図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2008年10月2日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (18)

課題

転移および/またはδPKCの機能を活性化するか、または阻害するのに効果的なペプチド、また、δPKCの阻害または活性化により利益を享受する、治療学的組成物および疾患または病状処置するための治療方法の提供など。

解決手段

δV1−1、δV1−2、ΨδRACK、δV1−5ならびにそれらの誘導体およびフラグメントから選択されるペプチド;δV1−1の改変されたフラグメント、δV1−2の改変されたフラグメント;ΨδRACKの改変されたフラグメントなど。

概要

背景

(参考文献)

(発明の背景
プロテインキナーゼCPKC)は、種々の細胞性機能(細胞増殖遺伝子発現およびイオンチャネル活性の調節を含む)に関するシグナル伝達において重要な酵素である。PKCファミリーアイソザイムは、少なくとも11の異なるプロテインキナーゼを含み、これらのプロテインキナーゼは、その相同性およびアクチベーターに対する感受性に基づいて少なくとも3つのサブファミリーに分割され得る。古典的サブファミリー、すなわちcPKCサブファミリーのメンバーである、αPKC、βIPKC、βIIPKC、およびγPKCは、アイソザイム独自領域(可変領域、すなわちV領域)の間に位置する、4つの相同性領域(C1、C2、C3およびC4)を含み、カルシウムホスファチジルセリン(PS)、およびジアシルグリセロール(DG)またはホルボールエステルを、活性化のために必要とする。新規サブファミリー、すなわち、nPKCサブファミリーのメンバーである、δPKC、εPKC、ηPKC、およびθPKCは、C2相同性領域を欠いており、かつ、活性化のためにカルシウムを必要としない。最終的に、異型サブファミリー、すなわちαPKCサブファミリーのメンバーである、ζPKCおよびλ/lPKCは、C2相同性領域およびC1相同性領域の半分の両方を欠いており、そして、DG,ホルボールエステル、およびカルシウムに対して非感受性である。

PKCアイソザイムの亜細胞(subcellular)分布についての研究によって、PKCの活性化がその細胞における再分配(これはまた、転移(translocation)と呼称される)を生じ、その結果、活性化されたPKCアイソザイムは、細胞膜細胞骨格成分、核、および他の亜細胞画分に関連することが実証される(Saitoら
、1989;Papadopoulos and Hall,1989;Mochly−Rosenら,1990)。

異なるPKCアイソザイムの独特細胞機能が、その亜細胞位置によって決定されることは明瞭である。例えば、活性化されたβIPKCが、核の内側で見出されるが、その一方、活性化されたβIIPKCが、心筋細胞核周囲および細胞周囲で見出される(Disatnikら,1994)。さらに、この同じ細胞において、εPKCが、活性化後または固定した細胞への外因性の活性化されたεPKCの添加後に、交差溝構造(cross−striated structure)(収縮要素であり得る)および細胞間接触部位に結合する(Mochly−Rosenら,1990;Disatnikら,1994)。この細胞中の異なった領域に対する異なったPKCアイソザイムの局在は、同様に、活性化Cキナーゼのためのレセプター(Recepotor for Activated C−Kinase)(RACK)と呼称される特定のアンカー分子に対する、この活性化されたアイソザイムの結合に起因するようである。

RACKは、それらの別個の亜細胞部位に対して活性化されたPKCアイソザイムを選択的に固定する(anchor)ことによって機能すると考えられている。RACKは、完全に活性化されたPKCにのみ結合するが、必ずしもこの酵素の基質ではない。RACKへの結合は、このキナーゼ触媒ドメインを媒介しない(Mochly−Rosenら、1991)。PKCの転移は、細胞粒子画分に固定されたRACKに対する、活性化された酵素の結合を反映し、そしてこのRACKの結合は、PKCがその細胞応答を生じるために必要とされる(Mochly−Rosen,1995;)。インビボでのRACKに対するPKC結合の阻害によって、PKC転移およびPKC媒介性機能が阻害される(Johnsonら、1996a;Ronら,1995;Smith and Mochly−Rosen,1992)。

RACK1およびRACK2をコードするcDNAクローンが、同定された(米国特許第5,519,003号;Ronら,1994;Csukaiら,1995)。両方とも、Gプロテインのβサブユニットホモログであり、このGプロテインは、別の転移タンパクプロテインキナーゼである、β−アドレナリン作動性レセプターキナーゼ、すなわちβARKについてのレセプターである(Pitcherら,1992)。Gβと同様に、RACK1およびRACK2は、7つのWD40リピートを有している(Ronら、1994;Csukaiら、1995)。近年のデータによって、RACK1はβIIPKC特異的RACKであり(Stebbinsら、2001)、そして、RACK2(Csukaiら、1997)は、活性化されたεPKCに特異的であることが示唆される。

PKCの転移は、PKCアイソザイムの適切な機能にとって必要とされる。RACK上のPKC結合部位(Mochly−Rosenら、1991a;Mochly−Rosenら、1995)またはPKC上のRACK結合部位(Ronら、1995;Johnsonら、1996a)のいずれかを模倣するペプチドは、インビボで酵素の機能を選択的に阻害する、PKCのアイソザイム特異的転移インヒビターである。例えば、εPKC由来の8アミノ酸ペプチド(ペプチドεV1−2;配列番号1、Glu Ala Val Ser Leu Lys Pro Thr)が、米国特許第6,165,977号において記載される。このペプチドは、εPKCのRACK結合部位の一部分を含み、そして、心筋細胞における特異的なεPKC媒介性機能を選択的に阻害する。このεPKCペプチドは、虚血性損傷からの保護を提供するために心臓プレコンディショニングに関連することが示される。長期間におよぶ虚血によって、不可逆的な心筋層損傷を生じ、これは、主に梗塞部位における細胞死に起因する。動物モデル、単離された心臓調製物および培養物中の単離された心筋細胞における研究によって、心筋虚血短期発作によって、それに続く長期間の虚血におけるこのような組織損傷が軽減されることが実証される(Liu,Y.ら、1995,1996;Huら,1995;Brewら、1995;Schultzら,1996)。この保護は、アンギナ後で自然に生じ、そしてプレコンディショニングと呼称され、種々の非特異的PKCアンタゴニストによって模倣され得る(Mitchellら、1993;Mitchellら、1995;Murryら、1986;Speechly−Dickら,1994)。δPKCの活性化およびεPKCの活性化が、プレコンディショニングの後に生じる(Grayら,1997)が、εPKC活性化の両方は、虚血誘導性細胞死からの心筋細胞の保護にとって必要とされる(米国特許第6,165,977号)。

近年の研究において、εPKC選択性ペプチドアゴニストペプチドが、単離された新生児心筋細胞および成体心筋細胞に対して細胞内に投与された場合およびトランスジェニックマウスにおいてインビボで細胞内で生成された場合に、虚血からの心臓保護を提供することが示された(Dorn Gら,1999)。

虚血現象から細胞および組織を保護するため、または、虚血現象によって引き起こされた損傷を反転させるかもしくは軽減するためのδPCKペプチドアゴニストおよびδPKCペプチドアンタゴニスト能力は、これまで報告されていない。より具体的には、δPCKペプチドアゴニストおよびδPKCアンタゴニストが、インビボで、全組織またはインタクト器官に対して細胞外送達され、治療的効果を達成し得るか否かは、当該分野で未知である。

概要

転移および/またはδPKCの機能を活性化するか、または阻害するのに効果的なペプチド、また、δPKCの阻害または活性化により利益を享受する、治療学的組成物および疾患または病状処置するための治療方法の提供など。δV1−1、δV1−2、ΨδRACK、δV1−5ならびにそれらの誘導体およびフラグメントから選択されるペプチド;δV1−1の改変されたフラグメント、δV1−2の改変されたフラグメント;ΨδRACKの改変されたフラグメントなど。なし

目的

近年の研究において、εPKC選択性ペプチドアゴニストペプチドが、単離された新生児心筋細胞および成体心筋細胞に対して細胞内に投与された場合およびトランスジェニックマウスにおいてインビボで細胞内で生成された場合に、虚血からの心臓保護を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

本願明細書等に記載されるペプチド

技術分野

0001

本発明は、転移および/またはδPKCの機能を活性化するか、または阻害するのに効果的なペプチドに関する。本発明はまた、δPKCの阻害または活性化により利益を享受する、治療学的組成物および疾患または病状処置するための治療方法に関する。

背景技術

0002

(参考文献)

0003

(発明の背景
プロテインキナーゼC(PKC)は、種々の細胞性機能(細胞増殖遺伝子発現およびイオンチャネル活性の調節を含む)に関するシグナル伝達において重要な酵素である。PKCファミリーアイソザイムは、少なくとも11の異なるプロテインキナーゼを含み、これらのプロテインキナーゼは、その相同性およびアクチベーターに対する感受性に基づいて少なくとも3つのサブファミリーに分割され得る。古典的サブファミリー、すなわちcPKCサブファミリーのメンバーである、αPKC、βIPKC、βIIPKC、およびγPKCは、アイソザイム独自領域(可変領域、すなわちV領域)の間に位置する、4つの相同性領域(C1、C2、C3およびC4)を含み、カルシウムホスファチジルセリン(PS)、およびジアシルグリセロール(DG)またはホルボールエステルを、活性化のために必要とする。新規サブファミリー、すなわち、nPKCサブファミリーのメンバーである、δPKC、εPKC、ηPKC、およびθPKCは、C2相同性領域を欠いており、かつ、活性化のためにカルシウムを必要としない。最終的に、異型サブファミリー、すなわちαPKCサブファミリーのメンバーである、ζPKCおよびλ/lPKCは、C2相同性領域およびC1相同性領域の半分の両方を欠いており、そして、DG,ホルボールエステル、およびカルシウムに対して非感受性である。

0004

PKCアイソザイムの亜細胞(subcellular)分布についての研究によって、PKCの活性化がその細胞における再分配(これはまた、転移(translocation)と呼称される)を生じ、その結果、活性化されたPKCアイソザイムは、細胞膜細胞骨格成分、核、および他の亜細胞画分に関連することが実証される(Saitoら
、1989;Papadopoulos and Hall,1989;Mochly−Rosenら,1990)。

0005

異なるPKCアイソザイムの独特細胞機能が、その亜細胞位置によって決定されることは明瞭である。例えば、活性化されたβIPKCが、核の内側で見出されるが、その一方、活性化されたβIIPKCが、心筋細胞核周囲および細胞周囲で見出される(Disatnikら,1994)。さらに、この同じ細胞において、εPKCが、活性化後または固定した細胞への外因性の活性化されたεPKCの添加後に、交差溝構造(cross−striated structure)(収縮要素であり得る)および細胞間接触部位に結合する(Mochly−Rosenら,1990;Disatnikら,1994)。この細胞中の異なった領域に対する異なったPKCアイソザイムの局在は、同様に、活性化Cキナーゼのためのレセプター(Recepotor for Activated C−Kinase)(RACK)と呼称される特定のアンカー分子に対する、この活性化されたアイソザイムの結合に起因するようである。

