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課題・解決手段

本発明は線維芽細胞成長因子(FGF)、特に一つ又は複数の新規導入N連結又はO連結グリコシル化部位を含むFGF—20及びFGF−21の変異体に関する。変異体のポリヌクレオチドコード配列、該コード配列含有発現カセット、該変異体発現細胞及び該変異体産生法も又開示される。更に該変異体含有薬剤組成及び該変異体使用法も開示される。

概要

背景

関連出願の相互参照
本出願は2004年10月29日に出願の米国仮特許出願60/623,342に関連し、全体を多目的のために本出願に関して参考として組み入れる。

線維芽細胞成長因子(FGF)は広範囲細胞組織型の成長、増殖、生存及び分化増進する。原型線維芽細胞成長因子(FGF)のFGF—1及びFGF—2は最初脳と下垂体ら線維芽細胞分裂促進因子として単離された。しかしFGF—1、FGF—2及び線維成長因子通常成長組織成人組織で広く発現され、血管新生有糸分裂誘発細胞分化及び組織損傷
復を含む多重生物活性を有する(例えばベイアード、エイ等(Baird, A. et.al.)、キャンサーセル(Cancer Cells)、3巻、239−243頁(1991)及びバーゲス、ダブリエッチ等(Burgess, W.H., et al.)、アニュアルビュオブバイオケミストリー(Annu. Rev. Biochem.)、58巻、575−606頁(1989)参照)。

公開文献によると、FGFファミリーは少なくともFGF—1からFGF—25の25の構成員からなる。FGF群における25の構成員の分子量は17キロダルトン乃至34キロダルトンの範囲で、13乃至71%のアミノ酸同一性共有する。FGFは脊椎動物種間で遺伝子構造アミノ酸配列両者を高度に保存する。

哺乳類FGFファミリーの25の構成員は多くの組織で差別的に発現される。その構成員は個々にはユニークではあるが類似発現様式を有するサブファミリーに分かれる。あるFGFは胚発生時にのみに発現される(例えばFGF3,4、8、15、17及び19)一方、他は胚組織及び成人組織で発現される。例えばFGF—16伝令RNAは主として成人組織のラット心臓で発現される。しかしラットのではFGF—16伝令RNAは褐色脂肪組織で主として発現される(例えば三宅、エイ等(Miyake A, et al.)、バイオケミストリーバイオフィジックリサーチコミュニケーション(Biochem. Biophys. Res. Commun.)、1998年、243巻、148−152頁参照)。

大部分のFGF(FGF3−8、10、15、17−19及び21−25)はアミノ末端シグナルペプチドを有し細胞から容易に分泌されるが、FGF9、16及び20は明白なアミノ末端シグナルペプチドを欠くにもかかわらず分泌される(例えば、本、エム等(Miyamaoto,M., et al.)、モレキュラーセルバイオロジー(Mol. Cell. Biol.)、13巻、4251−4259頁参照)。FGFの第三サブセット(FGF11−14)はシグナル配列を欠き細胞内に留まると考えられる。

上記のごとくFGF—9、FGF—16及びFGF—20からなるFGFタンパク質のサブファミリーは、核局在化シグナルを含むが古典的シグナル配列に欠け分泌される。これらのFGFは発育神経系と成人神経系で発現され、神経系の成長と機能での役割示唆する(例えば、スモールウッド、ピーエム等(Smallwood P.M., et al.)、プロシーディングオブナシナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、(1996年)、93巻、9850−9857頁参照)。実際にFGFコード化相補DNAがラットの脳から単離された(例えば米国特許6,797,695参照)。FGFファミリー構成員中でFGF—20はFGF—9とFGF—16と最も類似している(それぞれ70%と62%のアミノ酸同一性)。

ヒト疾患での多くの研究と同様に遺伝子ノックアウトマウスでの研究により、FGFは末梢神経系と中枢神経系両者の細胞に神経栄養性であり、哺乳類骨格系の発育に重要である。神経系発育と機能での役割は、FGF—20伝令RNAが脳の黒質緻密部優先的に発現されることを示すインサイツハイブリッド形成研究により支持される。試験管組み換えラットFGF—20が培養物中の中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存を強めることを示す研究により、更に神経系機能が支持されることが見出された。

他の研究では高度のFGF—21伝令RNA発現が肝臓で起こることが示され、ヒトFGF—21が肝疾患発生と回復で役立つ。FGF—21は又精巣胸腺で発現し、それ故精巣機能障害胸腺由来細胞機能の発生か回復に役立つ(例えば米国特許6,716,626参照)。

これらの広範囲で強力な活性により、FGFは筋骨格状態、骨折靱帯組織修復腱炎滑液包炎等のような創傷治癒、例えば、火傷切り傷裂傷褥瘡遅効治癒性潰瘍のような皮膚状態、組織保護、修復、心筋梗塞虚血時の血管新生誘導炎症状態炎症疾患(例えば炎症性腸疾患を含む腸炎症、例えばジェファーズ等(Jeffers, M., et al.)、ガストエンテロロジー(Gastroenterology)、2002年、123巻、1151−1162頁参照)、神経変性疾患(例えば、パーキンソン病)、および脳卒中のような神経性状態の治療黄斑変性症を含む眼疾患治療、癌症状と治療(例えばジェファーズ、エム等(Jeffers, M., et al.)、キャンサーリサーチ(Cancer Research)、61巻、3131—3138頁、4月1日、(2001年)及びジェファーズ等(Jeffers,, et al.)、エキスパートオピニオンオンセラピューティックターゲット(Expert Opinion on Therapeutic Targets)、(2002年)、6巻(4号)、469−482頁参照)及び糖尿病の治療を含む多くの異なる徴候治療薬として探求されている。残念ながら疾患や状態治療用FGF—9、FGF—18、FGF—20及びFGF—21のような治療用タンパク質投与は、例えば短い半減期変異原性物性により複雑になり得る。

ポリエチレングリコール(“PEG”)はポリペプチド複合化された代表的ポリマーである。ペプチド治療剤誘導化でのPEGの使用により、ペプチド免疫原性の減少と半減期を含む薬動力学の改良が示された。例えば米国特許4,179,337(デイビス等(Davis, et al.))はポリエチレングリコール(PEG)かポリプロピレングリコールと結合した酵素ペプチドのような非免疫原性ポリペプチドに関する。ポリペプチド1モル当たり10乃至100モルの間のポリマーを使用し、少なくとも15%の生理活性を維持した。更に問題のポリペプチドPEG複合物大きさの増加により循環時のクリアランス時間が延長された。デイビス等(Davis, et al.)開示の方法は化学的ペグ化法である。

ペプチドの化学修飾はしばしばペプチド修飾に用いた化学非選択性により好ましくないペプチド活性損失が生じる。例えば修飾基水溶性ペプチド、例えばPEGである場合、ペプチドに対するPEGとその誘導体付着の主様式では、ペプチドアミノ酸残基による非特異的結合となる。水溶性ポリマーインターロイキン—2との複合物(フィッシャー等(Fisher et al.)、ブリティッシュジャーナルオブヘマトロジー(Br. J. Haematol.)、82巻、654頁(1992年))、顆粒球コロニー刺激因子との複合物(佐石川等(Satake−Ishikawa et al.)、セルストラクチャーアンドファンクション(Cell Struct. Funct.)、17巻、157頁(1992年))、腫瘍壊死因子との複合物(等(Tsutsumi et al.)、ブリティッシュジャーナルオブキャンサー(Bri. J. Cancer)、71巻、963頁、(1996年))及び線維芽細胞成長因子との複合物(クラーク等(Clark et al.)、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J. Biol. Chem.)、271巻21969頁(1996年))の研究で、これらタンパク質の化学的ペグ化によりペプチドとの生体内受容体結合活性が低下することが示された。

多くの化学的ペグ化法でポリエチレングリコールが実質的に無作為に非特異的にペプチドバックボーン上の反応性残基に付加する。治療用ペプチド産生には特異的標識化した容易に特性化できる実質的に均質な産物を形成する誘導化戦略を用いることが明らかに望ましい。特異的に標識化したペプチドを産生する有望な手段は、糖転移酵素のような酵素を通して修飾糖成分をペプチドに付加することである。

酵素ベースの合成は位置選択性立体選択性で利点を有する。更に非保護基質を用いて酵素合成を行う。炭水化物合成で二つの主要種酵素である糖転移酵素(例えば、シアル酸転移酵素オリゴ糖転移酵素、N−アセチルグルコサミニル転移酵素)とグリコシダーゼを用いる。グリコシダーゼは更にエキソグリコシダーゼ(例えば、β—マンノシダーゼ、β—グリコシダーゼ)とエンドグリコシダアーゼ(例えば、エンドA、エンドM)に分類される。この種酵素のそれぞれをうまく合成に用いて炭水化物が産生された。一般的総説についてはクロート等(Crout et al.)、カレントオピニオンオンオンケミカルバイオロジー(Curr. Opin. Chem. Biol.)、2巻、98−111頁(1998年)を参照。

糖転移酵素は糖ペプチド上のオリゴ糖構造を修飾し、立体化学的、位置化学的に良く制御された特異的産物を産生する。糖転移酵素を用いてオリゴ糖を産生し、特に哺乳類細胞に産生の糖ペプチド上の末端N−連結及びO−連結炭化物構造を修飾する。例えば、糖ペプチドの末端オリゴ糖が完全にシアル酸付加し且つ/又はフコシル化され、糖ペプチドの薬動力学や種々の他生物物性が改良された一貫性のある糖構造を提供する。例えば、β—1,4−ガラクトシル基転移酵素を用いて、炭水化物合成での糖転移酵素利用の実例であるラクトサミンが合成された(例えばウオン等(Wong et al.)、ジャーナルオブオルガニックケミストリー(J. Org. Chem.)、47巻、5416−5418(1982年)参照)。更に多くの合成法でα—シアル酸転移酵素を利用してシチジン—5‘−一リン酸—N—アセチルノイラミン酸からガラクトースの3—水酸基位か6−水酸基位にシアル酸転移した(例えば、ケビン等(Kevin et al.)、ケミストリオブヨーロピアンジャーナル(Chem. Eur. J.)、2巻、1359—1362頁(1996年)参照)。フコースユニットグアノシン—5’—二リン酸フコースから糖類受容体の特定水酸基に転移する合成経路フコシル基転移酵素を用いる。例えば市川(Ichikawa)はクローン化フコシル転移酵素によるシアル酸付加ラクトサミンのフコシル化を伴う方法を用いて、シアリルルイス—Xを産生した(市川等(Ichikawa et al.)、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ(J. Am. Chem. Soc.)、114巻、9283−9298(1992年))。治療用複合糖質の最近の進歩に関する検討は、ケラー等(Koeller et al.)、ネーチャーバイオテクノロジー(Nature Biotechnology)、18巻、835—841頁(2000年)参照。又米国特許5,876,980、米国特許6,030,815、米国特許5,728,554、米国特許5,922,577及びWO/9831826参照。

グリコシダーゼは又糖類産生に使用できる。グリコシダーゼは通常グリコシド結合加水分解触媒する。しかし適切条件下ではグリコシダーゼはこの結合形成に使用できる。炭水化物合成に用いる大部分のグリコシダーゼはエキソグリコシダアーゼである。グリコシル転移が基質非還元性末端で起こる。このグリコシダーゼはグリコシル酵素中間体グリコシル供与体を取り込み、水により妨害されて加水分解物を生ずるか、又は受容体により新規グリコシドかオリゴ糖を生ずる。エキソグリコシダーゼを用いる典型的経路は、β—マンノシダーゼ作用で形成した取り扱いにくいβ—マンノシド結合を含む全N—結合糖ペプチドのコア三糖合成である(シン等(Singh et al.)、ケミカルコミュニケーション(Chem. Commun.)、993−994頁(1996年))。

グリコシド結合形成にグリコシダーゼを用いる他の代表的な適用では、変異グリコシダーゼを産生して活性部位内の正常な求核アミノ酸を非求核的アミノ酸に変える。変異酵素はグリコシド結合を加水分解せずにこの結合をまだ形成できる。変異グリコシダーゼを用いてα—フッ化グリコシル供与体とグリコシド受容体分子を用いたオリゴ糖を産生する(ウイザーズ等(Withers et al.)、米国特許5,716,812)。変異グリコシダーゼは遊離オリゴ糖形成には有用であるが、この酵素によりグリコシル供与体がグリコシル化ペプチドか非グリコシル化ペプチドに付加できるか、或いはこれら酵素は非活性化グリコシル供与体と一緒には用いられないかを示す必要が未だある。

その使用はエキソグリコシダーゼ使用に比しまれであるが、エンドグリコシダアーゼは又炭水化物産生に用いられる。エンドグリコシダアーゼ使用に基づく方法は単糖よりむしろオリゴ糖が転移される利点がある。エンド—Fやエンド—Mのようなエンド—β—N—アセチルグルコサミンを用いて、オリゴ糖断片が基質に付加された(ウオン等(Wang et al.)、テトラヘドロレター(Tetrahedron Lett.)、37巻、1975—1978及び羽田等(Haneda et al.)、カーボハイドレートリサーチ(Carbohydr. Res.)、292巻、61−70頁(1996年))。

炭水化物産生での使用以外に、上で検討の酵素は同様に糖ペプチド合成に応用される。均質糖鎖栄養素リボヌクレアーゼB合成が報告された(ビッテ、ケイ等(Witte K. et al.)、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ(J. Am. Chem. Soc.)、119巻、2114—2118頁(1997年))。リボヌクレアーゼBの高マンノースコアがその糖ペプチドをエンドグリコシダアーゼHで処理して切断した。この切断は二つのコアGlcNAc残基間で特異的に起こった。次いで四糖シアリルルイスXがβ—1,4−ガラクトシル基転移酵素、α—2,3—シアル酸転移酵素、α—1,3−フコシル基転移酵素Vを順次用いて、均質タンパク質上の残留GlcNAcアンカー部位酵素的再構築された。酵素触媒の各段階は高収率で進んだ。

化学的合成要素と酵素的合成要素の両者を組み合わす方法も又知られている。例えば山本と共同研究者(カーボハイドレートリサーチ(Carbohydr. Res.)、305巻、415−422頁(1998年))はエンドグリコシダアーゼを用いて糖ペプチドであるグリコシル化ペプチドTの化学酵素的合成を報告した。純粋に化学的手段でN—アセチルグルコサミニルペプチドが合成された。次いでこのペプチドをヒトトランスフェリン糖ペプチドのオリゴ糖で酵素的に産生した。エンド—β—N—アセチルグルコミニダーセで処理して糖部分をこのペプチドに付加した。生成グルコシル化ペプチドは、ペプチドTやN—アセチルグルコサミニルペプチドTに比してタンパク質分解に対し非常に安定且つ耐性であった。

ペプチド構造レポーター群で修飾するためにグルコシル転移酵素の使用が探求された。例えば、ブロスマー等(Brossmer et al.)(米国特許5,405,753)はシアル酸蛍光標識シチジン一リン酸(“CMP”)誘導体形成と、シアル酸転移酵素活性と細胞表面、糖タンパク質及びガングリオシドの蛍光標識のためのアッセイでの蛍光性グリコシドの使用を開示した。グロス等(Gross et al.)(アナリティカルバイオケミストリー(Analyt. Biochem.)、186巻、127頁(1990年)は類似のアッセイを記述している。ビーン等(Bean et al.)(米国特許5,432,059)は不完全グリコシル化タンパク質の再グリコシル化を用いるグリコシル化欠損症のアッセイを開示している。蛍光標識化CMPグリコシドによりこの欠損タンパク質を再グリコシル化する。各蛍光性シアル酸誘導体を9位か、通常シアル酸ではアセチル化されたアミン位のいずれかで蛍光性成分と置換する。蛍光性シアル酸誘導体を用いる方法はグリコシル転移酵素の存在又は非グリコシル化糖タンパク質又は不適切グリコシル化糖タンパク質に対するアッセイである。アッセイを少量の酵素か生物起源試料の糖タンパク質上で行う。修飾シアル酸を用いた実験規模又は工業規模でのグリコシル化ペプチド又は非グリコシル化ペプチドの酵素的誘導体化に付いては、これらの文献のいずれでも開示も示唆もされていない。

糖ペプチド質上グリコシル残基をそれに続く化学的産生で活性化するために又酵素法が用いられた。グリコシル残基は通常ガラクトース酸化酵素を用いて活性化され、末端ガラクトース残基を相応アルデヒドに変換する。このアルデヒドは次いでアミン含有修飾基と結合する。例えばカサレス等(Casares et al.)(ネーチャーバイオテクノロジー(Nature Biotech.)、19巻、142頁(2001年))は、ドキソルビシン組み換え型MHCIIペプチドキメラ酸化ガラクトース残基に付着した。

グリコシル残基は又ケトン基を有するように修飾された。例えば、マハル(Mahal)と共同研究者(サイエンス(Science)、276巻、1125頁(1997年))は天然基質では通常アセチル基が占める位置にケトン機能性を有するN—レブノイルマンノサミン(“ManLev”)を産生した。細胞をこのManLevで処理してケトン基を細胞表面に組み入れた。サクソン等(Saxon et al.)、サイエンス(Science)、287巻、2007頁(2000年)、ハン等(Hang et al.)ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ(J. Am. Chem. Soc.)、123巻、1242頁(2001年)、ヤレマ等(Yarema et al.)、ジャーナルオブオブバイオロジカルケミストリー(J. Biol. Chem.)、273巻、31168頁(1998年)及びチャーター等(Charter et al.)、グリコバイオロジー(Glycobiology)、10巻、1049頁(2000年)参照。

炭水化物は幾つかの方法で糖ペプチドに付着するが、アスパラギンとのN−結合、セリンスレオニンとのムチン型O−結合が組換え型糖タンパク質治療剤と最も良く関連する。明らかにタンパク質領域と構造を含む他因子も役割を果たすが、タンパク質のグリコシル化開始に関する決定因子一次配列状況である。N−結合グリコシル化は共通配列NXS/Tで起こり、ここでXはプロリン以外の任意アミノ酸である。

