DNASTAR,Inc.(Madison,WI))からのDNASTAR、4.)ミシガンアンアーバージーンコーズ社(Gene Codes Corporation(Ann Arbor,MI))からのシーケンチャー(Sequencher)、および5.)スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたFASTAプログラム(W.R.ピアソン(Pearson)著、Comput.MethodsGenome Res.[Proc.Int.Symp.](1994年)、1992年会議、111〜20頁、スハイサンドル(Suhai,Sandor)編、Plenum、New York,NY)が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに最初にロードされる、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。

0196

「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連するタンパク質の整合配列に沿った特定位置において保存された一組のアミノ酸を意味する。その他の位置のアミノ酸が相同的なタンパク質間で異なることができるのに対し、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性に必須のアミノ酸を示唆する。それらはタンパク質相同体ファミリーの整合配列におけるそれらの高度な保存によって同定されるので、それらは新たに判定された配列のタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判別するための識別子、または「シグネチャ」として使用できる。Δ15デサチュラーゼ活性を有する真菌タンパク質の徴候であるモチーフは、配列番号223として提供される一方、Δ12デサチュラーゼ活性を有する真菌タンパク質の徴候であるモチーフは、配列番号224として提供される。

0197

ここで使用される標準組換えDNAおよび分子クローニング技術は技術分野でよく知られており、サムルック(Sambrook),J.、フリッチュ(Fritsch),E.F.、およびマニアティス(Maniatis),T.著、「分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor,NY(1989年)(以下マニアティス(Maniatis));シルハビー(Silhavy),T.J.、ベンナン(Bennan),M.L.、およびエンイスト(Enquist),L.W.著、「遺伝子融合実験(Experiments with Gene Fusions)」、Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1984年);およびオースベル(Ausubel),F.M.ら著、「分子生物学現代プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」、Greene Publishing Assoc.and Wiley−Interscienceによる出版(1987年)で述べられている。

0198

DHA生成に好ましい微生物宿主:ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)
本出願人らの研究(ピカタッジョ(Picataggio)ら、国際公開第2004/101757号パンフレット参照)に先だって、油性酵母は、PUFAの生産プラットフォームとして使用するのに適した微生物クラスとして以前に調査されている。典型的に油性酵母として同定された属としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。ヤロウィア(Yarrowia)、カンジダ(Candida)、ロドトルラ(Rhodotorula)、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、トリコスポロン(Trichosporon)およびリポミセス(Lipomyces)。より具体的には例示的な油合成酵母として、次が挙げられる。ロドスポリジウム・トルロイデス(Rhodosporidium toruloides)、リポミセス・スターケイ(Lipomyces starkeyii)、L.リポフェラス(lipoferus)、カンジダ・レブカウフィ(Candida revkaufi)、C.プリケリーマ(pulcherrima)、C.トロピカリス(tropicalis)、C.ユチリス(utilis)、トリコスポロン・プランズ(Trichosporon pullans)、T.クタネウム(cutaneum)、ロドトルラ・グルチヌス(Rhodotorula glutinus)、R.グラミニス(graminis)、およびヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)(以前はカンジダ・リポリチカ(Candida lipolytica)として分類された)。

0199

油性酵母は、DHAの経済的な商業生産の宿主生物としてのそれらの使用を容易にする、いくつかの性質を有すると見なされる。第1に生物体は自然に油合成および蓄積ができるものとして定義され、そこでは油は、細胞乾燥重量の約25%を超え、より好ましくは細胞乾燥重量の約30%を超え、そして最も好ましくは細胞乾燥重量の約40%を超える量を構成できる。第2に高含油量で油性酵母を生育させる技術は、十分に開発されている(例えばEP第0 005 277B1号明細書;ラトレッジ(Ratledge),C.著、Prog.Ind.Microbiol.16:119〜206頁(1982年)参照)。そして、これらの生物は、過去に多様な目的のために商業的に使用されている。例えばヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の様々な株は、歴史的に以下の製造および生産のために使用されている。イソシトレートリアーゼDD第259637号明細書);リパーゼ(SU第1454852号明細書、国際公開第2001083773号パンフレット、DD第279267号明細書);ポリヒドロキシアルカノアート(国際公開第2001088144号パンフレット);クエン酸(RU第2096461号明細書、RU第2090611号明細書、DD第285372号明細書、DD第285370号明細書、DD第275480号明細書、DD第227448号明細書、PL第160027号明細書);エリトリトール(EP第770683号明細書);2−オキソグルタル酸(DD第267999号明細書);γ−デカラクトン(米国特許第6,451,565号明細書、FR第2734843号明細書);γ−ドデカラクトン(EP第578388号明細書);およびピルビン酸(特開平09−252790号公報)。