0006

RACKは、それらの別個の亜細胞部位に対して活性化されたPKCアイソザイムを選択的に固定する(anchor)ことによって機能すると考えられている。RACKは、完全に活性化されたPKCにのみ結合するが、必ずしもこの酵素の基質ではない。RACKへの結合は、このキナーゼ触媒ドメインを媒介しない(Mochly−Rosenら、1991)。PKCの転移は、細胞粒子画分に固定されたRACKに対する、活性化された酵素の結合を反映し、そしてこのRACKの結合は、PKCがその細胞応答を生じるために必要とされる(Mochly−Rosen,1995;)。インビボでのRACKに対するPKC結合の阻害によって、PKC転移およびPKC媒介性機能が阻害される(Johnsonら、1996a;Ronら,1995;Smith and Mochly−Rosen,1992)。

0007

RACK1およびRACK2をコードするcDNAクローンが、同定された(米国特許第5,519,003号;Ronら,1994;Csukaiら,1995)。両方とも、Gプロテインのβサブユニットホモログであり、このGプロテインは、別の転移タンパクプロテインキナーゼである、β−アドレナリン作動性レセプターキナーゼ、すなわちβARKについてのレセプターである(Pitcherら,1992)。Gβと同様に、RACK1およびRACK2は、7つのWD40リピートを有している(Ronら、1994;Csukaiら、1995)。近年のデータによって、RACK1はβIIPKC特異的RACKであり(Stebbinsら、2001)、そして、RACK2(Csukaiら、1997)は、活性化されたεPKCに特異的であることが示唆される。

0008

PKCの転移は、PKCアイソザイムの適切な機能にとって必要とされる。RACK上のPKC結合部位(Mochly−Rosenら、1991a;Mochly−Rosenら、1995)またはPKC上のRACK結合部位(Ronら、1995;Johnsonら、1996a)のいずれかを模倣するペプチドは、インビボで酵素の機能を選択的に阻害する、PKCのアイソザイム特異的転移インヒビターである。例えば、εPKC由来の8アミノ酸ペプチド(ペプチドεV1−2;配列番号1、Glu Ala Val Ser Leu Lys Pro Thr)が、米国特許第6,165,977号において記載される。このペプチドは、εPKCのRACK結合部位の一部分を含み、そして、心筋細胞における特異的なεPKC媒介性機能を選択的に阻害する。このεPKCペプチドは、虚血性損傷からの保護を提供するために心臓プレコンディショニングに関連することが示される。長期間におよぶ虚血によって、不可逆的な心筋層損傷を生じ、これは、主に梗塞部位における細胞死に起因する。動物モデル、単離された心臓調製物および培養物中の単離された心筋細胞における研究によって、心筋虚血短期発作によって、それに続く長期間の虚血におけるこのような組織損傷が軽減されることが実証される(Liu,Y.ら、1995,1996;Huら,1995;Brewら、1995;Schultzら,1996)。この保護は、アンギナ後で自然に生じ、そしてプレコンディショニングと呼称され、種々の非特異的PKCアンタゴニストによって模倣され得る(Mitchellら、1993;Mitchellら、1995;Murryら、1986;Speechly−Dickら,1994)。δPKCの活性化およびεPKCの活性化が、プレコンディショニングの後に生じる(Grayら,1997)が、εPKC活性化の両方は、虚血誘導性細胞死からの心筋細胞の保護にとって必要とされる(米国特許第6,165,977号)。

0009

近年の研究において、εPKC選択性ペプチドアゴニストペプチドが、単離された新生児心筋細胞および成体心筋細胞に対して細胞内に投与された場合およびトランスジェニックマウスにおいてインビボで細胞内で生成された場合に、虚血からの心臓保護を提供することが示された(Dorn Gら,1999)。

0010

虚血現象から細胞および組織を保護するため、または、虚血現象によって引き起こされた損傷を反転させるかもしくは軽減するためのδPCKペプチドアゴニストおよびδPKCペプチドアンタゴニスト能力は、これまで報告されていない。より具体的には、δPCKペプチドアゴニストおよびδPKCアンタゴニストが、インビボで、全組織またはインタクト器官に対して細胞外送達され、治療的効果を達成し得るか否かは、当該分野で未知である。

課題を解決するための手段

0011

本発明によって以下が提供される:
(1) δV1−1(配列番号4)、δV1−2(配列番号5)、ψδRACK(配列番号6)、δV1−5(配列番号7)ならびにそれらの誘導体およびフラグメントからなる群より選択される、ペプチド。
(2) 前記誘導体が、配列番号34〜48で示されるδV1−1誘導体からなる群より選択される、項目1に記載のペプチド。
(3) 前記誘導体が、配列番号65〜71で示されるδV1−2誘導体からなる群より選択される、項目1に記載のペプチド。
(4) 前記誘導体が、配列番号11〜19、22〜33で示されるψδRACK誘導体からなる群より選択される、項目1に記載のペプチド。
(5) 前記フラグメントが、配列番号49〜64で示される群から選択される配列を有する、項目1に記載のペプチド。
(6) 前記フラグメントが、配列番号20および配列番号21で示される群から選択される配列を有する、項目1に記載のペプチド。
(7) 前記ペプチドが組換え生成される、項目1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
(8) 前記ペプチドが化学的に合成される、項目1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
(9) 前記ペプチドがポリヌクレオチドによりコードされる、項目1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
(10) 前記ペプチドが、細胞膜を通じた輸送を容易にするのに有効な部分に連結されている、項目1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
(11) 前記ペプチドが、Tat由来ペプチド、Antennapediaキャリアペプチド、およびポリアルギニンペプチドから選択される部分に連結されている、項目10に記載のペプチド。
(12) 第2のペプチドに連結されて融合ペプチドを形成している、項目1〜6のいずれか1項に記載のペプチド。
(13)低酸素状態に曝された細胞または組織に対する虚血性損傷を低減するのに使用するための組成物であって、δPKCアンタゴニストを含む、組成物。
(14) 前記細胞または組織が前記低酸素状態に曝される前に、前記δPKCアンタゴニストが投与される、項目13に記載の組成物。
(15) 前記組織が前記低酸素状態に曝されている間に、前記δPKCアンタゴニストが投与される、項目13に記載の組成物。
(16) 前記組織が前記低酸素状態に曝された後に、前記δPKCアンタゴニストが投与される、項目13に記載の組成物。
(17) 前記δPKCアンタゴニストが、δV1−1(配列番号4)、δV1−2(配列番号5)、δV1−5(配列番号7)、δV1−1(配列番号4)の誘導体、δV1−2(配列番号5)の誘導体、δV1−5(配列番号7)の誘導体、δV1−1(配列番号4)のフラグメント、δV1−2(配列番号5)のフラグメント、およびδV1−5(配列番号7)のフラグメントである、項目13〜16のいずれか1項に記載の組成物。
(18) 前記δV1−1誘導体アンタゴニストが、配列番号34〜48で示されるペプチドである、項目17に記載の組成物。
(19) 前記δV1−2誘導体アンタゴニストが、配列番号65〜71で示されるペプチドである、項目17に記載の組成物。
(20) 前記ペプチドフラグメントが、配列番号49〜64で示される、項目17に記載の組成物。
(21) 前記δPKCアンタゴニストペプチドが、細胞膜を通じた輸送を容易にするのに有効な部分に連結されている、項目13〜20のいずれか1項に記載の組成物。
(22) 前記部分が、Tat由来ペプチド、Antennapediaキャリアペプチド、またはポリアルギニンペプチドである、項目21に記載の組成物。
(23) 前記δPKCアンタゴニストペプチドが、冠状動脈を通じた注入により組織に送達される、項目13〜22のいずれか1項に記載の組成物。
(24)発作に起因する低酸素現象から細胞または組織に対する損傷を低減するための組成物であって、δPKCアンタゴニストを含む、組成物。
(25) 前記細胞または組織が前記低酸素状態に曝される前に、前記δPKCアンタゴニストが投与される、項目24に記載の組成物。
(26) 前記組織が前記低酸素状態に曝されている間に、前記δPKCアンタゴニストが投与される、項目24に記載の組成物。
(27) 前記組織が前記低酸素状態に曝された後に、前記δPKCアンタゴニストが投与される、項目24に記載の組成物。
(28) 前記δPKCアンタゴニストが、δV1−1(配列番号4)、δV1−2(配列番号5)、δV1−5(配列番号7)、δV1−1(配列番号4)の誘導体、δV1−2(配列番号5)の誘導体、δV1−5(配列番号7)の誘導体、δV1−1(配列番号4)のフラグメント、δV1−2(配列番号5)のフラグメント、およびδV1−5(配列番号7)のフラグメントである、項目24〜27のいずれか1項に記載の組成物。
(29) 前記δV1−1誘導体アンタゴニストが、配列番号34〜48で示されるペプチドである、項目28に記載の組成物。
(30) 前記δV1−2誘導体アンタゴニストが、配列番号65〜71で示されるペプチドである、項目28に記載の組成物。
(31) 前記ペプチドフラグメントが、配列番号49〜64で示される、項目28に記載の組成物。
(32) 前記δPKCアンタゴニストペプチドが、細胞膜を通じた輸送を容易にするのに有効な部分に連結されている、項目24〜31のいずれか1項に記載の組成物。
(33) 前記部分が、Tat由来ペプチド、Antennapediaキャリアペプチド、またはポリアルギニンペプチドである、項目32に記載の組成物。
(34)低酸素状態に曝された細胞に対する損傷を増強するための組成物であって、δPKCアゴニストを含む、組成物。
(35) 前記アゴニストが、配列番号6で示されるψδRACK、配列番号6の誘導体、またはそのフラグメントである、項目34に記載の組成物。
(36) 前記アゴニストが、配列番号11〜19および配列番号22〜29から選択されるペプチドである、項目34に記載の組成物。
(37) 前記アゴニストが、配列番号20〜21から選択されるペプチドである、項目34に記載の組成物。
(38) 前記細胞が腫瘍細胞である、項目34〜37のいずれか1項に記載の組成物。
(39) 前記アゴニストが、細胞膜を通じた輸送を容易にするのに有効な部分に連結されている、項目34〜38のいずれか1項に記載の組成物。
(40)低酸素性損傷または虚血性損傷からの細胞の保護を誘導するのに有効な化合物を同定する方法であって、
試験化合物の存在下および非存在下で、δRACK結合部位を含むδPKCペプチドを、δRACK結合部位を有するδPKCアンタゴニストペプチドと接触させる工程、および
(i)該試験化合物の存在下での結合が、該試験化合物の非存在下での結合と比較して減少している場合、または(ii)該試験化合物の触媒活性が、該試験化合物の非存在下での活性と比較して増大している場合に、保護を誘導するのに有効であると該試験化合物を同定する工程、
包含する、方法。
(41) 前記接触工程が、δV1−1(配列番号4)、δV1−2(配列番号5)、δV1−5(配列番号7)ならびにそれらの誘導体およびフラグメントからなる群より選択されるδPKCペプチドと接触させる工程を包含する、項目40に記載の方法。
(42) 前記接触工程が、配列番号34〜48からなる群より選択されるδPKCアンタゴニストペプチドと接触させる工程を包含する、項目39に記載の方法。
(43) 前記接触工程が、配列番号49〜64からなる群より選択されるδPKCアンタゴニストペプチドと接触させる工程を包含する、項目39に記載の方法。
(44) 前記接触工程が、配列番号65〜71からなる群より選択されるδPKCアンタゴニストペプチドと接触させる工程を包含する、項目39に記載の方法。
(45) 前記δRACK結合部位を含むδPKCペプチドが、配列番号72で示される、項目39に記載の方法。
(46) 細胞における低酸素性損傷または虚血性損傷を増強するのに有効な化合物を同定する方法であって、
試験化合物の存在下および非存在下で、ψδRACKアゴニストペプチドを、RACK結合部位を含むδPKCペプチドと接触させる工程、および
(i)該試験化合物の存在下での結合が、該試験化合物の非存在下での結合と比較して減少している場合、または(ii)該試験化合物の存在下での該δPKCの触媒活性が、該試験化合物の非存在下での触媒活性と比較して増大している場合に、虚血性損傷を増大するのに有効であると該試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
(47) 前記接触工程が、配列番号6、そのフラグメントおよび誘導体からなる群より選択されるψδRACKペプチドと接触させる工程を包含する、項目46に記載の方法。
(48) 前記接触工程が、配列番号11〜19および配列番号22〜29で示されるペプチドからなる群より選択される配列を有するψδRACKペプチドと接触させる工程を包含する、項目46に記載の方法。
(49) 前記接触工程が、配列番号20〜21で示されるペプチドからなる群より選択される配列を有するψδRACKペプチドフラグメントと接触させる工程を包含する、項目46に記載の方法。
(50)虚血現象または低酸素現象により引き起こされる損傷から組織を保護するための組成物であって、配列番号4、配列番号5、配列番号7で示されるペプチド、それらの誘導体およびフラグメントから選択されるペプチドを含む、組成物。
(51) 前記ペプチドが、配列番号34〜47で示される誘導体から選択されるδV1−1ペプチド誘導体である、項目50に記載の組成物。
(52) 前記ペプチドが、配列番号65〜71で示される誘導体から選択されるδV1−2ペプチド誘導体である、項目50に記載の組成物。
(53) 前記ペプチドが、配列番号49〜64で示されるペプチドから選択されるフラグメントである、項目50に記載の組成物。
(54) 前記ペプチドが、細胞膜を通じた輸送を容易にするのに有効な部分に連結されている、項目50〜53のいずれか1項に記載の組成物。
(55) 前記部分が、Tat由来ペプチド、Antennapediaキャリアペプチド、またはポリアルギニンペプチドである、項目54に記載の組成物。
(56) 前記ペプチドが、静脈経路非経口経路、皮下経路、吸入経路鼻腔内経路、下経路、粘膜経路、および経皮経路から選択される経路によって前記組織に投与される、項目50〜55のいずれか1項に記載の組成物。
(57) 前記ペプチドが再灌流の間に投与される、項目50〜55のいずれか1項に記載の組成物。
(58) 前記ペプチドが、脳、心臓、目、および腎臓からなる群より選択される組織の虚血に対する保護を提供するのに有効である、項目50〜57のいずれか1項に記載の組成物。
(発明の要旨)
従って、虚血現象に起因する損傷から組織を保護する方法を提供することが本発明の目的である。