本発明は新規導入のN−連結又はO−連結グリコシル化部位含有のFGF変異体を提供し、これら組換え型FGF変異体のグリコシル化及び/又は糖質ペグ化に柔軟性を提供することでこれらの必要性に答える。更に該発明はN−連結又はO−連結変異FGFペプチドを水溶性ポリマー、治療成分生体分子及び類似体のような修飾基で修飾する工業的実用法を提供する。特に興味があるのは、修飾変異FGFが改良物性を有し治療薬や診断薬としての使用を強化する方法である。

概要

本発明は線維芽細胞成長因子(FGF)、特に一つ又は複数の新規導入N連結又はO連結グリコシル化部位を含むFGF—20及びFGF−21の変異体に関する。変異体のポリヌクレオチドコード配列、該コード配列含有発現カセット、該変異体発現細胞及び該変異体産生法も又開示される。更に該変異体含有薬剤組成及び該変異体使用法も開示される。なし

目的

特異的に標識化したペプチドを産生する有望な手段は、糖転移酵素のような酵素を通して修飾糖成分をペプチドに付加することである

効果

実績

技術文献被引用数
3件
牽制数
5件

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請求項1

線維芽細胞成長因子(FGF)複合物がFGFペプチド及び修飾基からなり、該修飾基が無傷グリコシル結合基により該ペプチドの事前選択グリコシル又はアミノ残基位で該ペプチドと結合する線維芽細胞成長因子。

請求項2

該FGFペプチドがFGF−1、FGF−2、FGF−18、FGF−20及びFGF−21から選んだ構成員である請求項1のFGF複合物。

請求項3

該FGFペプチドがSEQID NO: 1,9−14、18−45、48−65、69−109、112−146、161−214、220−320及び323−360からなる一群から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも95%相同である請求項1のFGF複合物。

請求項4

該修飾基が該予備選択グリコシル残基共役結合した請求項1のFGF複合物。

請求項5

該修飾基が非グリコシド修飾基である請求項4のFGF複合物。

請求項6

該非グリコシド修飾基が線型PEG及び分岐PEGから選んだ構成員である請求項5のFGF複合物。

請求項7

該PEG成分が線型PEGであり、該線型PEGが以下の式による構造を有し、この式でR2は水素原子置換アルキル又は非置換アルキル置換アリール又は非置換アリール置換ヘテロアリール又は非置換ヘテロアリール置換ヘテロシクロアルキル又は非置換ヘテロシクロアルキル置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキル、例えばアセタール、OHC- 、H2N-CH2CH2-, HS-CH2CH2-及び-(CH2)qC(Y1)Z2、糖—ヌクレオチド又はタンパク質であり、nは1乃至2500から選んだ整数であり、m、o及びqは0乃至20から独立に選んだ整数であり、ZはOH、 NH2、ハロゲン原子、S-R3、活性化エステルアルコール部分、-(CH2)pC(Y2)V、-(CH2)pU(CH2)s C(Y2)V、—糖—ヌクレオチド、タンパク質及び脱離基、例えばイミダゾール、p−ニトロフェニル、HOBTテトラゾールハロゲン化物であり、X,Y1、Y2、W及びUは酸素原子硫黄原子、N-R4から独立に選び、VはOH、 NH2、ハロゲン原子、S-R5、活性化エステルのアルコール部分、活性アミドアミン成分、糖—ヌクレオチド及びタンパク質であり、p、s及びvは0乃至20から独立に選んだ整数であり、R3、R4及びR5は水素原子、置換アルキル又は非置換アルキル、置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキル、置換アリール又は非置換アリール、置換ヘテロシクロアルキル又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロアリール又は非置換ヘテロアリールから独立に選んだ請求項6のFGF複合物。

請求項8

該グリコシル結合基が以下の式による構造を有する請求項1のFGF複合物で、ここでR2は水素原子、CH2OR7、COOR7又はOR7であり、ここでR7は水素原子、置換アルキル又は非置換アルキル又は置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキルを表し、R3及びR4及びは水素原子、置換アルキル又は非置換アルキル、OR8、NHC(O)R9から独立に選ぶ構成員であり、ここでR8及びR9は水素原子、置換アルキル又は非置換アルキル、置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキル又はシアリル酸から独立に選び、Laは結合、置換アルキル又は非置換アルキル、置換ヘテロアルキル及び非置換ヘテロアルキルから選ぶリンカーであり、R16及びR17は独立に選択したポリマー型アームであり、X2及びX4はポリマー成分R16及びR17を炭素原子に連結する独立に選んだ結合断片であり且つX5は非反応性基であるFGF複合物。

請求項9

該グリコシル結合基が以下の式による構造を有する請求項8のFGF複合物。

請求項10

変異線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチド配列からなる単離核酸であり、該変異線維芽細胞成長因子が相応する野生型線維芽細胞成長因子に存在しない新規導入のN連結又はO連結グリコシル化部位を含む単離核酸。

請求項11

核酸が少なくとも95%SEQID NO:1に相同な相応野生型線維芽細胞成長因子—20アミノ酸配列を有する変異線維芽細胞成長因子—20をコード化した請求項10の核酸。

請求項12

新規導入グリコシル化部位がプロリン残基近くである請求項10の核酸。

請求項13

該プロリン残基がSEQID NO:1の3、28、29、34、35、52、81、175、192、19又は201位に位置する請求項12の核酸。

請求項14

変異線維芽細胞成長因子がSEQID NO:9—4、18—45、48—65、69—109、112—145、161—214、220—320及び323—360からなる一群から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列に少なくとも95%相同な請求項10の核酸。

請求項15

変異線維芽細胞成長因子が一つより多い新規導入グリコシル化部位を含む請求項10の核酸。

請求項16

請求項10の核酸を含む発現カセット

請求項17

請求項10の核酸を含む細胞

請求項18

相応野生型線維芽細胞成長因子に存在しない新規導入のN連結又はO連結グリコシル化部位を含む変異線維芽細胞成長因子。

請求項19

相応野生型変異線維芽細胞成長因子がSEQID NO:1に少なくとも95%相同なアミノ酸配列を有する請求項18の変異線維芽細胞成長因子。

請求項20

新規導入グリコシル化部位がプロリン残基に近接する請求項18の変異線維芽細胞成長因子。

請求項21

プロリン残基がSEQID NO:1の3、28、29、34、35、52、81、175、192、197及び201位に位置する請求項20の変異線維芽細胞成長因子。

請求項22

該変異FGFがSEQID NO:9—14、18—45、48—65、69—109、112—145、161—214、220—320及び323—360からなる一群から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列に少なくとも95%相同な請求項18の変異線維芽細胞成長因子。

請求項23

変異線維芽細胞成長因子が一つより多い新規導入グリコシル化部位を含む請求項18の変異線維芽細胞成長因子。

請求項24

グリコシルリンカーによりグリコシル化部位と結合した水溶性ポリマーを含む請求項18の変異線維芽細胞成長因子。

請求項25

該グリコシルリンカーが無傷グリコシルリンカーである請求項24の変異線維芽細胞成長因子。

請求項26

相応野生型変異線維芽細胞成長因子に存在しない新規導入のN連結又はO連結グリコシル化を含む変異線維芽細胞成長因子作成法で、(a)該変異線維芽細胞成長因子を組み換え産生する段階と、(b)該変異線維芽細胞成長因子を新規導入グリコシル化部位でグリコシル化する段階を含み、該グリコシル化が無細胞試験管内プロセスである変異線維芽細胞成長因子作成法。

請求項27

相応野生型変異線維芽細胞成長因子がSEQID NO:1に少なくとも95%相同なアミノ酸配列を有する請求項26の方法。

請求項28

新規導入グリコシル化部位がプロリン残基に近い請求項26の方法。

請求項29

プロリン残基がSEQID NO:1の3、28、29、34、35、52、81、175、192、197又は201位に位置する請求項28の方法。

請求項30

変異線維芽細胞成長因子がSEQID NO:9—14、18—45、48—65、69—109、112—145、161—214、220—320及び323—360からなる一群から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む請求項26の方法。

請求項31

変異線維芽細胞成長因子が一つより多い新規導入グリコシル化部位を含む請求項26の方法。

請求項32

相応野生型変異線維芽細胞成長因子に存在しない新規導入のN連結又はO連結グリコシル化を含む有効量の変異線維芽細胞成長因子含有の薬剤組成

請求項33

相応野生型変異線維芽細胞成長因子がSEQID NO:1に少なくとも95%相同なるアミノ酸配列を有する請求項32の組成

請求項34

新規導入グリコシル化部位がプロリン残基近くである請求項32の組成。

請求項35

プロリン残基がSEQID NO:1の3、28、29、34、35、52、81、175、192、197又は201位に位置する請求項34の組成。

請求項36

変異線維芽細胞成長因子がSEQID NO:9—14、18—45、48—65、69—109、112—145、161—214、220—320及び323—360からなる一群から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列に少なくとも95%相同な請求項32の組成。

請求項37

変異線維芽細胞成長因子が一つより多い新規導入グリコシル化部位を含む請求項32の組成。

請求項38

有効量の変異線維芽細胞成長因子を該患者投与することを含む線維芽細胞成長因子欠損治療法で、該変異線維芽細胞成長因子が相応野生型変異線維芽細胞成長因子に存在しない新規導入のN連結又はO連結グリコシル化を含む治療法。

請求項39

相応野生型変異線維芽細胞成長因子がSEQID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項38の方法。

請求項40

新規導入グリコシル化部位がプロリン残基近くである請求項38の方法。

請求項41

プロリン残基がSEQID NO:1の3、28、29、34、35、52、81、175、192、197又は201位に位置する請求項40の方法。

請求項42

変異線維芽細胞成長因子がSEQID NO:9—14、18—45、48—65、69—109、112—145、161—214、220—320及び323—360からなる一群から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列に少なくとも95%相同な請求項38の方法。

請求項43

変異線維芽細胞成長因子が一つより多い新規導入グリコシル化部位を含む請求項38の方法。

請求項44

相応野生型変異線維芽細胞成長因子に存在しない新規導入のN連結又はO連結グリコシル化を含む変異線維芽細胞成長因子の複合糖質作成法で、(a)該変異線維芽細胞成長因子を組み換え産生する段階と、(b)該変異線維芽細胞成長因子を新規導入グリコシル化部位で修飾糖により酵素的にグリコシル化する段階を含み、該グリコシル化が無細胞試験管内プロセスである複合糖質作成法。

請求項45

該修飾糖が水溶性ポリマーで修飾する請求項44の方法。

請求項46

該修飾糖がポリエチレングリコール及びm−ポリエチレングリコールからなる一群から選んだ水溶性ポリマーで修飾する請求項45の方法。

請求項47

相応野生型変異線維芽細胞成長因子がSEQID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項44の方法。

請求項48

新規導入グリコシル化部位がプロリン残基近くである請求項45の方法。

請求項49

プロリン残基がSEQID NO:1の3、28、29、34、35、52、81、175、192、197又は201位に位置する請求項44の方法。

請求項50

変異線維芽細胞成長因子がSEQID NO:9—14、18—45、48—65、69—109、112—145、161—214、220—320及び323—360からなる一群から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む請求項44の方法。

請求項51

変異線維芽細胞成長因子が一つより多い新規導入グリコシル化部位を含む請求項44の方法。

背景技術

0001

関連出願の相互参照
本出願は2004年10月29日に出願の米国仮特許出願60/623,342に関連し、全体を多目的のために本出願に関して参考として組み入れる。

0002

線維芽細胞成長因子(FGF)は広範囲細胞組織型の成長、増殖、生存及び分化増進する。原型線維芽細胞成長因子(FGF)のFGF—1及びFGF—2は最初脳と下垂体ら線維芽細胞分裂促進因子として単離された。しかしFGF—1、FGF—2及び線維成長因子通常成長組織成人組織で広く発現され、血管新生有糸分裂誘発細胞分化及び組織損傷
復を含む多重生物活性を有する(例えばベイアード、エイ等(Baird, A. et.al.)、キャンサーセル(Cancer Cells)、3巻、239−243頁(1991)及びバーゲス、ダブリエッチ等(Burgess, W.H., et al.)、アニュアルビュオブバイオケミストリー(Annu. Rev. Biochem.)、58巻、575−606頁(1989)参照)。

0003

公開文献によると、FGFファミリーは少なくともFGF—1からFGF—25の25の構成員からなる。FGF群における25の構成員の分子量は17キロダルトン乃至34キロダルトンの範囲で、13乃至71%のアミノ酸同一性共有する。FGFは脊椎動物種間で遺伝子構造アミノ酸配列両者を高度に保存する。

0004

哺乳類FGFファミリーの25の構成員は多くの組織で差別的に発現される。その構成員は個々にはユニークではあるが類似発現様式を有するサブファミリーに分かれる。あるFGFは胚発生時にのみに発現される(例えばFGF3,4、8、15、17及び19)一方、他は胚組織及び成人組織で発現される。例えばFGF—16伝令RNAは主として成人組織のラット心臓で発現される。しかしラットのではFGF—16伝令RNAは褐色脂肪組織で主として発現される(例えば三宅、エイ等(Miyake A, et al.)、バイオケミストリーバイオフィジックリサーチコミュニケーション(Biochem. Biophys. Res. Commun.)、1998年、243巻、148−152頁参照)。

0005

大部分のFGF(FGF3−8、10、15、17−19及び21−25)はアミノ末端シグナルペプチドを有し細胞から容易に分泌されるが、FGF9、16及び20は明白なアミノ末端シグナルペプチドを欠くにもかかわらず分泌される(例えば、本、エム等(Miyamaoto,M., et al.)、モレキュラーセルバイオロジー(Mol. Cell. Biol.)、13巻、4251−4259頁参照)。FGFの第三サブセット(FGF11−14)はシグナル配列を欠き細胞内に留まると考えられる。

0006

上記のごとくFGF—9、FGF—16及びFGF—20からなるFGFタンパク質のサブファミリーは、核局在化シグナルを含むが古典的シグナル配列に欠け分泌される。これらのFGFは発育神経系と成人神経系で発現され、神経系の成長と機能での役割示唆する(例えば、スモールウッド、ピーエム等(Smallwood P.M., et al.)、プロシーディングオブナシナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、(1996年)、93巻、9850−9857頁参照)。実際にFGFコード化相補DNAがラットの脳から単離された(例えば米国特許6,797,695参照)。FGFファミリー構成員中でFGF—20はFGF—9とFGF—16と最も類似している(それぞれ70%と62%のアミノ酸同一性)。

0007

ヒト疾患での多くの研究と同様に遺伝子ノックアウトマウスでの研究により、FGFは末梢神経系と中枢神経系両者の細胞に神経栄養性であり、哺乳類骨格系の発育に重要である。神経系発育と機能での役割は、FGF—20伝令RNAが脳の黒質緻密部優先的に発現されることを示すインサイツハイブリッド形成研究により支持される。試験管組み換えラットFGF—20が培養物中の中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存を強めることを示す研究により、更に神経系機能が支持されることが見出された。

0008

他の研究では高度のFGF—21伝令RNA発現が肝臓で起こることが示され、ヒトFGF—21が肝疾患発生と回復で役立つ。FGF—21は又精巣胸腺で発現し、それ故精巣機能障害胸腺由来細胞機能の発生か回復に役立つ(例えば米国特許6,716,626参照)。

0009

これらの広範囲で強力な活性により、FGFは筋骨格状態、骨折靱帯組織修復腱炎滑液包炎等のような創傷治癒、例えば、火傷切り傷裂傷褥瘡遅効治癒性潰瘍のような皮膚状態、組織保護、修復、心筋梗塞虚血時の血管新生誘導炎症状態炎症疾患(例えば炎症性腸疾患を含む腸炎症、例えばジェファーズ等(Jeffers, M., et al.)、ガストエンテロロジー(Gastroenterology)、2002年、123巻、1151−1162頁参照)、神経変性疾患(例えば、パーキンソン病)、および脳卒中のような神経性状態の治療黄斑変性症を含む眼疾患治療、癌症状と治療(例えばジェファーズ、エム等(Jeffers, M., et al.)、キャンサーリサーチ(Cancer Research)、61巻、3131—3138頁、4月1日、(2001年)及びジェファーズ等(Jeffers,, et al.)、エキスパートオピニオンオンセラピューティックターゲット(Expert Opinion on Therapeutic Targets)、(2002年)、6巻(4号)、469−482頁参照)及び糖尿病の治療を含む多くの異なる徴候治療薬として探求されている。残念ながら疾患や状態治療用FGF—9、FGF—18、FGF—20及びFGF—21のような治療用タンパク質投与は、例えば短い半減期変異原性物性により複雑になり得る。

0010

ポリエチレングリコール(“PEG”)はポリペプチド複合化された代表的ポリマーである。ペプチド治療剤誘導化でのPEGの使用により、ペプチド免疫原性の減少と半減期を含む薬動力学の改良が示された。例えば米国特許4,179,337(デイビス等(Davis, et al.))はポリエチレングリコール(PEG)かポリプロピレングリコールと結合した酵素ペプチドのような非免疫原性ポリペプチドに関する。ポリペプチド1モル当たり10乃至100モルの間のポリマーを使用し、少なくとも15%の生理活性を維持した。更に問題のポリペプチドPEG複合物大きさの増加により循環時のクリアランス時間が延長された。デイビス等(Davis, et al.)開示の方法は化学的ペグ化法である。

