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技術 活性化Tリンパ球におけるリバビリン及びリバビリン類似体によるTH1型/TH2型サイトカインの発現の調節

出願人 バレアント・フアーマシユーテイカルズ・インターナシヨナル
発明者 ロバート・タムカンダサミー・ラマサミーデブロン・アベレツト
出願日 2008年1月9日 (12年11ヶ月経過) 出願番号 2008-002369
公開日 2008年6月12日 (12年6ヶ月経過) 公開番号 2008-133293
状態 拒絶査定
技術分野 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 増大率 混合付着 パターン変化 生体染料 チャンネル変化 リバビリン類似体 Barkerら 処理活性
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (7)

課題

活性Tリンパ球におけるリバビリン及びリバビリン類似体によるTH1型/TH2型サイトカイン発現を調節すること。

解決手段

リバビリンは、活性化T細胞におけるリンホカインの発現の調節に有効な投薬量範囲で患者投与する。特に、リバビリンは、Th2媒介性T細胞応答の抑制及びTh1媒介性T細胞応答の促進に用いる。本発明の他の態様において、1種以上のリバビリン類似体は、活性化T細胞におけるリンホカインの発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。該リバビリン類似体は、Th1又はTh2媒介性T細胞応答の抑制又は促進に用い得る。

概要

背景

リンホカインは、サイトカインファミリーに属する一群ポリペプチド、即ち、種々の細胞機能に影響を与え得且つ異なる細胞間の情報伝達を可能にするホルモン様分子である。近年の研究により、免疫応答におけるリンホカインの役割解明が進められた。ヘルパーCD4+(及びCD8+)T細胞により産生されるリンホカインは、マウス系の場合もヒト系の場合も、2種の表現型、Th1及びTh2のどちらかに属する場合が多い〔Romagnani,1991,Immunol Today 12:256−257,Mosmann,1989,Annu Rev Immunol,7:145−173〕。Th1型細胞は、インターロイキン−2(IL−2)、腫瘍壊死因子(TNFα)及びインターフェロンγ(IFNγ)を産生し、主として遅延型過敏症などの細胞性免疫関与する。Th2型細胞は、インターロイキン類、IL−4、IL−5、IL−6、IL−9、IL−10及びIL−13を産生し、主としてIgE及びIgG4抗体アイソタイプスイッチングなどの体液性免疫応答の促進に関与する(Mosmann,1989,Annu Rev Immunol,7:145−173)。

強度に分極したTh1型及びTh2型応答は、保護において異なる役割を果たすだけでなく、異なる免疫病理学的反応を促進し得る。Th1型応答は、実験自己免疫型ぶどう膜網膜炎(Dubeyら,1991,Eur Cytokine Network 2:147−152)、実験的自己免疫型脳炎(EAE)(Beraudら,1991,Cell Immunol 133:379−389)及びインスリン依存性糖尿病(Hahnら,1987,Eur J Immunol 18:2037−2042)などの器官特異的自己免疫状態や、接触性皮膚炎(Kapsenbergら,Immunol Today 12:392−395)及びある種の慢性炎症性疾患に関与する。それに対し、Th2型応答は、(一般的な環境性アレルゲンに対する)アレルギー性アトピー性疾患、例えば、アレルギー性喘息(Walkerら,1992,Am Rev Resp Dis 148:109−115)及びアトピー性皮膚炎(van der Heijdenら,1991,J Invest Derm 97:389−394)の誘発に関与し、蠕虫蠕虫(Finkelmanら,1991,Immunoparasitol Today 12:A62−66)やLeishmania major(Caceres−Dittmarら,1993,Clin Exp Immunol 91:500−505)などの組織寄生原虫感染症を悪化させると考えられ、高IgE症候群(Del Preteら,1989,J Clin Invest 84:1830−1835)及びOmennOs症候群(Schandeneら,1993,Eur J Immunol 23:56−60)などの特定の原発性免疫不全において選択的に誘発され、高IgE症候群(Del Preteら,1989,J Clin Invest 84:1830−1835)及びOmennOs症候群(Schandeneら,1993,Eur J Immunol 23:56−60)の低下に関連し、HIV複製抑制能Barkerら,1995,Proc Soc Nat Acad Sci USA 92:11135−11139)の低下に関連する。

従って、上記疾患状態のリンホカインプロフィールを調節することが治療上有用なことは明らかである。恐らく、Th1型応答を促進するとTh2表現型が抑制され、Th2型応答を促進するとTh1表現型が抑制されるであろう。リンホカインに対するモノクローナル抗体(mAb)、リンホカイン自体及び他の作用物質例えばチオール酸防止剤(Jeanninら,1995,J Exp Med 182 1785−1792)は、疾患促進サイトカインパターン、Th1又はTh2のいずれかを阻害することにより特定の疾患の病因逆転させることが証明されている。例えば、細胞内原虫感染症は、IFNγにより抑制され、IL−4により悪化するが、線虫感染症は、IL−4により抑制され、IFNγにより悪化する(Heinzelら,1989,J Exp Med 162:59−72,Elseら,1994,J Exp Med 179:347−351)。NODマウスのインスリン依存性糖尿病や、マウス及びラットのEAEは、該疾患が発症する前にIL−4又は抗IFNγ mAbで治療すると改善され得る(Rapoportら,1993,J Exp Med 178:87−99,Rackeら,1994,J Exp Med 180:1961−1966,Campbellら,1991,J Clin Invest 87:739−742)。また、全身性エリテマトーデス様症候群を特徴とする自己免疫移植片対宿主症(GVHD)は、Th2型リンホカインの産生に関連し、抗IL−4抗体によって阻害される(Umlandら,1992,Clin Immunol Immunopathol 63:66−73)。一方、Th1型サイトカインは、ドナーCD8+T細胞がCTLになり、宿主の免疫系を破壊する急性GVHDにおいて産生される。抗IFNγ又は抗TNFα mAbで治療すると疾患が改善され、抗IL−2mAbで治療すると急性GVHDが自己免疫型GVHDに変化する(Via及びFinkelman,1993,Int Immunol 5:565−572)。

1983年以来、HIV感染患者の治療において天然及び組換えIL−2の臨床実験が進められている(Volberdingら,1987,AIDS Res Hum Retroviruses,3:115−124)。この場合、両者の関係は、AIDSの発症が産生されるリンホカインのパターン変化に関連すると報告されたことに由来する(Clerici及びShearer,1994,Immunol Today 15:575−581)。発症に向かって進行している感染患者では、IL−2などのTh1型リンホカインの発現が経時的に低下する(Maggiら,1987,Eur J Immunol 17:1685−1690,Grutersら,1990,Eur J Immunol 20:1039−1044,Clericiら,1993,J Clin Invest 91:759−765)と同時に、IL−4及びIL−10などのTh2型リンホカインの産生が増大する(Clericiら,1994,J Clin Invest 93:768−775,Hoffmanら,1985,Virology 147:326−335)。IL−2で治療した非症候性又は長期生存患者由来のT細胞は、その抗HIV活性が増強されていたが、IL−4又はIL−10に暴露すると、そのHIV複製抑制能及びIL−2産生能が低下した(Barkerら,1995,Proc Soc Nat Acad Sci USA 92:11135−11139)。