0200

油性酵母として分類される生物から、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)がここでの目的で好ましい微生物宿主として選択された。この選択は、ω−3脂肪酸をTAG画分に組み込める油性株が利用でき、生物が遺伝的操作に適しており、種が以前に食物等級クエン酸の安全食品認定(米国食品医薬品局に従った「GRAS」)供給源として使用された知識に基づいた。さらに別の実施形態では、高脂質含量(パーセント乾燥重量として測定される)および高容量生産性(g/Lh−1として測定される)を有する野生型株の同定を目的とする予備的研究の結果、最も好ましいのはATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944、ATCC#76982、および/またはLGAMS(7)1(パパニコラオウ(Papanikolaou),S.、およびアゲリス(Aggelis),G.著、Bioresour.Technol.82(1):43〜9頁(2002年))と命名されたY.リポリティカ(lipolytica)株である

0201

国際公開第2004/101757号パンフレットで述べられるように、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)は、以前にω−3/ω−6生合成経路をコードする遺伝子の導入および発現によって遺伝子改変され、1.3%のARAおよび1.9%のEPAをそれぞれ生成した。より具体的には(ARA合成のためのΔ6デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、および高−親和力PUFAC18/20エロンガーゼ、またはEPA合成のためのΔ6デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、高−親和力PUFA C18/20エロンガーゼ、およびコドン最適化Δ17デサチュラーゼのどちらかを含んでなる)2つの異なるDNA発現コンストラクトを別々に形質転換して、酵素オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ(EC4.1.1.23)をコードするY.リポリティカ(lipolytica)染色体のURA3遺伝子に組み込んだ。適切な基質を供給された宿主細胞のGC分析からは、ARAおよびEPAの生成が検出された。この研究は、ω−6およびω−3脂肪酸生成のために油性宿主が遺伝子改変される能力のコンセプトの証明を実証するのには適切であったが、DHAの生成を実証できないかったか、または総油画分中5%を超えるDHA、より好ましくは総油画分中10%を超えるDHA、さらにより好ましくは総油画分中15〜20%を超えるDHA、最も好ましくは総油画分中25〜30%を超えるDHAの合成を可能にするのに必要な複雑な代謝エンジニアリングを示唆、または実施できなかった。

0202

同時係属米国仮特許出願第60/624812号明細書では、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)内で複雑な代謝操作を実施して、(1)EPAの合成および高蓄積を可能にする好ましいデサチュラーゼおよびエロンガーゼを同定し、(2)ω脂肪酸の貯蔵脂質プール内への転移を可能にするアシルトランスフェラーゼの活性を操作し、(3)マルチコピーで発現する強力プロモーターおよび/またはコドン−最適化の使用によってデサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびアシルトランスフェラーゼを過剰発現し、(4)EPAの総蓄積を減少させるPUFA生合成経路内の特異的遺伝子の発現を下方制御し、(5)EPA生産に影響する経路および包括制御因子を操作する。これは、特定の1つのヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)組換え株において28%までのEPAの生産をもたらした。

0203

本出願では、類似の複雑な代謝操作が実施されて、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)組換え株の全油画分中に5%を超えるDHAの生産がもたらされる。より具体的には、株を遺伝子改変してΔ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路を利用し、代案の実施形態では、形質転換株を遺伝子改変してΔ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路を利用し、それによってGLAを欠く高DHA油を生成できた。利用された代謝操作の態様について下で述べ、この油性酵母においてDHA生産性を顕著に増強するために実施できる追加的な操作および発酵方法についても述べる。

0204

概説:脂肪酸およびトリアシルグリセロールの微生物生合成
一般に、油性微生物中の脂質蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素対窒素比に答えて誘発される。油性微生物中に遊離パルミチン酸(16:0)の新規(de novo)合成をもたらすこのプロセスについては、国際公開第2004/101757号パンフレットで詳細に述べられる。パルミチン酸は、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じて形成される、より長鎖の飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆物質である。例えばパルミチン酸は、Δ9デサチュラーゼの作用によってその不飽和誘導体[パルミトレイン酸(16:1)]に変換される。同様にパルミチン酸は、C16/18脂肪酸エロンガーゼによって延長されてステアリン酸(18:0)が形成し、それはΔ9デサチュラーゼによってその不飽和誘導体に変換され、それによってオレイン(18:1)酸を生じることができる。