0011

ペプチドの化学修飾はしばしばペプチド修飾に用いた化学非選択性により好ましくないペプチド活性損失が生じる。例えば修飾基水溶性ペプチド、例えばPEGである場合、ペプチドに対するPEGとその誘導体付着の主様式では、ペプチドアミノ酸残基による非特異的結合となる。水溶性ポリマーインターロイキン—2との複合物(フィッシャー等(Fisher et al.)、ブリティッシュジャーナルオブヘマトロジー(Br. J. Haematol.)、82巻、654頁(1992年))、顆粒球コロニー刺激因子との複合物(佐石川等(Satake−Ishikawa et al.)、セルストラクチャーアンドファンクション(Cell Struct. Funct.)、17巻、157頁(1992年))、腫瘍壊死因子との複合物(等(Tsutsumi et al.)、ブリティッシュジャーナルオブキャンサー(Bri. J. Cancer)、71巻、963頁、(1996年))及び線維芽細胞成長因子との複合物(クラーク等(Clark et al.)、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J. Biol. Chem.)、271巻21969頁(1996年))の研究で、これらタンパク質の化学的ペグ化によりペプチドとの生体内受容体結合活性が低下することが示された。

0012

多くの化学的ペグ化法でポリエチレングリコールが実質的に無作為に非特異的にペプチドバックボーン上の反応性残基に付加する。治療用ペプチド産生には特異的標識化した容易に特性化できる実質的に均質な産物を形成する誘導化戦略を用いることが明らかに望ましい。特異的に標識化したペプチドを産生する有望な手段は、糖転移酵素のような酵素を通して修飾糖成分をペプチドに付加することである。

0013

酵素ベースの合成は位置選択性立体選択性で利点を有する。更に非保護基質を用いて酵素合成を行う。炭水化物合成で二つの主要種酵素である糖転移酵素(例えば、シアル酸転移酵素オリゴ糖転移酵素、N−アセチルグルコサミニル転移酵素)とグリコシダーゼを用いる。グリコシダーゼは更にエキソグリコシダーゼ(例えば、β—マンノシダーゼ、β—グリコシダーゼ)とエンドグリコシダアーゼ(例えば、エンドA、エンドM)に分類される。この種酵素のそれぞれをうまく合成に用いて炭水化物が産生された。一般的総説についてはクロート等(Crout et al.)、カレントオピニオンオンオンケミカルバイオロジー(Curr. Opin. Chem. Biol.)、2巻、98−111頁(1998年)を参照。

0014

糖転移酵素は糖ペプチド上のオリゴ糖構造を修飾し、立体化学的、位置化学的に良く制御された特異的産物を産生する。糖転移酵素を用いてオリゴ糖を産生し、特に哺乳類細胞に産生の糖ペプチド上の末端N−連結及びO−連結炭化物構造を修飾する。例えば、糖ペプチドの末端オリゴ糖が完全にシアル酸付加し且つ/又はフコシル化され、糖ペプチドの薬動力学や種々の他生物物性が改良された一貫性のある糖構造を提供する。例えば、β—1,4−ガラクトシル基転移酵素を用いて、炭水化物合成での糖転移酵素利用の実例であるラクトサミンが合成された(例えばウオン等(Wong et al.)、ジャーナルオブオルガニックケミストリー(J. Org. Chem.)、47巻、5416−5418(1982年)参照)。更に多くの合成法でα—シアル酸転移酵素を利用してシチジン—5‘−一リン酸—N—アセチルノイラミン酸からガラクトースの3—水酸基位か6−水酸基位にシアル酸転移した(例えば、ケビン等(Kevin et al.)、ケミストリオブヨーロピアンジャーナル(Chem. Eur. J.)、2巻、1359—1362頁(1996年)参照)。フコースユニットグアノシン—5’—二リン酸フコースから糖類受容体の特定水酸基に転移する合成経路フコシル基転移酵素を用いる。例えば市川(Ichikawa)はクローン化フコシル転移酵素によるシアル酸付加ラクトサミンのフコシル化を伴う方法を用いて、シアリルルイス—Xを産生した(市川等(Ichikawa et al.)、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ(J. Am. Chem. Soc.)、114巻、9283−9298(1992年))。治療用複合糖質の最近の進歩に関する検討は、ケラー等(Koeller et al.)、ネーチャーバイオテクノロジー(Nature Biotechnology)、18巻、835—841頁(2000年)参照。又米国特許5,876,980、米国特許6,030,815、米国特許5,728,554、米国特許5,922,577及びWO/9831826参照。

0015

グリコシダーゼは又糖類産生に使用できる。グリコシダーゼは通常グリコシド結合加水分解触媒する。しかし適切条件下ではグリコシダーゼはこの結合形成に使用できる。炭水化物合成に用いる大部分のグリコシダーゼはエキソグリコシダアーゼである。グリコシル転移が基質非還元性末端で起こる。このグリコシダーゼはグリコシル酵素中間体グリコシル供与体を取り込み、水により妨害されて加水分解物を生ずるか、又は受容体により新規グリコシドかオリゴ糖を生ずる。エキソグリコシダーゼを用いる典型的経路は、β—マンノシダーゼ作用で形成した取り扱いにくいβ—マンノシド結合を含む全N—結合糖ペプチドのコア三糖合成である(シン等(Singh et al.)、ケミカルコミュニケーション(Chem. Commun.)、993−994頁(1996年))。

0016

グリコシド結合形成にグリコシダーゼを用いる他の代表的な適用では、変異グリコシダーゼを産生して活性部位内の正常な求核アミノ酸を非求核的アミノ酸に変える。変異酵素はグリコシド結合を加水分解せずにこの結合をまだ形成できる。変異グリコシダーゼを用いてα—フッ化グリコシル供与体とグリコシド受容体分子を用いたオリゴ糖を産生する(ウイザーズ等(Withers et al.)、米国特許5,716,812)。変異グリコシダーゼは遊離オリゴ糖形成には有用であるが、この酵素によりグリコシル供与体がグリコシル化ペプチドか非グリコシル化ペプチドに付加できるか、或いはこれら酵素は非活性化グリコシル供与体と一緒には用いられないかを示す必要が未だある。

0017

その使用はエキソグリコシダーゼ使用に比しまれであるが、エンドグリコシダアーゼは又炭水化物産生に用いられる。エンドグリコシダアーゼ使用に基づく方法は単糖よりむしろオリゴ糖が転移される利点がある。エンド—Fやエンド—Mのようなエンド—β—N—アセチルグルコサミンを用いて、オリゴ糖断片が基質に付加された(ウオン等(Wang et al.)、テトラヘドロレター(Tetrahedron Lett.)、37巻、1975—1978及び羽田等(Haneda et al.)、カーボハイドレートリサーチ(Carbohydr. Res.)、292巻、61−70頁(1996年))。

0018

炭水化物産生での使用以外に、上で検討の酵素は同様に糖ペプチド合成に応用される。均質糖鎖栄養素リボヌクレアーゼB合成が報告された(ビッテ、ケイ等(Witte K. et al.)、ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ(J. Am. Chem. Soc.)、119巻、2114—2118頁(1997年))。リボヌクレアーゼBの高マンノースコアがその糖ペプチドをエンドグリコシダアーゼHで処理して切断した。この切断は二つのコアGlcNAc残基間で特異的に起こった。次いで四糖シアリルルイスXがβ—1,4−ガラクトシル基転移酵素、α—2,3—シアル酸転移酵素、α—1,3−フコシル基転移酵素Vを順次用いて、均質タンパク質上の残留GlcNAcアンカー部位酵素的再構築された。酵素触媒の各段階は高収率で進んだ。

0019

化学的合成要素と酵素的合成要素の両者を組み合わす方法も又知られている。例えば山本と共同研究者(カーボハイドレートリサーチ(Carbohydr. Res.)、305巻、415−422頁(1998年))はエンドグリコシダアーゼを用いて糖ペプチドであるグリコシル化ペプチドTの化学酵素的合成を報告した。純粋に化学的手段でN—アセチルグルコサミニルペプチドが合成された。次いでこのペプチドをヒトトランスフェリン糖ペプチドのオリゴ糖で酵素的に産生した。エンド—β—N—アセチルグルコミニダーセで処理して糖部分をこのペプチドに付加した。生成グルコシル化ペプチドは、ペプチドTやN—アセチルグルコサミニルペプチドTに比してタンパク質分解に対し非常に安定且つ耐性であった。

0020

ペプチド構造レポーター群で修飾するためにグルコシル転移酵素の使用が探求された。例えば、ブロスマー等(Brossmer et al.)(米国特許5,405,753)はシアル酸蛍光標識シチジン一リン酸(“CMP”)誘導体形成と、シアル酸転移酵素活性と細胞表面、糖タンパク質及びガングリオシドの蛍光標識のためのアッセイでの蛍光性グリコシドの使用を開示した。グロス等(Gross et al.)(アナリティカルバイオケミストリー(Analyt. Biochem.)、186巻、127頁(1990年)は類似のアッセイを記述している。ビーン等(Bean et al.)(米国特許5,432,059)は不完全グリコシル化タンパク質の再グリコシル化を用いるグリコシル化欠損症のアッセイを開示している。蛍光標識化CMPグリコシドによりこの欠損タンパク質を再グリコシル化する。各蛍光性シアル酸誘導体を9位か、通常シアル酸ではアセチル化されたアミン位のいずれかで蛍光性成分と置換する。蛍光性シアル酸誘導体を用いる方法はグリコシル転移酵素の存在又は非グリコシル化糖タンパク質又は不適切グリコシル化糖タンパク質に対するアッセイである。アッセイを少量の酵素か生物起源試料の糖タンパク質上で行う。修飾シアル酸を用いた実験規模又は工業規模でのグリコシル化ペプチド又は非グリコシル化ペプチドの酵素的誘導体化に付いては、これらの文献のいずれでも開示も示唆もされていない。

0021

糖ペプチド質上グリコシル残基をそれに続く化学的産生で活性化するために又酵素法が用いられた。グリコシル残基は通常ガラクトース酸化酵素を用いて活性化され、末端ガラクトース残基を相応アルデヒドに変換する。このアルデヒドは次いでアミン含有修飾基と結合する。例えばカサレス等(Casares et al.)(ネーチャーバイオテクノロジー(Nature Biotech.)、19巻、142頁(2001年))は、ドキソルビシン組み換え型MHCIIペプチドキメラ酸化ガラクトース残基に付着した。

0022

グリコシル残基は又ケトン基を有するように修飾された。例えば、マハル(Mahal)と共同研究者(サイエンス(Science)、276巻、1125頁(1997年))は天然基質では通常アセチル基が占める位置にケトン機能性を有するN—レブノイルマンノサミン(“ManLev”)を産生した。細胞をこのManLevで処理してケトン基を細胞表面に組み入れた。サクソン等(Saxon et al.)、サイエンス(Science)、287巻、2007頁(2000年)、ハン等(Hang et al.)ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ(J. Am. Chem. Soc.)、123巻、1242頁(2001年)、ヤレマ等(Yarema et al.)、ジャーナルオブオブバイオロジカルケミストリー(J. Biol. Chem.)、273巻、31168頁(1998年)及びチャーター等(Charter et al.)、グリコバイオロジー(Glycobiology)、10巻、1049頁(2000年)参照。

0023

炭水化物は幾つかの方法で糖ペプチドに付着するが、アスパラギンとのN−結合、セリンスレオニンとのムチン型O−結合が組換え型糖タンパク質治療剤と最も良く関連する。明らかにタンパク質領域と構造を含む他因子も役割を果たすが、タンパク質のグリコシル化開始に関する決定因子一次配列状況である。N−結合グリコシル化は共通配列NXS/Tで起こり、ここでXはプロリン以外の任意アミノ酸である。

0024

本発明は新規導入のN−連結又はO−連結グリコシル化部位含有のFGF変異体を提供し、これら組換え型FGF変異体のグリコシル化及び/又は糖質ペグ化に柔軟性を提供することでこれらの必要性に答える。更に該発明はN−連結又はO−連結変異FGFペプチドを水溶性ポリマー、治療成分生体分子及び類似体のような修飾基で修飾する工業的実用法を提供する。特に興味があるのは、修飾変異FGFが改良物性を有し治療薬や診断薬としての使用を強化する方法である。

0025

さて一個以上の修飾基(例えば、非グルコシド修飾基)で線維芽細胞成長因子を制御修飾することで、対応天然(非修飾)FGFに比し改良された薬動力学物性を有する新規FGFペプチド複合体が得られることが見出された。更に該発明のFGFペプチド複合体を信頼性と再現性のある費用効率の高い産生法が見出され且つ開発された。

0026

様態では該発明はFGFペプチドとFGFペプチドのアミノ酸残基に付着したグリコシル結合基—ポリエチレングリコールカセットからなるFGF複合体を提供する。

0027

典型的実施形態では該発明の複合糖質化FGF分子は、グリコシル化FGFペプチド又は非グリコシル化FGFペプチドと、その構造内にポリマー型修飾基、例えばポリエチレングリコールのような修飾基を含む酵素的転移可能な糖成分間で複合体を酵素仲介により形成して産生する。この修飾基は直接か(即ち二つの反応基の反応により形成する単一基を通して)、又はリンカー成分、例えば置換アルキル又は非置換アルキル置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキル等を通して糖成分と付着する。

0028

一様態では本発明はPEG成分と技術的に認知のFGFと同じかさもなければ類似の生体内活性を有するペプチド間の複合体を提供する。該発明のこの複合体では、PEG成分はグリコシル連結基無傷グリコシル連結基を通してペプチドと共有結合で付着する。典型的無傷グリコシル連結基としてはPEGで誘導体化したシアル酸成分が挙げられる。

0029

ポリマー型修飾基を有する糖成分はFGFグリコシル成分の任意位置で付着できる。更にポリマー型修飾基は野生型FGFペプチド又は変異FGFペプチドのアミノ酸配列の任意位置でグリコシル残基と結合できる。

0030

典型的実施形態では該発明によりポリマー型修飾基とグリコシル連結基で複合化したFGFペプチドが得られる。典型的FGFペプチド複合物としては以下から選んだ式を有するグリコシル連結基が挙げられる。

0031

式Iと式IIでR2は水素原子、CH2OR7、COOR7、COO−M+又はOR7で、R7は水素原子、置換アルキル又は非置換アルキル、置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキルである。記号R3、R4、R5、R6、及びR6‘は独立に水素原子、置換アルキル又は非置換アルキル、OR8、NHC(O)R9を表す。M+は金属である。指数dは0か1である。R8とR9は水素原子、置換アルキル又は非置換アルキル、置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキル又はシアル酸から独立に選ばれる。R3、R4、R5、R6又はR6‘の少なくとも一つはポリマー型修飾基、例えば、PEGを含む。代表的実施形態ではR6とR6’はこれらが付着した炭素原子と共にシアリル成分側鎖成分である。更なる代表的実施形態ではこの側鎖はポリマー型修飾基で官能化される。

0032

ここで検討するように該発明の複合物で用いるPEGは直鎖状でも分岐状でも良い。該発明の本実施形態による分岐PEG含有ペプチド複合物形成に用いる典型的前駆体は以下の式を有する。



この式による分岐ポリマー種は実質的に水溶性ポリマーである。X3'はイオン化可能基(例えばOH、COOH、H2PO4、HSO3、NH2及びその塩など)又は他反応性官能基、例えば以下の基を含む成分である。Cは炭素原子である。X5、R16及びR17は非反応性基(例えば、水素原子、非置換アルキル又は非置換ヘテロアルキル)とポリマーアーム(例えばPEG)から独立に選ぶ。X2及びX4は好ましくは生理的条件下では実質的に非反応性で、同一又は異なっても良い結合断片である。代表的リンカーとしては芳香族成分エステル成分も含まれれない。代わりにこれら結合は生理関連条件下で分解するように設計した一つ以上の成分、例えばエステル、ジスルフィドなどが挙げられる。X2及びX4によりポリマーアームR16とR17を炭素原子と連結する。X3'がリンカー−糖又はリンカー−糖カセットのような補足反応性を持つ反応性官能基と反応する場合、X3'は結合断片成分X3に変換する。

0033

代表的実施形態ではポリマー型修飾基は、通常グリコシルコア上のヘテロ原子(例えば、窒素原子酸素原子)により以下に示すようにリンカーLを通してグリコシル連結基と結合する。



R1はポリマー型修飾基であり、Lは一つの結合及び一つの連結基から選ぶ。指数wは1—6、好ましくは1—3、より好ましくは1—2から選んだ整数を表す。代表的連結基としては置換アルキル又は非置換アルキル、置換ヘテロアルキル又は非置換ヘテロアルキル成分及びシアル酸が挙げられる。リンカーの代表的成分はアシル成分である。他の代表的連結基はアミノ酸残基(例えば、システイン、セリン、リシン及び短鎖オリゴペプチド、例えば、Lys—Lys、Lys—Lys—Lys、Cys—Lys、Ser—Lys等)である。

0034

Lが結合の場合、R1前駆体上の反応性官能基とグリコシル連結基前駆体上の補足的反応性を持つ反応性官能基との反応でLは形成される。Lが非ゼロ次連結基の場合、LはR1前駆体と反応する前にグリコシル基上に配置されても良い。代わりにR1とL前駆体を予め形成したカセットに組み込み、次いでグリコシル成分に付着しても良い。ここに示すように適切な反応性官能基を持つ前駆体の選択作成は、技術の熟知者能力の範囲内である。更に該前駆体の連結は技術的に良く知られる化学により進められる。

0035

他様態では本発明により変異線維芽細胞成長因子をコードするポリヌクレオチドからなる単離核酸が得られる。該変異線維芽細胞成長因子は野生型線維芽細胞成長因子には存在しない一つ以上のN−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む。幾つかの実施形態では変異FGF—20コード化核酸はSEQID NO:1のアミノ酸配列を有する野生型線維芽細胞成長因子をコードする相応野生型配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:9−14。18−45、48−65、69−109及び112−145から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。幾つかの他実施形態では変異FGF—21コード化核酸はSEQIDNO:146のアミノ酸配列を有する野生型線維芽細胞成長因子をコードする相応野生型配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:161−214、220−320及び323−360から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。

0036

他様態では本発明により核酸、例えば、変異線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチド配列を含む単離核酸からなる発現カセットや細胞が得られる。変異線維芽細胞成長因子としては野生型線維芽細胞成長因子に存在しない一つ以上のN−連結グリコシル化部位又はO−連結グリコシル化部位が挙げられる。