しかし、現在使用されているこれらの免疫調節治療薬(mAb及び組換えサイトイン)には限界がある。例えば、長期間モノクローナル抗体を用いて治療を行うと、宿主動物にモノクローナル抗体に対する抗体ができ、そのためにモノクローナル抗体の有用性が制限される。mAbに対する免疫応答の誘発というリスクを明らかに低減させる「人化」(humanized)モノクローナル抗体が開発された。しかし、該抗体はまだ開発途上であり、その上、これら新規なmAbは依然、巨大タンパク質であり、従って、標的部位への到達が難しい可能性がある。サイトカインをベースとする治療薬にも限界がある。例えば、マウスでは、自己免疫型GVHDをIL−12で治療すると急性GVHDが発症する。

リバビリン登録商標)(1−b−D−リボフラノシル−1,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミド)は、RNA及びDNAウイルスの複製を阻害し得る合成ヌクレオシドである(Huffmanら,1973,Antimicrob Agents Chemother3:235,Sidwellら,1972,Science 177:705)。本発明者は、リバビリンが、その抗ウイルス活性に加えて、特定の免疫応答に作用することを示唆した他の人々の所見を確認した(Jolley及びSuchil,1984,Clinical Applications of Ribavirin:93−96ページ再検討した)。本発明者はさらに、リバビリンがマイトジェン及び抗原活性化T及びBリンパ球の増殖に影響を与え〔Tamら、1995(データ示さず),Peavyら,1980,Infection and Immunity 29:583−589〕、さらに、リバビリンは、シクロスポリンと組み合わせると、長期の同種移植生存効力を示す(Jelleyら,1988,Transplantation Proc 20:703−706)という他の人々の所見を確認した。

また、本発明者は、リバビリンが、Th1型応答を促進し且つTh2型応答を抑制することにより、少なくとも部分的に免疫応答のサイトカインパターンを調節することを証明することにより従来の研究を著しく進展させた。この発見は従来の研究と矛盾しないと洞察される。先ず第1に、リバビリンが機能性体液性免疫応答(Peavyら,1981,J Immunol 126:861−864,Powersら,1982,Antimicrob Agents Chemother22:108−114)及び肥満細胞分泌IgE媒介性調節(Marquardtら,1987,J Pharmacol Exp Therapeutics 240:145−149)(いずれもTh2型リンホカイン媒介性事象である)のどちらをも阻害することは公知である。第2に、リバビリンは、HIV患者由来の末梢血リンパ球においてアジドチミジン(AZT)の抗ウイルス作用拮抗する(Vogtら,1987,Science 235:1376−1379)。この知見は重要である。というのは、AZTはIL−2受容体(IL−2R)の発現を低下させるがIL−2の発現は低下させないからである(Viora及びCamponeschi,1995,Cell Immunol 163:289−295)。従って、リバビリンが、IL−2の発現を調節し且つ低下したIL−2Rレベルを上昇させることによりAZTを拮抗することは可能である。第3に、慢性GVHD(Th2媒介性疾患)を有する免疫減弱患者をリバビリンで治療すると該疾患が驚異的に消散するが、これは、シクロスポリンやグルココルチコイドなどの従来の免疫抑制療法では起こらなかったことである(Cassano,1991,Bone Marrow Transplantation 7:247−248)。最後に、C型肝炎(HCV)患者をリバビリンで(1年間)治療すると、プラシーボ対照群に比べ、リンパ球凝集率が低下し且つ肝損傷率がはるかに低下することが判明した(Dusheikoら,1994,Jan;Hepatology 19(1):13−8)。この所見は、C型肝炎に対する主要免疫応答はTh1型リンホカインにより媒介されるが、Th0/Th2表現型のT細胞はHCVを介して感染し得る(Zignegoら,1994,未公開データ)ことを表し得、この感染は肝細胞のさらなる抗体媒介性破壊を誘発し得る。

図面の簡単な説明
図1は、PMA/イオノマイシン活性化したTリンパ球におけるIL−2、IL−4、TNFα及びIFNγの細胞外発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、PMA/イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン発現に対する増大率(%)として表す。

図2は、PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球におけるIL−2(A及びC)及びIL−4(B及びD)の細胞外発現に及ぼす、2,000U/mlのインターフェロンαの存在下の2、10又は50mMのリバビリンの作用(左側パネル)と、10mMのリバビリンの存在下の500、1,000又は2,000U/mlのインターフェロンαの作用(右側パネル)を表すグラフである。

図3は、PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球におけるIL−2、IL−4及びIFNγのmRNAの発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。

図4は、PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球におけるIL−2及びIL−4受容体の細胞表面発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、PMA/イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン受容体発現に対する増大率(%)として表す。

図5は、休止T細胞(A及びE)、あるいはPMA/イオノマイシンのみで処理する(B及びF)か又はPMA/イオノマイシン処理を10mMのリバビリンの存在下(C及びG)若しくは5,000U/mlのインターフェロンαの存在下(D及びH)に行った活性化CD4+T細胞(上部パネル)若しくはCD8+T細胞(下部パネル)における細胞内IL−2の発現を表すグラフである。1回の実験から得られたデータを示し、IL−2とCD4又はCD8の二重ポジティブ染色を示す細胞の百分率として表わす。

図6は、企図されるリバビリン類似体を表すグラフである。

図7は、IL−2、TNFα、IFNγ、IL−4及びIL−5に対する種々の濃度のリバビリン類似体の結果を示すグラフを集めたものである。

発明の要旨
本発明の1つの態様によれば、このヌクレオシド、即ちリバビリンを、活性化T細胞におけるリンホカイン発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。特に、リバビリンは、Th2媒介性T細胞応答の抑制及びTh1媒介性T細胞応答の促進に用いる。

従って、本発明では、リバビリンをその抗ウイルス剤としての十分に認識された役割で投与する代わりに、リンホカイン発現の異常の治療に用いる。そのような異常は、アレルギー性喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性アトピー性疾患、蠕虫感染症及びリーシュマニア症、並びにウイルス感染に関連し得るものも関連しないと考えられるものも含めた種々の原発性及び続発性免疫不全付随するものとして見出され得る。

本発明の他の態様によれば、1種以上のリバビリン類似体を、活性化T細胞におけるリンホカイン発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。リバビリン類似体は、Th1又はTh2媒介性T細胞応答の抑制又は促進に用い得る。

発明の詳細な説明
好ましい実施態様において、リバビリンは、平均して0.25〜12.5mg/ml、最も好ましくは約2.5mg/mlの血清レベルが得られる投薬量で患者に経口投与する。典型的な個体では、最適な血清レベルは、1日につき体重1kg当たり約4.5mgであり、都合200〜1,200mgの投薬量で投与し得る。1日当たりの投薬量を何回分かに分割して投与するのが好ましい。