0205

TAG(脂肪酸の主要な貯蔵単位)は、以下が関与する一連の反応によって形成される。1.)リゾホスファチジン酸を生じる、アシルトランスフェラーゼによるアシル−CoAの1分子のグリセロール−3−リン酸塩へのエステル化、2.)1,2−ジアシルグリセロールリン酸塩(一般にホスファチジン酸として同定される)を生じる、アシルトランスフェラーゼによるアシル−CoAの第2の分子のエステル化、3.)1,2−ジアシルグリセロール(DAG)を生じる、ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸塩の除去、および4.)TAGを形成する、アシルトランスフェラーゼの作用による第3の脂肪酸の付加(図2)。

0206

飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする、幅広い脂肪酸をTAGに組み込むことができる。アシルトランスフェラーゼによってTAGに組み込むことができる脂肪酸の制限を意図しない例のいくつかとしては、カプリン(10:0)、ラウリン(12:0)、ミリスチン(14:0)、パルミチン(16:0)、パルミトレイン(16:1)、ステアリン(18:0)、オレイン(18:1)、バクセン(18:1)、LA、エレオステアリン酸(18:3)、ALA、GLA、アラキジン酸(20:0)、EDA、ETrA、DGLA、ETA、ARA、EPA、ベヘン酸(22:0)、DPA、DHA、リグセリン(24:0)、ネルボン(24:1)、セロチン(26:0)、およびモンタン(28:0)脂肪酸が挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、TAGへのDHAの組み込みが最も望ましい。

0207

ω−3脂肪酸であるDHAの生合成
オレイン酸がDHAに変換される代謝プロセスは、炭素原子付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合添加を通じた分子の不飽和化を伴う。これは、小胞体膜内に存在する一連の特別な不飽和化および延長酵素を必要とする。しかし図1に示され下で述べられるように、DHA生成のための複数の代案の経路が存在する(全ての場合において、DHA生成にはEPAの合成が必要となるが)。

0208

具体的には、全ての経路は、Δ12デサチュラーゼの作用によるオレイン酸から第1のω−6脂肪酸であるLA(18:2)への初期変換を必要とする。次にEPA生合成のための「ω−6Δ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路」を使用し(それによって主としてω−6脂肪酸の形成を通じてEPA生合成が起きる)、PUFAが次のようにして形成される。(1)Δ6デサチュラーゼの作用によってLAがGLAに変換される、(2)C18/20エロンガーゼの作用によってGLAがDGLAに変換され、(3)Δ5デサチュラーゼの作用によってDGLAがARAに変換され、(4)Δ17デサチュラーゼの作用によってARAがEPAに変換される。代案としては、主として「ω−3Δ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路」を通じたω−3脂肪酸の形成を通じてEPA生合成が起きる場合、(1)Δ15デサチュラーゼの作用によってLAが第1のω−3脂肪酸であるALAに変換され、(2)Δ6デサチュラーゼの作用によってALAがSTAに変換され、(3)C18/20エロンガーゼの作用によってSTAがETAに変換され、(4)Δ5デサチュラーゼの作用によってETAがEPAに変換される。場合によりΔ17デサチュラーゼの作用によってDGLAからETAが生成する場合、またはΔ6デサチュラーゼ、C18/20エロンガーゼ、およびΔ5デサチュラーゼと併せて、Δ15デサチュラーゼおよびΔ17デサチュラーゼの双方が同時発現される場合のどちらかで、EPA生成に先だってω−6およびω−3脂肪酸の組み合わせを合成できる。

0209

EPA生合成の代案の経路は、Δ9エロンガーゼおよびΔ8デサチュラーゼを利用する。より具体的には、「ω−6Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路」を通じて、Δ9エロンガーゼの作用によってLAがEDAに変換され、次にΔ8デサチュラーゼがEDAをDGLAに変換する。引き続くΔ5デサチュラーゼの作用によるDGLA不飽和化からは、上述のようにARAが生じ、そこでARAはΔ17デサチュラーゼの作用によって直接にEPAに変換できる。対照的に「ω−3Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路」を使用して、Δ15デサチュラーゼの作用によってLAが最初にALAに変換される。次にΔ9エロンガーゼの作用によってALAがETrAに変換され、それにETrAをETAに変換するΔ8デサチュラーゼが続く。引き続くΔ5デサチュラーゼの作用によるETAの不飽和化によって、EPAが生じる。