0037

他様態では本発明により野生型線維芽細胞成長因子に存在しない一つ以上のN−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む変異線維芽細胞成長因子が得られる。幾つかの実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQID NO:1のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:9−14、18−45、48−65、69−109及び112−145から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。幾つかの他実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:146のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:161−214、220−320及び323−360から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。

0038

他様態では本発明により野生型線維芽細胞成長因子に存在しないN−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む変異線維芽細胞成長因子作成法が提供される。本方法は変異線維芽細胞成長因子を組み換え的に産生する段階と、新規グリコシル化部位で変異線維芽細胞成長因子をグリコシル化する段階を含む。幾つかの実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQID NO:1のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:9−14、18−45、48−65、69−109及び112−145から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。幾つかの他実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:146のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:161−214、220−320及び323−360から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。

0039

更なる様態では本発明は野生型線維芽細胞成長因子に存在しないN−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む治療有効量の変異線維芽細胞成長因子を有する薬剤組成を提供する。幾つかの実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQID NO:1のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:9−14、18−45、48−65、69−109及び112−145から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。幾つかの他実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:146のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:161−214、220−320及び323−360から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。

0040

上記様態のそれぞれで変異線維芽細胞成長因子は一つ以上の修飾基、好ましくは複合糖質化により一つ以上の修飾基と任意に複合化し、該グリコシル化部位と該修飾基間にグリコシル連結基を生成しても良い。代表的修飾基はポリエチレングリコールである。

図面の簡単な説明

0041

図1Aに異なる温度、時間、ベクター及び大腸菌株でのヒトFGF—20誘導のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動(SDS—PAGE)分析結果を示す。、レーン1及び14:分子量マーカー(キロダルトンの大きさで表示)(誘導温度);レーン2−9及び15−18:37℃;レーン10−13及び19−22:20℃。使用株:レーン2−4、6−8及び10−12、W3110;レーン5,9及び13、BL21(DE3);レーン15−17及び19−21、大腸菌(trxb、gor、supp);レーン18及び22では大腸菌(trxb、gor、supp)(DE3)。使用ベクター:レーン2,6,10、15及び19ではベクター#1を使用し、レーン3,7、11、16及び20ではベクター#2を使用し、レーン4,8、12、17及び21ではベクター#3を使用し、レーン5,9、13、18及び22ではベクター#4を使用する。

0042

図1Bに異なる温度と大腸菌株でのヒトFGF—21溶解度のSDS—PAGE分析結果を示し、レーン1は分子量マーカー(キロダルトンの大きさ)である。偶数ペレットを表し、奇数上澄みを表す。使用誘導温度:レーン2−3:20℃;レーン4−5:30℃;レーン6−7:37℃、レーン8−9では37℃。使用株:レーン6−7、BL21(DE3);レーン2−5及び8−9、大腸菌(trxb、gor、supp)(DE3)。ベクター#4を使用した。

0043

図1に異なる温度、時間、ベクター及び大腸菌株でのヒトFGF—20誘導のSDS—PAGE分析結果を示す。レーン1及び15:分子量マーカー(キロダルトンの大きさ);レーン2;非誘導であり(誘導温度);レーン3−10及び16−20:37℃、レーン11−14及び21−23:20℃。使用株:レーン3−5、7−9及び11−13、W3110;レーン6,10及び14、BL21(DE3);レーン16−19及び21−23、大腸菌(trxb、gor、supp);レーン20、大腸菌(trxb、gor、supp)(DE3)。使用ベクター:レーン3,7,11,17及び21ではベクター#1であり、レーン4,8、12,18及び22ではベクター#2であり、レーン5,9,13,19及び23ではベクター#3であり、レーン6、10,14及び20ではベクター#4である。

0044

図1Dに異なる温度と大腸菌株でのヒトFGF—21溶解度のSDS—PAGE分析結果を示す。レーン1+1b:分子量マーカー(キロダルトンの大きさ)。偶数はペレットを表し、奇数は上澄みを表す。使用誘導温度;レーン2−3及び6−7;37℃、レーン4−5及び8−9;20℃、レーン11−12;18℃。使用株;レーン2−5、W3110;レーン6−12、大腸菌(trxb、gor、supp)(DE3)。ベクター#3を使用した。

0045

図2は該発明の複合糖質形成、例えば、修飾シアル酸によるペプチドのペグ糖質G化で使用の代表的シアル酸転移酵素を示す表である。

発明を実施するための最良形態

0046

略語
PEG、ポリエチレングリコール;PPG、ポリプロピレングリコール;Ara、アラビノシル
;Fru、フルクトシル;Fuc、フコシル;Gal、ガラクトシル;GalNAc、N—アセチルガラクトサミニル;Glc、グルコシル;GlcNAc、N—アセチルグルコサミニル;Man、マンノシル;ManAc、マンノサミニルアセテート;Xyl、キシロシル;NeuAc、シアリル又はN—アセチルノイラミニル;Sia、シアリル又はN—アセチルノイラミニル及びそれら誘導体と類似体。

0047

(定義)
別に定義しない限りここに用いた全技術科学用語は、通常本発明が属する技術の通常技量者が一般に理解するのと同じ意味を有する。通常ここで用いた細胞培養分子遺伝学有機化学及び核酸化学とハイブリダイゼーションでの命名法実験室手順は、技術的によく知られ通常的に使用されるものである。核酸とペプチド合成標準的技法が用いられる。その技法と手順は技術的に在来法と本文書を通じて提供される種々の一般文献(サムブロック等(Sambrook, et al.)、モレキュラークローニングラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、2版(1989年)、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)ニューヨーク(N.Y.)を通常参照し、ここに文献として取り入れる)により実施する。通常ここで用いた以下に記載の分析化学と有機化学での命名法と実験手順は技術的によく知られ通常的に使用されるものである。化学合成化学分析標準法やそれらの修正法が用いられる。

0048

“核酸”又は“ポリヌクレオチド”という用語は単鎖型か二重鎖型のデオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)及びそれらのポリマーを意味する。特に制限しない限り該用語は参照核酸と類似の結合特性をもち、自然発生ヌクレオチドと同じように代謝する既知天然ヌクレオチド類似体を含む。別なように示さない限り特定核酸配列は、又それらの保守的修正変種(例えば、縮重コドン置換体)、対立遺伝子オルソログ一塩基遺伝子多形体(SNP)及び相補配列、更には明示的に示した該配列も暗黙包含する。具体的には一つ以上の選択(又は全ての)コドンの3位を混合塩基及び/又はデオキシイノシン残基で置換した配列を産生して、縮重コドン置換体が得られる(バッツー等(Batzer et al.)、ヌクレイックアシッドリサーチ(Nucleic acid Res.)、19巻、5081頁(1991年);大塚等(Ohtsuka et al.)、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J. Biol. Chem.)、260巻、2605−2608(1985年)及びロッソリーニ等(Rossolini et al.)、モレキュラーアンドセルラープローブス(Mol. Cell. Probes)、8巻、91−98頁(1994年))。核酸という用語は遺伝子、相補DNA(cDNA)及び遺伝子コード化伝令RNA(mRNA)と互換的に用いる。

0049

“遺伝子”という用語はポリペプチド鎖産生に関わるDNAセグメントを意味する。コード領域(リーダートレイラー)に先行及び後続領域と同様に各コードセグメントエキソン)間の介在配列イントロン)を含んでも良い。

0050

“単離された”という用語が核酸やタンパク質に適応した場合、該核酸又はタンパク質は自然状態で関連する他細胞成分が実質的に存在しないことを意味する。乾燥でも水溶液のいずれであっても良いが、好ましくは均一状態である。純度均一性は通常ポリアクリルアミドゲル電気泳動高速液体クロマトグラフィのような分析化学技法を用いて決定する。調整時に存在する主要種であるタンパク質は実質的に精製される。特に該遺伝子をフランクし興味遺伝子以外のタンパク質をコードする読み取り枠から単離遺伝子を分離する。“精製された”という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルで実質的に単一バンドを生じることを意味する。特に該核酸又はタンパク質が少なくとも純度85%、より好ましくは少なくとも純度95%、最も好ましくは少なくとも純度99%であることを意味する。

0051

“アミノ酸”という用語は天然発生アミノ酸及び合成アミノ酸、更には天然発生アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸擬態物を意味する。天然発生アミノ酸は遺伝子コードでコードしたものであり、更には後に修飾したアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ—カルボキシグルタミン酸及びO—ホスホセリンである。アミノ酸類似体は天然発生アミノ酸と同一基本化学構造、即ち水素原子、カルボキシル基アミノ基及びR基と結合するα炭素原子を有する化合物、例えば、ホモセリンノルロイシンメチオニンスルホキシドメチルスルホニウムメチオニンを意味する。この類似体は修飾R基(例えば、ノルロイシン)又は修飾ペプチドバックボーンを有するが、天然発生アミノ酸と同一の基本化学構造を保持する。以下の特許出願に記載のアミノ酸類似体は該発明のFGFペプチド複合物及び変異FGF配列に組み入れることができる:米国特許出願11/094677(2005年3月29日出願);米国特許出願11/094676(2005年3月29日出願);米国特許出願11/093798(2005年3月29日出願);米国特許出願11/093797(2005年3月29日出願);米国特許出願10/965218(2004年10月13日出願);米国特許出願11/093797(2005年3月29日出願);米国特許出願11/009635(2004年12月10日出願);米国特許出願11/016348(2004年12月16日出願);米国特許出願10/825867(2004年4月16日出願);米国特許出願10/826919(2004年4月16日出願)及び米国特許出願10/686944(現米国特許6,927,042、2005年8月9日発行)。これら出願に記載の方法を用いて、又該発明のFGFペプチド複合物及び変異FGF配列が産生できる。“アミノ酸擬態物”はアミノ酸一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然発生アミノ酸と同様に機能する化合物を意味する。

0052

非天然アミノ酸誘導体や類似体を部位特異的な形でポリペプチド鎖に組み入れ得る技術の種々の既知法がある。WO02/086075参照。

0053

ここでアミノ酸は一般的に知られた三文字記号国際純正応用化学連合国際生化学連合(IUPAC—IUB)生化学命名法委員会推奨一文字記号のいずれかに基づくことができる。同様にヌクレオチドも通常容認された単一文字表記に従う。

0054

“保存型修飾変種”はアミノ酸配列と核酸配列両者に適応する。特定の核酸配列に関しては“保存型修飾変種”は同一アミノ酸又は実質的に同一のアミノ酸をコードする核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は実質的に同一配列のものを意味する。遺伝子コードの縮重性により多数の機能的に同一の核酸は任意の所定タンパク質をコードする。例えばコドンGCAGCC、GCG及びGCU全てがアミノ酸アラニンをコードする。従ってコドンにより特定されたアラニンの位置全てで、コード化ポリペプチドを変化すること無しに該コドンは記載の対応コドンのいずれかに変化できる。この核酸変形物は“サイレント変形物”であり、保存型修飾変形物の一種である。ポリペプチドをコードするここでの核酸配列全ては、又該核酸の可能な全てのサイレント変形物を記述する。技術者には核酸中の各コドンは(通常メチオニン用の唯一のコドンであるAUG及びトリプトファン用の唯一のコドンであるTGGを除いて)、機能的に同一分子を生じるように修飾できることが分かる。その結果ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変形物は各記載配列に潜在する。

0055

アミノ酸配列に関して技術者は変化により化学的類似アミノ酸によるアミノ酸置換を生ずる場合、コード化配列中の単一アミノ酸又はほんの一握りのアミノ酸を変化、付加又は削除する核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列との置換、削除又は付加のそれぞれが、“保存型修飾変種”であることが分かる。機能的に類似のアミノ酸を提供する同類置換表が技術的に良く知られている。この保存型修飾変種はそれ以外に該発明の多形変種、種間類似体及び対立遺伝子を除きはしない。

0056

以下の8つの各グループは互いに保存型置換体であるアミノ酸を含む。
アラニン(A)、グリシン(G);
アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
アルギニン(R)、リシン(K);
イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
セリン(S)、スレオニン(T)及び
システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、クレイトン(Creighton)、プロテイン(Proteins)(1984年)参照)。

0057

ここでアミノ酸は一般的に知られた三文字記号かIUPAC—IUB生化学命名法委員会推奨の一文字記号のいずれかに基づくことができる。同様にヌクレオチドも通常容認された単一文字表記に従う。

0058

本出願ではアミノ酸残基は非修飾野生型ポリペプチド配列では最末端N残基に番号1をつけ、それからの相対位置により番号付けする。

0059

ここで用いる“プロリン残基近接する”とは、プロリン残基を除去したアミノ酸が約10個のアミノ酸より少なく、好ましくはプロリン残基を除去したアミノ酸が約9,8、7、6又は5個のアミノ酸より少なく、より好ましくはプロリン酸残基を除去したアミノ酸が約4,3,2又は1個のアミノ酸より少ないアミノ酸を意味する。“プロリン残基に近接する”アミノ酸はプロリン残基のC末端側又はN末端側に位置できる。

0060

ここでは“ポリペブチド”、“ペプチド”及び“タンパク質”は互換的に用い、その単量体がアミノ酸でアミド結合により一緒に結合したポリマーを意味し、代わりにポリペプチドと呼ばれる。更に非天然アミノ酸、例えば、β—アラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニンも又含まれる。遺伝子コードされないアミノ酸も又本発明に使用できる。更に反応基、グリコシル化部位、ポリマー、治療成分、生体分子及び類似体を含むように修飾したアミノ酸も該発明で使用できる。本発明で用いるアミノ酸の全てはD異性体かL異性体のいずれであっても良い。L異性体が通常好ましい。更に他ペプチド擬態物も又本発明で使用できる。ここで用いる“ペプチド”とはグルコシル化ペプチドと非グリコシル化ペプチドを意味する。又ペプチドを発現する系による不完全グルコシル化ペプチドも含まれる。一般的総説に関してはスパトラ、エイエフ(Spatola, A.F.)、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質の化学と生化学(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins)、ワインシュタイン、ビー(Weinstein, eds.)編、マーセルデッカー(Marcel Dekker)、ニューヨーク(New York)、267頁(1983年)参照。

0061

“ペプチド複合物”という用語はペプチドがここに示した修飾糖と複合化した該発明種を意味する。

0062

“FGF”又は“線維芽細胞成長因子”という用語は25個の既知野生型ペプチドファミリーのいずれかを意味する。該用語は又この野生型配列に比して同数か、少ないか又は追加のアミノ酸を持つアミノ酸配列を意味する。天然又は非天然の追加アミノ酸はこのアミノ酸配列の始まり、中間又は終端に挿入できる。

0063

一つ又は複数の追加N−連結又はO−連結グリコシル化部位の野生型線維芽細胞成長因子への導入に関連して用いる“変異する”又は“変異”という用語は、生成線維芽細胞成長因子アミノ酸配列が対応野生型線維芽細胞成長因子には存在しない少なくとも一つのN−連結又はO−連結グリコシル化部位を含むように、化学手段、酵素手段又は他手段によりそれぞれ野生型線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチド配列又は野生型線維芽細胞成長因子のアミノ酸配列で、任意のヌクレオチド又はアミノ酸残基を削除、挿入又は置換することを意味する。アミノ酸置換の場合、同類置換又は非同類置換を用いてN−連結又はO−連結グリコシル化部位を含むFGF変異体を創生しても良い。

0064

新規N−連結又はO−連結グリコシル化部位を導入する変異用部位は、該ポリペプチド中の何処に位置しても良い。線維芽細胞成長因子変異体用の典型的アミノ酸配列はSEQID NO:9−14、18−22、23−45、48−65、69−109、112—145、161—214、220—320及び323—360に示される。従って本発明の“変異線維芽細胞成長因子”は少なくとも一つのアミノ酸置換、アミノ酸挿入又は変異アミノ酸残基を含む。一方コード配列が変異線維芽細胞成長因子を産生するように修飾した野生型線維芽細胞成長因子は、本出願では“対応野生型線維芽細胞成長因子”又は単に“野生型ペプチド”と云うことができる。例えばSEQ ID NO:1はSEQ ID NO:9−14、18−22、23−45、48−65、69−109及び112−145のアミノ酸配列を有する変異線維芽細胞成長因子に対する対応野生型線維芽細胞成長因子—20のアミノ酸配列である。同様にSEQ ID NO:146はSEQ ID NO:161−214、220−320及び323−のアミノ酸配列を有する変異線維芽細胞成長因子に対する対応野生型線維芽細胞成長因子—21のアミノ酸配列である。

0065

“有効量”、“に有効な量”又は“治療有効量”或いは任意の文法的に等価な用語は、物質の投与により治療効果を生ずる量を意味する。該効果は疾患/病気及び関連合併症の症状進行がいずれかの検知可能な程度に防止、補正又は阻害されることを含む。正確な量は治療目的に依存し、既知の方法を用いる技術の熟知者により確かめられる(例えば、リーバーマン(Lieberman)、医薬品投与形態(Pharmaceutical Dosage Forms)、(1−3巻、1992年);ロイド(Lloyd)、医薬配合方法、科学と技術(The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)、(1999年)及びピッカー(Pickar)、投与量計算(Dosage Calculations)、(1999年)参照)。

0066

ここで用いる“修飾糖”という用語は該発明工程でペプチドのアミノ酸か、グリコシル残基に酵素的に付加した天然発生又は非天然発生炭水化物を意味する。該修飾糖は限定はされないが、糖ヌクレオチド一リン酸塩二リン酸塩及び三リン酸塩)、活性化糖(例えばハロゲン化グリコシル、グリコシルメシラート)及び活性化もされずヌクレオチドでもない糖類を含む多数の酵素基質から選ぶ。該“修飾糖”は“修飾基”により共有結合的に機能化される。有用な修飾基は限定はされないが、水溶性ポリマー(PEG成分)、治療成分、診断成分、生体分子及び類似体を含む。該修飾基は好ましくは天然発生炭水化物でも非修飾炭水化物でもない。該修飾基による機能化座位は、該“修飾糖”がペプチドに酵素的に付加するのを妨げないように選ぶ。