リバビリンは数年前から市販されているので、多くの剤形投与経路が公知となっており、そのうちの適切なものを利用することができる。例えば、リバビリンは、経口投与以外にも、公知のように、静脈内、筋肉内、腹腔内に、局所投与したりすることができる。リバビリンを含む医薬組成物は、1種以上の医薬上許容し得る担体をさらに含み得、該担体は、(長期貯蔵用の)安定剤、乳化剤結合剤増粘剤、塩、保存剤溶剤分散媒コーティング剤抗菌剤及び抗真菌剤等張剤及び吸収遅延剤などを含み得る。医薬活性物質としてのそのような媒質及び作用物質の使用は当業界では周知である。従来の媒質又は作用物質は、リバビリンに不適合である場合を除いて、治療用組成物及び製剤に用いられる。組成物や製剤に補助有効成分を混和してもよい。

リバビリンは、本発明において企図されている治療用としての用途に加えて、吸収、分配、細胞取込み及び効力に関する研究の実験用ツールとしても用い得る。

さらに、今まで活性が極めて低いとして用いられていなかった(既知又は未知の)数種のビラゾール類似体も有意なサイトカイン活性を有することが見出された。本発明者が調べたところ、そのような活性を有するビラゾール類似体は数種存在し、以下の「リバビリン類似体」というタイトルの下にその実施例が示されている。これらの実施例は、活性組成物を得るためにビラゾールを修飾し得る位置を特定することを目的とし、従ってこの開示は、示されている特定の修飾に限定されるものではない。さらに、これらの修飾は、標準的なD型ビラゾールにも、L型ビラゾールにも適用し得るように企図されている。

概要

活性化Tリンパ球におけるリバビリン及びリバビリン類似体によるTH1型/TH2型サイトカインの発現を調節すること。リバビリンは、活性化T細胞におけるリンホカインの発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。特に、リバビリンは、Th2媒介性T細胞応答の抑制及びTh1媒介性T細胞応答の促進に用いる。本発明の他の態様において、1種以上のリバビリン類似体は、活性化T細胞におけるリンホカインの発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。該リバビリン類似体は、Th1又はTh2媒介性T細胞応答の抑制又は促進に用い得る。なし

目的

効果

実績

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請求項1

ヒト患者活性化T細胞におけるリンホカイン発現異常を治療するための医薬組成物の製造におけるリバビリンの使用であって、該医薬組成物はインターフェロンα含有組成物と併用されることを特徴とする前記使用。

請求項2

リバビリンを、Th1レベル亢進し且つTh2レベルを抑制するのに有効な量でヒト患者に経口投与使用する請求項1に記載の使用。

請求項3

リバビリンを、その血清レベルが平均して0.25〜12.5μg/mlとなるのに有効な量でヒト患者に経口投与使用する請求項1に記載の使用。

請求項4

リバビリンの血清レベルが約0.25μg/mlである請求項3に記載の使用。

請求項5

リバビリンを、その血清レベルが4.5mg/体重kgとなるのに有効な量でヒト患者に経口投与使用する請求項1に記載の使用。

請求項6

前記投与量を1日あたり各回少量の投与量に分けることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の使用。

請求項7

リバビリンとインターフェロンαとの組合せであって、リバビリンの量がヒト患者の活性化T細胞におけるリンホカイン発現を調節するのに有効な量であることを特徴とする前記組合せ。

請求項8

リバビリンがTh1レベルを亢進し且つTh2レベルを抑制するのに有効な量である請求項7に記載の組合せ。

請求項9

リバビリンを、その血清レベルが平均して0.25〜12.5μg/mlとなるのに有効な量でヒト患者に経口投与使用する請求項7に記載の使用。

請求項10

リバビリンをその血清レベルが約0.25μg/mlとなるようにヒトに経口投与する請求項9に記載の組合せ。

請求項11

リバビリンの量がその血清レベルが4.5mg/体重kgとなるような量である請求項7に記載の組合せ。

請求項12

インターフェロンαの第2医薬と組合されたリバビリンの医薬組成物であって、前記リバビリンの量がヒト患者の活性化T細胞におけるリンホカイン発現を調節するのに有効な量であることを特徴とする前記医薬組成物。

請求項13

リバビリンがTh1レベルを亢進し且つTh2レベルを抑制するのに有効な量である請求項12に記載の医薬組成物。

請求項14

リバビリンの量が、その血清レベルが平均して0.25〜12.5μg/mlとなるのに有効な量である請求項12に記載の医薬組成物。

請求項15

リバビリンの量が、その血清レベルが0.25μg/mgとなるのに有効な量である請求項14に記載の医薬組成物。

請求項16

リバビリンを、その血清レベルが1日あたり4.5mg/体重kgとなるような量で投与する請求項12に記載の医薬組成物。

請求項17

リバビリンを1日につき数回に分けて経口投与する請求項12〜16のいずれかに記載の医薬組成物。

請求項18

インターフェロンαとリバビリンとの組合せ。

技術分野

0001

本発明の分野は免疫学である。

背景技術

0002

リンホカインは、サイトカインファミリーに属する一群ポリペプチド、即ち、種々の細胞機能に影響を与え得且つ異なる細胞間の情報伝達を可能にするホルモン様分子である。近年の研究により、免疫応答におけるリンホカインの役割解明が進められた。ヘルパーCD4+(及びCD8+)T細胞により産生されるリンホカインは、マウス系の場合もヒト系の場合も、2種の表現型、Th1及びTh2のどちらかに属する場合が多い〔Romagnani,1991,Immunol Today 12:256−257,Mosmann,1989,Annu Rev Immunol,7:145−173〕。Th1型細胞は、インターロイキン−2(IL−2)、腫瘍壊死因子(TNFα)及びインターフェロンγ(IFNγ)を産生し、主として遅延型過敏症などの細胞性免疫関与する。Th2型細胞は、インターロイキン類、IL−4、IL−5、IL−6、IL−9、IL−10及びIL−13を産生し、主としてIgE及びIgG4抗体アイソタイプスイッチングなどの体液性免疫応答の促進に関与する(Mosmann,1989,Annu Rev Immunol,7:145−173)。

0003

強度に分極したTh1型及びTh2型応答は、保護において異なる役割を果たすだけでなく、異なる免疫病理学的反応を促進し得る。Th1型応答は、実験自己免疫型ぶどう膜網膜炎(Dubeyら,1991,Eur Cytokine Network 2:147−152)、実験的自己免疫型脳炎(EAE)(Beraudら,1991,Cell Immunol 133:379−389)及びインスリン依存性糖尿病(Hahnら,1987,Eur J Immunol 18:2037−2042)などの器官特異的自己免疫状態や、接触性皮膚炎(Kapsenbergら,Immunol Today 12:392−395)及びある種の慢性炎症性疾患に関与する。それに対し、Th2型応答は、(一般的な環境性アレルゲンに対する)アレルギー性アトピー性疾患、例えば、アレルギー性喘息(Walkerら,1992,Am Rev Resp Dis 148:109−115)及びアトピー性皮膚炎(van der Heijdenら,1991,J Invest Derm 97:389−394)の誘発に関与し、蠕虫蠕虫(Finkelmanら,1991,Immunoparasitol Today 12:A62−66)やLeishmania major(Caceres−Dittmarら,1993,Clin Exp Immunol 91:500−505)などの組織寄生原虫感染症を悪化させると考えられ、高IgE症候群(Del Preteら,1989,J Clin Invest 84:1830−1835)及びOmennOs症候群(Schandeneら,1993,Eur J Immunol 23:56−60)などの特定の原発性免疫不全において選択的に誘発され、高IgE症候群(Del Preteら,1989,J Clin Invest 84:1830−1835)及びOmennOs症候群(Schandeneら,1993,Eur J Immunol 23:56−60)の低下に関連し、HIV複製抑制能Barkerら,1995,Proc Soc Nat Acad Sci USA 92:11135−11139)の低下に関連する。