0210

EPAの合成に際して、C20/22エロンガーゼは基質からDPAへの変換に関与する。次にΔ4デサチュラーゼの作用によってDPAはDHAに変換される。

0211

分かりやすくするために、これらの各経路ならびにそれらの際立った特性を下の表に要約する。

0212

0213

DHA合成のための微生物遺伝子の選択
DHA生成のためにヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)に導入することが必要な特定の機能性は、宿主細胞(およびその天然PUFAプロフィールおよび/またはデサチュラーゼ/エロンガーゼプロフィール)、基質の入手可能性、および所望の最終産物に左右されることが考察される。天然宿主細胞について、Y.リポリティカ(lipolytica)は18:2脂肪酸を自然に生成し、したがって天然Δ12デサチュラーゼ(配列番号28および29、国際公開第2004/104167号パンフレット参照)を有することが知られている。所望の最終産物については、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現結果に対立するものとして、Δ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路の発現結果が、このようにして生成された油の最終脂肪酸プロフィールとして上に記述されている(すなわち高DHA油の最終組成中の%GLA)。

0214

したがっていくつかの実施形態では、Δ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路を通じてDHAを生成することが望ましい。したがってDHA生合成のために、最低限、Δ6デサチュラーゼ、C18/20エロンガーゼ、Δ5デサチュラーゼ、およびΔ17デサチュラーゼまたはΔ15デサチュラーゼのどちらか(または双方)、C20/22エロンガーゼおよびΔ4デサチュラーゼの遺伝子を宿主生物に導入して発現させなくてはならない。さらに好ましい実施形態では、宿主株は、Δ9デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、C14/16エロンガーゼ、およびC16/18エロンガーゼの少なくとも1つをさらに含む。

0215

代案の実施形態では、GLAの同時合成なしにDHAを生成することが望ましい(したがってΔ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現を要する)。その結果、このストラテジーは、DHA生合成のために、最低限、Δ9エロンガーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼまたはΔ15デサチュラーゼのどちらか(または双方)、C20/22エロンガーゼおよびΔ4デサチュラーゼの遺伝子を宿主生物に導入して発現することを要する。さらに好ましい実施形態では、宿主株は、Δ9デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、C14/16エロンガーゼ、およびaC16/18エロンガーゼの少なくとも1つをさらに含む。

0216

当業者は、DHA生合成のために所望される各酵素をコードする、様々な候補遺伝子を同定できるであろう。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列はあらゆる供給源に由来してもよく、例えば天然供給源(細菌、藻類、真菌、植物、動物などから)から単離され、半合成経路によって生成され、または新規(de novo)合成される。宿主中に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の供給源は本発明にとって重大でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特異的ポリペプチド選択のための配慮としては以下が挙げられる。1.)ポリペプチドの基質特異性、2.)ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、3.)デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のPUFA合成に必須であるかどうか、および/または4.)ポリペプチドが必要とする補助因子。発現したポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中のその位置の生化学的環境に適合したパラメーターを有する。例えばポリペプチドは、宿主細胞中のその他の酵素と基質獲得のために争わなくてはならないかもしれない。したがって宿主細胞中のPUFA生成を修正する特定ポリペプチドの適合性を判定するのに、ポリペプチドのKMおよび比活性の分析を考慮してもよい。特定の宿主細胞で使用されるポリペプチドは、意図される宿主細胞中に存在する生化学的条件下で機能できるものであるが、それ以外には所望のPUFAを修正できるデサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する、あらゆるポリペプチドであることができる。

0217

追加的実施形態では、特定の各デサチュラーゼおよび/またはエロンガーゼの変換効率を考慮することもまた有用であろう。より具体的には、各酵素が基質を生成物に変換するのに100%の効率で機能することは稀なので、宿主細胞中に生成される未精製油の最終脂質プロフィールは、典型的に(例えば100%のDHA油とは対照的に)所望のDHAならびに様々な上流中間PUFAからなる様々なPUFAの混合物である。したがってDHA生合成を最適化するのに際し、各酵素の変換効率の配慮もまた重要な変数であり、生成物の最終所望の脂質プロフィールの観点から考慮しなくてはならない。