0012

虚血現象に起因する損傷から細胞および組織の保護についてδPKCペプチドアゴニストを投与する方法を提供することが本発明のさらなる目的である。

0013

虚血現象によって生じる、組織に対する損傷を回復する方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。

0014

発作の結果としての損傷を低減するか、またはその損傷から細胞および組織を保護する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。

0015

虚血現象または低酸素現象の結果として細胞性損傷および組織性損傷を増強する方法を提供することが本発明の別の目的である。

0016

1つの局面において、本発明は、δV1−1(配列番号4)、δV1−2(配列番号5)、ΨδRACK(配列番号6)、δV1−5(配列番号7)ならびにそれらの誘導体およびフラグメントから選択されるペプチドを含む。δV1−1の例示的誘導体は、配列番号34〜配列番号48として同定される。δV1−2の例示的誘導体は、配列番号65〜配列番号71として同定される。ΨδRACKの例示的誘導体は、配列番号11〜配列番号19、配列番号22〜配列番号33として同定される。δV1−1の例示的フラグメントは、配列番号49〜配列番号64として同定される。ΨδRACKの例示的フラグメントは、配列番号20および配列番号21として同定される。

0017

1つの実施形態において、このペプチドが組換え生成され、ここで、このペプチドがポリペプチドによってコードされる。他の実施形態において、このペプチドは化学的に合成
される。

0018

1つの実施形態において、このペプチドは、細胞膜を通じた輸送を容易にするのに有効な部分に結合する。例示的部分は、Tat由来ペプチド、Antennapediaキャリアペプチド、およびポリアルギニンペプチドを含む。

0019

別の実施形態において、このペプチドは、第2のペプチドに結合して、融合ペプチドを形成する。

0020

別の局面において、本発明は、低酸素状態に曝露された細胞および組織に対して、相当量のアイソザイム特異的δPKCアンタゴニストを投与することによって、それらの細胞および組織に対する虚血性損傷を軽減させる方法を含む。企図されるアンタゴニストは、δV1−1(配列番号4)、δV1−2(配列番号5)、δV1−5(配列番号7)、ならびにその誘導体およびフラグメントを含む。

0021

本方法の種々の実施形態において、このペプチドは、細胞または組織を上記の低酸素状態に曝露する前、その曝露の間、またはその曝露の後に投与される。このペプチドは、上記のように、キャリアペプチドに結合され得る。

0022

1つの実施形態において、このペプチドは、インタクトな心臓に対して冠状動脈を通じて注入することによって投与される。

0023

別の局面において、本発明は、発作に起因する細胞もしくは組織に対する損傷を軽減または予防または回復させる方法を含み、この方法は、それらの細胞または組織に対して、相当量のアイソザイム特異的δPKCアンタゴニストを投与することによる。企図されるアンタゴニストは、δV1−1(配列番号4)、δV1−2(配列番号5)、δV1−5(配列番号7)、ならびにその誘導体およびフラグメントを含む。

0024

本方法の種々の実施形態において、このペプチドは、細胞または組織が低酸素現象に曝露される場合に、発作の前、発作の間、または発作の後に投与される。このペプチドは、上記のように、キャリアペプチドに結合され得る。

0025

別の局面において、本発明は、低酸素状態に曝露された細胞に対する損傷を増強する方法を含み、この方法は、これらの細胞に対して、相当量のアイソザイム特異的δPKCアゴニストを投与することによる。企図されるアゴニストは、配列番号6として同定されるΨδRACK、ΨδRACKの誘導体またはフラグメントを含む。例示的な誘導体としては、配列番号11〜配列番号19、および配列番号22〜配列番号29として同定されるペプチドが挙げられる。例示的フラグメントとしては、配列番号20〜配列番号21として同定されるペプチドが挙げられる。

0026

1実施形態において、このペプチドは、腫瘍細胞に投与される。このアゴニストペプチドは、細胞膜を通じた輸送を容易にするのに有効な部分に結合され得る。

0027

別の局面において、本発明は、低酸素状態または虚血条件からの細胞の保護を導入するのに効果的な化合物を同定する方法を含む。この方法において、δRACK結合部位を含むδPKCペプチドは、試験化合物の存在下または非存在下で、δRACK結合部位を有するδPKCアンタゴニストペプチドと接触する。この試験化合物は、以下の場合に保護を誘導するのに効果的であると同定される:(i)この試験化合物の存在下の結合が、試験化合物の非存在下での結合と比較して減少される場合、または(ii)この試験化合物の触媒活性が、試験化合物の非存在下での活性と比較して増加される場合。

0028

この方法において、このδPKCペプチドは、δV1−1(配列番号4)、δV1−2(配列番号5)、δV1−5(配列番号7)ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体からなる群より選択され得る。

0029

別の局面において、本発明は、細胞中の低酸素性損傷または虚血性損傷を増強するための効果的な化合物を同定する方法を包含する。ΨδRACKアゴニストペプチドが、試験化合物の存在下およびその非存在下で、RACK結合部位を含むδPKCペプチドと接触される。この試験化合物は、以下の場合に虚血性損傷を増強するのに効果的であるとして同定される:(i)試験化合物の存在下の結合が、試験化合物の非存在下での結合と比較して減少される場合、または(ii)試験化合物の存在下のδPKCの触媒活性が、この試験化合物の非存在下での触媒活性と比較して増加される場合。

0030

1つの実施形態において、配列番号6、そのフラグメントおよび誘導体からなる群より選択されるΨδRACKペプチドが使用される。例示的な適切な誘導体およびフラグメントは、配列番号11〜配列番号29として同定される。

0031

別の局面において、本発明は、配列番号4、配列番号5、配列番号7、それらの誘導体およびフラグメントからなる群より選択されるペプチドを、細胞に投与することによって、虚血現象または低酸素症事象によって引き起こされる損傷からの組織の保護を提供する方法を含む。適切な誘導体およびフラグメントとしては、上記で与えられる誘導体およびフラグメントが挙げられる。

0032

1実施形態において、このペプチドは、静脈内経路、非経口経路、皮下経路、吸入経路、鼻腔内経路、舌下経路、粘膜経路、および経皮経路によって投与される。別の方法において、このペプチドは、再灌流期間の最中に投与される;すなわち、初期灌流の期間の後に投与される。

0033

虚血に対する保護が、脳、心臓、眼、および腎臓を含むがこれらに限定されない種々の組織に提供される。

0034

本発明のこれらおよびその他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明が、添付の図面と共に読まれた場合に、より完全に理解される。

発明を実施するための最良の形態

0035

(配列の簡単な説明)
配列番号1は、εPKC由来の8アミノ酸のペプチド(εV1−2と称され、そして米国特許第6,165,977号に記載されている)である。
配列番号2は、ラットδPKC(登録番号KIRTCD)のV1ドメイン由来のアミノ酸1〜141に対応する。
配列番号3は、マウスθPKC(登録番号Q02111)のV1ドメインのアミノ酸1〜124に対応する。
配列番号4は、δPKCの第一可変領域由来のアミノ酸配列(アミノ酸8〜17)、δV1−1である。
配列番号5は、δPKCの第一可変領域由来のアミノ酸配列(アミノ酸35〜44)、δV1−2である。
配列番号6は、δPKC由来のアミノ酸配列(アミノ酸74〜81)であり、そして本明細書中において、「δ」RACK、またはψδRACKと称される。
配列番号7は、δPKCの領域由来のアミノ酸配列(アミノ酸619〜676)であり、本明細書中において、δV1−5と称される。
配列番号8は、Drosophila Antennapediaホメオドメイン由来のキャリアペプチドである。
配列番号9は、Tat由来のキャリアペプチド(Tat47〜57)である。
配列番号10は、βPKC選択的アクチベーターペプチドである。
配列番号11は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号12は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号13は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号14は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号15は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号16は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号17は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号18は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号19は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号20は、配列番号6(ψδRACK)のフラグメントである。
配列番号21は、配列番号6(ψδRACK)のフラグメントである。
配列番号22は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号23は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号24は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号25は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号26は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号27は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号28は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号29は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号30は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号31は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号32は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号33は、配列番号6(ψδRACK)の改変である。
配列番号34は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号35は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号36は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号37は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号38は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号39は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号40は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号41は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号42は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号43は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号44は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号45は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号46は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号47は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号48は、配列番号4(δV1−1)の改変である。
配列番号49は、配列番号4(δV1−1)のフラグメントである。
配列番号50は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号51は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号52は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号53は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号54は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号55は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号56は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号57は、配列番号4(δV1−1)の改変されたフラグメントである。
配列番号58は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号59は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号60は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号61は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号62は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号63は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号64は、δV1−1のフラグメントである。
配列番号65は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号66は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号67は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号68は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号69は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号70は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号71は、配列番号5(δV1−2)の改変である。
配列番号72は、アネキシンVの配列である。