0067

水溶性”という用語はある程度検出可能な水溶解度を有する成分を意味する。水溶解度の検出/定量法は技術的によく知られている。代表的水溶性ポリマーとしてはペプチド、糖類、ポリエーテルポリアミンポリカルボン酸及び類似体が挙げられる。ペプチドは単一アミノ酸、例えばポリリシンからなる混合配列を有しても良い。代表的糖類はポリシアル酸である。代表的ポリエーテルはポリエチレングリコール、例えば、m−PEGである。ポリエチレンイミンは代表的ポリアミンであり、ポリアクリル酸は代表的ポリカルボン酸である。

0068

水溶性ポリマーのポリマーハックボーンはポリエチレングリコール(即ちPEG)でも良い。しかし他の関連ポリマーも又本発明実施の使用に適し、PEG又はポリエチレングリコールという用語の使用は、この点に関して排他的でなく包括的であることを意図すると理解する必要がある。PEGという用語はアルコキシPEG、二官能性PEG、多分岐PEG、フォーク型PEG、分岐PEG、ペンダントPEG(即ちポリマーバックボーンつり下がった一つ以上の官能基を有するPEG又は関連ポリマー)又はその中に分解可能結合を持つPEGを含む任意形のポリエチレングリコールを含む。

0069

該ポリマーバックボーンは線型でも分岐形でも良い。分岐ポリマーバックボーンは通常技術的に知られている。典型的には分岐ポリマーは中心分岐コア成分と、該中心分岐コアに結合した複数の線状ポリマー鎖を有する。通常PEGは酸化エチレングリセリンペンタエリスリトール及びソルビトールのような種々のポリオールに付加して合成できる分岐形で使用される。中心分岐コアはまたリシンのような幾つかのアミノ酸から誘導できる。分岐ポリエチレングリコールは一般形R(—PEG—OX)mとして表され、Rはグリセリンやペンタエリスリトールのようなコア成分を表し、Xはキャッピング基又は末端基を表し、mはアーム数を表す。全体をここに文献として取り入れた米国特許5,932,463に記載のような多分岐PEG分子もまたポリマーバックボーンとして使用できる。

0070

多くの他ポリマーが又該発明に適する。非ペプチドで且つ水溶性で、2から約300末端のポリマーバックボーンが該発明で特に有用である。適切なポリマー例は限定はされないが、ここに全体を文献として取り入れた米国特許5,629,384に記載のようなポリプロピレングリコール(“PPG”)、エチレングリコールプロピレングリコール共重合体及び類似体のような他ポリアルキレングルコール、ポリオキシエチル化ポリオール)、ポリオレフィンアルコールポリビニルピロリドンポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリα—ヒドロキシ酸ポリビニルアルコールポリホスファゼンポリオキサゾリン、ポリN—アクリロイルモルフォリン、それらの共重合体、三元重合体及び混合物を含む。該ポリマーバックボーン各鎖の分子量は異なっても良いが、通常約100ダルトン乃至約100,000ダルトン、しばしば約6000ダルトン乃至約80000ダルトンの範囲である。

0071

“シアル酸”又は“シアリル”という用語は炭素数9のカルボキシル化糖類ファミリの任意構成員を意味する。該シアル酸ファミリの最も普通の構成員は、N—アセチルノイラミン酸(5−アセタミド—3,5−ジデオキシ—D—グリセロ—D—ガラクト—2—ノヌロソン酸)(しばしばNeu5Ac、NeuAc又はNANAと略記される)である。該ファミリの第二構成員はNeuAcの該Nアセチル基が水酸化されているN—グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc又はNeuGc)である。第三のシアル酸ファミリ構成員は3−デオキシ—2—ノヌロソン酸(KDN)である(ナダノ等(Nadano et al.)(1986年)、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J. Biol. Chem.)、261巻、11550—11557頁;金森等(Kanamori, et al.)、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J. Biol. Chem.)、265巻、21811—21819(1990年))。又9−O—ラクチル—Neu5Ac、9−O−アセチル—Neu5Ac、9−デオキシ—9—フルオロ—Neu5Ac及び9−アジド—9−デオキシ—Neu5Acのような9−O—C1—C6アシル—Neu5Acのような9−置換シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリの総説に関しては、例えば、ヴァルキ(Varki)、グリコバイオロジー(Glycobiology)、2巻、25−40頁(1992年);シアル酸:化学、代謝及び機能(Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and function)、シャウアー、アール(R. Schauer ed.)編(スプリンガーフェルラーグ(Springer−Verlag)、ニューヨーク(New York)、(1992年)参照。シアリル化法でのシアル酸化合物の合成と使用に関しては、1992年10月1日発行の国際出願WO92/16640に開示された。

0072

ここでペプチド薬剤患者への投与関連で用いる“曲線下面積”又は“AUC”は、患者体循環した場合の薬剤濃度のゼロから無限大への時間関数として描いた曲線全面積と定義する。

0073

ここでペプチド薬剤の患者への投与関連で用いる“半減期”又は“t1/2”という用語は患者血漿中薬剤濃度が半分に減少するに必要な時間と定義する。複数のクリアランス機構再分配及び技術的に良く知られた他機構により、ペプチド薬剤関連の半減期は一つより多くても良い。通常アルファ半減期とベータ半減期をアルファ相が再分配関連、ベータ相クレアランス関連と定義する。しかしタンパク質薬剤は大部分が血流に限定されるので、少なくとも二つのクリアランス半減期がある。あるグリコシル化ペプチドでは急速なベータ相クレアランスがマクロファージ上受容体、又は末端ガラクトース、N—アセチルガラクトサミン、N—アセチルグルコサミン、マンノース又はフコースを認識する内皮細胞により仲介される。遅速なベータ相クリアランスが有効半径2nmより小さい分子(約68キロダルトン)に対する腎糸球体濾過及び/又は組織の特異的又は非特異的取り込みと代謝により起こる。糖質ペグ化により末端糖類(例えばガラクトース又はN—アセチルガラクトサミン)をキャップし、その結果これら糖類を認識する受容体により急速なアルファ相クリアランスを遮断できる。糖質ペグ化により又より大きな有効半径が与えられ、その結果分配と組織取り込み体積を減じ、その結果後期ベータ相が延びる。従ってアルファ相半減期とベータ相半減期に対する糖質ペグ化の正確な影響は、技術的によく知られているように大きさ、グリコシル化状態及び他パラメーターにより異なる。“半減期”の追加説明は薬学生工学(Pharmaceutical Biotechnology)(1997年、クロッメリンディエフエイ(Crommelin,DFA)及びシンデラー、アールディ編(Sindelar, RD, ed.)、ハーウッド出版社(Harwood Publishers)、アムステルダム(Amsterdam)、101−120頁)に見いだせる。

0074

ここで用いた“複合糖質化”という用語は、修飾糖種のポリペプチドのアミノ酸又はグリコシル残基、例えば、本発明の変異線維芽細胞成長因子への酵素仲介による複合化を意味する。“複合糖質化”の亜属は、修飾糖の修飾基がポリエチレングリコール、PEGのアルキル誘導体(例えば、m—PEG)又はそれらPEGの反応性誘導体(例えば、H2N—PEG、HOOC—PEG)の“糖質ペグ化”である。

0075

“大規模”及び“工業的規模”という用語は互換的に用い、1回の反応サイクル完了により少なくとも約250mg、好ましくは少なくとも約500mg、より好ましくは少なくとも1gの複合糖質を産生する反応サイクルを意味する。

0076

ここで用いた“グリコシル連結基”という用語は、修飾基(例えば、PEG成分、治療成分、生体分子)が共有結合的に付着したグリコシル残基を意味する。グリコシル連結基は該修飾基を複合物残部と連結する。該発明法では該“グリコシル連結基”はグリコシル化ペプチドか非グリコシル化ペプチドに共有結合的に付着し、その結果該試薬をペプチドのアミノ酸及び/又はグリコシル残基に連結する。“グリコシル連結基”は通常“修飾糖”をペプチドのアミノ酸及び/又はグリコシル残基に酵素的に付着し“修飾糖”から誘導する。グリコシル連結基は修飾基—修飾糖カセット形成時に分解する(例えば、酸化→シッフ塩基形成→還元糖類由来構造であるか、又はグリコシル連結基は原型のままでも良い。 “無傷グリコシル連結基”は該修飾基と連結する糖類単量体のグリコシル成分に由来し、過ヨウ素酸塩で分解しない、例えば酸化されない複合体残部を意味する。該発明の“無傷グリコシル連結基”は天然発生オリゴ糖から一つ又は複数のグリコシル単位を付加するか、又は親糖構造から一つ以上のグリコシル単位を除去して得られる。

0077

ここで用いた“非グリコシド型修飾基”はグリコシル連結基と直接連結した天然発生糖を含まない修飾基を意味する。

0078

ここで用いた“放射性試薬”は腫瘍診断又は破壊に有効な任意の放射性同位体を含む。例としては限定はされないが、インジウム111コバルト60が挙げられる。更に通常放射性同位体混合物を表すウランラジウム及びトリウムのような天然発生放射性元素は放射性試薬の適例である。金属イオンは通常有機キレート化成分キレート化する。

0079

多くの有用なキレート化基、クラウンエーテルクリプタンド及び類似体が技術的に知られており、該発明化合物(例えばEDTA、DTPA、DOTA、NTA、HDTA等及びDTPP、EDTP、HDTP、NTP等のようなそれらのホスホン酸塩類似体)に組み入れられる。例えばピット等(Pitt, et al.)、“鉄過剰治療のためのキレート化剤デザイン(The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload)”、生物と医学における無機化学(Inorganic Chemistry in Biology and Medicine)、マーテル編(Martell, ed.)、アメリカ化学会(American Chemical Society)、ワシトンディシィ(Washington, D.C.)、1980年、279−312頁;リンドイ(Lindoy)、大環状リガンド錯体の化学(The Chemistry of Macrocyclic Ligand Complexes)、ケンブリッジユニバーシティプレス(Cambridge University Press)、ケンブリッジ(Cambridge)、1989年;デゥガス(Dugas)、生物有機化学(Bioorganic Chemistry)、スプリンガーフェルラーグ(Springer−Verlag)、ニューヨーク(New York)、1989年、及びそこに含まれる文献を参照。

0080

更にキレート化剤、クラウンエーテル及びシクロデキストリンを他分子に付着できる種々の経路が技術的な熟知者は利用できる。例えば、メアーズ等(Meares, et al.)、“生体内キレート標識化タンパク質とポリペプチドの性質”(Properties of In Vivo Chelate−Tagged Proteins and Polypeptides)、タンパク質の修飾:食糧的、栄養的及び薬学的性状(Modification of Proteins: Food, Nutritional and Pharmacological Aspects)、フィーニー等編(Feeney, et al. eds.)、アメリカ化学会(American Chemical Society)、ワシントンディシィ(Washington, D.C.)、1982年、370−387頁;カシナ等(Kasina, et al.)、バイオコンジュゲートケミストリ(Bioconjugate Chem.)、9巻、108−117頁(1998年);ソング等(Song, et al.)、バイオコンジュゲートケミストリ(Bioconjugate Chem.)、8巻、108−117頁(1997年)参照。

0081

ここで用いた“製薬的容認担体”としては該複合体と組み合わした場合、該複合体活性を保持し、且つ被験者の免疫系と反応しない任意の材料が挙げられる。例としては限定はされないが、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルジョンのようなエマルジョン及び種々の形の湿潤剤のような標準製薬担体のいずれかが挙げられる。他担体としては又無菌溶液、コート化錠剤を含む錠剤及びカプセルが挙げられる。通常この担体は澱粉乳汁、糖、ある種の粘土ゼラチンステアリン酸又はその塩、ステアリン酸マグネシウムステアリン酸カルシウムタルク植物性脂肪植物性油ゴム、グリコール又は他の既知賦形剤のような賦形剤を含む。この担体は又香味添加物着色添加物又は他材料が挙げられる。この担体を構成する組成は良く知られた在来法で調合する。

0082

ここで用いた“投与する”とは経口投与吸入座薬のような投与、局所接触、静脈内投与腹腔内投与筋肉内投与病巣内投与、鼻腔無い投与又は皮下投与、或いは緩放徐装置、例えば、ミニ浸透圧ポンプの被験者への埋め込みを意味する。投与は非経口的と経粘膜的(例えば、経口、経鼻経膣、経直腸又は経皮)を含む任意経路による。非経口投与としては、例えば静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、側脳室内及び脳内が挙げられる。更に注射が腫瘍治療、例えば、アポトーシスを誘導する場合には、該腫瘍及び又は該腫瘍周囲の組織に直接投与できる。他形式送達としては限定されないが、リポソーム処方静脈内点滴、経皮貼附等が挙げられる。

0083

“改善している”又は“改善する”という用語は、症状の寛解緩解又は減少或いは患者の身体的健康や精神的安らぎの改善のような目的パラメーター又は主観的パラメーターを含む病理病気治療におけるいずれかの成功の印を意味する。症状の改善は健康診断及び/又は精神鑑定結果を含む目的パラメーター又は主観的パラメーターを基にする。

0084

“治療”という用語は疾患や状態が該疾患にかかりやすいが、まだ疾患症状に陥りも示しもしていない動物で起こるのを防ぎ(予防処置)、該疾患を阻害し(その発生を遅らすか抑止し)、該疾患の症状や副作用を除き(対症療法を含み)、且つ該疾患を解放する(該疾患後退させる)ことを含む疾患や状態を“治療する”か“治療”を意味する。

0085

“単離された”という用語は材料を産生するのに用いた成分が実質的に又は本質的に含まれない材料を意味する。該発明のペプチド複合物での“単離された”という用語は、通常該ペプチド複合物産生に用いた混合物中の材料に伴う成分を実質的に又は本質的に含まない材料を意味する。通常該発明の単離ペプチド複合物は好ましくは範囲で表した純度レベルを有する。ペプチド複合物純度範囲の下限は約60%、約70%又は約80%であり純度範囲の上限は約70%、約80%、約90%又は約90%より高い。

0086

ペプチド複合物の純度が約90%より高い場合には、その純度は又好ましくは範囲で表す。純度範囲の下限は約90%、約92%、約94%、約96%又は約98%である。純度範囲の上限は約92%、約94%、約96%、約98%又は約100%である。

0087

純度は技術的に容認された任意の分析法(例えば、銀染色ゲル、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLC又は類似手段)で決定する。

0088

ここで用いた“該集団の実質的な各構成員”により、ペプチドに付加した選択パーセントの修飾糖類を該ペプチド上の複数の同一受容体部位に付加した該発明のペプチド複合物集団の特性を記述する。“該集団の実質的な各構成員”により、修飾糖に複合化したペプチド部位の“均一性”が語られ、少なくとも約80%均一、好ましくは少なくとも約90%均一、及びより好ましくは少なくとも約95%均一である該発明の複合体を意味する。

0089

“均一性”は該修飾糖類が複合化した受容体成分集団全体での構造的一貫性を意味する。従って各修飾糖成分が、他の全修飾糖と複合化した受容体部位と同構造を有する受容体部位と複合化した該発明のペプチド複合物では、該ペプチド複合物は約100%均一であると云われる。均一性は通常範囲で表す。ペプチド複合物の均一性範囲の下限は約60%、約70%又は約80%であり、均一性範囲の上限は約70%、約80%、約90%又は約90%より高い。

0090

ペプチド複合物の均一性が約90%より高い場合には、その均一性は又好ましくは範囲で表す。均一性範囲の下限は約90%、約92%、約94%、約96%又は約98%である。均一性範囲の上限は約92%、約94%、約96%、約98%又は約100%である。ペプチド複合物の均一性は通常技術の熟知者には既知の一つ以上の方法、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC—MS)、マトリックス支援レーザー脱離飛行間質量分析(MALDITOF)、キャピラリ電気泳動及び類似体で決定する。

0091

“実質的に均一糖質栄養素”又は“実質的に均一グリコシル化パターン”とは、糖ペプチド種に関する場合、興味の糖転移酵素(例えば、フコシル基転移酵素)によりグリコシル化された受容体成分パーセントを意味する。例えば、α1,2フコシル基転移酵素の場合、実質的に全ての(以下に定義するように)Galβ1,4−GlcNAc−Rとそのシアル酸付加類似体が該発明のペプチド複合物でフコシル化されると、実質的に均一なフコシル化パターンとなる。該原料がグリコシル化受容体成分(例えば、フコシル化Galβ1,4−GlcNAc−R成分)を含有できることが技術の一熟知者には分かる。従ってグリコシル化の計算パーセントは該発明法によりグリコシル化された受容体成分と同様に原料で既にグリコシル化された受容体成分をも含む。

0092

上で定義した“実質的に均一な”における“実質的に”という用語は通常特定糖転移酵素に対する受容体成分の少なくとも約40%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%及び更により好ましくは少なくとも95%がグリコシル化されていることを意味する。

0093

置換基が在来の化学式明記され左から右に書かれた場合、この基は右から左に構造を書いた化学的に同一の置換基も等しく含み、例えば−CH2O—は又—OCH2—と書くことを意図する。