0004

従って、上記疾患状態のリンホカインプロフィールを調節することが治療上有用なことは明らかである。恐らく、Th1型応答を促進するとTh2表現型が抑制され、Th2型応答を促進するとTh1表現型が抑制されるであろう。リンホカインに対するモノクローナル抗体(mAb)、リンホカイン自体及び他の作用物質例えばチオール酸防止剤(Jeanninら,1995,J Exp Med 182 1785−1792)は、疾患促進サイトカインパターン、Th1又はTh2のいずれかを阻害することにより特定の疾患の病因逆転させることが証明されている。例えば、細胞内原虫感染症は、IFNγにより抑制され、IL−4により悪化するが、線虫感染症は、IL−4により抑制され、IFNγにより悪化する(Heinzelら,1989,J Exp Med 162:59−72,Elseら,1994,J Exp Med 179:347−351)。NODマウスのインスリン依存性糖尿病や、マウス及びラットのEAEは、該疾患が発症する前にIL−4又は抗IFNγ mAbで治療すると改善され得る(Rapoportら,1993,J Exp Med 178:87−99,Rackeら,1994,J Exp Med 180:1961−1966,Campbellら,1991,J Clin Invest 87:739−742)。また、全身性エリテマトーデス様症候群を特徴とする自己免疫移植片対宿主症(GVHD)は、Th2型リンホカインの産生に関連し、抗IL−4抗体によって阻害される(Umlandら,1992,Clin Immunol Immunopathol 63:66−73)。一方、Th1型サイトカインは、ドナーCD8+T細胞がCTLになり、宿主の免疫系を破壊する急性GVHDにおいて産生される。抗IFNγ又は抗TNFα mAbで治療すると疾患が改善され、抗IL−2mAbで治療すると急性GVHDが自己免疫型GVHDに変化する(Via及びFinkelman,1993,Int Immunol 5:565−572)。

0005

1983年以来、HIV感染患者の治療において天然及び組換えIL−2の臨床実験が進められている(Volberdingら,1987,AIDS Res Hum Retroviruses,3:115−124)。この場合、両者の関係は、AIDSの発症が産生されるリンホカインのパターン変化に関連すると報告されたことに由来する(Clerici及びShearer,1994,Immunol Today 15:575−581)。発症に向かって進行している感染患者では、IL−2などのTh1型リンホカインの発現が経時的に低下する(Maggiら,1987,Eur J Immunol 17:1685−1690,Grutersら,1990,Eur J Immunol 20:1039−1044,Clericiら,1993,J Clin Invest 91:759−765)と同時に、IL−4及びIL−10などのTh2型リンホカインの産生が増大する(Clericiら,1994,J Clin Invest 93:768−775,Hoffmanら,1985,Virology 147:326−335)。IL−2で治療した非症候性又は長期生存患者由来のT細胞は、その抗HIV活性が増強されていたが、IL−4又はIL−10に暴露すると、そのHIV複製抑制能及びIL−2産生能が低下した(Barkerら,1995,Proc Soc Nat Acad Sci USA 92:11135−11139)。

0006

しかし、現在使用されているこれらの免疫調節治療薬(mAb及び組換えサイトイン)には限界がある。例えば、長期間モノクローナル抗体を用いて治療を行うと、宿主動物にモノクローナル抗体に対する抗体ができ、そのためにモノクローナル抗体の有用性が制限される。mAbに対する免疫応答の誘発というリスクを明らかに低減させる「人化」(humanized)モノクローナル抗体が開発された。しかし、該抗体はまだ開発途上であり、その上、これら新規なmAbは依然、巨大タンパク質であり、従って、標的部位への到達が難しい可能性がある。サイトカインをベースとする治療薬にも限界がある。例えば、マウスでは、自己免疫型GVHDをIL−12で治療すると急性GVHDが発症する。

0007

リバビリン登録商標)(1−b−D−リボフラノシル−1,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミド)は、RNA及びDNAウイルスの複製を阻害し得る合成ヌクレオシドである(Huffmanら,1973,Antimicrob Agents Chemother3:235,Sidwellら,1972,Science 177:705)。本発明者は、リバビリンが、その抗ウイルス活性に加えて、特定の免疫応答に作用することを示唆した他の人々の所見を確認した(Jolley及びSuchil,1984,Clinical Applications of Ribavirin:93−96ページ再検討した)。本発明者はさらに、リバビリンがマイトジェン及び抗原活性化T及びBリンパ球の増殖に影響を与え〔Tamら、1995(データ示さず),Peavyら,1980,Infection and Immunity 29:583−589〕、さらに、リバビリンは、シクロスポリンと組み合わせると、長期の同種移植生存効力を示す(Jelleyら,1988,Transplantation Proc 20:703−706)という他の人々の所見を確認した。

0008

また、本発明者は、リバビリンが、Th1型応答を促進し且つTh2型応答を抑制することにより、少なくとも部分的に免疫応答のサイトカインパターンを調節することを証明することにより従来の研究を著しく進展させた。この発見は従来の研究と矛盾しないと洞察される。先ず第1に、リバビリンが機能性体液性免疫応答(Peavyら,1981,J Immunol 126:861−864,Powersら,1982,Antimicrob Agents Chemother22:108−114)及び肥満細胞分泌IgE媒介性調節(Marquardtら,1987,J Pharmacol Exp Therapeutics 240:145−149)(いずれもTh2型リンホカイン媒介性事象である)のどちらをも阻害することは公知である。第2に、リバビリンは、HIV患者由来の末梢血リンパ球においてアジドチミジン(AZT)の抗ウイルス作用拮抗する(Vogtら,1987,Science 235:1376−1379)。この知見は重要である。というのは、AZTはIL−2受容体(IL−2R)の発現を低下させるがIL−2の発現は低下させないからである(Viora及びCamponeschi,1995,Cell Immunol 163:289−295)。従って、リバビリンが、IL−2の発現を調節し且つ低下したIL−2Rレベルを上昇させることによりAZTを拮抗することは可能である。第3に、慢性GVHD(Th2媒介性疾患)を有する免疫減弱患者をリバビリンで治療すると該疾患が驚異的に消散するが、これは、シクロスポリンやグルココルチコイドなどの従来の免疫抑制療法では起こらなかったことである(Cassano,1991,Bone Marrow Transplantation 7:247−248)。最後に、C型肝炎(HCV)患者をリバビリンで(1年間)治療すると、プラシーボ対照群に比べ、リンパ球凝集率が低下し且つ肝損傷率がはるかに低下することが判明した(Dusheikoら,1994,Jan;Hepatology 19(1):13−8)。この所見は、C型肝炎に対する主要免疫応答はTh1型リンホカインにより媒介されるが、Th0/Th2表現型のT細胞はHCVを介して感染し得る(Zignegoら,1994,未公開データ)ことを表し得、この感染は肝細胞のさらなる抗体媒介性破壊を誘発し得る。