0036

(発明の詳細な説明)
(I.定義)
他に示されない限り、本明細書中の全ての用語は、本発明の分野の当業者に対するものと同じ意味を有する。開業医は、特に、当該分野の定義および用語について、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,F.M.ら、John Wiley and Sons,Inc.,Media Pa.)に注目する。

0037

アミノ酸残基についての省略形は、20個の通常のL−アミノ酸の1つをいうために当該分野において使用される、標準的な3文字コードおよび/または1文字コードである。

0038

アミノ酸の「保存されたセット」とは、タンパク質の群のメンバー間で保存されているアミノ酸の、連続した配列をいう。保存されたセットは、長さが2〜50アミノ酸残基を超えるいずれでもあり得る。代表的に、保存されたセットは、長さが2の連続した残基と10の連続した残基との間である。例えば、2つのペプチドMKAAEDPM(配列番号11)およびMRAPEDPM(配列番号14)について、4つの同一の位置(EDPM;配列番号20)が存在し、これが、これら2つの配列のアミノ酸の保存されたセットを形成する。

0039

保存的アミノ酸置換」とは、選択されたポリペプチドまたはタンパク質の活性(例えば、δV1−1PKC活性)または三次構造に有意な変化を生じない、置換である。このような置換は、代表的に、類似の物理化学的特性を有する異なる残基での、選択されたアミノ酸残基の置換を包含する。例えば、GluでのAspの置換は、保存的置換と考えられる。なぜなら、両方が、類似の大きさの負に荷電したアミノ酸であるからである。物理化学的特性によるアミノ酸のグループ化は、当業者に公知である。

0040

「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中において交換可能に使用され、そしてペプチド結合によって連結したアミノ酸残基の鎖を形成する化合物をいう。他に示されない限り、ペプチドの配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への順で与えられる。

0041

2つのアミノ酸配列または2つのヌクレオチド配列は、変異ギャップ行列および6以上のギャップペナルティーを用いるプログラムALIGN(Dayhoff,M.O.,ATRAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE(1
972)第5巻、National Biomedical Research Foundation,101−110頁、およびこの巻の補遺2、1−10頁)を使用して5より大きいアライメントスコアを有する場合に、相同(この用語が本明細書中において好ましく使用される場合に)であるとみなされる。より好ましくは、2つの配列(またはその部分)は、それらのアミノ酸が、上述のALIGNプログラムを使用して最適に整列された場合に、50%以上、より好ましくは70%、なおより好ましくは80%同一である場合に、相同である。

0042

ペプチドまたはペプチドフラグメントは、親ペプチドまたは親ポリペプチドのアミノ酸配列と同一または相同なアミノ酸配列を有する場合、その親ペプチドまたは親ポリペプチド「由来」である。

0043

「虚血」または「虚血現象」とは、特定の細胞、組織または器官への不十分な血液の供給をいう。低下した血液供給の結果は、その器官または組織への、不十分な酸素の供給(低酸素症)である。長期にわたる低酸素症は、影響を受けた器官または組織に対して傷害を生じ得る。

0044

無酸素症」とは、器官または組織において、酸素が事実上完全に存在しないことをいい、これは、長期にわたる場合、その細胞、器管または組織の死を生じ得る。

0045

「低酸素症」または「低酸素状態」とは、細胞、器管または組織が、不十分な酸素の供給を受ける条件を意図する。

0046

「再灌流」とは、流れがない期間または低下した流れの期間の後の、組織への流体の流れの戻りをいう。例えば、心臓の再灌流においては、冠状動脈の閉塞が除かれた後に、流体または血液が、この冠状動脈を通って心臓に戻る。

0047

「組織」とは、本明細書中において使用される場合、インビボまたはエキソビボのいずれかの、器官全体、器官の断片、または2つ以上の細胞を意図する。

0048

用語「PKC」とは、プロテインキナーゼC、すなわちC−キナーゼをいう。

0049

用語「RACK」とは、活性化C−キナーゼに対するレセプターをいう。

0050

(II.δPKCペプチドアゴニストおよびアンタゴニスト)
1つの局面において、本発明は、δPKCを活性化するのに効果的なペプチドおよびδPKCを阻害するのに効果的なペプチドを包含する。δPKCに対するRACKの配列は、未知である。なぜなら、このRACKが、未だ同定されていないからである。従って、δRACK配列についてのいかなる情報も存在しない下で、δPKC選択的なアクチベーターペプチドおよびインヒビターペプチドを同定することは困難である。さらに、虚血に応答するδPKCの正確な役割もまた、当該分野で未知である。δPKC(εPKCのような)が、ラットにおける虚血前条件付けの際にトランスロケーションを受けることが公知である(Gray,M.O.ら;Chen,C.−H.ら)。しかし、δPKCのトランスロケーションが虚血からの保護を生じるか否かは、本発明まで未知であった。

0051

δPKCの活性化および阻害のためのペプチド配列を同定するために本発明を支持して行われた研究において、δPKCの配列を、θPKCの配列と比較した。なぜなら、他の3つの新規PKCアイソザイムのうち、δPKCが、θPKCに最も類似する(52%のアミノ酸配列同一性を有する)からである(Osada,S.−Iら;Baier,G.ら)。各PKCアイソザイムが、異なるRACKと相互作用するはずであることもまた、
仮定された。δPKCの第1の可変(V1)ドメインは、RACK結合部位を含むので(Johnsonら、1996a)、θPKCに最も類似性の低い領域が、RACK結合に関与し得る。図1は、ラットδPKCのV1ドメイン(配列番号2;登録番号KIRTCD)およびマウスθPKC V1ドメイン(配列番号3;登録番号Q02111)の配列を比較する。δPKC V1ドメインにおける3つの領域が、θPKCに対してわずか約10%の同一性を有するものとして同定された。これらの領域は、δPKC配列の上側の棒によって図1において示され、本明細書中でδV1−1(配列番号4として本明細書中で同定された配列(SFNSYELGSL)を有する)、δV1−2(配列番号5として本明細書中で同定された配列(ALTTDRGKLV)を有する)、およびψδRACK(配列番号6として本明細書中で同定された配列(MRAAEDPM)を有する)と呼ばれる。図1に示されないが、δPKCの活性化または阻害を試験するためにδPKC配列から同定された、なお別の配列が存在する。この配列は、配列番号7として同定され、そして本明細書中でδV1−5と呼ばれる。

0052

実施例1に記載されるように、δV1−1ペプチドおよびψδRACKペプチドを分析し、これらのペプチドが活性を有するか否か、そしてもしそうであるならば、その活性が、δPKCのアゴニストまたはアンタゴニストのいずれであるかを決定した。示されるように、δV1−1、δV1−2およびδV1−5は、δPKCアンタゴニストであり、ψδRACKは、δPKCアゴニストである。これらの研究において、δV1−1ペプチドおよびψδRACKペプチドを、Drosophila Antennapediaホメオドメイン(配列番号8;Theodore,L.ら;Johnson,J.A.ら、1996b)へのN末端Cys−Cys結合を介する架橋によって、キャリアペプチドを用いて改変した。本明細書中に記載されない他の研究において、ペプチドを、Tat(配列番号9)またはポリアルギニン(Mitchellら、2000;Rolhbardら、2000)を用いて改変し、本明細書中に記載される結果と同様の結果を得た。本研究の詳細を、実施例1に示す。手短に言うと、これらのAntennapedia結合体化ペプチドを、ホルボール12−ミリスレート13−アセテート(PMA)の存在下および非存在下、または互いの存在下で、500nMの濃度で心臓の細胞に導入した。δPKCアイソザイムのトランスロケーションを、処理した細胞のサイトゾル画分および粒子画分ウエスタンブロット分析によって評価した。δPKCアイソザイムの細胞内局在を、抗δPKC抗体、抗αPKC抗体および抗εPKC抗体でブロットプローブすることによる、免疫蛍光によって評価した。トランスロケーションを、未処理細胞におけるアイソザイムの量に対する粒子画分中のアイソザイムの量として表す。結果を、図2〜4に示す。

0053

図2A〜2Bは、PMAの存在下(+)および非存在下(−)においてδV1−1で処理した細胞についての結果を示す。図2Aは、ペプチドでの処理後ならびに抗δPKC抗体および抗εPKC抗体でプローブした後の、可溶性(S)細胞画分および粒子性(P)画分のウエスタンブロットオートラジオグラムである。図2Bは、未処理細胞におけるアイソザイムの量に対する粒子画分中のアイソザイムの量として表した、δPKCのトランスロケーションを示す。δV1−1ペプチドは、PMA誘導性δPKCトランスロケーションを阻害した。本明細書中に示されない他の研究において、δV1−1ペプチドは、εPKCまたはαPKCのトランスロケーションを阻害しなかった。

0054

図3A〜3Bは、PMAの存在下(+)および非存在下(−)においてψδRACKで処理した細胞についての同様のプロットである。ψδRACKは、それが、αPKCまたはεPKCのいずれのトランスロケーションに影響を及ぼすことなく、心筋細胞においてδPKCのトランスロケーションを選択的に誘導するという点で、δV1−1とは、効果において正反対である。

0055

図4A〜4Bは、ψδRACKの存在下および非存在下においてδV1−1で処理した
細胞についての結果を示す。粒子性画分におけるδPKCの基礎的な分配は、δV1−1によって阻害され、そしてψδRACKの存在は、このδV1−1の効果を反転させた。

0056

図2〜4の結果は、まとめて、δV1−1が、δPKCの選択的なトランスロケーションインヒビターであること、およびψδRACKが、ψRACK部位に類似し、そしてδPKCの選択的なトランスロケーションアクチベーターとして作用することを、示す。

0057

(A.虚血に起因する損傷からの細胞の保護)
別の研究において、δPKCアクチベーターペプチドψδRACKおよびδPKCインヒビターペプチドδV1−1を、単離されたラット心筋細胞に投与し、虚血からの保護におけるδPKCの役割を決定した。実施例2に記載されるように、δV1−1および/またはψδRACKのAntennapediaキャリアペプチド結合体を、長期の虚血の10分前に、単離された成体ラット心筋細胞に導入した。細胞損傷を、トリパンブルーの取り込みを測定することによる、浸透圧脆弱性試験を使用して評価した。結果を、図5A〜5Cに示す。

0058

図5Aは、1μMのψδRACKの存在下(+)または非存在下(−)において10nM、100nM、500nMおよび1μMの濃度のδV1−1で処理した細胞についての結果を示す。これらの結果を、x軸に沿って示される処理した細胞についての、細胞損傷のパーセンテージとして表す。コントロールとして、βPKC選択的アクチベーターペプチド(SVEIWD、配列番号10)を使用した。これらのペプチドを、180分間の虚血期間の10分前に投与した。虚血前に投与したδV1−1の存在は、虚血誘導性損傷からの濃度依存性ベルの保護を生じた。保護は、δPKC特異的トランスロケーションアクチベーターペプチドψδRACKとの同時インキュベーションによって妨げられたが、コントロールのβPKC選択的トランスロケーションアクチベーターとの同時インキュベーションによって妨げられなかった。