0094

アルキル”という用語はそれ自身か他置換基の一部として別に記述しない限り完全に飽和一不飽和かポリ不飽和で、指定炭素原子数(即ちC1−C10は炭素数1乃至10)を有するジラジカル及び多ラジカルを含む直鎖又は分岐鎖環状炭化水素ラジカル又はそれらの組み合わせを意味する。飽和炭化水素ラジカルの例としては限定されないが、メチルエチル、n—プロピル、イソプロピル、n—ブチル、t−ブチル、イソブチル、sec—ブチル、シクロヘキシルシクロヘキシルメチルシクロプロピルメチル、例えば、n—ペンチル、n—ヘキシル、n—ヘプチル、n—オクチル及び類似体の同族体と異性体が挙げられる。不飽和アルキル基は一つ以上の二重結合三重結合を持つモノである。不飽和アルキル基の例は限定されないが、ビニル、2−プロペニル、クロチル、2—イソペンテニル
2−ブタジエニル、2,4−ペンタジエニル、3−(1,4—ペンタジエニル)、エチニル、1−プロピニルと3−プロピニル、3−ブチニル及び高級同族体と異性体が挙げられる。“アルキル”という用語は別に記述しない限り、“ヘテロアルキル”のような以下により詳しく定義するアルキル誘導体を含むことを意味する。炭化水素基は限定したアルキル基は“ホモアルキル”と称する。

0095

アルキレン”という用語は、それ自身か他置換基の一部として限定はされないが、ーCH2CH2CH2CH2—で示されるようにアルカン由来の二価ラジカルを意味し、更に以下に記載の“ヘテロアルキレン”のような基を含む。通常アルキル(又はアルキレン)基は炭素原子1乃至24個有し、本発明では10以下の炭素原子を持つ基が好ましい。“低級アルキル”又は“低級アルキレン”とは通常8つ以下の炭素原子を有する短鎖アルキル又はアルキレン基である。

0096

“アルコキシ”、“アルキルアミノ”及び“アルキルチオ”(又はチオアルコキシ)という用語は従来の意味で使用し、それぞれ酸素原子、アミノ基又は硫黄原子により該分子残部に結合するアルキル基を意味する。

0097

“ヘテロアルキル”という用語はそれ自身か他置換基の一部として別に記述しない限り、記載数の炭素原子と酸素窒素ケイ素及び硫黄原子からなる一群から選んだ少なくとも一つのヘテロ原子からなる安定な直鎖、分岐鎖又は環状炭化水素ラジカル又はその組み合わせを意味し、該窒素原子と硫黄原子は酸化されていても良く、且つ該窒素ヘテロ原子は4級化されていても良い。一つ又は複数の該酸素、窒素、硫黄及びケイ素ヘテロ原子は、ヘテロアルキル基の内側位にあっても又該アルキル基が該分子残部と結合した位置にあっても良い。例としては限定はされないが、—CH2—CH2—O—CH3、—CH2—CH2—NH—CH3、—CH2CH2—N(CH3) —CH3、—CH2—S—CH2—CH3、—CH2—CH2—S(O) —CH3、—CH2—CH2—S(O)2—CH3、—CH=CH—O—CH3、—Si(CH3)3、—CH2—CH=N—OCH3及び—CH=CH—N(CH3) —CH3が挙げられる。例えば、—CH2—NH—OCH3及び、—CH2—O—Si(CH3)3のような二つまでのヘテロ原子が連続しても良い。同様に“ヘテロアルキレン”という用語はそれ自身か他置換基の一部として限定はされないが、—CH2—CH2—S—CH2—CH2—及び—CH2—S—CH2—CH2—NH—CH2—で示されるようにヘテロアルキル由来の二価ラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基においてヘテロ原子は該鎖末端の片側か両側のいずれかを占めることができる(例えば、アルキレンオキシアルキレンジオキシアルキレンアミノ、アルキレンジアミノ及び類似体)。更にアルキレン及びヘテロアルキレン連結基において該連結基式の書く方向によっては連結基の配向は示唆されない。例えば式—C(O)2R'—は—C(O)2R'— と—R'C(O)2—両者を表す。

0098

シクロアルキル”及び“ヘテロシクロアルキル”という用語は、それら自身又は他用語との組み合わせで別に云わない限り、それぞれ“アルキル”と“ヘテロアルキル”の環状バージョンを表す。更にヘテロシクロアルキルにおいてヘテロ原子は、該ヘテロ環が該分子残部と結合した位置を占め得る。シクロアルキルの例としては限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、1−シクロヘキセニル、3−シクロヘキセニル、シクロヘプチル及び類似体が挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては限定されないが、1−(1,2,5,6−テトラヒドロピリジル)、1−ピペリジニル、2−ピペリジニル、3−ピペリジニル、4−モルホリニル、3−モルホリニル、テトラヒドロフランー2−イル、テトラヒドロフランー3−イル、テトラヒドロチエン—2−イル、テトラヒドロチエン—3−イル、1−ピペラジニル、2−ピペラジニル及び類似体が挙げられる。

0099

ハロ”又は“ハロゲン” という用語は、それ自身か他置換基の一部として別に記述しない限り、フッ素塩素臭素又はヨウ素原子を意味する。更に“ハロアルキル”のような用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、“ハロ(C1—C4)アルキル”という用語は限定はされないが、トリフルオロメチル、2,2,2−トリフルオロエチル、4−クロロブチル、3−ブロモプロピル及び類似体を含む。

0100

アリール”という用語は別に記述しない限り、単環か一緒に縮合するか共有結合した多環(好ましくは1乃至3環)のポリ不飽和芳香族置換基を意味する。“ヘテロアリール”という用語は酸素、窒素、ケイ素及び硫黄原子から選んだ1乃至4個のヘテロ原子を含む
アリール基(又は複数環)を意味し、該窒素原子と硫黄原子は酸化されていても良く、且つ一つ又は複数の該窒素原子は4級化されていても良い。ヘテロアリール基はヘテロ原子により該分子残部と結合できる。アリール基とヘテロアリール基の非制限例としては、フェニル、1−ナフチル、2−ナフチル、4−ビフェニル、1−ピロリル、2−ピロリル、3−ピロリル、3−ピラゾリル、2−イミダゾリル、4−イミダゾリル、ピラジニル、2−オキサゾリル、4−オキサゾリル、2−フェニル—4—オキサゾリル、5−オキサゾリル、3−イソオキサゾリル、4−イソオキサゾリル、5−イソオキサゾリル、2−チアゾリル、4−チアゾリル、5−チアゾリル、2−フリル、3−フリル、2−チエニル、3−チエニル、2−ピリジル、3−ピリジル、4−ピリジル、2−ピリミジル、4−ピリミジル、5−ベンゾチアゾリルプリニル、2—ベンゾイミダゾリル、5−インドリル、1−イソキノリル、5−イソキノリル、2−キノオキサリニル、5−キノオキサリニル、3−キノリルテトラゾリルベンゾ[b]フラニル、ベンゾ[b]チエニル、2,3−ジヒドロベンゾ[1,4]ダイオキシン—6—イル、ベンゾ[1,3]ダイオソール—5—イル及び6−キノリルが挙げられる。上記の各アリールとヘテロアリール環系に対する置換基は以下に記載の容認置換基群から選ぶ。

0101

“アリール”という用語が他用語と組み合わして用いる場合(例えば、アリールオキシアリールチオキシアリールアルキル)、略して上に定義したようにアリール環ヘテロアリール環両者を含む。従って“アリールアルキル”とは、アリール基が、炭素原子(例えば、メチレン基)が、例えば、酸素原子で置換されたアルキル基(例えばフェノキシメチル、2−ピリジルオキシメチル、3−(1−ナフチルオキシ)プロピル及び類似体)を含むアルキル基(例えば、ベンジルフェネチルピリジルメチル及び類似体)と結合したラジカルを含むことを意味する。

0102

上記用語のそれぞれ(例えば、“アルキル”、“ヘテロアルキル”、“アリール”及び“ヘテロアリール”)は、表示ラジカルでの置換形及び非置換形を含むことを意味する。各形のラジカルでの好ましい置換基は以下に提供する。

0103

アルキルラジカルヘテロアルキルラジカル(しばしばアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニルアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルと云われる基も含む)での置換基は、通常“アルキル基置換基”と云われ限定はされないが、以下のから選んだ一つ以上の種々の基である。—OR'、=O、=NR'、=N—OR'、—NR'R''、—SR'、—ハロゲン、—SiR'R''R'''、—OC(O)R'、—C(O)R'、—CO2R',—CONR'R''、—OC(O)NR'R''.—NR''C(O)R'、—NR' —C(O)NR''R'''、—NR''C(O)2R'、—NR—C(NR'R''R''')=NR'''',—NR—C(NR'R'')=NR'''、—S(O)R'、—S(O)2R'、—S(O)2NR'R''、—NRSO2R', —CN及びーNO2で、その数はゼロから2m’+1で、m’はそのラジカルの炭素原子総数である。R'、R''、R'''及びR''''はそれぞれ好ましくは独立に、水素原子、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、例えば1乃至3個のハロゲン置換アリール、置換又は非置換アルキル、アルコキシ又はチオアルコキシ基又はアリールアルキル基を意味する。該発明化合物が一つより多いR基を含む場合、例えば、各R基はR'、R''、R'''及びR''''基が一つより多い場合にはそれぞれ独立に選ぶ。R'とR''が同一窒素原子と結合する場合、窒素原子と結合して5員環、6員環又は7員環を形成できる。例えば、—NR'R''は限定はされないが1−ピロリジニルと4−モルホリニルを含むことを意味する。置換基に関する上記の検討から技術の一熟知者には、”アルキル“という用語はハロアルキル(例えば—CF3及び—CH2CF3)やアシル(例えば—C(O)CH3、—C(O)CF3、—C(O)CH2CH3及び類似体)のような水素基以外の基と結合した炭素原子を含む基が含まれることを意味することが分かる。

0104

アルキルラジカルで記載の置換基と同様に、アリール基とヘテロアリール基での置換基は通常“アリール基置換基”と称する。該置換基は例えば、以下から選ぶ。—OR'、=O、=NR'、=N—OR'、—NR'R''、—SR'、—ハロゲン、—SiR'R''R'''、—OC(O)R'、—C(O)R'、—CO2R'、—CONR'R''、—OC(O)NR'R''、—NR''C(O)R'、—NR' —C(O)NR''R'''、—NR''C(O)2R'、—NR—C(NR'R''R''')=NR'''',—NR—C(NR'R'')=NR'''、—S(O)R'、—S(O)2R'、—S(O)2NR'R'、—NRSO2R', —CN及び—NO2、—R'、—N3、—CH(Ph)2、フルオロ(C1—C4)アルコキシ及びフルオロ(C1—C4)アルキルで、その数はゼロから芳香族環系の空き原子価総数の範囲である。R'、R''、R'''及びR''''はそれぞれ好ましくは、水素原子、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール及び置換又は非置換ヘテロアリールから独立に選ぶ。該発明化合物が一つより多いR基を含む場合、例えば、各R基はR'、R''、R'''及びR''''基が一つより多い場合にはそれぞれ独立に選ぶ。以下の図式で記号Xは上記のように”R“を表す。

0105

アリール環又はヘテロアリール環の隣接原子上置換基の二つは、式—T—C(O) —(CRR')u—U—置換基で置換されても良く、TとUは独立に—NR—、—O—、—CRR'—又は単結合であり、uはゼロ乃至3の整数である。代わりにアリール環又はヘテロアリール環の隣接原子上置換基の二つは、式—A—(CH2)r—B—置換基で置換されても良く、AとBは独立に—CRR' —、—O—、—NR—、—S—、—S(O) —、—S(O)2—、—S(O)2NR' —又は単結合であり、rは1乃至4の整数である。新しい形成環の単結合の一つは二重結合で置換しても良い。代わりにアリール環又はヘテロアリール環の隣接原子上置換基の二つは、式—(CRR'z—X—(CR'R''')d—置換基で置換されても良く、zとdは独立にゼロ乃至3の整数であり、Xは—O—、—NR' —、—S—、—S(O)—、—S(O)2—又は—S(O)2NR' —である。置換基R、R'、R''及びR'''は好ましくは独立に水素原子又は置換か非置換(C1−C6)アルキルから選ぶ。

0106

ここで用いた“ヘテロ原子”という用語は、酸素(O)、窒素(N)、硫黄(S)及びケイ素(Si)を含むことを意味する。

0107

(序論)
FGF—9は脳と子宮内膜分泌蛋白質として発現する線維芽細胞成長因子である。208アミノ酸ヘパリン結合タンパク質は、野生型状態で非グリコシル化されていると考えられる。FGF—9は運動ニューロン前立腺で見られるように、グリア細胞発達とFGF受容体を発現する他細胞増殖活性化で、自己分泌パラ分泌成長因子として重要な役割を果たす。
FGF—18はFGFファミリの他構成員である。これは肝増殖と腸増殖刺激関与し、骨軟骨分化の必須制御因子である。FGF—9のようにこのものは又野生型状態で非グリコシル化されていると考えられる。この207アミノ酸タンパク質は又筋線維芽細胞増殖分化を刺激して出生後発達に関与する。FGF—18はカルシニュリンにより誘導されてノギン発現を阻止する能力があり、有効な神経保護剤として働く。
FGF—20は脳(例えば小脳と黒質緻密部)で分泌蛋白質として発現し、見掛け分子量が23キロダルトン単量体として大腸菌で発現する新規線維芽細胞成長因子である。この211アミノ酸ヘパリン結合タンパク質は、野生型状態で非グリコシル化されていると考えられる。その生物活性としては、神経発生神経保護、中枢神経系(CNS再生抗炎症作用(例えば、腸抗炎症剤)及び創傷治癒が挙げられ、パーキンソン病やアルツハイマー症のような疾患治療用の有効薬剤となりうる。FGF—20は例えば化学療法及び放射線療法、核テロ放射性物質テロ、放射線事故などで生ずる胃腸部や体の他部分での放射線毒性に対して、又は予防薬緩和薬として用い得る。幾つかの研究でFGF—20は又穏和な紅斑から重症の有痛潰瘍形成範囲の症状を示す病気である口腔粘膜炎防止治療への有効性が示された。

0108

FGF−21は新規線維芽細胞成長因子で肝組織、胸腺組織及び精巣組織で発現される。209アミノ酸タンパク質は又野生型状態で非グリコシル化されていると考えられる。最近の研究でFGF—21はヒト脂肪細胞でのブドウ糖取り込みを制御することが示され、代謝制御因子としての役割を示唆する。インスリン活性に対するその効果と脂質代謝制御により、FGF—21は2型糖尿病と肥満症の有効な治療となる。このものは細胞組織や器官機能の完全損失又は部分損失、更には細胞及び/又は組織機能か数の異常という特徴を持つ種々の疾患と関わる。FGF—21は又以下に述べるように多数の他治療用途を有する。

0109

FGF—21治療を受け入れる疾患は虚血性血管障害である。このペプチドによる治療により、血管新生を誘導するか、又は心筋虚血/心筋梗塞、末梢血管障害腎動脈障害又は脳卒中などのような疾患を被る患者の細胞機能/生存を守ることができる。

0110

FGF—21治療が有効な他疾患としては、心臓で起こる心筋細胞支持細胞機能損失や死で特徴づけられ心筋症、例えば、鬱血性心不全心筋炎及び、例えば、骨格筋細胞骨細胞或いは支持細胞の機能損失、機能不十分又は死で特徴づけられる筋骨格疾患、例えば、骨格筋障害、骨疾患及び関節炎が挙げられる。更に例えばFGF—21やその機能の損失で起こる肝臓、心臓、脳、肢、腎臓などでの先天的欠陥はFGF—21で治療できる。

0111

FGF—21ポリペプチド及びポリヌクレオチドは又外傷、疾患、医学療法や外科治療で起こる創傷治癒を促進し、上記環境で必要な細胞組織の再生を助けることができる。例えばFGF—21は肝再生、手術創治癒、損傷血管の再内皮化,、外傷性創傷治癒、血管障害や代謝障害などによる潰瘍の治癒、骨折、炎症性疾患などによる細胞損失に効果がある。

0112

本発明は治療目的で用いる組換え型FGFの効果を改善するために修飾基とのFGFペプチド複合物を提供する。これらFGFペプチド複合物中のペプチドのあるものは、野生型FGFと同じアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有する一方、他は変異体である。

0113

該修飾基は例えばPEG(m−PEG)、PPG(m−PPG)等、のようなポリマー型修飾基、治療成分、診断成分、標的成分及び類似体から選べる。FGFペプチド複合物の創生、例えば水溶性ポリマー型修飾基の付加により、患者でのFGF循環の安定性と保持時間が改善でき、且つ/又はFGFの抗原性を減少できる。

0114

該発明のペプチド複合物は修飾基をグリコシル化ペプチド又は非グリコシル化ペプチドに酵素的に付着形成できる。アミノ酸グリコシル化部位及び/又はグリコシル基により、修飾基を持つ修飾糖のペプチドと複合化、例えば、複合糖質化する座位が提供される。

0115

本発明により又天然発生の線維芽細胞成長因子に存在しないN−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む線維芽細胞成長因子の遺伝子操作変異体が提供される。これらFGF変異体は実質的に野生型ホルモンの生物活性を保持するが、新規導入のグリコシル化部位により組換え型産生FGF変異体は種々のパターンでグリコシル化できる。

0116

該発明法により実質的に均一な誘導体化パターンを持つペプチド複合物と糖ペプチド複合物が構築できる。該発明に用いる酵素は通常特定アミノ酸残基、アミノ酸残基の組み合わせ、特定グリコシル残基又は該ペプチドのグリコシル残基の組み合わせに選択的である。この方法は又ペプチド複合物の大規模産生にも実用的である。従って該発明法により事前選択の均一誘導体化パターンをもつペプチド複合物の大規模産生の実用的手段が提供される。この方法は限定はされないが、細胞培養物で細胞(例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞植物細胞真菌細胞酵母菌細胞又は原核細胞)産生時に不完全にグリコシル化された糖ペプチド、遺伝子導入植物又は遺伝子導入動物を含む治療用ペプチドの修飾に特に良く適する。

0117

このFGFペプチド複合物としてFGFペプチド複合物と同様に薬剤容認担体からなる薬剤処方が含まれる。

0118

本発明は又例えば、クリアランス速度の減少又は免疫系又は細網内皮系(RES)による取り込み速度の減少により治療半減期の増加したFGFペプチド複合物を提供する。更に該発明法によりペプチドの抗原決定基遮蔽手段が提供され、その結果該ペプチドに対する宿主免疫応答を減ずるか又は除去する。標的試薬選択的付着を用いて、ペプチドは特定標的試薬に特異的な特定組織細胞表面受容体を標的とする。