0009

図面の簡単な説明
図1は、PMA/イオノマイシン活性化したTリンパ球におけるIL−2、IL−4、TNFα及びIFNγの細胞外発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、PMA/イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン発現に対する増大率(%)として表す。

0010

図2は、PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球におけるIL−2(A及びC)及びIL−4(B及びD)の細胞外発現に及ぼす、2,000U/mlのインターフェロンαの存在下の2、10又は50mMのリバビリンの作用(左側パネル)と、10mMのリバビリンの存在下の500、1,000又は2,000U/mlのインターフェロンαの作用(右側パネル)を表すグラフである。

0011

図3は、PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球におけるIL−2、IL−4及びIFNγのmRNAの発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。

0012

図4は、PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球におけるIL−2及びIL−4受容体の細胞表面発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、PMA/イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン受容体発現に対する増大率(%)として表す。

0013

図5は、休止T細胞(A及びE)、あるいはPMA/イオノマイシンのみで処理する(B及びF)か又はPMA/イオノマイシン処理を10mMのリバビリンの存在下(C及びG)若しくは5,000U/mlのインターフェロンαの存在下(D及びH)に行った活性化CD4+T細胞(上部パネル)若しくはCD8+T細胞(下部パネル)における細胞内IL−2の発現を表すグラフである。1回の実験から得られたデータを示し、IL−2とCD4又はCD8の二重ポジティブ染色を示す細胞の百分率として表わす。

0014

図6は、企図されるリバビリン類似体を表すグラフである。

0015

図7は、IL−2、TNFα、IFNγ、IL−4及びIL−5に対する種々の濃度のリバビリン類似体の結果を示すグラフを集めたものである。

0016

発明の要旨
本発明の1つの態様によれば、このヌクレオシド、即ちリバビリンを、活性化T細胞におけるリンホカイン発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。特に、リバビリンは、Th2媒介性T細胞応答の抑制及びTh1媒介性T細胞応答の促進に用いる。

0017

従って、本発明では、リバビリンをその抗ウイルス剤としての十分に認識された役割で投与する代わりに、リンホカイン発現の異常の治療に用いる。そのような異常は、アレルギー性喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性アトピー性疾患、蠕虫感染症及びリーシュマニア症、並びにウイルス感染に関連し得るものも関連しないと考えられるものも含めた種々の原発性及び続発性免疫不全付随するものとして見出され得る。

0018

本発明の他の態様によれば、1種以上のリバビリン類似体を、活性化T細胞におけるリンホカイン発現の調節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。リバビリン類似体は、Th1又はTh2媒介性T細胞応答の抑制又は促進に用い得る。

0019

発明の詳細な説明
好ましい実施態様において、リバビリンは、平均して0.25〜12.5mg/ml、最も好ましくは約2.5mg/mlの血清レベルが得られる投薬量で患者に経口投与する。典型的な個体では、最適な血清レベルは、1日につき体重1kg当たり約4.5mgであり、都合200〜1,200mgの投薬量で投与し得る。1日当たりの投薬量を何回分かに分割して投与するのが好ましい。

0020

リバビリンは数年前から市販されているので、多くの剤形投与経路が公知となっており、そのうちの適切なものを利用することができる。例えば、リバビリンは、経口投与以外にも、公知のように、静脈内、筋肉内、腹腔内に、局所投与したりすることができる。リバビリンを含む医薬組成物は、1種以上の医薬上許容し得る担体をさらに含み得、該担体は、(長期貯蔵用の)安定剤、乳化剤結合剤増粘剤、塩、保存剤溶剤分散媒コーティング剤抗菌剤及び抗真菌剤等張剤及び吸収遅延剤などを含み得る。医薬活性物質としてのそのような媒質及び作用物質の使用は当業界では周知である。従来の媒質又は作用物質は、リバビリンに不適合である場合を除いて、治療用組成物及び製剤に用いられる。組成物や製剤に補助有効成分を混和してもよい。

0021

リバビリンは、本発明において企図されている治療用としての用途に加えて、吸収、分配、細胞取込み及び効力に関する研究の実験用ツールとしても用い得る。

0022

さらに、今まで活性が極めて低いとして用いられていなかった(既知又は未知の)数種のビラゾール類似体も有意なサイトカイン活性を有することが見出された。本発明者が調べたところ、そのような活性を有するビラゾール類似体は数種存在し、以下の「リバビリン類似体」というタイトルの下にその実施例が示されている。これらの実施例は、活性組成物を得るためにビラゾールを修飾し得る位置を特定することを目的とし、従ってこの開示は、示されている特定の修飾に限定されるものではない。さらに、これらの修飾は、標準的なD型ビラゾールにも、L型ビラゾールにも適用し得るように企図されている。

0023

細胞系及びT細胞の精製
健康なドナー由来の血液60mlをフィコールハイパック密度勾配遠心分離にかけた後、バフィーコートから末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。次いで、T細胞に特異的なLymphokwikリンパ球単離試薬(LK−25T,One Lambda,Canoga Park,CA)を用い、PBMCからT細胞を精製した。次いで、平均収量40〜60×106個のT細胞を、20〜30mlのRPMIAP5〔20mMのHEPES緩衝液、pH7.4、5%の自己由来血漿、1%のL−グルタミン、1%のペニシリンストレプトマイシン及び0.05%の2−メルカプトエタノールを含むPRMI−1640培地(ICN,Costa Mesa,CA)〕中37℃で一晩インキュベートして、不純混合付着細胞を除去した。全ての実験において、T細胞をRPMI−AP5で洗浄し、次いで、96ウエルマイクロタイタープレート上に1×106細胞/mlの細胞密度平板培養した。

0024

細胞活性化及びリバビリン処理
500ngのイオノマイシン及び10ngのホルボール12−ミリステート13−アセテート(PMA)(Calbiochem,La Jolla,CA)を添加してT細胞を活性化し、37℃で48〜72時間インキュベートした。PMA/イオノマイシンで活性化されたT細胞を、活性化直後に0.5〜50mMのリバビリン又は250〜10,000U/mlの対照抗ウイルス剤、インターフェロンα(Accurate,Westbury,NY)で処理し、24時間後に再処理した。各プレートからのT細胞を免疫蛍光法分析に用い、上清細胞外サイトカインの測定に用いた。活性化後、細胞由来サイトカインの産生を分析するために、各マイクロプレートから細胞上清900mlを取り出し、別のマイクロプレートに移した。次いで、細胞を、免疫蛍光法による細胞内サイトカインレベル及びサイトカイン受容体の発現の分析に用いた。