0218

上の各考察を念頭に置いて、公的に入手できる文献(例えばジェンバンク)、特許文献、およびPUFAを生成する能力を有する微生物の実験的分析に従って、適切なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性を有する候補遺伝子を同定できる。例えば次のジェンバンク登録番号は、DHA生合成で有用な公的に入手できる遺伝子の例を指す。AY131238、Y055118、AY055117、AF296076、AF007561、L11421、NM_031344、AF465283、AF465281、AF110510、AF465282、AF419296、AB052086、AJ250735、AF126799、AF126798(Δ6デサチュラーゼ);AF390174(Δ9エロンガーゼ);AF139720(Δ8デサチュラーゼ);AF199596、AF226273、AF320509、AB072976、AF489588、AJ510244、AF419297、AF07879、AF067654、AB022097(Δ5デサチュラーゼ);AAG36933、AF110509、AB020033、AAL13300、AF417244、AF161219、AY332747、AAG36933、AF110509、AB020033、AAL13300、AF417244、AF161219、X86736、AF240777、AB007640、AB075526、AP002063(Δ12デサチュラーゼ);NP_441622、BAA18302、BAA02924、AAL36934(Δ15デサチュラーゼ);AF338466、AF438199、E11368、E11367、D83185、U90417、AF085500、AY504633、NM_069854、AF230693(Δ9デサチュラーゼ);AY630574、AY332747、AY278558、AF489589(Δ4デサチュラーゼ)、およびNP_012339、NP_009963、NP_013476、NP_599209、BAB69888、AF244356、AAF70417、AAF71789、AF390174、AF428243、NP_955826、AF206662、AF268031、AY591335、AY591336、AY591337、AY591338、AY605098、AY605100、AY630573(C14/16、C16/18、C18/20、およびC20/22エロンガーゼ)。同様に特許文献は、PUFA生産に関与する遺伝子の多数の追加的DNA配列(および/または上の遺伝子のいくつかに関する詳細およびそれらの単離方法)を提供する[例えば国際公開第02/077213号パンフレット(Δ9エロンガーゼ);国際公開第00/34439号パンフレットおよび国際公開第04/057001号パンフレット(Δ8デサチュラーゼ);米国特許第5、968、809号明細書(Δ6デサチュラーゼ);米国特許第5,972,664明細書および米国特許第6,075,183号明細書(Δ5デサチュラーゼ);国際公開第号94/11516パンフレット、米国特許第5,443,974号明細書、国際公開第03/099216号パンフレットおよび国際公開第05/047485号パンフレット(Δ12デサチュラーゼ);国際公開第93/11245号パンフレット(Δ15デサチュラーゼ);国際公開第91/13972号パンフレットおよび米国特許第5,057,419号明細書(Δ9デサチュラーゼ);米国特許出願公開第2003/0196217号明細書(Δ17デサチュラーゼ);国際公開第02/090493号パンフレット(Δ4デサチュラーゼ)、および国際公開第00/12720号パンフレット、米国特許第6,403,349号明細書、米国特許第6,677,145号明細書、米国特許出願公開第2002/0139974 A1号明細書、米国特許出願公開第2004/0111763号明細書(C14/16、C16/18、C18/20、およびC20/22エロンガーゼ)]。これらの各特許および特許出願は、その内容全体を参照によって本明細書に組み込んだものとする。

0219

上の例は制限を意図するものではなく、(1)Δ6デサチュラーゼ、C18/20エロンガーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼまたはΔ15デサチュラーゼのどちらか(または双方)、C20/22エロンガーゼおよびΔ4デサチュラーゼ(そして場合によりΔ9デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、C14/16エロンガーゼおよび/またはC16/18エロンガーゼをコードするその他の遺伝子)、または(2) Δ9エロンガーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ5デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼまたはΔ15デサチュラーゼのどちらか(または双方)、C20/22エロンガーゼおよびΔ4デサチュラーゼ(そして場合によりΔ9デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、C14/16エロンガーゼおよび/またはC16/18エロンガーゼをコードするその他の遺伝子)をコードする、異なる供給源に由来する多数のその他の遺伝子が、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)中への導入のために適している。