0119

(変異体)
本発明は野生型ペプチドには見られない一つ以上のO−連結かN−連結グルコシル化部位を含むFGF変異体を提供する。該変異体は野生型ペプチドでは通常はグルコシル化されないか、殆どグリコシル化されない一つ以上の部位で酵素的グリコシル化する基質である。従って該変異体ではグリコシル残基又はグリコシル連結基の位置を操作して、選択の所望物性を有するペプチドが得られる。グリコシル残基又はグリコシル連結基の位置と数以外に、該発明の変異体と方法を用いて変化できる他物性としては、薬物動態力学、薬力学タンパク質分解耐性免疫原性、細網内皮系による認識、組織分配及び類似体が挙げられる。

0120

その結果一様態では、本発明は変異線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチドを含む単離核酸を提供する。変異線維芽細胞成長因子は対応野生型線維芽細胞成長因子には存在しないO−連結又はN−連結グルコシル化部位を含む。幾つかの実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQID NO:1のアミノ酸配列を含む。幾つかの好ましい実施形態では、変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:9−14、18−45、48−65、69−109及び112−145から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。幾つかの他実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:146のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:161−214、220−320及び323−360から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。代表的実施形態では、線維芽細胞成長因子活性をもつペプチドは、ここに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約95%相同なアミノ酸配列を有する。好ましくはアミノ酸配列はここに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約96%、97%、98%又は99%相同である。

0121

他様態では本発明により核酸、例えば、変異線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチド配列を含む単離核酸からなる発現カセットや細胞が提供される。変異線維芽細胞成長因子としては相応野生型線維芽細胞成長因子に存在しない一つ以上のN−連結又はO−連結グリコシル化部位が挙げられる。

0122

他様態では本発明により対応野生型線維芽細胞成長因子に存在しない一つ以上のN−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む変異線維芽細胞成長因子が提供される。幾つかの実施形態では対応野生型線維芽細胞成長因子はSEQID NO:1のアミノ酸配列を含む。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:9−14、18−45、48−65、69−109及び112−145から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列からなる。幾つかの他実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:146のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:161−214、220−320及び323−360から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。代表的実施形態では線維芽細胞成長因子活性をもつペプチドは、ここに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約95%相同なアミノ酸配列を有する。好ましくはアミノ酸配列はここに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約96%、97%、98%又は99%相同である。

0123

他様態では本発明により対応野生型線維芽細胞成長因子に存在しないN−連結又はO−連結グリコシル化部位を含む変異線維芽細胞成長因子作成法が提供される。本方法は変異線維芽細胞成長因子を組み換え的に産生する段階と、新規グリコシル化部位で変異線維芽細胞成長因子をグリコシル化する段階を含む。幾つかの実施形態では対応野生型線維芽細胞成長因子はSEQID NO:1のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:9−14、18−45、48−65、69−109及び112−145から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。幾つかの他実施形態では野生型線維芽細胞成長因子はSEQ ID NO:146のアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態では変異線維芽細胞成長因子は、SEQ ID NO:161−214、220−320及び323−360から選んだ少なくとも一つのアミノ酸配列を含み。代表的実施形態では、線維芽細胞成長因子活性をもつペプチドは、ここに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約95%相同なアミノ酸配列を有する。好ましくはアミノ酸配列はここに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約96%、97%、98%又は99%相同である。
(FGFコード配列の獲得)
一般的組み換え技術

0124

本発明は組み換え遺伝学分野での定型法に依存する。本発明で使用の一般法を開示した基礎書籍としては、サンルック(Sambrook)及びラッセル(Russell)、分子クローニングラボマニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)、(3版、2001年);クリーグラー(Kriegler)、遺伝子導入と発現:ラボマニュアル(Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual)、(1990年)及びオウベル等編(Ausubel, et al. eds.)、分子生物学での現行プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、(1994年)が挙げられる。

0125

核酸の大きさはキロベースkb)又は塩基対(bp)のいずれかで与えられる。これらはアガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、配列核酸又は公表DNA配列に基づく評価である。タンパク質の大きさはキロダルトン(kDa)又はアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質の大きさはゲル電気泳動配列タンパク質、誘導アミノ酸配列又は公表タンパク質配列により評価する。

0126

市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、ビューケージ(Beaucage)及びカルーザス(Caruthers)、テトラヘドロンレター(Tetrahedron Lett.)、22巻、1859−1862頁(1981年)に最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法により、バンデバンター等(Van Devanter et al.)、ヌクレイックアシッドリサーチ(Nucleic AcidsRes.)、12巻、6151−6168頁(1984年)に記載の自動シンセサイザーを用いて化学的に合成できる。オリゴヌクレオチドの精製は任意の技術的に認知の方法、例えば、ピアーソン(Pearson)及びレニアー(Reanier)、ジャーナルオブクロマトグラフィ(J. Chrom.)、255巻、137−149頁(1983年)に記載の未変性アクリアミドゲル電気泳動か陰イオン交換HPLCを用いて行う。

0127

クローン化野生型線維芽細胞成長因子遺伝子配列、変異線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチド配列及び合成オリゴヌクレオチド配列は、例えばウオレス等(Wallace et al.)、ジーン(Gene)、16巻21−26頁(1981年)の配列決定二本鎖鋳型に関するチェーンターミネーション法を用いてクローン化後検証できる。
野生型FGFコード配列のクローン化とサブクローニング

0128

多数の野生型線維芽細胞成長因子—20コード化ポリヌクレオチド、例えばジェンバンクアクセス番号NM_019851、NM_019113が決定され業者から入手できる。

0129

ヒトゲノム研究の急速な進歩により、ヒトDNA配列データベースが以前に同定された線維芽細胞成長因子をコード化したモノのように、既知ヌクレオチド配列に対して一定パーセントの配列相同性を有する任意遺伝子断片が調べられる場合、クローン化アプローチが可能になった。同定した任意DNA配列は、次いで化学合成及び/又は重複伸長法のようなポリメラーゼ連鎖反応PCR)法により得られる。短鎖配列では完全にデノボ合成で十分である一方、大きな遺伝子を得るには更にヒト相補DNAからの全長コード配列単離、或いは合成プローブで用いるゲノムライブラリが必要となる。

0130

代わりに線維芽細胞成長因子コード化核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような標準的クローン化法を用いてヒト相補DNAかゲノムDNAライブラリから単離でき、相同性ベースのプライマーがしばしば線維芽細胞成長因子コード化既知核酸配列から誘導される。この目的に最も良く用いる技法は標準テキスト、例えば上出のサンブルック(Sambrook)及びラッセル(Russell)に記載されている。

0131

野生型線維芽細胞成長因子用コード配列を得るのに適した相補DNAライブラリーは市販されており又構築できる。伝令RNAの単離、逆転写による相補DNAの作成、相補DNAの組換え型ベクターへの連結、伝播スクリーニング及びクローン化のための組み換え宿主への形質移入の一般法はよく知られている(例えば、ガブラー(Gubler)及びホフマン(Hoffman)、ジーン(Gene)、25巻、263−269頁(1983年);オースベル等(Ausubel, et al.)、上出)。PCRによりヌクレオチド配列の増幅セグメントが得られると、該セグメントを更にプローブとして用いて該相補DNAライブラリーから野生型線維芽細胞成長因子コード化完全長ポリヌクレオチド配列が単離できる。適切た手順の一般的記述は上述のサンブルック(Sambrook)及びラッセル(Russell)に見られる。

0132

類似法に従って野生型線維芽細胞成長因子コード化完全長配列、例えば上述のジェンバンクアクセス番号の任意の一つがヒトゲノムライブラリから得られる。ヒトゲノムライブラリは市販されており種々の技術的に認知された方法により構築できる。通常ゲノムライブラリを構築するには、該DNAを先ず線維芽細胞成長因子が見つけられやすい組織から抽出する。次いで該DNAを機械的に剪断するか、又は酵素的に消化して長さが約12−20kbの断片を得る。次いで該断片を好ましくない大きさのポリヌクレオチド断片から勾配遠心分離により分離し、バクテリオファージλベクターに挿入する。これらベクターとファージを試験管内でパッケジする。組み換えファージをベントン(Benton)及びデイビス(Davis)、サイエンス(Science)、196巻、180−182頁(1977年)に記載のようにプラークハイブリッド形成法により分析する。コロニーハイブリッド形成法グルスタイン等(Grunstein, et al.)、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、72巻、3961−3965頁(1975年)に記載のように行う。

0133

配列相同性に基づいて縮重オリゴヌクレオチドプライマー組みとしてデザインし、PCRを適切条件下で行い(例えばホワイト等(White, et al.)、PCRプロトコル:最新の方法と応用(PCR Protocols: Current Methodsand Applications)、1993年;グリフィン(Griffin)及びグリフィン(Griffin)、PCR技術(PCR Technology)、シーアールシー出版社(CRCPress Inc.)、1994年参照)、ヌクレオチド配列セグメントを相補DNAかゲノムライブラリから増幅できる。該増幅セグメントをプローブとして用いて、野生型線維芽細胞成長因子コード化完全長核酸が得られる。

0134

野生型線維芽細胞成長因子コード化核酸配列が得られると、該コード配列をベクター、例えば発現ベクターサブクローンし、組み換え野生型線維芽細胞成長因子が生成作成物から産生できる。次いで野生型線維芽細胞成長因子コード配列への更なる修飾、例えばヌクレオチド置換が行われ該分子の特性が変えられる。
FGF配列への変異導入

0135

コード化ポリヌクレオチド配列から野生型線維芽細胞成長因子のアミノ酸配列、例えばSEQID NO:1、SEQ ID NO:146が決定できる。次いでこのアミノ酸配列を一つ又は複数の追加グリコシル化部位を該アミノ酸配列の種々の位置に導入して修飾し、タンパク質のグリコシル化パターンを変えても良い。

0136

幾つかの形のタンパク質グリコシル化部位が技術的に良く知られている。例えば、真核動物ではN−連結グリコシル化がXaaがプロリン以外の任意のアミノ酸である共通配列Asn−Xaa−Ser/Thrのアスパラギンで起こる(コーンフェルト等(Kornfeld et al.)、アニュアルレビュオブバイオケミストリ(Ann. Rev. Biochem.)、54巻、631−664頁(1985年);ククルジンスカ等(Kukuruzinska, et al.)、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、84巻、2145−2149頁(1987年);ヘルスコビック等(Herscovics, et al.)、エフエイエスイービー(FASEB)、7巻、540−550頁(1993年);及びオルリン(Orlean)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、3巻、(1996年))。O−連結グリコシル化はセリン残基スレオニン残基で起こる(タンナー等(Tanner et al.)、バイオキミバイオフィジクアクタ(Biochim. Biophysl Acta)、906巻、81−91頁(1987年)及びハウンセル等(Hounsell, et al.)、グリココンジュゲートジャーナル(Glycoconj. J.)、13巻、19−26頁、(1996年))。他グリコシル化パターンはグリコシルホスファチジルイノシトールをタンパク質のカルボキシル末端カルボキシル基に連結して形成する(武田等(Takeda, et al.)、トレンドインバイオケミストリサイエンス(TrendsBiochem. Sci.)、20巻、367−371頁(1995年)及びウデフレンド等(Udenfriend, et al.)、アニュアルレビュオブバイオケミストリ(Ann. Rev. Biochem.)、64巻、593−591頁(1995年))。この知見に基づいて適切な変異を野生型線維芽細胞成長因子配列に導入して新規グリコシル化部位が形成できる。

0137

線維芽細胞成長因子ポリペプチド配列内のアミノ酸残基の直接修飾入は、新規のN−連結又はO−連結グリコシル化部位導入には適するが、線維芽細胞成長因子配列コード化ポリヌクレオチドの変異により新規グリコシル化部位導入がよりしばしば完遂される。これは既知の変異誘発法のいずれかを用いて達成でき、その幾つかを以下に検討する。線維芽細胞成長因子への代表的修飾としてはSEQID NO:9又はSEQ ID NO:87が挙げられる。

0138

種々の変異発生プロトコルが技術的に確立され記載されている。例えばザング等(Zhang, et al.)、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエイ(Proc. Natl. Acad. Sic. USA)、94巻、4504−4509頁(1997年);ステマー(Stemmer)ネーチャー(Nature)、370巻、389−391頁(1994年)参照。その方法を独立又は組み合わして用いて、核酸組みの変異体の産生とそれによるコード化ポリペプチド変異体が産生できる。変異誘発キット、ライブラリ構築及び他の多様性産生法は市販されている。

0139

多様生産性の変異方法としては、例えば部位特異的変異誘発ボットステイン(Botstein)、ショートル(Shortle)、サイエンス(Science)、229巻、1193−1201頁(1985年))、ウラシル含有鋳型使用の変異誘発(クンケル(Kunkel)、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエイ(Proc. Natl. Acad. Sic. USA)、82巻、488−492頁(1985年))、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発(ゾッラー(Zoller)、スミス(Smith)、ヌクレイックアシッドリサーチ(Nucl. AcidsRes.)、10巻、6487−6500頁(1982年))、ホスホロチオエート修飾DNA変異誘発(テーラー等(Taylor, et al.)、ヌクレイックアシッドリサーチ(Nucl. Acids Res.)、13巻、8749−8764頁及び8765−8787頁(1985年)及びギャップ付き二重鎖DNA使用の変異誘発(クレーマー等(Kramer et al.)、ヌクレイックアシッドリサーチ(Nucl. Acids Res.)、12巻、9441−9456頁(1984年))が挙げられる。

0140

変異発生の他方法としては、点ミスマッチ修復(クレーマー等(Kramer et al.)、セル(Cell)、38巻、879−887頁(1984年))、修復欠損宿主株使用の変異誘発(カーター等(Carter, et al.)、ヌクレイックアシッドリサーチ(Nucl. AcidsRes.)、13巻、4431—4443頁(1985年))、欠失変異誘発(エグテダルザデー(Eghtecarzadeh)、ヘニコフ(Henikoff)、ヌクレイックアシッドリサーチ(Nucl. Acids Res.)、14巻、5115頁(1986年))、制限選択及び制限精製(ウエルズ等(Wells et al.)、フィロソフィカルトランザクションオブロイヤルソサエティオブロンドンA(Phil. Trans. R. Soc. Lond. A)、317巻、415−423頁(1986年))、遺伝子全合成による変異誘発(ナンビア等(Nambier et al.)、サイエンス(Science)、223巻、1299—1301頁(1984年))、二本鎖切断修復(マンデッキ(Mandecki)、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユウエスエイ(Proc. Natl. Acad. Sic. USA)、83巻、7177−7181頁(1986年))、ポリヌクレオチド連鎖停止法による変異誘発(米国特許5,965,408)及び誤りがちなPCR(リュング等(Leung, et al.)、バイオテクニック(Biotechniques)、1巻、11−15頁(1989年))が挙げられる。
宿主生物での好ましいコドン使用用核酸の修飾

0141

変異線維芽細胞成長因子コード化ポリペプチド配列は、更に特定宿主で使用に好ましいコドンと一致するように変化できる。例えば、細菌性細胞の一株での使用に好ましいコドンを用いて該発明の変異線維芽細胞成長因子をコードし、本株で好まれるコドンを含むポリヌクレオチドを誘導できる。宿主細胞が示す好ましいコドン使用頻度は、宿主細胞発現の多数の遺伝子での好ましいコドン使用の平均頻度で計算できる(例えば計算サービスは上総DNA研究所(Kazusa DNA Research Institute)、日本(Japan)のホームページが利用できる)。この分析は好ましくは該宿主細胞により高度に発現する遺伝子に限られる。例えば、米国特許5,824,864では、双子葉植物単子葉植物が示す高度発現遺伝子によるコドン使用頻度が与えられる。

0142

修飾が完結すると変異線維芽細胞成長因子コード配列が配列決定により確認され、次いで野生型線維芽細胞成長因子と同様に組み換え産生用の適切発現ベクターにサブクローンする。
変異FGFの発現と精製

0143

配列確認に続いて本発明の変異線維芽細胞成長因子が、ここに開示の該ポリペプチドコード化ポリヌクレオチド配列により、組み換え遺伝学分野での常法を用いて産生できる。
発現系

0144

本発明の高レベルの変異線維芽細胞成長因子コード化核酸の発現を得るには、通常変異線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチドを転写を指示する強力プロモーター、転写/翻訳ターミネーター及び翻訳開始リボソーム結合部位含有の発現ベクターにサブクローンする。適切な細菌性プロモーターは技術的によく知られ、例えば上出のサンブルック(Sambrook)とラッセル(Russell)とアウスベル等(Ausubel, et al.)に記載されている。野生型又は変異線維芽細胞成長因子発現用の細菌性発現系は、例えば大腸菌、バチルスsp、サルモネラ菌、及びカウロバクターとして入手できる。この発現系用キットが市販されている。哺乳類細胞、酵母菌及び昆虫細胞用の真核生物発現系は、技術的によく知られており又市販されている。一実施形態では該真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクターアデノ関連ベクター又はレトロウイルスベクターである。

0145

異種核酸の直接発現に用いるプロモーターは特定用途に依存する。該プロモーターはその天然設定での転写開始部位とほぼ同じ距離の異種転写開始部位に位置しても良い。しかし技術的に知られているように、この距離はプロモーター機能を失うこと無しにいくらかの変化に適応できる。