0025

細胞外サイトカインの分析
各マイクロプレートからの細胞上清中で細胞由来ヒトサイトカインの濃度を定量した。市販のELISAキット(R&D systems Quantikine kit,Minneapolis,MN)を用いるか、又はIL−2依存性細胞系、CTLL−2(ATCC,Rockville,MD)を用いたバイオアッセイにかけて、活性化により誘発されたインターロイキン−2(IL−2)のレベルの変化を定量した。ELISAキットを用い、活性化により誘発された、インターロイキン−4(IL−4)、腫瘍壊死因子(TNFα)、インターロイキン−8(IL−8)(R&D Systems(Quantikine kit,Minneapolis、MN)及びインターフェロンγ(IFNγ)(Endogen(Cambridge,MA)のレベルの変化を定量した。全てのELISAの結果はpg/mlとして表し、CTLL−2バイオアッセイは、CTLL−2細胞による3H−チミジン(ICN,Costa Mesa,CA)のIL−2依存性細胞取込みを表す1分当たりのカウント数として表した。

0026

直接免疫蛍光法実験(サイトカイン受容体)
蛍光標識した細胞表面抗原に対する抗体で直接染色するために、細胞を生理食塩液、pH7.4(Becton Dickinson,Mansfield,MA)で2回洗浄し、50mlの生理食塩液に再懸濁し、2つの試料に分割した。一方の試料アリコートをPE抗CD25/FITC−抗CD4又はPE−ラット抗マウスIgG+抗CDw124/FITC−抗CD4 mAbで同時染色し、第2のアリコートをPE/FITCで標識したアイソタイプマッチド対照モノクローナル抗体で染色して、非特異的蛍光を評価した。蛍光標識したモノクローナル抗体は全てBecton Dickinson(San Jose,CA)から入手したが、抗CDw124はPharmingen,San Diego,CAから入手した。インキュベーションは、飽和mAb濃度を用い暗所で45分間4℃で行った。取り込まれなかった標識をPBSで洗浄して除去した後、FACScanフローサイトメトリー(Becton Dickinson)を用いて分析した。

0027

ゲートをかけた生きているCD4+T細胞中抗原密度間接定量し、平均蛍光チャンネル(MCF)として表した。特異的抗原(CDw124,CD25)の表面発現を、FITC又はPE標識した抗原特異的mAb染色細胞のMCFからFITC又はPE標識したアイソタイプマッチド(IgG1)対照mAb染色細胞のMCFを減算して得られた平均チャンネル変化(MCS)として表した。あるいは、CD28mAbで染色された細胞のCD4+サブセットの表面発現を、CD28−CD4−細胞のMCFからCD28+CD4+のMCFを減算して測定した。

0028

未処理対照とリバビリン処理細胞及びインターフェロンα処理細胞の生存能力を、生体染料ヨウ化プロピジウム(propidium iodide)(最終濃度:5mg/ml)で染色することにより、多重ドナーの全てのオリゴヌクレオチドを有する各バッチ中で定量した。ヨウ化プロピジウムを除去した生存細胞の百分率をフロー・サイトメトリーで測定すると、用いた全ての濃度において、処理した後、>90%(90〜99%の範囲)であった。

0029

細胞内サイトカイン発現の免疫蛍光法分析
CD4+及びCD8+T細胞サブセットにおけるIL−2の細胞内発現を分析するために、先ず、48〜72時間の活性化の最後の4時間に、T細胞を10mgのBrefeldin A(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)で処理して、新たに合成されるIL−2の細胞外への分泌を最小限にした。活性化後、細胞由来サイトカインの産生を分析するために、各マイクロプレートから細胞上清900mlを取り出し、別のマイクロプレートに移した。FITC標識した細胞表面抗原、CD4及びCD8に対する抗体で直接染色(30分間、4℃、暗所)する前に、細胞を生理的食塩液、pH7.4で2回洗浄し、100〜150mlの染色緩衝液〔1%ウシ胎児血清FCS)(Hyclone,Logan,UT)及び0.1%アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生食液、pH7.4〕に再懸濁し、2つの試料に分割した。染色された細胞を1mlの染色緩衝液で洗浄し、上清を吸引した後、細胞ペレットを100mlの固定緩衝液(PBS中4%パラホルムアルデヒド)に再懸濁した。固定された細胞を20分間4℃に維持し、次いで、1mlの染色緩衝液で洗浄し、細胞ペレットを50mlの透過性化緩衝液〔PBS中0.1%サポニン(ICN,Costa Mesa,CA)〕に攪拌下に再懸濁した。透過性となった細胞を、暗所で30分間4℃で、PE標識したIL−2抗体で染色し、次いで、1mlの透過性化緩衝液中で洗浄し、FACS分析にかける前に250mlの染色緩衝液に再懸濁した。

0030

サイトカインmRNAの分析
商業用のグラニジウムチオシアネートフェノール抽出剤〔Trizol剤(GIBCO/BRL)〕を用い、休止T細胞、リバビリン処理T細胞及びインターフェロンα処理T細胞、並びに非処理活性化T細胞から全RNAを抽出した。RNAを70%エタノールで洗浄し、最後に、DEPC処理した水10μlに再懸濁した。

0031

製造業者(Promega,Madion,WI)の指示に従ってcDNA合成反応を行った。簡略的に言えば、全RNA(1μg)を65℃で10分間加熱し、上で冷却してから、10×逆転写緩衝液〔100mMのTris HCl(pH8.8)、500mMのKCl、1%のTriton X−100、5mMのMgCl〕(2μl)、10mMのdNTP(各dNTP:1mM)(2μl)、RNアーゼ阻害剤(0.5μl)、オリゴ(dT)15プライマー(0.5μg/μgRNA)(1μl)及びAMV逆転写酵素(H.C.)(0.65μl)と合わせた。反応混合物を42℃で1時間次いで95℃で10分間次いで氷上で5分間インキュベートした。

0032

GeneAmpPCRキット(Perkin−Elmer Cetus,FosterCity,CA)を用い、PCR反応を行った。新しい試験管中で、RT反応混合物(3μl)を、10×PCR緩衝液〔500mMのKCl、100mMのTris−HCl、pH8.3、15mMのMgCl2及び0.01%(w/v)のゼラチン〕(5μl)、10mMのdNTP(1μl)並びにTaqDNAポリメラーゼ(1U)と合わせた。用いたプライマーは以下の通りであった:インターロイキン−2、インターロイキン−4、インターフェロンγ(ヒト)プライマー(Stratagene,La Jolla,CA)及びpHEリボソーム遺伝子増幅条件は、94℃で45秒間、57℃で1分間、72℃で2分間のサイクルを35回、次いで、72℃で8分間であった。臭化エチジウムを含む2%アガロースゲル上でPCR産物を分析した。電気泳動させた後、PCR産物を20×SSC中で一晩かけてHybond N+メンブラン(Amersham,Arlington Heights,IL)に移し、0.4M NaOHを用いて固定化した。ブロットをRapid−hyb緩衝液(Amersham)中42℃で1時間、32P−γATP標識オリゴヌクレオチドプローブハイブリダイズさせた。(指示に従って)各サイトカインプライマーミックス放射線標識プローブとして用いた。pHE7センスプライマーから作製したプローブとハイブリダイズさせた後、処理量が等しいことを確認した。次いで、洗浄したブロットをPhosphorImagerで分析した。