0220

DHA合成のために好ましい遺伝子
しかしヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)中での発現に適することができるデサチュラーゼおよびエロンガーゼの幅広い選択にも関わらず、本発明の好ましい実施形態では、デサチュラーゼおよびエロンガーゼは以下(またはその誘導体)から選択される。

0221

0222

0223

0224

0225

本出願人らは様々なエロンガーゼの多数の分析を実施して、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)中で発現する際の各酵素の基質特異性および/または基質選択性を判定または確認した。例えば2つのY.リポリティカ(lipolytica)エロンガーゼのコード配列は公的に入手でき、各タンパク質は推定上の長鎖脂肪酸アシルエロンガーゼとして注釈され、またはその他の脂肪酸エロンガーゼと顕著な相同性を共有しているが、これらの酵素の基質特異性はいまだかつて判定されていない。ここで実施した分析に基づいて、YE1は基質としてC14脂肪酸を優先的に使用してC16脂肪酸を生成する脂肪酸エロンガーゼ(すなわちC14/16エロンガーゼ)であると判定され、YE2は基質としてC16脂肪酸を優先的に使用してC18脂肪酸を生成する脂肪酸エロンガーゼ(すなわちC16/18エロンガーゼ)であると判定された。同様に新規M.アルピナ(alpina)ELO3遺伝子の同定に際して、配列はその他の脂肪酸エロンガーゼに相同的であると特性決定された。しかしC16/18エロンガーゼとしてのELO3の特異性を確認するために、脂質プロフィールの分析が必要であった。

0226

Δ12デサチュラーゼについて、本出願人らはY.リポリティカ(lipolytica)中で18:2を生成する際に、フザリウム・モニリフォルメ(Fusarium moniliforme)Δ12デサチュラーゼ(配列番号32によってコードされる)が、天然ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)Δ12デサチュラーゼよりも高い効率で機能するという意外な発見をした(国際公開第2005/047485号パンフレット参照)。具体的には、TEFプロモーター制御下にあるY.リポリティカ(lipolytica)Δ12デサチュラーゼをコードするキメラ遺伝子の発現によって以前得られた(LAの生成物蓄積59%)よりも、Y.リポリティカ(lipolytica)中でTEFプロモーター制御下にあるF.モニリフォルメ(moniliforme)Δ12デサチュラーゼの発現が、高いレベルの18:2を生成する(LAの生成物蓄積68%)と判定された。これはそれぞれ85%対74%の%基質変換(([18:2+18:3]/[18:1+18:2+18:3])×100として計算される)の差に相当する。これらの結果に基づいて、Y.リポリティカ(lipolytica)の高DHA生成株を操作する手段として、本真菌F.モニリフォルメ(moniliforme)Δ12デサチュラーゼの発現は、その他の知られているΔ12デサチュラーゼよりも好ましい(しかし当業者は、例えばコドン最適化に続いてY.リポリティカ(lipolytica)中でF.モニリフォルメ(moniliforme)Δ12デサチュラーゼの活性が増強できることを期待するであろう)。

0227

代案としては、最近、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)において、おそらく改善された効率で機能する5つの新しいΔ12デサチュラーゼが同定されている。具体的には、サッカロミセス・クリヴェリ(Saccharomyces kluyveri)Δ12デサチュラーゼ(ジェンバンク登録番号BAD08375)についてワタナベ(Watanabe)ら著、Biosci.Biotech.Biocheml.68(3):721〜727頁(2004年)で述べられているのに対し、モルティエラ・アルピナ(Mortierella alpina)(ジェンバンク登録番号AB182163)からのものついてはサクラダニ(Sakuradani)ら著、Eur.J.Biochem.261(3):812〜820頁(1999年)で述べられる。これらの配列および下述の方法を使用して、以下の3つの追加的Δ12デサチュラーゼがここで本出願人らによって同定された。クリヴェロミセスラクチス(Kluyveromyces lactis)gnl|GLV|KLLA0B00473gORF(配列番号48)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)ジェンバンク登録番号EAK94955(配列番号49)、およびデバリオミセス・ハンセニ(Debaryomyces hansenii)CBS767ジェンバンク登録番号CAG90237(配列番号500)。ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)におけるこれらの追加的Δ12デサチュラーゼのいずれかの過剰発現は、LA生成を増大させる手段として有用であることができ、それによってその他の下流PUFA(例えばDHA)の生成増大を可能にする。

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