0059

図5Aのデータは、ψδRACKでのδPKCの活性化が、虚血発作後の心筋細胞損傷のわずかな増加を生じることを示唆した。これに基づいて、ψδRACKが、δPKCの虚血誘導性活性化と相乗的に作用して、細胞損傷を引き起こすと仮定した。これを、虚血発作の期間を減少することによって評価した。なぜなら、細胞損傷の誘導におけるψδRACKと虚血との間の相乗作用は、虚血発作が減少された場合に明らかになるはずであるからである。従って、虚血期間を90分に短縮して、別の研究を行った。この研究の結果を、図5Bに示す。細胞損傷におけるψδRACK誘導性の増加は、虚血時間を180分から90分に短縮した場合に有意となり、そしてδPKCインヒビターδV1−1との同時処理によって反転された。従って、虚血によるδPKCの活性化は、細胞損傷を媒介するようである。まとめて、図5Aおよび5Bは、擬態性の虚血によって誘導される細胞損傷が、δPKCの活性化に少なくとも一部起因することを、実証する。

0060

(B.心臓全体へのペプチドのエキソビボ送達)
本発明を支持して行われた別の研究において、δPKC選択的インヒビターペプチドδV1−1、またはアクチベーターペプチドψδRACKを、エキソビボで心臓全体に送達し、これらのペプチドが器官全体に細胞外導入された場合に、活性を有するか否かを決定した。実施例3に示されるように、δV1−1ペプチドおよびψδRACKペプチドを、キャリアペプチドであるTat由来ペプチドに結合体化した。これらのペプチドを、虚血期間の導入前に、Langendorff灌流したラット心臓に送達した。ペプチドを灌流した後、全体的な虚血が、30分間もたらされた。この30分間の虚血期間後、放出されたクレアチンホスホキナーゼCPK)の量を、30分間の再灌流期間中モニターした。結果を、図6A〜6Bに示す。

0061

図6Aは、虚血後の再灌流期間中の時間の関数としての、δV1−1(黒丸)またはψδRACK(黒菱形)で処置したラット心臓全体におけるクレアチンホスホキナーゼ(CPK)放出によって測定した、細胞損傷を示す。コントロールとして、いくつかの心臓を、虚血前に未処置のままにし(白四角)、そして他の心臓を、酸素正常状態で維持した(白三角)。

0062

図6Bは、δV1−1およびψδRACKで、実施例6Aに記載のように処置したエキソビボ心臓についての総CPK放出によって測定した、総細胞損傷を示す、棒グラフである。図6Bはまた、以下の2つのコントロールで処置したエキソビボ心臓についての総細胞損傷を示す:Tatキャリアペプチド単独およびTatキャリアペプチドに結合体化させた改変ψδRACK配列。

0063

図6A〜6Bは、δPKCアクチベーターψδRACKの急性投与が、虚血によって誘導される心臓損傷を約30%増加させることを示す。δPKC選択的インヒビターδV1−1の急性投与は、クレアチンキナーゼの放出の減少によって示されるように、虚血損傷から心臓を保護した。まとめると、これらのデータは、インタクトな心臓において、δPKCの阻害が、虚血損傷に対して50%を超える保護を与えることを示す(図6A)。従って、本発明は、δPKC選択的アンタゴニスト(例えば、δV1−1、δV1−2、δV1−5)を組織に投与することによって、虚血に起因する損傷から細胞または組織を保護する方法を意図する。このような投与は、細胞損傷を、虚血発作前に未処置にしておいた組織と比較して、少なくとも約10%、より好ましくは、少なくとも約25%、そして最も好ましくは、少なくとも約50%減少させるのに効果的である。

0064

別の研究を行い、これらのペプチドをインタクトな器官に送達して、虚血発作後に保護を提供する提供し得るか否かを決定した。実施例4に記載されるように、この研究において、上記のラット心臓モデルを使用し、血行力学パラメーターを、20分間の全体的な虚血中および20分間の再灌流中に測定した。再灌流の間のみ、δV1−1を、500nMの濃度で送達した。結果を、図7A〜7Bに示す。

0065

図7Aは、20分間の全体的な虚血後の、δV1−1を灌流した作動中の心臓の機能的回復を示す。ここで、左心室圧(LVP、mmHg)、その一次導関数(dp/dt、m
mHg/秒)および冠動脈灌流圧(PP、mmHg)を示す。図7Bは、未処置の心臓に
ついての同様のプロットである。δV1−1で処置した心臓(図7A)および未処置の心臓(図7B)についてのトレースを比較することによって理解されるように、δV1−1を再灌流の最初の20分間中に送達した場合、虚血後の機能的回復に有意な改善が存在した。特に、LVP回復およびその一次導関数(dP/dt)の両方における有意な改善が、虚血発作後にδV1−1を投与することによって達成された。δV1−1ペプチドは、その上昇されたLVP拡張末期圧および冠動脈灌流圧(PP)を減少させた。さらに、ビヒクルコントロールで処置した心臓と比較して、クレアチンホスホキナーゼ放出における約50%の減少が存在した(示さず)。

0066

類似の研究において、5対のラットを、実施例4に記載されるように処置した。ここで、エキソビボ心臓を、20分間の虚血および30分間の再灌流に供した。再灌流の最初の20分間に、500nMのδV1−1またはビヒクルコントロールを投与した。平均した結果を、図8A〜8Cに示す。

0067

図8Aは、虚血前(「ベースライン」としてx軸上に示す)および再灌流が提供された後の5〜30分の期間中の左心室圧のパーセント(%LVDP)を示す。データを、この再灌流中(δV1−1での処置中および処置後を意味する)に収集した。δV1−1ペプチドで処置した心臓(黒四角)は、未処置で置いた心臓(白丸)よりも、2倍〜4倍高い
LVDPを有した。

0068

図8Bは、虚血前(x軸上に「ベースライン」として示す)およびδV1−1での再灌流処置後(黒四角)またはコントロールビヒクルの再灌流後(白丸)の5〜30分の期間中の拡張末期圧(EDP)を示す、類似のプロットである。δV1−1で処置した心臓についてのEDPは、約60mmHgであった。虚血後に未処置のままにした心臓(白丸)は、約70〜80mmHgのEDPを有した。

0069

図8Cは、δV1−1で処置した心臓(黒四角)および未処置の心臓(白丸)の灌流圧(PP)を示す。虚血前のベースラインの灌流圧を、x軸上に示す。虚血後およびδV1−1での処置後に、灌流圧は、未処置のままの心臓で見出された灌流圧の約75%であった。

0070

図7〜8のデータは、虚血発作後の細胞または組織へのδPKCアンタゴニストペプチド(例えば、δV1−1、δV1−2、δV1−5)の投与が、虚血および生じる低酸素症に起因する損傷から細胞または組織を保護するのに効果的であることを示す。これらのデータはまた、δPKCアンタゴニストペプチドが、虚血および低酸素症に起因する損傷を減少または最小化するのに効果的であり、組織が虚血後に、その機能的特性を回復するのを可能にすることを示す。

0071

(C.δV1−1でのインビボ処置)
本発明を支持する別の研究において、虚血性または低酸素症性の現象に起因する損傷から組織を保護するδV1−1ペプチドの能力を、成体雌性ブタにインビボでペプチドを投与することによって評価した。実施例5に詳述されるように、δV1−1ペプチドを、30分間の虚血発作の最後の10分間の間、ブタに投与した。5日後、心臓を、組織損傷について分析した。これらの結果を、図9A〜9Bに示す。

0072

図9A〜〜9Bは、δV1−1(図9A)またはコントロールとしてのキャリアペプチド単独(図9B)で5日前にインビボ処置したブタから採取した、ブタ心臓スライスデジタル化した写真である。これらの心臓を、二重染色技術(実施例5)で染色した。この技術は、虚血損傷の危険性のある領域(矢印内の領域、主に、2つの矢印間の下半球における)および梗塞領域図9Bにおける白い領域)の決定を可能にした。図9Bに示されるように、コントロールの心臓は、危険性のある領域(矢印で示される境界)内に大きな梗塞領域を有する。対照的に、δV1−1ペプチド(図9A)を受けたブタは、有意に減少された梗塞領域を有する。危険性領域の外側(矢印の外側)の図9Aにおける白い領域は、結合組織および脂肪であり、梗塞領域ではない。

0073

図9Cは、未処置のコントロール動物およびδV1−1で処置した動物についての、危険性のある領域の梗塞率を示す棒グラフである。δPKCアンタゴニストで処置した動物は、未処置のままの動物よりも、約2倍低い梗塞率を有した。まとめると、図9A〜9Cは、δV1−1が、インビボで器官全体に投与され得、そして虚血に起因する損傷からの保護を提供し得ることを示す。

0074

肝臓、脳、腸、腎臓などの血液サンプルおよび組織サンプルを、動物から収集し、そして病理学実験室で分析した。全てのサンプルは正常であり、炎症も組織の異常も観察されなかった。さらに、マウスモデルにおける1μMの最終濃度でのδV1−1アンタゴニストペプチドの2回の注射で、悪い影響は存在しなかった。腎臓、肝臓、脳および肺の機能は正常であり、そして全ての血液分析もまた正常であった。

0075

別の研究において、左心室造影を、以下の3つの時点でブタ(n=5)において実行し
た:(1)バルーンカテーテルによる左前方下行動脈の閉塞前(虚血前);(2)2.5μM/10mLのδV1−1を用いる再灌流直後(虚血後);および(3)6フレンチのブタ尾部カテーテルを使用する、5日後の屠殺前(虚血後5日)。LVGを、2つの視点右斜め前方および左斜め前方)によって記録した。放出分率(EF)(最大収縮の間の、左心室に存在する総最大量のうち、1心拍数で放出された血液の割合)を、ソフトウェア(Plus Plus(Sanders Data Systems))によって分析し、そして2つの視点の平均を評価した。放出分率を、左心室の寸法に基づいて算定し、そして結果を図10に示す。放出分率を、心臓が十分に機能しているかどうかの測定であり、より高い放出分率は、心臓がより良く機能していることを示す。短時間での50%未満の放出分率は、心不全状態への進行を示唆し得る。δV1−1処置動物(黒丸)は、スクランブルペプチドで処置したコントロール動物(白丸)が示したものよりも、放出分率において、より顕著でない減少を示し、このことは、このペプチドが、虚血に起因する細胞および組織に対する損傷を減少または予防するために有効であることを示唆する。このことはまた、虚血後5日目のデータポイントから明らかである。ここで、δV1−1処置された動物は、虚血前に測定された基準値に対して、未処置動物よりも有意により高い放出分率を有した。

0076

まとめると、エキソビボおよびインビボの研究によって、虚血の前、虚血の間または虚血後に送達された場合に、δV1−1が、虚血により誘導される心臓および脳に対する損傷の実質的な減少を付与することが示される。従って、δPKCペプチドアンタゴニスト(例えば、δV1−1ペプチド、δV1−2ペプチド、δV1−5ペプチド)での処置は、(例えば、心臓虚血の間に生じる)虚血に曝された組織についての治療的処置を提供する。

0077

(D.発作誘導性損傷の阻害のためのインビボ処置)
本発明を支持するためにさらに実行された別の研究において、δV1−1ペプチド(配列番号4)が発作の結果としての脳に対する損傷を阻害する能力を試験した。実施例6に記載されるこの研究において、ラット大脳虚血モデルを使用した。虚血を、中大脳動脈の口を閉塞するための腔内縫合を使用して誘導した。Tatペプチド(配列番号9)に結合体化したδV1−1またはTatペプチド単独を、2時間の閉塞時間の前または後に、頚動脈に注射した。各動物由来の脳を、24時間後に収集し、染色し、そして試験した。結果を、図11A〜11Bに示す。