0033

活性化T細胞における細胞外サイトカインレベルに及ぼすリバビリンの作用
図1に示されている代表的な実験において、リバビリンを0.5〜50mMの用量範囲で添加すると、Th1サイトカイン、IL−2及びTNFαの活性化レベルが、それぞれ5mM(30%)及び20mM(36%)で極大増大を示した。それに対し、インターフェロンαを添加すると、非処理活性化T細胞におけるレベルに比べ、IL−2及びTNFαの発現が用量依存的に阻害された(250〜10,000U/ml、極大阻害率はそれぞれ33%及び38%)。さらに、リバビリンはTh2型サイトカイン、IL−4の活性化レベルの同時低下を媒介した(2mMで74%のピーク阻害率)が、インターフェロンαは細胞外IL−4を最大で26%増大させた(10,000U/ml)。図2は、リバビリンとインターフェロンαを組み合わせて用いると、2,000U/mlの定濃度のインターフェロンαは活性化IL−2レベルのリバビリン用量依存性増大を抑制し(A)、活性化IL−4レベルの阻害を逆転させた(C)ことを示している。同様に、10mMの定濃度のリバビリンは、活性化IL−2レベルのインターフェロンα媒介性用量依存性阻害を逆転させ(B)、活性化IL−4レベルの増大を抑制した(D)。

0034

活性化T細胞におけるサイトカインmRNAレベルに及ぼすリバビリンの作用
活性化細胞外サイトカインレベルに及ぼすリバビリンとインターフェロンαの上記対立作用は転写レベルにおいても認められた。図3は、ヒトT細胞をPMA/イオノマイシンで処理すると、IL−2、IL−4及びIFNγのmRNAレベルが実質的に増大することを示している。T細胞を活性化した後でリバビリン(2、5及び10mM)で処理すると、IL−2のmRNAレベルは増大し、IL−4のmRNAレベルは低下するが、IFNγのmRNAレベルには影響がない。それに対し、1,000、2,000及び5,000U/mlのインターフェロンαで処理すると、IL−2のmRNAレベルは低下し、IL−4のmRNAレベルは増大し、IFNγのmRNAレベルは低下する。従って、IL−2、TNFα及びIL−4のmRNAの発現に及ぼすリバビリンとインターフェロンαそれぞれの用量依存性作用はELISA分析と一致した。これらのデータは、リバビリンが、活性化ヒトT細胞において、Th1型サイトカイン、IL−2及びTNFαの合成を促進し、Th2型サイトカイン、IL−4の発現を阻害することを示唆している。

0035

活性化T細胞におけるIL−2及びIL−4受容体レベルに及ぼすリバビリンの作用
FACS分析を用い、活性化T細胞におけるIL−2受容体(CD25)及びIL−4受容体(CDw124)の発現に及ぼすリバビリンとインターフェロンαの作用を比較した。PMA/イオノマイシンで処理すると、CD25とCDw124の発現が、それぞれ50.16±0.45及び62.31±1.46の休止レベルから162.48±2.89及び87.53±3.98の活性化レベルに増大する(n=4)。図4は、3回の実験のうち代表的なものでは、リバビリン(1〜50mM)はIL−2及びIL−4受容体の活性化レベルには殆ど作用しないが、インターフェロンαは、250〜10,000U/mlの用量範囲で、対照活性化T細胞における受容体レベルに比べ、用量依存的にIL−2受容体の発現を低下させ且つIL−4受容体の発現を増大させたことを示している。従って、これらのデータは、サイトカイン合成に及ぼすリバビリンの作用は、サイトカイン受容体の発現とは独立に作用することを示している。それに対し、IL−2及びIL−4受容体に及ぼすインターフェロンα処理の作用は、活性化IL−2及びIL−4発現に及ぼすインターフェロンαの作用と相関関係にある。

0036

活性化T細胞のCD4+及びCD8+サブセットにおける細胞内IL−2レベルに及ぼすリバビリンの作用
IL−2発現に及ぼすリバビリンの作用がCD4+T細胞とCD8+T細胞のどちらかに特異的であるかを調べた。固定され且つ透過性化された活性化T細胞における細胞内IL−2の発現を、蛍光標識したCD4又はCD8抗体及びIL−2抗体を用い、2色フロー・サイトメトリーにより定量した。図5は、10mMのリバビリンで処理した後では、IL−2を発現しているCD4+T細胞は82%から91%に増大し、IL−2を発現しているCD8+T細胞は81%から91%に増大したことを示している。対照的に、インターフェロンα(5,000U/ml)で処理した後では、IL−2を発現しているCD4+及びCD8+T細胞は、それぞれ81%と71%であった。これらのデータは、リバビリンが、CD4+T細胞サブセットとCD8+T細胞サブセットとを区別せずに細胞内IL−2発現に作用を及ぼすことを示している。それに対し、インターフェロンαによる処理は、CD4+T細胞には殆どを作用を及ぼさず、しかも、CD8+T細胞サブセットではIL−2の発現を低下させさえする。

0037

リバビリン類似体
臨床的にTh1又はTh2媒介性T細胞応答の調節に有効であると考えられるリバビリン類似体は数種存在する。該類似体には、図6一般式〔式中、Xは、O、S、CH2、CHOH又はN−CO−R11であり;A、B及びCは独立に、N、P、CH、C−OH、C−CH3、C−アルキル、C−アルケニル、C−CH2、−CN、C−ハロゲン、C−CN、C−COOCH3、C−NH2、C−SNH2、C−SO2−NH2、C−CONH2、C−CS−NH2、C−C(NH)NH2、CPO2−NH2又はC−複素環系であり;Dは、S、Se、Te、PH、NH又はNR12であり;R1は、H、(CH2)p(OH)、ハロゲン、CN、(CH2)pONH2、(CH2)pNH2、CH3、CH2SPH又は(CH2)−複素環であり;R2は、H、OH、OCH3、SH、SCH3、ハロゲン、CN、NH2、ONH2、NHCH3、(CH2)OH、(CH2)pNH2、CH3又はCOOMeであり;R3、R4、R5、R6、R7及びR8は独立に、H、OH、OCH3、SH、SCH3、ハロゲン、CN、NH2、ONH2、NHCH3、(CH2)OH、(CH2)pNH2、CH3、COOMe又はフェニルであり;R9は、H、ハロゲン、NH2、CH3、CONH、CSNH2、COOMe、SNH2、SO2NH2、PO2NH2、(CH2)p、(CH2)p−複素環系又は(CH2)p−グルコースであり;R10は、H、ハロゲン、NH2、CH3、CONH、CSNH2、COOMe、SNH2、SO2NH2、PO2NH2、(CH2)p、(CH2)p−複素環系、(CH2)p−グルコース、O−CH3、O−CH2CH3又はアミノ酸であり;Yは、O、S、NH・HCl、NOH、NOCH3又はNOCH2PHであり;R10とYは一緒になると、チアゾールイミダゾールなどのような複素環系を形成し;R11は、CH3(CH2)pNH2、(CH2)p−複素環、(CH2)p−アミノ酸又は(CH2)p−糖(グルコースなど)であり;pは0〜8の整数である〕を有する分子が含まれ、該分子には、LヌクレオシドもDヌクレオシドも包含される。