0146

プロモータ以外に該発現ベクターとしては、通常宿主細胞の変異線維芽細胞成長因子発現に必要な追加エレメント全てを含む転写ユニット又は発現カセットが挙げられる。従って典型的な発現カセットは、変異線維芽細胞成長因子コード化核酸配列と機能的に連結したプロモーターと、転写物の効果的なポリアデニル化、リボソーム結合部位及び翻訳終結に必要なシグナルを含む。線維芽細胞成長因子コード化核酸配列は。通常切断可能シグナルペプチド配列と連結して形質転換細胞による線維芽細胞成長因子分泌を促進する。このシグナルペプチドとしては、特に組織プラスミノーゲン活性因子インスリン及びニューロン成長因子のシグナルペプチド及びオオタバニコガの幼若ホルモンエステル分解酵素が挙げられる。該カセットの追加エレメントとしてはエンハンサーを含んでも良く、ゲノムDNAが構造遺伝子として用いた場合には、機能性スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位を有するイントロンを含んでも良い。

0147

プロモーター配列以外に該発現カセットは、又効果的終結するために構造遺伝子下流に転写終結領域を含む必要がある。該終結領域はプロモーター配列と同一遺伝子から得ても良く又異なる遺伝子から得ても良い。

0148

遺伝子情報の細胞への輸送に用いる特定発現ベクターは特に決定的ではない。真核細胞や原核細胞での発現に用いる在来ベクターのいずれかが使用できる。標準的細菌性発現ベクターとしては、pBR332ベースのプラスミドのようなプラスミド、pSKF、pET23D及びGST及びLacZのような融合発現系が挙げられる。エピトープ標識も又在来の単離法を提供するために組み換えタンパク質、例えばc−mycに付加される。

0149

真核ウイルス調節エレメント含有発現ベクターは、通常真核発現ベクター、例えばSV40ベクター、パピローマウイルスベクター及びEBウイルス由来ベクターで用いられる。他の代表的真核ベクターとしては、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo—5、バキュロウイルスpDSVE及びSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーターメタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター又は真核細胞での発現に有効性が示された他プローモーターの指示でタンパク質発現が可能な他ベクターが挙げられる。

0150

幾つかの発現系はチミジンキナーゼハイグロマイシンBリン酸転移酵素及びジヒドロ葉酸還元酵素のような遺伝子増幅を与えるマーカーを有する。代わりに遺伝子増幅を含まない高収率発現系は、昆虫細胞のバキュロウイルスベクターのようにポリヘドリンプロモーター、又は他の強力なバキュロウイルスプロモーター指示のもとに変異線維芽細胞成長因子コード化ポリヌクレオチド配列に適する。

0151

発現ベクターに通常含まれるエレメントとしては、又大腸菌で機能するレプリコン組み換えプラスミドを持つ細菌選択が可能な抗生物質耐性コード化遺伝子と、真核生物配列挿入が可能な該プラスミドの非必須領域での特異的制限部位が挙げられる。選んだ特定の抗生物質耐性遺伝子は特に決定的ではなく、技術的に既知の多くの耐性遺伝子のいずれかが適する。原核生物配列は必要な場合には真核細胞のDNA複製を妨げないように選択しても良い。抗生物質耐性選択マーカーと同様に、既知代謝経路に基づく代謝選択マーカーも又形質転換宿主細胞選択手段として用いても良い。

0152

組み換えタンパク質(例えば本発明のFGF変異体)のペリプラズム発現を望む場合、該発現ベクターは更に大腸菌OppA(ペリプラズムオリゴペプチド結合タンパク質)のように発現すべきタンパク質コード配列の5’位と直接結合する分泌シグナルコード化配列又はその修飾バージョンを含む。このシグナル配列により細胞膜を通して細胞質に産生の該組み換えタンパク質をペリプラズム空間に向かわす。発現ベクターは更に該組み換えタンパク質がペリプラズム空間に入る時にシグナル配列を酵素切断できるシグナルペプチダーゼ1用コード配列を含む。組み換えタンパク質のペリプラズム産生に関するより詳細な説明は、例えばグレイ等(Gray, et al.)、ジーン(Gene)39巻、247−254頁(1985年)、米国特許6,160,089及び米国特許6,436,674に見いだせる。

0153

上に検討したように技術の熟知者は、種々の同類置換が線維芽細胞成長因子の生物活性を今なお保持しながら、任意の野生型又は変異線維芽細胞成長因子又はそのコード配列に行えることが分かる。更にポリヌクレオチドコード配列修飾も又生成アミノ酸配列を変えることなしに特定発現宿主に好ましいコドンの使用が適応できる。
形質移入法

0154

標準形移入法を用いて大量の変異線維芽細胞成長因子を発現する細菌性株細胞、哺乳類株細胞、酵母菌株細胞、昆虫株細胞又は植物株細胞を産生し、次いで標準法を用いて精製する(例えば、コーリー等(Colley, et al.)、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J. Biol. Chem.)、264巻、17619−17622頁(1989年);タンパク質精製ガイド(Guide to Protein Purification)、メソッドインエンイモロジー(Methodsin Enzymology)、182巻(ドイチャー等編(Deutscher, ed.)、1990年)参照)。真核細胞と原核細胞の形質転換は標準法により行う(例えば、モリソン(Morrison)、ジャーナルオブバクテリオロジー(J. Bact.)、132巻、349−351頁(1977年);クラークーカーティス(Clark−Curtiss)、カーティス(Curtiss)、メソッドインエンザイモロジー(Methods in Enzymology)、101巻、347—362頁(ウー等編(Wu, et al., eds)、1983年)参照)。

0155

異種ヌクレオチドを宿主細胞に導入する既知法のいずれかが使用できる。これらとしてはリン酸カルシウム形質移入、ポリブレンプロトプラスト融合電気穿孔リポソーム微量注入、血漿ベクター、ウイルスベクター及びクローン化ゲノムDNA、相補DNA、合成DNA又は他異種遺伝的材料を宿主細胞に導入する他の既知方法の使用が挙げられる(例えば、サンブルック(Sambrook)及びラッセル(Russel)、上出参照)。用いる特定遺伝子工学法は、少なくとも一つの遺伝子を変異線維芽細胞成長因発現可能な宿主細胞に成功裏に導入できることだけが必要である。
宿主細胞中の変異FGF発現の検出

0156

発現ベクターを適切宿主細胞に導入後、形質移入細胞を変異線維芽細胞成長因子発現が好のまれる条件下で培養する。次いで該細胞を組み換えポリペプチド発現のために選別し、次いで標準法を用いて該培養物から回収する(スコープス(Scopes)、タンパク質精製:原理と実施(Protein Purification: Principles and Practice)、(1982年);米国特許4,673,641;アウスベル等(Ausubel, et al.)、上出;サンブルック(Sambrook)、ラッセル(Russel)、上出参照)。

0157

技術の熟知者には遺伝子発現選別に関する幾つかの標準法がよく知られている。先ず遺伝子発現が核酸レベルで検出できる。核酸ハイブリッド化法を用いる種々の特異的DNA及びRNA測定法通常用いられる(例えばサンブルック(Sambrook)及びラッセル(Russel)、上出)。幾つかの方法は電気泳動分離(例えばDNA検出用サザンプロット法及びRNA検出用のノーザンブロット法)が含まれるが、DNA又はRAN検出は同様に電気泳動無しで実施できる(ドットブロットのような)。形質移入細胞の変異線維芽細胞成長因子コード化核酸の存在も又配列特異的プライマーを用いてPCR又はRT−PCRにより検出できる。

0158

次いで遺伝子発現はポリペプチドレベルで検出できる。技術の熟知者により種々の免疫アッセイ日常的に用いて、特にSEQID NO:3、4又は5のアミノ酸配列を有するポリペプチドのように、本発明の変異線維芽細胞成長因と特異的に反応するポリクロナール抗体又はモノクロナル抗体を用いて遺伝子産物レベルを測定する(例えばハーロウ(Harlow)、レーン(Lane)、抗体、ラボマニュアル(Antibodies, A laboratory Manual)、14章、コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor)、1988年;コーラー(Kohler)、ミルステイン(Milstein)、ネーチャー(Nature)、256巻、495—497頁(1975年))。この技法は変異線維芽細胞成長因子に対して高特異性を持つ抗体又はその抗原部分の選択により抗体産生する必要がある。ポリクロナール抗体及びモノクロナル抗体産生法はよく確立されており、その説明は文献に見られ、例えばハーロウ(Harlow)、レーン(Lane)、上出;コーラー(Kohler)、ミルステイン(Milstein)、ヨーロピアンジャーナルオブイムノロジー(Eur. J. Immunol)、6巻、511−519頁(1976年)参照。本発明の変異線維芽細胞成長因子に対する抗体の産生と、変異線維芽細胞成長因子検出の免疫アッセイ実施に関する説明は後章に提供する。
組み換え産生変異FGFの精製

0159

形質移入宿主細胞の組み換え変異線維芽細胞成長因子発現が一旦確認されると、次いで該宿主細胞は該組み換えポリペプチド精製目的のため適切規模で培養する。
細菌からの組み換え産生変異FGFの精製

0160

本発明の変異線維芽細胞成長因子が、通常プロモーター誘導後大量に形質移入細菌により組み換え産生されると、発現は恒常的であるが該タンパク質は不溶性凝集物を形成する。タンパク質封入体の精製に適する幾つかのプロトコルがある。例えば凝集タンパク質(以後封入体と呼ぶ)精製については、細菌性細胞破壊、例えば約100—150μg/mlリゾチーム非イオン界面活性剤の0.1%ノニデット(Nonidet)P40緩衝液中でインキュベートして封入体を抽出、分離及び/又は精製することが挙げられる。該細胞懸濁物ポリトロン(Polytron)グラインダーブリンクマンインストルメント(Brinkman Instruments)、ウエストバリー(Westbury)、ニューヨーク(NY))を用いて粉砕する。代わりに該細胞を上で超音波処理できる。細菌溶解の代替え法はアウスベル等(Ausubel, et al.)及びサンブルック(Sambrook)、ラッセル(Russel)、両者上出で説明され、技術の熟知者には明白である。

0161

該細胞懸濁物は通常遠心分離し、該封入体含有ペレットを溶解はしないが封入体を洗浄する緩衝液、例えば20mMトリス塩酸塩(pH7.2)、1mMEDTA、150mM食塩及び非イオン界面活性剤の2%トリトン(Triton)X100に再懸濁する。細胞性残骸をできるだけ除去するために洗浄工程を繰り返す必要があるかもしれない。封入体残留ペレットを適当な緩衝液(例えば20mMリン酸ナトリウム、pH6.8、150mM食塩)に再懸濁しても良い。技術の熟知者には他の適切緩衝液が明らかである。

0162

洗浄工程に続いて強水素受容体と強水素供与体両者(又はこれら物性の一つを持つ各溶剤の組み合わせ)である溶剤を添加して、該封入体を可溶化する。次いで該封入体形成タンパク質は適合緩衝液で希釈又は透析して変性する。適切溶剤としては限定はされないが、尿素(約4M乃至約8M)、ホルムアミド(少なくとも体積体積基準で80%)及びグアニジン塩酸塩(約4M乃至約8M)が挙げられる。SDS(ナトリウムドデシル硫酸塩)と70%ギ酸のように凝集物形成タンパク質を可溶化できる幾つかの溶剤は、該タンパク質の不可逆変性の可能性のため免疫原性及び/又は活性欠如を伴いこの方法での使用に不適切である。グアニジン塩酸塩及び類似薬剤変性剤であるが、この変性は不可逆ではなく該変性剤除去(例えば透析により)又は希釈により再変性が起こり、興味の免疫活性タンパク質及び/又は生物活性タンパク質再形成できる。可溶化後該タンパク質は一般的分離法により他細菌性タンパク質から分離できる。細菌性封入体からの組み換え線維芽細胞成長因子精製の更なる説明に関しては、例えばパトラ等(Patra, et al.)、プロテインエクスプレッションアンドピュリフィケーション(Protein Expression and Purification)、18巻、182−190頁(2000年)参照。

0163

代わりに組み換えポリペプチド、例えば変異線維芽細胞成長因子を細菌性ペリプラズムから精製できる。該組み換えタンパク質が該細菌ペリプラズムに搬出された場合、該細菌のペリプラズム画分は技術の熟知者に既知の他法以外に冷浸透圧衝撃により単離できる(例えばアウスベル等(Ausubel, et al.)、上出参照)。該ペリプラズムから組み換えタンパク質を単離するために該細菌精細胞を遠心分離してペレットを形成する。該ペレットを20%蔗糖含有緩衝液に再懸濁する。該細胞溶解のために該細菌を遠心分離にかけ、ペレットを氷冷5mM硫酸マグネシウム中に再懸濁し、氷浴に約10分間保持する。該細胞懸濁物を遠心分離にかけ上澄み液デカントし取っておく。上澄みに存在する該組み換えタンパク質を技術の熟知者には良く知られた一般的分離法で宿主タンパク質から分離できる。
精製のための一般的タンパク質分離

0164

組み換えポリペプチド、例えば本発明の変異線維芽細胞成長因子が宿主細胞に可溶形で発現されると、その精製は以下に記載の標準的タンパク質精製法に従う。
溶解度分画

0165

しばしば第一段階で且つタンパク質混合物が複雑な場合、最初の塩分画により無用宿主細胞タンパク質(又は細胞培地由来のタンパク質)の多くを興味の組み換えタンパク質、例えば本発明の変異線維芽細胞成長因子から除去できる。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムによりタンパク質混合物中の水量を効果的に減少してタンパク質が沈殿する。次いでタンパク質がその溶解度に基づいて沈殿する。タンパク質がより疎水性であればあるほど、低硫酸アンモニウム濃度で沈殿しやすい。典型的プロトコルは生成硫酸アンモニウム濃度が20乃至30%の間になるように飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に加える。これにより大部分の疎水性タンパク質は沈殿する。沈殿を捨て(興味のタンパク質が疎水性でなければ)、興味のタンパク質が沈殿すると考えられる濃度に硫酸アンモニウムを上澄みに加える。次いで該沈殿を緩衝液に可溶化し、必要なら透析又はダイアフィルトレーションのいずれかにより過剰塩を除去する。冷エタノール沈殿のよなタンパク質の溶解度に依存する他法は技術の熟知者には良く知られており、複合タンパク質混合物分画に使用できる。
サイズ分画濾過

0166

計算分子量に基づいて異なる細孔径膜(例えばアミコン(Amicon)膜又はミリポア(Millipore)膜)による限外濾過を用いて、より大きいサイズとより小さいサイズのタンパク質が単離できる。第一段階で該タンパク質混合物を興味のタンパク質、例えば変異線維芽細胞成長因子の分子量より低い分子量カットオフを持つ細孔サイズを有する膜により限外濾過する。次いで限外濾過保持物を興味のタンパク質の分子量より大きな分子カットオフを持つ膜で限外濾過する。組み換えタンパク質はこの膜を通過して濾液に入る。次いで濾液を以下に説明するようにクロマトグラフにかける。
カラムクロマトグラフィ

0167

興味のタンパク質(本発明の変異線維芽細胞成長因子のような)も又その大きさ、正味表面電荷、疎水性又は配位子親和性を基に他タンパク質から分離できる。更に線維芽細胞成長因子に対して産生の抗体をカラム担体と複合化し、線維芽細胞成長因子に免疫精製できる。これらの方法の全ては技術的に良く知られている。

0168

クロマトグラフ法は任意の規模で且つ多くの異なる製造会社(例えばファルマシアバイオテク(Pharmacia Biotech))の機器を用いて実施できことは一熟知者には明白である。
変異FGF発現検出用イムノアッセイ

0169

組み換え変異線維芽細胞成長因子産生を確認するために、免疫学的アッセイは試料中の該ペプチドの発現検出に有用である。又免疫学的アッセイは該組み換えホルモンの発現レベルの定量に有用である。変異線維芽細胞成長因子に対する抗体がこれら免疫学的アッセイ実施に必要である。
変異FGFに対する抗体の産生

0170

興味の免疫原と特異的の反応するポリクロナール抗体とモノクロナル抗体の産生法は技術の熟知者には既知である(例えば、コリガン(Coligan)、免疫学における最新プロトコル(Current Protocols in Immunology)、ワイリー/グリーン(Wiley/Greene)、ニューヨーク(NY)、1991年;ハーロウ(Harlow)、レーン(Lane)、抗体:ラボマニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)、コールドスプリングハーバーブレス(Cold Spring Harbor Press)、ニューヨーク(New York)、1989年;スタイテス等編(Stites, et al. eds.)、基礎及び臨床免疫学(Basic and Clinical Immunology)(4版)、ラングメディカルパブリケーション(Lange Medical Publications)、ロスアルトス(Los Altos)、カルフォルニア(CA)及びそこに記載の文献;ゴディング(Goding)、モノクロナル抗体:原理と実施(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice)(2版)、アカミックプレス(Academic Press)、ニューヨーク(New York)、ニューヨーク(NY)、1986年及びコーラー(Kohler)、ミルステイン(Milstein)、ネーチャー(Nature)、256巻、495−497頁、1975年参照)。この方法としてはファージ又は類似ベクターの組み換え抗体ライブラリでの抗体選択による抗体産生が挙げられる(ヒューズ等(Huse, et al.)、サイエンス(Science)、246巻、1275−1281、(1989年)及びワード等(Ward, et al.)、ネーチャー(Nature)、544−546頁(1989年))。

0171

所望特異性性を持つ抗体含有抗血清を産生するために、興味のポリペプチド(例えば、本発明の変異線維芽細胞成長因子)又はその抗原断片を用いて適切な動物、例えばマウス、ウサギ又は霊長類を免疫できる。標準的免疫化プロトコルによりフロイントアジュバントのような標準アジュバントを用いることができる。代わりにその特定ポリペプチド由来の合成抗原ペプチドを担体タンパク質に複合化し、次いで抗原として使用できる。

0172

抗原製剤に対する動物の免疫応答は、試験出血を取り興味抗原に対する反応性力価を決定することでモニターする。抗原に対する抗体の適切な高力価が得らると、動物から血液を採取し抗血清を産生する。次いで該抗原に対し特異反応性の抗体を濃縮するために該抗血清の更なる分画と該抗体の精製を行うが、ハーロー(Harlow)、レーン(Lane)、上出と上記のタンパク質精製の一般的説明を参照する。

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