0078

図11Aは、発作誘導に供された未処置動物から取られた脳のデジタル写真である。染色されたラット脳切片は、明らかに、中大脳動脈領域の塞栓を実証した。2時間の閉塞によって誘導された塞栓領域は、動物間で再現性があった。図11Bは、虚血前および虚血期間の終了時にδV1−1ペプチドで処置された2匹の動物由来の脳切片を示す。塞栓領域の有意な減少は、容易に明らかである。

0079

従って、本発明は、中枢神経系(例えば、脳、ニューロンおよびグリア細胞)の組織に対する損傷を、δPKCペプチドアンタゴニスト(例えば、δV1−1、δV1−2またはδV1−5)を、発作の前、発作の間、または発作後に投与することによって、減少させる方法を意図する。このペプチドは、虚血傷害に曝された未処置の組織と比較した場合、少なくとも約10%の塞栓領域の減少、より好ましくは少なくとも約25%の減少、そして最も好ましくは少なくとも約50%の減少によって明らかなように、組織損傷を減少させるために有効である。

0080

(III.使用方法
上記のように、本発明のペプチド(δV1−1、δV1−2、δV1−5およびψδRACK)は、δPKCの転移インヒビターまたはアクチベーターとして作用する。ψδR
ACKは、δPKC転移を誘導して、虚血および/または低酸素症に起因する細胞損傷を促進する、アゴニストである。δV1−1、δV1−2およびδV1−5は、δPKC転移を阻害して、虚血および結果として生じる低酸素症に起因する細胞損傷を予防する、アンタゴニストである。

0081

このペプチドが、天然形態で使用されてもよく、上記のようなキャリアへの結合体化によって改変されてもよいことが理解される。あるいは、これらの配列由来の1または2個のアミノ酸は、置換または欠失され得、そして各ペプチドについての例示的な改変および誘導体およびフラグメントを、以下に示す。

0082

配列番号6として同定されるψδRACKペプチドについて、潜在的な改変としては、以下に小文字で示される変化が挙げられる:MkAAEDPM(配列番号11)、MRgAEDPM(配列番号12)、MRAgEDPM(配列番号13)、MRApEDPM(配列番号14)、MRAnEDPM(配列番号15)、MRAAdDPM(配列番号16)、MRAAEDPv(配列番号17)、MRAAEDPi(配列番号18)、MRAAEDPl(配列番号19)、およびMRAAEDmp(配列番号22)、MeAAEDPM(配列番号23)、MdAAEDPM(配列番号24)、MRAAEePl(配列番号25)、MRAAEDPl(配列番号26)、MRAAEePi(配列番号27)、MRAAEePv(配列番号28)、MRAAEDPv(配列番号29)、ならびに上記の任意の組み合わせ。ψδRACKに対する以下の改変もまた意図され、そしてこのペプチドをアゴニストからアンタゴニストへ転換することが予測される:MRAAnDPM(配列番号30)、およびMRAAqDPM(配列番号31)、MRAAEqPM(配列番号32)、MRAAEnPM(配列番号33)。ψδRACKの適切なフラグメントもまた意図され、配列番号20、21が例示的である。

0083

従って、用語「δPKCアゴニスト」は、本明細書中で使用される場合、ψδRACKペプチドを意図し、これは、配列番号6、ならびに配列番号6および本明細書中で同定されたペプチド(配列番号11〜19および配列番号21〜29に限定されない)に対する配列相同性を有するペプチドをいう。用語δPKCアゴニストは、さらに、配列番号20〜21によって例示されるような、これらのψδRACKペプチドのフラグメントをいう。

0084

δV1−1について、潜在的な改変としては、以下に小文字で示される変化が挙げられる:tFNSYELGSL(配列番号34)、aFNSYELGSL(配列番号35)、SFNSYELGtL(配列番号36)(これら3つの置換の任意の組み合わせ(例えば、tFNSYELGtL(配列番号37)を含む)。他の潜在的な改変としては、SyNSYELGSL(配列番号38)、SFNSfELGSL(配列番号39)、SNSYdLGSL(配列番号40)、SFNSYELpSL(配列番号41)が挙げられる。他の潜在的な改変としては、1つまたは2つのLからIまたはVへの変化が挙げられる:例えば、SFNSYEiGSv(配列番号42)、SFNSYEvGSi(配列番号43)、SFNSYELGSv(配列番号44)、SFNSYELGSi(配列番号45)、SFNSYEiGSL(配列番号46)、SFNSYEvGSL(配列番号47)、aFNSYELGSL(配列番号48)および上記の改変の組み合わせ。δV1−1のフラグメントおよびフラグメントの改変もまた意図される(例えば、YELGSL(配列番号49)、YdLGSL(配列番号50)、fDLGSL(配列番号51)、YDiGSL(配列番号52)、YDvGSL(配列番号53)、YDLpsL(配列番号54)、YDLglL(配列番号55)、YdLGSi(配列番号56)、YdLGSv(配列番号57)、LGSL(配列番号58)、iGSL(配列番号59)、vGSL(配列番号60)、LpSL(配列番号61)、LGlL(配列番号62)、LGSi(配列番号63)、LGSv(配列番号64))。

0085

従って、用語「δV1−1ペプチド」は、本明細書中で使用される場合、配列番号4によって同定されるペプチド、配列番号4に対して相同なペプチド(配列番号34〜48に示されるペプチド、ならびに活性を保持するこれらのペプチドのいずれかのフラグメント(配列番号49〜64によって例示されるが、これらに限定されない)が挙げられるが、これらに限定されない)をいう。

0086

δV1−2について、潜在的な改変としては、以下に小文字で示される変化が挙げられる:ALsTDRGKTLV(配列番号65)、ALTsDRGKTLV(配列番号66)、ALTTDRGKsLV(配列番号67)およびこれら3つの置換の任意の組み合わせ、ALTTDRpKTLV(配列番号68)、ALTTDRGrTLV(配列番号69)、ALTTDkGKTLV(配列番号70)、ALTTDkGkTLV(配列番号71)、1つまたは2つのLからIまたはVへの変化、1つまたは2つのVからIまたはLへの変化、ならびに上記の任意の組み合わせ。特に、LおよびVは、V、L、I、RおよびDに変化され得、そしてEは、NまたはQに変化され得る。

0087

従って、用語「δV1−2ペプチド」は、本明細書中で使用される場合、配列番号5によって同定されるペプチドおよび配列番号5に対して相同なペプチド(配列番号65〜71に示されるペプチド、その活性を保持するこれらのペプチドのいずれかのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない)をいう。

0088

δV1−5(配列番号7)について、潜在的な改変としては、δV1−2について記載された改変と類似の改変が挙げられる。用語「δV1−5ペプチド」は、本明細書中で使用される場合、配列番号7および配列番号7に対して相同なペプチド、ならびにその活性を保持するこれらのフラグメントをいう。

0089

従って、用語「δPKCアンタゴニスト」は、本明細書中で使用される場合、δPKCペプチドを意図し、δV1−1ペプチド、δV1−2ペプチドおよびδV1−5ペプチドのいずれかをいう。

0090

なお他の実施形態において、このペプチドは、融合タンパク質または輸送タンパク質結合体の一部であり得る。代表的には、融合タンパク質を形成するために、ペプチドは、Cys−Cys結合以外の結合によって、別のペプチド結合する。1つのペプチドのC末端から他方のペプチドのN末端へのアミド結合は、融合タンパク質における結合の例示である。δPKCアゴニスト/アンタゴニストペプチドが結合する第二のペプチドは、治療目的または輸送目的のために選択される、実質的に任意のペプチドであり得る。例えば、おそらくサイトカインまたは生物学的応答を誘発する他のペプチドに対して、δV1−1ペプチドを結合させることが望ましい。

0091

このペプチドが結合体の一部である場合、このペプチドは、代表的に、キャリアペプチド(例えば、Tat由来の輸送ポリペプチド(Vivesら、1997)、ポリアルギニン(Mitchellら、2000;Rolhbardら、2000)またはAntennapediaペプチド)に、Cys−Cys結合によって結合体化される。米国特許第5,804,604号を参照のこと。別の一般的な実施形態において、このペプチドは、キャリアまたはカプセル化剤(例えば、リポソーム媒介性送達におけるリポソーム)を使用して、細胞、組織または器官全体に導入され得る。

0092

このペプチドは、(i)化学的に合成され得るか、または(ii)例えば、このペプチドをコードするポリヌクレオチドフラグメントを含む発現ベクターを使用して、宿主細胞において組み換え的産生され得、ここで、このポリヌクレオチドフラグメントは、宿主
胞においてこのフラグメントからmRNA発現し得るプロモーターに、作動可能に連結される。

0093

別の局面において、本発明は、低酸素症状態に曝された細胞、組織または器官全体に対する虚血損傷を減少させる方法を包含する。この方法は、治療的有効量のアイソザイム特異的δPKCアンタゴニスト(例えば、δV1−1、δV1−2、δV1−5または上記のこれらのペプチドの改変、誘導体およびフラグメントのいずれか)を、低酸素症状態に曝される前に細胞、組織または器官全体に導入する工程を包含する。δPKCアンタゴニストはδPKCを阻害し、細胞に対する虚血損傷を減少させることによって、細胞、組織または器官全体の保護を生じる。虚血損傷の減少は、δPKCアンタゴニストペプチドの前処置を受けなかった対応する細胞、組織または器官全体が被った虚血損傷に対して測定される。

0094

投与されるペプチドの用量は、被験体の状態、投与のタイミング(すなわち、虚血現象の前、虚血現象中または虚血現象後にペプチドが投与されるかどうか)に依存して異なることが理解される。当業者は、適切な投薬量、使用、例えば、本明細書中に記載される器官全体研究および動物研究において使用される投薬量を決定できる。

0095

この方法は、種々の細胞型心臓細胞、中枢神経系(CNS)細胞(例えば、ニューロンおよびグリア細胞)、腎臓細胞などを含む)を用いて実行され得る。種々の組織または器官全体(脳、心臓、眼および腎臓が挙げられるが、これらに限定されない)が処置され得る。

0096

このペプチドは、インビトロ、インビボまたはエキソビボで、細胞、組織または器官全体に投与され得る。全ての投与様式(静脈内、非経口、皮下、吸入経鼻、舌下、粘膜および経皮を含む)が意図される。好ましい投与様式は、標的組織に対して動脈を介した(例えば、インタクトな心臓に対して冠状動脈を介した)、注入または再灌流による。

0097

なお別の局面において、本発明は、低酸素症状態に曝された細胞、組織または器官全体に対する虚血損傷を増強する方法を包含する。この方法は、例えば、被験体中の固形腫瘍の処置に適切である。この方法はまた、細胞または組織に対する損傷が所望される、インビトロまたはインビボの研究において用途を見出す。この方法は、治療的有効量のアイソザイム特異的δPKCアゴニスト(例えば、ψδRACK(配列番号6)または上記のψδRACKに対する改変から得られる任意のペプチド)を、この細胞、組織または器官全体に導入する工程を包含する。虚血損傷の増強の程度は、δPKCアゴニストで処置されていない対応する細胞、組織または器官全体が被った虚血損傷と比較して測定される。

0098

(IV.試験化合物の同定およびスクリーニング
別の局面において、本発明は、低酸素症/虚血損傷からの細胞もしくは組織の保護を誘導するか、または細胞もしくは組織における低酸素症損傷もしくは虚血損傷を増強するに有効な化合物を同定する方法を包含する。