0038

そのような分子は、以下に例示する図式の1つ以上に従って製造し得る。

0039

1. ICN1369(ピラゾマイシン)の合成:該化合物合成法は、以下の参考文献に記載されている:(a)J.Farkas,Z.Flegelova及びF.Sorm,Tetrahedron Letts.,22,2279(1972);(b)S.De Bernardo及びM.Weigele,J.Org.Chem.,41,287(1976);(c)J.G.Buchanan,A.Stobie及びR.H.Wightrnan,J.Chem.Soc.Chem.Commun.,916(1980);N.Karagiri,K.Takashima,T.Haneda及びT.Kato,J.Chem.Soc.Perkin Transd.,553(1984)。

0040

2. ICN3438(1−β−D−キシロフラノシル−1,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミド)の合成:該化合物の合成は、J.T.Witkowski,M.Fuertes,P.D.Cook及びR.K.Robins,J.Carbohydr.Nucleosides,Nucleotides 2(1)、1(1975)に記載の手順に従って行った。

0041

3. ICN3844(1(5−O−スルファモイル−β−D−リボフラノシル)−1,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミド)の合成:該化合物は、G.D.Kini、B.M.Henry、R.K.Robins、S.B.Larson、J.J.Marr,R.L.Berens,C.J.Bacchi,H.C.Nathan及びB.S.Keithly,J.Med.Chem.,33,44(1990)に開示されている手順に従って製造した。

0042

4. ICN4625(1(3−デオキシ−β−D−エリスロペントフラノシル)−1,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミド)の合成:該化合物は、以下の合成法を用いて製造した。

0043

0044

5. ICN5531(5−アミノ−1−β−D−リボフラノシルピラゾール−4−カルボキサミド)の合成:標記化合物は、B.K.Bhattacharya,R.K.Robins及びG.R.Revankar,J.Heterocyclic Chem.,21,795(1990)に記載の合成法に従って製造した。

0045

6. ICN5676(1−β−D−アラビノフラノシル−1,2,4−トリアゾール−3−カルボキサミド)の合成:該化合物の合成は、J.T.Witkowski,M.Fuefles,P.D.Cook及びR.K.Robins,J.Carbohydr.Nucleosides,Nucleotides,2(1),1(1975)に記載の手順に従って行った。

0046

7. ICN5839(1−β−D−エリスロフラノシル−1,2,4−3−カルボキサミド)の合成:該化合物は、以下に記載の合成順序を用いて製造した:

0047

0048

8. ICN6242(2−ブロモ−1−β−D−リボフラノシルイミダゾール−4−カルボキサミド)の合成:ICN6242は、以下に示されている方法に従って製造した。

0049

0050

9. ICN11808(1−β−D−リボフラノシル−ピラゾール−3,4−ジカルボキサミド)の合成:該化合物の合成は、Y.S.Sanghvi,B.K.Bhattacharya,G.D.Kini,S.S.Matsumoto,S.B.Larson,W.J.Jolley,R.K.Robins及びG.R.Revankar,J.Med.Chem.,33,336(1990)に記載されている方法に従って行った。

0051

10. ICN12204(2−(β−D−リボフラノシル)イミダゾール−5−カルボキサミド)の合成:該化合物の合成は、J.Igoleo,T.H.Dinh,A.Keib及びC.Perreur,Chimie Therapeutique,207(1972)に記載の手順に従って行った。

0052

リバビリン類似体の炭素環式4′−チオ糖及び4′−アザ糖誘導体を得るには、以下の糖を適切な複素環式化合物縮合し、上記図式及び参考文献に記載の方法で誘導体化し得る。

0053

0054

1.炭素環式糖は、以下の文献に記載の手順に従って製造し得る:M.Yoshikawa,Y.Yoshikawa,Y.Inoue,S.Yamaguchi及びN.Murakami,Tetrahedron,50,9961(1994);L.Agrofoglio,E.Suhas,A.Parese,R.Condom,S.R.Challand,R.A.Earl及びR.Guedj,Tetrahedron,50,10611(1994)。

0055

2. 4−アザ糖は、E.J.Reist,D.E.Gueffroy及びL.Goodman,J.Am.Chem.Soc.87,677(1965)に記載の手順に従って製造した。

0056

3. 4−チオ−D−リボフラノースは、M.Hobek及びR.L.Whistler,“Methodsin Carbohydrate Chemistry”,第1巻,292(1962)に記載の手順に従って製造した。

0057

Th1型及びTh2型サイトカインの調節にリバビリンが有効であるという証拠図7及び以下の表に示されている。該図及び表に示されているアッセイは、テストした35種のリバビリン類似体のうち注目すべきもののリストを含み、アッセイは全て3回実施した。一般に、テストした化合物は主要な3種:(1)IFNγ、IL−2、IL−4、IL−S及びTNFαを抑制したICN1369及びICN3844などの化合物;(2)IL−2及びTNFαを促進し、ILA及びIL−5を抑制したリバビリンなどの化合物;及び(3)IL−2及びIFNγを促進し、IL−4及びIL−5を抑制したICN6242,ICN3839及びICN3531などの化合物に分類されることがわかるであろう。上記にリストしたような活性は、サイトカインの調節が適切な免疫応答に強い影響を与えるであろうという見通しのために潜在的に有用であると考えられる。

0058

0059

このように、リバビリン及びリバビリン類似体は、活性化T細胞においてリンホカインの発現の調節に有効であることが証明された。特定の実施態様及び用途を記載したが、当業者には、本発明の概念を逸脱せずにさらに多くの変更を実施し得ることが明らかであろう。従って、本発明は、以下の請求の範囲の精神においてのみ制限されるものとする。

図面の簡単な説明

0060

PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球におけるIL−2、IL−4、TNFα及びIFNγの細胞外発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、PMA/イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン発現に対する増大率(%)として表す。
PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球におけるIL−2(A及びC)及びIL−4(B及びD)の細胞外発現に及ぼす、2,000U/mlのインターフェロンαの存在下の2、10又は50mMのリバビリンの作用(左側パネル)と、10mMのリバビリンの存在下の500、1,000又は2,000U/mlのインターフェロンαの作用(右側パネル)を表すグラフである。
PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球におけるIL−2、IL−4及びIFNγのmRNAの発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。
PMA/イオノマイシンで活性化したTリンパ球におけるIL−2及びIL−4受容体の細胞表面発現に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラフである。結果を、PMA/イオノマイシン処理のみを行った後のリンホカイン受容体発現に対する増大率(%)として表す。
休止T細胞(A及びE)、あるいはPMA/イオノマイシンのみで処理する(B及びF)か又はPMA/イオノマイシン処理を10mMのリバビリンの存在下(C及びG)若しくは5,000U/mlのインターフェロンαの存在下(D及びH)に行った活性化CD4+T細胞(上部パネル)若しくはCD8+T細胞(下部パネル)における細胞内IL−2の発現を表すグラフである。1回の実験から得られたデータを示し、IL−2とCD4又はCD8の二重ポジティブ染色を示す細胞の百分率として表わす。
企図されるリバビリン類似体を表すグラフである。
IL−2、TNFα、IFNγ、IL−4及びIL−5に対する種々の濃度のリバビリン類似体の結果を示すグラフを集めたものである。

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