0099

第一の方法において、δPKC特異的アゴニスト(δV1−1、δV1−2、δV1−5または上記のこれらペプチドの任意の改変)を使用して、細胞におけるδPKC転移を阻害するに有効な化合物を同定し、そして/またはアネキシンV(配列番号72)もしくは他のδRACK由来のペプチドを競合的に置換し、そして/またはペプチドがδRACKなどに結合することを予防もしくは阻害する。このような化合物は、δPKCの転移および/または機能を阻害し、それによって細胞または組織を虚血に起因する損傷からの保
護を誘導するための治療剤としての用途を見出す。この化合物はまた、他のペプチドを同定するためのスクリーニングツールとして、または他のペプチドを同定するために適切な
化合物としての用途を見出す。

0100

この方法において、δRACK結合部位を有するδPKCペプチド(例えば、アネキシンV)は、試験化合物の存在下または非存在下で、δRACK結合部位を有するδPKCアンタゴニストペプチド(例えば、δV1−1、δV1−2またはδV1−5)と接触させられる。δRAKC結合部位を有するペプチドと試験化合物との相互作用が、モニタリングされるか、そして/またはδPKCアゴニストもしくは試験化合物の触媒活性がモニタリングされる。一般に、試験化合物は、試験化合物の存在下で、δRACK結合部位に対するペプチドアンタゴニストの結合が減少する場合、試験化合物の非存在下での結合と比較して、虚血現象または低酸素症現象からの保護を誘導するに有効であるとして同定される。あるいは、これら成分の触媒活性がモニタリングされ得る。例えば、ペプチドのリン酸化活性がモニタリングされ得る。この試験化合物がリン酸化を増加させる能力、または結合に引き続くいくつかの他の触媒活性が、試験化合物の非存在下での活性と比較して増加する場合、この化合物は、低酸素症現象または虚血現象のいずれかによって引き起こされた創傷からの保護を誘導するに有効であるとして同定される。

0101

別の方法において、アゴニストペプチドψδRACKを使用して、細胞または組織における低酸素症損傷または虚血損傷を増強するに有効な化合物を同定し得る。この方法において、ψδRACKアゴニストペプチドは、試験化合物の存在下または非存在下で、δRACK結合部位を含むδPKCペプチドと接触させられる。試験化合物の存在下での結合と比較して、δRACK結合部位に対するペプチドアゴニストの結合を減少させることができる場合、この試験化合物は、虚血に起因する損傷を増強するに有効であるとして同定される。適切なψδRACKペプチドとしては、配列番号6として同定されるペプチド、そのフラグメントおよび誘導体(配列番号10〜24に示されるペプチドが挙げられるが、これらに限定されない)が挙げられる。

0102

ψδRACK様化合物もまた、インビトロでδPKCの触媒活性に対するその影響を測定することによって、同定され得る。所望の化合物は、限定量のδPKC補因子の存在下で、δPKCの触媒活性を増加させる(Ronら、1995)。触媒活性とは、別のタンパク質または基質をリン酸化する、ペプチドの能力をいう。

0103

類似のスクリーニング方法実験の詳細は、米国特許第6,165,977号に示され、そしてこの第14欄第45行〜第15欄第54行の部分は、本明細書中に参考として援用される。手短に言うと、そして細胞または組織を虚血から保護するのに効果的な化合物を同定するための例示として、δPKCを、マルチウェルプレートウェルの内側に固定する。これは、δPKCを含む溶液プレートに導入し、そしてδPKCをそのプラスチックに結合させることによる。ウェルは、δPKCの結合を増強する物質および/または非特異的結合のレベルを減少する物質で予めコートされ得る。

0104

次いで、プレートを、ブロッキング溶液(例えば、ウシ血清アルブミンを含有する)と共にインキュベートし、次いで、数回洗浄する。レポーター標識化(例えば、放射標識化または蛍光タグ化)したペプチドδV1−1(配列番号4)、および試験ウェルコントロールウェルとは対照的に)に試験化合物を含む溶液、添加する。異なるウェルは、異なる試験化合物または異なる濃度の同じ試験化合物を含み得る。各濃度の各試験化合物を、代表的には、2連で実行し、そして各アッセイを、代表的には、ネガティブコントロール(試験化合物を含まないウェル)およびポジティブコントロール(「試験化合物」が未標識のペプチドであるウェル)を用いて実行する。次いで、遊離のペプチドを洗い流し、ウェル中の結合の程度を評価する。

0105

試験化合物を、それがペプチドの結合を減少させる場合(すなわち、結合の程度に対す
るその効果が、閾値レベルを超える場合)、その試験化合物を活性とみなす。より詳細には、結合の減少が、コントロールサンプル実験サンプルとの間で数倍異なる場合、その化合物を、結合活性を有するものとみなす。代表的には、試験サンプルとコントロールサンプルとの間の結合において、2倍または4倍の閾値差が求められる。

0106

このようなアッセイにおいて有用な検出方法としては、抗体ベースの方法、ペプチドに組み込まれたレポーター部分(例えば、蛍光標識)の直接検出などが挙げられる。

0107

種々の試験化合物がスクリーニングされ得、これらには、他のペプチド、高分子、低分子化学混合物および/または生物的混合物真菌抽出物細菌抽出物、または藻類抽出物が挙げられる。化合物は、生物学的起源または合成起源であり得る。

0108

前述から、本発明の種々の目的および特徴がどのようにして満たされるかが、理解され得る。δPKCのトランスロケーションおよび機能の新規なアクチベーターおよびインヒビターが、同定された。これらのペプチドは、インビボまたはエキソビボで送達され、δPKCの機能的阻害または活性化を達成し得る。例えば、冠状動脈を介するインタクトな心臓へのペプチドの送達は、そのペプチドが、細胞内でタンパク質−タンパク質相互作用の直接的なペプチドモジュレーターとして作用するのを可能にする。δPKCアンタゴニストの送達によるδPKCの阻害は、虚血現象に起因する組織損傷を減少することもまた、見出された。δPKCおよびεPKC(これは、当該分野で以前に記載されている)が、虚血に応答して対抗する効果を示すが、両方のアイソザイムの活性化が、同様の形態の心臓肥大を導くことは、注目すべきことである。このことは、特に予測されていなかった。なぜなら、両方のアイソザイムは、虚血によって、そして虚血から心臓保護を導く刺激によって、活性化されるからである(Gray,M.O.ら、Chen,C.−H.ら)。δPKCおよびεPKCは、対向する力であり、そしておそらく、これらの対向する力間のバランスが、虚血発作に対する結果を決定し、ここで、保護は、εPKCの活性化がδPKCの活性化を超える場合に生じる。長期の虚血期間の間、細胞死を誘導するが有利であり得、細胞死は、εPKCの活性と比較したδPKCの活性における、時間依存性の増加から生じる。このようにして、制限された量の酸素、グルコースおよび他の栄養素が、残存する、ほとんど損傷されていない細胞によって使用され得、最終的に、器官に対して改善された結果を導く。

0109

(V.実施例)
以下の実施例は、本明細書中に記載の本発明をさらに例示し、そして本発明の範囲を限定することを全く意図されない。

0110

(実施例1)
(δV1−1、δV1−2およびψδRACKの活性)
(A.ペプチド調製)
δV1−1(配列番号4)およびψδRACK(配列番号6)を、Stanford Protein and Nucleic Acid Facilityで合成および精製(>95%)した。これらのペプチドを、Drosophila Antennapediaホメオドメイン(配列番号8;Theodore,L.ら;Johnson,J.A.ら、1996b)へのN末端Cys−Cys結合を介する架橋によって、キャリアペプチドを用いて改変した。本明細書中で報告されないいくつかの研究において、これらのペプチドを、Tat由来ペプチド(配列番号9)に整列させた。

0111

(B.細胞へのペプチド送達
初代心筋細胞培養物(90〜95%純度)を、新生仔ラットから調製した(Gray,
M.O.ら;Disatnik M.−H.ら)。ペプチドδV1−1およびψδRACKを、500nMの適用濃度にて、それぞれ、3nmおよび10nmの濃度のホルボール12−ミリスチレート13−アセテート(PMA)の存在下および非存在下で、10〜20分間、細胞に導入した。第3のセットの細胞において、ペプチドδV1−1を、500nMのψδRACKの存在下および非存在下で、500nMの濃度で適用した。

0112

δPKCアイソザイムのトランスロケーションを、δPKCアイソザイム特異的抗体を使用して、ウエスタンブロット分析(Santa Cruz Biotechnology)によって評価した。処理した細胞のサイトゾル画分および粒子画分のウエスタンブロット分析を、Johnsonら、1995に記載されるように行った。δPKCアイソザイムの細胞内局在を、抗δPKC抗体、抗αPKC抗体および抗εPKC抗体でプローブしたブロットの化学発光によって評価した。各画分におけるPKCアイソザイムの量を、スキャナを使用して定量化し、そしてトランスロケーションを、未処理細胞におけるアイソザイムの量に対する粒子画分中のアイソザイムの量として表す。δPKCアイソザイムのトランスロケーションにおける変化もまた、処理した細胞および固定した細胞の免疫蛍光研究(Grayら、1997)によって決定した。トランスロケーションを、盲検様式での処理あたり100個を超える細胞を計数することによって決定した。結果を、図2A〜2B、図3A〜3Bおよび図4A〜4Bに示す。

0113

(実施例2)
(単離された心筋細胞へのペプチド投与)
ペプチドδV1−1およびψδRACKを、実施例1に記載のように調製した。

0114

成体雄性Wistarラット心筋細胞を、コラーゲナーゼ処理(Armstrong,S.ら)によってLangendorff装置(van der Heide,R.S.ら)で調製した。これらの細胞を、1μMのψδRACKの存在下または非存在下で、10nM、100nM、500nMおよび1μMの濃度のδV1−1で処理した。βPKC選択的アクチベーターを、コントロールとして使用した。

0115

刺激された虚血について、キャリアに結合体化させたδV1−1ペプチドおよび/またはψδRACKペプチドで微量遠心管において処理した成体筋細胞を、グルコースを含まない脱気したインキュベーション緩衝液で2回洗浄し、そしてペレット化した。最小量の緩衝液の上に、この細胞ペレットを、マイクロバルーン(Sig Manufacturing,Montezuma,IA)または窒素飽和させた脱気した緩衝液のいずれかを用いて重層し、そして気密蓋シールした。次いで、管を、37℃で、180分または90分のいずれかの間インキュベートした。

0116

細胞損傷を、低張性(85mosM)溶液中に添加したトリパンブルーの取り込みを測定することによる、浸透圧脆弱性試験によって評価した。結果を、図5A〜5Bに示す。同様の結果がまた、live−deadキット(Molecular Probes)を使用することによってか、または以前に記載されたように(Chenら、1999;Grayら、1997;Mackayら、1999)、キット(Sigma)を使用して培地へのラクトースデヒドロゲナーゼの放出を測定することによって得られた。

0117

(実施例3)
(心臓全体へのエキソビボペプチド投与および細胞損傷に対する効果)
成体雄性ラットを、静脈内アベルチン(avertin)で麻酔し、そしてそれらの心臓を迅速に取り出し、そしてランゲドルフ装置を使用する当該分野で記載されるような(Colbert,M.C.ら)灌流のために、大動脈を介してカニューレ挿入した。除去の90秒以内に心臓を灌流するように注意した。心臓を、酸素付加したKrebs−H
enseleit溶液で灌流した。この溶液は、以下から構成される(nmol/L):NaCl 120;KCl 5.8;NaHCO3 25;NaH2CO4 1.2;MgSO4 1.2;CaCl2 1.0;およびデキストロース10、pH7.4、37℃。

0118

10〜20分の平衡化期間後、心臓を、実施例1に記載のように調製したが、Tat由来ペプチド(Tat47−57、配列番号9)を結合体化した、δV1−1ペプチド(配列番号4)またはψδRACKペプチド(配列番号6)で、20分間灌流した。灌流を、0.5μMの適切なペプチドを含有するKrebs−Hanseleit溶液を用いて、10mL/分の一定流速で維持した。使用したLangendorff法は、肺動脈バイパスして、心室から大動脈へ、そして冠状動脈内へ、流れを逆行させる。

0119

全体的な虚血を誘導するために、流れを、30分間中断した。虚血現象後、心臓を、30〜60分間再灌流した。再灌流中、虚血が誘導された細胞の損傷を、Sigmaキットを使用して灌流液中のクレアチンホスホキナーゼ(CPK)の活性(520nmでの吸光度)を測定することによって、決定した。コントロールとして、いくつかのエキソビボ心臓を、未処理で残すか、または酸素正常状態下に維持するか、またはTatキャリアペプチド単独で処理するか、またはスクランブルしたδV1−1ペプチドに結合体化させたTatキャリアペプチドで処理した。これらの結果を、図6A〜6Bに示す。

0120

(実施例4)
(心臓全体へのエキソビボペプチド投与および機能回復に対する効果)
ラット心臓を、実施例3に記載のように単離した。左心室圧およびその実時間導関数(dP/dt)を、心室内腔中に配置したラテックスバルーンを介し、ペーシング(3.3Hz)によって一定の心拍数で、そして一定の流速(10ml/分)で、モニターした。心臓を、20分間の虚血および30分間の再灌流に供した。再灌流の最初の20分間中、500nMのδV1−1またはビヒクルコントロールを送達した。結果を、図7A〜7Bに示す。

0121

(実施例5)
(虚血後のδV1−1のインビボ投与
成体雌性ブタ(35〜40kg体重)を麻酔し、そしてカテーテルを、頸動脈を通して心臓へ導入した。従来の介入心臓学的技術を使用して、ワイヤを、カテーテルを通して、そして左前室間動脈に配置した。バルーンを、このワイヤ上で、閉塞部位に対して作動させ、その後、30分間膨張させて、血流ブロックした。この30分間の閉塞の最後の10分間中、キャリアペプチド単独または実施例3に記載されるようなキャリアTatペプチドを結合体化したδV1−1ペプチドのいずれかから構成されるコントロールを、ゆっくりとした拡散(1mL/分)で、閉塞部の下流に直接送達した。約20μgのδV1−1ペプチド(約400ng/kg体重)を、投与した。

0122

30分間の閉塞後、バルーンを取り外し、そしてブタを、手術から回復させた。5日後、ブタを安楽死させ、そして心臓を収集した。心臓の取り出し後、LADを閉塞させた。閉塞を定置に保ち、Evans Blue色素(これは、梗塞の危険性がない全ての領域を青色染色し、一方、血流へのアクセスがない全ての領域を赤色で残す)を、注入した。次いで、心臓を、スライスに切り取りテトラゾリウム赤色色素で染色した。この色素は、全ての生存領域を赤色に染色し、梗塞性の死組織を白色に残す。各心臓は、虚血の危険性を有する領域および梗塞領域を示す特有の領域を有する、複数の組織スライスを有した。これから、各スライスおよび心臓全体についての危険性の領域あたりの梗塞の割合を決定した。結果を、図9A〜9Cに示す。

0123

(実施例6)
(発作損傷保護のためのラットへのδV1−1のインビボ投与)
(A.大脳虚血モデル)
成体雄性Sprague−Dawleyラット(280〜320g体重)を、使用した。動物を、全ての外科手順中、イソフルランでの麻酔下に維持した。生理学的パラメーターをモニターし、そして正常範囲に維持した。直腸温度もまた、測定した。実験の完了時に、動物を、過剰用量のバルビツレートで安楽死させ、そして組織学的分析のために調製した。

0124

(B.病巣モデル)
虚血を、閉塞管内縫合を使用して誘導した。炎処理によって先端を丸くした、3−0ナイロンモノフィラメント縫合糸のコートされていない30mm長のセグメントを、総頸動脈断端に挿入し、分岐部から約19〜20mm、内頸動脈内に前進させ、中大脳動脈の入口を閉塞させた。偽コントロール動物は、同様の麻酔および外科操作を受けたが、虚血を受けなかった。2時間の虚血期間後、縫合糸を除去し、動物を回復させた。24時間の再灌流後、脳を収集した。

0125

(C.ペプチド送達)
Tatペプチドに結合体化したδV1−1(配列番号4)(0.05mL、配列番号8)またはTatキャリアコントロールペプチド(50μLの生理食塩水中の10μM溶液)を、2時間の閉塞の直前または直前および直後のいずれかに、頸動脈に注射した。δV1−1の最終血液濃度は、1μMであった。

0126

(D.組織学)
動物を、ヘパリン処理した生理食塩水で灌流し、そして脳を取り出し、2mmの厚のスライスに切片化した。虚血損傷を評価するために、脳切片を、クレシルバイオレットまたはトリフェニルテトラゾリウムクロリド(梗塞領域を示すための生組織染料)で染色した。次いで、梗塞領域(白色)を、以前に記載された画像分析システム(Yenari、M.A.ら、1998;Maier,C.ら、1998)を使用して測定した。結果を、図11A〜11Bに示す。

0127

本発明は、特定の実施形態について記載されたが、種々の変化および改変が、本発明から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に明らかである。

図面の簡単な説明

0128

図1は、ラットδPKCおよびマウスΘPKC V1ドメインのプライマリー配列のアライメントを示す。δV1−1、δV1−2、およびψδRと指定された、ブラケットを付けた領域は、これら2つのアイソザイム間で異なる領域を示す。
図2Aは、ホルボール12−ミリステート13−アセテート(PMA)の存在下および非存在下での、δV1−1での処理、ならびに抗δPKC抗体および抗εPKC抗体でのプロービングの後の、可溶性(S)細胞画分および粒子(P)細胞画分のウェスタンブロットオートラジオグラフを示す。
図2Bは、図2Aにおいて示されるように、PMAの存在下(+)および非存在下(−)でδV1−1で処理された細胞について、処理していない細胞におけるアイソザイムの量に対する、粒子画分におけるアイソザイムの量として表した、δPKCおよびεPKCの転座を示す。
図3Aは、ψδRACKまたはPMAでの処理、ならびに抗δPKC抗体および抗αPKC抗体でのプロービングの後の、可溶性(S)細胞画分および粒子(P)細胞画分のウェスタンブロットのオートラジオグラフを示す。
図3Bは、図3Aにおいて示されるように、PMAの存在下(+)および非存在下(−)でψδRACKで処理された細胞について、処理していない細胞におけるアイソザイムの量に対する、粒子画分におけるアイソザイムの量として表した、δPKCおよびαPKCの転座を示す。
図4Aは、ψδRACKの存在下および非存在下での、δV1−1での処理、ならびに抗δPKC抗体および抗εPKC抗体でのプロービングの後の、可溶性(S)細胞画分および粒子(P)細胞画分のウェスタンブロットのオートラジオグラフを示す。
図4Bは、図4Aにおいて示されるように、ψδRACKの存在下(+)および非存在下(−)でδV1−1で処理された細胞について、処理していない細胞におけるアイソザイムの量に対する、粒子画分におけるアイソザイムの量として表した、δPKCの転座を示す。
図5Aは、ψδRACKの非存在下(−)または(x軸に沿って示される濃度での)存在下でδV1−1で処理された、単離された心臓筋細胞についての、細胞損傷の百分率を示す。これらのペプチドを、180分間の虚血期間の10分前に投与した。コントロールとして、βPKC選択的アクチベーターペプチドを使用した。
図5Bは、非存在下(−)または(x軸に沿って示される濃度での)存在下でδV1−1で処理された、単離された心臓筋細胞についての、細胞損傷の百分率を示す。これらのペプチドを、90分間の虚血期間の10分前に投与した。
図6Aは、δV1−1(黒い丸)またはψδRACK(黒い菱形)でエキソビボで処理したラット心臓全体におけるクレアチンホスホキナーゼ(CPK)放出によって測定した場合の細胞損傷を、虚血後および処理後の時間の関数として示す。コントロールとして、いくつかの心臓を、虚血前に未処理のままにし(白い四角形)、そして他の心臓を、酸素正常状態に維持した(白い三角形)。
図6Bは、図6Aに記載されるようにδV1−1およびψδRACKで処理したエキソビボの心臓、ならびに2つのコントロール(Tatキャリアペプチド単独およびTatキャリアペプチドに結合体化したスクランブルδV1−1配列)で処理した、エキソビボの心臓についての全CPK放出によって測定される場合の、細胞損傷全体を示す棒グラフである。
図7A〜7Bは、全体の虚血の20分後にδV1−1で灌流した動いている心臓(図7A)、または未処理のままの動いている心臓(図7B)の、機能回復を示す。ここで、左心室で生じた圧力(LVP、mmHg)、その一次導関数dP/dt、mmHg/秒)、および冠動脈灌流圧(PP、mmHg)が示される。右側には、再灌流前(ベースライン)および再灌流の30分後の、同じ機能測定拡張した追跡が示される。
図8A〜8Cは、動いている心臓の、左心室で生じた圧力の百分率(%LVDP、図8A)、拡張末期圧力(EDP、図8B)および灌流圧力(PP、図8C)の、虚血前の時間(ベースライン)および虚血の5〜30分後の関数としての、δV1−1での処理の間(黒い四角形)または未処理(白い丸)のプロットである。
図9A〜9Bは、30分間の虚血発作の最後の10分間の間の、δV1−1でのインビボでの処理(図9A)またはコントロールとしてキャリアペプチド単独での処理(図9B)の5日後のブタから採取した、ブタ心臓スライスの、デジタルカメラによって得られた写真である。
図9A〜9Bは、30分間の虚血発作の最後の10分間の間の、δV1−1でのインビボでの処理(図9A)またはコントロールとしてキャリアペプチド単独での処理(図9B)の5日後のブタから採取した、ブタ心臓スライスの、デジタルカメラによって得られた写真である。
図9Cは、δV1−1で処理されたブタおよび処理されていないコントロール動物について、図9A〜9Bの心臓スライスから決定された、危険な領域の梗塞の百分率を示す棒グラフである。
図10は、以下の3つの時点におけるブタの左脳室造影によって測定した場合の、δV1−1で処理した動物(黒い丸)およびスクランブルペプチドで処理したコントロール動物(白い丸)についての、駆出分率を示すグラフである:(1)バルーンカテーテルによる左前室間動脈の閉塞前(虚血前);(2)δV1−1での再灌流の直後(虚血後);および(3)5日後の屠殺前(虚血の5日後)。
図11A〜11Bは、処理していない動物(図11A)およびδV1−1で処理した動物(図11B)から、誘導された発作の前に採取した脳の、デジタル化写真である。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